DE102018200602A1

DE102018200602A1 - Biologische Synthese von Aminosäureketten zur Herstellung von Peptiden und Proteinen

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Publication number: DE102018200602A1
Application number: DE102018200602.4A
Authority: DE
Inventors: Christoph Kutzner; Marco Giuman
Original assignee: Technische Universitaet Muenchen
Current assignee: Kutzner Christoph De
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2019-07-18
Also published as: CA3087218A1; EP3740584A1; DE202019005825U1; US11697809B2; WO2019138125A1; US20200347373A1; CA3087218C; EA202091713A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Fusionspolypeptide, dafür kodierende Nukleinsäuremoleküle und diese Nukleinsäuremoleküle enthaltende gentechnisch modifizierte Zellen. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Zielpeptiden unter Verwendung der Fusionspolypeptide.

Description

Die Erfindung betrifft Fusionspolypeptide, dafür kodierende Nukleinsäuremoleküle und diese Nukleinsäuremoleküle enthaltende gentechnisch veränderte Zellen. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Zielpeptiden, insbesondere von Zielpeptiden mit authentischem N-Terminus, unter Verwendung der Fusionspolypeptide.
Natürliche und synthetische Peptide und Polypeptide finden in den verschiedensten Bereichen Anwendung, u.a. in der Wirkstoffentwicklung, Kosmetik- und Lebensmittelindustrie, Medizin, Materialforschung und der asymmetrischen Katalyse. Die verschiedenen Funktionen werden durch die große strukturelle und funktionelle Vielfalt von Peptiden ermöglicht.
Es besteht daher ein Bedürfnis, einfache und effiziente Mittel sowie Verfahren zur Herstellung von Peptiden zu entwickeln.
WO 2006/113957 betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Polypeptids, welches die Expression eines Fusionspolypeptids umfasst, das eine Mutante der Autoprotease N^pro von Pestiviren und ein zweites Polypeptid C-terminal dazu umfasst, wobei das zweite Polypeptid autoproteolytisch abgespalten werden kann. Darüber hinaus können weitere Fusionsdomänen am N-Terminus vorhanden sein, die zur Bindung an ein affinitätschromatographisches System erforderlich sind, z.B. Polyaminosäuren wie Polylysin oder Epitop-Tags, d.h. kurze Peptidsequenzen, für die ein spezifischer Antikörper verfügbar ist.
Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht insbesondere darin, dass zur Gewinnung des Zielpeptids aufwändige Reinigungsschritte, wie zum Beispiel Affinitätschromatographie und HPLC, durchgeführt werden müssen. Ferner werden für affinitätschromatographische Verfahren teure Reagenzien (z.B. Ni/NTA, Antikörper) benötigt und große Mengen an umweltschädlichen und/oder toxischen Lösungsmitteln eingesetzt. Darüber hinaus müssen affinitätschromatographisch gereinigte Peptide oftmals in einem zusätzlichen Schritt durch HPLC gereinigt werden, um so die für die Applikation benötigte Reinheit zu erreichen. Hierdurch werden die Ausbeuten stark gemindert und die Wirtschaftlichkeit dieser Verfahren weiter gehemmt.
WO 2008/052387 offenbart Stärkebindungsdomänen und diese enthaltende rekombinante Polypeptide, wobei die Stärkebindungsdomänen N- und/oder C-terminal von einem Zielpeptid angeordnet sind. Die Fusionspolypeptide können durch Chromatographie an einem Stärketräger gereinigt werden.
Ein gravierender Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die zur Reinigung verwendeten Domänen nicht abgespalten werden und damit im Zielpeptid verbleiben. Diese Modifikation des Zielpeptids kann in der Anwendung zu unvorhersehbaren und ungewünschten Nebenwirkungen führen.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Fusionspolypeptid, umfassend in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus:

(i) eine Aufreinigungsdomäne,
(ii) eine Autoproteasedomäne und
(iii) eine Zielpeptid-Domäne,

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Fusionspolypeptid wie zuvor beschrieben, gegebenenfalls in Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine gentechnisch modifizierte Zelle, die ein Nukleinsäuremolekül wie zuvor beschrieben enthält.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Zielpeptids, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid wie zuvor beschrieben exprimiert,
(b) Kultivieren der Zelle in geeignetem Kulturmedium und unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionspolypeptids und zur Bildung von das Fusionspolypeptid enthaltenden Einschlusskörpern geeignet sind,
(c) Solubilisieren der das Fusionspolypeptid enthaltenden Einschlusskörper,
(d) Inkontaktbringen des solubilisierten Fusionspolypeptids mit einer Kohlenhydrat-basierenden Matrix, die Affinität zu der Aufreinigungsdomäne (i) aufweist, unter Bedingungen, bei denen das Fusionspolypeptid an die Matrix bindet,
(e) Spalten des Fusionspolypeptids durch die Autoproteasedomäne (ii) und Freisetzen des Zielpeptids (iii) und
(f) Gewinnen des Zielpeptids (iii).

Die Erfindung beruht darauf, dass die Herstellung eines Zielpeptids mittels eines Fusionspolypeptids, das eine an ein Kohlenhydrat bindende Aufreinigungsdomäne und eine Autoprotease enthält, zu einer signifikanten Vereinfachung des Verfahrens, beispielsweise durch Verzicht auf aufwändige HPLC-Reinigungsschritte, und/oder zu einer Verbesserung der Ausbeute eines korrekt prozessierten Zielpeptids, insbesondere eines Zielpeptids mit authentischem N-Terminus, führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Fusionspolypeptid aus den Domänen (i), (ii) und (iii) sowie gegebenenfalls einer N-terminalen Signalsequenz, die gegebenenfalls die Startaminosäure der Aufreinigungsdomäne (i) ersetzt, und/oder einer zwischen den Domänen (i) und (ii) befindlichen Linkersequenz.
Das erfindungsgemäße Fusionspolypeptid umfasst (i) eine Aufreinigungsdomäne, die an ein Kohlenhydrat bindet. Beispielsweise bindet die Aufreinigungsdomäne an ein Oligo- oder Polysaccharid, insbesondere an Cellulose, an Chitin und/oder an Stärke. Günstigerweise hat die Aufreinigungsdomäne (i) eine Länge von 90 bis 2000 Aminosäuren, bevorzugt von 100 bis 1000 Aminosäuren und stärker bevorzugt von 100 bis 600 Aminosäuren.
In einer bevorzugten Ausführungsform bindet die Aufreinigungsdomäne an Stärke. Der Begriff „Stärke“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein lineares, vernetztes oder cyclisches, aus α-1,4- und/oder α-1,6-verknüpften Glucoseeinheiten bestehendes Kohlenhydrat, beispielsweise Amylose, Amylopektin, Glucagen, Dextrin oder Cyclodextrin. Eine an Stärke bindende Aufreinigungsdomäne umfasst beispielsweise eine Glucoamylase und/oder eine Amylase und/oder eine Stärke-bindende Domäne davon. Beispiele sind humane Amylasen, Amylase aus Aspergillus niger oder Glucoamylase aus Rhizopus spp, beispielsweise die Kohlenhydrat-bindenden Module CBM20, CBM21 und/oder CBM26, sowie Kombinationen davon.
Als Aufreinigungsdomäne, die an Cellulose bindet, kann beispielsweise eine Endoglucanase oder eine Cellobiase oder ein Cellulose-bindendes Fragment davon verwendet werden. Als Aufreinigungsdomäne, die an Chitin bindet, kann z.B. eine Intein-Chitin-bindende Domäne (iCBD) verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen weist eine Aufreinigungsdomäne (i) gemäß vorliegender Erfindung eines oder mehrere der folgenden Merkmale auf:

(a) Sie bindet an Stärke, wie beispielsweise Amylose, Amylopektin, Glycogen, ein Dextrin und/oder ein Cyclodextin;
(b) Sie enthält keine, eine oder mehrere Stärke-Bindedomänen (starch binding domains);.
(c) Sie enthält keine, eine oder mehrere Oberflächen-Bindestellen (surface binding sites) für Kohlenhydrate;
(d) Sie verfügt über keine, eine oder mehrere Kohlenhydrat-Bindestellen (carbohydrate binding sites) oder
(e) sie weist eine Kombination von einem oder mehreren der Merkmale (a) bis (d) auf.

Der Begriff „Stärke-Bindedomäne“ (starch binding domain) im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf bestimmte Schlüsselmoleküle, die in einigen Enzymen anwesend sind und die am Polysaccharid-Metabolismus beteiligt sind. Diese nicht-katalytischen Module sind als essentiell für ein Binden von Stärke und die katalytische Aktivität von Stärke Synthase III beschrieben (Barchiesi et al. BMC Res Notes 2015, 8, 613.).
Der Begriff „Oberflächen-Bindestelle“ (surface binding site) im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Liganden-Bindestelle, die sich auf dem katalytischen Modul eines Enzyms, aber außerhalb der aktiven Stelle selbst, befindet. Oberflächen-Bindestellen wurden bis dato in der Kristallstruktur von mehr als 45 Kohlenhydrat-aktiven Enzymen beobachtet, wobei ungefähr die Hälfte dieser Enzyme zur GH13 Familie gehören (Cockburn et al. Biologica 2014, 69, 705; Rauter und Lindhorst (Hrsg.) Carboyhdrate Chemistry - Chemical and Biological Approaches - Volume 39, Specialist Periodical Reports Verlag 2013).
Der Begriff „Kohlenhydrat-Bindestelle“ (carbohydrate binding site) im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Protein-Domäne, die in Kohlenhydrat-aktiven Enzymen wie zum Beispiel Glykosid-Hydrolasen zu finden ist. Die Mehrheit dieser Domänen weist Kohlenhydrat-Bindungsaktivität auf. Kohlenhydrat-Bindestellen werden auch als Cellulose-Bindestellen bezeichnet (Gilkes et al. Microbiol Rev 1991, 55, 303). Sie werden - basierend auf Aminosäuresequenzähnlichkeit - in zahlreiche Familien klassifiziert, von denen aktuell mehr als 65 bekannt sind (Carbohydrate-Active EnZymes Datenbank (CAZy), www.cazypedia.org/index.php/Carbohydrate-binding_modules am 10.01.18).
Ein weiterer Bestandteil des erfindungsgemäßen Fusionspolypeptids ist die Autoproteasedomäne (ii). Unter dem Begriff „Autoproteasedomäne“ ist eine Protease zu verstehen, die einen daran gebundenen Fusionspartner an einer vorbestimmten Stelle spaltet. Die Autoproteasedomäne (ii) kann eine virale Autoprotease, bevorzugt eine Autoprotease aus einem Virus der Gattung Flaviviridae, stärker bevorzugt eine Autoprotease aus einem Pestivirus und noch stärker bevorzugt eine N^pro-Autoprotease oder ein aktives Fragment oder eine aktive Mutante einer derartigen Autoprotease umfassen. Beispielsweise kann die Autoproteasedomäne (ii) eine N^pro-Autoprotease aus CSVF (Klassischer Schweinefiebervirus), z.B aus dem CSFV-Stamm Alfort (Gottipati et al. PLoS Pathog 2013, 9, e1003704; Paton et al. Vet Microbiol 2010, 73, 137; Meyers et al. Virology 1989, 171, 555; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04358 am 10.01.2018) oder eine Mutante einer N^pro-Autoprotease umfassen. Beispielsweise kann eine Mutante einer N^pro-Autoprotease verwendet werden, bei der mindestens ein Cysteinrest der natürlich vorkommenden N^pro-Autoprotease durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, wobei bevorzugte Mutanten in WO 2006/113957 offenbart werden. Bevorzugte Mutationsstellen sind C112, C134 und C138 der natürlich vorkommenden N^pro-Autoprotease. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist die Mutante EDDIE, die als SEQ ID No. 5 in WO 2006/113957 offenbart wird. Ebenfalls geeignet sind jedoch auch Wildtyp-N^pro-Autoproteasen oder N^pro-Autoproteasemutanten ohne Mutation eines der darin vorhandenen Cysteinreste. Solche Mutationen können beispielsweise das Ersetzen von wenigstens einer basischen Aminosäure durch eine saure Aminosäure, von wenigstens einer sauren Aminosäure durch eine basische Aminosäure, von wenigstens einer hydrophoben Aminosäure durch eine hydrophile Aminosäure und/oder von wenigstens einer hydrophilen Aminosäure durch eine hydrophobe Aminosäure umfassen.
Die Autoproteasedomäne (ii) kann das Fusionspolypeptid nach ihrem C-Terminus und vor dem N-Terminus, d.h. vor dem Beginn des Zielpeptids (iii) schneiden. Günstigerweise erfolgt der Schnitt so, dass keine Aminosäurereste der Autoproteasedomäne (ii) beim Zielpeptid (iii) verbleiben und ein Zielpeptid mit authentischem N-Terminus erhalten wird. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Cystein-Rest am N-Terminus des Zielpeptids verbleiben.
Die Erfindung ermöglicht die Aufreinigung verschiedenartiger Zielpeptide. Der Begriff „Zielpeptid“ umfasst dabei Peptidsequenzen mit einer Länge von 2 oder mehr Aminosäuren, z.B. von 2 bis 1000 oder mehr Aminosäuren. So kann das Zielpeptid beispielsweise eine Kettenlänge von (a) 2-100, z.B. 2-50 Aminosäuren, (b) 100-500 Aminosäuren oder (c) mehr als 500 Aminosäuren aufweisen.
Durch die Erfindung können verschiedenste Arten von Zielpeptiden hergestellt werden, insbesondere solche, die über die gängigen Verfahren wie rekombinante Synthese und Festphasensynthese nicht oder nur schwer zugänglich sind. Erfindungsgemäße Peptide schließen beispielsweise stark hydrophobe Zielpeptide ein, die einen Anteil an hydrophoben Aminosäuren von ≥10 %, bevorzugt ≥20 %, stärker bevorzugt ≥30 % und noch stärker bevorzugt ≥40 % aufweisen, wobei hydrophobe Aminosäuren ausgewählt werden aus Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Tryptophan und Phenylalanin. Andererseits können auch Zielpeptide mit einem stark hydrophilen Charakter hergestellt werden, beispielsweise mit einem Anteil von hydrophilen Aminosäuren von ≥10 %, bevorzugt ≥20 %, stärker bevorzugt ≥30 %, noch stärker bevorzugt ≥40 %, wobei hydrophile Aminosäuren ausgewählt werden aus Serin, Threonin, Glutamin, Asparagin, Tyrosin, Glycin, Cystein, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Histidin, Arginin und Lysin. Außerdem können auch Zielpeptide hergestellt werden, die Kombinationen von hydrophoben und hydrophilen Aminosäureblöcken wie zuvor beschrieben aufweisen. Beispielsweise können jene Zielpeptide über längere Abschnitte über einen Anteil von ≥10 %, bevorzugt ≥20 %, stärker bevorzugt ≥30 % hydrophoben Aminosäuren und über weitere Abschnitte über einen Anteil von ≥10 %, bevorzugt ≥20 %, stärker bevorzugt ≥30 % hydrophilen Aminosäuren verfügen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das für ein Fusionspolypeptid wie zuvor beschrieben kodiert. Das Nukleinsäuremolekül kann in einzel- oder doppelsträngiger Form, z.B. als RNA oder DNA, vorliegen. Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Gegebenenfalls liegt die für das Fusionspolypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz, z.B. einem Promotor und/oder Enhancer, vor, d.h. einer Sequenz, die eine Expression in einer Wirtszelle ermöglicht. Die Expressionskontrollsequenz kann beispielsweise einen chemisch und/oder thermisch induzierbaren Promotor umfassen, der eine gezielte Steuerung der Expression ermöglicht.
Das Nukleinsäuremolekül kann weiterhin auf einem Vektor angeordnet sein, d.h. einem Nukleinsäurekonstrukt, welches in eine Wirtzelle eingebracht werden kann. Beispiele für Vektoren sind virale Vektoren, Plasmide oder Cosmide, die zur Einführung in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen geeignet sind. Vorzugsweise ist der Vektor ein Plasmid, insbesondere ein Plasmid, das zur Einführung in prokaryontische Wirtszellen geeignet ist.
Gegebenenfalls enthält das für das Fusionspolypeptid kodierende Nukleinsäuremolekül eine Signalpeptid-kodierende Sequenz, welche die Art der Expression des Fusionspolypeptids in der Wirtszelle steuert. Vorzugsweise ist eine Signalpeptid-kodierende Sequenz vorhanden, welche die Expression in Form unlöslicher Einschlusskörper in der Wirtszelle steuert. Ein Beispiel für eine geeignete Signalsequenz ist in SEQ ID NR:1/SEQ ID NR:2 dargestellt. Vorzugsweise ersetzt die Signalpeptid-kodierende Sequenz das Startcodon der Aufreinigungsdomäne (i). Ferner kann das rekombinante Nukleinsäuremolekül gegebenenfalls eine für einen Linker kodierende Sequenz zwischen der Aufreinigungsdomäne (i) und der Autoproteasedomäne (ii) aufweisen. Die Länge des Linkers kann 1 bis 50 oder mehr Aminosäuren betragen. In einer anderen Ausführungsform sind die Domänen (i) und (ii) direkt, d.h. ohne Linker, fusioniert. Eine bevorzugte Ausführungsform der Fusionspolypeptid-kodierenden Gensequenz weist eine zusätzliche Klonierungsstelle, zum Beispiel eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle, am 3' Ende der Autoproteasedomäne (ii) auf. Die zusätzliche Klonierungsstelle kann zum Beispiel durch eine stumme Mutation eingeführt werden, d.h. eine Mutation auf DNA-Ebene, die ohne Auswirkung auf die Aminosäuresequenz bleibt, und beispielsweise die Codons 2 und 3 aus Richtung des C-Terminus der Autoproteasedomäne umfassen. Gegebenenfalls enthält das rekombinante Nukleinsäuremolekül am C-Terminus ein zusätzliches Stoppcodon, beispielsweise das Codon TAA.
Die erfindungsgemäße gentechnisch modifizierte Zelle enthält ein Nukleinsäuremolekül wie zuvor beschrieben, vorzugsweise ein auf einem Vektor angeordnetes Nukleinsäuremolekül und ist günstigerweise in der Lage, das Fusionspolypeptid zu exprimieren, insbesondere in Form von unlöslichen Einschlusskörpern oder aber in löslicher Form. Die gentechnisch modifizierte Zelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Bevorzugt ist eine prokaryontische Zelle, z.B. eine gram-negative Bakterienzelle wie etwa E. coli oder eine gram-positive Bakterienzelle wie etwa Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis. Andererseits kann die Zelle auch eine eukaryontische Zelle sein, beispielsweise eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

Schritt (a) umfasst das Bereitstellen einer gentechnisch modifiziertenZelle, die ein Fusionspolypeptid exprimiert. Eine derartige Zelle ist erhältlich, indem ein Nukleinsäuremolekül, welches eine für ein Fusionspolypeptid kodierende Sequenz enthält, insbesondere in Form eines Vektors, nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Transfektion oder Transformation, in die Zelle eingebracht wird. In Schritt (b) wird die Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, z.B. in einem für die betreffende Zelle üblicherweise verwendeten Kulturmedium kultiviert. Die Kultivierung erfolgt unter Bedingungen, bei denen eine Expression des Fusionspolypeptids und die Bildung von das Fusionspolypeptid enthaltenden Einschlusskörpern erfolgt. Beispielsweise kann ein induzierbarer Promotor, z.B. ein chemisch oder thermisch induzierbarer Promotor, verwendet werden, um die Expression des Fusionspolypeptids zu steuern. Schritt (c) umfasst das Solubilisieren der das Fusionspolypeptid enthaltenden Einschlusskörper, die günstigerweise zuvor von anderen zellulären Bestandteilen abgetrennt werden. Das Solubilisieren der Einschlusskörper kann unter Verwendung eines Puffers erfolgen, der hohe Mengen einer chaotropen Substanz, beispielsweise Harnstoff und/oder Guanidiniumhydrochlorid, enthält.
In Schritt (d) wird das solubilisierte Fusionspolypeptid mit einer Kohlenhydrat-basierenden Matrix in Kontakt gebracht, die eine Affinität zur Aufreinigungsdomäne (i) aufweist, so dass das Fusionspolypeptid über die Aufreinigungsdomäne an die Matrix bindet. Beispielsweise kann hierzu eine Chromatographie des Fusionspolypeptids über die Matrix, z.B. über eine die Matrix enthaltende Säule, erfolgen. Dieser Schritt erfolgt unter Bedingungen, bei denen die Autoproteasedomäne (ii) inaktiv ist, um eine vorzeitige Abspaltung der Zielpeptiddomäne (iii) zu vermeiden. Der Anteil an gespaltenem Fusionspolypeptid unter diesen Bedingungen beträgt günstigerweise ≤5%, ≤3% oder ≤1%. Bedingungen, bei denen eine „inaktive Autoproteasedomäne“ vorliegt, sind (1) Bedingungen, bei denen die Autoproteasedomäne konstitutionell inaktiv ist und erst durch Änderung der äußeren Bedingungen, beispielsweise durch eine Anpassung der Temperatur, des pH-Werts und/oder der lonenstärke, aktiviert wird oder (2) Bedingungen, bei denen die Autoproteasedomäne konstitutionell aktiv ist, aber während der zur Durchführung des Verfahrensschritts erforderlichen Zeitspanne, z.B. von bis zu 10 min, bis zu 20 min oder bis zu 30 min, innerhalb derer die Bindung des Fusionspolypeptids an die Matrix und die Abtrennung von Verunreinigungen erfolgt, eine zu geringe Aktivität aufweist, um eine vorzeitige Abspaltung der Zielpeptiddomäne zu bewirken.
Vorzugsweise wird in Schritt (d) eine unlösliche Matrix verwendet, wodurch eine Abtrennung von Verunreinigungen vereinfacht wird.
In Schritt (e) wird das Fusionspolypeptid durch die Autoproteasedomäne (ii) gespalten, wobei das Zielpeptid (iii) freigesetzt wird. Die Spaltung des Fusionspolypeptids kann durch Zugabe eines Autoproteolysepuffers erfolgen, d.h. eines Puffers, der für Bedingungen sorgt, bei denen die Autoprotease aktiv ist. In einer Ausführungsform erfolgt die Spaltung des Fusionspolypeptids durch eine Änderung des pH-Werts, beispielsweise durch Zugabe eines Autoproteolysepuffers mit einem pH-Wert ≤5,0, ≤4,5 oder ≤4,0. Wird ein Fusionspolypeptid mit einem C-terminalen Cystein-Rest an der Autoproteasedomäne (ii) verwendet, kann dieser bei solchen Bedingungen am Zielpeptid (iii) verbleiben.
Abschließend erfolgt in Schritt (f) das Gewinnen des Zielpeptids (iii), das vorzugsweise ein Abtrennen von der Matrix und dem daran gebundenen verbleibenden Rest des Fusionspolypeptids und/oder ein Isolieren des Zielpeptids umfasst. Vorzugsweise umfasst Schritt (f) eine Ausfällung des Zielpeptids mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. einem Alkohol, oder Lösungsmittelgemisch. Hydrophobe Peptide können gegebenenfalls mit einem Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch extrahiert werden. Das gewonnene Zielpeptid kann einen authentischen N-Terminus oder einen N-terminalen Cystein-Rest aufweisen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Zielpeptids, umfassend die Schritte:

(a') Bereitstellen einer gentechnisch modifizierte Zelle, die ein Fusionspolypeptid wie zuvor beschrieben exprimiert,
(b') Kultivieren der Zelle in geeignetem Kulturmedium und unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionspolypeptids in löslicher Form geeignet sind,
(c') Inkontaktbringen des Fusionspolypeptids mit einer Kohlenhydrat-basierenden Matrix, die Affinität zu der Aufreinigungsdomäne (i) aufweist, unter Bedingungen, bei denen das Fusionspolypeptid an die Matrix bindet,
(d') Spalten des Fusionspolypeptids durch die Autoproteasedomäne (ii) und Freisetzen des Zielpeptids (iii) und
(e') Gewinnen des Zielpeptids (iii).

Schritt (a') umfasst das Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid exprimiert. Eine derartige Zelle ist erhältlich, indem ein Nukleinsäuremolekül, welches eine für ein Fusionspolypeptid kodierende Sequenz enthält, insbesondere in Form eines Vektors, nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Transfektion oder Transformation, in die Zelle eingebracht wird. In Schritt (b') wird die Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, z.B. in einem für die betreffende Zelle üblicherweise verwendeten Kulturmedium kultiviert. Die Kultivierung erfolgt unter Bedingungen, bei denen eine Expression des Fusionspolypeptids in löslicher Form erfolgt. Beispielsweise kann ein induzierbarer Promotor, z.B. ein chemisch oder thermisch induzierbarer Promotor, verwendet werden, um die Expression des Fusionspolypeptids zu steuern.
In dieser Ausführungsform wird günstigerweise ein Fusionspolypeptid mit einer Autoproteasedomäne (ii) verwendet, die bei den während der Expression in der Wirtszelle und/oder im Kulturmedium herrschenden Bedingungen konstitutionell inaktiv ist und erst durch gezielte Änderung der äußeren Bedingungen aktiviert wird, zum Beispiel durch die Zugabe einer Aktivatorsubstanz und/oder die Änderung des pH-Werts aktiviert werden kann.
Die Schritte (c') bis (e') können analog zu den Schritten (d) bis (f) der oberhalb beschriebenen Ausführungsform erfolgen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein Fusionspolypeptid umfassend die Domänen (i) und (ii) wie zuvor beschrieben und eine Klonierungsstelle zum Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls umfassend die Domäne (iii) wie zuvor beschrieben, gegebenenfalls in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz. Dieses Nukleinsäuremolekül stellt ein Ausgangsmaterial zur Herstellung eines beliebigen Zielpeptids dar, da ein für ein solches Zielpeptid kodierendes Nukleinsäuremolekül mittels Standardmethoden, z.B. Restriktionsspaltung und anschließender Ligation, einkloniert werden kann. Auch dieses Nukleinsäuremolekül kann auf einem Vektor wie zuvor beschrieben, z.B. einem Plasmid, angeordnet sein.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele erläutert werden.
Beispiel 1 Aufbau der Fusionspolypeptid-kodierenden Gensequenzen
Es wurden Gensequenzen hergestellt, die für ein aus drei Teilen bestehendes Fusionspolypeptid kodieren. Der N-terminale Abschnitt besteht aus einer Aufreinigungsdomäne (i), der mittlere Abschnitt aus einer N^pro-Autoproteasedomäne (ii) und der C-terminale Abschnitt aus der Zielpeptid-Domäne (iii). Die Domänen (i) und (ii) sind optional mit einem Linker verbunden (SEQ ID NR:3/SEQ ID NR:4).
Als Aufreinigungsdomäne wurden die humane α-Amylase (AMY1c; SEQ ID NR:5/SEQ ID NR:6), die Glucoamylase 1 (GA 1) aus Aspergillus niger (SEQ ID NR:7/SEQ ID NR:8) sowie die Kohlenhydrat-Bindeeinheiten CBM20 (SEQ ID NR:9/SEQ ID NR:10) und CBM26 verwendet.
Als Autoproteasedomäne wurden NPro (CSFV Alfort 187; SEQ ID NR:11/SEQ ID NR:12) sowie die Mutante EDDIE (SEQ ID NR:13/SEQ ID NR:14) aus WO 2006/113957 verwendet.
Als Zielpeptide wurden eine an Methionin-35 oxidierte Form von Amyloid-β (1-42), ein heptameres Valin (Val₇), ein hydrophobes IIe13Thr8-Peptid und das bekannte Grünfluoreszenz-Protein (GFP) verwendet.
Beispiel 2 Herstellung von Zielpeptiden
Die in Beispiel 1 beschriebenen Gensequenzen wurden in gentechnisch modifizierten Wirtszellen exprimiert.
In einem ersten Schritt wurde ein die betreffende Gensequenz enthaltender Vektor (z.B. der Vektor pet28a(+)) in eine Wirtszelle, z.B. E. coli, BL21 DE 3, eingeführt. Auf diesem Vektor befindet sich die Gensequenz unter Kontrolle des durch Isopropyl-β-D-1-thioglactopyranosid (IPTG) induzierbaren lac-Promotors. Die den Vektor enthaltenden Zellen wurden selektioniert, z.B. durch Ausplattieren auf Kanamycin-haltigen Agaroseplatten. Kolonien auf dieser Platte wurden für die Expression genutzt.
Die Bakterienzellen wurden in einem geeigneten Kultivierungsmedium, z.B. LB-Medium, bis zu einer optischen Dichte OD₆₀₀ von 0,6 unter Standardbedingungen kultiviert. Dazu erfolgte eine Induzierung der Genexpression bei 37 °C für 12 h durch Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration).
Im Anschluss an die Expression wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in einem Lysepuffer (z.B. 2 mM MgCl₂, 5 mM EDTA, 75 mM NaOAc, 20 mM HEPES pH 7,3) aufgenommen und durch Sonifikation aufgeschlossen. Das Fusionspolypeptid wurde während der Expressionsphase in Form von Einschlusskörpern (IBs) im Inneren der Zellen hergestellt und lag somit ungelöst in kristalliner Form in den Zellen vor. Dann wurden die IBs in einem Solubilisierungspuffer (z.B. 8 M Harnstoff, 6 M Guanidinum-HCI, 20 mM HEPES, 50 mM Dithiothreitol pH 7,3), vorzugsweise unter reduzierenden Bedingungen solubilisiert, um weiter verarbeitet werden zu können. Für die Zellmasse wurde aus einem Liter Kultur 10-30 ml dieses Puffers eingesetzt.
In dem Denaturierungspuffer ist die Autoproteasedomäne des Fusionspolypeptids inaktiv. Zur Überführung in die natürliche Konformation und somit zur Reinigung und Aktivierung der Autoprotease wurde die Lösung der solubilisierten IBs in eine Suspension von Autoproteolysepuffer (z.b. 0,5 M Arginin, 100 mM HEPES, 10 mM Saccharose, 5 mM EDTA pH 7,3) und Stärke gegeben, z.B. Maisstärke. Andere Stärkequellen kommen aber ebenso in Frage. Das Fusionsprotein wurde dabei über dessen Aufreinigungsdomäne (Amylase oder Stärke-bindende Einheit) an die Stärke gebunden.
Das Fusionsprotein wurde dann unter ständigem Rühren 10 min bei 37 °C in der Suspension aus Autoproteolysepuffer und Stärke inkubiert. Anschließend wurde die Suspension zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Zentrifugat wurde zweimal oder mehrmals in Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Der jeweilige Überstand wurde verworfen. Hierdurch wurden etwaige Verunreinigungen entfernt. Anschließend wurde das Zentrifugat erneut im Autoproteolysepuffer suspendiert und bei 8 °C 60 min gelagert. Nach Resuspension und anschließender Zentrifugation wurde der Überstand in einem Alkohol gefällt und erneut zentrifugiert. Somit wurde das Zielpeptid erhalten welches anschließend gefriergetrocknet werden kann und somit lagerfähig wird.
Sollte es sich bei dem Zielpeptid um ein wasserunlösliches Peptid oder Protein handeln (beispielsweise Amyloid-β-Peptid), dann wurde die Stärke vor der Fällung im Alkohol nochmals in einem geeigneten Lösemittel extrahiert (beispielsweise in Hexafluoroisopropanol, HFIP), zentrifugiert und anschließend gefällt.
Beispiel 3 Charakterisierung der Zielpeptide
Die Identität der in Beispiel 2 gewonnenen Zielpeptide wurde durch spektroskopische sowie spektrometrische Methoden verifiziert.

zeigt ein MALDI-TOF Spektrum von Amyloid-β (1-42) mit Oxidation am Methioninrest 35 (+16 Da). Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser (1:1, 0,1% Trifluoroessigsäure (TFA)) gelöst und mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) als Matrix (10 mg/ml) in einem Verhältnis von 1:50 cokristallisiert. Die Messung erfolgte durch 1000 Laserpulse bei 100 Hz.
zeigt ein MALDI-TOF Spektrum von IIe₁₃Thr₈. Die Probe wurde in Acetonitril/Wasser (1:1, 0,1 %TFA) gelöst und mit DHB als Matrix (10 mg/ml) in einem Verhältnis von 1:50 cokristallisiert. Die Messung erfolgte durch 1000 Laserpulse bei 100 Hz. Zwei Signale entsprechend IIe₁₃Thr₈ (M/Z = 2) und IIe₁₃Thr₈ + Na (M/Z = 2) wurden detektiert.
zeigt ein Fluoreszenz-Emissionsspektrum von GFP bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer gemessenen Emissionswellenlänge von 510 nm.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2006/113957 [0004, 0021, 0043]
WO 2008/052387 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Cockburn et al. Biologica 2014, 69, 705; Rauter und Lindhorst (Hrsg.) Carboyhdrate Chemistry - Chemical and Biological Approaches - Volume 39, Specialist Periodical Reports Verlag 2013 [0019]
Gottipati et al. PLoS Pathog 2013, 9, e1003704 [0021]
Paton et al. Vet Microbiol 2010, 73, 137 [0021]
Meyers et al. Virology 1989, 171, 555 [0021]

Claims

Fusionspolypeptid, umfassend in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus: (i) eine Aufreinigungsdomäne, (ii) eine Autoproteasedomäne und (iii) eine Zielpeptid-Domäne, wobei die Aufreinigungsdomäne (i) an ein Kohlenhydrat bindet.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aufreinigungsdomäne (i) an ein Oligo- oder Polysaccharid, insbesondere an Cellulose, an Chitin und/oder an Stärke bindet.
Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Aufreinigungsdomäne (i) an Stärke bindet und eine Glucoamylase und/oder eine Amylase, und/oder eine Stärke-bindende Domäne, eine Oberflächen-bindende Domäne und/oder eine Kohlenhydrat-bindende Domänedavon umfasst.
Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Autoproteasedomäne (ii) eine virale Autoprotease, bevorzugt eine Autoprotease aus einem Virus der Gattung Flavividae, stärker bevorzugt eine Autoprotease aus einem Pestvirus und noch stärker bevorzugt eine N^pro-Autoprotease oder ein aktives Fragment oder eine aktive Mutante einer derartigen Autoprotease umfasst.
Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Autoproteasedomäne (ii) eine N^pro-Autoprotease aus CSFV oder eine Mutante einer N^pro-Autoprotease, insbesondere die CSFV N^pro Mutante EDDIE, umfasst.
Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Autoproteasedomäne (ii) das Fusionspolypeptid nach ihrem C-Terminus und vor dem N-Terminus des Zielpeptids (iii) schneidet.
Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Zielpeptid (iii) eine Kettenlänge von (a) 2-1000 Aminosäuren, (b) 100-500 Aminosäuren oder (c) mehr als 500 Aminosäuren aufweist.
Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Zielpeptid (iii) einen Anteil an (a) hydrophoben Aminosäuren von ≥10 %, bevorzugt ≥20 %, stärker bevorzugt ≥30 %, noch stärker bevorzugt ≥40 %, (b) hydrophilen Aminosäuren von ≥10 %, bevorzugt ≥20 %, stärker bevorzugt ≥30 %, noch stärker bevorzugt ≥40 %, und/oder (c) eine Kombination von (a) und (b) aufweist.
Rekombinantes Nukleinsäure-Molekül kodierend für ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 gegebenenfalls in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz.
Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 9, das auf einem Vektor, insbesondere einem Plasmid angeordnet ist.
Gentechnisch modifizierte Zelle, die ein Nukleinsäure-Molekül nach einem der Ansprüche 9 bis 10 enthält, wobei die Zelle eine prokaryontische oder eine eukaryontische Zelle ist, bevorzugt eine prokaryontische Zelle, stärker bevorzugt eine E. coli-Zelle.
Gentechnisch modifizierte Zelle nach Anspruch 11, die ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 exprimiert.
Verfahren zum Herstellen eines Zielpeptids, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer gentechnisch modifizierten Zelle, die ein Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 exprimiert, (b) Kultivieren der Zelle in geeignetem Kulturmedium und unter Bedingungen, die zur Expression des Fusionspolypeptids und zur Bildung von das Fusionspolypeptid enthaltenden Einschlusskörpern geeignet sind, (c) Solubilisieren der das Fusionspolypeptid enthaltenden Einschlusskörper, (d) Inkontaktbringen des solubilisierten Fusionspolypeptids mit einer Kohlenhydrat-basierenden Matrix, die Affinität zu der Aufreinigungsdomäne (i) aufweist, unter Bedingungen, bei denen das Fusionspolypeptid an die Matrix bindet, (e) Spalten des Fusionspolypeptids durch die Autoproteasedomäne (ii) und Freisetzen des Zielpeptids (iii) und (f) Gewinnen des Zielpeptids (iii).
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Inkontaktbringen (d) eine Chromatographie über die Matrix umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, wobei das Spalten (e) durch Zugabe eines Autoproteolysepuffers erfolgt, und/oder wobei das Gewinnen (f) ein Abtrennen und/oder Isolieren des Zielpeptids von der Matrix umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das in Schritt (f) gewonnene Zielpeptid (iii) einen authentischen N-Terminus oder einen zusätzlichen Cystein-Rest am N-Terminus aufweist.
Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein Fusionspolypeptid umfassend die Domänen (i) und (ii) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und eine Klonierungsstelle zum Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls umfassend die Domäne (iii) nach einem der Ansprüche 1 bis 8 gegebenenfalls in operativer Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17, das auf einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, angeordnet ist.