[go: up one dir, main page]

DE102011078342A1 - Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit - Google Patents

Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit Download PDF

Info

Publication number
DE102011078342A1
DE102011078342A1 DE201110078342 DE102011078342A DE102011078342A1 DE 102011078342 A1 DE102011078342 A1 DE 102011078342A1 DE 201110078342 DE201110078342 DE 201110078342 DE 102011078342 A DE102011078342 A DE 102011078342A DE 102011078342 A1 DE102011078342 A1 DE 102011078342A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
probe
probes
pair
nucleic acid
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE201110078342
Other languages
English (en)
Inventor
Timo Hillebrand
Elmara Graser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AJ Innuscreen GmbH
Original Assignee
AJ Innuscreen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AJ Innuscreen GmbH filed Critical AJ Innuscreen GmbH
Priority to DE201110078342 priority Critical patent/DE102011078342A1/de
Priority to PCT/EP2012/062575 priority patent/WO2013001005A1/de
Publication of DE102011078342A1 publication Critical patent/DE102011078342A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/137—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of a displacement step
    • C12Q2537/1373—Displacement by a nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
    • C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Das Verfahren zur RealTime- bzw. Endpunkt- Bestimmung von Nukleinsäuren erfolgt mittels rehybridisiest charakterisiert durch eine Möglichkeit, einen homogenen und automatisierbaren Hochdurchsatz-Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Durch das rehybridisierende Sondensystem wird auch ein Multiplex-Nachweis ermöglicht. In einer besonders effizienten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für eine qualitative oder quantitative Echtzeitmessung von spezifischen Targetnukleinsäuren zwei Sonden eingesetzt. Dadurch kann eine deutliche Verstärkung der Nachweissensitivität und Signalstärke erzeugt werden sowie eine Targetdifferenzierung erreicht werden.

Description

  • Das neuartige rehybridisierende Sondensystem dient dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen in Echtzeit und damit der molekularen Diagnostik. Das neuartige Sondensystem ist charakterisiert durch eine Möglichkeit, einen homogenen und automatisierbaren Hochdurchsatz-Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Durch das rehybridisierende Sondensystem wird auch ein Multiplex-Nachweis ermöglicht.
  • In einer besonders effizienten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden für eine qualitative oder quantitative Echtzeitmessung von spezifischen Targetnukleinsäuren zwei Sonden eingesetzt. Dadurch kann eine deutliche Verstärkung der Nachweissensitivität und Signalstärke erzeugt werden sowie eine Targetdifferenzierung erreicht werden.
  • Stand der Technik
  • Die Gendiagnostik ist zu einem unverzichtbaren Bestandteil der modernen medizinischen Labordiagnostik, der forensischen Diagnostik, der veterinärmedizinischen Labordiagnostik oder der Lebensmittel- und Umweltdiagnostik geworden.
  • Revolutioniert wurde die genetische Diagnostik mit der Erfindung der PCR-Technologie, die es gestattet, jede beliebige Nukleinsäuresequenz spezifisch zu vervielfachen.
  • Diese Technologie besitzt aber neben ihren eindeutigen Vorteilen (wie Sensitivität, Spezifität) auch ihre Nachteile. Für die Durchführung der Amplifikationsreaktion werden teure Geräte benötigt, die den schnellen Temperaturwechsel gewährleisten können; die Ergebnisse der Amplifizierung bzw. die mit der Amplifizierung gekoppelte Sondenhybridisierung müssen ebenfalls mittels teurer und aufwendig zu bedienender Labortechnik ausgewertet werden. Hierbei ist eine „einfache” Visualisierung mittels Gelelektrophorese manchmal wegen ihrer Ungenauigkeit unzureichend.
  • Eine weit verbreitete Methode zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist z. B. die Light Cycler Technologie (Fa. Roche). Die Firma Roche entwickelte dazu spezielle Hybridisierungssonden, bestehend aus zwei verschiedenen Oligonukleotiden, die jeweils mit nur einem Fluorochrom markiert sind. Am 3'-Ende der einen Sonde befindet sich der Akzeptor, das andere Oligonukleotid ist am 5'-Ende mit einem Donor versehen. Die Sonden werden so gewählt, dass sie beide an den gleichen DNA-Strang binden, wobei der Abstand zwischen Akzeptor und Donor nur maximal 1 bis 5 Nukleotide betragen darf, damit es zum sog. FRET-Effekt kommen kann. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Annealingschrittes, wobei nur Licht dieser Wellenlänge nachweisbar ist, solange beide Sonden an die DNA gebunden sind und sich in räumlicher Nähe befinden. Der Schmelzpunkt beider Sonden sollte bei diesem System identisch sein. Durch die Verwendung zweier hybridisierender Sonden zusätzlich zu den verwendeten Primern ist die Spezifität dieses Detektionssystems äußerst hoch.
  • Eine weitere Real-Time-PCR-Anwendung zum Nachweis spezifischer Nukleinsäure-Targets kann mit sog. Double Dye Sonden, welche in der Patentschrift US 5210015 und US 5487972 offenbart sind (TaqMan-Sonden), durchgeführt werden. Double Dye Sonden tragen zwei Fluorochrome auf einer Sonde. Der Reporterfarbstoff befindet sich hier am 5'-Ende, der Quencherfarbstoff am 3'-Ende. Zusätzlich befindet sich am 3'-Ende der Sonde eventuell noch eine Phosphatgruppe, damit die Sonde bei der Elongation nicht als Primer fungieren kann. Solange die Sonde intakt ist, ist die freigesetzte Lichtstärke gering, da fast die gesamte Lichtenergie, die nach der Anregung des Reporters entsteht, aufgrund der räumlichen Nähe vom Quencher aufgenommen und umgeformt wird. Das emittierte Licht des Reporterfarbstoffes wird „gequenched”, d. h. gelöscht. Dieser FRET-Effekt bleibt auch erhalten, nachdem die Sonde an den komplementären DNA-Strang gebunden hat. Während der Elongationsphase trifft die Polymerase auf die Sonde und hydrolysiert sie. Man bezeichnet die Fähigkeit der Polymerase, ein Oligonukleotid (bzw. eine Sonde) während der Strangsynthese zu hydrolysieren, als 5'-3' Exonukleaseaktivität. Nicht alle Polymerasen haben eine 5'-3' Exonukleaseaktivität (Taq- und Tth-Polymerase). Als erstes wurde dieses Prinzip für die Taq-Polymerase beschrieben. Das Prinzip wird als TaqMan-Prinzip bezeichnet. Nach Sondenhydrolyse befindet sich der Reporterfarbstoff nicht mehr in räumlicher Nähe zum Quencher. Die emittierte Fluoreszenz wird jetzt nicht mehr umgeformt, dieser Fluoreszenzanstieg wird gemessen.
  • Eine weitere Möglichkeit zum spezifischen Nachweis von Amplifikationsprodukten mittels Real-Time-PCR-Technologie besteht in der Nutzung von interkalierenden Farbstoffen (Ethidiumbromid, Hoechst 33258, Yo-Pro-1 oder SYBR GreenTM u. ä.). Eine klare Differenzierung zwischen spezifischem Amplifikationsereignis bzw. Artefakt ist aber zwingend notwendig. Um dies dennoch zu erreichen, nutzt man eine sog. Schmelzpunktanalyse am Ende der eigentlichen PCR-Reaktion.
  • Mittels Real-Time-PCR-Anwendungen ist es darüber hinaus auch möglich, eine Quantifizierung der nachzuweisenden Targets durchzuführen.
  • Wie schon aufgeführt, ist die Nutzung des sog. TaqMan-Assays Stand der Technik. Dieses elegante Verfahren der Echtzeit-Messung von Targetnukleinsäuren wird weltweit für die qualitative und quantitative molekulare Diagnostik eingesetzt.
  • Anwendungslimitierend sind die für diese Nachweistechnologie bestehenden Schutzrechte. Dadurch ist die Anwendung extrem teuer und kann so z. B. in Entwicklungs- und Schwellenländern oftmals nicht genutzt werden. Ziel der Erfindung war es deshalb, ein alternatives System zu finden, welches ebenfalls die Durchführung eines homogenen Assays erlaubt und dieselben Anwendungsfelder bedienen kann.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Lösungen zu beseitigen bzw. alternative Lösungen bereitzustellen.
  • Lösung der Aufgabe
  • Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Nachweissystem, was eine komplette Alternative zu den bestehenden Real-Time-PCR-Nachweistechnologien darstellt.
  • Dabei handelt es sich um ein rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von Nukleinsäuren in Echtzeit.
  • Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem stellt ein oder mehrere Paare von einander jeweils zugeordneten Oligonukleotiden dar. Die Oligonukleotide des jeweiligen Paares sind partiell oder vollständig komplementär. Ein Oligonukleotid des Paares besitzt darüber hinaus eine Komplementarität zur Target-Nukleinsäure. Dabei ist die Hybridisierungstemperatur einer der Sonden zur Targetnukleinsäure höher als die Hybridisierungstemperatur zwischen den Sonden des jeweiligen Paares. Dabei ist eine Sonde mit einem Reporterfarbstoff (im allgemeinen Sinne) und die andere Sonde des jeweiligen Paares mit entsprechendem Quencherfarbstoff markiert.
  • Eine Amplifikationsreaktion mit dem rehybridisierenden Sondensystem ist in 1 dargestellt.
  • Am Anfang der PCR sind die jeweiligen Oligonukleotidpaare miteinander hybridisiert und die Fluoreszenz der Probe in Folge eines FRET-Effekts gequencht. Nachfolgend werden die Doppelhelixbindungen bei 95°C denaturiert. Nach der Abkühlung der Reaktion auf die Hybridisierungstemperatur 1 (Anealing, HT1) wird die Targetnukleinsäure mithilfe der im Reaktionsansatz enthaltenen Primer amplifiziert. Gleichzeitig bindet auch die zu der Targetsequenz komplementäre Sonde, die während der Vervielfältigungsreaktion der Targetnukleinsäure von der 5'-3' Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase zerstört wird. Anschließend wird der PCR-Mix auf die Hybridisierungstemperatur des jeweiligen Sondenpaares (Reanealing, HT2) abgekühlt. Die freien Sonden rehybridisieren und die Fluoreszenz der nach der Reaktion übrig gebliebenen Sonde wird gequencht. Die von der Taq-Polymerase zerstörten Sonden können aber nicht rehybridisieren, wobei die Quenchung verhindert wird. Diese Freisetzung der Fluoreszenz liegt überraschenderweise in der direkten Proportionalität zu dem Amplifikationsgeschehen und liefert daher auch eine quantitative Information über das Vorhandensein der Targetnukleinsäure.
  • Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem offenbart in einer weiteren speziellen Ausführungsform überraschenderweise einen zusätzlichen und erheblichen Vorteil. So führt die Verwendung von zwei Sonden in einem Reaktionsansatz zu einer viel höheren diagnostischen Sensitivität. Dabei bindet eine erste Sonde an den „Plus-Strang” und eine zweite Sonde an den „Minus-Strang” der Targetnukleinsäure. Wenn beide Sonden mit demselben Farbstoff markiert sind, führt diese Ausführungsform zu einer deutlich höheren Fluoreszenz sowie zu früheren CT-Werten bei der Echtzeit-Messung. Diese Beobachtung ist im Ausführungsbeispiel dargestellt. Damit kann eine viel höhere diagnostische Sensitivität erreicht werden, als z. B. mit einem System, welches eine dem Stand der Technik entsprechende TaqMan-Sonde zur quantitativen Echtzeitmessung benutzt. Die erfindungsgemäße Verwendung von zwei Sonden offenbart überraschenderweise noch einen weiteren wesentlichen Vorteil. Über die Nutzung einer zweiten Sonde wird es möglich, einen zweiten Detektionssequenzbereich in die Nachweisreaktion einzuführen. Dies ist gerade dann bedeutsam, wenn spezifische Zielsequenzen durch Mutationen häufig variieren. Mit einer zweiten Sonde kann somit ein größerer Sequenzbereich spezifisch für die Nachweisreaktion abgedeckt werden. In einem solchen Fall kann die zweite Sonde dann z. B. auch mit einem anderen Farbstoff markiert sein als die erste Sonde. Damit können dann beide Sonden unabhängig voneinander gemessen und detektiert werden. Die Platzierung von mehreren Sonden kann auch ggf. auf dem gleichen Strang der Zielnukleinsäure erfolgen.
  • Mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren steht somit ein alternatives Verfahren zur qualitativen und quantitativen Echtzeitmessung von Nukleinsäuren zur Verfügung, welches gegenüber dem Stand der Technik eingesetzter Verfahren sogar noch deutliche Vorteile aufzeigt. Darüber hinaus handelt es sich auch um ein homogenes Assay-Format, welches universell einsetzbar ist und auch mit allen eingesetzten Geräten zur Echtzeitmessung von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren und Testkit eignen sich bestens für einen Salmonellen-Test
  • Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem stellt ein oder mehrere Paare von einander jeweils zugeordneten Oligonukleotiden dar. Die Oligonukleotide des jeweiligen Paares sind partiell oder vollständig komplementär. Ein Oligonukleotid des Paares besitzt darüber hinaus eine Komplementarität zur Target-Nukleinsäure. Dabei ist die Hybridisierungstemperatur einer der Sonden zur Targetnukleinsäure höher als die Hybridisierungstemperatur zwischen den Sonden des jeweiligen Paares. Dabei ist eine Sonde mit einem Reporterfarbstoff (im allgemeinen Sinne) und die andere Sonde des jeweiligen Paares mit entsprechendem Quencherfarbstoff markiert.
  • Die Messung der Fluoreszenz erfolgt während des Schrittes der Rehybridisierung (im Gegensatz dafür wird bei Taqman während des Annealing Schrittes/Extension gemessen).
  • Die Sondenmarkierung mit sämtlichen dafür geeigneten Farbstoffen (Reporter/Quencher Systeme), sowie Umkehrung der Farbstoffe sind auch möglich.
  • Die Sonde die an das Target bindet, sollte modifiziert sein, damit keine Verlängerung erfolgt (z. B. Phosphorylierung, etc.).
  • Die andere Sonde soll vorzugsweise kürzer sein, als Sonde fürs Target oder eine nichtkomplementäre Sequenz zur Targetsonde besitzen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Doppelsondensystem mit gleicher Markierung zur Steigerung der Sensitivität verwendet.
  • Es ist auch möglich, ein Doppelsondensystem mit unterschiedlicher Markierung zur zusätzlichen Targetdiskriminierung zu verwenden.
  • Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt. Dabei stellen die Ausführungsbeispiele keine Limitierung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.
  • Ausführungsbeispiel 1:
  • Testung der Hybridisierung, Denaturierung und Rehybridisierung der Sondenpaare.
  • Dieser Versuch belegt, dass die Sondenpaare (Reporter/Quencher) FAM/BHQ1 und ROX/BHQ2 die Fluoreszenz der Probe in der Abhängigkeit von der Temperatur verändern. Dieses Experiment beweist darüber hinaus, dass es sich nicht um die herkömmlichen „TaqMan”-Sonden handelt ( FAM/BHQ1; ROX/BHQ2). Alle Messungen wurden auf dem Real-Time-PCR-Gerät (QTower; Analytik Jena AG) durchgeführt.
  • Es wurden folgende Ansätze getestet:
  • Ansatz A:
  • 15 μl-PCR-Ansatz mit 2 FAM bzw. BHQ1 markierten Sondenpaaren. Jede FAM-markierte Sonde wurde in einer Konzentration von 0,15 pmol/μl des PCR-Ansatzes der Reaktion zugefügt. ( ; 1-6) Sondenpaar 1:
    Figure 00060001
    Sondenpaar 2:
    Figure 00060002
  • Ansatz B
  • 15 μl PCR-Ansatz mit einer FAM/BHQ-markierten TaqMan-Sonde der gleichen Sequenz wie die Sonde 1A in der Konzentration 0,3 pmol/μl des PCR-Ansatzes (2a; 7-9).
    Figure 00070001
  • Bei der Erhöhung der Cycler-Temperatur bis 95°C wurde bei den PCR-Proben mit der FAM/BHQ1-markierten Sonde kein relevanter Anstieg der Fluoreszenz beobachtet. Die geringe Fluoreszenzerhöhung dieser Sonde ist durch die „Streckung” der Sonde zu erklären. Ein solcher „Fluoreszenzanstieg” wird z. B. bei der Patentschrift EP 0 826 066 B1 als Messgröße verwendet. Bei dem erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystem zeigt sich ein anderes Temperaturverlaufsbild:
    • – Bei einer Temperatur von 40°C (dies ist die Hybridisierungstemperatur des jeweiligen Sondenpaares) ist die Fluoreszenz niedrig.
    • – Bei einer Erhöhung der Temperatur auf 95°C denaturiert die Wasserstoffbindung zwischen den beiden Sonden des Paars, FAM und BHQ1 verlieren ihre räumliche Nähe und die Fluoreszenz der Probe steigt um das drei- bis vierfache an.
    • – Dieser Prozess scheint auch reversibel zu sein. Eine Temeraturverringerung auf die Hybridisierungstemperatur des Sondenpaars führt zur Rehybridisierung der Sonden. Dieser Prozess bewirkt dann ein erneutes deutliches Absinken der Probenfluoreszenz.
  • Ansatz 3
  • 15 μl-PCR-Ansatz mit jeweils nur einem ROX bzw. BHQ2 markierten Sondenpaar. Die ROX-markierte Sonde wurde in einer Konzentration von 0,15 pmol/μl des PCR-Ansatzes der Reaktion zugefügt. (2b 1-3 nd 4-6) Sondenpaar 1:
    Figure 00070002
    Sondenpaar 2:
    Figure 00070003
  • Figure 00080001
  • Ansatz 4
  • 15 μl-PCR-Ansatz mit zwei ROX bzw. BHQ2 markierten Sondenpaaren (wie bei Punkt 3 beschrieben (7-9).
  • Bei diesem Ansatz konnte man gleichfalls eine Denaturierung und Rehybridisierung der ROX-BHQ2-Sondenpaare während der Temperaturveränderung beobachten. Dies eröffnet eine Möglichkeit für den multiplexen Nachweis der Proben. Darüber hinaus sieht man, dass die Anwendung von zwei Sondenpaaren zu einer deutlichen Signalverstärkung führt. Dies ermöglicht die Steigerung der diagnostischen Sensitivität.
  • Ausführungsbeispiel 2
  • Relative Quantifizierung einer unbekannten Probe mittels des erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystem.
  • Im Ansatz werden zwei Salmonellen-DNA-Proben mit einer unbekannten Konzentration und eine Standardverdünnungsreihe amplifiziert. Die Reaktion wurde auf einem anderen Real-Time-Gerät (BioRad) durchgeführt. Die Target-Nukleinsäure (HilA-Gen von Salmonella sp.) wurde mit folgenden Primern amplifiziert: PCR-Primer:
    Figure 00080002
    Rehybrydisierende Sondenpaare Sondenpaar 1:
    Figure 00080003
    Sondenpaar 2:
    Figure 00090001
    Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)
    Pro Probe:
    sense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl
    antisense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl
    Sonden (je 25 pmol/μl) je 0,1 μl
    dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μl
    10X PCR-Buffer (MgCl2 included) 1,5 μl
    Taq-DNA-Polymerase 0,75 U
    PCR-Grade H2O add 15 μl
  • Zur Testung wurden auch 3 negative Proben (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H2O) eingesetzt. Amplifikations-/Hybridisierungskonditionen
    Schritt 1: Denaturierung 95°C 180''
    Schritt 2: Amplifizierung/Rehybridisierung 45 Zyklen
    95°C 10''
    52°C 10''
    40°C 30''
  • Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Rehybridisierungsphase (40°C) jedes Zyklus (3a und 3b).
  • 3a zeigt die Real-Time-PCR-Ergebnisse
    • S:
    Standard- Verdünnungsreihe
    P:
    Probe
    N:
    Negativkontrolle
  • 3b zeigt die Standardkurve der getesteten Proben
  • Die nachfolgende Tabelle 1 enthält die jeweiligen Ct-Werte und die Berechnung der relativen Probenkonzentration. Quantification Data
    Figure 00100001
    Tabelle 1
  • Dieser Versuch beweist, dass das erfindungsgemäße Sondensystem eine relative Quantifizierung der Targetnukleinsäure, ähnlich wie bei einer Real-Time-TaqMan-Quantifizierung ermöglicht. Das erfindungsgemäße rehybridisierende Sondensystem funktioniert auch auf gängigen kommerziell verfügbaren Geräten und kann damit auf diesen Systemen als eine Alternative zu TaqMan-Tests eingesetzt werden, ohne das ein neues Gerätesystem benötigt wird.
  • Ausführungsbeispiel 3
  • Vergleich einer relativen Quantifizierung einer unbekannten Probe mittels des rehybridisierenden Sondensystems und mittels herkömmlichen TaqMan Sonden.
  • Es werden zwei unterschiedliche Real-Time-PCR-Ansätze mit den gleichen Standardreihen und Proben gegeneinander getestet. Die Reaktionen wurden auf einem dritten Real-Time-Gerät (Eppendorf AG) durchgeführt. Die Target-Nukleinsäure (HilA-Gen von Salmonella sp.) wurde in beiden Fällen mit folgenden Primern amplifiziert: PCR-Primer
    Figure 00110001
    Ansatz 1: Erfindungsgemäße rehybrydisierende Sondenpaare: Sondenpaar 1:
    Figure 00110002
    Sondenpaar 2:
    Figure 00110003
    Ansatz 2: TaqMan-Sonde:
    Figure 00110004
    Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)
    Pro Probe:
    sense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl
    antisense Primer (50 pmol/μl) 0,1 μl
    Sonden (je 25 pmol/μl) je 0,1 μl
    dNTP-Mix (12,5 mM) 0,3 μl
    10X PCR-Buffer (MgCl2 included) 1,5 μl
    Taq-DNA-Polymerase 0,75 U
    PCR-Grade H2O add 15 μl
  • Zur Testung wurden auch 3 negative Proben (beinhaltend nur PCR-Chemikalien und H2O) eingesetzt. Amplifikations-/Hybridisierungskonditionen Ansatz 1
    Schritt 1: Denaturierung 95°C 120''
    Schritt 2: Amplifizierung/Rehybridisierung 40 Zyklen
    95°C 15''
    52°C 15''
    40°C 40''
  • Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Rehybridisierungsphase (40°C) jedes Zyklus (4a). Amplifikations-/Hybridisierungskonditionen Ansatz 2
    Schritt 1: Denaturierung 95°C 120''
    Schritt 2: Amplifizierung 40 Zyklen
    95° C15''
    53°C 60''
  • Die Messung der freigesetzten Fluoreszenz erfolgte in Echtzeit während der Anealingphase (53°C) jedes Zyklus (4b).
  • Die nachfolgenden Tabellen 2 und 3 zeigen die jeweiligen Ct-Werte und die Ergebnisse der relativen Quantifizierung im Vergleich der beiden Nachweissysteme. Tabelle 2: Ansatz mittels des erfindungsgemäßen rehybridisierenden Sondensystems
    Pos Name Ct FAM Amount FAM [Copies]
    B2 Std_1/1 20,79 1,00
    B3 Std_0.1/1 25,48 0,100
    B4 Std_0.01/1 28,72 1,000E-2X
    B5 Std_0.001/1 32,31 1,000E-3X
    B6 Std_0.0001/1 35,94 1,000E-4X
    B8 2 30,20 4,170E-3X
    C2 Std_1/1 21,05 1,00
    C3 Std_0.1/1 26,09 0,100
    C4 Std_0.01/1 28,93 1,000E-2X
    C5 Std_0.001/1 32,53 1,000E-3X
    C6 Std_0.0001/1 36,15 1,000E-4X
    C8 2 30,51 3,440E-3X
    E6 3 -
    E7 3 -
    E8 3 -
    Tabelle 3: Ansatz mit TaqMan-System
    Name Ct FAM Amount FAM [Copies]
    1_1/1 21,39 1,00
    1_0.1/1 25,47 0,100
    1_0.01/1 29,09 1,000E-2X
    1_0.001/1 32,77 1,000E-3X
    1_0.0001/1 35,71 1,000E-4X
    2 30,23 3,750E-3X
    1_1/1 21,06 1,00
    1_0.1/1 25,62 0,100
    1_0.01/1 29,04 1,000E-2X
    1_0.001/1 32,64 1,000E-3X
    1_0.0001/1 34,59 1,000E-4X
    2 29,84 4,830E-3X
    3 - -
    3 - -
    3 - -
  • Wie man aus den Versuchsergebnissen entnehmen kann, sind die Ergebnisse mit beiden Systemen sowohl in Bezug auf die R^2-Werte, die PCR-Effizienz, die Ct-Werte und die Methodensensitivität absolut vergleichbar.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 5210015 [0007]
    • US 5487972 [0007]
    • EP 0826066 B1 [0034]

Claims (9)

  1. Verfahren zur RealTime- bzw. Endpunkt-Bestimmung von Nukleinsäuren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellung mindestens eines miteinander hybridisierten Sondenpaares, welches eine Hybridisierungstemperatur aufweist, die niedriger ist als die Hybridisierungstemperatur einer dieser Sonden zur Nukleinsäure (Target), wobei die eine Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die ein auswertbares Signal erzeugt ist und die andere Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die dieses Signal aufheben kann in einem konventionellen Amplifikationsansatz mit einer Polymerase mit 5'-3' Exonukleaseaktivität b) Erwärmen der zu bestimmenden Nukleinsäure und des miteinander hybridisierten Sondenpaares auf eine Temperatur, so dass sowohl eine Strangtrennung des Sondenpaares als auch der Nukleinsäure erfolgt c) Abkühlung des Ansatzes auf eine Temperatur, bei der eine Sonde mit einem Strang der Nukleinsäure (Target) hybridisiert, Zugabe, wobei die Nukleinsäure amplifiziert und die an die Nukleinsäure hybridisierte Sonde durch die 5'-3' Exonukleaseaktivität der Polymerase gespalten wird. d) Abkühlung des Ansatzes auf eine Temperatur, bei der das ursprüngliche Sondenpaar re-hybridisiert. e) Bestimmung der Nukleinsäuren durch Auswertung des Signals, das nach der Rehybridisierung vorhanden ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde, die mit dem Target hybridisiert, gegen eine Verlängerung geschützt ist, vorzugsweise mittels Phosphorylierung.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde, die mit dem Target hybridisiert, länger ist als die andere Sonde des Sondenpaares oder die andere Sonde eine zum Target nicht-komplementäre Sequenz enthält.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Markierungen der Sonden um Farbstoffe, vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffe, bzw. Quencher handelt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein miteinander hybridisiertes Sondenpaar eingesetzt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere miteinander hybridisierte Sondenpaare eingesetzt werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen Sondenpaare unterschiedliche Markierungen aufweisen.
  8. Testkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend a) mindestens ein miteinander hybridisiertes Sondenpaares, welches eine Hybridisierungstemperatur aufweist, die niedriger ist als die Hybridisierungstemperatur einer dieser Sonden zur Nukleinsäure (Target), wobei die eine Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die ein auswertbares Signal erzeugt ist und die andere Sonde des Sondenpaares mit einer Markierung versehen ist, die dieses Signal aufheben kann. b) an sich bekannte Primer und eine Polymerase mit 5'-3' Exonukleaseaktivität c) an sich bekannte Geräte zum Erwärmen, Abkühlen und Auswerten des Mess-Signals.
  9. Verwendung des Verfahrens oder des Testkits zum Nachweis von Salmonellen.
DE201110078342 2011-06-29 2011-06-29 Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit Withdrawn DE102011078342A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE201110078342 DE102011078342A1 (de) 2011-06-29 2011-06-29 Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit
PCT/EP2012/062575 WO2013001005A1 (de) 2011-06-29 2012-06-28 Rehybridisierendes sondensystem zur qualitativen und quantitativen messung von spezifischen nukleinsäuren in echtzeit

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE201110078342 DE102011078342A1 (de) 2011-06-29 2011-06-29 Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102011078342A1 true DE102011078342A1 (de) 2013-01-03

Family

ID=46583959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE201110078342 Withdrawn DE102011078342A1 (de) 2011-06-29 2011-06-29 Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102011078342A1 (de)
WO (1) WO2013001005A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016083354A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Roche Diagnostics Gmbh Detecting single nucleotide polymorphism using overlapping hydrolysis probes

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
EP0826066B1 (de) 1995-05-05 2000-09-13 The Perkin-Elmer Corporation Methoden and reagentien fuer die kombination einer pcr-amplifizierung mit einem hybridisierungs-assay
US6150097A (en) * 1996-04-12 2000-11-21 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Nucleic acid detection probes having non-FRET fluorescence quenching and kits and assays including such probes
DE69429626T2 (de) * 1993-09-03 2002-09-12 Abbott Laboratories, Abbott Park Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis
US20080213792A1 (en) * 2003-04-30 2008-09-04 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Homogeneous Multiplex Screening Kits
US20090111170A1 (en) * 2003-05-19 2009-04-30 Brandeis University Nucleic acid processing methods, kits and devices
US20090286694A1 (en) * 2006-08-21 2009-11-19 Gafur Zainiev Nucleic acid array with releaseable nucleic acid probes
US20100056388A1 (en) * 2006-08-21 2010-03-04 Cnvgenes, Inc. Nucleic acid array having fixed nucleic acid anti-probes and complementary free nucleic acid probes

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1348096A (zh) * 2000-10-10 2002-05-08 栾国彦 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法
CA2548205C (en) * 2003-12-03 2017-06-27 Abbott Laboratories Double stranded linear nucleic acid probe and uses thereof
GB0510979D0 (en) * 2005-05-28 2005-07-06 Kbiosciences Ltd Detection system for PCR assay
EP2059614A4 (de) * 2006-08-15 2010-06-30 Zygene Biotech Llc Sonden-gegensonden-zusammensetzungen und verfahren für dna- oder rna-nachweis

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5487972A (en) 1990-08-06 1996-01-30 Hoffmann-La Roche Inc. Nucleic acid detection by the 5'-3'exonuclease activity of polymerases acting on adjacently hybridized oligonucleotides
DE69429626T2 (de) * 1993-09-03 2002-09-12 Abbott Laboratories, Abbott Park Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Chlamydia trachomatis
EP0826066B1 (de) 1995-05-05 2000-09-13 The Perkin-Elmer Corporation Methoden and reagentien fuer die kombination einer pcr-amplifizierung mit einem hybridisierungs-assay
US6150097A (en) * 1996-04-12 2000-11-21 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Nucleic acid detection probes having non-FRET fluorescence quenching and kits and assays including such probes
US20080213792A1 (en) * 2003-04-30 2008-09-04 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Homogeneous Multiplex Screening Kits
US20090111170A1 (en) * 2003-05-19 2009-04-30 Brandeis University Nucleic acid processing methods, kits and devices
US20090286694A1 (en) * 2006-08-21 2009-11-19 Gafur Zainiev Nucleic acid array with releaseable nucleic acid probes
US20100056388A1 (en) * 2006-08-21 2010-03-04 Cnvgenes, Inc. Nucleic acid array having fixed nucleic acid anti-probes and complementary free nucleic acid probes

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gidwani V. u.a.: Hybridization kinetics of double-stranded DNA probes for rapid molecular analysis. In: Analyst. (2009) 134(8) 1675-81. *
Li Q. u.a.: A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization. In: Nucleic Acids Res. (2002) 30 (2) E5. *
Marras S.A. u.a.: Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. In: Clin. Chim. Acta. (2006) 363 (1-2) 48-60. *
Mo Z.H. u.a.: A nanogold-quenched fluorescence duplex probe for homogeneous DNA detection based on strand displacement. In: Anal. Bioanal. Chem. (2007) 389 (2) 493-7. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016083354A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Roche Diagnostics Gmbh Detecting single nucleotide polymorphism using overlapping hydrolysis probes

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013001005A1 (de) 2013-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69733958T2 (de) Verfahren zur positionierung von klonen mittels molekularen kaemmens
EP2167685B1 (de) Verfahren und sonden/primersystem zum "real time" nachweis eines nukleinsäuretargets
DE112013004650T5 (de) Multiplexpyrosequenzierung unter Verwendung nichtinterferierender, rauschbeendender Polynukleotididentifikationstags
DE102004036285A1 (de) Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
DE60204874T2 (de) Verfahren zur nachweis von nukleinsäuren
EP3830292B1 (de) Verfahren zur durchführung einer echtzeit-pcr
DE69839235T3 (de) Fluorometrisches Verfahren zur Überwachung und zum Nachweis von Nukleinsäure- Amplifizierung
DE102007029772B4 (de) Verfahren und Schnelltest zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen
DE102007013099A1 (de) Verfahren und Testkit zum schnellen Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, insbesondere zum Nachweis von Mutationen oder SNP's
DE60313828T2 (de) Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonden welches auf der Analyse von Schmelzkurven basiert
DE112020000525B4 (de) Verfahren zum nachweis mehrerer ziele basierend auf einer einzigen nachweissonde unter verwendung eines markierungs-sequenz-snp
EP1064408A1 (de) Verfahren zum nachweis einer nukleotidsequenz
WO2011020588A1 (de) Verfahren zum nachweis von zielnukleinsäuren
EP2556168B1 (de) Verfahren zum nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen
WO2012069484A2 (de) Verfahren zum qualitativen und quantitativen nachweis von spezifischen nukleinsäuresequenzen in echtzeit
DE102011078342A1 (de) Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit
WO2009127408A1 (de) Verfahren zur quantitativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer probe
DE112018008028B4 (de) Verfahren zur mehrfachanalyse von amplikon unter verwendung der fluoreszenzbasierten mehrfachschmelzanalyse
DE10242359A1 (de) Verfahren zur Amplifikation genetischer Informationen
DE112022005006T5 (de) Verfahren und zusammensetzungen zur detektion mutierter nukleinsäuresequenzen
WO2012016936A1 (de) Nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen mittels fluoreszenz - quenching
DE102005051816A1 (de) Verfahren zur relativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe
DE102010033107A1 (de) Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mittels Fluoreszenzlöschung
DE19834913A1 (de) Markierter Primer zum Nachweis amplifizierter Nukleinsäuren
DE10159904A1 (de) Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnachweis sowie Vorrichtung hierfür

Legal Events

Date Code Title Description
R079 Amendment of ipc main class

Free format text: PREVIOUS MAIN CLASS: C12M0001340000

Ipc: C12Q0001680000

R163 Identified publications notified
R012 Request for examination validly filed
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee