DE102012011647B4

DE102012011647B4 - Analyse von Mikroben aus Mikrokolonien mittels MALDI-Massenspektrometrie

Info

Publication number: DE102012011647B4
Application number: DE102012011647.0A
Authority: DE
Inventors: Lasch Peter; Prof. Dr. Naumann Dieter; Stämmler Maren; Thomas Maier; Jens Boßmeyer
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2020-07-02
Anticipated expiration: 2032-06-09
Also published as: US20150136972A1; JP6143385B2; EP2859346A1; CN104380109A; EP2859346B1; CN104380109B; DE102012011647A1; US9171709B2; JP2015520382A; WO2013182648A1

Abstract

Ein Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben aus Kolonien auf einer Nährmitteloberfläche in einem Massenspektrometer, mit den Schritten:(a) Mikroben werden von der Nährmitteloberfläche durch direkten Kontakt mit der Kontaktfläche eines Probenträgers auf die Kontaktfläche übertragen,(b) die übertragenen Mikroben werden auf der Kontaktfläche des Probenträgers aufgeschlossen, und(c) der Probenträger mit den molekularen Bestandteile der aufgeschlossenen Mikroben wird dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt.

Description

Anwendungsgebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren für die massenspektrometrische Analyse von Mikroben aus Kolonien auf Nährmitteloberflächen, insbesondere in einem Massenspektrometer mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption (MALDI).
Stand der Technik
Die routinemäßig schnelle und fehlerfreie Analyse von Mikroorganismen spielt insbesondere in der klinischen und außerklinischen Infektionsdiagnostik, in der Hygieneüberwachung in Krankenhäusern oder Badegewässern, in der Lebensmittelanalytik, bei der Überwachung und Regelung von biotechnologischen Prozessen oder in der forschenden Mikrobiologie eine wichtige Rolle. Zu den Mikroorganismen, die hier kurz als Mikroben bezeichnet werden, zählen alle mikroskopisch kleinen Lebewesen, beispielsweise einzellige Pilze (z.B. Hefen), Algen oder Protozoen (z.B. Plasmodien als Malaria-Erreger), wenn auch meist der Schwerpunkt der Identifizierungsarbeit auf Bakterien liegt.
Die Identifizierung der Mikroben bedeutet im Prinzip die Bestimmung der Art und damit die Einordnung der Mikroben in das taxonomische Hierarchieschema: Domäne (Bakterien, Archäen, Eukaryoten), Reich, Abteilung, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung und Art (Spezies). Da die Bezeichnung „Art“ im deutschsprachigen Raum vielfach und in wechselnden Bedeutungen gebraucht wird, wird hier vorwiegend die Bezeichnung „Spezies“ gebraucht. Neben der taxonomischen Identifizierung kann die Analyse von Mikroben auch deren Charakterisierung in Bezug auf andere Eigenschaften umfassen, beispielsweise auf die Pathogenität eines Mikroorganismus (Fähigkeit, eine Krankheit auszulösen) oder auf die Resistenz eines Mikroorganismus gegenüber Antibiotika.
Für massenspektrometrische Identifizierungsverfahren werden in der Regel Mikroben aus Analysenproben auf Nährmedien in Petrischalen zu Kolonien herangezüchtet. Die Zeitdauer von der Anlieferung der Analysenproben im Untersuchungslabor bis zur Identifizierung der Spezies wird im Wesentlichen durch diese Zeitdauer der Kultivierung vorgegeben, da die eigentliche massenspektrometrische Bestimmung nur Minuten dauert. Die Zeitdauer für diese Kultivierung beträgt gegenwärtig oft zwischen 18 bis 24 Stunden. Diese Zeitdauer ist für viele Anwendungen zu lang, insbesondere für Anwendungen in der medizinischen Diagnostik. Es besteht daher ein dringender Bedarf, die für die massenspektrometrische Identifizierung benötigte Zeitdauer wesentlich, insbesondere auf einen Arbeitstag, zu verkürzen.
Für die gegenwärtig durchgeführten Verfahren befindet sich das Nährmedium für die Anzucht üblicherweise in einem Agar in einer Petrischale (Agar-Platten), wodurch eine Züchtung von jeweils reinen „Isolaten“ in getrennten Kolonien erreicht wird. Agar ist ein gelatinöses Galactose-Polymer mit weit über 90 Prozent Wasser. Das Agar selbst ist unverdaulich und wird von Mikroben kaum angegriffen. Da die Mikroben gegenwärtig überwiegend manuell entnommen werden, sollten die Kolonien für eine sichere Entnahme der Mikroben Durchmesser von mindestens einem halben Millimeter, besser von mindestens einem Millemeter aufweisen. Die Zeitdauer der Züchtung von Kolonien dieser Größe dauert je nach Wachstumskraft der Mikroben viele Stunden oder manchmal sogar Tage; für die klinisch bedeutsamen Spezies werden die Proben auf Agar-Platten gegenwärtig normalerweise etwa 18 bis 24 Stunden kultiviert. Überlagern oder mischen sich die Kolonien, so werden in einer zweiten Züchtung getrennte Kolonien gewonnen.
Bei der manuellen Präparation einer MALDI-Probe wird eine kleine Menge einer ausgewählten Kolonie von der Nährmitteloberfläche auf einen Probenträger übertragen, wozu in der Praxis oft ein hölzerner Zahnstocher verwendet wird, der danach entsorgt wird. Die übertragene Mikrobenmenge wird dann für eine spätere Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) mit einer stark angesäuerten Lösung einer üblichen Matrixsubstanz (meist α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, HCCA, aber auch 2,5-Dihydroxybenzoesäure, DHB) beträufelt (Matrixlösung). Die Säure (meist Ameisensäure oder Trifluor-Essigsäure) greift die Zellwände an, worauf das organische Lösungsmittel (meist Acetonitril) der Matrixlösung in die mikrobiellen Zellen eindringen und deren geschwächte Zellwände osmotisch platzen lassen kann. Das Zerstören der an sich widerstandsfähigen Zellwände wird „Aufschluss“ genannt; durch den Aufschluss werden die löslichen Proteine aus der Zelle freigesetzt. Anschließend wird die Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels getrocknet, wobei das gelöste Matrixmaterial auskristallisiert. Die freigesetzten löslichen Proteine der Mikroben, in geringem Umfang auch andere Substanzen der Zelle, werden dabei während der Kristallisation in die Matrixkristalle eingebaut. Es entsteht dabei auf dem Probenträger eine Probenpräparation, die im Folgenden „MALDI-Probe“ genannt wird.
Die MALDI-Proben mit den eingebauten Analytmolekülen werden in einem Massenspektrometer mit fokussierten UV-Laserlichtblitzen von wenigen Nanosekunden Dauer beschossen, wobei in den Verdampfungsplasmen Ionen der Analytmoleküle entstehen, die dann im Massenspektrometer nach Ionenmassen voneinander getrennt und gemessen werden können. Für die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroben werden derzeit zur Erzielung höchster Empfindlichkeit einfache Flugzeitmassenspektrometer ohne Reflektor verwendet.
Das Massenspektrum ist das Profil der Massenwerte der Analytionen aus den Mikroben. Es handelt sich dabei ganz vorwiegend um Proteinionen, wobei die Ionen mit nützlichster Information für die Identifizierung Massen zwischen etwa 3000 Dalton bis 15000 Dalton haben. Die Proteinionen sind bei diesem Verfahren ganz überwiegend nur einfach geladen (Ladungszahl z = 1), weshalb hier auch einfach von der Masse m der Ionen gesprochen werden kann, statt immer den Begriff der „ladungsbezogenen Masse“ m/z zu verwenden, wie es eigentlich in der Massenspektrometrie notwendig ist. Die Identifizierung wird durch Ähnlichkeitsvergleiche der von den Mikroben aufgenommenen Massenspektren mit Referenzspektren einer Referenzbibliothek durchgeführt, siehe dazu das Dokument DE 10 2010 006 450 A1 (M. Kostrzewa), das auch eine detaillierte Schilderung des massenspektrometrischen Verfahrens enthält. Es sind heute in der Medizin verwendbare Referenzbibliotheken mit Referenzmassenspektren von einigen Tausend Mikrobenstämmen kommerziell erhältlich.
Das massenspektrometrische Verfahren zur Identifizierung ist sehr robust; Änderungen der Züchtungsbedingungen oder der Präparationsverfahren wirken sich praktisch nicht auf die Identifizierungsergebnisse aus, weil für jede Spezies praktisch nur genetisch vorgegebene Proteine mit genetisch vorgegebenen Häufigkeiten analysiert werden. Etwa 60 bis 85 Prozent der Proteine stammen aus den Ribosomen, die je nach Spezies eine feste Anzahl zwischen 40 und 60 verschiedener Proteine enthalten. Bakterienzellen enthalten jeweils mehrere Zehntausend identische Ribosome, Zellen von Eukarioten mehrere Hunderttausend. Die Häufigkeiten der gemessenen Proteine hängen daher nicht von Nährbedingungen oder Reife der Kolonie ab, wie es beispielsweise bei Lipoproteinen oder bei den als Energiespeicher dienenden Fettsäuren der Fall ist. Die Robustheit des Verfahrens erlaubt es, Mikroben aus sehr jungen, aus reifen oder sogar aus überalterten Kolonien für die Identifizierung zu verwenden, wobei etwa gleiche Identifizierungserfolge erreicht werden.
Bisher gilt als Faustregel, dass mindestens etwa 10⁵ Mikroben für die Präparation der MALDI-Probe auf der Probenplatte benötigt werden, um eine sichere massenspektrometrische Identifizierung der Mikroben zu gewährleisten. Diese Menge ist kaum mit dem bloßen Auge erkennbar. Mengen zwischen 10⁵ und 10⁷ sind besonders geeignet. Für Eukariotenzellen mit mehreren Hunderttausend Ribosomen ist es bereits gelungen, von einzelnen Zellen brauchbare Massenspektren aufzunehmen. Für Bakterien aber, deren harte Zellwände einen besonderen Aufschluss verlangen, ist es bisher nur in Einzelfällen gelungen, von nur 10³ Individuen oder weniger genügend gute Massenspektren für eine Identifizierung zu erzeugen.
Das massenspektrometrische Verfahren der Identifizierung hat sich als außerordentlich erfolgreich erwiesen. Es ist ab vollendeter Kultivierung sehr schnell, und die Sicherheit für eine richtige Identifizierung ist weit größer als diejenige der bisher angewandten mikrobiologischen Identifizierungsverfahren, wie in verschiedenen Studien nachgewiesen werden konnte.
Das massenspektrometrische Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Mikroben aus einer reinen Kultur von Mikroben, einem so genannten „Isolat“. Das Massenspektrum einer Reinkultur enthält keine Überlagerungen von Signalen anderer Mikroben. Es hat sich jedoch gezeigt, dass notfalls auch Massenspektren von Mischungen aus zwei Mikrobenspezies ausgewertet werden können, und dass beide Spezies identifiziert werden können (siehe beispielsweise das Dokument DE 10 2009 007 266 A1 , M. Kostrzewa et al.). Die Identifizierungssicherheit leidet nur geringfügig.
Das Bestreben nach Automatisierung hat zu Vorrichtungen geführt, die die manuelle Übertragung durch eine maschinelle Übertragung mit einem kleinen Stempelstäbchen ersetzt. So hat das Fraunhofer-Institut für Fabrikbetrieb und -automatisierung (Magdeburg) einen Roboter namens „MiRob“ entwickelt, der diese Aufgabe übernehmen kann (siehe: O. Lange et el. (2008) „MIROB: automatic rapid identification of micro-organisms in high through-put“, Industrial Robot: An International Journal, Vol. 35 Iss: 4, pp.311 - 315 oder Patent DE 10 2004 020 885 B2 ). Der Roboter wird als MiRob 300i von der Firma Mess-, Prüf- und Handlungs-Systeme GmbH, Reutlingen, hergestellt. Auch hier werden, wie schon bei der manuellen Übertragung, die Mikroben von der Kolonie durch ein Werkzeug, hier das Stempelstäbchen, mittelbar auf den massenspektrometrischen Probenträger übertragen. Die Kolonien sollen auch hier einen Mindestdurchmesser von 0,5 Millimetern haben. Die bisher verwendeten Übertragungswerkzeuge (Zahnstocher, Stempelstäbchen) sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Eine direkte Übertragung der Mikroben auf einen analytisch verwendeten Probenträger ist für die Aufnahme von Infrarot-Spektren der Mikroben durch Infrarot-Mikroskopie durch das Dokument EP 0 456 995 B1 (D. Naumann und H. Labischinski, 1989, entsprechend US 5,660,998 A ) bekannt.
Aus der Druckschrift DE 102010033105 A1 ist zudem ein Verfahren zum Nachweis und zur massenspektrometrischen Identifizierung von Mikroben in Körperflüssigkeiten bekannt, in denen Mikroben einer Körperflüssigkeitsprobe nicht auf einer Agar-Platte gezüchtet werden, sondern von der Körperflüssigkeit abgetrennt und in einer Nährbouillon vermehrt werden.
Die Patentschrift US 5,808,300 A offenbart Verfahren zur Aufnahme von massenspektrometrischen Bildern von biologischen Proben mittels MALDI Massenspektrometrie, wobei insbesondere Substanzen aus einem Gewebeschnitt ortsgetreu auf eine Trägermembran (blot membrane) übertragen werden und ortsaufgelöste Massenspektren der Trägermembran aufgenommen werden. Aus der Druckschrift DE 60317314 T2 ist ein Verfahren für die Identifikation und Zuordnung von Biomolekülen bekannt, wobei insbesondere Proteine von einem Gewebeschnitt oder einer bakteriellen Zellkultur mittels Elektroblottens durch eine Verdaumembran gezogen und enzymatisch verdaut werden, die Verdaupeptide ortsgetreu auf eine Einfangmembran übertragen werden und ortsaufgelöste MALDI-TOF Massenspektren der Verdaupeptide aufgenommen werden. Die Druckschrift WO 2003/044825 A1 offenbart Verfahren zur Aufnahme von MALDI Massenspektren von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen, die auf einer Oberfläche angeordnet sind, die nicht eben ist, wodurch eine massenspektrometrische Analyse von Proteinen auf unebenen Trägermembranen mit hoher massenspektrometrischer Auflösung ermöglicht wird.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben anzugeben, deren Zeitbedarf von der Anlieferung von zu untersuchenden Proben (Analysenproben) bis zur Identifizierung gegenüber gegenwärtigen Verfahren wesentlich, bevorzugt auf einen Arbeitstag, verkürzt ist. Das Verfahren soll zudem zuverlässig und automatisierbar sein und wenig Verbrauchsmaterial benötigen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben auf einer Nährmitteloberfläche in einem Massenspektrometer mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption bereit, mit den Schritten: (a) Mikroben werden durch direkten Kontakt auf eine Kontaktfläche eines Probenträgers übertragen, (b) die übertragenen Mikroben werden auf der Kontaktfläche des Probenträgers aufgeschlossen und die molekularen Bestandteile der aufgeschlossenen Mikroben werden zu einer MALDI-Probe präpariert, und (c) der Probenträger mit der MALDI-Probe wird dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt. Der Aufschluss der Mikroben erfolgt dabei bevorzugt durch die Präparation der MALDI-Probe, beispielsweise durch die Zugabe einer entsprechend aggressiven Matrixlösung (Matrixsubstanz in einem stark angesäuerten organischen Lösungsmittel). Anstelle der Ionisierung durch MALDI können auch andere Ionisierungsarten verwendet werden, bei denen sich die zu ionisierenden Substanzen auf einem Probenträger befinden, wie beispielsweise die Clusterionisierung nach EP 1 200 984 B1 , Desorption Electrospray Ionization (DESI) nach WO 2005/094389 A2 oder Matrix Assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (MALDESI) nach DE 10 2004 002 729 A1 . Dabei kann die Präparation einer massenspektrometrischen Probe aus dem Aufschluss der Mikroben auf dem Probenträger bestehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet die meisten der klinisch bedeutsamen Mikroben mit einer Kultivierungszeit von maximal etwa acht Stunden und damit innerhalb eines Arbeitstages zu identifizieren. In dieser kurzen Zeit werden auf Nährmitteloberflächen in der Regel nur Mikrokolonien gebildet, die etwa einen Durchmesser von 50 bis 200 Mikrometer aufweisen. Auch für langsam wachsende Mikroben, die bisher viele Tage kultiviert werden mussten, kann die Zeitdauer auf die Hälfte der Zeit oder sogar weniger reduziert werden.
Mikroben, die für viele diagnostisch relevante Mikroben nach nur sechs- bis achtstündiger Kultivierung entstanden sind, werden durch Auflage von Kontaktflächen der Probenträger mit hoher Übertragungsausbeute direkt auf die Probenträger übertragen, selbst wenn sie nur in Form von Mikrokolonien vorliegen. Die Mikroben werden auf diesen Kontaktflächen aufgeschlossen und die freigesetzten Proteine werden auf der Kontaktfläche der Probenträger mit Matrixmaterial zu MALDI-Proben präpariert. Die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption findet ebenfalls auf den Kontaktflächen der Probenträger statt. Überraschenderweise können aus Mikrokolonien mit nur etwa 1000 Individuen genügend gute Massenspektren gewonnen werden. Die Gründe für diese hohe Empfindlichkeit sind nicht im Einzelnen bekannt: es mag aber sein, dass gegenüber der händischen Übertragung auf einen Probenträger durch den direkten Kontakt nur saubere Mikroben ohne anhängendes Agar-Material und mit nur wenig Nährmittellösung übertragen wird. Zudem gibt es keine Übertragungsverluste von Mikrobenmaterial, das am Übertragungswerkzeug anhaftet und dort verbleibt, ohne auf einen Probenträger übertragen zu werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zudem den Einsatz von Probenträgern mit hohem Adhäsionsvermögen für Mikroben, was für ein Übertragungswerkzeuge insofern ungeeignet ist, da diese das aufgenommene Mikrobenmaterial auch wieder abgegeben müssen. Für die meisten der klinisch bedeutsamen Mikroben kann daher die kritische Zeitspanne von der Anlieferung der Analysenproben bis zur Identifizierung der Mikroben von etwa 18 bis 24 Stunden auf nur etwa acht Stunden reduziert werden.
Der wesentliche Teil der Erfindung besteht somit darin, die Mikroben einer Kolonie, insbesondere einer Mikrokolonie, auf der Oberfläche des Nährmediums, in der Regel einer Agar-Platte, durch direkten Kontakt mit einer geeignet geformten Kontaktoberfläche eines geeigneten Probenträgers auf diese Kontaktoberfläche zu übertragen, ohne Verwendung besonderer Übertragungswerkzeuge wie beispielsweise der oben erwähnten Zahnstocher. Durch diese Kontaktübertragung lässt sich ein weitaus höherer Prozentsatz der Mikroben aus einer Mikrokolonie auf einen Probenträger übertragen, als es mit einem Werkzeug möglich ist. Die Mikroben werden dann direkt auf der Kontaktoberfläche aufgeschlossen und zu einer MALDI-Probe präpariert; der Probenträger mit der Kontaktoberfläche wird dann, gegebenenfalls eingepasst in eine geeignete Adapterplatte, in die Ionenquelle des Massenspektrometers eingeschleust. Die MALDI-Ionisierung findet also direkt auf der Kontaktoberfläche des Probenträgers statt.
Die Mikroben können direkt auf einen stiftförmigen Probenträger (Probenträgerstift) übertragen werden, wobei dieser stirnseitig mit Mikroben in Kontakt gebracht wird. Die Kontaktfläche des stiftförmigen Probenträgers ist so klein ist, dass nur Mikroben einer einzelnen Kolonie auf den stiftförmigen Probenträger übertragen werden. Der stiftförmige Probenträger wird nach der Übertragung von Mikroben bevorzugt so in eine Adapterplatte eingebracht, dass die Stirnseite des stiftförmigen Probenträgers mit der Oberfläche der Adapterplatte im Wesentlichen formschlüssig fluchtet. Im Wesentlichen formschlüssig bedeutet hier, dass eine massenspektrometrische Analyse in einem MALDI Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Ioneneinschuss mit hinreichender Auflösung möglich ist. Mikroben von unterschiedlichen Kolonien können jeweils auf einen stiftförmigen Probenträger übertragen werden, die zusammen in eine Adapterplatte eingebracht und in der Adapterplatte dem Massenspektrometer zugeführt werden. Es ist auch möglich, dass Mikroben aus einer Kolonie auf mehrere stiftförmige Probenträger übertragen werden.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren unter Verwendung von stiftförmigen Probenträgern besteht beispielsweise aus den folgenden Schritten: Aufnahme eines Bildes der Nährmitteloberfläche, Ermittlung der Positionen von Kolonien aus dem Bild, Kontakttransfer von Mikroben an den ermittelten Positionen auf jeweils einen stiftförmigen Probenträger, Einführung der stiftförmigen Probenträger in eine Adapterplatte, Präparation von MALDI-Proben aus den Mikroben auf den stiftförmigen Probenträgern, Einschleusen der Adapterplatte in ein Massenspektrometer, und Spektrenaufnahmen mit Ionisierung durch matrix-unterstützte Laserdesorption an den Positionen der stiftförmigen Probenträger in der Adapterplatte.
Die Mikroben können auch direkt auf einen plattenförmigen Probenträger (Probenträgerplatte) übertragen werden, wobei die Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers so groß ist, dass Mikroben von mehreren Kolonien gleichzeitig auf den plattenförmigen Probenträger übertragen werden. Ein oder mehrere plattenförmige Probenträger können nach der Übertragung auf einer Adapterplatte angeordnet werden und dort fixiert werden, beispielsweise durch mechanische oder magnetische Kräfte.
Die Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers kann nach der Übertragung der Mikroben abgebildet werden, um aus dem aufgenommenen Bild die Positionen der übertragenen Mikroben auf dem plattenförmigen Probenträger zu ermitteln. Dies geschieht bevorzugt nach der Anordnung des plattenförmigen Probenträgers auf einer Adapterplatte und umfasst die Registrierung von Markierungen der Adapterplatte, aus denen die Lage des Probenträgers bzw. Positionen der übertragenen Mikroben relativ zur Adapterplatte bestimmt werden, was eine gerichtete Positionierung der übertragenen Mikroben im Ionisationsbereich der MALDI-Quelle erlaubt. Ebenso kann die Nährmitteloberfläche abgebildet werden und die Lage des plattenförmigen Probenträgers relativ zur Nährmitteloberfläche bestimmt werden, um daraus die Positionen der übertragenen Mikroben auf dem plattenförmigen Probenträger zu ermitteln. Die Matrixlösung wird danach bevorzugt auch auf der gesamten Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers aufgebracht, aber die massenspektrometrischen Analysen werden nur an den ermittelten Positionen durchgeführt. Andererseits können die MALDI Proben auch nur an den ermittelten Positionen präpariert werden und die massenspektrometrischen Analysen nur dort durchgeführt werden. Die Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers und die Nährmitteloberfläche werden bevorzugt mittels lichtoptischer Messverfahren abgebildet, besonders bevorzugt mit einem Auflichtmikroskop im sichtbaren Spektralbereich. Das lichtoptische Messverfahren kann auch eine ortsaufgelöste Messung von Streulicht, der Raman-Streuung oder der Fluoreszenz sein. Die Abbildung der Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers erfolgt bevorzugt vor dem Aufschluss der Mikroben, kann aber auch nach dem Aufschluss der Mikroben erfolgen.
Eine zu untersuchende Probe wird meistens in Form einer verdünnten Lösung auf eine Nährmitteloberfläche ausgestrichen (plattiert), wodurch zunächst räumlich separierte Mikrokolonien entstehen. Bei der Verwendung von plattenförmigen Probenträgern werden die Mikroben der Mikrokolonien auf räumlich getrennte Bereiche des Probenträger übertragen, wodurch sie ohne gegenseitige Beeinflussung (Vermischung) massenspektrometrisch identifiziert werden können, was insbesondere beim Vorhandensein von unterschiedlichen Mikrobenarten in der zu untersuchenden Probe (Mischprobe) von Vorteil ist. Die Analysenprobe kann auch in Form einer Spur auf die Nährmitteloberfläche aufgebracht werden, wodurch das Wachstum der Mikroben und damit die Positionen der Mikrokolonien auf die Spur eingegrenzt ist. Die Spur kann schon beim Aufbringen der Analysenprobe auf die Nährmitteloberfläche aufgezeichnet werden. Nach der Kultivierung der Mikroben wird ein plattenförmiger Probenträger mit der Nährmitteloberfläche in Kontakt gebracht und die Lage des plattenförmigen Probenträgers zur Nährmitteloberfläche bestimmt, woraus die Spur auf der Kontaktfläche des Probenträgers ermittelt wird. Danach wird eine Matrixlösung auf der gesamten Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers aufgebracht und die massenspektrometrischen Analysen werden nur entlang der ermittelten Spur durchgeführt. Das Abfahren der Spur ohne vorherige Abbildung der Nährmitteloberfläche bzw. der Kontaktfläche ermöglicht es, Mikroben auch in Mikrokolonien zu identifizieren, die noch nicht in den entsprechenden Bildern erkennbar sind, ohne den gesamten Probenträger massenspektrometrisch analysieren zu müssen. Es ist auch möglich MALDI Proben nur entlang der ermittelten Spur zu präparieren.
Die Kontaktfläche der Probenträger kann beispielsweise die Oberfläche einer ebenen Probenträgerplatte beliebiger Außenkontur von etwa ein bis acht Zentimeter Durchmesser sein, die durch leichtes parallel ausgerichtetes Aufsetzten oder Aufpressen auf die Nährmitteloberfläche gleichzeitig die Mikroben vieler Kolonien aufnehmen kann, oder aber auch nur die stirnseitige Oberfläche eines Probenträgerstiftes mit nur etwa zwei Millimeter Durchmesser für die Abnahme von Mikroben aus nur einer ausgewählten Kolonie, insbesondere einer Mikrokolonie.
Die Kontaktfläche der Probenträger kann dabei in besonderer Weise präpariert sein, um möglichst viele Mikroben zu übertragen. Sie kann beispielsweise einfach nur angefeuchtet, aber auch mit protein-adsorptiven oder klebstoffartigen Bereichen präpariert sein, die eine hohe Affinität für Mikroben aufweisen und diese dadurch festzuhalten vermögen. So erzeugt beispielsweise eine Dünnschichtpräparation mit α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA) eine mikrokristalline Oberfläche, die Peptide und Proteine fest adsorbiert, und damit auch die Hüllproteine von Bakterien. Auch eine angefeuchtete, dünne Schicht von Di- oder Trinitrozellulose adsorbiert Proteine und wirkt sich gleichzeitig positiv auf den MALDI-Prozess aus.
Die Oberfläche der Nährmedien kann vor der Abnahme der Mikroben digital abgebildet werden, um Informationen über die Lage der Mikrokolonien zu erhalten. Die Informationen können zur Steuerung der Abnahme von Mikroben von den Nährmedien verwendet werden, insbesondere der Abnahme mit dünnen Probenträgerstiften. Ein digitales Bild der übertragenen Mikroben auf plattenförmige Probenträgerplatten ergibt die Positionen der Mikroben auf deren Kontaktoberflächen; diese Informationen können zur Steuerung der Abtastung größerer Probenträgerplatten mit dem Laserstrahl während der Spektrenaufnahme dienen.
Zusätzlich ist zu beachten, dass die Präparation der Mikroben auf der Kontaktfläche durch besondere Maßnahmen wie beispielsweise Entsalzen und gleichmäßiges Einlagern der Mikrobenproteine in Matrixdünnschichten auf höchste Ionenausbeute ausgerichtet wird.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zeichnen sich dadurch gegenüber dem Stand der Technik aus, dass sie durch den Wegfall von Übertragungswerkzeugen weniger Verbrauchsmaterial benötigen und damit kostengünstiger sind. Gegenüber dem händischen Übertragen der Mikroben von verschiedenen Analysenproben auf einen massenspektrometrischen Probenträger lassen sich durch die direkte Kontaktübertragung Fehler in der Probenzurordnung ausschließen, indem ein Identifizierungskennzeichen der Analysenprobe, das auf dem Träger des Nährmittels gespeichert ist, jeweils bei der Übertragung automatisch auf den jeweils verwendeten massenspektrometrischen Probenträger übertragen wird.
Figurenliste

gibt ein Beispiel für einen einfachen Probenträgerstift (3) wieder, mit einer als Kontaktfläche dienenden Stirnfläche, die eine zentrale Belegung (1) mit einer protein-adsorptiven Schicht und einen hydrophoben Rand (2) aufweist. Der Probenträgerstift (3) hat in diesem Beispiel einen Durchmesser von etwa zwei Millimeter und ist etwa acht Millimeter lang.
zeigt eine Probenträgerplatte (5) mit Kontaktfläche (4). Die Probenträgerplatte (5) ist in diesem Beispiel rund, kann aber sonst beliebige Außenkonturen mit einer Fläche zwischen einem und acht Zentimeter Durchmesser haben. Die Fläche der probenträgerplatte entspricht bevorzugt der Fläche des Nährmediums, also etwa der Form und Fläche einer Petrischale.
In ist dargestellt, wie die Probenträgerstifte (3) in eine Adapterplatte (10) so eingesteckt sind, so dass ihre Stirnflächen mit der Oberfläche der Adapterplatte fluchten.
zeigt eine Adapterplatte (12) mit fluchtend eingefügten Probenträgerplatten (5). Die Probenträgerplatten (5) haben auf der Rückseite Griffstücke (6), mit denen sie von einem Robotersystem ergriffen und auf die Nährmittelplatten aufgedrückt werden können.
zeigt eine Vorrichtung zur Kontaktübertragung der Mikroben mit Fußplatte (20) und Ständersäule (21). Eine Petrischale (22) ist auf der Fußplatte (20) mit Klammern (23) fixiert. An der Ständersäule (21) ist eine Kamera (24) befestigt, die digitale Bilder von der Oberfläche des Nährmediums in der Petrischale (22) aufnehmen kann. Ein Roboterarm (25) mit steuerbaren Gelenken kann Probenträgerstifte (3) oder auch Probenträgerplatten (5) auf das Nährmedium in der Petrischale (22) positionsgenau aufdrücken.
stellt eine Petrischale (30) in Aufsicht dar, mit einer Spur (31) einer manuell aufgetragenen Analysenprobe (Analytlösung). Der Vorgang des Auftragens kann digital fotografiert werden, und das Bild (oder die Videoaufnahme) kann, nach Abnahme der Mikrobenkolonien durch Kontaktübertragung, zur Steuerung der Laserabtastung auf der Kontaktoberfläche der Probenträgerplatte während der massenspektrometrischen Analyse dienen.
gibt eine etwas andere Version der Vorrichtung zur Übertragung der Mikroben wieder, als in gezeigt. Der Roboterarm ist hier durch einen starren Arm ersetzt, der sich durch das Gelenk (26) lediglich zwischen zwei festen Winkelpositionen drehen lässt. Der starre Arm trägt eine Vorrichtung (27), die einen Probenträgerstift festhalten und auf die Oberfläche des Nährmittels in der Petrischale (22) absenken kann. Die richtige Kontaktposition wird durch eine horizontal in zwei Richtungen wirkende Bewegungseinrichtung (28) für die Petrischale (22) hergestellt. Nach Schwenken der Vorrichtung (27) um das Gelenk (26) kann die Vorrichtung (27) einen Probenträgerstift aus dem Vorratsbehälter (19) aufnehmen oder wieder zurückstecken, wobei der Vorratsbehälter (19) durch die Bewegungseinrichtung (29) in die richtige Position gefahren wird.
zeigt einen Vergleich der Massenspektren verschiedener Probentransfertechniken für die MALDI-TOF Massenspektrometrie anhand zweier Testkeime (E. coli RKI A139 und S. aureus DSM 20231). Die jeweils nach oben weisenden Spektren („Makro“) wurden an Proben aufgezeichnet, welche mit bisheriger Technik aus 24-h-Kulturen präpariert wurden. Für die nach unten weisenden Spektren („Mikro“) wurde der Kontakttransfer für Mikrokolonien eingesetzt. Obwohl deutliche Unterschiede zwischen den jeweiligen Mikro- und Makro-Spektren erkennbar sind, ergab der BioTyper™-Datenbankabgleich von Mikro-Spektren mit hinterlegten Referenzspektren aus 24 h-Kulturen eine korrekte Spezies-Identifizierung mit guten (S. aureus) bzw. sehr guten (E. coli) Score-Werten.

Bevorzugte Ausführungsformen
Das Wachstum von Mikroben findet in vier Phasen statt. In einer ersten, kurzen Anpassungsphase („lag phase“) wird der Stoffwechsel der Mikrobe an das Nährmedium angepasst, beispielsweise durch die Erzeugung anderer Verdau-Enzyme. Danach folgt ein Phase ungehinderten Wachstums mit exponentieller Zunahme der Mikroben („log phase“), bis Nährstoffmangel oder die Produktion von Toxinen die exponentielle Zunahme beendet („Stationäre Phase“). Schließlich sterben die Mikroben durch Nahrungsmangel oder Vergiftung ab („Sterbephase“). In der Phase ungehinderten Wachstums findet jeweils nach einer charakteristischen Zeitspanne, der „Generationszeit“, eine Teilung statt. Die Generationszeiten hängen von den Mikrobenspezies und den äußeren Bedingungen ab; für optimale Bedingungen (Temperatur, Nährmittel) liegen die Zeiten für je eine Generation zwischen 15 Minuten und 24 Stunden. Die meisten der klinisch bedeutsamen, pathogenen Mikroben teilen sich nach eher kürzeren Zeitspannen zwischen 15 und 45 Minuten; jedoch gibt es auch klinisch bedeutsame Ausnahmen mit langsamen Wachstum.
Diese Wachstumsphasen beziehen sich aber auf das Wachstum in flüssigen Nährmedien, das Wachstum auf Agar-Platten ist notwendigerweise verschieden, da das ungehinderte exponentielle Wachstum in einer aufsitzenden Kolonie nur kurze Zeit stattfinden kann. Nur am Rande der Kolonie herrscht ungehindertes Wachstum. In der Fläche der Kolonie werden Mikroben durch Teilungen in eine zweite, dritte, vierte Schicht nach oben gedrückt, wobei ihre Versorgung mit Nährmitteln geringer wird. Manche Mikroben sitzen in diesen Oberschichten fest, einige können sich aber auch über die unterste Mikrobenschicht hinweg zum Rande bewegen und dort wieder Zugang zu Nährmitteln bekommen. Nach acht Sunden sind nur Mikrokolonien gewachsen, die für virulente Mikroben zwischen 10³ und 10⁵ Individuen enthalten, für langsam wachsende sogar noch weniger.
Für die nachfolgend geschilderten Ausführungsformen werden die Mikroben, insbesondere Bakterien, aus einer Analysenprobe in üblicher Weise auf eine Nährmittel enthaltende Platte, beispielsweise eine Agar-Platte, aufgestrichen und für sechs bis acht Stunden bei optimaler Temperatur (meist 37° Celsius) in einem Brutschrank kultiviert. Es wachsen dabei auf der Nährmitteloberfläche die oben beschriebenen Mikrokolonien. Das Nährmittel befindet sich bevorzugt in einer Petrischale. Die Oberfläche des Nährmittels sollte so beschaffen sein, dass sich Mikroben gut von ihr abheben lassen, d.h., dass die Mikroben nicht durch die Oberfläche hindurch in das Nährmittel eindringen sollten.
stellt eine Vorrichtung dar, die zur Abnahme der Mikroben aus den Mikrokolonien durch Kontaktübertragung dienen kann. Die Petrischale (22) ist dabei mit kleinen Klammern (23) auf der Fußplatte (20) der Vorrichtung fixiert. Bevor die Mikroben entnommen werden, ist es zweckmäßig, mit einer Kamera (24) ein digitales Bild der Oberfläche des Nährmediums aufzunehmen, um die Positionen der Mikrokolonien bestimmen zu können. Die Positionsdaten der Mikrokolonien können durch Bilderkennungsverfahren automatisch ermittelt werden. Die Mikrokolonien können aber auch durch Anklicken ihrer Position auf einem Bildschirm, der das Bild wiedergibt, visuell festgelegt und dabei für eine Übertragung ausgewählt werden. Mikrokolonien mit nur 1000 Bakterien haben etwa 0,05 Millimeter Durchmesser; bei richtiger Beleuchtung können selbst diese noch fotografisch erkannt werden. Im günstigen Fall enthalten Mikrokolonien diagnostisch wichtiger Bakterien nach acht Stunden Brutzeit einige Tausend bis einige Zehntausend Individuen.
Wird das automatische Bilderkennungsverfahren für die Bestimmung der Positionen der Mikrokolonien verwendet, so kann durch vorgegebene Parameter für eine Charakterisierung der Mikrokolonien, wie etwa die Kolonieform, auch die Auswahl der Mikrokolonien für eine Identifizierung automatisiert werden. Die Parameter können insbesondere Größe, Form, Reflektionsstärke und Farbe der Mikrokolonien betreffen.
In einer ersten Ausführungsform werden kleine Probenträgerstifte (3), wie sie in wiedergegeben werden, mit ihrer Stirnfläche von maximal etwa neun, vorzugsweise weniger als vier Quadratmillimeter zentral auf jeweils eine ausgewählte Mikrokolonien aufgedrückt, um Mikroben aus den Mikrokolonien durch Kontakt auf die Stirnflächen der Probenträgerstifte (3) zu übertragen. In ist ein Probenträgerstift (3) mit zwei Millimeter Durchmesser gezeigt. Die Probenträgerstifte (3) sollen aus elektrisch leitenden Material bestehen, beispielsweise aus Metall oder auch aus leitendem Kunststoff. Das Aufdrücken kann manuell, besser aber durch einen Roboterarm (25) der Vorrichtung aus erfolgen, der durch die Positionsdaten aus dem optischen Bild der Nährmitteloberfläche gesteuert wird. Noch günstiger ist eine Vorrichtung nach , die auch die Entnahme der Probenträgerstifte aus und das Zurückstecken in einen Vorratsbehälter (19) ermöglicht. Die Probenträgerstifte (3) können dann passgenau in entsprechende Aufnahmelöcher geeigneter Adapterplatten (10), die sich für das Einschleusen in das Massenspektrometer eignen, eingesetzt werden. Bei Verwendung eines Vorratsbehälters (19) kann das Umstecken in die Adapterplatte leicht für alle Probenträgerstifte gemeinsam erfolgen, indem einfach die Adapterplatte mit den Aufnahmelöchern nach unten auf den gefüllten Vorratsbehälter aufgesteckt, beide Behälter umgedreht, und der Vorratsbehälter wieder abgenommen wird. Die Stirnflächen der Probenträgerstifte (3) können aufgeraut oder glatt; die Stirnflächen können aber auch in besonderer Weise präpariert sein, wie in gezeigt, um möglichst viele Mikroben festhalten zu können. Die Probenträgerstifte (3) sind in der Regel für einmaligen Gebrauch bestimmt, wie es für diagnostische Verfahren vorteilhaft ist. Die Präparation für den MALDI-Prozess und die Laserdesorption selbst finden auch auf dieser Stirnfläche statt; siehe dazu die Beschreibung weiter unten.
Eine besondere Ausformung dieser Probenträgerstifte (3) trägt Belegungen mit einer Dünnschicht von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA). Diese Schicht ist unlöslich in Wasser. Wird diese Schicht mit Wasser befeuchtet, so adsorbiert sie Proteine, wodurch Mikroben durch ihre Hüllproteine an der Schicht festgehalten werden. Die befeuchtet aufgedrückten Probenträgerstifte (3) können dabei etwas hin- und hergeschoben oder an etwas verschiedenen Stellen tupfend aufgesetzt werden, um die Mikroben aus der Mikrokolonie über eine etwas größere Fläche zu verteilen und mehr Mikroben aufnehmen zu können. In diese Dünnschicht aus HCCA werden später mit an sich bekannten Verfahren die löslichen Proteine aus den aufgeschlossenen Mikroben eingelagert.
In einer anderen Ausformung ist die Stirnfläche der Probenträgerstifte (3) mit einer hauchdünnen Schicht von Di- oder Trinitrozellulose belegt. Die Nitrozellulosen sind in Alkohol löslich und können so als Lösung aufgebracht und dann eingetrocknet werden. Auch diese Schicht ist wasserunlöslich und kann vor dem Kontakt mit der Nährmittel-Oberfläche befeuchtet werden, sie adsorbiert dann die Hüllproteine der Mikroben mit starker Haltekraft. Die Nitrozellulosen behindern den MALDI-Prozess der Ionisierung der Analytmoleküle nicht.
Es ist auch möglich, klebstoffartige Beschichtungen nach Art von Heftpflastern, die auf der Haut haften, aufzubringen. Probenträgerstifte mit klebstoffartiger Beschichtung können am besten ohne Befeuchtung mehrfach tupfend auf die Mikrokolonien aufgesetzt werden. Der Klebstoff muss so beschaffen sein, dass er den MALDI-Prozess der Ionisierung nicht behindert.
In einer besonderen Ausformung der Probenträgerstifte (3), wie sie in gezeigt ist, werden diese Schichten aus HCCA, Nitrozellulose oder Klebstoffen nur in zentralen Bereichen (1) der Stirnflächen mit beispielsweise 0,8 Millimeter Durchmesser aufgebracht, während die Randbereiche (2) der Stirnflächen hydrophob beschichtet sind. Diese Umrandung (2) mit einer hydrophoben Fläche vereinfacht die weitere Präparation der MALDI-Probe und die Handhabung des Probenträgerstiftes. Sie erlaubt beispielsweise ein einfaches Einstecken der Probenträgerstifte in einen Vorratsbehälter (19), wobei nur die hydrophobe Fläche auf einem Rezess in den Aufnahmelöchem aufsitzt, und zwar so, dass die Rückseiten der Probenträgerstifte aus dem Vorratsbehälter herausragen.
Die Präparation findet günstiger Weise statt, wenn die Probenträgerstifte (3) in die Adapterplatte (10) eingesetzt sind; die Präparation kann manuell oder in einem Pipettierautomaten erfolgen. Die Mikroben werden zunächst mit etwa 0,5 Mikroliter einer starken Säure aufgeschlossen, meist Ameisensäure oder Trifluoressigsäure (TFA), wobei es das Ziel ist, die Zellwände zu zerstören oder zumindest stark zu schwächen. Bei Probenträgerstiften (3) mit hydrophober Umrandung (2) bleibt der kleine Tropfen der Säure dabei auf den zentralen, hydrophilen Bereich (1) beschränkt. Nach dem Eintrocknen der Säuren erfolgt dann die Präparation der freigesetzten Proteine mit der Matrixsubstanz: bei HCCA-Dünnschichten können die Proteine durch einen Tropfen (etwa 0,5 Mikroliter) Acetonitril in die Schichten eingelagert werden, bei Nitrozelluloseschichten muss jetzt die Lösung der Matrixsubstanz zugeführt werden. Für das Aufbringen der kleinen Flüssigkeitsmengen hat sich ein berührungsloses Aufbringen bewährt, wobei ein kleiner Tropfen, der gesteuert aus einer zentralen Kanüle herausgedrückt wird, durch einen kurzen Druckstoß eines Gases aus einer konzentrisch angeordneten zweiten Kanüle den Tropfen löst und auf das Ziel fallen lässt. Es soll hier noch angemerkt werden, dass Aufschluss und Matrixzugabe auch in einem Schritt erfolgen können, indem eine stark angesäuerte Matrixlösung verwendet wird.
Eine zweite Ausführungsform des Übertragungsverfahrens betrifft die gleichzeitige Kontaktübertragung vieler Mikrokolonien auf die Kontaktfläche (4) einer Probenträgerplatte (5). Eine als Beispiel dienende runde Ausführungsform der Probenträgerplatte (5) ist in gezeigt. Die Probenträgerplatte (5) kann aber im Prinzip eine beliebig geformte Platte von etwa ein bis acht Zentimeter Durchmesser sein, die durch leichtes Aufpressen auf die Nährmitteloberfläche gleichzeitig die Mikroben vieler Mikrokolonien aufnehmen kann, wobei die Kontaktfläche (4) der Probenträgerplatte (5) parallel zur Nährmitteloberfläche ausgerichtet sein sollte. Die Probenträgerplatte (5) kann manuell, aber beispielsweise auch durch eine Vorrichtung nach mit einem Roboterarm (25) aufgedrückt werden, wobei der Roboterarm (25) auch den Aufpressdruck steuern kann. Die Oberfläche (4) dieser Probenträgerplatte (5) kann in ähnlicher Weise wie die der Probenträgerstifte präpariert sein, um möglichst viele Mikroben zu binden. Sie kann beispielsweise einfach nur angefeuchtet, aber auch mit klebstoffartigen oder stark adsorptiven Schichten belegt sein.
Probenträgerplatten (5) können ebenfalls in besonders geformte Adapterplatten (12) eingesetzt werden, wobei die Adapterplatten (12) eine Außenkontur haben, die für das Einschleusen in die Ionenquelle des Massenspektrometers erforderlich ist. Zweckmäßigerweise nimmt jetzt eine Kamera ein digitales Bild der übertragenen Mikrokolonien auf den Probenträgerplatten auf. Aus diesem Bild können die Positionen der übertragenen Mikrokolonien ermittelt werden. Das Bild kann aufgenommen werden, wenn die Probenträgerplatten in die Adapterplatte eingesetzt sind, da dann die Positionen relativ zur Adapterplatte leicht ermittelt werden können. Die Positionsdaten können später zur Steuerung der Spektrenaufnahme dienen.
Die Präparation der Mikroben aus den Mikrokolonien kann für die einzelnen Kolonien so erfolgen, wie es oben für die Probenträgerstifte beschrieben ist; günstiger ist aber ein Verfahren, das in ähnlicher Weise für die Präparation von Gewebedünnschnitten für die bildgebende Massenspektrometrie entwickelt wurde. Hier ist es üblich, mit Sprühnebeln zu arbeiten, um eine gleichmäßige Präparation ohne starke seitliche Verschmierungen der Proteine zu erhalten. Präparationsverfahren dieser Art sind im Dokument DE 10 2006 059 695 B3 (M. Schürenberg, identisch mit GB 2 446 251 A und US 2008/0142703 A1 ) wiedergegeben. Es ist allerdings zu beachten, dass für die Mikroben auf den Kontaktoberflächen ein Aufschluss der Mikroben mit einer Zerstörung der relativ widerstandsfähigen Zellwände vorzunehmen ist, der bei der Präparation von Gewebedünnschnitten entfällt, da hier die Zellen einerseits bereits aufgeschnitten, und andererseits nur mit dünnen Membranen umgeben sind, nicht mit widerstandsfähigen Zellwänden.
Die Spektrenaufnahme von den Probenträgerplatten kann in einem Abrastern der ganzen Kontaktoberfläche bestehen, was aber in der Regel zu viel Zeit kostet. Es ist daher besser, sich auf die Positionsdaten aus den Digitalbildern zu stützen und nur die erkannten Positionen der Mikrokolonien und deren enge Umgebung in die Spektrennahme einzubeziehen.
Eine besondere Ausführungsform der Spektrenaufnahme an Probenträgerplatten kann darin bestehen, die Massenspektren nur längs der Spur (31) der auf die Nährmitteloberfläche in einer Petrischale (30) aufgestrichenen Analysenprobe zu nehmen ( ). Dazu ist es erforderlich, das Aufstreichen der Analysenprobe auf die Nährmitteloberfläche fotografisch festzuhalten, beispielsweise mit einer lange geöffneten Verschlusszeit oder mit einer Video-Kamera. Mit diesem Verfahren ist es möglich, auch fotografisch nicht erkennbare Mikrokolonien zu analysieren, ohne massenspektrometrische Analysen auf der gesamten Kontaktfläche durchzuführen.
Es sollen nun Beispiele für die beiden bevorzugten Verfahren etwas detaillierter beschrieben werden: das erste Verfahren unter Benutzung von HCCA-belegten Probenträgerstiften (3) und das zweite Verfahren mit Verwendung größerer Probenträgerplatten (5).
Für das erste Verfahren werden die Mikroben in Petrischalen auf Oberflächen, die Nährmittel enthalten, in etwa acht Stunden zu Mikrokolonien herangezüchtet. Die Nährmittel enthaltenden Oberflächen können Agar-Oberflächen, aber auch mikroporöse Membranen mit Nährlösungen sein, von denen sich die Mikroben besser abheben lassen, beispielsweise eine Membran aus Silikongummi mit Poren unter 100 Nanometer Durchmesser. Die Petrischalen (22) werden dann auf der Fußplatte (20) einer Vorrichtung nach fixiert, und es wird die Oberfläche des Nährmittels mit einer fest an der Vorrichtung installierten Kamera (24) fotografiert. Das Bild der Oberfläche wird auf einem Bildschirm gezeigt, und der Benutzer kann jetzt eine von ihm festgelegte Anzahl von Mikrokolonien durch Anklicken auswählen. Die Anzahl der auszuwählenden Mikrokolonien hängt von der analytischen Aufgabenstellung ab, insbesondere von der Erwartung, ob es sich in der angelieferten Analysenprobe nur um eine einzige Mikrobenspezies oder aber um mehrere handeln könnte. Sind verschiedenartige Kolonien zu sehen, so kann jede Kolonienart in die Auswahl einbezogen werden.
Die Vorrichtung enthält außerdem einen steuerbaren Roboterarm (25), der die Probenträgerstifte (3) aus einem Vorratsbehälter (nicht gezeigt) aufnehmen und positionsgenau auf die Nährmittel-Oberfläche in der Petrischale (22) aufdrücken kann. Die Stirnflächen der Probenträgerstifte (3) haben vorzugsweise einen Durchmesser von etwa zwei Millimetern und sind, wie in gezeigt, in einem zentralen Bereich (1) von etwa 0,8 Millimeter Durchmesser mit einer Dünnschicht von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (HCCA) belegt; der umgebende Rand (2), der eine Breite von etwa 0,6 Millimeter hat, ist hydrophob beschichtet. Der Roboterarm (25) drückt die Stirnfläche des Probenträgerstifts (3) zunächst auf einen feuchten Schwamm, um den hydrophilen Teil der Oberfläche zu befeuchten und drückt sie dann, gesteuert durch die Positionsdaten für eine Mikrokolonie, mit sehr geringem Pressdruck zentral auf eine der ausgewählten Mikrokolonien auf. Besteht der Probenträgerstift (3) aus Metall, so genügt es meistens, den Probenträgerstift über der Oberfläche loszulassen, so dass er durch sein Eigengewicht aufliegt. Ein leichtes Hin- und Herbewegen des Probenträgerstiftes um einige Zehntel Millimeter in verschiedene Richtungen oder eine wiederholtes Betupfen hilft, die Mikroben über eine etwas größere Fläche zu verteilen, als es dem Durchmesser der Kolonie entspricht. Durch die adsorptive Kraft der Dünnschichtbelegung kann ein großer Teil aller Mikroben der Mikrokolonie aufgenommen werden, insbesondere dann, wenn sich das Nährmittel in einem Material befindet, von dem sich die Mikroben besonders leicht abheben lassen. Die adsorptive Fläche (1) von 0,8 Millimeter Durchmesser kann bei dichter Belegung mit durchschnittlich großen Bakterien (etwa 1 × 2 Mikrometer) eine Viertel Million Individuen aufnehmen, ist also auf jeden Fall groß genug für die Aufnahme der Mikroben aus Mikrokolonien. Enthält die Mikrokolonie nur etwa 1000 Individuen, so können nach ersten Erfahrungen nahezu alle Mikroben auf die Kontaktfläche übertragen werden.
Der Probenträgerstift (3) kann dann beispielsweise von einem zweiten Roboterarm (in nicht gezeigt) übernommen werden, um ihn umzudrehen und in eine Passöffnung in einer Adapterplatte (10) einzusetzen. Die Adapterplatte (10) hat eine Form, die ein Einschleusen der Adapterplatte mit allen Probenträgern in das verwendete Massenspektrometer erlaubt. Die Stirnflächen der Probenträgerstifte (3) sollen dabei exakt mit der Oberfläche der Adapterplatte (10) fluchten, um später in einem Flugzeitmassenspektrometer eine ebene und lückenlose Fläche für die Ausbildung homogener Beschleunigungsfelder für die Ionen zu bieten. Eine Adapterplatte (10) in Form und Größe einer Mikrotiterplatte kann beispielsweise 8 × 12 = 96 Probenträgerstifte (3) aufnehmen; eine dichtere Packung bis zu 384 Probenträgerstiften ist möglich, aber nicht unbedingt zweckmäßig. Die Zeitdauer für die Kontaktübertragung von 96 Mikrokolonien hängt weitgehend von der Anzahl der bebrüteten Petrischalen ab, die fotografiert und ausgewertet werden müssen; im Allgemeinen lässt sich diese Arbeit aber in etwa einer Viertelstunde bewältigen. Ist die Adapterplatte (10) mit einer genügenden Anzahl von Probenträgerstiften (3) gefüllt, so kann die Präparation der Proben beginnen. Die Präparation kann besonders gut in einem Pipettierautomaten ausgeführt werden, der Tropfen berührungslos abgibt.
Zunächst müssen die Mikroben aufgeschlossen werden, indem die starken Zellwände der Mikroben geschwächt oder zerstört werden. Das kann, wie üblich, durch Säuren wie Ameisensäure oder Trifluoressigsäure geschehen. Dazu sind nur jeweils etwa 0,5 Mikroliter Lösung auf die hydrophilen Zentralbereiche (1) der Probenträgerstifte (3) aufzubringen. Die Tröpfchen werden dort festgehalten und können nicht in die umgebenden, hydrophoben Randbereiche (2) fließen. Nach wenigen Minuten sind die Zellwände genügend geschwächt, und es können die Säuren, beispielsweise durch Einbringen der Adapterplatte (10) in einen evakuierbaren Exsikkator, eingetrocknet werden. Nun erfolgt eine Zugabe von etwa 0,5 Mikroliter eines Acetonitril-Wasser-Gemischs, das in die Zellen eindringt und diese sprengt, so dass die löslichen Proteine aus dem Inneren freigesetzt werden. Gleichzeitig löst das Acetonitril den obersten Teil der HCCA-Dünnschicht an. Die Verdunstung des Acetonitrils bewirkt, dass eine Rekristallisation stattfindet, bei der die meisten der adsorptiv auf den Kristalloberflächen aufsitzenden Proteinmoleküle in das Kristallgitter eingebaut werden.
Die Empfindlichkeit des MALDI-Prozesses der Ionisierung kann zudem durch Maßnahmen zur Entfernung von Salz-Ionen wie Na⁺ oder K⁺ erhöht werden, die dafür bekannt sind, die Ionisierung zu unterdrücken. Dies kann beispielsweise durch Zugeben von Ammonium-Zitrat oder Ammonium-Tartrat zur Matrixlösung, oder durch die Verwendung von salztoleranten Matrixsubstanzen wie 3,4-Diaminobenzophenon (DABP) erreicht werden. Auch ein einfaches Waschen ist wirksam; ein Aufbringen und wieder Absaugen von 0,5 Mikroliter destilliertem Waschwasser beseitigt den größten Teil der Salze und anderer Stoffe, die den MALDI-Prozess der Ionisierung behindern könnten.
Es ist besonders günstig, wenn alle Flüssigkeiten kontaktlos in Form kleiner Tröpfchen aufgebracht werden, da dann nicht immer neue Pipettenspitzen verwendet werden müssen. Für das Aufbringen der kleinen Flüssigkeitsmengen unter einem Mikroliter hat sich ein berührungsloses Aufbringen bewährt, bei dem ein winziger Tropfen, der gesteuert aus einer Mikrokanüle gedrückt wird, durch einen kurzen Druckstoß eines Gases aus einer konzentrisch angeordneten zweiten Kanüle von der zentralen Mikrokanüle gelöst wird und senkrecht auf das Ziel fällt. Für das Absaugen des Waschwassers von allen Probenträgerstiften gleichzeitig kann einfach ein Löschblatt auf die Adapterplatte aufgelegt und sofort wieder entfernt werden.
Die Präparation für 96 Proben kann in weniger als zehn Minuten durchgeführt werden. Die Adapterplatte (10) mit den fertig präparierten MALDI-Proben kann dann durch eine Vakuumschleuse in die Ionenquelle eines Massenspektrometers eingeführt werden. Die Aufnahme der Massenspektren, jeweils zusammengesetzt aus Hunderten von Einzelspektren, benötigt in modernen Massenspektrometern nur etwa eine Sekunde pro Probe. Kann das Identifizierungsprogramm genügend schnell arbeiten, so können die Identifizierungsergebnisse für 96 MALDI-Proben in weniger als fünf Minuten nach Einschleusen der Adapterplatte vorliegen. Die Gesamtzeit der Arbeiten nach Abschluss der Kultivierung, also der Kontaktübertragung, der Probenpräparation und der Spektrenaufnahme, beträgt also etwa eine halbe Stunde.
Das zweite Beispiel, das hier geschildert werden soll, betrifft die gleichzeitige Abnahme der Mikroben aus mehreren Mikrokolonien mit einer größeren Probenträgerplatte (5) und die Art der Präparation der Mikroben auf der Kontaktfläche.
Nach der Kultivierung der Mikroben in einer Petrischale und dem Fotografieren der Mikrokolonien auf der Petrischale wird eine Probenträgerplatte (5) durch eine Vorrichtung, beispielsweise durch die Vorrichtung in , auf die Oberfläche des Nährmediums aufgedrückt. Die Probenträgerplatte (5) sei in diesem Beispiel rund mit einem Durchmesser von 2,5 Zentimeter, und sei mit einer dünnen Schicht einer Nitrozellulose belegt, um sie für die Hüllproteine der Mikroben stark adsorptiv zu machen. Die Vorrichtung kann die Probenträgerplatte (5) mit einem einstellbaren Anpressdruck auf einen zuvor vom Benutzer ausgewählten Bereich der Nährmittel Oberfläche aufdrücken. Die Probenträgerplatte (5) kann dabei um einige Zehntel Millimeter hin- und herbewegt werden, um die Mikroben auf eine etwas größere Fläche zu verteilen.
Nach dem Abnehmen von der Nährmitteloberfläche kann die Probenträgerplatte (5) zusammen mit weiteren Probenträgerplatten (5) fluchtend in die Oberfläche einer Adapterplatte (12) eingefügt werden. Die Adapterplatte (12) hat eine Form, die das Einschleusen in das verwendete Massenspektrometer ermöglicht. Von der Adapterplatte (12) mit den eingefügten Probenträgerplatten (5) wird mit geeigneter Beleuchtung ein hoch auflösendes Digitalbild aufgenommen, das die übertragenen Mikrobenkolonien anzeigt und der Positionsbestimmung in Bezug auf Positionsmarken der Adapterplatte dient. Ist die Kontaktoberfläche der Probenträgerplatten hochglänzend poliert, und trifft die Beleuchtung schräg auf diese Oberfläche, so können die Mikroben durch ihr Streulicht hochempfindlich auf dunklem Untergrund erkannt werden. Die Adapterplatte kann jetzt für die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption präpariert werden. Das kann mit einfachen Sprühpistolen für die Erzeugung feiner Aerosole oder bevorzugt in einer speziell für diesen Zweck entwickelten Sprühapparatur („ImagePrep“, Bruker Daltonik GmbH, Bremen) vorgenommen werden. Die Sprühapparatur erzeugt von einer Flüssigkeit einen Nebel, dessen Mikrotröpfchen sich gleichmäßig auf der Oberfläche absetzen. Dabei kann die Dichte der abgesetzten Tröpfchen gesteuert werden, um ein laterales Verlaufen weitgehend zu verhindern. Sprüh- und Trocknungsperioden können sich gesteuert abwechseln, wie von der Präparation von Gewebedünnschnitten her bekannt.
Zunächst müssen die widerstandsfähigen Zellwände der Mikroben durch Versprühen von Ameisen- oder Trifluoressigsäure geschwächt werden. Danach wird eine Lösung der Matrixsubstanz versprüht, wobei die Zellwände endgültig zerstört und die löslichen Proteine aus dem Inneren der Zellen freigesetzt werden. Mit abwechselnden Sprüh- und Trocknungsperioden wachsen jetzt Mikrokristalle heran, mit zunehmendem Einschluss der löslichen Proteine aus den Mikrobenzellen. Die Prozedur wird beendet, wenn die mikrokristalline Schicht etwa zwei bis drei Mikrometer Dicke erreicht hat. Ist das Matrixmaterial wasserunlöslich, so kann die mikrokristalline Oberfläche jetzt einfach mit reinem Wasser abgespült werden, um alle Salze und sonstig schädlichen, aber wasserlöslichen Substanzen zu entfernen. Um eine weitgehend geschlossene mikrokristalline Schicht zu erzeugen, kann vor dem Versprühen der Matrixlösung eine Suspension mit feinsten Festkörper-Kristallisationskeimen zerstäubt aufgebracht und getrocknet werden. Die Kristallisationskeime können beispielsweise aus feinst gemahlenem Quarzsand bestehen; die Kristallisationskeime sorgen für ein flächendeckendes Kristallisieren des Matrixmaterials.
Die Adapterplatte (12) wird in ein Massenspektrometer eingeschleust. Die Ionenquellen der Massenspektrometer enthalten Vorrichtungen, mit denen die Adapterplatten in zwei Richtungen mit Positionsgenauigkeiten von einigen Mikrometern bewegt werden können. Durch die Verknüpfung mit den Positionsdaten der Mikrokolonien im Digitalbild können die Mikrobenpositionen dieser Kolonien auf der Probenträgerplatte jetzt einzeln angesteuert und analysiert werden. Dabei können alle erkennbaren oder auch nur die automatisch ausgewählten Mikrokolonien analysiert werden, oder aber vorher vom Benutzer visuell ausgewählte Kolonien. Die aus den Massenspektren hervorgehenden Identifizierungsergebnisse können dann wieder den Mikrokolonien auf dem Digitalbild zugeordnet werden: ein Anklicken einer Mikrokolonie auf dem Bildschirm kann dann die Spezies anzeigen. Die Ergebnisse können aber auch, insbesondere für diagnostische Analysenproben, in Form von Tabellen ausgegeben werden, wie sie zur Weiterleitung an den Arzt benötigt werden, der die Analysenproben genommen und an das massenspektrometrische Labor versandt hat.
Es ist bei diesem Verfahren nicht auszuschließen, dass einige Mikrokolonien nicht auf dem Digitalbild erkannt werden, weil sie zu klein sind oder weil sie sich farblich auch unter angepasster Beleuchtung nicht von der Oberfläche des Probenträgers abheben. Besteht diese Gefahr, so kann ein besonderes Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Spur (31) des Auftragens der Analysenprobe auf die Oberfläche des Nährmediums analytisch mit den Laserschüssen des MALDI-Verfahrens abgetastet wird. Dazu ist es erforderlich, das Aufstreichen der Analysenprobe aufzunehmen und zu dokumentieren, beispielsweise durch eine Festkamera mit lange geöffnetem Verschluss, aber auch durch eine Videokamera. Für gewöhnlich wird die Analysenprobe manuell mit einigen Hin- und Herbewegungen in Form einer Zickzacklinie aufgestrichen, wie sie in schematisch als Spur (31) dargestellt ist. Ist diese Spur dokumentiert, so kann die Adapterplatte im Massenspektrometer so bewegt werden, dass die Spur des Auftragens in aufeinander folgenden Spektrenaufnahmen analytisch abgetastet wird. Dadurch können auch solche Mikrokolonien erfasst werden, die zwar genügend Individuen gebildet haben, aber unsichtbar geblieben sind.
Die beiden geschilderten Verfahren der Übertragung und Präparation können in vielfältiger Weise abgeändert oder erweitert werden. So können insbesondere nach Abnahme der Mikroben durch Probenträgerstifte oder Probenträgerplatten die verbleibenden Mikroben in den Petrischalen weiter kultiviert werden, um auch langsamer wachsende Mikroben zu entdecken und identifizieren zu können, wenn auch nach längerer Kultivierungsdauer. Dabei kann es zweckmäßig sein, die Mikrokolonien von schnell wachsenden Mikroben abzutöten oder mechanisch zu entfernen. Auch hier helfen die Digitalbilder, die nach einer kurzen Kultivierungsperiode aufgenommen werden, um nach längerer Kultivierung weitere Kolonien zu entdecken. Diese können dann ebenso wie die ursprünglichen Mikrokolonien mit Probenträgerstiften oder Probenträgerplatten abgenommen und identifizierend analysiert werden.
Besteht der Verdacht auf die Anwesenheit besonders langsam wachsender, aber gefährlicher Mikroben, so können in einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens die Petrischalen mit den Nährmitteln in geeigneten Zeitabständen, beispielsweise alle acht Stunden, wiederholt auf das Wachsen von Mikrokolonien untersucht werden. Sind dabei störende Mikroben mit schnellem Wachstum vorhanden, die nicht interessieren, so können die Mikrokolonien dieser Mikroben, gegebenenfalls nach Kontaktabnahme mit Probenträgerstiften, in diesen Untersuchungsperioden abgetötet oder vollkommen entnommen werden. Dadurch wird die Gefahr gemindert, dass die schnell wachsenden Mikroben die langsam wachsenden überwuchern. Die langsam wachsenden Mikroben können an vorgegebenen Merkmalen erkannt werden, beispielsweise an ihrem langsamen Wachstum, aber auch an anderen Merkmalen wie Form und Farbe der Kolonien, werden dann durch Kontaktübertragung auf Probenträgerstifte von der Nährmitteloberfläche abgenommen und der Analyse zugeführt.
Es können auch für die Kontaktübertragung andere Vorrichtungen verwendet werden, als in gezeigt. So ist es beispielsweise möglich, Probenträgerplatten oder Probenträgerstifte nicht mit einem komplizierten Roboterarm, sondern einfach mit einer nur senkrecht bewegbaren Einrichtung, beispielsweise durch einen piezogesteuerten Linearmotor oder durch einen kleinen Faltenbalg, auf die Oberfläche des Nährmittels abzusetzen. Der Faltenbalg kann durch eine kleine Pumpe in seiner Länge und in seinem Anpressdruck gesteuert werden. zeigt eine solche Vorrichtung mit einem kleinen Linearmotor (27) zum Absenken eines Probenträgerstifts. Um jede Stelle der Nährmittel Oberfläche erreichen zu können, kann die Schale (22) mit dem Nährmittel auf eine Bewegungseinrichtung (28) aufgesetzt werden, die die Schale horizontal in zwei Richtungen bewegen kann. Eine solche Vorrichtung unterstützt die Automatisierung.
Die Einrichtung (27) zur senkrechten Bewegung der Probenträgerplatten oder Probenträgerstifte kann vorzugsweise zwischen zwei Winkelstellungen um ein Gelenk (26) an der Ständersäule gedreht werden, um einerseits den Blickweg der Kamera frei zu machen und andererseits die Probenträgerplatten oder Probenträgerstifte aus Vorratsbehältern (19) aufnehmen zu können. Diese Vorratsbehälter (19) können sich ebenfalls auf einem horizontal bewegbaren Tisch (29) befinden. In ist als Beispiel ein Vorratsbehälter (19) mit 4 × 6 = 24 Probenträgerstiften wiedergegeben. Die Probenträgerstifte können nach ihrer Belegung mit Mikroben wieder in den Vorratsbehälter zurückgesteckt werden. Im Vorratsbehälter liegen sie nur mit dem hydrophoben Rand (2) der Stirnfläche auf einem Rezess der Aufnahmeöffnung auf. Da dieser Rand ist nicht mit Mikroben belegt ist, findet kein Verlust an Mikroben statt.

Claims

Ein Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Mikroben aus Kolonien auf einer Nährmitteloberfläche in einem Massenspektrometer, mit den Schritten: (a) Mikroben werden von der Nährmitteloberfläche durch direkten Kontakt mit der Kontaktfläche eines Probenträgers auf die Kontaktfläche übertragen, (b) die übertragenen Mikroben werden auf der Kontaktfläche des Probenträgers aufgeschlossen, und (c) der Probenträger mit den molekularen Bestandteile der aufgeschlossenen Mikroben wird dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt.
Ein Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Bestandteile der aufgeschlossenen Mikroben im Schritt (b) zu einer MALDI-Probe präpariert werden, die im Schritt (c) dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein stiftförmiger Probenträger stirnseitig mit Mikroben in Kontakt gebracht wird und dass nur Mikroben einer einzelnen Kolonie auf den stiftförmigen Probenträger übertragen werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der stiftförmige Probenträger nach der Übertragung von Mikroben so in eine Adapterplatte eingebracht wird, dass die Stirnseite des stiftförmigen Probenträgers mit der Oberfläche der Adapterplatte im Wesentlichen formschlüssig fluchtet.
Ein Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Übertragung der Mikroben auf einen stiftförmigen Probenträger ein Bild der Nährmitteloberfläche aufgenommen wird und aus dem Bild Positionen von Kolonien ermittelt werden und dass Mikroben an den ermittelten Positionen auf jeweils einen stiftförmigen Probenträger durch direkten Kontakt übertragen werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stirnseiten der stiftförmigen Probenträger Oberflächen von weniger als neun Quadratmillimeter aufweisen.
Ein Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein plattenförmiger Probenträger mit Mikroben in Kontakt gebracht wird, wobei die Kontaktfläche des plattenförmigen Probenträgers so groß ist, dass Mikroben von mehreren Kolonien gleichzeitig auf den plattenförmigen Probenträger übertragen werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktfläche nach der Übertragung der Mikroben auf den plattenförmigen Probenträger abgebildet wird und dass aus dem Bild die Positionen der übertragenen Mikroben auf dem plattenförmigen Probenträger ermittelt werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Abbildung MALDI-Proben nur an den ermittelten Positionen präpariert werden und dass die massenspektrometrische Analysen nur an den präparierten MALDI-Proben durchgeführt werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Abbildung auf der gesamten Kontaktfläche des Probenträgers eine Matrixlösung aufgebracht wird und dass die massenspektrometrischen Analysen nur an den ermittelten Positionen durchgeführt werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass beim Aufbringen der zu untersuchenden Analysenprobe auf die Nährmitteloberfläche die Spur des Aufbringens aufgezeichnet wird und dass die massenspektrometrischen Analysen nur entlang der aufgezeichneten Spur durchgeführt wird.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben auf dem Probenträger durch die Zugabe einer entsprechend aggressiven Matrixlösung aufgeschlossen werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben vor der Übertragung auf den Probenträger weniger als 8 Stunden auf der Nährmitteloberfläche kultiviert werden.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährmitteloberfläche während der Kultivierung wiederholt auf das Wachstum von Mikrobenkolonien untersucht wird, und dass bei Entdeckung von Kolonien die Kontaktübertragung stattfindet.
Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktfläche des Probenträgers mit protein-adsorptiven oder klebstoffartigen Bereichen präpariert ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des plattenförmigen Probenträger eben ist und einen Durchmesser von einem bis acht Zentimeter aufweist.