DE102013217694A1

DE102013217694A1 - Apparatus and method for measurement on membranes and cells

Info

Publication number: DE102013217694A1
Application number: DE102013217694.5A
Authority: DE
Inventors: Thomas Knott; Michael Huber; Peter van Stiphout
Original assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Current assignee: CYTOCENTRICS BIOSCIENCE GmbH
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-03-05
Also published as: WO2015032868A1

Abstract

Bei einer Vorrichtung (1) nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12) ist mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat (2) vorgesehen, das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen (3–7, 9–11) sowie mindestens eine Öffnung (8), an der die Membran oder Zelle (12) zumindest während einer Messung unter elektrischer Kontaktierung immobilisierbar ist, vorgesehen. Weiter umfasst die Vorrichtung (1) mindestens einen optischen Pfad (13) zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung, der dem Substrat (2) zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats (2) ist.In a device (1) in the manner of a patch clamp chip for determining biologically relevant measured variables on membranes and cells (12), at least one, preferably flat substrate (2) is provided, the microfluidic components and / or microfluidic structures (3). 7, 9-11) and at least one opening (8) on which the membrane or cell (12) can be immobilized, at least during a measurement under electrical contacting. Furthermore, the device (1) comprises at least one optical path (13) for transmitting electromagnetic radiation, which is assigned to the substrate (2) and / or is part of the substrate (2).

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen sowie Verfahren zur Bestimmung solcher Messgrößen. The invention relates to a device in the manner of a patch clamp chip for determining preferably biologically relevant measured variables on membranes and cells as well as methods for determining such measured variables.

Bei der sogenannten Patch-Clamp-Technik handelt es sich um eine Messmethode aus der Elektrophysiologie, die seit der zweiten Hälfte der 70er Jahre des vergangenen Jahrhunderts durch die Arbeiten von Neher und Sakmann bekannt ist. Durch diese Methode lassen sich Ströme durch einzelne Ionenkanäle in biologischen Membranen und Zellmembranen darstellen. The so-called patch-clamp technique is an electrophysiology measuring method known from the works of Neher and Sakmann since the second half of the 1970s. Through this method, currents can be represented by individual ion channels in biological membranes and cell membranes.

Das Funktionsprinzip der Patch-Clamp-Technik ist in vielen Übersichtsartikeln als Stand der Technik beschrieben. The functional principle of the patch clamp technique is described in many review articles as state of the art.

Bei der sogenannten manuellen Patch-Clamp-Technik wird eine Glaskapillare, die in der Regel frisch bereitgestellt wird, mit einer leitfähigen Lösung, in die eine Metallelektrode taucht, befüllt und, meist unter optischer Kontrolle, mit einer intakten Zelle kontaktiert. Dann wird durch einen angelegten Unterdruck eine Versiegelung zwischen biologischer Membran und Pipette erzeugt, idealerweise unter Ausbildung eines sogenannten Gigaseals, d.h. unter Ausbildung eines elektrischen Widerstands in der Größenordnung von mindestens einem Gigaohm. In the so-called manual patch-clamp technique, a glass capillary, which is usually freshly prepared, is filled with a conductive solution, into which a metal electrode dips, and contacted, usually under optical control, with an intact cell. Then a seal between the biological membrane and the pipette is created by an applied negative pressure, ideally to form a so-called gigaseal, i. forming an electrical resistance of the order of at least one gigaohm.

Eine solche manuelle Patch-Clamp-Technik ist jedoch für den wachsenden Bedarf an Patch-Clamp-Messungen in der Forschung, insbesondere in der Pharmaforschung, nicht geeignet, da die Durchführung einer einzelnen Messung viel Zeit in Anspruch nimmt. Es wurden deshalb Patch-Clamp-Techniken entwickelt, die an planaren, d.h. flachen, Substraten durchgeführt werden. Hier wird dann keine Pipette auf einer Zelle positioniert, sondern eine Zell-Suspension wird auf ein flaches Substrat, das auch als Chip bezeichnet wird, aufgebracht, und die Membranen/Zellen werden auf Öffnungen oder Vertiefungen positioniert, die in diesem Chip vorgesehen sind. However, such a manual patch clamp technique is not suitable for the growing need for patch clamp measurements in research, particularly in drug discovery, since it takes a long time to perform a single measurement. Patch-clamp techniques have therefore been developed that are designed to be planar, i. flat, substrates are performed. Here, no pipette is then positioned on a cell, but a cell suspension is applied to a flat substrate, also referred to as a chip, and the membranes / cells are positioned on openings or recesses provided in that chip.

Mit diesen zuletzt beschriebenen Techniken lassen sich automatisierte Verfahren für Patch-Clamp-Messungen realisieren. Dabei sind mikrofluidische Strukturen, die für die entsprechende Messung notwendig oder von Vorteil sind, idealerweise bereits in den sogenannten Patch-Clamp-Chip integriert. With these last described techniques, automated procedures for patch-clamp measurements can be realized. In this case, microfluidic structures which are necessary or advantageous for the corresponding measurement are ideally already integrated in the so-called patch clamp chip.

Bei den beschriebenen planaren Systemen gibt es solche, bei denen es nicht notwendig ist, dass an jeder der vorhandenen Öffnungen tatsächlich eine Membran oder Zelle immobilisiert ist. Ein solches System ist beispielsweise in der EP-B1-1 802 752 bzw. der parallelen US-A1-2006/0194255 beschrieben. Allerdings lassen sich mit solchen Systemen sogenannte Gigaseals nur schwer realisieren, so dass zur Bereitstellung von Gigaseals beispielsweise sogenannte seal enhancer (Pufferlösungen basierend auf reaktionsfreudigen Elementen wie beispielsweise Fluor) zur Hilfe genommen werden müssen. In the planar systems described, there are those in which it is not necessary for any membrane or cell to actually be immobilized at each of the existing openings. Such a system is for example in the EP-B1-1 802 752 or the parallel US-A1-2006 / 0194255 described. However, so-called gigaseals are difficult to realize with such systems, so that, for example, so-called seal enhancers (buffer solutions based on reactive elements such as fluorine) must be used to provide gigaseals.

Ein anderes planares Patch-Clamp-System ist in der EP-B1-1 311 655 dargestellt. Hier ist es durch einen separaten Ansaugkanal möglich, dass eine einzelne Membran oder Zelle über der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung positioniert wird, bevor das eigentliche Seal an der Öffnung ausgebildet wird. Hierbei sind auch ohne weiteres sogenannte Gigaseals realisierbar. Another planar patch clamp system is in the EP-B1-1 311 655 shown. Here it is possible by means of a separate suction channel that a single membrane or cell is positioned above the actual patch clamp opening before the actual seal is formed at the opening. In this case, so-called Gigaseals can also be realized without further ado.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die bereits bekannten planaren Patch-Clamp-Systeme weiter zu verbessern. Insbesondere soll es ermöglicht werden, die Positionierung und Immobilisierung von Membranen oder Zellen an einer Öffnung, an der das entsprechende Seal ausgebildet wird, noch besser zu kontrollieren. Weiter wird zum einen angestrebt, die Faktoren, die die Messgrößen bei der Patch-Clamp-Messung beeinflussen, gezielt zu variieren, und zum anderen, die erhaltenen Messgrößen besser zu detektieren und auszuwerten. Schließlich soll es ermöglicht werden, die Membranen und Zellen gezielt zu stimulieren.The invention has the task of further improving the already known planar patch clamp systems. In particular, it should be possible to control the positioning and immobilization of membranes or cells at an opening at which the corresponding seal is formed even better. Furthermore, on the one hand the aim is to selectively vary the factors which influence the measured variables in the patch clamp measurement, and on the other hand to better detect and evaluate the measured quantities obtained. Finally, it should be possible to specifically stimulate the membranes and cells.

Diese Aufgaben werden gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch die Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 10 und 11. Bevorzugte Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 9 beschrieben. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. These objects are achieved by the device having the features of claim 1 and by the methods having the features of claims 10 and 11. Preferred embodiments of the device according to the invention are described in the dependent claims 2 to 9. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into the content of this specification.

Wie eingangs erläutert, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen vorgesehen. Insbesondere weisen diese Membranen und Zellen Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle auf oder sind in der Lage, solche Membranproteine auszubilden. As explained at the outset, the device according to the invention is provided in the manner of a patch clamp chip for determining preferably biologically relevant measured variables on membranes and cells. In particular, these membranes and cells have membrane proteins such as ion channels or are capable of forming such membrane proteins.

Nach der Erfindung weist die beanspruchte Vorrichtung mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat auf, das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen sowie mindestens eine Öffnung besitzt, an der die Membran oder Zelle zumindest während einer Messung unter elektrischer Kontaktierung immobilisierbar ist. Dieses Immobilisieren erfolgt vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung. According to the invention, the claimed device has at least one, preferably flat, substrate which has microfluidic components and / or microfluidic structures and at least one opening on which the membrane or cell can be immobilized, at least during a measurement with electrical contacting. This immobilization is preferably carried out at the top of the opening.

Weiter besitzt die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens einen optischen Pfad, der dem Substrat zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats ist. Dieser optische Pfad dient zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung. Furthermore, the device according to the invention has at least one optical path which is assigned to the substrate and / or is part of the substrate. This optical path is used to transmit electromagnetic radiation.

Mit anderen Worten lässt sich die Erfindung auch so beschreiben, dass bei einem planaren Patch-Clamp-System, das mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat aufweist und mit dem sich automatisierte Verfahren für Patch-Clamp-Messungen realisieren lassen, insbesondere bei einem sogenannten Patch-Clamp-Chip, mindestens ein optischer Pfad vorhanden ist. Dieser optische Pfad ist entweder Teil des Substrats selbst, oder er ist dem Substrat zugeordnet. In other words, the invention can also be described in such a way that, in the case of a planar patch clamp system, which has at least one, preferably flat, substrate and with which automated methods for patch clamp measurements can be realized, in particular in the case of a so-called patch clamp. Clamp chip, at least one optical path is present. This optical path is either part of the substrate itself, or it is associated with the substrate.

Der Ausdruck „Substrat“ soll nach der Erfindung umfassend verstanden werden, d.h. es soll sich hier um ein Material nach Art eines Trägers, einer Grundplatte oder dergleichen handeln, an dem die zur Durchführung der Patch-Clamp-Messungen notwendigen Strukturen, Komponenten und dergleichen ausgebildet oder vorgesehen sind. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um ein flaches Substrat nach Art einer Platte oder Folie. Dies soll bedeuten, dass derartige Substrate in der Regel eine größere Breite bzw. Länge, insbesondere eine wesentlich größere Breite bzw. Länge, gegenüber der Dicke (oder Höhe) eines solchen flachen Substrats aufweisen. Dabei wird in der Regel die Dicke eines folienartigen Substrats, das auch flexibel ausgestaltet sein kann, geringer sein als die Dicke eines plattenartigen Substrats. The term "substrate" is to be understood in accordance with the invention in its entirety, i. it should be a material in the manner of a carrier, a base plate or the like, on which the structures, components and the like necessary for carrying out the patch clamp measurements are designed or provided. This is preferably a flat substrate in the manner of a plate or foil. This is intended to mean that such substrates generally have a greater width or length, in particular a substantially greater width or length, compared to the thickness (or height) of such a flat substrate. As a rule, the thickness of a film-like substrate, which can also be made flexible, will be less than the thickness of a plate-like substrate.

„Mikrofluidische Komponenten“ oder „mikrofluidische Strukturen“ sind Komponenten, Strukturen, Bauteile und dergleichen, die eine Bevorratung, Bewegung, Mischung, Trennung oder sonstige Handhabung von flüssigen Medien auf kleinem und kleinstem Raum ermöglichen. Wie eingangs erläutert, werden bei den entsprechenden Patch-Clamp-Messungen die zu untersuchenden Membranen oder Zellen in der Regel in Form von Suspensionen in geeigneten Lösungsmitteln gehandhabt, und dabei u.a. an die entsprechende Patch-Clamp-Öffnung herangeführt oder von dieser abtransportiert. Derartige Suspensionen werden durch die genannten mikrofluidischen Komponenten und Strukturen hindurchgeführt. Das entsprechende Fachgebiet ist dem Fachmann unter dem Begriff der Mikrofluidik bekannt. "Microfluidic components" or "microfluidic structures" are components, structures, components and the like which enable storage, movement, mixing, separation or other handling of liquid media in the smallest and smallest spaces. As explained above, in the case of the corresponding patch clamp measurements, the membranes or cells to be examined are generally handled in the form of suspensions in suitable solvents, and in the process u.a. brought to the appropriate patch clamp opening or transported away from this. Such suspensions are passed through said microfluidic components and structures. The corresponding field is known to the person skilled in the art under the term of microfluidics.

Unter „Membranen“ im Sinne der Erfindung sollen alle Trennschichten oder auch Schichten mit anderer Funktion verstanden werden, die mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht werden können. Es kann sich hier ohne weiteres auch um künstliche Membranen handeln, die beispielsweise in Form von Lipid-Doppelschichten realisierbar sind. Bei den sogenannten Biomembranen, die erfindungsgemäß bevorzugt untersucht werden, handelt es sich in der Regel um Trennschichten zwischen verschiedenen Bereichen innerhalb einer lebenden Zelle (intrazellulär) oder auch zwischen dem Inneren einer Zelle und dem Zellaußenraum. Dementsprechend ist es erfindungsgemäß möglich, sowohl einzelne Membranfragmente, vollständige Membranen oder auch vollständige Zellen zu untersuchen. Auch Zellverbunde sollen von der Erfindung mit umfasst sein. For the purposes of the invention, "membranes" are to be understood as meaning all separating layers or also layers having a different function, which can be investigated with the aid of the patch-clamp technique. It may also be readily artificial membranes, which can be realized for example in the form of lipid bilayers. The so-called biomembranes, which are preferably investigated according to the invention, are usually separating layers between different regions within a living cell (intracellularly) or else between the interior of a cell and the cell outer space. Accordingly, it is possible according to the invention to study both individual membrane fragments, complete membranes or even complete cells. Cell assemblies should also be included in the invention.

Bei einem „optischen Pfad“ handelt es sich erfindungsgemäß um Mittel, die zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung vorgesehen oder geeignet sind. Derartige Mittel können auch gegebenenfalls weitere Mittel zur Erzeugung der elektromagnetischen Strahlung selbst enthalten.According to the invention, an "optical path" is a means provided or suitable for transmitting electromagnetic radiation. Such means may also optionally contain other means for generating the electromagnetic radiation itself.

Erfindungsgemäß ist der optische Pfad nicht auf die Übertragung bestimmter Wellenlängen der elektromagnetischen Strahlung beschränkt. Es können die unterschiedlichsten Wellenlängen, insbesondere von dem Gebiet der ultravioletten Strahlung bis zum Gebiet der Infrarotstrahlung übertragen werden. Insoweit ist der Begriff „optisch“ breit zu verstehen, und nicht nur auf den Bereich des sichtbaren Lichts beschränkt. According to the invention, the optical path is not limited to the transmission of certain wavelengths of the electromagnetic radiation. The most varied wavelengths, in particular from the field of ultraviolet radiation to the field of infrared radiation, can be transmitted. In that regard, the term "optical" is to be understood broadly, and not limited only to the range of visible light.

Der optische Pfad dient bei der Erfindung im weitesten Sinne dazu, die durch ihn übertragene elektromagnetische Strahlung für die Patch-Clamp-Messung, insbesondere die automatisierte Patch-Clamp-Messung nutzbar zu machen. The optical path is used in the invention in the broadest sense to make available the electromagnetic radiation transmitted through it for the patch clamp measurement, in particular the automated patch clamp measurement.

Solange dieser Zweck erfüllt ist, spielt es grundsätzlich keine Rolle, in welcher Weise der optische Pfad bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen ist. As long as this purpose is fulfilled, it basically does not matter in which way the optical path is provided in the device according to the invention.

Dementsprechend kann der optische Pfad dem Substrat in beliebiger Weise zugeordnet sein oder einen Teil des Substrates darstellen. Verschiedene bevorzugte Ausgestaltungen werden im Folgenden noch diskutiert. Accordingly, the optical path may be associated with the substrate in any manner or may constitute part of the substrate. Various preferred embodiments will be discussed below.

Wie bereits erläutert, befindet sich erfindungsgemäß im Substrat mindestens eine Öffnung, an der die Membran oder Zelle unter Ausbildung des Seals immobilisiert wird. Diese Öffnung wird in der Regel an einem Kanal, einer Pore, einer Bohrung oder dergleichen gebildet sein, die im weitesten Sinne die Patch-Clamp-Pipette darstellt. Bezogen auf den Funktionszustand der Vorrichtung, d.h. auf den Zustand, in dem die Zelle an der Öffnung immobilisiert ist und eine Messung durchgeführt werden kann, erfolgt die Immobilisierung bevorzugt an der „Oberseite“ der Patch-Clamp-Pipette und damit auch an der „Oberseite“ der durch diese Pipette gebildeten Öffnung. Dies wird im Zusammenhang mit der Zeichnung noch näher erläutert. As already explained, according to the invention there is at least one opening in the substrate at which the membrane or cell is immobilized to form the seal. This opening will usually be formed on a channel, a pore, a bore or the like, which represents the patch clamp pipette in the broadest sense. Based on the functional state of the device, i. to the state in which the cell is immobilized at the opening and a measurement can be carried out, the immobilization is preferably carried out on the "top" of the patch clamp pipette and thus also on the "top" of the opening formed by this pipette. This will be explained in more detail in connection with the drawing.

Der erfindungsgemäß vorgesehene optische Pfad kann nun grundsätzlich an beliebigen Stellen am Substrat vorgesehen oder diesem zugeordnet sein. Bezieht man dies auf die soeben beschriebene Ausgestaltung, dass die Immobilisierung der Membran oder Zelle an der „Oberseite“ der Öffnung erfolgt, so kann der optische Pfad dementsprechend möglichen Seitenflächen des Substrats zugeordnet sein oder auch der Seite (Oberseite), an der die Immobilisierung der Membran/Zelle erfolgt. Es ist erfindungsgemäß jedoch bevorzugt, wenn der optische Pfad derjenigen Seite des Substrats zugeordnet ist oder sich an derjenigen Seite des Substrats befindet, die zu der Seite der Öffnung abgewandt ist, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird. Wie im Zusammenhang mit der Zeichnung ebenfalls noch erläutert wird, erfolgt die Immobilisierung der Membran/Zelle dann vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung (Funktionszustand), während der optische Pfad dann am Substrat an der Seite vorgesehen ist, die zu der der Membran/Zelle abgewandten Seite der Öffnung bzw. der Patch-Clamp-Pipette gehört. Wird der optische Pfad in diesem Zusammenhang beispielsweise zu einer direkten optischen Beobachtung der Membran/Zelle während des Messvorgangs eingesetzt oder beispielsweise zur optischen Anregung der Membran/Zelle oder zur optischen Anregung von Reaktionen, die an der Membran/Zelle ablaufen, so kann man dies auch so beschreiben, dass diese Beobachtung/Anregung „von unten her“ erfolgt. The optical path provided according to the invention can now basically be provided at arbitrary locations on the substrate or assigned to it. If this is referred to the embodiment just described, that the immobilization of the membrane or cell takes place at the "top" of the opening, the optical path can accordingly be assigned to possible side surfaces of the substrate or also to the side (upper side) at which the immobilization of the Membrane / cell takes place. However, it is preferred according to the invention if the optical path is assigned to that side of the substrate or is located on that side of the substrate which faces away from the side of the opening at which the membrane / cell is immobilized. As will also be explained in connection with the drawing, the immobilization of the membrane / cell is then preferably at the top of the opening (functional state), while the optical path is then provided on the substrate on the side facing away from the membrane / cell Page of the opening or the patch clamp pipette heard. If, in this context, the optical path is used, for example, for a direct optical observation of the membrane / cell during the measuring process or, for example, for optical excitation of the membrane / cell or for optical excitation of reactions taking place at the membrane / cell, this is also possible so describe that this observation / excitation is done "from below".

Wie bereits dargestellt, kann der optische Pfad bei der Erfindung in verschiedener Weise realisiert werden. So ist es vorzugsweise möglich, dass der optische Pfad mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig, als Ausnehmung im Substrat selbst ausgebildet ist. Besteht das Substrat bei der Erfindung mindestens teilweise aus Material , das für mindestens einen Teil des elektromagnetischen Spektrums transparent ist, so kann an den Stellen, an denen der optische Pfad ausgebildet sein soll, entweder dieses Material selbst oder ein anderes Material, das dieses Material umgibt, entfernt werden, um auf diese Weise den „Zugang“ der entsprechenden elektromagnetischen Strahlung hin zur immobilisierten Membran/Zelle und damit die entsprechende Beobachtung/Anregung und dergleichen zu ermöglichen. As already stated, the optical path in the invention can be realized in various ways. Thus, it is preferably possible that the optical path is formed at least partially, preferably completely, as a recess in the substrate itself. In the invention, if the substrate is at least partially made of material that is transparent to at least a portion of the electromagnetic spectrum, then at the locations where the optical path is to be formed, either this material itself or another material surrounding that material , be removed to allow in this way the "access" of the corresponding electromagnetic radiation towards the immobilized membrane / cell and thus the corresponding observation / excitation and the like.

In Weiterbildung ist es bei der Erfindung möglich, dass der optische Pfad ein transparentes Material umfasst, das zumindest für einen Teil des elektromagnetischen Spektrums (mindestens teilweise) transparent ist. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um entsprechende Kunststoffmaterialien handeln. Vorzugsweise umfasst der optische Pfad jedoch in solchen Fällen (transparentes) Glas oder Quarzglas oder besteht vollständig aus solchen Materialien. Insbesondere können in diesen Fällen dann Sichtöffnungen oder sogenannte Fenster aus transparentem Glas oder Quarzglas vorgesehen sein. In a further development, it is possible with the invention that the optical path comprises a transparent material which is transparent (at least in part) at least for part of the electromagnetic spectrum. This may also be, for example, corresponding plastic materials. Preferably, however, the optical path in such cases comprises (transparent) glass or quartz glass or consists entirely of such materials. In particular, viewing openings or so-called windows made of transparent glass or quartz glass can then be provided in these cases.

Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der optische Pfad mindestens eine Glasfaseroptik oder mindestens eine Mikroskopoptik. Derartige Optiken sind dann dem Substrat ebenfalls in geeigneter Weise zugeordnet, oder sie bilden ein Bauteil des Substrats. Insbesondere können solche Optiken in entsprechenden Ausnehmungen am Substrat vorgesehen sein. In gleicher Weise ist es möglich, eine Schnittstelle für eine Glasfaseroptik oder eine Mikroskopoptik vorzusehen, mit deren Hilfe dann die eigentliche Glasfaseroptik oder Mikroskopoptik an das Substrat bzw. die Vorrichtung angeschlossen werden kann. Auch hier soll der Begriff der Optik umfassend verstanden werden und bedeuten, dass grundsätzlich jede Art von elektromagnetischer Strahlung durch die entsprechenden Optiken hindurch übertragen werden kann.In other preferred embodiments of the invention, the optical path comprises at least one glass fiber optic or at least one microscope optic. Such optics are then also suitably associated with the substrate, or they form a component of the substrate. In particular, such optics may be provided in corresponding recesses on the substrate. In the same way it is possible to provide an interface for a glass fiber optic or a microscope optics, with the aid of which then the actual glass fiber optics or microscope optics can be connected to the substrate or the device. Again, the term of optics should be understood comprehensively and mean that in principle any type of electromagnetic radiation can be transmitted through the corresponding optics.

Wie bereits ausgeführt, können die mikrofluidischen Komponenten oder mikrofluidischen Strukturen bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung in unterschiedlicher Weise ausgebildet sein, insbesondere im Hinblick darauf, dass automatisierte Patch-Clamp-Messungen durchführbar sind. In diesem Zusammenhang sind Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt, bei denen zusätzlich zu der Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, und gegebenenfalls zusätzlich zu dem Kanal, an dem diese Öffnung ausgebildet ist, mindestens ein (weiterer) separater Kanal vorgesehen ist. Dieser separate Kanal steht mit der genannten Öffnung nicht in (direkter) Verbindung und ist dazu vorgesehen, die Membran oder Zelle durch Anlegen eines Unterdrucks an der genannten Öffnung zu positionieren bzw. festzulegen. Dieses Merkmal des separaten Kanals, der gegebenenfalls auch als Ansaugkanal bezeichnet werden kann, sowie dessen Funktion ist in der oben bereits genannten EP-B1-1 311 655 beschrieben. Auf den Inhalt dieser Patentschrift wird Bezug genommen und verwiesen. Die insoweit notwendige Offenbarung wird hiermit durch diese Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.As already stated, the microfluidic components or microfluidic structures in the device according to the invention can be embodied in different ways, in particular in view of the fact that automated patch clamp measurements can be carried out. In this connection, embodiments of the device according to the invention are preferred in which at least one (further) separate channel is provided in addition to the opening at which the membrane / cell is immobilized, and optionally in addition to the channel on which this opening is formed. This separate channel is not in direct communication with said opening and is intended to position the membrane or cell by applying a negative pressure to said opening. This feature of the separate channel, which may optionally also be referred to as intake duct, as well as its function is already mentioned in the above EP-B1-1 311 655 described. Reference is made to the content of this patent and referenced. The disclosure required to this extent is hereby made the content of this description by this reference.

Der (zusätzliche) separate Kanal kann eine beliebige Querschnittsform bzw. Querschnittsfläche besitzen. Bevorzugt handelt es sich um Querschnittsflächen, die kreisförmig, oval, rechteckförmig oder quadratisch sind. Es sind jedoch auch andere n-eckförmige (n > 3) Querschnittsflächen u.a. möglich. Der Durchmesser D all dieser Querschnittsflächen soll dabei als die größte Abmessung definiert sein, die zwischen zwei Punkten auf dem Außenumfang der Querschnittsfläche existiert. The (additional) separate channel may have any cross-sectional shape or cross-sectional area. Preferably, they are cross-sectional areas which are circular, oval, rectangular or square. However, there are also other n-cornered (n> 3) cross-sectional areas u.a. possible. The diameter D of all these cross-sectional areas should be defined as the largest dimension existing between two points on the outer circumference of the cross-sectional area.

Vorzugsweise mündet der genannte separate Kanal in einer separaten Öffnung, d.h. in einer Öffnung, die mit der Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, nicht in Verbindung steht. Vorzugsweise umgibt die separate Öffnung die Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig konzentrisch. Auch dies wird im Zusammenhang mit der Zeichnung noch näher erläutert. Preferably, said separate channel opens in a separate opening, ie in one Opening that does not communicate with the opening where the membrane / cell is immobilized. Preferably, the separate opening surrounds the opening at which the membrane / cell is immobilized, at least partially, preferably completely concentrically. This too will be explained in more detail in connection with the drawing.

Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Durchmesser (D) des separaten Kanals über den Verlauf dieses Kanals nicht konstant. Insbesondere vergrößert sich der Durchmesser des separaten Kanals in Richtung auf seine separate Öffnung, vorzugsweise kontinuierlich. Auf diese Weise lässt sich die Funktion des separaten Kanals, nämlich die Membran/Zelle (vor Ausbildung des eigentlichen Seals/Gigaseals an der Öffnung) beispielsweise aus der Suspension, in der sich die Membran/Zelle befindet, zu selektieren, zu positionieren oder wieder zu entfernen in steuerbarer Weise noch besser zu erfüllen. In further preferred embodiments of the device according to the invention, the diameter (D) of the separate channel over the course of this channel is not constant. In particular, the diameter of the separate channel increases in the direction of its separate opening, preferably continuously. In this way, the function of the separate channel, namely the membrane / cell (before the formation of the actual seal / gigaseal at the opening), for example, from the suspension in which the membrane / cell is located to select, position or re-closed remove in a controllable way even better.

Wie aus den bisherigen Ausführungen bereits hervorgeht, kann das Merkmal des separaten Kanals, der zur Positionierung/Festlegung der Membran/Zelle an der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung vorgesehen ist, auf unterschiedliche Weise realisiert werden. So kann zu dem entsprechenden Zweck ein separater Kanal, der in der zugehörigen separaten Öffnung mündet, vorgesehen sein. Bei anderen Ausführungsformen kann auch ein separater Kanal vorhanden sein, der mit mindestens zwei, vorzugsweise mehreren separaten Öffnungen in Verbindung steht. As already apparent from the previous embodiments, the feature of the separate channel, which is provided for positioning / fixing the membrane / cell to the actual patch-clamp opening, can be realized in different ways. Thus, for the corresponding purpose, a separate channel, which opens into the associated separate opening, may be provided. In other embodiments, a separate channel may be present, which communicates with at least two, preferably a plurality of separate openings.

Schließlich sind Ausführungsformen möglich, bei denen mindestens zwei, vorzugsweise mehrere separate Kanäle vorgesehen sind, die wiederum jeweils in einer separaten Öffnung oder auch in mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Öffnungen münden können. Finally, embodiments are possible in which at least two, preferably a plurality of separate channels are provided, which in turn may each open into a separate opening or in at least two, preferably a plurality of openings.

Bei allen genannten Ausführungsformen mit mindestens einem separaten Kanal ist es bevorzugt, wenn die separaten Öffnungen, in denen die separaten Kanäle münden, die eigentliche (Patch-Clamp-)Öffnung, an der die Membran/Zelle unter Ausbildung eines Seals/Gigaseals immobilisiert wird, mindestens teilweise konzentrisch umgeben. Durch eine derartige (mindestens teilweise) konzentrische Anordnung kann die Zelle in besonders günstiger Weise entlang ihres Aussenumfangs an bzw. über der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung positioniert bzw. festgelegt werden. In all the above-mentioned embodiments with at least one separate channel, it is preferred if the separate openings in which the separate channels open open, the actual (patch clamp) opening at which the membrane / cell is immobilized to form a seal / gigaseal, surrounded at least partially concentrically. By such (at least partially) concentric arrangement, the cell can be positioned or fixed in a particularly favorable manner along its outer circumference at or above the actual patch clamp opening.

Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung unter näherer Definition der vorgesehenen mikrofluidischen Komponenten oder Strukturen wie folgt ausgebildet. Sie weist auf:

– ein Substrat mit den folgenden mikrofluidischen Strukturen: o mindestens einen Flüssigkeitszulauf, vorzugsweise zwei Flüssigkeitszuläufe, o mindestens einen Flüssigkeitsablauf, o mindestens eine zwischen dem Flüssigkeitszulauf und dem Flüssigkeitsablauf angeordnete Perfusionskammer, o mindestens einen Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette mit einer Öffnung, die in der Perfusionskammer mündet, wobei der Kanal vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Flüssigkeitskanal in direkter Verbindung steht, und o mindestens einen separaten Kanal, der mit der Öffnung nicht in direkter Verbindung steht und der in mindestens einer separaten Öffnung mündet, die insbesondere die Öffnung mindestens teilweise konzentrisch umgibt.

With particular preference, the device according to the invention is formed as follows by further defining the intended microfluidic components or structures. She points out:

A substrate having the following microfluidic structures: o at least one liquid inlet, preferably two liquid inlets, o at least one liquid outlet, o at least one perfusion chamber arranged between the liquid inlet and the liquid outlet, o at least one channel in the manner of a patch clamp pipette with an opening opening in the perfusion chamber, the channel preferably being in direct communication with at least one further fluid channel, and o at least one separate channel not in direct communication with the opening and opening into at least one separate port, in particular the port at least partially concentric surrounds.

Weiterhin ist bei den zuletzt genannten Ausführungsformen ebenfalls ein optischer Pfad zur Übertragung von elektromagnetischer Strahlung vorhanden. Dieser optische Pfad befindet sich vorzugsweise auf der zur Oberseite der Öffnung abgewandten Seite des Substrats. Furthermore, in the latter embodiments also an optical path for the transmission of electromagnetic radiation is present. This optical path is preferably located on the side of the substrate facing away from the top of the opening.

Bei den zuletzt beschriebenen Ausführungsformen besitzt also der Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette diejenige Öffnung, an der die Immobilisierung der Membran/Zelle unter Ausbildung des Seals/Gigaseals für die Patch-Clamp-Messung erfolgt. Diese Öffnung mündet in der Perfusionskammer, in der sich also die immobilisierte Membran/Zelle während der Patch-Clamp-Messung in immobilisiertem Zustand befindet. Der weitere Flüssigkeitskanal, der mit dem genannten Kanal in Verbindung stehen kann, dient dazu, an der Öffnung einen definierten, einstellbaren Flüssigkeitsdruck auf die Membran/Zelle zur Ausbildung des Seals/Gigaseals aufzubringen. Dies geht auch aus der Zeichnung hervor.In the last-described embodiments, the channel thus has the opening in the manner of a patch clamp pipette, at which the immobilization of the membrane / cell takes place with formation of the seal / gigaseal for the patch clamp measurement. This opening opens into the perfusion chamber, in which the immobilized membrane / cell is immobilized during patch clamp measurement. The further liquid channel, which may communicate with said channel, serves to apply at the opening a defined, adjustable liquid pressure to the membrane / cell to form the seal / gigaseal. This is also apparent from the drawing.

Der separate Kanal, der mit der genannten Öffnung, an der das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, nicht in (direkter) Verbindung steht, mündet in einer oder mehreren separaten Öffnungen. Diese separaten Öffnungen dienen beispielsweise dazu, die Membran/Zelle durch Anlegen eines Unterdrucks an der Öffnung, an der später das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, zu positionieren. Zu diesem Zweck ist es von Vorteil, wenn die separate Öffnung bzw. die separaten Öffnungen die Öffnung, an der (später) das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, mindestens teilweise konzentrisch, vorzugsweise vollständig konzentrisch, umgibt oder umgeben. The separate channel, which is not in (direct) connection with said opening on which the seal / gigaseal is formed, opens in one or more separate openings. These separate openings serve, for example, to position the membrane / cell by applying a negative pressure to the opening at which the seal / gigaseal is later formed. For this purpose, it is advantageous if the separate opening or the separate openings at least partially concentric, preferably completely concentric, surrounds or surrounds the opening on which (later) the seal / gigaseal is formed.

Die eine oder mehrere separate Öffnungen können so ausgelegt sein, dass eine Strömung durch die separate Öffnung hindurch an der Zelle vorbei möglich ist, wodurch der Lösungswechsel oder Suspensionswechsel an der Zelle bei longitudinaler Strömung in der Perfusionskammer (d.h. in Längsrichtung der Kammer vom Zulauf zum Ablauf) zusätzlich beschleunigt werden kann, indem die Zelle zusätzlich zu einer laminaren longitudinalen Strömung einer transversalen Strömung (d.h. quer, insbesondere senkrecht zur Längsrichtung (quasi in Richtung Substrat)) ausgesetzt wird. The one or more separate openings may be configured to allow flow past the cell through the separate opening, whereby the solution change or suspension change at the cell at longitudinal Flow in the perfusion chamber (ie in the longitudinal direction of the chamber from inlet to drain) can be additionally accelerated by the cell in addition to a laminar longitudinal flow of a transverse flow (ie transversely, in particular perpendicular to the longitudinal direction (in the direction of substrate)) is exposed.

Sowohl der Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette als auch der separate Kanal sind vorzugsweise in der Weise steuer- und regelbar, dass diese Kanäle gezielt mit Flüssigkeit, insbesondere mit Flüssigkeitsdruck, beaufschlagbar sind, und dies bidirektional. Dies bedeutet, dass gezielt Überdrucke und Unterdrucke der entsprechenden Flüssigkeiten in diese Kanäle eingebracht werden können, damit diese die beschriebenen Funktionen erfüllen.Both the channel in the manner of a patch clamp pipette and the separate channel are preferably controllable and controllable in such a way that these channels can be acted upon specifically with liquid, in particular with liquid pressure, and this bidirectional. This means that targeted overpressures and underpressures of the corresponding liquids can be introduced into these channels, so that they fulfill the functions described.

Insbesondere können die letztgenannten Funktionen erfindungsgemäß dadurch bereitgestellt werden, dass mindestens zwei, vorzugsweise zwei weitere Flüssigkeitskanäle vorgesehen sind, die mit dem Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette in Verbindung stehen. In gleicher Weise können vorzugsweise mindestens zwei separate Kanäle, vorzugsweise zwei (weitere) separate Kanäle, die mit der separaten Öffnung in Verbindung stehen, vorgesehen sein. Auf diese Weise ist es möglich, dass die jeweils zusätzlichen (zweiten) Kanäle eine Bypass-Funktion für die jeweils zugehörigen (ersten) Kanäle übernehmen können. In particular, the last-mentioned functions can be provided according to the invention in that at least two, preferably two, further liquid channels are provided, which communicate with the channel in the manner of a patch clamp pipette. In the same way, preferably at least two separate channels, preferably two (further) separate channels, which communicate with the separate opening may be provided. In this way, it is possible that the respective additional (second) channels can take over a bypass function for the respectively associated (first) channels.

Bei den zuletzt beschriebenen Ausführungsformen ist es dann beispielsweise möglich, den Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette bzw. den separaten Kanal mit Hilfe des jeweiligen Bypass-Kanals zu befüllen. Dabei sind die beiden jeweils einander zugehörigen Kanäle als Zuführkanal (Einfließrichtung der Flüssigkeit) bzw. als Abführkanal (Rückflussrichtung der Flüssigkeit) genutzt. Der eigentliche Patch-Clamp-Kanal (Pipette) bzw. der der separaten Öffnung zugeordnete eigentliche separate Kanal wird auf diese Weise nach Art einer Abzweigung befüllt, da der eigentliche Füllstrom der Flüssigkeit an den jeweiligen Öffnungen vorbeigeführt wird. Dies ist insbesondere deshalb von praktischer Bedeutung, da auf diese Weise bspw. Luft oder allgemein Gase, die sich in diesen mikrofluidischen Strukturen befinden, besser kontrolliert oder geregelt strömen und ggf. durch die entsprechende Flüssigkeit ersetzt werden können. In the embodiments described last, it is then possible, for example, to fill the channel in the manner of a patch clamp pipette or the separate channel with the aid of the respective bypass channel. In this case, the two mutually associated channels are used as a feed channel (inflow direction of the liquid) or as a discharge channel (return direction of the liquid). The actual patch-clamp channel (pipette) or the separate opening associated actual separate channel is filled in this way in the manner of a branch, since the actual filling flow of the liquid is guided past the respective openings. This is particularly of practical importance, since in this way, for example, air or generally gases that are in these microfluidic structures, better controlled or regulated flow and possibly can be replaced by the corresponding liquid.

Auch ein Flüssigkeitsaustausch in den mikrofluidischen Strukturen ist auf diese Weise besser möglich, da auch ein solcher Flüssigkeitsaustausch nicht über die eigentliche Patch-Clamp-Öffnung bzw. über die separate Öffnung erfolgen muss. Ein solcher Flüssigkeitsaustausch ist beispielsweise nach dem mechanischen Durchbrechen einer Zellmembran für einen intrazellulären Lösungswechsel nötig oder für das Einbringen perforierender Substanzen, wenn ein mechanisches Durchbrechen der Zellmembran nicht vorgesehen ist. Also, a fluid exchange in the microfluidic structures is better possible in this way, as well as such a liquid exchange does not have to be made via the actual patch clamp opening or via the separate opening. Such a fluid exchange is necessary, for example, after the mechanical breakdown of a cell membrane for an intracellular solution change or for the introduction of perforating substances, if a mechanical breakdown of the cell membrane is not provided.

Schließlich ist es bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt, dass die von dem Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette gebildete Öffnung und/oder die von dem separaten Kanal gebildete separate Öffnung in die Perfusionskammer hineinragt, d.h. sich sozusagen im Inneren der Perfusionskammer befindet. Man kann dies auch so beschreiben, dass sich die entsprechenden Öffnungen in diesen Fällen nicht in der Begrenzungsfläche oder Wand der Perfusionskammer befinden, sondern über diese Begrenzungsfläche hinaus in das Innere der Perfusionskammer ragen. Dies hat Vorteile im Hinblick auf die Durchströmung der Perfusionskammer mit der Suspension, die die Membranen/Zellen enthält, und damit einen Einfluss auf die Positionierbarkeit bzw. auf die tatsächliche Immobilisierung der Membranen/Zellen mit Hilfe der und an den entsprechenden Öffnungen. Des Weiteren kann eine auf der Öffnung kontaktierte Zelle bei solchen Ausführungsformen so schneller mit einer weiteren Lösung oder Suspension umspült werden, z.B. um einen Liganden schneller an einen ligandengesteuerten Ionenkanal anzuspülen, als dieser Ionenkanal durch Desensitivierung inaktiviert.Finally, in the device according to the invention it is preferred that the opening formed by the channel in the manner of a patch-clamp pipette and / or the separate opening formed by the separate channel project into the perfusion chamber, i. is inside the perfusion chamber, so to speak. This can also be described in such a way that the corresponding openings in these cases are not located in the boundary surface or wall of the perfusion chamber, but project beyond this boundary surface into the interior of the perfusion chamber. This has advantages with regard to the flow through the perfusion chamber with the suspension containing the membranes / cells, and thus an influence on the positionability or on the actual immobilization of the membranes / cells by means of and at the corresponding openings. Furthermore, in such embodiments, a cell contacted on the opening may be soaked with a further solution or suspension more rapidly, e.g. to rinse a ligand more rapidly to a ligand-gated ion channel than this ion channel inactivates by desensitization.

Die zuletzt beschriebene Ausbildung der Öffnungen (Hineinragen) kann beispielsweise durch eine entsprechende mikromechanische Strukturierung im Substrat realisiert werden. The last-described design of the openings (inches) can be realized for example by a corresponding micromechanical structuring in the substrate.

Bei allen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann das Substrat mindestens teilweise aus Glas oder Quarzglas, vorzugsweise vollständig aus Glas oder Quarzglas, bestehen. Auch andere teilweise oder völlig transparente Materialien wie teilweise oder völlig transparente Kunststoffe können eingesetzt werden. Auch Materialien, die ein spezifisches Transmissionsspektrum aufweisen, sind verwendbar, um z.B. bestimmte Frequenzanteile elektromagnetischer Strahlung (beispielsweise mit unerwünschter biologischer Aktivität) auszublenden.In all embodiments of the device according to the invention, the substrate may at least partially consist of glass or quartz glass, preferably completely of glass or quartz glass. Other partially or completely transparent materials such as partially or completely transparent plastics can be used. Also, materials which have a specific transmission spectrum are useful for e.g. certain frequency components of electromagnetic radiation (for example, with unwanted biological activity) hide.

In diesem Zusammenhang ist es insbesondere auch möglich, bestimmte Stellen des Substrats bewusst nicht aus teilweise oder völlig transparentem Material zu fertigen, beispielsweise um einen Einfall von elektromagnetischer Strahlung an bestimmten Stellen zu verhindern. Dies kann beispielsweise dazu dienen, eine Einstreuung unerwünschter elektromagnetischer Strahlung (Streulicht) zu verhindern. In this context, it is also possible, in particular, to deliberately not make certain parts of the substrate from partially or completely transparent material, for example to prevent an incidence of electromagnetic radiation at specific locations. This can be used, for example, to prevent interference with unwanted electromagnetic radiation (scattered light).

Außerdem sollen von der Erfindung auch Vorrichtungen umfasst sein, bei denen in einem Substrat, vorzugsweise flachen Substrat, nicht nur eine Öffnung, sondern mindestens zwei, vorzugsweise mehrere Öffnungen vorgesehen sind, an denen unter Immobilisierung einer Membran/Zelle ein Seal/Gigaseal ausgebildet ist. Zusätzlich zu diesen Öffnungen können dann gegebenenfalls für alle Öffnungen separate Öffnungen vorgesehen sein, an denen eine vorherige Positionierung der Membranen/Zellen vor Ausbildung des Seals/Gigaseals möglich ist. In der beschriebenen Weise können solche separaten Öffnungen diese Öffnungen mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig, konzentrisch umgeben. In addition, the invention also includes devices in which in a substrate, preferably flat substrate, not only an opening, but at least two, preferably a plurality of openings are provided, in which under Immobilization of a membrane / cell a seal / gigaseal is formed. In addition to these openings, separate openings may then optionally be provided for all openings, at which a prior positioning of the membranes / cells before the formation of the seal / gigaseal is possible. In the manner described, such separate openings may surround these openings at least partially, preferably completely, concentrically.

Weiter ist es erfindungsgemäß möglich, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung mehrere vorzugsweise flache Substrate (mit einer Öffnung oder mehreren Öffnungen) umfasst. Dabei können mindestens zwei, insbesondere mehrere solcher Substrate über einen geeigneten Träger, der beispielsweise gitter- oder rasterartig angeordnet sein kann, zu einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zusammengefasst werden. Furthermore, it is possible according to the invention that a device according to the invention comprises a plurality of preferably flat substrates (with one or more openings). In this case, at least two, in particular a plurality of such substrates via a suitable support, which may be arranged, for example, grid or grid-like, are combined to form a device according to the invention.

Schließlich ist es auch möglich, mehrere der zuletzt beschriebenen Vorrichtungen zu einer (größeren) erfindungsgemäßen Vorrichtung zusammenzufassen. Finally, it is also possible to combine several of the devices described last to a (larger) device according to the invention.

Man kann dies auch so beschreiben, dass in den zuletzt genannten Fällen mehrere Patch-Clamp-Chips (mit einem oder mehreren Substraten, die wiederum eine oder mehrere Öffnungen für das Seal/Gigaseal aufweisen können) zu einer größeren Einheit mit mehreren Chips zusammengefasst werden. This can also be described in such a way that in the last-mentioned cases several patch clamp chips (with one or more substrates, which in turn can have one or more openings for the seal / gigaseal) are combined to form a larger unit with several chips.

Neben der beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Erfindung neue Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden. In addition to the described device according to the invention, the invention comprises novel methods, which are described below.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist zunächst ein Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, bei dem entweder eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran oder der Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung oder eine optisch ausgelöste Messung an einer Membran oder Zelle, die an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist, erfolgt. Solche Verfahren können vorzugsweise mit der bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden. According to the invention, preference is first given to a method for determining preferably biologically relevant parameters on membranes and cells, which in particular comprise or form membrane proteins such as ion channels, in which either an optically triggered immobilization of the membrane or of the cell is provided on an opening provided in a preferably flat substrate an optically triggered measurement on a membrane or cell, which is immobilized on an opening provided in a preferably flat substrate, takes place. Such methods can preferably be carried out with the device according to the invention already described.

Weiter bevorzugt ist erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden, bei dem eine Stimulation, insbesondere eine optische Stimulation der Membran oder der Zelle erfolgt, während die Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist. Auch bei den zuletzt genannten bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dieses insbesondere mit der bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden. Further preferred according to the invention is a method for determining preferably biologically relevant parameters on membranes and cells, in particular membrane proteins such as ion channels or form, in which a stimulation, in particular an optical stimulation of the membrane or the cell takes place while the cell at an in a preferably flat substrate provided opening is immobilized. Even with the last-mentioned preferred embodiments of the method according to the invention, this can be carried out in particular with the device according to the invention already described.

Erfolgt bei den zuletzt genannten Verfahren (alternativ zu oder zusätzlich zu einer optischen Stimulation) eine andere Stimulation der Membran oder Zelle, so handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine mechanische, eine chemische, eine biochemische und/oder eine thermale Stimulation. In diesen Fällen wird die Membran/Zelle dementsprechend mechanisch, durch einen chemischen oder biochemischen Stoff oder durch die Einwirkung von Wärme/Hitze stimuliert, um eine mögliche Reaktion der Membran/Zelle auf den entsprechenden Reiz (Stimulation) zu untersuchen.If in the last-mentioned methods (alternatively to or in addition to an optical stimulation) another stimulation of the membrane or cell occurs, this is preferably a mechanical, a chemical, a biochemical and / or a thermal stimulation. In these cases, the membrane / cell is accordingly stimulated mechanically, by a chemical or biochemical substance or by the action of heat / heat in order to investigate a possible reaction of the membrane / cell to the corresponding stimulus (stimulation).

Im Rahmen der genannten erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran/Zelle beispielsweise in der Weise realisieren, dass basierend auf einem optischen Signal Membranen/Zellen an der Patch-Clamp-Öffnung gefangen und immobilisiert werden. Auch eine Freigabe der Membran/Zelle von dieser Öffnung kann aufgrund optischer Signale bewirkt werden. Man kann hier auch von einer optisch getriggerten Selektion der Membranen/Zellen sprechen. Within the scope of the aforementioned method according to the invention, an optically initiated immobilization of the membrane / cell can be realized, for example, in such a way that membranes / cells are captured and immobilized on the patch clamp opening based on an optical signal. A release of the membrane / cell from this opening can be effected due to optical signals. One can also speak here of an optically triggered selection of the membranes / cells.

Eine optisch ausgelöste Messung an der Membran/Zelle kann bei anderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen, indem Eigenschaften, Zusammensetzungen, Konzentrationen u.a. von nicht-organischen oder organischen/biologischen Substanzen an den immobilisierten Membranen oder Zellen bestimmt werden. An optically triggered measurement on the membrane / cell can be carried out in other embodiments of the method according to the invention, by properties, compositions, concentrations u.a. of non-organic or organic / biological substances on the immobilized membranes or cells.

Auch hier ist eine optisch getriggerte Messung möglich, z.B. ein Start der Messung nach Überschreitung einer vorgegebenen Schwelle eines optischen oder elektrophysiologischen Messwerts. Again, optically triggered measurement is possible, e.g. a start of the measurement after exceeding a predetermined threshold of an optical or electrophysiological measurement.

Grundsätzlich können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die unterschiedlichsten Messgrößen bestimmt werden wie Volumen, Größe, Masse, Dichte, elektrophysiologische Aktivität, Vitalität, Morphologie und dergleichen. In diesem Zusammenhang ist es auch möglich, emittierte elektromagnetische Strahlung beliebiger Frequenzen zu detektieren, um molekulare Veränderungen, insbesondere Konzentrationsänderungen ausgewählter Stoffe zu detektieren, entweder in der beschriebenen mikrofluidischen Struktur oder in der entsprechenden Membran/Zelle. Besonders hervorzuheben ist hier die Detektion fluoreszierender Stoffe, beispielsweise Moleküle, deren Wechselwirkung mit der Membran/Zelle erfindungsgemäß untersucht werden kann. In principle, in the method according to the invention, the most varied measured variables can be determined, such as volume, size, mass, density, electrophysiological activity, vitality, morphology and the like. In this context, it is also possible to detect emitted electromagnetic radiation of arbitrary frequencies in order to detect molecular changes, in particular changes in concentration of selected substances, either in the described microfluidic structure or in the corresponding membrane / cell. Particularly noteworthy here is the detection of fluorescent substances, such as molecules whose interaction with the membrane / cell according to the invention can be investigated.

Erfindungsgemäß können hier über den erfindungsgemäß vorgesehenen optischen Pfad Patch-Clamp-Messungen kombiniert werden mit abbildender Mikroskopie, mit Fluoreszenzmessungen, mit Polarisationsfiltern, Frequenz- und anderen Filtern, mit konfokaler Mikroskopie, mit FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer), mit anderer (Bio-/Chemo-)Lumineszenzmessung, mit photometrischen oder kolorimetrischen Messungen, mit optischer Detektion von Gasblasen und makroskopischen Teilchen, mit dem Einsatz von Kontrastmitteln, auch in Verbindung mit den zuvor genannten Verfahren. Auch die zeitabhängige optische Messung der Proteinlokalisation und des sogenannten Proteintrafficking (gegebenenfalls im Zeitraum von Stunden oder Tagen) ist erfindungsgemäß möglich. According to the invention, patch clamp measurements can be combined with imaging microscopy, with fluorescence measurements, with polarization filters, frequency and other filters, with confocal microscopy, with FRET (fluorescence resonance energy transfer), with other (biological / Chemo-) Lumineszenzmessung, with photometric or colorimetric measurements, with optical detection of gas bubbles and macroscopic particles, with the use of contrast agents, also in conjunction with the aforementioned methods. Also, the time-dependent optical measurement of protein localization and the so-called protein trafficking (possibly in the period of hours or days) is possible according to the invention.

Wie bereits angesprochen, ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem eine Stimulation der Membran oder Zelle erfolgt, die Applikation unterschiedlichster Stimuli möglich, und zwar am Äußeren der Zellen oder im Inneren der Zellen oder sogar im Zellverbund oder Gewebsverbund. Diese Stimuli werden in der Regel über die mikrofluidischen Strukturen im Substrat während der Messung aufgebracht. As already mentioned, in the method according to the invention, in which a stimulation of the membrane or cell takes place, the application of a wide variety of stimuli is possible, specifically on the outside of the cells or in the interior of the cells or even in the cell composite or tissue composite. These stimuli are typically applied via the microfluidic structures in the substrate during the measurement.

Bei den mechanischen Stimuli kann es sich hier um eine Änderung des Durchflusses der Strömung, um einen Richtungswechsel der Strömung, um Druckveränderungen in den verschiedenen mikrofluidischen Strukturen (Patch-Clamp-Kanal, Ansaugkanal, Perfusionskammer und dergleichen) handeln. The mechanical stimuli may be a change in the flow rate of the flow, a change of direction of the flow, pressure changes in the various microfluidic structures (patch-clamp channel, suction channel, perfusion chamber and the like).

Eine chemische/biochemische Stimulation kann erfolgen über, vorzugsweise schnelle Substanzwechsel an der Zelle während deren Immobilisierung im Gigaseal, z.B. an Liganden gesteuerten Ionenkanälen, über einen transversalen Strömungsfluss in der Perfusionskammer (sogenannter Cross Flow), und dergleichen. Dieser Cross Flow kann beispielsweise mit Hilfe der bereits beschriebenen Ansaugöffnung erfolgen. A chemical / biochemical stimulation can be carried out via, preferably rapid, substance changes on the cell during its immobilization in the gigaseal, e.g. Ligand-controlled ion channels, via a transverse flow flow in the perfusion chamber (so-called cross flow), and the like. This cross flow can take place, for example, with the aid of the intake opening already described.

Weiter können lichtaktivierbare Substanzen appliziert werden, die durch Belichtung in gleichbleibender oder veränderlicher Frequenz und/oder Lichtstärke und/oder über Lichtpulse freigesetzt werden, und so die jeweiligen Rezeptoren gegebenenfalls schneller ansprechen, als dies durch einen Lösungswechsel/Substanzwechsel möglich wäre. Furthermore, it is possible to apply light-activatable substances which are released by exposure in constant or variable frequency and / or light intensity and / or by light pulses, and thus possibly respond faster to the respective receptors than would be possible by changing the solution / substance.

Weitere Stimuli können direkt oder indirekt erzeugt werden durch

– Applikation von elektromagnetischer Strahlung jeglicher Frequenz zur Modifikation von Membranen, Zellen oder vorhandenen Substanzen während der Messung,
– Transfektion von positionierten Einzelzellen oder eines Zellverbunds oder eines Gewebsverbunds während der Messung,
– Zellwachstum von positionierten Einzelzellen oder eines Zellverbunds oder Gewebsverbunds während der Messung,
– Kultivierung von zellulären Netzwerken während der Messung,
– optische Stimulation lichtsensitiver Proteine (beispielsweise Ionenkanälen bzw. von an solchen Ionenkanälen gekoppelten Rezeptoren) und Vermessung der Lichtemission (im Dunkeln).

Further stimuli can be generated directly or indirectly by

Application of electromagnetic radiation of any frequency for modifying membranes, cells or substances present during the measurement,
Transfection of positioned single cells or a cell composite or a tissue composite during the measurement,
Cell growth of positioned single cells or of a cell composite or tissue composite during the measurement,
- Cultivation of cellular networks during the measurement,
Optical stimulation of light-sensitive proteins (for example ion channels or receptors coupled to such ion channels) and measurement of the light emission (in the dark).

Insbesondere umfasst die Erfindung Verfahren, bei denen eine optische Messung und/oder optische Stimulation mit Patch-Clamp-Messungen und/oder einem Lösungswechsel an Zellen oder Membranen kombiniert wird. Dazu wird eine Zelle oder Membran mittels der separaten Öffnung auf der Patch-Clamp-Öffnung reversibel platziert und optisch vermessen. Weist die Zelle auf Basis der optischen Messungen nicht die gewünschten Eigenschaften auf, so kann die Zelle mit der separaten Öffnung und/oder der Strömung in der Perfusionskammer wieder abgespült werden und eine weitere Zelle angesaugt und, falls geeignet, an der Patch-Clamp-Öffnung irreversibel nach dem Patch-Clamp-Verfahren kontaktiert und dann optisch vermessen und stimuliert werden. Dabei kann intrazellulärer oder extrazellulärer Lösungswechsel erfolgen, um z.B. die Ionenkonzentration zu verändern oder biologisch aktive Substanzen an die Membran oder Zelle zu bringen. Parallel kann eine mechanische Stimulation über Drucke oder Strömungen an Öffnung, separater Öffnung oder Perfusionkammer erfolgen. Beispiele für das Verfahren sind automatisiertes Patch Clamp in Kombination mit intrazellulärer Perfusion, mit fluoreszenzbasierter Detektion und Zellselektion bei transienter Transfektion (z.B. GFP-Expression), mit fluoreszenzbasierter Detektion und Zellselektion von Antikörper-markierten Zellen, mit Fluoreszenz Detektion für intrazelluläre Calcium- oder pH-Messung (Fura-2 bzw.,BCECF-Farbstoffe u.ä), mit FRET, um in Kombination mit Patch Clamp Funktionsbeziehungen von Ionenkanälen zu untersuchen, mit der Möglichkeit der optisch induzierten Freisetzung von Zellstimulatoren und sog. Second Messenger (“caged compounds”, z.B. Ca2+, NO,) mit mechanosensitiven Zellen, mit Primärzellen, Stammzellen und Expressionssystemen, mit ligandengesteuerten Ionenkanälen, mit Lipidmembranpräparationen (wie Liposomen, Vesikel, Bilayer), mit der Erfassung von Teilchenströmung, z.B. Nanoteilchendichte oder Anzahl Zellen pro Volumen für Zellzählung, oder für die Erfassung von Verschmutzungen in Flüssigkeiten, wie z.B. Medikamentenrückständen im Trinkwasser u.a.In particular, the invention comprises methods in which an optical measurement and / or optical stimulation is combined with patch clamp measurements and / or a change of solution to cells or membranes. For this purpose, a cell or membrane is reversibly placed on the patch clamp opening and visually measured by means of the separate opening. If the cell does not have the desired properties on the basis of the optical measurements, the cell with the separate opening and / or the flow in the perfusion chamber can be rinsed off again and another cell aspirated and, if appropriate, at the patch clamp opening contacted irreversibly by the patch-clamp method and then optically measured and stimulated. In this case, intracellular or extracellular solution change can be carried out, e.g. to change the ion concentration or to bring biologically active substances to the membrane or cell. In parallel, mechanical stimulation may be via pressures or currents at the port, separate port, or perfusion chamber. Examples of the method are automated patch clamp in combination with intracellular perfusion, with fluorescence-based detection and cell selection in transient transfection (eg GFP expression), with fluorescence-based detection and cell selection of antibody-labeled cells, with fluorescence detection for intracellular calcium or pH Measurement (Fura-2 or, BCECF dyes, etc.), with FRET, in combination with Patch Clamp to investigate functional relationships of ion channels, with the possibility of optically induced release of cell stimulators and so-called second messengers ("caged compounds"). , eg Ca 2+, NO,) with mechanosensitive cells, with primary cells, stem cells and expression systems, with ligand-controlled ion channels, with lipid membrane preparations (such as liposomes, vesicles, bilayer), with the detection of particle flow, eg Nanoparticle density or number of cells per volume for cell counting, or for detection of contaminants in liquids, e.g. Drug residues in drinking water u.a.

Zur weiteren Definition der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der erfindungsgemäßen Verfahren werden noch die folgenden Angaben gemacht, die die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen. Diese Angaben nennen lediglich Größen, die für die Erfindung bevorzugt, jedoch nicht zwingend sind. For further definition of the device according to the invention and the method according to the invention, the following details are given, which are not intended to limit the invention in any way. These data only mention sizes that are preferred for the invention, but not mandatory.

So können die Abmessungen des Substrats, welches ein wesentliches Bauteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung darstellt, in der Größenordnung von wenigen mm liegen. Fertigungstechnisch können die Abmessungen ca. 1 mm betragen, wobei Abmessungen von beispielsweise 2 mm × 3 mm üblich sind. Thus, the dimensions of the substrate, which represents an essential component of the device according to the invention, may be of the order of a few mm. Manufacturing technology, the dimensions may be about 1 mm, with dimensions of, for example, 2 mm × 3 mm are common.

Der Durchmesser der Öffnung, an der die eigentliche Patch-Clamp-Messung stattfindet (Öffnung der Patch-Clamp-Pipette) beträgt zwischen 0,1 µm bis maximal einige 10 µm. Diese Obergrenze wird in der Regel ca. 1/10 des Durchmessers der zu untersuchenden Zellen betragen. Vorzugsweise beträgt der Durchmesser der genannten Öffnung ca. 1 bis ca. 5 µm, insbesondere ca. 2 bis 3 µm. The diameter of the opening at which the actual patch clamp measurement takes place (opening of the patch clamp pipette) is between 0.1 μm and a maximum of a few 10 μm. This upper limit will usually be about 1/10 of the diameter of the cells to be examined. Preferably, the diameter of said opening is about 1 to about 5 microns, in particular about 2 to 3 microns.

Der (Gesamt-)Durchmesser der separaten Öffnung (des Ansaugkanals) liegt vorzugsweise zwischen 0,5 µm bis ebenfalls einigen 10 µm. Als Obergrenze kann hier beispielsweise das Zweifache des Durchmessers der zu untersuchenden Zellen gewählt werden. Vorzugsweise liegt der Durchmesser der separaten Öffnung zwischen ca. 2 µm und ca. 20 µm, wobei innerhalb dieses Bereichs Durchmesser zwischen ca. 9 µm und ca. 12 µm weiter bevorzugt sind. The (total) diameter of the separate opening (of the intake duct) is preferably between 0.5 μm and also a few 10 μm. The upper limit here can be, for example, twice the diameter of the cells to be examined. Preferably, the diameter of the separate opening between about 2 microns and about 20 microns, wherein within this range diameter between about 9 microns and about 12 microns are more preferred.

Die Dicke (Höhe) des Substrats liegt in der Größenordnung von einigen 10 µm. Dieses Substrat besteht üblicherweise aus einem Träger aus Silizium (Si) mit einer sich darauf befindenden Quarzschicht (SiO₂). In diese Quarzschicht sind üblicherweise die mikrofluidischen Strukturen (Kanäle, Öffnungen und dergleichen) eingebracht, in der Regel durch mikromechanische Bearbeitung, Ätzen oder dergleichen.The thickness (height) of the substrate is on the order of several tens of microns. This substrate usually consists of a support of silicon (Si) with a quartz layer (SiO ₂ ) on it. In this quartz layer usually the microfluidic structures (channels, openings and the like) are introduced, usually by micromechanical machining, etching or the like.

Die Drucke, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren in den mikrofluidischen Strukturen zur Anwendung kommen, liegen in der Regel zwischen 150 mbar bis 4 bar, wobei Druckänderungen über den genannten vollen Druckbereich innerhalb kurzer Zeiträume, beispielsweise innerhalb von 10 ms, vorgenommen werden können. Auch Stoßwellen können in entsprechender Weise erzeugt werden.The pressures that are used in the inventive method in the microfluidic structures are usually between 150 mbar to 4 bar, with pressure changes over the full range of pressure within a short time, for example, within 10 ms, can be made. Shock waves can also be generated in a corresponding manner.

Die Strömungsgeschwindigkeiten innerhalb der mikrofluidischen Strukturen, insbesondere innerhalb der Perfusionskammer, liegen vorzugsweise zwischen einigen µm/s und einigen 100 mm/s, wobei hier Strömungsgeschwindigkeiten zwischen ca. 2 mm/s bis ca. 400 mm/s weiter bevorzugt sind. The flow velocities within the microfluidic structures, in particular within the perfusion chamber, are preferably between a few μm / s and a few 100 mm / s, flow rates between about 2 mm / s and about 400 mm / s being more preferred.

Sofern nach den erfindungsgemäßen Verfahren Stimuli auf die immobilisierten Membranen/Zellen oder auf die sich innerhalb der mikrofluidischen Strukturen befindenden Flüssigkeiten aufgebracht werden, so können diese grundsätzlich so lange andauern wie die entsprechende Messkonfiguration besteht. In der Regel beträgt die Dauer der Stimuli zwischen 1 ms und 1h, wobei Stimuli über Zeiträume zwischen 10 ms bis 15 min, weiter bevorzugt sind. If, according to the method according to the invention, stimuli are applied to the immobilized membranes / cells or to the liquids located within the microfluidic structures, they can in principle last as long as the corresponding measurement configuration exists. In general, the duration of the stimuli is between 1 ms and 1 h, with stimuli being more preferred over periods of between 10 ms to 15 min.

In der Zeichnung zeigtIn the drawing shows

1 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips. 1 an embodiment of the device according to the invention in the manner of a patch clamp chip.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 nach 1 ist in der bereits beschriebenen Weise zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12) vorgesehen, wobei diese Membranen/Zellen insbesondere Membranproteine wie beispielsweise Ionenkanäle aufweisen oder ausbilden. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind in 1 weitere Komponenten der Vorrichtung 1 wie Elektroden(n), Gegenelektrode(n), Pumpe(n), Ventil(e), Flüssigkeitsreservoir(s), Mess- und Steuergerät(e) u.a. nicht dargestellt.The device according to the invention 1 to 1 is in the manner already described for the determination of preferably biologically relevant parameters on membranes and cells ( 12 ), these membranes / cells in particular having or forming membrane proteins such as ion channels. For clarity, in 1 other components of the device 1 such as electrodes (n), counter electrode (s), pump (s), valve (s), liquid reservoir (s), measuring and control unit (s), etc. not shown.

Das gemäß 1 nicht in allen Einzelheiten dargestellte Substrat 2 umfasst in der Regel einen Träger aus Silizium (Si), der mit Quarz (SiO₂) beschichtet ist. Die in 1 dargestellten mikrofluidischen Strukturen (Kanäle, Öffnungen und dergleichen) sind in der Regel in der Quarzschicht vorgesehen. Insgesamt ist das Substrat 2 mehrere 10 µm dick. The according to 1 not shown in detail substrate 2 typically includes a support of silicon (Si) coated with quartz (SiO ₂ ). In the 1 shown microfluidic structures (channels, openings and the like) are usually provided in the quartz layer. Overall, the substrate 2 several 10 μm thick.

Das Substrat 2 gemäß 1 weist zwei Zuläufe 3, 4 auf, durch die Lösungen/Suspensionen, insbesondere Suspensionen, die die zu untersuchenden Membranen/Zellen enthalten, einströmen können, und zwar in eine Perfusionskammer 6, an deren (Austritts-)Ende sich ein Ablauf 5 befindet. The substrate 2 according to 1 has two inlets 3 . 4 on, by the solutions / suspensions, in particular suspensions, which contain the membranes to be examined / cells can flow, in a perfusion chamber 6 , at the (exit) end of a sequence 5 located.

In die Perfusionskammer 6 hinein ragt die Öffnung 8 eines Kanals 7 nach Art einer Patch-Clamp-Pipette. Gemäß 1 ist an der (Oberseite) der Öffnung 8 eine Zelle 12 immobilisiert, und zwar unter Ausbildung eines Seals/Gigaseals. Bei der Öffnung 8 handelt es sich also um die eigentliche Patch-Clamp-Öffnung, an der die Patch-Clamp-Messung stattfindet. Into the perfusion chamber 6 the opening protrudes into it 8th a channel 7 in the manner of a patch clamp pipette. According to 1 is at the (top) of the opening 8th a cell 12 immobilized, with the formation of a seal / gigaseal. At the opening 8th this is the actual patch clamp opening at which the patch clamp measurement takes place.

Der Kanal 7 mit Öffnung 8 ist mit einem weiteren Kanal 9 verbunden, mit dessen Hilfe Lösungen/Suspensionen in den Kanal 7 und damit an die Öffnung 8 (und gegebenenfalls an die immobilisierte Zelle 12) herangeführt werden können (oder wieder abgeführt). Gegebenenfalls können auch zwei Kanäle 9 vorgesehen sein, die beide mit dem Kanal 7 in Verbindung stehen. Der zweite Kanal dient bspw. nach Art eines Bypass zur Befüllung des Kanals 7 oder zum Flüssigkeitsaustausch im Kanal 7.The channel 7 with opening 8th is with another channel 9 connected, with the help of which solutions / suspensions in the channel 7 and thus to the opening 8th (and optionally to the immobilized cell 12 ) (or removed again). Optionally, also two channels 9 be provided, both with the channel 7 keep in touch. The second channel is used, for example, in the manner of a bypass for filling the channel 7 or for fluid exchange in the channel 7 ,

Weiter zeigt 1 einen separaten Kanal 10 mit einer separaten Öffnung 11, wobei die Öffnung 11 mit dem Kanal 7 und der Öffnung 8 nicht (direkt) verbunden ist. Auch hier kann ggf. ein zweiter Kanal 10 mit Bypass-Funktion vorgesehen sein, wie im Zusammenhang mit Kanal 9 bereits beschrieben. Next shows 1 a separate channel 10 with a separate opening 11 where the opening 11 with the channel 7 and the opening 8th not (directly) connected. Again, if necessary, a second channel 10 be provided with bypass function, as related to channel 9 already described.

Der Durchmesser des separaten Kanals 10 vergrößert sich in Richtung auf die Öffnung 11. Weiter umgibt die separate Öffnung 11 die Öffnung 8 konzentrisch, d.h. nach Art eines die Öffnung 8 umschließenden Rings, so dass mit Hilfe der separaten Öffnung 11 eine Zelle 12 über der Öffnung 8 eingefangen und positioniert werden kann (beispielsweise durch Anlegen eines Unterdrucks/Ansaugdrucks). Sobald die Zelle 12 selektiert und gegebenenfalls positioniert ist, kann das eigentliche Seal/Gigaseal an der Öffnung 8 ausgebildet werden. The diameter of the separate channel 10 increases in the direction of the opening 11 , Next surrounds the separate opening 11 the opening 8th concentric, ie the way of opening 8th enclosing ring, so with the help of the separate opening 11 a cell 12 over the opening 8th can be captured and positioned (for example, by applying a negative pressure / suction pressure). Once the cell 12 is selected and possibly positioned, the actual seal / gigaseal at the opening 8th be formed.

Schließlich zeigt 1 einen als Ausnehmung bzw. Sichtfenster 13 ausgebildeten optischen Pfad, der im Substrat 2 vorgesehen ist. Wenn 1 den Funktionszustand der Vorrichtung 1 wiedergibt, so ist in dargestellten Fall die Zelle 12 an der Oberseite der Öffnung 8 bzw. des Kanals 7 immobilisiert, während die Ausnehmung 13 bzw. das Sichtfenster 13 an der Unterseite des Substrats vorgeseheen ist, die sich dementsprechend an der der Zelle abgewandten Seite der Öffnung 8 bzw. des Kanals 7 befindet. Eine Beobachtung oder Stimulation der Zelle 12 mit Hilfe der Ausnehmung 13 bzw. des Sichtfensters 13 als optischem Pfad erfolgt dementsprechend in der Ausführung gemäß 1 „von unten“. Finally shows 1 as a recess or window 13 formed optical path in the substrate 2 is provided. If 1 the functional state of the device 1 represents, in the illustrated case, the cell 12 at the top of the opening 8th or the channel 7 immobilized while the recess 13 or the viewing window 13 is vorgeseheen on the underside of the substrate, which is accordingly on the cell side facing away from the opening 8th or the channel 7 located. An observation or stimulation of the cell 12 with the help of the recess 13 or the viewing window 13 as an optical path is accordingly in the embodiment according to 1 "from underneath".

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of the documents listed by the applicant has been generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturCited patent literature

EP 1802752 B1 [0007]
US 2006/0194255 A1 [0007]
EP 1311655 B1 [0008, 0028]

Claims

Contraption ( 1 ) in the manner of a patch clamp chip for the determination of preferably biologically relevant parameters on membranes and cells ( 12 ), which in particular have or form membrane proteins, such as ion channels, with - at least one, preferably flat substrate ( 2 ), the microfluidic components and / or microfluidic structures ( 3 - 7 . 9 - 11 ) and at least one opening ( 8th ) at which the membrane or cell ( 12 ) is immobilized at least during a measurement under electrical contact, preferably at the top of the opening ( 8th ), and - at least one optical path ( 13 ) for transmitting electromagnetic radiation to the substrate ( 2 ) and / or part of the substrate ( 2 ).

Device according to claim 1, characterized in that the optical path ( 13 ) on the side of the substrate ( 2 ) provided to the side of the opening ( 8th ) at which the membrane or cell ( 12 ) is immobilized, averted.

Device according to Claim 1 or Claim 2, characterized in that the optical path ( 13 ) is at least partially, preferably formed completely as a recess in the substrate.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the optical path ( 13 ) Glass or quartz glass, in particular at least one window made of glass or quartz glass.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that the optical path comprises at least one glass fiber optic or at least one microscope optics or at least one interface for a glass fiber optic or a microscope optics.

Device according to one of the preceding claims, characterized in that at least one separate channel ( 10 ) provided with the opening ( 8th ) is not in direct communication and by means of which the membrane or cell ( 12 ) by applying a negative pressure at the opening ( 8th ) is positionable and / or fixable, preferably this separate channel ( 10 ) in at least one separate opening ( 11 ), which in particular the opening ( 8th ) at least partially concentrically surrounds.

Apparatus according to claim 6, characterized in that the diameter of the separate channel ( 10 ) in the direction of its separate opening ( 11 ).

Device according to one of the preceding claims, comprising - a substrate ( 2 ), which has as microfluidic structures: - at least one liquid feed, preferably two liquid feeds ( 3 . 4 ), - at least one liquid outlet ( 5 ), - at least one between the liquid feed ( 3 . 4 ) and the liquid drain ( 5 ) arranged perfusion chamber ( 6 ), - at least one channel ( 7 ) like a patch clamp pipette with an opening ( 8th ) in the perfusion chamber ( 6 ), and with at least one further fluid channel ( 9 ), and - at least one separate channel ( 10 ), with the opening ( 8th ) is not in direct connection and in at least one separate opening ( 11 ), in particular the opening ( 8th ) surrounds at least partially concentrically, - an optical path ( 13 ) for the transmission of electromagnetic radiation, preferably on the top of the opening ( 8th ) facing away from the substrate ( 2 ) is provided.

Apparatus according to claim 8, characterized in that the of the channel ( 7 ) opening formed like a patch clamp pipette ( 8th ) and / or from the separate channel ( 10 ) formed separate opening ( 11 ) into the perfusion chamber ( 6 ) protrudes.

Method for determining preferably biologically relevant measured quantities on membranes and cells, which in particular comprise or form membrane proteins, such as ion channels, wherein the method is preferably carried out with the device according to one of the preceding claims, characterized in that an optically triggered immobilization of the membrane or the Cell is carried out on an opening provided in a preferably flat substrate, or that an optically triggered measurement on the membrane or the cell, which is immobilized on an opening provided in a preferably flat substrate, takes place.

Method for determining preferably biologically relevant parameters on membranes and cells, which in particular comprise or form membrane proteins, such as ion channels, wherein the method is preferably carried out with a device according to one of claims 1 to 9, characterized in that a stimulation, in particular an optical Stimulation of the membrane or the cell takes place while the cell is immobilized on an opening provided in a preferably flat substrate.