DE10220234B4 - Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen unter Verwendung von Mikroorganismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind und/oder eine verringerte Aktivität aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die D-Lactat-Dehydrogenase ausgeschaltet wird und diese Mikroorganismen eingesetzt werden.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen.
• Ein klassisches Verfahren zur Herstellung von Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure) ist die Pyrolyse (d. h. das Brenzen) von Traubensäure. Dabei werden Schwermetalle sowie Temperaturen von etwa 200°C benötigt (Römp Chemie Lexikon, 1995). Weiterhin sind folgende mikrobielle Verfahren zur Pyruvat Synthese aus Lactat bekannt: Produktion von Pyruvat aus Lactat mit permeabilisierten Zellen der methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris, die das Gen für die (S)-Hydroxysäure-Oxidase aus Spinat exprimieren (DiCosimo, R.; Eisenberg, A.; Seip, J. E.; Gavagan J. E.; Payne, M. S.; Anton D. L. (1997): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2, 223–232; US-Patent 5 538 875 A ). Das bei der Lactat-Oxidation gebildete H₂O₂ wird durch endogene Katalase zu H₂O und O₂ umgesetzt. Mit diesem Prozess konnte eine 1 M Lösung von Natrium- oder Ammonium-Lactat zu über 98% in Pyruvat umgesetzt werden. Daneben ist auch die Möglichkeit zur zellfreien Oxidation von Lactat zu Pyruvat mit immobilisierter (S)-Hydroxysäure-Oxidase und Katalase bekannt (Burdick, B. A.; Schaeffer, J. R. (1987): Co-immobilized coupled enzyme systems an nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production. Biotechnol. Lett. 9: 253–258). Ein weiteres Verfahren stellt die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit ruhenden, anaerob gezüchteten Zellen von Proteus mirabilis oder Proteus vulgaris dar (Simon, H.; Schinschel, C. (1993): Preparation of pyruvate from (R)-lactate with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191–203). Mit diesem System konnte eine 0,65 M Lactat-Lösung in 1 h zu 94% in Pyruvat umgesetzt werden.
• Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvatproduktion mittels Ganzzell-Biotransformation durch Hefen oder Bakterien eingesetzt, wobei Pyruvat primär durch die Reaktionen der Glycolyse gebildet wird. Es wurden beispielsweise Torulopsis glabrata Stämme mit einer multiplen Vitamin-Auxotrophie beschrieben, die 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose produzierten (Yonehara, T.; Miyata, R. (1994): Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155–159). Die mit diesen Stämmen maximal erreichte Pyruvat-Konzentration bei Fed-Batch-Fermentationen betrug 67,8 g/L (0,77 M). Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Glucose wurde auch für Liponsäure-auxotrophe Stämme von Enterobacter aerogenes (Yokota A. (1989): Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 53: 705–711) und Escherichia coli beschrieben (Yokota A.; Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994b): Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41: 638–643). Bei Anzucht auf Glucose unter Liponsäure-Mangelbedingungen produzierten die Enterobacter aerogenes Stämme maximal 0,8 Mol Pyruvat pro Mol Glucose, die Escherichia coli Stämme bis zu 1,2 Mol Pyruvat/Mol Glucose (Yokata A. Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994a): Pyruvic acid production by an F1-ATPase-defective mutant of Escherichia coli W1485lip2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58: 2164–2167; Yokota, A.; Henmi, M.; Takaoka, N.; Hayashi, C.; Takezawa Y.; Fukumori, Y.; Tomita, F. (1997): Enhancement of glucose metabolism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in F1-ATPase activity. J. Ferm. Bioeng. 83: 132–138). Die Herstellung von Pyruvat durch Pyrolyse der Traubensäure hat den Nachteil, daß 1. für den Prozeß ein hoher Energieverbrauch (Siedepunkt der Traubensäure: ca. 200°C) anfällt sowie 2. Schwermetalle benötigt werden und 3. Traubensäure nur begrenzt zur Verfügung steht. Der Nachteil der mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Lactat liegt darin, daß das Substrat zunächst produziert werden muß, z. B. mit Hilfe von Milchsäurebakterien aus Glukose. Bei den Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose ist der Nachteil, daß die erreichten Ausbeuten signifikant unter der maximal theoretisch erreichbaren Ausbeute liegen. Außerdem muss eine aufwendige Optimierung der Vitamin-Konzentrationen erfolgen (Li, Y.; Chen, J.; Lun, S.-Y.; Rui, X.-S. (2001) Efficient pyruvate production by a multi-vitamin auxotroph of Torulopsis glabrata: key role and optimization of vitamin levels. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 680–685). Von den Erfindern wurde bereits in der DE 101 29 711 A1 ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat mit Hilfe eines Escherichia coli Stammes YYC202 entwickelt, welches unter geeigneten Versuchsbedingungen eine nahezu vollständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erlaubt (≥ 1,9 Mol Pyruvat/Mol Glucose).
• Dieses Verfahren basiert auf einem Escherichia coli Stamm YYC202, der eine Deletion der Gene aceEF für die Proteine E₁ und E₂ der Pyruvat-Dehydrogenase besitzt sowie Mutationen in den Genen poxB für die Pyruvat-Oxidase, pflB für die Pyruvat-Formiatlyase und pps für die PEP-Synthetase. Die Pyruvat-Dehydrogenase ist verantwortlich für die Oxidation von Pyruvat zu Acetyl-CoA unter aeroben Bedingungen. Die Pyruvat-Formiat-Lyase katalysiert die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA und Formiat unter anaeroben Bedingungen und wird bereits bei geringen Sauerstoff-Konzentrationen vollständig inaktiviert. Die Pyruvat-Oxidase katalysiert die Oxidation von Pyruvat zu Acetat und überträgt die Elektronen dabei auf Ubichinon. Das Enzym wird verstärkt in der stationären Phase gebildet und seine Synthese ist abhängig von einem Sigma-Faktor S (RpoS). Die PEP-Syn-thetase katalysiert die Bildung von Phosphoenolpyruvat, AMP und PP_i aus Pyruvat und ATP. Der Stamm YYC202 ist bei aerobem Wachstum in Glucose-Minimalmedim Acetat-auxotroph (Ace^–). Dieser Ace^–-Phänotyp beruht darauf, dass vor allem durch das Fehlen der Pyruvat-Dehydro-genase keine Acetyl-Gruppen für Biosynthesen mehr bereitgestellt werden können. E. coli-Mutanten, denen nur die Pyruvat-Dehydrogenase fehlt, zeigen einen ähnlichen Phänotyp, können allerdings nach 6–8 Tagen Inkubation auf Glucose-Minimalmedium-Platten Mikrokolonien bilden. Verantwortlich für die geringe Acetat-Produktion, die die Bildung dieser Mikrokolonien ermöglicht, ist die Pyruvat-Oxidase. Inaktiviert man in einer Pyruvat-Dehydrogenase-Mutante zusätzlich das poxB-Gen, werden keine Mikrokolonien mehr gebildet. Der Stamm E. coli YYC202 bildete ebenfalls nach 6–8 Tagen keine Mikrokolonien auf Glucose-Minimalmedium-Platten ohne Acetat.
• Bei aerobem Wachstum in Minimalmedium mit Glucose und Acetat setzt E. coli YYC202 einen großen Teil der Glucose zu Pyruvat um (bis zu 1.7 Mol Pyruvat/Mol Glucose) und scheidet es ins Medium aus. Unter nicht wachsenden Bedingungen konnte mit E. coli YYC202 sogar ≥ 1.9 Mol Pyruvat/Mol Glucose gebildet werden. Sowohl unter wachsenden wie auch unter nicht wachsenden Bedingungen wird das in der Glykolyse gebildete NADH durch die Atmungskette mit Sauerstoff als terminalem Elektronenakzeptor zu NAD⁺ reoxidiert. Unter anaeroben, gärenden Bedingungen ist dagegen eine Umsetzung von Glucose zu Pyruvat aufgrund der fehlenden Möglichkeit zur Reoxidation von NADH nicht möglich.
• Durch Transformation von E. coli YYC202 mit dem Plasmid pGS87 (erhalten von J. R. Guest, University of Sheffield, Great Britain), das die Gene aceEF und lpd (kodierend für die 3. Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase) von E. coli trägt, konnte die Acetat-Auxotrophie aufgehoben werden und der Stamm produzierte kein Pyruvat mehr. Dies bestätigt, dass insbesondere die Deletion der Gene aceE und aceF für die Pyruvat-Bildung durch E. coli YYC202 verantwortlich ist.
• Alle bisher beschriebenen Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose mit Ausnahme von DE 101 29 711 A1 basieren auf Vitamin-auxotrophen, insbesondere Thiamin-auxotrophen Stämmen, z. B. von Torulopsis glabrata oder von E. coli. Dabei wird die Aktivität der Pyruvat-umsetzenden Enzyme, z. B. der Pyruvat-Decarboxylase oder der Pyruvat-Dehydrogenase, durch die Verfügbarkeit der Vitamine kontrolliert. Im Gegensatz dazu besitzt der Stamm E. coli YYC202 gemäß DE 101 29 711 A1 keine Vitamin-Auxotrophien und benötigt ausschließlich Acetat als Supplement zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium.
• Aus US 5 869 301 A ist bekannt, daß die E. coli Mutante AFP-111 mit einem Defekt in den Genen, die für die Pyruvat-Formiat Lyase und die Lactat Dehydrogenase codieren, sowie einer weiteren, unbekannten Mutation, in verstärktem Maße unter anaeroben Bedingungen Malat, Fumarat und Succinat bildet, nicht aber Pyruvat. Es wird in US 5 869 301 A allgemein darauf hingewiesen, daß Maßnahmen, die zum Ausschalten von Enzymsystemen des Pyruvatabbaus führen, theoretisch auch eine Anreicherung des Pyruvats verursachen. Ein Hinweis, welche Enzyme speziell ausgeschaltet werden müssen, um gezielt eine Steigerung der Pyruvatproduktion zu erzielen, wird jedoch nicht offenbart. Insbesondere wird aber nicht berücksichtigt, dass eine kontinuierliche Pyruvat-Bildung aus Glucose unter anaeroben, gärenden Bedingungen nicht möglich ist, da die Reoxidation des in der Glykolyse gebildeten NADH nur unter Umsetzung von Pyruvat zu anderen, reduzierteren Verbindungen, wie z. B. Lactat möglich ist.
• Wie in DE 101 29 711 A1 beschrieben, konnte durch Ausschaltung Pyruvat abbauender Enzyme eine nahezu vollständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erreicht werden (≥ 1,9 Mol Pyruvat/Mol Glucose). Bei aerober Kultivierung von E. coli YYC202 in Gegenwart hoher Glucose-Konzentrationen wurde neben Pyruvat jedoch auch Lactat gebildet. Dies reduziert die Ausbeute an Pyruvat und erschwert zusätzlich dessen Aufreinigung.
• Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, welches die oben genannten Nachteile nicht mehr aufweist.
• Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 12, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 12 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe, ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 13, gelöst, mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 13 angegebenen Merkmalen.
• Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und den erfindungsgemäßen Mikroorganismen ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pyruvat zu produzieren. Die Erfinder fanden überraschenderweise heraus, daß bei Verwendung von Mikroorganismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind oder eine verringerte Aktivität aufweisen, das zusätzliche Ausschalten der Enzymaktivität der NAD⁺-abhängigen D-Lactat-Dehydrogenase zu einer weiteren Steigerung der Pyruvatproduktion führt. Diese D-Lactat-Dehydrogenase wird im folgenden auch unter der Bezeichnung LDH zusammengefaßt. Der im folgenden verwendete Begriff „Ausschalten” beinhaltet die völlige Hemmung der Synthese von LDH bzw. die Inaktivierung des für die D-Lactat-Dehydrogenase kodierenden Gens oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der genannten Enzyme.
• Die für die LDH kodierende Gensequenz ist aus der Literatur bereits bekannt (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195.). Dieses Gen wird im folgenden unter der Bezeichnung „ldhA-Gensequenz” zusammengefaßt. Mit Hilfe gerichteter rekombinanter DNA-Techiken können für eine LDH codierende Nukleotidsequenzen entfernt oder in ihrer Expression reduziert werden. Mit Hilfe dieser Methoden kann zum Beispiel die für die LDH kodierende ldhA-Gensequenz im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind dem Fachmann z. B. aus Link A. J., Philips D., Church G. M. (1997) Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-Type Escherichia coli: application to open reading frame charaterization. J. Bacteriol. 179: 6228–6237, oder auch aus Datsenko K. A., Wanner W. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640–6645, bekannt. Auch können nur Teile der ldhA-Gensequenz deletiert werden, oder auch mutierte Fragmente der ldhA-Gensequenz ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Verlust oder eine Reduktion der LDH-Aktivität erreicht. Durch Transduktion mit dem Phagen P1 konnte das intakte ldhA-Gen von E. coli YYC202 durch ein defektes ldhA-Gen aus dem Stamm E. coli NZN117 (erhalten von D. P. Clark, Dep. of Microbiology, Southern Illinois University, Carbondale, USA) ersetzt werden. Die entsprechenden Protokolle sind für E. coli gut etabliert (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.). Durch Inaktivierung des ldhA-Gens wird ein völliger Verlust der LDH-Aktivität erreicht. Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der Escherichia coli Stamm YYC202 ldhA, hinterlegt am 12.03.2002 unter der Bezeichnung DSM 14863, der eine Insertion in der ldhA-Gensequenz trägt.
• Eine weitere Möglichkeit die Aktivität der LDH abzuschwächen oder auszuschalten sind Mutageneseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien wie z. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder auch UV-Bestrahlung zur Mutagenese benutzen. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden.
• Darüber hinaus kann auch die Expression der ldhA-Gen-sequenz reduziert werden. So kann die Promoter- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionsregulationskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen Pyruvatproduktion zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Des weiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit geringer Aktivität kodieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression der ldhA-Gensequenz durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
• Die LDH katalysiert die Reduktion von Pyruvat zu Lactat mit NADH als Coenzym und wird durch Pyruvat allosterisch aktiviert (Tarmy, E. M. and Kaplan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation. J. Biol. Chem. 243: 2587–2596). Der apparente K_m-Wert für Pyruvat liegt je nach pH-Wert zwischen 4.4 mM (pH 6.7) und 7.2 mM (pH 7.5) (Tarmy, E. M. and Kaplan, N. O. (1968) Kinetics of Escherichia coli B D-lactate dehydrogenase and evidence for pyruvate-controlled change in conformation. J. Biol. Chem. 243: 2587–2596.). Diese Konzentrationen werden in E. coli-Wildtyp-Stämmen unter aeroben Bedingungen normalerweise nicht erreicht. Die Expression des ldhA-Gens wird unter anaeroben Bedingungen durch einen niedrigen pH-Wert induziert, unter aeroben Bedingungen gibt es eine pH-unabhängige Expression (Jiang, G. R., Nikolova, S. and Clark D. P. (2001) Regulation of the ldhA gene, encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 147: 2437–2446.). Pyruvat stimuliert die Expression des ldhA-Gens 2- bis 4-fach (Jiang et al. 2001). Die signifikante Bildung von Lactat bei Kultivierung von E. coli YYC202 mit hohen Glucose-Konzentrationen kann wie folgt erklärt werden: Durch die Blockade des Pyruvat-Abbaus kommt es zu einer Akkumulation von Pyruvat, die einerseits eine verstärkte Expression des ldhA-Gens bewirkt und andererseits die Aktivität des Enzyms stimuliert. Eine signifikante Lactat Bildung wird in Schüttelkolben-Ansätzen ab einer Glucose-Konzentration von 50 mM beobachtet, während sie bei Fermentationen bereits ab Glucose-Konzentrationen von ca. 5 mM beobachtet wird. Um die Lactat-Bildung zu unterbinden, wurde in der vorliegenden Erfindung beispielsweise ein Derivat des Stammes Escherichia coli YYC202 konstruiert, bei dem das ldhA-Gen durch Insertion eines Kanamycin-Resistenzgens in den offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz inaktiviert wurde.
• Escherichia coli YYC202 ist in der Literatur hinsichtlich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1982): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon Tn10: location of a gene affecting pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 151: 1279–1289; Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1983): Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 (5): 756–762; Georgiou, D. Ch.; Fang, H.; Gennis, R. B. (1987): Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrom d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 2107–2112). Für das Verfahren geeignet sind Bakterien und Hefen, insbesondere gram-negative Bakterien, bevorzugt aus der Familie der Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia coli. Als besonders geeignet hat sich der Stamm Escherichia coli YYC202 ldhA, hinterlegt am 12.03.2002 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSM-Nummer 14863, erwiesen, der wie in oben beschriebener Weise verändert wurde.
• Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte die Bildung von Lactat als Stoffwechselendprodukt verhindert und durch Ausschalten der Enzyme Pyruvat-Dehydrogenase, Pyruvat-Oxidase, und Phosphoenolpyruvat-Synthetase und zusätzlichem Ausschalten der LDH die Umsetzung hoher Glucose-Konzentrationen in Pyruvat signifikant verbessert werden. Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können Pyruvat beispielsweise aus Kohlenhydraten wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose, oder aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
• Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pyruvat-Produktion durchgeführt werden. Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Die Fermentationen werden aerob durchgeführt.
• Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
• Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat-Stoff-wechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens.
• Es zeigt:
• 1: Schema der Umsetzung von Glucose in Pyruvat in E. coli YYC202 ldhA. Nach Aufnahme von Glucose durch das Phosphoenolpyruvat-abhängige Phosphotransferase-System (PTS) wird Glucose-6-phosphat in den Reaktionen der Glykolyse zu Pyruvat umgesetzt. Aufgrund der genetischen Defekte in den Genen aceEF, pflB, poxB, und ldhA kann Pyruvat nicht weiter umgesetzt werden und wird ins Medium ausgeschieden.
• 2: Southern-Blot-Analyse (Southern, E. M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503–517.) von E. coli YYC202 ldhA.
• Die Spuren 1, 5 und 6 enthalten je 75 ng Digoxigenin-markierten DNA-Standard. Die Spuren 2 und 7 enthalten chromosomale DNA von E. coli YYC202, die Spuren 3 und 8 chromosomale DNA von E. coli YYC202 ldhA und die Spuren 4 und 9 chromosomale DNA von E. coli NZN117. Es wurden jeweils 15 μg chromosomale DNA, die mit EcoRI und HindIII verdaut worden war, pro Spur aufgetrennt. Der Blot mit den Spuren 1–5 wurde mit einem Digoxigenin-markierten 2153-bp DNA-Fragment mit dem E. coli ldhA-Gen hybridisiert, der Blot mit den Spuren 6–10 mit einem Digoxigenin-markierten 668-bp Fragment mit dem Kanamycin-Resistenzgen aus E. coli NZN117. Die DNA-Fragmente wurden auf einem 1%-igen Agarose-Gel aufgetrennt und nach Denaturierung auf eine Nylon-Membran geblottet. Die Markierung der Sonden mit Digoxigenin, Hybridisierung, Waschen und Detektion der Sonden mit CDP-Star erfolgten mit dem DIG-Chemlink-Labeling-and-Detektion-Kit (Roche Diagnostics) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Wie erwartet, wurde mit der ldhA-Sonde in E. coli YYC202 ein 11 kb EcoRI-HindIII-Fragment detektiert, in E. coli YYC202 ldhA und E. coli NZN117 dagegen Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb. Mit der kan-Sonde wurde erwartungsgemäss kein Signal in E. coli YYC202 detektiert, in YYC202 ldhA und NZN117 dagegen wiederum Fragmente von 6.2 kb und 6.8 kb.
• 3: Umsetzung von Glucose

  

  zu Pyruvat

  

  und ggf. Lactat

  

  durch Zellsuspensionen von E. coli YYC202 (A) und E. coli YYC202 ldhA (B). Die Abszisse X gibt die Zeit in Stunden an und die Ordinate Y die Konzentration von Glucose, Pyruvat, bzw. Lactat in mM.
• Die Zellen wurden in M9-Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert, dann mit 0.9%-iger NaCl-Lösung gewaschen und anschließend zu einer OD₆₀₀ von 7.4 (YYC202) bzw. 3.1 (YYC202 ldhA) in 500 mM MOPS-Puffer pH 7.0 mit 100 mM bzw. 88 mM Glucose resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in Schüttelkolben bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Die Glucose-Konzentration wurde in einem gekoppelten enzymatischen Test mit Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bestimmt (Bergmeyer, H. U. (1984) Methods of enzymatic analysis, 3^rd edition. Vol. VI: Metabolites 1: Carbohydrates, Seiten 163–172. Verlag Chemie, Weinheim.). Pyruvat und Lactat wurden durch HPLC-Analyse mit einer Aminex HPX-87H-Säule (BioRad) und UV-Detektion bei 215 nm bestimmt.
• 4: Fed-batch-Fermentation von E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA. Die Abszisse X gibt die Fermentationszeit in Stunden an und die Ordinate Y in A die optische Dichte OD₆₀₀ bzw. in B die Konzentration von Pyruvat bzw. Lactat in mM.
• Die Stämme wurden in einem 7.5 l-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (pO2 > 40% Sättigung) bei 37°C und konstant pH 7 (pH-Regulation) in einem synthetischen Medium kultiviert. Die Glucose-Konzentration wurde mit Hilfe eines „On-line General Analyzer” konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat-Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulation die CO₂-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. In A ist das Wachstum von E. coli YYC202

  

  und E. coli YYC202 ldhA

  

  dargestellt. In B wird die Pyruvat-Bildung durch E. coli YYC202

  

  und E. coli YYC202 ldhA

  

  sowie die Lactatbildung durch E. coli YYC202

  

  und E coli YYC202 ldhA (☐) dargestellt.
• Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.
• Durch Verwendung von Mikroorganismen, deren Aktivität der LDH verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, konnte bei Umsetzung hoher Glucose-Konzentrationen einem gegenüber z. B. aus DE 101 29 711 A1 bekannten Verfahren, erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden. Mit ruhenden Zellen konnte die Ausbeute an Pyruvat bei Umsetzung von 100 mM Glucose um 20% gesteigert werden. Bei Fermenationen im fed-batch-Verfahren konnte die nach 37 h erreichte Pyruvat-Konzentration um 40% gesteigert werden. Als Mikroorganismen können sowohl Hefen als auch Bakterien eingesetzt werden. Mikroorganismen aus der Familie der Enterobacteriaceae, insbesondere aus der Gattung Escherichia haben sich als besonders geeignet erwiesen. Dabei hat sich insbesondere der Organismus Escherichia coli YYC202 als sehr geeignet erwiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wildtypstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist z. B. aus DE 101 29 711 A1 bekannt, dass folgende Gensequenzen verändert wurden: aceEF-kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 der Pyruvat-Dehydrogenase, poxB-kodierend für die Pyruvat-Oxidase; pps-kodierend für die Phosphoenolpyruvat-Synthetase; pflB-kodierend für die Pyruvat-Formiat-Lyase. In überraschender Weise erzielte das zusätzliche Ausschalten der LDH in Form von z. B. einer Insertion eines Resistenzgens in den offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz, wie für Escherichia coli YYC202 ldhA beschrieben, eine weitere deutliche Steigerung der Pyruvatproduktion. Das Ausschalten der Gensequenzen kodierend für die Pyruvat-Dehydrogenase, die Pyruvat-Oxidase die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die LDH, wird für eine verbesserte Pyruvatproduktion als besonders vorteilhaft angesehen.
• Mit ruhenden Zellen konnte eine Umsetzung des Substrates in Pyruvat erreicht werden, die erheblich über den mit bisher bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten lag. Auf Grund des Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. Diese Acetat-Auxotrophie erlaubt es, Wachstum und Produktbildung durch die Dosierung des essentiellen Co-Substrats Acetat zu regulieren. Dabei konnte in DE 101 29 711 A1 gezeigt werden, dass die Acetat-Verbrauchsrate identisch ist mit der CO₂-Bildungs-rate. Über diese Korrelation lässt sich anhand der online-messbaren CO₂-Konzentration im Abgas die Acetat-Verbrauchsrate bestimmen und regulieren. In Anwesenheit von Acetat und weiterer Nährstoffe wie z. B. Stickstoff im Fermentationsmedium kann stoffwechselbedingt Zellteilung/Wachstum stattfinden. Da bei Wachstum aber auch ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthese neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale Pyruvat-Ausbeute mit wachsenden Zellen nicht zu erwarten. Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medienbedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h. „ruhende” Zellen. Diese Zellen werden durch Kultivierung in einem Medium erhalten, im dem eine hohe Zellkonzentration gebildet werden kann. Danach werden die Zellen z. B. durch Zentrifugation geerntet und in ein Medium gegeben, welches kein Acetat und keine weiteren für Wachstum erforderlichen Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff enthält. Unter diesen Bedingungen kann eine noch höhere Pyruvatausbeute erreicht werden. Als Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlenhydrate, insbesondere Hexosen, sowie Alkohole. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Abfallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produziert werden müssen.
• Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes Pyruvat in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. ¹³C-markierte Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich zusätzlich positiv auf die Produktion weiterer vom Pyruvat abgeleiteter Stoffwechselprodukte auswirken. So kann z. B. durch das Einbringen eines Gens für die L-Alanin-Dehydrogenase und in Gegenwart hoher Ammonium-Konzentrationen unter anaeroben Bedingungen eine Homoalanin-Gärung etabliert werden, bei der 1 Mol Glucose und 2 Mol Ammonium zu 2 Mol L-Alanin umgesetzt wird.
• Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
• 1. Konstruktion eines Derivats von E. coli YYC202 mit defektem ldhA-Gen
• Zur Inaktivierung des ldhA-Gens wurde das offene Leseraster durch ein Kanamycin-Resistenzgen unterbrochen. Die entsprechende Mutation wurde durch P1-Transduktion (Silhavy, J., Berman, M. and Enquist, L. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) aus dem Donorstamm E. coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195.) in E. coli YYC202 transferiert. Die erfolgreiche Transduktion wurde durch Southern-Blot-Analyse bestätigt (2). Die Lactat-Dehydro-genase-Aktivität (LDH-Aktivität) im Ausgangsstamm YYC202 und im Derivat YYC202 ldhA wurde nach 6-stündiger Kultivierung in LB-Medium mit 0.4% (w/v) Glucose bestimmt. Dazu wurden zellfreie Extrakte hergestellt, die Membranfraktion durch Ultrazentrifugation entfernt und die lösliche Fraktion in einen Enzymtest eingesetzt, bei dem die pyruvatabhängige Oxidation von NADH zu NAD⁺ spektrophotometrisch anhand der Abnahme der Extinktion bei 340 nm gemessen wurde (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195). E. coli YYC202 besass eine hohe Lactat-Dehydrogenase-Aktivität von 3.1 μmol min^–1 mg Protein^–1, während E. coli YYC202 ldhA eine Aktivität von < 0.01 μmol min^–1 mg Protein^–1 zeigte.
• 2. Glucose-Umsetzung durch ruhende Zellen von E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA
• Die Stämme E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA wurden in Minimalmedium mit Glucose und Acetat vorkultiviert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, in einem Puffer (500 mM MOPS, pH 7.0) mit circa 100 mM Glucose resuspendiert, und in Schüttelkolben bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Wie in 3A dargestellt, wurde die Glucose im Stamm YYC202 anfänglich mit annähernd gleicher Rate zu Pyruvat und Lactat umgesetzt. Nach dem Verbrauch der Glucose wurde das gebildete Lactat langsam zu Pyruvat reoxidiert. Im Stamm YYC202 ldhA wurde dagegen die Glucose mit konstanter Rate zu Pyruvat umgesetzt, aber kein Lactat gebildet (3B).
• 3. Wachstum und Produktbildung bei fed-batch-Kultivierung von E. coli YYC202 und E. coli YYC202 ldhA in Glucose-Minimalmedium
• Für die fed-batch-Fermentation wurden die Stämme in einem 7.5 l-Laborfermenter unter aeroben Bedingungen (pO2 > 40% Sättigung) bei 37°C und pH 7 (geregelt) in einem synthetischen Medium kultiviert (pro Liter 1.5 g NaH₂PO₄ × H₂O; 3.25 g KH₂PO₄; 2.5 g K₂HPO₄; 0.2 g NH₄Cl; 2 g (NH₄)SO₄; 0.5 g MgSO₄; 10 mg CaCl₂ × 2H₂O; 0.5 mg ZnSO₄ × 7H₂O I^–1; 0.25 mg CuCl₂ × 2H2O; 2.5 mg MnSO₄ × H₂O; 1.75 mg CoCl₂ × 6H₂O; 1.25 mg H₃BO₃; 2.5 mg AlCl₃ × 6H₂O; 0.5 mg Na₂MoO₄ × 2H₂O; 10 mg FeSO₄). Die Glucose-Konzentration wurde mit Hilfe eines „On-line General Analyzer” konstant bei etwa 5 mM gehalten. Die Acetat-Zufütterung erfolgte im Überschuss, wobei zur Regulation die CO₂-Konzentration im Abgas eingesetzt wurde. Es war zuvor gezeigt worden, dass die Acetat-Verbrauchs-rate gleich der CO₂-Bildungsrate ist ( Deutsche Patent-Anmeldung 101 29 711 ). Bei den in 4A und 4B dargestellten Experimenten zeigten beide Stämme annähernd gleiches Wachstumsverhalten, unterschieden sich aber deutlich hinsichtlich Pyruvat- und Lactat-Bildung. Der Ausgangsstamm YYC202 hatte nach 37 h 487 mM Pyruvat und 341 mM Lactat gebildet, während der Stamm YYC202 ldhA nach 37 h 673 mM Pyruvat, aber kein Lactat gebildet hatte.
• 4. Kontrollexperiment mit E. coli NZN117
• Um auszuschließen, dass die ldhA-Mutation im Stamm E. coli YYC202-ldhA für die Pyruvat-Bildung verantwortlich ist, wurde der Donorstamm E. coli NZN117 (Bunch, P. K., Mat-Jan, F., Lee, N. and Clark, D. P. (1997) The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology 143: 187–195.) in Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat bei 37°C und 140 Upm inkubiert. Zu keinem Zeitpunkt während des Wachstums und in der stationären Phase konnte Pyruvat im Kulturüberstand detektiert werden. Dies zeigt, dass eine ldhA-Mutation unter den genannten Bedingungen nicht zur Exkretion von Pyruvat führt. In E. coli YYC202 ldhA ist dafür vielmehr die Deletion der aceEF-Gene für zwei Untereinheiten der Pyruvat-Dehydrogenase sowie die Inaktivierung des Gens poxB für die Pyruvat-Oxidase verantwortlich.

Claims (19)

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen unter Verwendung von Mikroorganismen, in denen die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind und/oder eine verringerte Aktivität aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die D-Lactat-Dehydrogenase ausgeschaltet wird und diese Mikroorganismen eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der ldhA-Gensequenz verringert und/oder die ldhA-Gensequenz so verändert wird, dass keine Expression stattfindet oder die ldhA-Gensequenz deletiert wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass in das offene Leseraster der ldhA-Gensequenz ein Resistenzgen eingebaut wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen aus der Gruppe der Enterobacteriaceae eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia eingesetzt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli YYC202 ldhA, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 14863, eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat bei der Fermentation Kohlenhydrate, oder Alkohole eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Acetat bei der Fermentation mit wachsenden Zellen eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass bei Fermentationen mit ruhenden Zellen kein Acetat eingesetzt wird.
10. Verfahren nach eine der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass bei den Fermentationen eine CO₂ Messanalytik eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine aerobe Fermentationen durchgeführt wird.
12. Verfahren zur Produktion von Stoffwechselprodukten, die sich vom Pyruvat ableiten, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 11 durchgeführt wird und eine anaerobe Fermentation durchgeführt wird.
13. Mikroorganismus zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen in dem die Pyruvat-Dehydrogenase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase inaktiviert sind und/oder eine verringerte Aktivität aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass er eine ausgeschaltete D-Lactat-Dehydrogenase aufweist.
14. Mikroorganismus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der ldhA-Gensequenz verringert und/oder die ldhA-Gensequenz so verändert ist, dass keine Expression stattfindet oder die ldhA-Gensequenz deletiert ist.
15. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Insertion im offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz aufweist.
16. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass er die Insertion eines Resistenzgens im offenen Leserahmen der ldhA-Gensequenz aufweist.
17. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Familie der Enterobacteriacea stammt.
18. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gattung Escherichia stammt.
19. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 18, hinterlegt bei der DSMZ unter der DSM-Nr. 14863.

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