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DE10225443A1 - Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten für den G-Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 - Google Patents

Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten für den G-Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1

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Publication number
DE10225443A1
DE10225443A1 DE10225443A DE10225443A DE10225443A1 DE 10225443 A1 DE10225443 A1 DE 10225443A1 DE 10225443 A DE10225443 A DE 10225443A DE 10225443 A DE10225443 A DE 10225443A DE 10225443 A1 DE10225443 A1 DE 10225443A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
receptor
chemical compound
mas
cells
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10225443A
Other languages
English (en)
Inventor
Evi Kostenis
Johann Gassenhuber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Aventis Pharma Deutschland GmbH
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Priority to PCT/EP2003/005601 priority patent/WO2003104818A1/de
Priority to JP2004511838A priority patent/JP4359238B2/ja
Priority to CA002489083A priority patent/CA2489083A1/en
Priority to AT03735480T priority patent/ATE542141T1/de
Priority to EP03735480A priority patent/EP1516190A1/de
Priority to AU2003237702A priority patent/AU2003237702A1/en
Priority to US10/456,700 priority patent/US20040029180A1/en
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität des G Protein gekoppelten Rezeptors mas like 1 stimuliert oder abschwächt.

Description

  • Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten für den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1
  • Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität des G Protein gekoppelten Rezeptors mas like 1 verändert.
  • G Protein gekoppelte Rezeptoren vermitteln extrazelluläre Signale wie beispielsweise von Hormonen, Neurotransmittern, Licht oder Geruchsstoffen über G Proteine ins Zellinnere, wobei über eine intrazelluläre Signalkaskade unterschiedliche Effekte ausgelöst werden können. G Proteine bestehen normalerweise aus drei verschiedenen Untereinheiten (alpha, beta, gamma). Man kennt verschiedene heterodimere G-Proteine, die sich in Rezeptorspezifität und Wirkung unterscheiden. Die G Proteine werden durch GTP aktiviert. Ein bekanntes G Protein ist das Transducin aus dem Sehprozess.
  • G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen. Sie stellen eine der größten bekannten Proteinfamilien dar. Zur Zeit wird geschätzt, daß etwa 1000 Gene des menschlichen Genoms für diese Rezeptorklasse kodieren. GPCR sind Membranproteine mit 7 transmembranen α-Helices. Eine Vielzahl von Arzneimitteln entfaltet ihre Wirkung über GPCRs.
  • GPCRs sind insbesondere bei der Signalverarbeitung und Steuerung des Organismus beteiligt und spielen deshalb eine übergeordnete Rolle bei der Aufrechterhaltung der Funktion des intakten Organismus.
  • Die Bindung eines extrazellulären Liganden führt zu einer Konformationsänderung des betreffenden GPCR. Die Konformationsänderung schafft die Voraussetzung für die Interaktion mit dem jeweils zugeordneten G-Protein. Das G-Protein wiederum löst eine für den entsprechenden Zelltyp charakteristische intrazelluläre Signalkaskade aus. Kennzeichnend für die intrazellulären Signalkaskaden sind die sogenannten "second messengers". Darunter sind niedermolekulare Verbindungen wie beispielsweise cAMP (cyclisches Adenosinmonophosphat), cGMP (cyclisches Guanozinmonophosphat) oder Ca2+ zu verstehen. Das intrazelluläre Signaling wird über Änderungen der Konzentration der second messengers gesteuert. Die G- Proteine bzw. deren Untereinheiten wechselwirken hierzu mit Proteinen wie der Adenylat-Zyklase, der Phospholipase C oder Ionenkanälen. Die Änderung der Konzentration der "second messenger" wiederum bewirkt eine Aktivierung oder Deaktivierung von anderen Proteinen insbesondere von Kinasen und Phosphatasen. Das Signal endet schließlich in einer für den jeweiligen Zellverband typischen Antwort beispielsweise der Expression eines Proteins.
  • Die heterotrimeren G-Proteine liegen an der Innenseite der Plasmembran. Ein aktivierter Rezeptor nimmt Kontakt auf mit dem G-Protein-Heterotimer, welches daraufhin eine α-Untereinheit und den βγ-Komplex dissoziiert. Sowohl die aktivierte α-Untereinheit als auch der βγ-Komplex können intrazelluläre Effektorproteine beeinflussen. Die G-Protein-α-Untereinheit Familie kann in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Bekannt sind beispielsweise die Gαs-, Gαi-, Gαq- und Gα12- Klasse. GPCRs werden entsprechend der aktivierten G-Proteine klassifiziert.
  • GPCRs der Gs-Klasse vermitteln über Aktivierung von Gαs die Stimulation der Adenylacyclase und erhöhen die intrazelluläre cAMP-Konzentration. GPCRs der Gi- Klasse bewirken über Aktivierung von Gαi eine Hemmung der Adenylatcyclase und erniedrigen das intrazelluläre cAMP.
  • GPCRs der Gq-Klasse wiederum erreichen über Aktivierung von Gαq eine Stimulation verschiedener PLCβ-Isoformen und führen über die Hydrolyse von membranständigem Phosphatidyl-inositol-4,5-biphosphat zu Diacylglycerol und Insositoltriphosphat (IP3). IP3 setzt aus intrazellulären Speichern Ca2+ frei. Die meisten GPCRs können nur mit einer G-Protein-β-Untereinheit Familie Kontakt aufnehmen, d. h., sie besitzen Selektivität für einen bestimmten Signaltransduktionsweg.
  • G-Proteine mit geänderter Rezeptorspezifität und unterschiedlicher Anbindung an einen Signaltransduktionsweg können durch Aneinanderfügen von Bestandteilen aus verschiedenen G-Proteinen zu Hybrid-G-Proteinen mittels der Methoden der Molekularbiologie und Biochemie konstruiert werden.
  • Hybrid-G-Proteine sind Fusionskonstrukte, die innerhalb eines Proteins Sequenzen verschiedener Gα-Untereinheiten vereinigen. So kann z. B. durch die Fusion der Rezeptorerkennungsregion von Gαi mit der Effektor-Aktivierungsregion von Gαq ein Gαq/i-Hybrid hergestellt werden, das Signale von Gi-gekoppelten Rezeptoren empfängt, aber den Gαq-PLCβ-Signaltransduktionsweg anschaltet. Ein derartiges Hybrid, bei welchem die C-terminalen 5-Aminosäuren von Gαq durch die entsprechende Gαi-Sequenz ersetzt worden ist (Gαiq5) wurde von Conklin et al. Nature 363, 274-276 (1993) erstmalig beschrieben.
  • Diese "Umkopplung" von Rezeptoren hat den Vorteil, daß der Assayendpunkt (Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration im Vergleich zur Hemmung der Adenylatzyklase) einfacher durch meßtechnische Verfahren zugänglich ist und im High-Troughput-Screening verwendet werden kann.
  • Substanz P ist ein Neurotransmitter, der sowohl von zentralen als auch von peripheren Nervenendigungen primärer afferenter Neuronen freigesetzt wird. Die biologischen Wirkungen von Substanz P werden vermittelt durch Tachykininrezeptoren (= Neurokininrezeptoren), welche zur Gruppe der G Protein gekoppelten Rezeptoren zählen. Bisher sind drei Tachykininrezeptoren bekannt: NK1, NK2 und NK3. NK1 bindet bevorzugt Substanz P, NK2 bindet bevorzugt Neurokinin A und NK3 bevorzugt Neurokinin B. Die endogenen Tachykinine sind jedoch nicht besonders selektiv für die jeweiligen Rezeptorsubtypen und prinzipiell aktivieren Substanz P, NKA und NKB alle drei NK Rezeptorsubtypen. Zusätzlich zu den bekannten Neurokininrezeptorsubtypen wird ein weiterer Subtyp, der NK4 Rezeptor postuliert.
  • Substanz P wird mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht, bei welchen chronische Entzündung und Schmerzen eine Rolle spielen, wie z. B. Asthma, chronische Bronchitis, entzündliche Magen-Darmerkrankungen, Blasenentzündungen, aber auch Migräne, Depressionen, Erbrechen und epileptische Erkrankungen. Nicht zuletzt im cardiovaskulären Bereich spielt Substanz P eine wichtige Rolle. Substanz P ist ein sehr starker Vasodilator. Vasodilatation und Blutdrucksenkung kommen zustande über die Freisetzung von NO aus dem Endothel großer Gefäße (vermittelt über NK1 Rezeptoren).
  • Substanz P - agierend über Neurokininrezeptoren - ist außerdem ein wichtiger Mediator der neurogenen Plasmaextravasation: Aktivierung von NK1 Rezeptoren in Endothelzellen postkapillärer Venolen macht die tight junctions (Zell-Zell-Kontake) permeabel und erlaubt so den Plasmaproteinen den Austritt aus dem Gefäßlumen in den Interstitialraum.
  • Während die Rolle der Tachykinine (Substanz P, Neurokinin A und Neurokinin B) recht gut untersucht sind, ist wenig bekannt über die physiologischen und pathophysiologischen Wirkungen der Substanz P Abbauprodukte. Substanz P wird metabolisiert zu N-terminalen Fragmenten (1-9, 1-7, 1-4) sowie zu C-terminalen Fragmenten (2-11, 3-11). Während die Effekte der Substanz P Spaltprodukte auf die bekannten Neurokininrezeptoren z. T. schon beschrieben wurde, ist bisher nicht bekannt, ob diese Spaltprodukte auch selbst an Rezeptoren binden und eine Signalwirkung auslösen können, also als natürliche Liganden wirken.
  • Als Ligand soll ein Molekül verstanden werden, welches reversibel an einen G- Protein gekoppelten Rezeptor bindet und über diese Bindung eine Wirkung auf den Rezeptor (Stabilisierung, Inaktivierung, Stimulierung) ausübt. Diese Wirkung betrifft im allgemeinen eine nachgeschaltete intrazelluläre Signalkaskade und kann über die Effekte aus der Signalkaskade nachgewiesen werden. Ein Ligand ist natürlich, wenn er von einem biologischen System hergestellt wird.
  • Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des G Protein gekoppelten Rezeptors mas like 1 ist bekannt und der Öffentlichkeit zugänglich (Genbank: AC 027026). Die Nukleotidsequenz von mas like 1 ist in SEQ ID Nr. 1 und die Aminosäuresequenz von mas like 1 ist in SEQ ID Nr. 2 wiedergegeben.
  • Bislang war kein natürlicher Ligand für den Rezeptor mas like 1 bekannt. Das hatte den Nachteil, daß keine Agonisten oder Antagonisten für diesen Rezeptor identifiziert werden konnten. Agonisten und Antagonisten sind sehr nützliche Hilfsmittel, um die Funktion eines Rezeptors hinsichtlich seiner normalen Aktivität oder pathologisch veränderten Aktivität zu studieren. Agonisten und Antagonisten sind weiterhin von Vorteil bei der Wiederherstellung krankhaft veränderter Rezeptoraktivitäten, die sich unter anderem in unnormal verminderter oder gesteigerter Aktivität äußern können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist demnach die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung einer Verbindung, welche agonistisch oder antagonistisch auf den Rezeptor mas like 1 wirkt.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
    • 1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert,
    • 2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
    • 3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
    • 4. d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
  • Zur Herstellung von Bedingungen, die eine Bindung einer chemischen Verbindung an den Rezeptor ermöglichen, ist insbesondere die Temperatur oder der pH-Wert von Bedeutung. Als Temperatur wird bevorzugt ein Bereich von Raumtemperatur bis 40°C, besonders bevorzugt ein Bereich von 36°C bis 38°C und ganz besonders bevorzugt 37°C ausgewählt. Der pH-Wert liegt bevorzugt im Bereich der Werte 6 bis 8 und besonders bevorzugt bei pH 7,0.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
    • 1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist,
    • 2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
    • 3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
    • 4. d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Präparation aus den Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
    • 1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den besagten Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert,
    • 2. b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet,
    • 3. c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet,
    • 4. d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
    • 5. e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hierin besteht die erste chemische Verbindung aus der Substanz P oder einem Spaltprodukt der Substanz P oder dem Neuropeptid FF.
  • Zur Bestimmung der Bindung der ersten chemischen Verbindung und/oder der Bindung der zweiten chemischen Verbindung in dem vorstehend beschriebenen Verfahren und den weiteren Verfahren dieser Erfindung kann die Erstellung einer Eichkurve erforderlich sein.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
    • 1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist,
    • 2. b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet,
    • 3. c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet,
    • 4. d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
    • 5. e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform hierbei enthält die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die erste chemische Verbindung aus Substanz P oder einem Spaltprodukt der Substanz P oder dem Neuropeptid FF.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei
    • 1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
    • 2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
    • 3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen,
    • 4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors anzeigt.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei
    • 1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
    • 2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
    • 3. c] die Präparation aus Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen,
    • 4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Präparation aus der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hierbei enthält die Präparation aus den Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
    • 1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
    • 2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
    • 3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Inaktivierung desselben ermöglichen,
    • 4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Inaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
    • 1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
    • 2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
    • 3. c] die Präparation der Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen,
    • 4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Präparation aus der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Deaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hierin enthält die Präparation aus den Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Arzneimittelzubereitung enthaltend eine Verbindung, welche durch eines der vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert wurde sowie weiterhin Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Arzneimittelzubereitung die Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P.
  • Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung der Substanz P oder eines Spaltprodukts der Substanz P oder des Neuropeptides FF zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch eine Fehlfunktion des Rezeptors mas like 1 bedingt ist.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Verbindung, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde zur Herstellung eines Komplexes des Rezeptors mas like 1 mit dieser Verbindung. Geeignete Verbindungen zur Herstellung eines solchen Komplexes sind beispielsweise die Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptid FF. Die Erfindung betrifft auch einen Komplex aus dem Rezeptor mas like 1 sowie Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptid FF. Als Komplex soll hier ein Verbund aus einem oder mehreren Proteinen des Rezeptors in mindestens spezifischer Bindung mit Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptide FF sowie evtl. Membranbestandteilen oder Detergentien zur Stabilisierung des Rezeptors bzw. Rezeptor/Ligand-Komplexes verstanden werden. Die Bindung ist spezifisch, wenn die Bindekonstante kleiner oder gleich 100 µM beträgt.
  • Der natürliche Ligand kann in dem biologischen Material oder der Präparation aus biologischem Material bereits vorhanden sein. Man kann einem solchen Liganden aber auch von außen zugeben. Hierzu sollte der Ligand in einer Menge, Konzentration und einem Reinheitsgrad vorliegen, daß dessen Bindung an den Rezeptor sowie die Auslösung des Rezeptorsignals bewirkt wird.
  • Die Zugabe des natürlichen Liganden erfolgt, nachdem das biologische Material oder eine Präparation des biologischen Materials, welche jeweils den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 enthalten, in geeigneter Weise (Zubereitung/Menge) zur Verfügung steht.
  • Bei solch einem natürlichen Liganden handelt es sich bevorzugt um Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptide FF. Die natürlichen Liganden und insbesondere auch Substanz P, ein Spaltprodukt der Substanz P oder Neuropeptide FF können zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren eine durch eine geeignete Detektionsmethode nachweisbare Markierung enthalten. Eine solche Markierung ist beispielsweise eine radioaktive Markierung oder eine fluorometrisch nachweisbare Markierung.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise so verwendet, daß die identifizierten Verbindungen agonistisch oder antagonistisch zum natürlichen Liganden wirken.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Verbindung, welche die Aktivität des G Protein gekoppelten Rezeptors mas like 1 modifiziert, wobei die Verbindung durch ein Verfahren wie vorstehend beschrieben identifiziert wurde.
  • Eine solche Verbindung zeichnet sich dadurch aus, daß deren Masse bevorzugt zwischen 0,1 bis 50 kDa liegt, oder besonders bevorzugt zwischen 0,1 bis 5 kDa liegt oder ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 bis 3 kDa liegt.
  • Eine solche Verbindung, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde, kann ein Protein, eine Aminosäure, ein Polysaccharid, ein Zucker, ein Polynukleotid, ein Nukleotid, eine fettsäurehaltige Verbindung, ein Fett, eine Fettsäure, ein Fettsäurederivat oder eine aromatische Kohlenwasserstoffverbindung sein.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel, welche eine Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde, enthält, sowie weiterhin Formulierungshilfsstoffe für ein Arzneimittel und/oder weitere Zusatzstoffe. Dieses Arzneimittel eignet sich insbesondere zur Behandlung einer Herz- Kreislauferkrankung.
  • Eine Verbindung, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifiziert wurde, kann zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Herz- Kreislauferkrankung verwendet werden.
  • Der G Protein gekoppelte Rezeptor mas like 1 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch Expression einer exogenen DNA Sequenz in einem Prokaryonten oder Eukaryonten hergestellt werden. Grundsätzlich eignet sich zur Herstellung des Proteins jeder prokaryotische oder eukaryotische Plasmidvektor, Bakteriophagenvektor oder Hefeplasmidvektor. Beispiele für solche Vektoren sind pBR322, pUC18, 19, pBlueScript, pcDNA3.1 und andere. Die Expression kann transiert oder permanent erfolgen.
  • Rekombinante Vektorkonstruktionen können unter Zuhilfenahme des einschlägigen Fachwissens, wie dargestellt beispielsweise in "F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (ISBN 0-471-50338-X)" oder om "J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Mamiatis, Molekular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press" (ISBN 0-87969-309-6), hergestellt werden. Dabei wird ein Polynukleotid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß einer der beschriebenen Sequenzinformationen (SEQ ID NO. 1) oder eine Polynukleotidsequenz gemäß einer der beschriebenen Sequenzinformationen (SEQ ID NO. 2) in einen Basisvektor eingebaut. Als Basisvektor soll ein Vektor verstanden werden, in welchen eine Polynukleotidsequenz eines Polynukleotids mittels der Methoden der Molekularbiologie eingebaut und in einem Mikroorganismus beispielsweise einem Bakterium, Pilz oder der Zelle einer Zellkultur kloniert werden kann. Der Basisvektor kann beispielsweise aus einem Plasmid mit einem Antibiotikumresistenzmarker, einem "origin of replication" geeignet zur Vermehrung des Plasmids in Bakterien oder Zellkulturen, sowie einem Promotor geeignet zur Expression eines Proteins bestehen. Der Basisvektor kann beispielsweise auch aus einem Phagenvektor, einem Phagemidvektor, einem Phasmidvektor, einem Cosmidvektor, einem Virusvektor, einem YAC-Vektor oder anderen Vektortyp bestehen. Beispiele für Basisvektoren sind pUC 18, pUC19, pBLuescript, pKS, pSK und andere. Der Einbau des einzubauenden Polynukleotids erfolgt über geeignete Restriktionsschnittstellen mittels der entsprechenden Restriktionsenzyme, welche kommerziell von Firmen wie BioLabs, Roche Diagnostics, Stratagene und anderen angeboten werden. Solche Restriktionsschnittstellen können beispielsweise die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme BamHI, EcoRI, SaII, EcoRV und andere sein.
  • Die rekombinante Vektorkonstruktion besteht in einer bevorzugten Ausführungsform aus einem in Eukaryonten und/oder Prokaryonten verwendbaren Expressionsvektor. Ein Expressionsvektor enthält einen Promotor, der funktionell mit einer Polynukleotidsequenz verbunden werden kann, so daß ein von dieser Polynukleotidsequenz kodiertes Protein in einem biologischen Organismus beispielsweise einem Bakterium, Pilz oder der Zelle einer eukaryotischen Zelllinie synthetisiert wird. Der Promotor kann induzierbar sein beispielsweise mittels Tryptophan oder er kann konstitutiv aktiv sein. Beispiele für Expressionsvektoren sind pUC18, pUC19, pBluescript, pcDNA3.1 oder andere.
  • Biologisches Material ist jedes Material, das genetische Informationen enthält und sich selbst reproduzieren oder in einem biologischen System reproduziert werden kann. Biologisches Material sind beispielsweise Zellen aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Organen wie insbesondere Gehirn, Fettgewebe, Lunge, Herz, Leber, Niere, Milz, Muskel und andere. Biologisches Material sind beispielsweise auch Bakterien oder Pilze wie beispielsweise Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae. Weiterhin umfaßt biologisches Material Zellen aus Zellkulturen.
  • Die Gewinnung von biologischem Material kann im Falle von Zellen aus tierischen oder menschlichen Geweben durch Biopsie, operative Entnahme, Entnahme mittels Spritzen oder Kathetern oder vergleichbaren Techniken erfolgen. Die so entnommenen Zellen können tiefgefroren, aufgearbeitet oder in Zellkultur genommen werden. Bakterien und Hefezellen werden mittels gebräuchlicher Techniken der Mikrobiologie vermehrt und aufgearbeitet.
  • Entsprechende Anleitungen hierfür findet der Fachmann in "Current Protocols in Molecular Biology; ed.: F. M. Ansubel et al., laufend erneuert, Ausgabe 2001, Verlag John Wiley & Sons".
  • Biologisches Material kann auch aus den Zellen einer tierischen Zellkultur bestehen. Solche Zellen sind beispielsweise Mauszellen, Rattenzellen oder Hamsterzellen. Die Zellkulturzellen können primäre Zelltypen oder etablierte Zelllinien sein. Beispiele für etablierte Zelllinien sind Maus 3T3-Zellen, CHO-Zellen, HEK-Zellen oder Hela- Zellen. Haltung, Anzucht und Vermehrung von Zelllinien ist in Standardlehrbüchern beschrieben, wie beispielsweise in "Basic Cell Culture; ed.: J. M. Davis IRL Press, Oxford (1996).
  • Eine Präparation eines biologischen Materials wird beispielsweise durch Aufschluß des biologischen Materials und sich daran anschließende Reinigungsschritte hergestellt. Methoden zum Aufschluß des biologischen Materials können insbesondere wiederholtes Einfrieren und Auftauen, die Behandlung mit Ultraschall, die Verwendung einer French-Press, die Zugabe von Detergentien und Enzymen oder vergleichbares sein. Sich anschließende Reinigungsschritte bestehen beispielsweise aus differentieller Zentrifugation, der Fällung mit Ammonsulfat oder organischen Lösungsmitteln, der Anwendung von chromatographischen Techniken und anderen. Chromatographische Techniken sind beispielsweise die Polyacrylamidgelektrophorese, Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Ionenaustauschchromatograhie, Affinitätschromatographie, Gaschromatograhie, Massenspektrometrie und anderes. Hierfür und insbesondere auch für detaillierte Anweisungen zur Reindarstellung von Proteinen stehen dem Fachmann detaillierte Anweisungen in Lehrbüchern zur Verfügung wie insbesondere in "Current Protocols in Protein Science, ed.: J. E. Coligan et al., Ausgabe 2001, Verlag John Wiley & Sons.
  • Das Inkontaktbringen des biologischen Materials oder der Präparation aus biologischem Material mit einer chemischen Verbindung kann in gewöhnlichen Laborgefäßen wie beispielsweise Eppendorf-Gefäßen, Zentrifugen-Röhrchen oder Glaskolben erfolgen. Das zugrundeliegende wäßrige Medium enthält beispielsweise Puffersubstanzen, Nährmediumbestandteile, einwertige oder zweiwertige Ionen wie Na+, K+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO3 2- oder andere, weiterhin Proteine, Glycerin oder anderes. Für das Inkontaktbringen können bestimmte konstante Bedingungen wie insbesondere die Temperatur, der pH-Wert, die Ionenbedingungen, die Konzentration eines Proteins, des Volumens oder andere Faktoren vorteilhaft sein. Dies wird erreicht, in dem beispielsweise das Inkontaktbringen in konstant temperierten Inkubationsvorrichtungen, in Gegenwart eines Puffers oder mit den zuvor genau eingewogenen Mengen der Ionen oder Proteine durchgeführt wird. Das wäßrige Lösungsmittel kann insbesondere auch einen bestimmten Anteil eines organischen Lösungsmittels wie Dimethylsulfoxid, Methanol oder Ethanol enthalten. Der Gehalt eines solchen Lösungsmittels beträgt aber vorzugsweise nicht mehr als 10 Vol.-% des Ansatzes.
  • Die Bereitstellung einer chemischen Verbindung erfolgt beispielsweise durch chemische Synthese. Dem Fachmann sind die Standardsynthesemethoden geläufig. Die chemische Verbindung kann Teil einer Sammlung chemischer Verbindungen sein, wie sie durch Lagerung und Katalogisierung der chemischen Verbindungen aus abgeschlossenen Syntheseprogrammen entstehen (sogenannte "chemical libraries"). Die Verbindung kann in anderen Fällen von einem Mikroorganismus insbesondere einem Bakterium, aber auch von einem Pilz oder einer Pflanze gebildet worden sein (Naturstoff).
  • Geeignete pharmazeutische Verbindungen können als Arzneimittel in oraler, peroraler, topischer, parenteraler oder rektaler Form verabreicht werden. Die am besten geeignete Verabreichungsweise ist in jedem Einzelfall von der Art und Schwere des zu behandelnden Zustands und von der Art der jeweils verwendeten Verbindung abhängig. Eine geeignete Wirkstoffkonzentration beträgt ca. 1% bis 35%, vorzugsweise ca. 3% bis 15%.
    • Beispiele Klonierung des humanen mas like 11 Rezeptors
  • Die Sequenz des humanen GPCR mas like 1 ist in Datenbanken, die für die Öffentlichkeit zugänglich sind, hinterlegt. Die entsprechende Zugangsnummer von Genbank lautet AC 027026. Die SEQ ID Nr. 1 enthält die Nukleotidsequenz des mas like 1 Rezeptors. In der SEQ ID Nr. 2 findet sich die entsprechende Aminosäuresequenz. Das humane Gen enthält keine Introns. Der Rezeptor wurde deshalb ausgehend von genomischer DNA mittels einer Polymerasekettenverlängerungsreaktion (Polymerase Chain Reaction; PCR) vervielfältigt. Die humane genomische DNA stammte im vorliegenden Fall von der Firma Clontech, Palo Alto. Grundsätzlich eignet sich auch humane genomische DNA einer anderen Firma oder aus eigener Herstellung zur Durchführung der PCR. Die PCR Reaktionsbedingungen wurden wie folgt gewählt: zuerst Inkubation bei 94°C für 10 Min., anschließend 35 Zyklen pro Zyklus Inkubation bei 94°C für 1 Min., dann bei 60°C für 1 Min. und schließlich bei 72°C für 2 Min. Die Reaktion wurde mittels des GC-Melt Kit der Firma Clontech durchgeführt. Zur Ausführung der PCR insbesondere hinsichtlich Pufferbedingungen und Enzym eignet sich aber auch ein anderes in den Lehrbüchern verwendetes Protokoll. Die verwendeten Primer gemäß SEQ ID Nr. 3 und 4 wurden so konstruiert, daß eine HindIII-Stelle (SEQ ID Nr. 3) bzw. eine EcoRI-Schnittstelle (SEQ ID Nr. 4) vorhanden war. Das gebildete PCR- Produkt hatte eine Länge von 1260 Basenpaaren. Es wurde mittels der HindIII- und EcoRI-Schnittstellen in den Expressionsvektor pcDNA3.1 eingebaut. Dieser Vektor ist kommerziell erhältlich unter anderem von der Firma Invitrogen, Carlsbad in Kalifornien, USA.
    • Quantitative RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) in Echtzeit mittels Taqman
  • Kommerziell erhältliche RNA Proben aus folgenden Geweben und Organen standen zur Verfügung: Nebennierendrüse, fötales Gehirn, fötale Leber, Dünndarm, Herz, Niere, Leber, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Plazenta, Prostata, Skelettmuskel, Milz, Hoden, Thymus, Knochenmark, Speicheldrüse, Thymusdrüse, Luftröhre und Uterus.
  • Die RNA Proben wurden zuerst unter Standardreaktionsbedingungen einem DNAase-Verdau unterworfen. Aus ca. 2 µg der Dnase behandelten RNA wurde mit Hilfe einer reversen Transkriptase des MMLV Moloney Murine Leukemia Virus cDNA hergestellt. Der Reaktionsansatz hierfür wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und enthielt 25 mM/MgCl2 je 10 mM dNTPs, 50 µM Random-Hexamer- Primer, 50 µM Oligo(dT)16 und 20 U/µl Rnase Inhibitor. Die Reaktion wurde in einem Volumen von 100 µl durchgeführt, wobei zuerst für 10 Min. bei 25°C, anschließend für 60 Min. bei 42°C inkubiert wurde, dann für 5 Min. bei 95°C inaktiviert und schließlich in Eis abgekühlt wurde.
  • Die anschließende PCR-Reaktion wurde mittels eines TaqMan Universal PCR Master Mix der Firma Applera aus Weiterstadt, Deutschland durchgeführt. Dieser entspricht hinsichtlich Puffer, Enzymausstattung und anderer Reagenzien den üblichen und dem Fachmann bekannten Laborprotokollen.
  • Als Primer wurden die folgenden Sequenzen verwendet:
    5'-TGC ITT GTG GCA AGG AGA CC-3'
    (SEQ ID Nr. 5; "vorwärts"-Primer)
    5'-TTC CTA CCA GCC CGA CCA G-3'
    (SEQ ID Nr. 6; "rückwärts"-Primer).
  • Die Inkubationsbedingungen für die PCR wurden folgendermaßen gewählt: 2 Min. 50°C, dann 10 Min. 95°C, anschließend 40 Zyklen für jeden Zyklus 15 Sekunden 95°C und 1 Min. 60°C. Die Primer wurden in einer Konzentration von je 50 µM eingesetzt. Als Kontrolle verwendete man ribosomale 18 S RNA.
  • Die quantitative Analyse erfolgte mittels eines Fluoreszenz Resonanz Energietransfers (FRET). Der Fachmann kennt die quantitative Bestimmung dieser Art auch unter der Bezeichnung Taqman-PCR. Eine Taqman-Probe setzt sich aus einem einzelsträngigen Oligonukleotid zusammen, welches an den Enden mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren markiert ist. Das Fluorophor des 3'-Endes, der sogenannte Acceptor, funktioniert dabei mit abschwächendem Effekt ("quencher") des Fluorophors vom 5'-Ende, dem sogenannten Donor.
  • Der Donor am 5'-Ende wird durch die 5'-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA Polymerase im Verlauf der Kettenverlängerungsreaktion freigesetzt. Da der Donor in freier Form nicht mehr gequenscht wird, kann dessen Menge mittels eines Fluorimeters bestimmt werden. Da sich gebildete Donormenge und akkumuliertes PCR-Produkt proportional verhalten, kann die amplifizierte DNA quantifiziert werden. Grundsätzlich ist darauf zu achten, daß die Schmelztemperatur der Taqman-Probe höher liegt als diejenige der Primer für die Amplifizierung.
  • Als Fluorophore verwendete man FAM (6-Carboxyfluorescein) als Donor und TAMRA (5-Carboxy-tetramethylrhodamin) als Acceptor (= quencher). Die verwendete Taqman-Probe hatte die folgende Nukleotidsequenz:
    3'-TGA TCC CGG TCT TCC TGA TCC TTT TCA-5' (SEQ ID. Nr. 7).
    Zellkultur und Transfektion für den FLIPR-Assay
    CHO-K1 Zellen wurden in basalem Iscove-Medium, welches ergänzt wurde mit 10% fötalem Rinderserum 10 000 U/ml-10 000 µg/ml Penicillin-Streptomycin, Gentamycin und 2 mM Glutamin, kultiviert.
  • Iscove-Medium ist kommerziell erhältlich unter anderem von der Firma Biochrom, Berlin. Die Zusammensetzung von Iscove-Medium ist beschrieben in "Iscove, N. N., Melchers, F., Journal of Experimental Medicine 147, 923-933 (1978)". Die CHO-K1 Zellen wurden für die transiente Transfektion in einer Menge von 2 × 105 Zellen auf eine 35 mm Kulturschale ausgebracht. Die Zellen wurden nach ca. 24 Stunden Inkubation oder bei einer Konfluenz von 50-80% mit 2 µg DNA mittels Lipofectamine Reagenz, welches unter anderem von Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe kommerziell zur Verfügung gestellt wird, transfiziert.
  • Etwa 16 bis 18 Stunden nach der Transfektion überführte man die Zellen auf 96 well Mikrotiterplatten mit einer Dichte von etwa 80 000 Zellen pro well. Anschließend wurde für weitere 18 bis 24 Stunden inkubiert. Danach gab man 95 µl HBSSC (Hank's buffered Saline Solution), welche 20 mM HEPES, 2,5 mM Probenecid, 4 µM Fluo4 und 1% fötales Rinderserum enthielt und inkubierte für 1 Stunde bei 37°C in Gegenwart von 5% CO2. Fluo4 ist ein Farbstoff, welcher in Anwesenheit von Ca2+ fluoresziert. Fluo4 wird unter anderem von Molecular Probes Europe BV, Leiden kommerziell vertrieben. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS (Phosphate buffered sahne), welche 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA und 2,5 mM Probenecid enthielt, gewaschen.
  • Nach dem letzten Waschschritt wurden in jeder Vertiefung etwa 100 µl der Lösung auf den Zellen belassen. Die zu testenden Peptide wurden in Wasser oder DMSO (Dimethylsulfoxid) in einer Konzentration von 2 mM gelöst. Von einer solchen Stammlösung ausgehend wurden die entsprechenden Verdünnungen der Endkonzentration (20 mM) hergestellt. Die Fluoreszenz wurde mittels eines FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader; Molecular Devices GmbH, Ismaning) insgesamt für 3 Minuten in 1 Sekundenintervallen während der ersten Minute und in 3 Sekundenintervallen während der zweiten und dritten Minute gemessen. Zur Bestimmung der agonistischen Wirkung wurden die Meßwerte zwischen 18 Sekunden und 37 Sekunden verwendet.
    • Identifizierung von Liganden des Rezeptors mas like 1
  • Verschiedene Peptide wurden hinsichtlich ihrer stimulierenden Eigenschaft auf den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 getestet. Der Test wurde mittels FLIPR Technologie durchgeführt. Der Rezeptor wurde hierzu in CHO-K1 Zellen transient zur Expression gebracht.
  • Getestet wurden die folgenden Peptide: Neuropeptid FF, Neuropeptid AF, Neuropeptid SF, Angiotensin, Bradykinin, Bombesin, Adrenomedullin, Substanz P, Substanz P1-9, Substanz P2-11.
  • Fluoreszenzbildung in den Zellen konnte nachgewiesen werden bei Anwesenheit von Substanz P (ca. 500 Fluorescence intensity units), Substanz P2-11 (ca. 2500 Fluorescence intensity units) und Neuropeptid FF (ca. 2000 Fluorescence intensity units). Der Nullwert lag jeweils bei ca. 20 Fluorescence intensity units.
  • Die Aktivierung des Rezeptors zeigte im Bereich der Konzentration von 5 × 10-6 bis 1 × 10-5 M von Substanz P und Substanz P2-11 eine lineare Abhängigkeit. Der ECSO- Wert für Substanz P betrug 10,37 µM.
  • Die Substanz P2-11 setzte in den transient transfizierten CHO-K1 Zellen Arachidonsäure frei.
  • Damit konnten für den G Protein gekoppelten Rezeptor mit der Bezeichnung mas like 1 die Substanz P, die Substanz P2-11 und das Neuropeptid FF als natürliche Liganden identifiziert werden.
  • Ein entsprechend dem Nachweisverfahren aufgebautes Testsystem zum Auffinden von Agonisten bzw. Antagonisten hinsichtlich der Aktivität von mas like 1 enthielt zusätzlich Substanz P, Substanz P2-11 oder Neuropeptid FF. Agonistisch wirkten unter anderem weitere Fragmente der Substanz P wie beispielsweise Substanz P4- 11 oder Substanz P1-9.
  • Neuropeptide FF hat folgende Aminosäuresequenz:
    H-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Pro-NH2. (SEQ ID Nr. 8)
  • Substanz P2-11 hat folgende Aminosäuresequenz:
    H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2. (SEQ ID Nr. 9). SEQUENZPROTOKOLL







Claims (22)

1. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert,
2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
4. d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
2. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet, wobei
1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist,
2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
4. d] die Bindung der chemischen Verbindung an den Rezeptor mas like 1 festgestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
4. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den besagten Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert,
2. b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet,
3. c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet,
4. d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
5. e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die erste chemische Verbindung die Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P oder das Neuropeptid FF ist.
6. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 in spezifischer Weise und kompetitiv bezüglich einer ersten chemischen Verbindung bindet, wobei
1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, in welcher dieser Rezeptor enthalten ist,
2. b] mindestens eine erste chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche an den Rezeptor mas like 1 bindet,
3. c] mindestens eine zweite chemische Verbindung bereitgestellt wird, welche sich von der ersten chemischen Verbindung unterscheidet,
4. d] die Zellen aus a] mit der ersten chemischen Verbindung aus b] und der zweiten chemischen Verbindung aus c] entweder gleichzeitig oder nacheinander in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglichen,
5. e] die Bindung der ersten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor oder die Bindung der ersten und zweiten chemischen Verbindung an den Rezeptor bestimmt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die erste chemische Verbindung die Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P oder das Neuropeptid FF ist.
9. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei
1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen,
4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Zelle in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
10. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen aktiviert, wobei
1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
3. c] die Präparation aus Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen,
4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Präparation aus der Zelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Aktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
12. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
1. a] mindestens eine Zelle bereitgestellt wird, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimiert und in welcher mittels des Rezeptors mas like 1 eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
3. c] die Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht werden unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Inaktivierung desselben ermöglichen,
4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Zelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Inaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
13. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche an den G Protein gekoppelten Rezeptor mas like 1 spezifisch bindet und diesen inhibiert, wobei
1. a] eine Präparation aus Zellen, welche den Rezeptor mas like 1 an ihrer Oberfläche exprimieren, bereitgestellt wird, wobei in dieser Präparation eine "second messenger" Signalkaskade ausgelöst werden kann,
2. b] mindestens eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
3. c] die Präparation der Zellen aus a] mit der chemischen Verbindung aus b] in Kontakt gebracht wird unter Bedingungen, die eine Bindung an den Rezeptor und eine Aktivierung desselben ermöglichen,
4. d] die Änderung der Konzentration des "second messenger" in der Präparation aus der Zelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der chemischen Verbindung bestimmt wird, wobei eine Änderung bei Anwesenheit der chemischen Verbindung eine Deaktivierung des Rezeptors mas like 1 anzeigt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation aus Zellen die Membranfraktion eines Zellextrakts enthält.
15. Verfahren nach Anspruch 1, 4, 5, 9, 10 dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine CHO, CHO-K1 oder eine HEK-Zelle ist.
16. Arzneimittelzubereitung enthaltend eine Verbindung, welche durch ein Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 identifiziert wurde, sowie Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
17. Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 15 enthaltend Substanz P oder ein Spaltprodukt von Substanz P oder Neuropeptide FF.
18. Verwendung von Substanz P zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch eine Fehlfunktion des Rezeptors mas like 1 bedingt ist.
19. Verwendung eines Spaltprodukts von Substanz P zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch Fehlfunktion des Rezeptors mas like 1 bedingt ist.
20. Verwendung von Neuropeptide FF zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die durch Fehlfunktion des Rezeptors mas like 1 bedingt ist.
21. Verwendung von Substanz P oder eines Spaltproduktes der Substanz P oder des Neuropeptids FF zur Herstellung eines Komplexes des Rezeptors mas like 1 mit dieser Verbindung.
22. Protein enthaltend den Rezeptor mas like 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz P oder ein Spaltprodukt der Substanz P oder das Neuropeptide FF spezifisch an den Rezeptor mas like 1 gebunden ist.
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