DE10336177B4

DE10336177B4 - Verwendung von Zellorganellen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren und Zellen

Info

Publication number: DE10336177B4
Application number: DE10336177A
Authority: DE
Inventors: Alexander Cherkasky
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2003-08-07
Publication date: 2010-02-11
Anticipated expiration: 2023-08-08
Also published as: DE10336177A1

Abstract

Verwendung von Zellorganellen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren und Zellen in einem extrazellulären wässrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Medium ein Zellvermehrungssystem, ein in vitro – Translations – oder in vitro – Transkriptionssystem, Zellreinigungssystem, ein PCR-System, ein Nukleinsäurevermehrungssystem, Nukleinsäurereinigungssystem, oder ein Nukleinsäure-Ligationssystem ist.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Zellorganellen zur Stabilisierung von Nuckleinsäuren und Zellen.
Biologische Moleküle wie Nukleinsäuren sind empfindlich und können in präparativen und analytischen Verfahren leicht zersetzt oder abgebaut werden. Bei mechanischen Manipulationen erfahren Nukleinsäuren dynamische Belastungen, die die Stabilität derselben insbesondere bei höheren Temperaturen (28–36°C) beeinträchtigen. Bekannt ist die chemische Stabilisierung von Nukleinsäuren durch Extrakte von extremophilen Bakterien. Diese Extrakte werden aus halo- und thermophilen Bakterien isoliert. Sie enthalten Verbindungen, die sich an den Nukleinsäuren anlagern und sie dadurch stabilisieren.
Halo- oder thermophile Bakterien enthalten definitionsgemäß keine Zellorganellen, da sie zu den Prokaryoten gehören.
OKAZAKI et al. (Biochemistry International, Vol. 18, S. 211–216) untersuchen in einem zellfreien System die stabilisierende Bindung von Hexokinase an Mitochondrien, die Teil der natürlichen Regulation dieser Enzymaktivität innerhalb von Zellen ist. Die künstliche Stabilisierung von Nukleinsäuren oder Zellen durch Zellorganellen geht aus diesem Dokument nicht hervor.
Werden Nukleinsäuren, die zuvor in nichtstabilisierten Medien gelagert wurden, elektrophoretisch oder gelchromatographisch getrennt, tritt eine Vielzahl von Banden von Nukleinsäurebruchstücken auf. Häufig ist die Degradation der DNA nach kurzer Zeit bereits soweit fortgeschritten, daß bei einer bestimmten DNA eine Hauptbande schon nicht mehr erkannt werden kann.
Es besteht daher das Bedürfnis nach weiteren Verfahrensweisen, Nukleinsäuren und Zellen während der Lagerung und der Verwendung in wässrigen Systemen zu stabilisieren.
Überraschend wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Zellorganellen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren und Zellen in extrazellulären wässrigen Systemen. Es konnte festgestellt werden, daß Nukleinsäuren, die über einen gewissen Zeitraum in Gegenwart von Zellorganellen gelagert wurden, weniger degradiert sind als solche, die über denselben Zeitraum im gleichen Medium gehalten wurden. Darüber hinaus zeigte sich, daß die Aktivität biologischer Systeme in Gegenwart von Zellorganellen deutlich höher ist als unter denselben Bedingungen in deren Abwesenheit.
Zur Durchführung der Erfindung geeignete Zellorganellen umfassen Mitochondrien, Chloroplasten oder deren Gemische. Sie können in Konzentrationen von mindestens 1 mg/ml, vorzugsweise 3 bis 15 mg/ml, beispielsweise 5 bis 10 mg/ml wässriges extrazelluläres System eingesetzt werden.
Darüber hinaus lassen sich auch prokaryotische Zellen wie E. coli und eukaryotische Zellen durch die erfindungsgemäße Verwendung vorteilhaft stabilisieren oder in Gegenwart der Zellorganellen zu eine gesteigerten Produktivität veranlassen. Eukaryotische Zellen schließen S. cerevisae, Aspergillus niger, Hefe, Eizellen, ausgenommen befruchtete Eizellen des Menschen, Stammzellen, embryonale Stammzellen, ausgenommen solche des Menschen, adulte Stammzellen, Nabelschnurstammzellen ein.
Extrazelluläre wässrige Systeme im Sinne der Erfindung umfassen die üblichen gepufferten Lösungen, in denen Nukleinsäuren oder Zellen gelagert, vermehrt oder zur Reaktion gebracht werden. Solche Systeme sind beispielsweise Zellvermehrungssysteme, in vitro-Translationssysteme und in vitro-Transkriptionssysteme, Zellreinigungssysteme, PCR-, Nukleinsäurevermehrungssysteme, Reinigunssysteme, Nukleinsäure-Ligationssysteme, Systeme, in denen Zellentkernungen vorgenommen werden oder Zellkerne auf entkernte Eizellen übertragen werden oder Zellfusionen erfolgen.
Die Stabilisierung kann in stagnierenden, zirkulierenden und vibrierenden Medien erfolgen. Diese Medien sind übliche Medien wie sie in der Biotechnologie, der Gentechnologie und insbesondere den zuvor genannten Systemen eingesetzt werden. Diese Medien sind dem Fachmann bekannt.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1 – Isolierung von Mitochondrien.
Hefezellen wurden in Zentrifugenbechern geerntet und 5 Min. lang bei 3.500 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden mit 40 ml destilliertem Wasser gewaschen und erneut 5 Min. lang bei 6.000 UpM zentrifugiert. Nach Gewichtsbestimmung wurden diese in mit 40 ml Sorbitolpuffer und Zymolyase (50 mg/10 g Zellen) getränktem Zellpellet resuspendiert und 25 Min. bei 30°C im Schüttelwasserbad bewegt. Die hierbei gebildeten Sphäroplasten werden 5 Min. lang bei 6.000 UpM zentrifugiert und anschließend in 30 ml 1,2 M Sorbitolpuffer resuspendiert. Nach erneutem fünfminütigen Zentrifugieren bei 6.000 UpM werden die Sphäroplasten in einer Mischung aus 30 ml Homogenisationspuffer [10 mM Tris/HCL, pH 7,4, 0,5% BSA (W/V), 0,6 M Sorbitol, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF] und 0,5% BSA und 1 mM PMSF (Proteaseinhibitor) resuspendiert. Die Suspension wurde mit einem Potter homogenisiert, mit demselben Puffer aufgefüllt und in SS34-Röhrchen gegeben. Es wurde 5 Min. lang bei 3.000 UpM (11.000 g) zentrifugiert. Der Überstand über den Zelltrümmern wurde entnommen und erneut 5 Min. lang bei 4.000 UpM (19.000 g) zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde schließlich ein weiteres Mal 10 Min. lang bei 10000 UpM (12.000 g) zentrifugiert. Das die Mitochondrien enthaltene Pellet wurde in SEM-Puffer (250 mM Sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM MOPS, pH 7,2 in einer Stammlösung mit 1 M-K-Phosphat-Puffer pH 7,4) aufgenommen und nach Überführung in Eppendorf-Pipetten 5 Min. lang bei 4.000 UpM, 2°C (1.200 g) zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde 10 Min. lang bei 12.000 UpM (12.000 g) zentrifugiert und das Pellet in SEM aufgenommen (0,1 ml/g Zellprotein). 10 μl der Mitochondrien-Präparation wurde mit 990 μl einer 6%igen SDS-Lösung vermischt und die Proteinkonzentration bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen.
Beispiel 2 – Isolierung der DNA
Die Isolierung der DNA erfolgte gemäß Gene 42 (1986) 169–173). 5 × 10⁸ Hefezellen wurden aus der Kultur abzentrifugiert, in Wasser gewaschen und in 150 μl SCE-Puffer resuspendiert. Es wurden 10 μl Zymolyase-Lösung zugesetzt und das Gemisch 20 Min. lang bei 37°C inkubiert und anschließend kurz zentrifugiert, um die Zellen zur Sedimentation zu bringen. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 150 μl Guaninhydrochlorid-Lösung suspendiert. Das Gemisch wurde 10 Min. bei 65°C gehalten und vorsich tig geschüttelt. Es wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 150 ml kaltes Ethanol (70%) zugesetzt, 5 Min. lang zentrifugiert und das Pellet vom Überstand befreit. Es wurden 10 × 0,3 ml TrisEDTA zugegeben bis sich das Pellet verflüssigt hatte, anschließend wurden 3 μl Proteinase K-Lösung (5 mg/ml) und 1 h lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die DNA 2 × mit 0,5 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert. Zu der wäßrigen Phase wurden 30 μl 3 M NaOAc und 600 μl Ethanol (70%) gegeben und das Gemisch 15 Min. lang bei –70°C gehalten. Anschließend wurde 10 Min. lang zentrifugiert, das erhaltene Pellet mit Ethanol (70%) gewaschen, getrocknet und mit 50 μl TrisEDTA, pH 8 aufgenommen.
Beispiel 3 – Untersuchung der Stabilität der DNA
Die folgenden Untersuchungen wurden mit vier DNA-Proben durchgeführt, die gemäß Beispiel 1 isoliert worden waren. In allen Proben wurden 10 μl der DNA eingesetzt, was etwa 2,5 μg DNA je Probe entsprach. Probe A wurde direkt nach der Isolierung auf ein Elektrophoresegel aufgetragen und diente als Kontrolle. Probe B wurde 12 h bei 36°C gelagert, mit 10 μl Mitochondrien versetzt und auf das Elektrophoresegel aufgetragen. Probe C wurde erhalten, indem DNA und Mitochondrien im Gemisch 12 h lang bei 28°C inkubiert wurden. Bei Probe D wurde in gleicher Weise verfahren, wobei die Inkubation bei 36°C erfolgte. Nachdem alle Proben auf das Elektrophoresegel (PAA/SDS) aufgetragen waren wurde die Elektrophorese eine Stunde lang bei 200 Volt und einer Stromstärke von anfänglich 110 mA bis später 70 mA durchgeführt.
Die Auswertung der Elektrophorese ergab im Falle der Probe A eine sehr geringe Degradation. Die eine Bande der hochmolekularen DNA war scharf auf dem Gel zu sehen. Demgegenüber fehlte die Ausbildung einer scharfen Bande bei der Probe B. Vielmehr zeigte sich eine unspezifische Färbung über den gesamten Verlauf der Bahn. Die Proben C und D (in Gegenwart von Mitochondrien) zeigten scharfe Banden für die hochmolekulare DNA. Die Degradation war in diesen Proben sehr viel geringer als in Probe B.
Es kann somit festgestellt werden, daß die Zugabe von Mitochondrien eine stabilisierende Wirkung auf die DNA hatte.

Claims

Verwendung von Zellorganellen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren und Zellen in einem extrazellulären wässrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Medium ein Zellvermehrungssystem, ein in vitro – Translations – oder in vitro – Transkriptionssystem, Zellreinigungssystem, ein PCR-System, ein Nukleinsäurevermehrungssystem, Nukleinsäurereinigungssystem, oder ein Nukleinsäure-Ligationssystem ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellorganellen Mitochondrien; Chloroplasten oder deren Gemische sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Medium ein biologisches Reaktionssystem ist, in dem die Zellorganellen von der zu stabilisierenden Nukleinsäure durch eine für Zellorganellen undurchlässige Membran getrennt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Medium ein Medium ist, in dem Zellentkernungen vorgenommen werden, Zellkerne auf entkernte Eizellen, ausgenommen solche des Menschen übertragen werden oder Zellfusionen erfolgen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Zellorganellen in dem extrazellulären wässrigen Medium mindestens 1 mg/ml, insbesondere 4 mg/ml, beträgt.