DE112008003237T5

DE112008003237T5 - Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression

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Publication number: DE112008003237T5
Application number: DE112008003237T
Authority: DE
Inventors: Jörg Dr. Bauer; Tom Wetjen; Yiao Saskatoon Qiu; Guohai Saskatoon Wu
Original assignee: Bioriginal Food and Science Corp; BASF Plant Science GmbH
Current assignee: Bioriginal Food and Science Corp; BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2011-03-17
Also published as: EP2222856A2; US20100263088A1; CA2708087A1; WO2009077478A2; WO2009077478A3; AU2008337600A1

Abstract

Polynukleotid, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, die eine samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz wie in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt;
(b) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt;
(c) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist;
(d) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die mindestens zu 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt;
(e) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfahren, die eine gewebespezifische und insbesondere samenspezifische Expression von Genen ermöglichen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Polynukleotid, das eine Expressionskontrollsequenz umfasst, die eine samenspezifische Expregssion einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist. Ferner zieht die vorliegende Erfindung Vektoren, Wirtszellen, nicht-humane transgene Organismen in Betracht, die das oben genannte Polynukleotid umfassen, wie auch Verfahren und Anwendungen eines solchen Polynukleotids.
Im Bereich der ”grünen” (landwirtschaftlichen) Biotechnologie werden Pflanzen genetisch manipuliert, um ihnen günstige Merkmale zu verleihen. Diese günstigen Merkmale können eine höhere Ausbeute, höhere Toleranz, verringerte Abhängigkeit von Düngemitteln, Herbizid-, Pestizid- oder Fungizidresistenz oder die Fähigkeit sein, chemische Spezialitäten, wie Nahrungsbestandteile, Arzneimittel, Öle für Nahrungsmittel und Petrochemie, usw. zu erzeugen.
In vielen Fällen ist es notwendig, ein heterologes Gen in den genetisch modifizierten Pflanzen an einer ziemlichen spezifischen Stelle zu exprimieren, um eine Pflanze zu erhalten, die das gewünschte günstige Merkmal aufweist. Eine Hauptstelle für eine Genexpression ist der Pflanzensamen. In den Samen verlaufen viele wichtige Synthesewege, z. B., in der Fettsäuresynthese. Daher ermöglicht eine Expression heterologer Gene in Samen die Manipulation von Fettsäuresynthesewegen und somit die Bereitstellung verschiedener Fettsäurederivate und Verbindungen auf Lipidbasis.
Für viele heterologe Gene jedoch ist eine samenspezifische Expression erforderlich. Promotoren, die eine samenspezifische Expression ermöglichen, sind im Stand der Technik bekannt. Solche Promotoren enthalten den Napin-Promoter aus Raps ( US 5,608,152 ), den USP-Promoter aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225(3): 459–67), den Oleosin-Promoter aus Arabidopsis ( WO 98/45461 ), den Phaseolin-Promoter aus Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), den Bce4-Promoter aus Brassica ( WO 91/13980 ) oder den Legumin-B4-Promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233–9), und Promotoren, die eine samenspezifische Expression in monocotyledonen Pflanzen bewirken, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis und dergleichen. Geeignete, nennenswerte Promotoren sind der Gerste Ipt2- oder Ipt1-Genpromotor ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder die Promotoren von dem Gerste-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, dem Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen oder dem Roggen-Secalin-Gen, die in WO 99/16890 beschrieben sind.
Es besteht jedoch ein eindeutiger Bedarf an weiteren Promotoren, die eine zuverlässige und effiziente Expression von Fremdnukleinsäuren in Samen ermöglichen.
Das technische Problem, das dieser Erfindung zugrunde liegt, kann als die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren erachtet werden, die den oben genannten Bedürfnissen gerecht werden. Das technische Problem wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen und in der Folge dargestellt sind.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynukleotid, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, die eine samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz wie in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt;
(b) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt;
(c) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist;
(d) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die mindestens zu 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt;
(e) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking von einer offenen Leserahmen-Sequenz, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt, erhältlich ist; und
(f) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking von einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, die mindestens zu 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt.

Der Begriff ”Polynukleotid”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein lineares oder kreisförmiges Nukleinsäuremolekül. Er beinhaltet DNA- wie auch RNA-Moleküle. Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine Expressionskontrollsequenz umfasst, wie anderwärts in dieser Beschreibung definiert. Zusätzlich zu der Expressionskontrollsequenz umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise des Weiteren mindestens eine Nukleinsäure von Interesse, die funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden ist, und/oder eine Terminationssequenz zur Transkription. Somit umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Expressionskassette für die Expression mindestens einer Nukleinsäure von Interesse. Als Alternative kann das Polynukleotid zusätzlich zu der Expressionskontrollsequenz mehrere Klonierungsstellen und/oder eine Terminationssequenz für die Transkription umfassen. In einem solchen Fall ist die mehrfache Klonierungsstelle vorzugsweise derart angeordnet, dass eine funktionsfähige Verbindung einer Nukleinsäure, die in die mehrfache Klonierungsstelle eingeführt werden soll, mit der Expressionskontrollsequenz möglich ist. Zusätzlich zu den oben genannten Komponenten könnte das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Komponenten umfassen, die für eine homologe Rekombination erforderlich sind, d. h., flankierende genomische Sequenzen einer Zielstelle. Ebenso vorzugsweise jedoch kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen aus der Expressionskontrollsequenz bestehen.
Der Begriff ”Expressionskontrollsequenz”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die imstande ist, die Expression einer anderen Nukleinsäure zu steuern, die funktionsfähig an diese gebunden ist, z. B. einer Nukleinsäure von Interesse, auf die anderwärtig in dieser Beschreibung ausführlich Bezug genommen wird. Eine Expressionskontrollsequenz, auf die gemäß der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, umfasst vorzugsweise Sequenzmotive, die von Polypeptiden, d. h. Transkriptionsfaktoren, erkannt und gebunden werden. Die Transkriptionsfaktoren sollen bei einer Bindung RNA-Polymerasen, vorzugsweise, RNA-Polymerase I, II oder III, insbesondere RNA-Polymerase II oder III, und ganz besonders RNA-Polymerase II rekrutieren. Dadurch wird die Expression einer Nukleinsäure, die funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden ist, eingeleitet. Es ist klar, dass abhängig von der Art einer zu exprimierenden Nukleinsäure, d. h. der Nukleinsäure von Interesse, eine Expression, im vorliegenden Sinn, eine Transkription von RNA-Polynukleotiden von der Nukleinsäuresequenz umfassen kann (wie zum Beispiel für Antisense-Methoden oder RNAi-Methoden geeignet) oder eine Transkription von RNA-Polynukleotiden, gefolgt von einer Translation der RNA-Polynukleotide in Polypeptide umfassen kann (wie z. B. für die Genexpression und rekombinante Polypeptidproduktionsmethoden geeignet). Zur Steuerung der Expression einer Nukleinsäure kann sich die Expressionskontrollsequenz unmittelbar neben der zu exprimierenden Nukleinsäure befinden, d. h. physisch an die Nukleinsäure an ihrem 5'-Ende gebunden sein. Als Alternative kann sie in physischer Nähe liegen. Im letztgenannten Fall muss sie jedoch so angeordnet sein, dass sie eine funktionelle Interaktion mit der zu exprimierenden Nukleinsäure ermöglicht. Eine Expressionskontrollsequenz, auf die hier Bezug genommen wird, umfasst vorzugsweise zwischen 200 und 5.000 Nukleotide in der Länge. Insbesondere umfasst sie zwischen 500 und 2.500 Nukleotide und ganz besonders mindestens 1.000 Nukleotide. Wie oben erwähnt, umfasst eine Expressionskontrollsequenz vorzugsweise mehrere Sequenzmotive, die für eine Transkriptionsfaktorbindung oder zur Verleihung einer gewissen Struktur an das Polynukleotid, das die Expressionskontrollsequenz umfasst, erforderlich sind. Sequenzmotive werden manchmal auch als cis-regulatorische Elemente bezeichnet und enthalten, im vorliegenden Sinn, Promotorelemente wie auch Enhancer-Elemente.
Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen, die in einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthalten sein sollen, haben eine Nukleinsäuresequenz wie in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt.
Des Weiteren hat eine Expressionskontrollsequenz, die aus einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht, eine Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts der offenen Leserahmensequenz liegt, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt, d. h. ist eine variante Expressionskontrollsequenz. Es ist klar, dass sich die Expressionskontrollsequenzen aufgrund von allelischen Variationen geringfügig in ihren Sequenzen unterscheiden können. Daher zieht die vorliegende Erfindung auch eine Expressionskontrollsequenz in Betracht, die von einem offenen Leserahmen abgeleitet werden kann, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist. Die Expressionskontrollsequenzen sind imstande, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, an die stromaufwärts liegenden Sequenzen der offenen Leserahmen zu hybridisieren, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist, d. h. die Expressionskontrollsequenzen, die in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt sind. Stringente Hybridisierungsbedingungen im vorliegenden Sinn sind vorzugsweise Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 53 bis 65°C, vorzugsweise bei 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C oder 65°C. Der Fachmann weiß, dass sich diese Hybridisierungsbedingungen abhängig von der Art der Nukleinsäure unterscheiden und, zum Beispiel wenn organische Lösemittel vorhanden sind, in Bezug auf die Temperatur und Konzentration des Puffers. Zum Beispiel variiert unter ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” die Temperatur abhängig von der Art der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässerigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 to 5 × SSC (pH 7,2). Wenn ein organisches Lösemittel in dem oben genannten Puffer vorhanden ist, zum Beispiel 50% Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben genannten Hybridisierungstemperature werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Rasenpaaren) Länge und einen G + C Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Solche hybridisierenden Expressionskontrollsequenzen sind insbesondere zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94% mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% mit den Expressionskontrollsequenzen, wie in einer von SEQ ID NO.: 7 bis 12 dargestellt, identisch. Die prozentuellen Identitätswerte werden vorzugsweise über die gesamte Nukleinsäuresequenzregion berechnet. Eine Reihe von Programmen, die auf einer Vielzahl von Algorithmen basieren, steht dem Fachmann für einen Vergleich verschiedener Sequenzen zur Verfügung. In diesem Zusammenhang liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Zur Ausführung von Sequenzausrichtungen sind das Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443–453 (1970)) und Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482–489 (1981))], die Teil des GCG Software-Pakets sind [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], zu verwenden. Die oben in Prozent (%) angegebenen Sequenzidentitätswerte sind vorzugsweise unter Verwendung des Programms GAP über die gesamte Sequenzregion mit den folgenden Einstellungen zu bestimmen: Lückengewichtung: 50, Längengewichtung: 3, durchschnittliche Übereinstimmung: 10,000 und durchschnittliche Fehlübereinstimmung: 0,000, die, falls nicht anders angegeben, immer als Standardeinstellungen für Sequenzausrichtungen verwendet werden sollen.
Ferner können Expressionskontrollsequenzen, die eine samenspezifische Expression ermöglichen, nicht nur stromaufwärts der oben genannten offenen Leserahmen mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer von SEQ ID NO. 1 bis 6 dargestellt, gefunden werden. Vielmehr können Expressionskontrollsequenzen, die eine samenspezifische Expression ermöglichen, auch stromaufwärts von orthologen, paralogen oder homologen Genen (d. h. offenen Leserahmen) gefunden werden. Somit hat auch vorzugsweise eine variante Expressionskontrollsequenz, die aus einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht, eine Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmensequenz liegt, die zu mindestens 70%, bevorzugter mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94% mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, oder mindestens 99% mit einer Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt. Der variante offene Leserahmen soll für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität des entsprechenden Polypeptids kodieren, für das der offene Leserahme kodiert, der in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist. In diesem Zusammenhang sollte erwähnt werden, dass der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, für ein Polypeptid mit Pectinesterase-Aktivität kodiert, die offenen Leserahmen, die in SEQ ID NO: 2 und 5 dargestellt sind, für ”late embryogenenis adundant” (LEA) Polypeptide kodieren, der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, für ein Polypeptid mit Anthocyanidin-Reduktase-Aktivität kodiert, der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, für ein Polypeptid mit Proteinase-Inhibitor-Aktivität kodiert, und der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, für ein Polypeptid mit Lipidtransfer-Aktivität kodiert. Diese biologischen Aktivitäten können von Fachmännern ohne weiteres bestimmt werden.
Ebenso ist vorzugsweise eine variante Expressionskontrollsequenz, die aus einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht, (i) durch 5' Genome Walking von einer offenen Leserahmensequenz erhältlich, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist, oder (ii) 5' Genome Walking von einer offenen Leserahmensequenz erhältlich, die zu mindestens 80% mit einem offenen Leserahmen identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist. Variante Expressionskontrollsequenzen sind ohne weiteres durch die Genome Walking Technologie erhältlich, die wie in den beiliegenden Beispielen beschrieben ausgeführt werden kann, z. B. unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits.
Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 110, mindestens 120 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 1 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 8 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 110, mindestens 120, mindestens 130, mindestens 140 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 2 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 9 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 110 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 3 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 10 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 4 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 11 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 150, mindestens 200, mindestens 210, mindestens 220, mindestens 230, mindestens 240 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 5 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 12 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 110, mindestens 120 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 6 angeführt sind. Insbesondere bestehen die folgenden Elemente aus allen varianten Expressionskontrollsequenzen, auf die gemäß der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird: CA-reiches Element, CCAAT-Box, G-Box Bindungsfaktor 1, RY-Wiederholungselement, Prolamin-Box, Legumin-Box, Dof-Box und RITA-Motiv. Die spezifischen Sequenzen für die Elemente sind in der Folge in den Tabellen dargestellt (fett gedruckt). Diese Elemente sind für samenspezifische Promotoren charakteristisch (Kim 2006, Mol Genet Genomics 276(4): 351–368).
Der Begriff ”samenspezifisch”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass eine Nukleinsäure von Interesse, die funktionsfähig an die hierin genannte Expressionskontrollsequenz gebunden ist, vorwiegend in Samen exprimiert wird, wenn sie in einer Pflanze vorhanden ist. Eine vorwiegende Expression im vorliegenden Sinn ist durch ein statistisch signifikant höheres Maß an detektierbarer Transkription in den Samen in Bezug auf andere Pflanzengewebe gekennzeichnet. Ein statistisch signifikantes höheres Maß an Transkription ist vorzugsweise ein Maß, das mindestens das Zweifache, Dreifache, Vierfache, Fünffache, Zehnfache, Hundertfache, Fünfhundertfache oder Tausendfache des Maßes ist, das in mindestens einem der anderen Gewebe mit detektierbarer Transkription vorgefunden wird. Als Alternative ist es eine Expression in Samen, wobei das Maß an Transkription in Nicht-Samengeweben geringer ist als 1%, 2%, 3%, 4% oder besonders bevorzugt 5% des gesamten (ganze Pflanze) Maßes an Expression. Das Maß an Transkription korreliert direkt mit der Menge an Transkripten (d. h. RNA) oder Polypeptiden, für die die Transkripte kodieren, die in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden sind. Geeignete Techniken zum Messen der Transkription, die entweder auf RNA oder Polypeptiden basieren, sind im Stand der Technik gut bekannt. Samenspezifisch, als Alternative und vorzugsweise zusätzlich zu dem Vorhergesagten, bedeutet, dass die Expression auf Samen beschränkt oder nahezu beschränkt ist, d. h. es gibt im Wesentliche keine detektierbare Transkription in anderen Geweben. Nahezu beschränkt bedeutet im vorliegenden Sinn, dass eine unspezifische Expression in weniger als zehn, weniger als fünf, weniger als vier, weniger als drei, weniger als zwei oder einem anderen Gewebe(n) detektierbar ist. Eine samenspezifische Expression, wie hierin verwendet, enthält eine Expression in Samenzellen oder deren Vorläufern, wie Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos.
Eine Expressionskontrollsequenz kann auf samenspezifische Expression durch Bestimmen des Expressionsmusters einer Nukleinsäure von Interesse, z. B. einer Nukleinsäure, die für ein Reporterprotein kodiert, wie GFP, in einer transgenen Pflanze getestet werden. Transgene Pflanzen können durch Techniken erzeugt werden, die dem Fachmann bekannt sind und anderwärtig in dieser Beschreibung besprochen werden. Die oben genannten Mengen oder Expressionsmuster werden vorzugsweise, durch Northern Blot- oder In-situ-Hybridisierungstechniken, wie in WO 02/102970 beschrieben ist, in Brassica napus-Pflanzen bestimmt, insbesondere 40 Tage nach der Blüte.
Der Begriff ”Nukleinsäure von Interesse” bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die unter der Kontrolle der hierin genannten Expressionskontrollsequenz exprimiert werden soll. Vorzugsweise kodiert eine Nukleinsäure von Interesse für ein Polypeptid, dessen Gegenwart in einer Zelle oder einem nicht-humanen Organismus erwünscht ist, wie hierin angegeben, und insbesondere in einem Pflanzensamen. Ein solches Polypeptid kann ein Enzym sein, das für die Synthese von Samenspeicherverbindungen erforderlich ist, oder kann ein Samenspeicherprotein sein. Es ist klar, dass, wenn die Nukleinsäure von Interesse für ein Polypeptid kodiert, die Transkription der Nukleinsäure in RNA und Translation der transkribierten RNA in das Polypeptid erforderlich sein könnte. Eine Nukleinsäure von Interesse enthält auch vorzugsweise biologisch aktive RNA-Moleküle und insbesondere Antisense-RNAs, Ribozyme, Mikro-RNAs oder siRNAs. Die biologisch aktiven RNA-Moleküle können zum Modifizieren der Menge eines Zielpolypeptids verwendet werden, das in einer Zelle oder in einem nicht-humanen Organismus vorhanden ist. Zum Beispiel kann eine unerwünschte enzymatische Aktivität in einem Samen aufgrund der samenspezifischen Expression von Antisense-RNAs, Ribozymen, Mikro-RNAs oder siRNAs reduziert werden. Die zugrunde liegenden biologischen Wirkungsprinzipien der oben genannten, biologisch aktiven RNA-Moleküle sind im Stand der Technik gut bekannt. Ferner ist dem Fachmann wohl bewusst, wie Nukleinsäuren zu erhalten sind, die für solche biologisch aktiven RNA-Moleküle kodieren. Es ist klar, dass die biologisch aktiven RNA-Moleküle direkt durch Transkription der Nukleinsäure von Interesse erhalten werden können, d. h. ohne Translation in ein Polypeptid. Es ist klar, dass die Expressionskontrollsequenz auch die Expression von mehr als einer Nukleinsäure von Interesse steuern kann, d. h., von mindestens einer, mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf usw. Nukleinsäuren von Interesse.
Der Begriff ”funktionsfähig gebunden”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Expressionskontrollsequenz der vorliegenden Erfindung und eine Nukleinsäure von Interesse so gebunden sind, dass die Expression durch die Expressionskontrollsequenz gesteuert werden kann, d. h., die Expressionskontrollsequenz soll funktionell an die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz gebunden sein. Daher können die Expressionskontrollsequenz und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz physisch aneinander gebunden sein, z. B. durch Einsetzen der Expressionskontrollsequenz am 5'-Ende der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. Als Alternative können die Expressionskontrollsequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure nur in physischer Nähe sein, so dass die Expressionskontrollsequenz die Expression der mindestens einen Nukleinsäuresequenz von Interesse steuern kann. Die Expressionskontrollsequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure sind vorzugsweise nicht mehr als 500 bp, 300 bp, 100 bp, 80 bp, 60 bp, 40 bp, 20 bp, 10 bp oder 5 bp getrennt.
Wie dargelegt, umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform auch eine Terminationssequenz für die Transkription stromabwärts der Nukleinsäure von Interesse. Eine Terminationssequenz für die Transkription bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die den Prozess der RNA-Transkription beendet. Geeignete Terminationssequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen vorzugsweise die SV40-poly-A-Stelle, die tk-poly-A-Stelle, den nos- oder ocs-Terminator von Agrobacterium tumefaciens oder den 35S-Terminator des Blumenkohlmosaikvirus.
Es hat sich in vorteilhafter Weise in den Studien, die der vorliegende Erfindung zugrunde liegen, gezeigt, dass die samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse durch Expression der Nukleinsäure von Interesse unter der Kontrolle einer Expressionskontrollsequenz von Brassica napus oder einer varianten Expressionskontrollsequenz, wie oben spezifiziert, erreicht werden kann. Die Expressionskontrollsequenzen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, ermöglichen eine zuverlässige und hochspezifische Expression von Nukleinsäuren von Interesse. Dank der vorliegenden Erfindung ist es möglich, (i) spezifisch biochemische Prozesse in Samen zu manipulieren, z. B. durch Expression heterologer Enzyme oder biologisch aktiver RNAs, oder (ii) heterologe Proteine in Samen zu erzeugen. Im Prinzip zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polynukleotids, des Vektors, der Wirtszelle oder des nicht-humanen, transgenen Organismus für die Expression einer Nukleinsäure von Interesse in Betracht Vorzugsweise ist die angestrebte Expression samenspezifisch. Insbesondere kodiert die Nukleinsäure von Interesse, die in den verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, für ein Samenspeicherprotein oder ist an der Modulation von Samenspeicherverbindungen beteiligt.
Wie hierin verwendet, enthalten Samenspeicherverbindungen Fettsäuren und Triacylglyceride, die zahlreiche Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie, Tiernahrung, Kosmetik und im pharmakologischen Sektor haben. Abhängig davon, ob sie freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder sonst Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren sind, sind sie für verschiedene unterschiedliche Anwendungen geeignet. Insbesondere wird das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, das die oben genannte Expressionskontrollsequenz umfasst, für die Herstellung von polyungesättigten Fettsäuren (”polyunsaturated fatty acids” – PUFAs) verwendet. Für die Herstellung von PUFAs in Samen, muss die Aktivität von Enzymen, die an deren Synthese beteiligt sind, insbesondere Elongasen und Desaturasen, moduliert werden. Dies wird durch samenspezifische Expression der Nukleinsäuren von Interesse erreicht, die für die oben genannte Enzyme kodieren, oder durch samenspezifische Expression von Antisense-, Ribozym-, RNAi-Molekülen, die die Aktivität der Enzyme abwärts regulieren, indem sie deren Proteinsynthese stören. PUFAs sind Samenspeicherverbindungen, die durch einen anschließend angewandten Reinigungsprozess unter Verwendung der oben genannten Samen isoliert werden können.
Besonders bevorzugte PUFAs gemäß der vorliegenden Erfindung sind polyungesättigte langkettige ω-3-Fettsäuren, wie Eicosapentaensäure (= EPA, C20:5^{Δ5,8,11,14,17}) ω-3 Eicostetraensäure (= ETA, C20:4^{Δ8,11,14,17)}, Arachidonsäure (= ARA C20:4^Δ5,8,11,14) oder Docosahexaensäure (= DHA, C22:6^{Δ4,7,10,13,16,19}) Sie sind wichtige Komponenten der menschlichen Ernährung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in Gesundheitsaspekten, einschließlich der Entwicklung des kindlichen Gehirns, der Funktionalität der Augen, der Synthese von Hormonen und anderer Signalsubstanzen, und der Vorbeugung bei kardiovaskulären Beschwerden, Krebs und Diabetes (Poulos, A Lipids 30: 1–14, 14Δ8,11,14,17 995; Horrocks, LA und Yeo YK Pharmacol Res 40: 211–225, 1999). Es besteht daher ein Bedarf an der Herstellung polyungesättigter langkettiger Fettsäuren.
Besonders bevorzugte Enzyme, die an der Synthese von PUFAs beteiligt sind, sind in WO 91/13972 (Δ9-Desaturase), WO 93/11245 (Δ15-Desaturase), WO 94/11516 (Δ12-Desaturase), EP A 0 550 162 , WO 94/18337 , WO 97/30582 , WO 97/21340 , WO 95/18222 , EP A 0 794 250 , Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144–20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200–203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649–659, offenbart. Δ6-Desaturasen sind in WO 93/06712 , US 5,614,393 , US 5,614,393 , WO 96/21022 , WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben und auch die Anwendung für die Herstellung in transgenen Organismen ist in WO 98/46763 , WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. Hier ist auch die Expression verschiedener Desaturasen in WO 99/64616 oder WO 98/46776 beschrieben und beansprucht, wie auch die Bildung polyungesättigter Fettsäuren. In Bezug auf die Expressionswirksamkeit von Desaturasen und ihre Wirkung auf die Bildung polyungesättigter Fettsäuren muss festgehalten werden, dass die Expression einer einzigen Desaturase, wie bisher beschrieben, nur zu geringen Gehalten an ungesättigten Fettsäuren/Lipiden geführt hat, wie zum Beispiel γ-Linolensäure und Stearidonsäure. Ferner werden für gewöhnlich Mischungen von ω-3- und ω-6-Fettsäuren erhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Begriff ”Vektor” umfasst vorzugsweise Phage-, Plasmid-, virale oder retrovirale Vektoren wie auch künstliche Chromosome, wie bakterielle oder künstliche Hefechromosome. Ferner betrifft der Begriff auch zielgerichtete Konstrukte, die eine zufällige oder ortsgerichtete Integration des zielgerichteten Konstrukts in genomische DNA ermöglichen. Solche Zielkonstrukte umfassen vorzugsweise DNA ausreichender Länge für entweder homologe oder heterologe Rekombination, wie ausführlich in der Folge beschrieben. Der Vektor, der die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfasst, umfasst vorzugsweise des Weiteren selektierbare Marker zur Vermehrung und/oder Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann in eine Wirtszelle durch verschiedene Techniken eingearbeitet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Bei Einführung in eine Wirtszelle kann der Vektor im Zytoplasma liegen oder kann in das Genom eingearbeitet werden. Im letztgenannten Fall ist klar, dass der Vektor des Weiteren Nukleinsäuresequenzen umfassen kann, die eine homologe Rekombination oder heterologe Insertion ermöglichen. Vektoren können in prokaryotische oder eukaryotische Zellen durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, sollen mehrere Verfahren nach dem Stand der Technik zum Einführen fremder Nukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Kalziumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Kalziumchlorid-Co-Präzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürlicher Kompetenz, auf Kohlenstoff basierender Cluster, chemisch vermittelten Transfers, Elektroporation oder Partikelbombardement (z. B. ”gene-gun”). Geeignete Verfahren für die Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, finden sich in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Als Alternative kann ein Plasmidvektor durch Wärmeschock- oder Elektroporationstechniken eingeführt werden. Sollte der Vektor ein Virus sein, kann er in vitro unter Verwendung einer geeigneten Verpackungszelllinie vor der Anwendung an Wirtszellen verpackt werden. Retrovirale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Im letztgenannten Fall erfolgt die virale Vermehrung im Allgemeinen nur in komplementierenden Wirt/Zellen.
Vorzugsweise ist der hierin genannte Vektor als Klonierungsvektor geeignet, d. h. in microbiellen Systemen replizierbar. Solche Vektoren garantieren ein effizientes Klonen in Bakterien und vorzugsweise Hefen oder Pilzen, und ermöglichen die stabile Transformation von Pflanzen. Jene, die zu erwähnen sind, sind insbesondere verschiedene binäre und co-integrierte Vektorsysteme, die für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, sowie die Sequenzen, die die T-DNA begrenzen (T-DNA-Grenze). Diese Vektorsysteme umfassen vorzugsweise auch weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit welchen geeignete transformierte Wirtszellen oder Organismen identifiziert werden können. Während co-integrierte Vektorsysteme vir-Gene und T-DNA-Sequenzen aufweisen, die auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf mindestens zwei Vektoren, von welchen einer vir-Gene, aber keine T-DNA trägt, während einer zweiter T-DNA, aber kein vir-Gen trägt. Infolgedessen sind die zuletzt erwähnten Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und können sowohl in E. coli wie auch in Agrobacterium replizieren. Diese binären Vektoren enthalten Vektoren der pBIB-HYG-, pPZP-, pBecks-, pGreen-Serie. Vorzugsweise werden gemäß der Erfindung Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA verwendet. Ein Überblick über binäre Vektoren und deren Verwendung findet sich in Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451. Ferner kann durch Verwendung geeigneter Klonierungsvektoren das Polynukleotid der Erfindung in Wirtszellen oder Organismen wie Pflanzen oder Tiere eingeführt werden und somit in der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie jenen, die in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225, veröffentlicht und zitiert sind.
Insbesondere ist der Vektor der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor. In einem solchen Expressionsvektor umfasst das Polynukleotid eine Expressionskassette, wie oben spezifiziert, die eine Expression in eukaryotischen Zellen oder davon isolierten Fraktionen ermöglicht. Ein Expressionsvektor kann zusätzlich zu dem Polynukleotid der Erfindung auch weitere regulatorische Elemente umfassen, einschließlich transkriptionaler wie auch translationaler Enhancer. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor auch ein Gentransfer- oder Targetingvektor. Expressionsvektoren, die von Viren abgeleitet werden, wie Retroviren, Vacciniavirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesviren oder Rinderpapillomavirus, können zur Abgabe der Polynukleotide oder des Vektors der Erfindung in eine angepeilte Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können zur Konstruktion rekombinanter viraler Vektoren verwendet werden; siehe zum Beispiel die Techniken, die in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994) beschrieben sind.
Geeignete Expressionsvektorrückgrate werden vorzugsweise von Expressionsvektoren abgeleitet, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Okayama-Berg cDNA Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene) oder pSPORT1 (GIBCO BRL). Weitere Beispiele für typische Fusionsexpressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), wo Glutathion S-Transferase (GST), Maltose E-Bindungsprotein beziehungsweise Protein A mit der Nukleinsäure von Interesse fusioniert sind, die für ein zu exprimierendes Protein kodiert. Die Target-Genexpression des pTrc-Vektors basiert auf der Transkription eines hybriden trp-lac Fusionpromotors durch Wirt-RNA-Polymerase. Die Target-Genexpression des pET-11d-Vektors basiert auf der Transkription eines T7-gn10-lac Fusionspromotors, die durch eine co-exprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch die Wirtstämme BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophage, der ein T7 gn1 Gen beherbergt, unter der transkriptionalen Kontrolle des lacUV 5 Promotors bereitgestellt. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasec1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Prozesse für die Konstruktion von Vektoren, die zur Verwendung in anderen Pilzen geeignet sind, wie den Fadenpilzen, umfassen jene, die ausführlich beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene tansfer systems and vector development for filamentous fungi", in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennett & L.L. Lasure, Hrg., S. 396–428: Academic Press: San Diego). Weitere geeignete Hefevektoren sind zum Beispiel pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBKLYe23. Als Alternative können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung auch in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9 Zellen) erhältlich sind, umfassen die pAc-Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serie (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können zur Expression einer Nukleinsäure von Interesse in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3): 239–251 und die darin zitierten Referenzen, und Pflanzenzellen höherer Pflanzen (zum Beispiel Spermatophyten, wie Ackerfrüchte) unter Verwendung von pflanzlichen Expressionsvektoren verwendet werden. Beispiele für pflanzliche Expressionsvektoren umfassen jene, die ausführlich beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38. Eine pflanzliche Expressionskassette umfasst vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die imstande sind, die Genexpression in Pflanzenzellen zu kontrollieren, und die funktionell so gebunden sind, dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, wie transkriptionale Termination, zum Beispiel Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind jene, die von Agrobacterium tumefaciens T-DNA abgeleitet sind, wie das Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5, das als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 und folgende) oder funktionelle Äquivalente von diesen, aber alle anderen Terminatoren, die funktionell in Pflanzen aktiv sind, sind auch geeignet. Da eine pflanzliche Genexpression sehr häufig nicht auf transkriptionale Ebenen beschränkt ist, umfasst eine pflanzliche Expressionskassette vorzugsweise andere funktionell gebundene Sequenzen, wie Translations-Enhancer, zum Beispiel die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Tabakmosaikvirus-Leadersequenz enthält, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in der funktionellen Bindung in pflanzlichen Genexpressionskassetten sind zielgerichtete Sequenzen, die zum Targeting des Genprodukts in sein relevantes Zellenkompartiment erforderlich sind (für einen Überblick, siehe Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und die darin zitierten Referenzen), zum Beispiel in die Vakuole, den Nukleus, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisome und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Die oben genannten Vektoren sind nur ein kleiner Überblick über Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind. Weitere Vektoren sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in: Cloning Vectors (Hrg., Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) beschrieben. Für weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe die Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Die vorliegende Erfindung zieht auch eine Wirtszelle in Betracht, die das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Wirtszellen sind Primärzellen oder Zelllinien, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind, wie Pflanzen oder Tieren. Ferner umfassen Wirtszellen prokaryotische oder eukaryotische einzellige Organismen (auch als Mikroorganismen bezeichnet). Primärzellen oder Zelllinien, die als Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von den in der Folge genannten multizellulären Organismen abgeleitet werden. Wirtszellen, die genutzt werden können, sind des Weiteren erwähnt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Spezifische Expressionsstämme, die verwendet werden können, zum Beispiel jene mit einer geringeren Protease-Aktivität, sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119–128. Diese umfassen Pflanzenzellen und gewisse Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in allen ihren phänotypischen Formen, wie Staubbeutel, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Keimblätter, Blattstiele, geerntetes Material, Pflanzengewebe, Reproduktionsgewebe und Zellkulturen, die von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet werden und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Vorzugsweise können die Wirtszellen von Pflanzen erhalten werden. Insbesondere werden Ölpflanzen in Betracht gezogen, die große Mengen an Lipidverbindungen umfassen, wie Ölraps, Nachtkerze, Hanf, Distel, Erdnuss, Raps, Leinsamen, Sojabohne, Saflor, Sonnenblume, Borretsch oder Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniokstrauch, Pfeffer, Tagetes, Solanaceae-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Luzerne, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss) und winterharte Gräser und Futterpflanzen. Besonders bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölpflanzen, wie Sojabohne, Erdnuss Ölraps, Raps, Leinsamen, Hanf, Nachtkerze, Sonnenblume, Saflor, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Geeignete Verfahren zur Erhalten von Wirtszellen von den in der Folge genannten multizellulären Organismen wie auch Kultivierungsbedingungen für diese Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die Mikroorganismen sind vorzugsweise Bakterien oder Pilze, einschließlich Hefen. Bevorzugte Pilze, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind ausgewählt aus der Gruppe der Familien Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae oder Tuberculariaceae. Weitere bevorzugte Mikroorganismen sind ausgewählt aus der Gruppe: Choanephoraceae, wie die Gattungen Blakeslea, Choanephora, zum Beispiel Gattungen und Spezies Blakeslea trispora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae, wie Genus Mortierella, zum Beispiel Gattungen und Spezies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae, wie die Gattungen Phytium, Phytophthora, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae, wie die Gattungen Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenula henricii, Hansenula holstii, Hansenula minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenula polymorpha, Hansenula saturnus, Hansenula subpelliculosa, Hansenula wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiosa, Pichia ciferrii, Pichia farinosa, Pichia fermentans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegens/s, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomycetaceae, wie die Gattungen Schizosaccharomyces, z. B. die Spezies Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae, wie die Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, z. B. die Spezies Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum oder Thraustochytrium visurgense. Weitere bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Familien Bacillaceae, Enterobacteriacae oder Rhizobiaceae. Beispiele für solche Mikroorganismen können ausgewählt werden aus der Gruppe: Bacillaceae, wie die Gattungen Bacillus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis oder Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae, wie die Gattungen Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella oder Serratia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Citrobacter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Erwinia carnegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subsp. odorifera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia persicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia coli-mutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp., Escherichia vulneris, Klebsiella aeroGenen, Klebsiella edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klebsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella trevisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis subsp. bongori, Salmonella choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae, Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella choleraesuis subsp. salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subsp. houtenae, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp. quinovora, Serratia quinivorans oder Serratia rubidaea; Rhizobiaceae, wie die Gattungen Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizoGenen, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Carbophilus carboxidus, Chelatobacter heintzii, Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium ciceri Rhizobium etli, Rhizobium fredii Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuii, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizoGenen, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli oder Sinorhizobium xinjiangense.
Wie die oben genannten Mikroorganismen zu kultivieren sind, ist dem Fachmann gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen nicht-humanen transgenen Organismus, vorzugsweise eine Pflanze oder einen Samen davon, umfassend das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff ”nicht-humaner transgener Organismus” betrifft vorzugsweise eine Pflanze, einen Pflanzensamen, einen nicht-humanen tierischen oder einen multizellulären Mikroorganismus. Das Polynukleotid oder der Vektor können im Zytoplasma des Organismus vorhanden sein oder können in das Genom entweder heterolog oder durch homologe Rekombination eingegliedert werden. Wirtszellen, insbesondere jene, die von Pflanzen oder Tieren erhalten werden, können in einen sich entwickelnden Embryo eingeführt werden, um Mosaik- oder chimäre Organismen zu erhalten, d. h., nicht-humane transgene Organismen, die die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung umfassen. Geeignete transgene Organismen sind vorzugsweise alle Organismen, die für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind.
Bevorzugte Pflanzen, die zur Herstellung nicht-humaner transgener Organismen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind alle Dicotyledon- oder Monocotyledon-Pflanzen, Algen oder Moose. Vorteilhafte Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Prasinophyceae oder Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen wie Tagetes. Beispiele, die erwähnt werden können, sind die folgenden Pflanzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Adelotheciaceae, wie die Gattungen Physcomitrella, wie die Gattungen und Spezies Physcomitrella patens, Anacardiaceae, wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Kaschu], Asteraceae, wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, zum Beispiel die Gattung und Spezies Calendula officinalis [gemeine Ringelblume], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Chicoree], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Feldsalat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [afrikanische oder französische Ringelblume], Apiaceae, wie die Gattung Daucus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Daucus carota [Karotte], Betulaceae, wie die Gattung Corylus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss], Boraginaceae, wie die Gattung Borago, zum Beispiel die Gattung und Spezies Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae, wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterkohl] oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas), zum Beispiel die Gattungen und Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas], Caricaceae, wie die Gattung Carica, wie die Gattung und Spezies Carica papaya [Papaya], Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, die Gattung und Spezies Cannabis sativa [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Batate], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, wie die Gattungen und Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae, wie die Gattung Crypthecodinium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, wie die Gattung Cucurbita, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis/Speisekürbis], Cymbellaceae, wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, zum Beispiel die Gattung und Spezies Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon, purpureus spp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae, wie die Gattung Elaeagnus, wie die Gattung und Spezies Olea europaea [Olive], Ericaceae, wie die Gattung Kalmia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euphorbiaceae, wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok] oder Ricinus communis [Rizinus], Fabaceae, wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Aibizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Luzerne], Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae, wie die Gattungen Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae, wie die Gattungen Pelargonium, Kokos, Oleum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss], Gramineae, wie die Gattung Saccharum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Saccharum officinarum, Juglandaceae, wie die Gattungen Juglans, Wallis, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallis cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallis nigra [Walnuss], Lauraceae, wie die Gattungen Persea, Laurus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima oder Persea Persea [Avocado], Leguminosae, wie die Gattung Arachis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss], Linaceae, wie die Gattungen Linum, Adenolinum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Leinsamen], Lythrarieae, wie die Gattung Punica, zum Beispiel die Gattung und Spezies Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae, wie die Gattung Gossypium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle], Marchantiaceae, wie die Gattung Marchantia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, wie die Gattung Musa, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane], Onagraceae, wie die Gattungen Camissonia, Oenothera, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Nachtkerze], Palmae, wie die Gattung Elacis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme], Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn], Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Sesamum indicum [Sesam], Piperaceae, wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [Cayennepfeffer], Poaceae, wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen], Porphyridiaceae, wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Porphyridium cruentum, Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae, wie die Gattungen Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui Tetraselris suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, wie die Gattung Cofea, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phloroides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze], Solanaceae, wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicur frutescens [Pfeffer], Capsicur annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine], Lycopensicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopensicuum [Tomate], Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, zum Beispiel die Gattung und Spezies Theobroma cacao [Kakao] oder Theaceae, wie die Gattung Camellia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Camellia sinensis [Tee]. Insbesondere sind bevorzugte Pflanzen, die als transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Ölfrüchte, die große Mengen an Lipidverbindungen umfassen, wie Erdnuss, Ölraps, Raps, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Sesam, Ringelblume, Granatapfel, Nachtkerze, Königskerze, Distel, wilde Rosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis/Speisekürbis, Leinsamen, Sojabohne, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss) oder Nutzpflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniokstrauch, Pfeffer, Tagetes, Solanaceae-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Luzerne oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies und winterharte Gräser und Futterpflanzen. Bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölpflanzen, wie Erdnuss, Ölraps, Raps, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Ringelblume, Granatapfel, Nachtkerze, Kürbis/Speisekürbis, Leinsamen, Sojabohne, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss). Besonders bevorzugt sind Pflanzen, die reich an C18:2- und/oder C18:3-Fettsäuren sind, wie Sonnenblume, Saflor, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis/Speisekürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen, Hanf, Distel oder Saflor. Ganz besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen wie Saflor, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen oder Hanf.
Bevorzugte Moose sind Physcomitrella oder Ceratodon. Bevorzugte Algen sind Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium und Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium. Bevorzugter sind die Algen und Moose ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Cryphthecodinium, insbesondere von den Gattungen und Spezies Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricornutum oder Caenorhabditis elegans oder besonders bevorzugt Phytophtora infestans, Thallasiosira pseudonona und Cryptocodinium cohnii.
Transgene Pflanzen können durch Transformationstechniken erhalten werden, wie in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225, veröffentlicht und zitiert. Vorzugsweise können transgene Pflanzen durch T-DNA-vermittelte Transformation erhalten werden. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, und die Sequenzen, die die T-DNA abgrenzen (T-DNA Grenze). Geeignete Vektoren sind anderwärtig in der Beschreibung ausführlich beschrieben.
Vorzugsweise bezieht sich ein multizellulärer Mikroorganismus, wie hierin verwendet, auf Protisten oder Diatomeen. Insbesondere ist es ausgewählt aus der Gruppe der Familien Dinophyceae, Turaniellidae oder Oxytrichidae, wie die Gattungen und Spezies: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricornutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum oder Colpidium sp.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Expression einer Nukleinsäure von Interesse in einer Wirtszelle, umfassend

(a) Einführen des Polynukleotids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in die Wirtszelle, wodurch die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und
(b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in der Wirtszelle.

Das Polynukleotid oder der Vektor der vorliegenden Erfindung können durch geeignete Transfektions- oder Transformationstechniken in die Wirtszelle eingeführt werden, wie anderwärtig in dieser Beschreibung spezifiziert ist. Die Nukleinsäure von Interesse wird unter geeigneten Bedingungen in der Wirtszelle exprimiert. Zu diesem Zweck wird die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die im Prinzip eine Transkription von Nukleinsäuren ermöglichen. Ferner umfasst die Wirtszelle vorzugsweise die exogen zugeführte oder endogen vorhandene Transkriptionsmaschinerie, die für eine Expression einer Nukleinsäure von Interesse durch die Expressionskontrollsequenz erforderlich ist. Insbesondere ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle und ganz besonders eine Samenzelle oder ein Vorläufer davon.
Ferner umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Expression einer Nukleinsäure von Interesse in einem nicht-humanen Organismus, umfassend

(a) Einführen des Polynukleotids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in den nicht-humanen Organismus, wobei die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und
(b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in dem nicht-humanen transgenen Organismus.

Das Polynukleotid oder der Vektor der vorliegenden Erfindung können durch geeignete Techniken in den nicht-humanen transgenen Organismus eingeführt werden, wie anderwärtig in dieser Beschreibung spezifiziert. Der nicht-humane, transgene Organismus umfasst vorzugsweise die exogen zugeführte oder endogen vorhandene Transkriptionsmaschinerie, die zur Expression einer Nukleinsäure von Interesse durch die Expressionskontrollsequenz erforderlich ist. Bevorzugter ist der nicht-humane transgene Organismus eine Pflanze oder ein Samen davon. Es ist klar, dass die Nukleinsäure von Interesse vorzugsweise samenspezifisch in dem nicht-humanen, transgenen Organismus exprimiert wird.
In den folgenden Tabellen 1 bis 6 sind die cis-regulatorischen Elemente, die in den Expressionskontrollsequenzen der vorliegenden Erfindung vorgefunden werden, dargestellt.
Alle in dieser Patentschrift zitierten Referenzen werden hiermit hinsichtlich ihres gesamten Offenbarungsinhalts und des Offenbarungsinhalts, der insbesondere in dieser Beschreibung erwähnt ist, durch Bezugnahme inkorporiert.
Die Figuren zeigen:
1: Gaschromatogramm einer transgenen Linie, die mit dem binären Vektor pSUN-BN3 transformiert ist.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die den Umfang dieser Anmeldung in keiner Weise einschränken sollen.
Beispiel 1: Allgemeine Klonierungsmethoden
Allgemeine Klonierungsmethoden, die den enzymatischen Verdau durch Restriktionsenzyme, Agarose Gel-Elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose auf Nylonmembranen, Ligation von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Bakterien, wie auch Kultur von Bakterien und Sequenzanalyse von rekombinanter DNA enthalten, wurden wie in Sambrook et al. (1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6) beschrieben ausgeführt.
Beispiel 2: Klonieren von Promotorelementen von Brassica napus

Für die Analyse möglicher samenspezifischer exprimierter Gene in Brassica napus, wurden drei verschiedene Samenstufen untersucht. Zu diesem Zweck wurden Brassica napus cv. Westar Pflanzen unter Standardbedingungen gezüchtet (Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports 8: 238–242). Die Samen wurden 20 Tage, 25 Tage und 40 Tage nach der Blüte geerntet. Die Samen wurden für die Herstellung von RNA (RNAeasy, Qiagen) nach dem Handbuch des Herstellers verwendet. Parallel wurde pflanzliches Material von Wurzeln, Blättern und Stängeln für die Herstellung von RNA verwendet. Die RNA wurde gemischt und als Kontrolle für die weiteren Experimente verwendet. RNA von den Samenstufen wie auch Kontroll-RNA wurden mit dem einfärbigen Genexpressions-Kit (Agilent) für Mikroarray-Analysen behandelt. Der Arapidopsis Whole Genome Chip (Agilent) wurde mit der behandelten RNA hybridisiert. Basierend auf verschiedenen markierten RNAs konnten die Gene von Brassica napus identifiziert werden, die nur in den Samen, aber nicht in anderen Organen oder Geweben exprimiert werden. Sechs Gene von Arabidopsis thaliana wurden identifiziert, die mit den Sonden von Brassica napus hybridisieren (Tabelle 7). Tabelle 7: Arabidopsis-Gene, die zur Hybridisierung der samenspezifischen Sonden von Brassica napus imstande waren:

Arabidopsis-Sequenz	Proteinfunktion	Expressionsmuster
At1g23200	Pectinesterase	Samen
At1g52690	LEA-Gen	Samen
At1g61720	Athocyanidin-Reduktase	Samen
At2g38900	Proteinase-Inhibitor	Samen
At3g15670	LEA Gen	Samen
At5g38170	Lipidtransferprotein	Samen

Basierend auf den Gensequenzen von Arabidopsis thaliana wurden Homologe in Brassica napus cDNA-Bibliotheken identifiziert. Für alle sechs Arabidopsis Gene konnten homologe Kodierungssequenzen in Brassica napus identifiziert werden (Tabelle 8). Tabelle 8: Homologiesequenz von Brassica napus entsprechend der Arabidopsis-Sequenz, die in Tabelle 7 dargestellt ist.

Brassica napus-Sequenz	SEQ ID NO:	Arabidopsis-Homologie	Proteinfunktion
BN1	1	At1g23200	Pectinesterase
BN2	2	At1g52690	LEA-Gen
BN3	3	At1g61720	Anthocyanidin-Reduktase
BN4	4	At2g38900	Proteinase-Inhibitor
BN6	5	At3g15670	LEA-Gen
BN8	6	At5g38170	Lipidtransferprotein

Aus Blattmaterial von Brassica napus cv. Westar, wurde genomische DNA unter Verwendung des DNAeasy Kits (Qiagen) nach dem Handbuch des Herstellers isoliert. Die Kulturbedingungen für Brassica napus cv. Westar waren wie oben besprochen. Basierend auf der genomischen DNA wurde eine genomische DNA-Bibliothek unter Verwendung des Genome Walker Kits (Clontech) erstellt. Die folgenden Primer-Sequenzen wurden von Brassica napus cDNA-Sequenzen abgeleitet, um stromaufwärts liegende Sequenzen der genomischen Brassica napus-Sequenzen zu isolieren (Tabelle 9). Tabelle 9: Primer-Sequenzen für die Implizierung von 5' stromaufwärts liegenden Sequenzen in Kombination mit AP1/AP2 (Clontech).
Die angegebenen Primer wurden in Kombination mit den AP1- und AP2-Primern nach dem Handbuch des Herstellers des Genome Walker Kits in einer PCR verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:

Primäre PCR:
7 Zyklen 94°C, 25 Sekunden, 72°C, 4 Minuten,
32 Zyklen 94°C, 25 Sekunden 67°C; 4 Minuten,
letzter Zyklus 67°C, 4 Minuten,

Sekundäre PCR
5 Zyklen 94°C, 25 Sekunden, 72°C; 4 Minuten,
22 Zyklen 94°C, 25 Sekunden, 67°C, 4 Minuten,
letzter Zyklus 67°C, 4 Minuten,
Unter Verwendung der vorherigen spezifischen Primer wurden spezifische Fragmente für die Primerkombinationen erhalten. Diese Fragmente wurden in den pGEM-T (Pomega) Vektor unter Verwendung des Handbuchs des Herstellers geklont und durch Standardtechniken (Laser-Fluoreszenz-DNA-Sequenzierung, ABI nach dem Verfahren von Sanger et al., 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467) sequenziert. Die folgenden Brassica napus-Sequenzen wurden erhalten (Tabelle 10). Tabelle 10: Genomische 5' stromaufwärtis liegende Sequenzen von den Brassica napus cDNA Sequenzen.

Brassica napus-Sequenz Genomische 5' Sequenz in bp SEQ ID NO:

BN1 1336 7

BN2 1532 8

BN3 1612 9

BN4 1767 10

BN6 2281 11

BN8 1490 12
Die Analyse der 5' stromaufwärts liegenden Sequenzen unter Verwendung der Genomatix Software GemsLauncher zeigte, dass die Sequenzen Promotorelemente umfassten. Dies wurde durch das Vorhandensein einer TATA-Box bestätigt, die für die Transkription durch RNA-Polymerasen erforderlich ist. Ebenso wurden in den isolierten Fragmenten Elemente gefunden, die für Samen-Transkriptionsfaktoren (z. B. Prolamin-Box, Legumin-Box, RITA usw.) spezifisch sind.
Beispiel 3: Produktion von Testkonstrukten für den Nachweis einer Promotoraktivität
Zum Testen der Promotorelemente wurden in einem ersten Schritt Promotor-Terminatorkassetten erzeugt. Zu diesem Zweck wurden Fusions-PCRs verwendet, in welchen über zwei PCR-Stufen ein CaMV35S-Terminator mit Promotorelementen verbunden wurde. In einem weiteren Schritt wurde eine mehrfache Klonierungsstelle zwischen den Promotor- und Terminatorelementen eingeführt. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 11 angeführt. Tabelle 11: Primerpaare, die für die Erzeugung von Promoter-Terminator Kassetten durch Fusion-PCR verwendet werden.
Die Promotor-Terminatorkassetten wurden in pGEMT (Promega Vektor) nach dem Handbuch des Herstellers geklont und anschließend sequenziert. Über die Restriktionsstelle Sbf1-EcoRV (New England Biolabs) wurden Kassetten nach Standardtechniken in den Vektor pENTRB (Invitrogen) übertragen. In einem weiteren Schritt wurde das Delta 6 Desaturase Gen (SEQ ID NO: 13) über die Nco1-Pac1 Restriktionsstellen in die erzeugten pENTRB Vektoren pENTRB-p-BN1_t-35S, pENTRB-p-BN2_t-35S, pENTRB-p-BN3_t-35S, pENTRB-p-BN4_t-35S, pENTRB-p-BN6_t-35S, pENTRB-p-BN8_t-35S eingeführt.
Die erhaltenen Vektoren wurden anschließend für Gateway (Invitrogen) Reaktionen, gemeinsam mit dem binären Plasmid pSUN verwendet, um binäre Vektoren für die Erzeugung transgener Pflanzen zu erzeugen. Die Promotoraktivität in den transgenen Pflanzensamen wurde auf der Basis der Expression von Delta 6 Desaturase und einer beobachteten Modifizierung in dem Lipidmuster der Samen gemessen.
Beispiel 4: Produktion von transgenen Pflanzen

a) Erzeugung von transgenen Rapspflanzen (geändertes Protokoll nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238–242)

Für die Erzeugung transgener Rapspflanzen wurden die binären Vektoren in Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 transformiert (Deblaere et al., 1984, Nucl. Acids Res. 13: 4777–4788). Für die Transformation von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Norddeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Deutschland) wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernacht-Kultur positiver transformierter Acrobacteria-Kolonien, gezüchtet in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant, 15, 473), ergänzt durch 3% Saccharose (3MS-Medium), verwendet. Blattstiele oder Hypocotyledone sterialer Rapspflanzen wurden in einer Petri-Schale mit einer 1:50 acrobacteriellen Verdünnung 5–10 Minuten inkubiert. Darauf folgte eine dreitägige Co-Inkubation im Dunkeln bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Nach drei Tagen wurde die Kultur wöchentlich 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit auf MS-Medium ausgesetzt, das 500 mg/l Claforan (Cefotaxim-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1,6 g/l Glucose enthielt. Wachsende Sprossen wurden auf MS-Medium übertragen, das 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar enthielt. Selbst nach drei Wochen wurde keine Wurzelbildung beobachtet, ein Wachstumshormon, 2-Indolbuttersäure, wurde dem Medium zur Verstärkung der Wurzelbildung zugegeben.
Regenerierte Sprossen wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten und zum Sprießen ins Glashaus gebracht. Nach der Blüte wurden die reifen Samen geerntet und auf Expression des Desaturase Gens durch Lipidanalyse analysiert, wie in Qui et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561–31566, beschrieben ist.

b) Produktion transgener Flachspflanzen

Die Produktion transgener Flachspflanzen kann gemäß dem Verfahren von Bell et al., 1999, In Vitro Cell, Dev. Biol. Plant 35(6): 456–465 unter Verwendung von Partikelbombardement ausgeführt werden. Acrobacterielle Transformation könnte nach Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282–285, ausgeführt werden.

c) Produktion transgener Arabidopsis-Pflanzen

Transgene Arabidopsis-Pflanzen wurden nach dem Protokoll von Bechthold et al., 1993 (Bechthold, N., Ellis, J., Pelletier, G, (1993) In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of Arabidopsis thaliana plants, C.R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie., 316, 1194–1199) erzeugt. Arabidopsis-Pflanzen des Ecotyps Col0fae1 wurden nach einer Vernalisation der Samen über 3 Tage bei 4°C auf Erde gezüchtet. Nachdem die Pflanzen zu blühen begonnen hatten, wurden sie in eine Agrobacterium tumefadens Lösung getaucht, die Agrobacterium Stamm pMP90, transformiert mit den binären Plasmiden, wie in Beispiel 3 beschrieben, und folgende andere Komponenten enthielt: ½ MS pH 5,7, 5% (w/v) Sacharose, 4,4 μM Benzylaminopurin, 0,03% Silwet L-77 (Lehle Seeds, Round Rock, TX, USA). Die Agrobacterium-Lösung wurde auf eine Endkonzentration von OD₅₄₆ 0,8 verdünnt. Die Pflanzen wurden zweimal in die oben beschriebene Lösung getaucht und 4–6 Wochen für ein normales Wachstum und Samenbildung gehalten. Getrocknete Samen wurden geerntet und einem selektiven Wachstum unterzogen, basierend auf der Toleranz gegen das Herbizid Pursuit (BASF). Samen dieser Generation selektierter Pflanzen wurden dann einer Lipidanalyse unterzogen.
Beispiel 5: Lipidextraktion
Lipide können wie in der Standardliteratur beschrieben extrahiert werden, einschließlich Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S, 89–90 und S. 443–613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry und Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery und purification", S, 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley und Sons; Kennedy, J.F., und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley und Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation und purification techniques in Biotechnologie, Noyes Publications.
Als Alternative wird eine Extraktion ausgeführt wie in Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(22): 12935–12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141–145 beschrieben. Quantitative und qualitative Analysen von Lipiden oder Fettsäuren sind beschrieben in Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Schottland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids, A Practical Guide – Ayr, Schottland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)–16 (1977) u. d. T.: Progress in the Chemistry of Fats und Other Lipids CODEN.
Basierend auf den analysierten Lipiden wurde die Expression der Desaturase bestimmt, da das Lipidmuster erfolgreich transformierter Pflanzensamen sich von dem Muster von Kontrollpflanzensamen unterschied.
Analyse von Promoter BN3:
Samen von verschiedenen Arabidopsis-Pflanzen, die die T-DNA des binären Vektors pSUN-BN3 enthielten (siehe Beispiel 3), wurden wie oben beschrieben einer Lipidanalyse unterzogen (Tab. 12 und 1). Verglichen mit den nicht-transgenen Kontrollpflanzen (WT), erzeugten Pflanzen, die pSUN-BN3 enthielten, zusätzlich zu den Fettsäuren, die in den Kontrollpflanzen vorgefunden werden, eine neuartige Fettsäure, γ-Linolensäure (18:3Δ6,9,12). Die Synthese dieser neuartigen Fettsäure unterliegt dem Enzym Δ6-Desaturase, wobei dieses Gen hinter dem BN3-Promotor liegt. Die Tatsache, dass die neuartige Fettsäure in signifikanten Mengen in den Samen von Arabidopsis Pflanzen detektiert werden kann, die die T-DNA des binären Vektors pSUN-BN3 enthalten, wird durch die die funktionelle Expression des Gens Δ6-Desaturase von Pythium irregulare erklärt. Gemäß der Identifikation der neuartigen erzeugten Fettsäure γ-Linolensäure ermöglicht der Promotor BN3 die funktionelle Expression des jeweiligen Gens. Daher ist der Promotor BN3 ein funktioneller Promotor, der die Expression von Genen in Samen steuert.

Andere Teile der transgenen Arabidopsis Pflanzen wurden auch gaschromatographischen Analysen unterzogen, aber es wurden keine anderen Fettsäuren als in den nicht-transgenen Arabidopsis Pflanzen beobachtet. Daher steuert der Promotor BN3 die funktionelle Expression in samenspezifischer Weise, wodurch nur die Transkription anhaftender Gene in Samen ermöglicht wird. Tabelle 12: Gaschromatographische Analysen von Samen von verschiedenen Arabidopsis-Pflanzen, die entweder nicht-transgene Kontrollen (WT) oder transgene Linien sind, die die T-DNA von Plasmid pSUN-BN3 enthalten, abgeleitet von Chromatogrammen, wie in Fig. 1 dargestellt. Die jeweiligen Fettsäuren sind in chemischer Nomenklatur angegeben (16:0 Palmitinsäure, 18:0 Stearinsäure, 18:1-n-9 Oleinsäure, 18:2n-6 Linolsäure, 18:3n-6 γ-Linolensäure, 18:3n-3 α-Linolensäure). Die Fettsäure 18:3n-6 ist ein Produkt der enzymatischen Reaktion der Δ6-Desaturase von Pyhtium irregulare, die in den nicht-transgenen Kontrolllinien nicht beobachet wird.

Probenname	16:0	18:0	18:1 n-9	18:2n-6	18:3n-6	18:3n-3
WT
WT	13,03	3,68	27,65	35,37	0,00	20,27
WT	14,04	3,51	25,16	42,81	0,00	14,49
WT	9,63	2,66	36,85	35,07	0,00	15,80
WT	10,16	2,80	37,84	35,35	0,00	13,86
WT	8,94	3,02	31,66	36,93	0,00	19,44
WT	9,52	2,93	29,74	37,15	0,00	20,66
pSUN-BN3_1	13,19	2,82	35,20	25,31	12,20	11,28
pSUN-BN3_2	14,23	5,25	44,38	14,58	14,57	7,00
pSUN-BN3_3	13,27	3,45	46,13	18,62	9,86	8,67
pSUN-BN3_4	11,76	2,08	43,63	29,17	3,97	9,39
pSUN-BN3_5	12,26	1,76	42,01	25,92	8,12,	9,94
pSUN-BN3_6	10,25	3,22	35,82	26,64	10,43	13,65
pSUN-BN3_7	10,65	3,78	34,04	23,74	14,62	13,17

Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfahren, die eine gewebespezifische und insbesondere samenspezifische Expression von Genen ermöglichen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Polynukleotid, das eine Expressionskontrollsequenz umfasst, die eine samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist. Ferner zieht die vorliegende Erfindung Vektoren, Wirtszellen, nicht-humane transgene Organismen in Betracht, die das oben genannte Polynukleotid umfassen, wie auch Verfahren und Verwendungen eines solchen Polynukleotids.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Polynukleotid, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, die eine samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz wie in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt; (b) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO: 7 bis 12 dargestellt; (c) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt ist; (d) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die mindestens zu 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt; (e) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking von einer offenen Leserahmen-Sequenz, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt, erhältlich ist; und (f) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking von einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, die mindestens zu 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 1 bis 6 dargestellt.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die Expressionskontrollsequenz mindestens 1.000 Nukleotide umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid des Weiteren eine Nukleinsäure von Interesse umfasst, die funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden ist.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynukleotid des Weiteren eine Terminationssequenz umfasst, die eine Beendigung der Transkription einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht.
Vektor, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Vektor nach Anspruch 5, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
Wirtszelle, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor nach Anspruch 5 oder 6.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Nicht-humaner transgener Organismus, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor nach Anspruch 5 oder 6.
Nicht-humaner transgener Organismus nach Anspruch 9, wobei der Organismus eine Pflanze oder ein Samen davon ist.
Verfahren zum Exprimieren einer Nukleinsäure von Interesse in einer Wirtszelle, umfassend (a) Einführen des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors nach Anspruch 5 oder 6 in die Wirtszelle, wobei die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und (b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in der Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren zum Exprimieren einer Nukleinsäure von Interesse in einem nicht-humanen Organismus, umfassend (a) Einführen des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors nach Anspruch 5 oder 6 in den nicht-humanen Organismus, wobei die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und (b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in dem nicht-humanen transgenen Organismus.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der nicht-humane transgene Organismus eine Pflanze oder ein Samen davon ist.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Nukleinsäure von Interesse samenspezifisch exprimiert wird.
Verwendung des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, des Vektors nach Anspruch 5 oder 6, der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8 oder des nicht-humanen transgenen Organismus nach Anspruch 9 oder 10 für die Expression einer Nukleinsäure von Interesse.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Expression samenspezifisch ist.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, des Vektors nach Anspruch 5 oder 6, der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8, des nicht-humanen transgenen Organismus nach Anspruch 9 oder 10, des Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 15 oder die Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Nukleinsäure von Interesse für ein Samenspeicherprotein kodiert oder an der Modulation von Samenspeicherverbindungen beteiligt ist.