DE112011102286T5

DE112011102286T5 - Massenspektrometrische Quantifizierung von Analyten unter Verwendung eines Universalreporters

Info

Publication number: DE112011102286T5
Application number: DE112011102286T
Authority: DE
Inventors: Joel Louette; John Charles Rogers
Original assignee: Thermo Fisher Scientific GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific GmbH
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2013-05-02
Anticipated expiration: 2031-06-01
Also published as: US20150148260A1; DE112011102291T5; GB2559928B; US20130210051A1; GB2495036B; WO2012005838A1; US9945867B2; GB201901818D0; GB2495036A; WO2012006406A2; GB2494567B; US9297808B2; DE112011102286B4; US9377469B2; GB2559928A; WO2012006406A3; GB201223164D0; US20130105684A1; DE112011106145B4; US20160097749A1

Abstract

Quantifizierung von Analyten, einschließlich aber nicht beschränkt auf Peptide, Polypeptide und Proteine, mittels Massenspektrometrie unter Verwendung eines markierten, mit einem Reporter verbundenen Peptids und eines Universalreporters.

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der gleichzeitig anhängigen, am 7. Juli 2010 angemeldeten US-Anmeldung mit der Nummer 61/361,970, welche durch Bezugnahme hierin ausdrücklich vollständig einbezogen ist.
Die Massenspektrometrie (MS) ermöglicht in Verbindung mit internen Standardpeptiden, welche mit stabilen, schweren Isotopen markiert sind, eine schnelle, genaue und präzise absolute Quantifizierung von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen in biologischen und anderen Proben. Dieses Verfahren basiert auf Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie (IDMS), auch als AQUA bekannt ( WO 03/016861 ).
Wie unten erläutert wird, hat die IDMS Einschränkungen. Deshalb sind Verbesserungen wie etwa das erfindungsgemäße Verfahren erwünscht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ergab eine absolute Quantifizierung von Analyten mittels MS, und ermöglichte eine einfache Konzentrationskalibrierung von Analyten in Referenzlösungen. Im Verfahren wurde ein schwerer, isotopenmarkierter Analyt (interner Standard) verwendet, welcher in äquimolarer Konzentration wie ein Reporter R vorliegt (welcher mit einem schweren Isotop markiert sein kann oder nicht) und welcher mit diesem spaltbar verbunden ist; und ein schwerer, isotopenmarkierten Universalreporter U. Analyten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Peptide, Polypeptide und Proteine. Der Universalreporter U umfasst, ist aber nicht beschränkt auf Peptide (d. h. Polymere von Aminosäuren) und andere Polymere.
Bei einer Ausführungsform ergab das erfindungsgemäße Verfahren eine absolute Quantifizierung von Peptid-, Polypeptid- und Protein-Analyten mittels MS. Im Verfahren wurde ein schweres, isotopenmarkiertes Peptid (proteotypisches Peptid, unten beschrieben; interner Standard) verwendet, welches in äquimolarer Konzentration mit einem optional mit einem schweren Isotop markierten Reporterpeptid R vorlag, und welches an einer proteolytischen Stelle mit diesem spaltbar verbunden war; ein schweres, markiertes Universalreporterpeptid U, analysiert mittels Aminosäureanalyse. Es ist nicht erforderlich, das schwere, isotopenmarkierte Peptid einer Aminosäureanalyse zu unterziehen. Bei einer Ausführungsform wurden mehrere unterschiedliche proteotypische Peptide eines einzelnen Proteins, verbunden mit separaten Reporterpeptiden R, analysiert. Bei einer Ausführungsform wurden mehrere unterschiedliche, zu einem Polypeptid verbundene, proteotypische Peptide analysiert, welche mit einem einzelnen Reporterpeptid R verbunden waren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Peptide für eine massenspektrometrische (MS) Quantifizierung.
2 zeigt eine Konfiguration für ein zu quantifizierendes Peptid, verbunden mit einem Reporterpeptid und korreliert mit einem Universalpeptid U.
3 zeigt eine Ausführungsform für die Quantifizierung von mehr als einem Peptid, worin jedes Peptid mit einem separaten Reporterpeptid R verbunden ist.
4 zeigt eine Ausführungsform mit drei verbundenen Peptiden, verbunden mit einem einzelnen Reporterpeptid R.
5 zeigt eine Ausführungsform für einen gleichzeitigen Assay von mehr als einem Analyten in einer Probe und Verwendung eines einzelnen Assays (Multiplex), mit drei proteotypischen Peptiden, jeweils spaltbar mit dem eigenen Reporterpeptid R verbunden, und korreliert mit einem einzelnen Universalreporterpeptid U.
6 zeigt eine Konfiguration und Beziehung zwischen Komponenten.
7 zeigt eine Konfiguration und Beziehung zwischen Peptidkomponenten.
8 zeigt eine Namensgebung.
9 zeigt die Ergebnisse einer Verdünnungsreihe eines Universalreporterpeptids U und Verwendung von linearen (9A) und logarithmischen (9B) Skalen.
10 zeigt die proteolytische Effizienz eines beispielhaften schweren, isotopenmarkierten Peptids.
11 zeigt Daten eines beispielhaften schweren, isotopenmarkierten Peptids.
1 zeigt die proteotypischen Peptide A, B und C des Proteins oder Polypeptids P. Ein proteotypisches Peptid ist ein Signaturpeptid, welches nach MS-Dissoziierung in eine Reihe vorhersagbarer Ionen fragmentiert und eine spezifische Identifizierung und Quantifizierung des Elternproteins ermöglicht, entweder in gereinigter Form oder aus einem komplexen Gemisch. Es weist Eigenschaften auf, welche es leicht quantifizierbar machen. Ein Signaturpeptid ist ein eindeutiges Identifizierungsmerkmal eines spezifischen Proteins. Jedes Protein enthält zwischen 10 und 100 Signaturpeptide. Jedes Signaturpeptid erfüllt die meisten der folgenden Kriterien: leicht nachzuweisen durch Massenspektroskopie, vorhersagbar und stabil zu eluieren von einer Flüssigchromatographie-(LC)Säule, angereichert durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC), gute Ionisierung, gute Fragmentierung. Ein Peptid, welches leicht quantifiziert werden kann, erfüllt die meisten der folgenden Kriterien: leicht synthetisierbar, kann hochgereinigt werden (> 97%), löslich in ≥ 20% Acetonitril, geringe nicht-spezifische Bindung, oxidationsresistent, resistent gegen eine Modifikation nach der Synthese, und eine Hydrophobizität oder einen Hydrophobizitätsindex ≥ 10 und ≤ 40. Der Hydrophobizitätsindex wird in Krokhin, Molecular and Cellular Proteomics 3 (2004) 908, beschrieben, welches hierin ausdrücklich durch Bezugnahme integriert ist. Ein Peptid mit einem Hydrophobizitätsindex von weniger als 10 wird nicht reproduzierbar durch RP-HPLC aufgelöst. Ein Peptid mit einem Hydrophobizitätsindex größer als 40 wird nicht reproduzierbar von einer RP-HPLC-Säule eluiert.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein interner Standard verwendet, welcher die schwere Isotopenform (markiert) des zu quantifizierenden Analyten darstellt, auch als ein schwerer Analyt bezeichnet und in 6 gezeigt. In der Ausführungsform, worin ein proteotypisches Peptid verwendet wird, ist der interne Standard die markierte Form des proteotypischen Peptids, auch als ein schweres proteotypisches Peptid bezeichnet, wie in 7 gezeigt wird.
IDMS bezieht sich auf die Verwendung von schweren, isotopenmarkierten Peptiden als interne Standards zur Bildung des Verhältnisses Konzentration versus MS-Response, und zur Durchführung einer absoluten Quantifizierung eines Peptids. Das schwere, isotopenmarkierte Peptid besitzt identische Eigenschaften wie das nicht markierte Peptid, mit der Ausnahme, dass seine Masse durch das eingefügte Isotop (die eingefügten Isotope) verschoben ist. Als ein Ergebnis dieser Massenverschiebung kann ein bekannter Gehalt des isotopenmarkierten Peptids als ein interner Standard für eine Peptidquantifizierung verwendet werden. Das IDMS-Verfahren ergibt eine gezielten massenspektrometrische (SRM (Selected-Reaction-Monitoring)/MRM (Multiple-Reaction-Monitoring)) Quantifizierung von Peptiden in komplexen Proben oder Gemischen. SRM umfasst das Einrichten der MS-Erfassung zur Quantifizierung einer Reihe von Zielproteinen durch die Quantifizierung von spezifischen Fragment-Ionen von proteotypischen Peptiden dieser Zielproteine. Die zielgerichtete Assayentwicklung muss schnell sein, einen hohen Durchsatz haben, sensitiv sein, spezifisch, gezielt, robust, reproduzierbar und kostengünstig; normalerweise wird Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS, LC/MS²) verwendet. Jedoch bleibt die genaue Quantifizierung einer großen Anzahl von Peptiden in gezielt ausgerichteten Proteomik-Experimenten unter Verwendung von SRM eine Herausforderung.
Bei der IDMS unterscheidet sich das native proteotypische Peptid vom schweren proteotypischen Peptid nur aufgrund der Insertion einer schweren Aminosäure. Eine schwere Aminosäure enthält ¹³C (das schwere Kohlenstoff-Isotop) und/oder ¹⁵N (das schwere Stickstoff-Isotop). Die Insertion einer schweren Aminosäure führt zu HeavyPeptide AQUA^®, welches sich nur durch den Unterschied in der Masse vom proteotypischen Peptid unterscheidet. Die Reinheit des schweren Peptids wird durch Verwendung einer präparativen Hochdurchsatz-Flüssigchromatographie (HPLC) auf > 97% erhöht. Die genaue Menge an HeavyPeptide AQUA^® wird mittels Aminosäureanalyse bestimmt. Das Gemisch aus dem zu quantifizierenden Peptid und HeavyPeptide AQUA^® als interner Standard ergibt bei der Massenspektroskopie zwei Peaks: die zwei Peaks weisen die gleiche Elutionszeit, aber unterschiedliche Massen auf. HeavyPeptide AQUA^® wird in einer bekannten Menge in die zu analysierende Probe untergemischt, wobei die Verwendung dieser Menge zur Berechnung der Menge des zu analysierenden Peptids aus den Peakflächen ermöglicht wird. Im Verfahren wird die Fläche des entsprechenden MS-Peaks vom schweren, isotopenmarkierten Peptid verglichen mit dem Peak des nicht markierten Peptids mit exakt der gleichen Sequenz, welches von dem zu quantifizierenden Analyten (z. B. Polymer, Protein, Peptid oder Polypeptid) stammt. Die Genauigkeit der Quantifizierung korreliert direkt mit der Präzision der Menge des zu der Probe zugegebenen schweren Peptids.
Obwohl das folgende Beispiel speziell bei einem Proteinanalyten verwendet wird, veranschaulicht es das allgemeine anwendbare Verfahren für Analyten, ob Protein oder Nicht-Protein. Eine Probe (z. B. biologische Probe, Nahrungsmittelprobe) mit zahlreichen Proteinen wird mit einem Spaltungsmittel, wie etwa einer Protease (z. B. Trypsin) behandelt. Trypsin spaltet bei jeder Aminosäure R und jeder Aminosäure K, was zahlreiche Fragmente ergibt, wobei jedes Fragment etwa 13 Aminosäuren aufweist (Bereich von 6 Aminosäuren bis 20 Aminosäuren). In diese fragmenthaltige, zu analysierende Probe werden ein, zwei oder drei interne Standards HeavyPeptide AQUA^® eingebracht (untergemischt), und die Quantifizierung wird wie beschrieben durchgeführt. Bei Ausführungsformen worin ein proteolytischer Verdau eingesetzt wird, ist die Genauigkeit der Quantifizierung ebenso direkt korreliert mit der Berechenbarkeit und Effizienz des Verdaus.
Bei einer Ausführungsform enthalten die Proteine eine, zwei oder drei proteotypische Peptidsequenzen, markiert als schwer oder leicht (HeavyPeptide AQUA^®, QuantPro^® oder Ultimate^®). Die zu analysierenden Proben sind mit den proteotypischen Peptiden versetzt bzw. vermischt und werden durch LC-MS/MS quantifiziert.
Bei der IDMS weist der interne Standard die gleiche Sequenz auf wie das proteotypische Peptid von dem zu quantifizierenden Protein, aber der interne Standard besitzt eine andere Masse wie das proteotypische Peptid. Somit ist die Sequenz des internen Standards durch die Proteinsequenz vorherbestimmt; sie kann nicht geändert werden. Der interne Standard muss mittels Aminosäureanalyse quantifiziert werden. Da das zu quantifizierende Protein oder Polypeptid bei jedem Experiment unterschiedlich ist, ist auch der interne Standard für dieses Protein oder Peptid notwendigerweise bei jedem Experiment unterschiedlich, und es ist erforderlich, dass bei jedem Experiment eine Aminosäureanalyse durchgeführt wird. Jede Quantifizierung erfordert vor der tatsächlichen Quantifizierung der Probe eine Verdünnungskurve, welche normalerweise sechs Punkte umfasst, wobei jeder Punkt etwa eine Stunde MS-Zeit benötigt. Die Kosten für eine Aminosäureanalyse sind relativ hoch und das Verfahren ist zeitaufwändig. Jede Peptidsequenz besitzt eine spezifische Löslichkeit, und seine nicht-spezifische Bindungskonstante variiert auf Basis verschiedener Faktoren, welche bei jeder Analyse unterschiedlich sein können, z. B. Material von Gefäßen, Puffer, Temperatur usw. Eine solche Variabilität reduziert die Genauigkeit und die Reproduzierbarkeit.
Im Gegensatz dazu, mit Peptiden als nicht beschränkendes Beispiel, wurde beim erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines modifizierten, optimierten, markierten Universalreporters U und eines Analyten, mehr als einem Analyten oder mehrerer verbundener Analyten die analytische Genauigkeit des SRM erhöht, wobei die Qualität von internen Standards für die Sicherstellung einer genauen Quantifizierung entscheidend ist. Nur dieser Universalreporter U durchläuft eine Aminosäureanalyse, statt dass ein interner Standard für jedes zu quantifizierende Peptid eine Aminosäureanalyse erfordert. Die Quantifizierung des Universalreporters U braucht somit nur einmal durchgeführt werden, anstatt bei jedem Experiment. Der Universalreporter U kann bevorratet und leicht verfügbar gemacht werden. Bei einer Ausführungsform ist der Universalreporter U mit einem Fluorophor und/oder einem Chromophor markiert, und der Universalreporter U wird durch Messung des Absorptionsvermögens des Fluorophors und/oder des Chromophors quantifiziert. Bei Peptidanalyten ist keine Aminosäureanalyse erforderlich. Bei einer Ausführungsform enthält das Universalreporterpeptid U ein Tryptophan, und das Universalreporterpeptid U wird durch Messung des Absorptionsvermögens unter Verwendung des spezifischen Extinktionsfaktors von Tryptophan quantifiziert.
Wie in 2 unter Verwendung eines Peptidanalyten gezeigt wird, wird bei einer Ausführungsform das Peptid A*, der interne Standard, mit einem Reporterpeptid R durch eine spaltbare Stelle (z. B. proteolytische Stelle) zwischen A* und R verbunden. Bei dieser Ausführungsform enthalten sowohl das Peptid A* als auch das Reporterpeptid R mindestens eine mit einem schweren Isotop markierte Aminosäure, bekannt als schwere Aminosäure. Wenn das Reporterpeptid R mit einem schweren Isotop markiert ist, und weil das Universalreporterpeptid U eine unterschiedliche Masse aufweisen muss, kann das Universalreporterpeptid U mit zwei schweren Aminosäuren dargestellt werden, und das Reporterpeptid R mit einer schweren Aminosäure. Es gibt jedoch andere Wege, um Unterschiede in der Atommasse zu erhalten, z. B. die Verwendung unterschiedlicher, schwerer Aminosäuren für das Reporterpeptid R und das Universalreporterpeptid U, um Unterschiede in der Atommasse zu erhalten.
Das Peptid A* besitzt die gleiche Sequenz wie das proteotypische Peptid A, aber das Peptid A* besitzt aufgrund der Anwesenheit einer schweren Aminosäure eine unterschiedliche Masse. Das Universalreporterpeptid U ist ein Peptidstandard für das Reporterpeptid R. Das Universalreporterpeptid U ist nicht der interne Standard, der zur Quantifizierung des Proteins oder Polypeptids verwendet wird. Das Universalreporterpeptid U weist genau die gleiche Sequenz wie das Reporterpeptid R auf, besitzt jedoch eine unterschiedliche Atommasse.
Bei der Ligation zwischen dem Peptid A* und dem Reporterpeptid R unter Bildung eines Polypeptids, kann das Reporterpeptid R C-terminal zu A* sein, d. h. R-A*, oder das Reporterpeptid R kann N-terminal zu A* sein, d. h. A*-R. Die Bezeichnung A*-R wird verwendet, um entweder das Polypeptid A*-R oder das Polypeptid R-A* darzustellen. Wenn A* ein proteotypisches Peptid ist, muss bei dem sich ergebenden Polypeptid in jedem Fall eine spaltbare (z. B. proteolytische) Stelle zwischen dem Peptid A* und dem Reporterpeptid R vorliegen.
Das Polypeptid A*-R wird mit der Probe gemischt, welche das zu quantifizierende Protein oder Polypeptid P enthält. Eine bekannte Menge des Universalreporterpeptids U wird zu der Probe zugegeben, d. h. das Universalreporterpeptid U wird in die Probe untergemischt. Die Probe wird mit einer Protease (z. B. Trypsin) verdaut, welche die Polypeptidbindungen spaltet. Als Ergebnis der Proteasewirkung muss das Polypeptid A*-R vollständig verdaut sein. Bei einer Ausführungsform wird das Universalreporterpeptid U vor der Spaltung (z. B. proteolytischer Verdau) zugegeben. Bei einer Ausführungsform wird das Universalreporterpeptid U nach der Spaltung (z. B. proteolytischer Verdau) zugegeben.
Nach dem Verdau ist die Konzentration des Peptids A* und der Reporterpeptids R in der Probe äquimolar. Das bedeutet, die Menge an Peptid A* ist gleich der Menge an Reporterpeptid R. Das Universalreporterpeptid U wird zur Quantifizierung des Reporterpeptids R unter Verwendung einer MS-Quantifizierung verwendet. Die Menge an Peptid A*, die sich durch den proteolytischen Verdau des Proteins oder Polypeptids P ergibt, wird zur Messung der Menge an Peptid A in der Probe verwendet.
Bei der in 3 gezeigten Ausführungsform unter Verwendung eines Peptids wird das gleiche Verfahren auf die proteotypischen Peptide B und C des Proteins P angewandt, um die Spezifität der Quantifizierung zu erhöhen. Das Peptid B* besitzt die gleiche Sequenz wie das proteotypische Peptid B, weist jedoch aufgrund der Anwesenheit der schweren, isotopenmarkierten Aminosäure eine unterschiedliche Atommasse auf. Das Peptid C* besitzt die gleiche Sequenz wie das proteotypische Peptid C, weist jedoch aufgrund der Anwesenheit der schweren, isotopenmarkierten Aminosäure eine unterschiedliche Atommasse auf.
Bei Verwendung einer beispielhaften Peptid-Ausführungsform umfasst A*-R eine Spaltungsstelle (z. B. proteolytische Stelle) zwischen A* und R. Das Polypeptid A*-R kann somit als ein Pseudostellvertreter des Proteins oder Polypeptids P verwendet werden, um den proteolytischen Verdau in einem einzelnen Experiment, die Effizienz des Verdaus zwischen Proben und Experimenten zu überprüfen, und in einigen Fällen die Ergebnisse von unterschiedlichen Proben und/oder unterschiedlichen Experimenten zu normieren.
Bei Beispielen, bei welchen Peptide verwendet werden, kann das Reporterpeptid R für einen proteolytischen Verdau optimiert werden. Beispielsweise kann das Reporterpeptid R so ausgewählt und/oder modifiziert werden, dass es eine spezifische Aminosäure (z. B. Tryptophan) enthält, welche leicht durch Absorptionsmessungen quantifiziert werden kann. Wie in 5 gezeigt wird, kann das Reporterpeptid R mehr als eine schwere, isotopenmarkierte Aminosäure enthalten. Diese Ausführungsform erhöht die Multiplexmöglichkeiten des Verfahrens durch Erhöhung der Anzahl von möglichen Atommassen für die gleiche Reporterpeptid R-Sequenz, so dass mehrere Peptide in einem einzigen Experiment unter Verwendung eines Universalreporterpeptids U quantifiziert werden können.
In dieser Multiplex-Ausführungsform wird das Reporterpeptid R unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Standardverfahren mit unterschiedlichen Atommassen synthetisiert. Wie in 5 gezeigt wird, werden die Peptide A, B und C von dem Protein oder Polypeptid P in einem einzigen Experiment quantifiziert unter Verwendung der schweren Peptide A*, B* bzw. C*, und unter Verwendung der Reporterpeptide R1, R2, R3. In der in 5 gezeigten Ausführungsform weisen die Reporterpeptide R1, R2, R3 und das Universalreporterpeptid U die gleiche Sequenz, aber unterschiedliche Atommassen auf. Um die Anzahl der für das Reporterpeptid R verfügbaren Massenkombinationen zu maximieren, kann die Sequenz aus einer oder mehreren der folgenden Aminosäuren zusammengesetzt werden: Alanin, Arginin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Valin, ist aber nicht darauf beschränkt. Diese Aminosäuren besitzen eine Massenverschiebung ≥ 4 Da. Der minimale Massenunterschied zwischen dem proteotypischen Peptid (z. B. A) und dem internen Standard (z. B. A*) sollte den Grenzwert für die Sensitivität der Bestimmung für eine MS-Differenzierung überschreiten. Bei einer Ausführungsform beträgt der minimale Massenunterschied zwischen dem proteotypischen Peptid und dem internen Standard 4 kDa, wenn 4 kDa der minimale Atommassenunterschied ist, welcher unterschieden werden kann. Die Anzahl an Peptiden, welche gleichzeitig unter Verwendung eines schweren Universalpeptids U quantifiziert werden kann, ist nur durch die Anzahl der innerhalb der Sequenz verfügbaren Kombinationen des Massenunterschieds beschränkt.
Bei einem anderen Beispiel, worin Peptide verwendet werden, kann das Reporterpeptid R mit einem niedrigen Hydrophobizitätsindex gestaltet werden, welcher die wässrige Löslichkeit des Polypeptids A*-R erhöht, worin das Peptid A* einen Hydrophobizitätsindex ≥ 40 aufweist oder worin das Peptid A* schlecht löslich ist. Ein Beispiel eines Reporterpeptids mit einer Sequenz, welcher es gut löslich macht, ist PVVVPR (SEQ ID NO. 1); es besitzt einen Hydrophobizitätsindex von 13,45. Ein Beispiel eines Reporterpeptids R mit einer Sequenz, welches es gut löslich macht, ist SSAAPPPPPR (SEQ ID NO. 2) mit einen Hydrophobizitätsfaktor von 7,57. In einem Beispiel enthalten sowohl das Reporterpeptid R als auch das Universalreporterpeptid U ein Chromophor und/oder Fluorophor, welches für die Quantifizierung durch Absorptionsmessung verwendet wird. Bei der Ausführungsform, worin sowohl Universalreporterpeptid U als auch Reporterpeptid R ein Chromophor und/oder Fluorophor umfassen, kann das Universalreporterpeptid U durch Messung des Absorptionsvermögens des Chromophors und/oder Fluorophors quantifiziert werden, und nicht mittels Aminosäureanalyse. Das Verfahren der Protein- oder Polypeptidquantifizierung mittels Absorptionsvermögen ist stabiler als das Verfahren der Aminosäureanalyse. Die Protein- oder Polypeptidquantifizierung mittels Absorptionsvermögen wird als genauer erachtet als die Protein- oder Polypeptidquantifizierung mittels Aminosäureanalyse. Beispiele eines Chromophors oder Fluorophors und Verfahren zur Bestimmung ihres Absorptionsvermögens sind im Fachgebiet bekannt.
Bei der in 4 gezeigten Ausführungsform enthält das Polypeptid drei proteotypische Peptide, jeweils markiert mit einer schweren Aminosäure, verbunden mit einem einzelnen Reporterpeptid R, welches ebenso mit einer Aminosäure mit einem schweren Isotop markiert ist, unter Bildung von C*-B*-A*-R. Die Verwendung dieses Polypeptids C*-B*-A*-R garantiert äquimolare Mengen von jedem der Peptide A*, B* und C* und verringert somit die Variabilität der Quantifizierung im Vergleich zu einer Quantifizierung unter Verwendung einzelner Peptide. Diese Ausführungsform erhöht die Anzahl an Peptiden, welche mit der gleichen Sequenz wie derjenigen des Universalreporterpeptids U quantifiziert werden können.
Bei einer Ausführungsform kann A*-R oder B*-A*-R oder C*-B*-A*-R vor dem Einbringen in die zu quantifizierende Probe gespalten werden.
Bei Ausführungsformen, worin proteotypische Peptide verwendet werden, können die Peptide A*, B*, C* und das Reporterpeptid R willkürlich angeordnet werden, solange sie durch eine Spaltungsstelle (z. B. proteolytische Stelle) verbunden sind.
Das in 4 gezeigte Polypeptid enthält drei schwere, isotopenmarkierte Peptide (A*, B* und C*), welche den Zielpeptiden A, B und C entsprechen, verbunden mit dem Reporterpeptid R, welches ebenso eine Markierung mit einem schweren Isotop enthält. Es sind andere Ausführungsformen möglich, worin R keine Markierung mit einem schweren Isotop enthält. Andere Ausführungsformen sind möglich, welche eine unterschiedliche Anzahl (n) von markierten Peptiden enthalten, entsprechend einem oder mehreren Zielpeptiden, verbunden mit einem oder mehreren Reporterpeptiden. Der Bereich für n wird beispielsweise beeinflusst durch die Realisierbarkeit der Herstellung, Löslichkeit usw., wie einem Fachmann bekannt ist. Bei einer Ausführungsform ist ein Wert von n bis zu 99 möglich. Bei einer Ausführungsform ist ein Wert von n bis zu 49 möglich. Bei einer Ausführungsform ist n = 4. Bei einer Ausführungsform ist n = 5. Bei einer Ausführungsform ist n = 6. Bei einer Ausführungsform ist n = 7. Bei einer Ausführungsform ist n = 8. Bei einer Ausführungsform ist n = 9. Bei einer Ausführungsform ist n = 10. Bei einer Ausführungsform ist n = 11. Bei einer Ausführungsform ist n = 12.
Das Universalreporterpeptid U und das Reporterpeptid R können mit unterschiedlichen Sequenzen für eine Multiplex-Quantifizierung gestaltet werden. Die Anzahl der durch eine Peptidsequenz bestimmten Kombinationen der Massenunterschiede ist beschränkt. Wenn die Anzahl der zu quantifizierenden Peptide die maximale Anzahl der für das Reporterpeptid R verfügbaren Kombinationen der Massenunterschiede übersteigt, kann man zusätzliche Sequenzen des Universalreporterpeptids U verwenden: z. B. U¹, U², ... Uⁿ, wobei n nur durch die Anzahl der Peptide beschränkt ist, welche gleichzeitig mit einen Apparat quantifiziert werden können. Beispielsweise kann das Polypeptid A*-R die Aminosäuresequenz TTVSKTETSQVAPA (SEQ ID NO. 3) aufweisen, wobei das Peptid A* die Sequenz TETSQVAPA (SEQ ID NO. 4) und das Reporterpeptid R die Sequenz TTVSK (SEQ ID NO. 5) aufweist, wie in WO/2003/046148 offenbart wird.
Da die Sequenz des Universalreporterpeptids U weder begrenzt noch eingeschränkt ist, und da das Universalreporterpeptid U ein Produkt ist, welches leicht bestellt, bevorratet, erhalten und inventarisiert werden kann, stellt dessen Verwendung eine Flexibilität bei der MS-Peptidquantifizierung bereit. Bei einer Ausführungsform kann die Sequenz des Universalreporterpeptids U individuell angepasst werden, um die nicht-spezifische Bindung des Peptids, Polypeptids oder Proteins, beispielsweise an einen Behälter, ein Gefäß, an einen Schlauch usw. zu minimieren, durch Auswahl einer Sequenz mit einem geringen Hydrophobizitätsindex, z. B. PVVVPR (SEQ ID NO. 1), welche eine Hydrophobizitätsindex von 13,45 aufweist, oder SSAAPPPPPR (SEQ ID NO. 2), welche einen Hydrophobizitätsindex von 7,57 aufweist. Bei einer Ausführungsform kann die Sequenz des Universalreporterpeptids U individuell angepasst werden, um die Löslichkeit des Polypeptids A*-R zu maximieren. Da das Universalreporterpeptid U verwendet wird, muss beispielsweise das Polypeptid A*-R vor der MS-Analyse nicht exakt quantifiziert werden. Dies ergibt eine kürzere Herstellungszeit und geringere Kosten bei der Herstellung des Polypeptids A*-R. Das Peptid A* wird bei einer sehr niedrigen Konzentration quantifiziert, bei welcher seine Löslichkeit garantiert ist, wodurch eine verbesserte Genauigkeit und Reproduzierbarkeit erhalten wird.
Da die Quantifizierung des Peptids A* mit dem gleichen Apparat, welcher für die Quantifizierung des Reporterpeptids R verwendet wird, und innerhalb des gleichen MS-Verfahrens durchgeführt wird, spiegelt sie immer die in die Probe zugegebene Menge wider und ist unabhängig von einer möglichen Änderung, Degradierung und einem partiellen Verlust des Polypeptids A*-R während der Probenpräparation, Fraktionierung und flüssigchromatographischen Trennung vor der MS-Quantifizierung. Wenn das in WO 03/016861 beschriebene Verfahren verwendet wird, wird A* in einer bekannten Konzentration bereitgestellt, welche zu hoch ist für eine Verwendung ohne Verdünnung, somit erfolgt normalerweise eine Verdünnung von 1000 bis 10000 verdünnt. Wenn die Sequenz von A* relativ hydrophob und anfällig für eine nicht-spezifische Bindung ist, wie dies bei β-Amyloidpeptiden der Fall ist, wird bei der Verdünnung eine signifikante Menge des Standards verloren gehen. Dies verringert die Genauigkeit des Verfahrens. Da die Sequenz des Universalreporterpeptids U so gestaltet und optimiert werden kann, dass eine nicht-spezifische Bindung verringert wird, ist die Verdünnung des Universalreporterpeptids U nicht anfällig für eine signifikante nicht-spezifische Bindung. Das Universalreporterpeptid U wird in die zu quantifizierende Probe eingebracht, und die Quantifizierung des Reporterpeptids R wird in der verdünnten Probe durchgeführt, somit wird eine nicht-spezifische Bindung des Standards (z. B. β-Amyloidpeptide) die Genauigkeit der Methode nicht verringern.
Das Polypeptid A*-R ist ein Pseudostellvertreter des Proteins P und kann verwendet werden, um die Spaltung (z. B. proteolytischer Verdau) zu kontrollieren. Es kann verwendet werden, um eine Probe mit einer anderen Probe und/oder ein Experiment mit einem anderen Experiment, die Effizienz des Verdaus zu vergleichen. Sie kann verwendet werden, um die Ergebnisse zwischen Proben und/oder zwischen Experimenten zu normieren.
Bei einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren an eine MS-Quantifizierung von Analyten angepasst, einschließlich aber nicht beschränkt auf Peptide, Polypeptide und Proteine, unter Verwendung eines proteotypischen Peptids, welches durch eine spaltbare Stelle mit einem Reporterpeptid R oder einem anderen Teil verbunden ist. Dies wird schematisch für einen beliebigen Analyten in 6 und für einen Peptidanalyten in 7 gezeigt. Das schwere proteotypische Peptid enthält die gleiche Aminosäuresequenz wie das native proteotypische Peptid, aber eine unterschiedliche Atommasse. Das schwere proteotypische Peptid liegt in äquimolarer Konzentration wie das Reporterpeptid R vor. Bei einer Ausführungsform ist das Reporterpeptid R mit einem schweren Isotop markiert. Bei einer Ausführungsform ist das Reporterpeptid R nicht mit einem schweren Isotop markiert. Das Universalreporterpeptid U besitzt die gleiche Sequenz wie das Reporterpeptid R. Das Universalreporterpeptid U weist eine unterschiedliche Masse als das Reporterpeptid R auf, da es eine Markierung mit einem schweren Isotop enthält. Nur das Universalreporterpeptid U wird quantifiziert. Nach der Spaltung (z. B. proteolytischer Verdau) werden das schwere proteotypische Peptid und das Reporterpeptid R mit äquimolarer Konzentration in der Probe freigesetzt. Die Menge des Reporterpeptids R wird unter Verwendung der Menge des schweren Universalreporterpeptids U bestimmt.
Das Universalreporterpeptid U ist sequenzunabhängig und wird als ein Quantifizierungsstandard und ein Spaltungsstandard verwendet. Das Universalreporterpeptid U besitzt eine Peptidsequenz, welche identisch ist mit dem Reporterpeptid R, aber welche von dem zu untersuchenden Protein unabhängig ist. Da die Sequenz des Universalreporterpeptids U und des Reporterpeptids R identisch ist, wird der Unterschied der Atommasse zwischen dem Universalreporterpeptid U und dem Reporterpeptid R durch Verwendung eines schweren, markierten Reporterpeptids R und eines schweren, markierten Universalreporterpeptids U erhalten. Der Unterschied der Atommasse wird durch Verwendung von unterschiedlichen schweren Markierungen beim Reporterpeptid R und beim Universalreporterpeptid U, oder durch Verwendung einer zusätzlichen schweren Aminosäure beim Reporterpeptid R oder beim Universalreporterpeptid U erhalten. Das Reporterpeptid R kann eine geringere Atommasse oder eine höhere Atommasse als das Universalreporterpeptid U aufweisen.
Wie in 8 dargestellt wird, lautet ein geeignetes Übereinkommen zur Namensgebung von Komponenten wie folgt: proteotypische Peptide werden mit Buchstaben benannt, z. B. A, B, C; schwere, isotopenmarkierte proteolytische Peptide werden mit Buchstaben mit einem Stern benannt, welcher die Markierung mit einem schweren Isotop anzeigt, z. B. A*, B*, C*; R ist ein Reporter; U ist ein Universalreporter; eine Aminosäure, welche die Markierung mit einem schweren Isotop trägt, wird entweder durch die konventionelle Aminosäurebenennung mit einem oder drei Buchstaben in fettgedruckter Schreibweise angezeigt, z. B. bezeichnet entweder R oder Arg die Aminosäure Arginin mit einer Markierung mit einem schweren Isotop; eine Zusammensetzung von verbundenen Peptiden und einem Universalreporter, kommerziell erhältlich unter dem Handelsnamen HeavyPeptide IGNIS^TM, ist A*B*C*R.
Bei einer Ausführungsform ist die Sequenz des Universalreporterpeptids U so optimiert und/oder individuell angepasst, dass sie mit den Eigenschaften des proteotypischen Peptids kompatibel ist, durch Optimierung der chromatographischen Ionisierung und Fragmentierungseigenschaften. Beispielsweise wird das Universalreporterpeptid U modifiziert, um die Ionisierung und/oder Desolvatisierung zu verbessern, durch Einbringen einer zusätzlichen Ladung oder von hydrophoben Eigenschaften. Beispielsweise wird das Universalreporterpeptid U modifiziert, um die Fragmentierung durch Einbringen einer Aspartat-Prolin-(DP)Gruppe zu verbessern, welche eine in hohem Maße leicht spaltbare Bindung enthält, welche bei einer Tandem-MS bei niedrigeren Kollisionsenergien fragmentiert als andere Dipeptidbindungen. Beispielsweise wird das Universalreporterpeptid U so modifiziert, dass es bei einer Flüssigchromatographie eine ähnliche Retentionszeit aufweist wie das proteotypische Peptid, durch Auswahl eines Reporterpeptids mit einem ähnlichen Hydrophobizitätsfaktor wie das proteotypische Peptid. Somit kann das Universalreporterpeptid U mittels Ausgestaltung optimiert werden. Beispielsweise kann die Anzahl der Massenkombinationen für die identische Peptidsequenz optimiert werden, um die Multiplexkapazität zu erhöhen, wobei bis zu 100 Proteine in einem einzelnen Assay quantifiziert werden können. Weil die Peptidsequenzen identisch sind, ist nur eine Verdünnungskurve erforderlich, um das Universalreporterpeptid U zu quantifizieren. Durch Erhöhung der Anzahl von identischen Sequenzen mit unterschiedlichen Massen steigt die Anzahl von Proteinen, welche in einem einzelnen Experiment quantifiziert werden können, ohne eine gleichzeitige Vergrößerung der instrumentellen Ausrüstung und der Ressourcen.
Bei einer Ausführungsform wurde das Universalreporterpeptid U für eine niedrige spezifische Bindung, eine hohe Löslichkeit, eine hohe MS-Signalintensität und/oder eine gewünschte Flüssigchromatographie-Retentionszeit optimiert. Bei einer Ausführungsform wurde die Peptidsequenz so modifiziert, dass ihre chromatographischen Retentionseigenschaften verändert waren; dies ist ein Beispiel einer internen Modifikation. Bei einer Ausführungsform wurde die Struktur modifiziert durch Anbringen von Markierungen, um die chromatographischen Retentionseigenschaften zu verändern; dies ist ein Beispiel einer externen Modifikation. Bei einer Ausführungsform wurde die Struktur durch Anbringen von Markierungen modifiziert, welche selbst modifiziert waren, um die chromatographischen Retentionseigenschaften zu verändern; dies ist ein anderes Beispiel einer externen Modifikation.
Bei einer Ausführungsform wird ein Universalpolymer verwendet, worin Polymer allgemein als eine verbundene Gruppe von Monomeren definiert ist. Die Monomere müssen keine Peptide sein, oder müssen nicht vollständig Peptide sein. Bei einer Ausführungsform werden Polysaccharide (d. h. Glykanmonomere) als Universalpolymere (U^polymer) verwendet. Ein Polysaccharid ist eine Kombination von zwei oder mehreren Monosacchariden, verbunden durch glykosidische Bindungen. Beispiele für Polysaccharide umfassen Stärke, Cellulose und Glykogen. Deren Strukturen und Synthese sind im Fachgebiet bekannt. Bei einer Ausführungsform wird Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) als Universalpolymere (U^polymer) verwendet. Deren Strukturen und Synthese sind im Fachgebiet bekannt. Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Nukleotiden sind bestens bekannt, z. B. PCR, quantitative PCR. Mit einem Analyten verbundene Nukleotide können als ein eindeutiges Identifizierungsmerkmal (d. h. „Barcode”) des Analyten und für Quantifizierungszwecke unter Verwendung von PCR, quantitativer PCR oder Isotopenverdünnung verwendet werden.
Bei einem Beispiel wurde eine der in der Tabelle unten gezeigten folgenden Peptidsequenzen, welche derzeit als Retentionszeit-Kalibrierungspeptide verwendet werden, als Universalreporterpeptid U verwendet. Diese Peptide zeigten eine ausreichende Ionisierung und besaßen definierte Elutionseigenschaften. Die folgende Tabelle unten zeigt ihre Sequenz, Hydrophobizität und das chromatographische Verhalten auf einer Hypersil Gold C₁₈-Säule.
Die Hydrophobizität wurde bestimmt unter Verwendung von Berechnungen, durchgeführt mit Algorithmen, welche in Spicer et al. (2007) beschrieben werden. "Sequence-specific retention calculator. A family of peptide retention time prediction algorithms in reversed-phase HPLC: applicabillity to various chromatographic conditions and columns". Anal Chem. 79 (22): 8762–8.
Bei einer Ausführungsform wird die schwere Isotopenmarkierung in die C-terminale Aminosäure eingebracht. Bei der Verwendung des Peptids SSAAPPPPPR (SEQ ID NO. 2) kann diese Ausführungsform beispielsweise als SAAPPPPPR* dargestellt werden, wobei das terminale R die schwere Isotopenmarkierung enthält.
Bei einer Ausführungsform ist das schwere Isotop in das Peptid an einer anderen Stelle als dem C-Terminus eingebracht. Eine oder mehrere der folgenden Aminosäuren können mit einem schweren Isotop markiert werden: Alanin, Arginin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Valin. Diese Aminosäuren weisen eine Massenverschiebung > 4 Da auf. Zusätzlich können mehrere Aminosäuren innerhalb des Peptids markiert werden, und die gleiche Aminosäure kann mit unterschiedlichen Isotopen markiert werden, wie etwa ¹³C₆-Arginin (R) und ¹³C₆ ¹⁵N₄-Arginin, was eine 6 Da bzw. 10 Da Masseverschiebung einbringen würde. Beispielsweise sind bei Verwendung des Peptids SSAAPPPPPR (SEQ ID NO. 2) die folgenden Positionen möglich, wobei * die Aminosäure mit der Position der schweren Isotopenmarkierung anzeigt: S*SAAPPPPPR, SS*AAPPPPPR, SSA*APPPPPR, SSAA*PPPPPR, SSAAP*PPPPR, SSAAPP*PPPR, SSAAPPP*PPR, SSAAPPPP*PR, SSAAPPPPP*R, SSAAPPPPPR*, S*SAAPPPPPR*, SS*AAPPPPPR*, SSA*APPPPPR*, SSAA*PPPPPR*, SSAAP*PPPPR*, SSAAPP*PPPR*, SSAAPPP*PPR*, SSAAPPPP*PR*, SSAAPPPPP*R*, SSAAPPPPPR** (im Hinblick auf SSAAPPPPPR** ermöglicht eine doppelte Markierung ein höheres Multiplexieren, die Quantifizierung wird auf dem MS/MS-Level unter Verwendung von Fragmenten des Eltern-Ions durchgeführt). Diese Ausführungsform, worin das schwere Peptid an einer anderen Position als dem C-Terminus lokalisiert ist, ermöglicht ein höheres Multiplexieren mit der gleichen Reportersequenz.
Bei Multiplex-Assays werden individuell angepasste Peptide miteinander für komplexe, zielgerichtete Assays kombiniert. Jedes individuell angepasste Peptid besitzt einen unterschiedlichen entsprechenden Universalreporter U, welcher ähnlich wie das individuell angepasste Peptid eluiert. Dies ermöglicht, dass viele Peptide über einen LC-Gradienten ohne Kreuzkontamination leicht multiplexiert und quantifiziert werden können. Beispielsweise enthält eine Multiplexanalyse-Anordnung eine beliebige Anzahl an unterschiedlichen Universalpeptiden U mit der gleichen Aminosäuresequenz, aber einer aufgrund der Anwesenheit eines schweren Isotops unterschiedlichen Atommasse, und eine Anzahl von Reporterpeptiden R, worin jedes Reporterpeptid R mit einem unterschiedlichen, in einer Probe zu quantifizierenden isotopenmarkierten proteotypischen Peptid spaltbar verbunden ist. Die Universalpeptide U weisen eine im wesentlichen ähnliche chromatographische Retentionszeit wie die individuell angepassten Peptide auf. Bei einer Ausführungsform ist die schwere Isotopenmarkierung in dem Universalreporterpeptid U auf unterschiedliche Aminosäuren verschoben. Diese Ausführungsform ermöglicht höhere Multiplex-Anordnungen und Verwendung der gleichen Universalreporterpeptide U-Aminosäuresequenz.
Bei einer Ausführungsform ist das Universalreporterpeptid U für ein spezielles Massenspektrometer und/oder eine spezielle Verwendung angepasst für eine Identifizierung, Charakterisierung und Quantifizierung von krankheitsspezifischen Biomarkern (Proteomik, Metabolomik, Pharmakoproteomik), der Entdeckung, Bestätigung, Validierung; und für eine frühe klinische Diagnose und der Überwachung der Krankheitsentwicklung. Beispielsweise fragmentiert ein Reporterpeptid mit 4–10 Aminosäuren in einem Massenspektrometer in weniger Produkt-Ionen, was insgesamt größere Intensitäten der Fragment-Ionen ergibt als bei einem Reporterpeptid mit 11–25 Aminosäuren. Die intensiveren Produkt-Ionen ergeben eine bessere Sensitivität bei einem Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer. Alternativ kann ein größeres Peptid mit 11–25 Aminosäuren bei einem höheren Ladungszustand ionisieren, und kann mit einem Massenspektrometer mit einer hohen Massengenauigkeit leichter gesehen und gemessen werden. Proteomik ist durch Einbringen eines internen Standards in den Assay von der Identifizierung (qualitative Proteomik) zur Quantifizierung fortgeschritten. Ein interner Standard ist erforderlich, da sich die resultierende Peakhöhe oder Peakfläche im Massenspektrometer aus einer komplexen Funktion von Parametern ergibt (z. B. Peptidmenge, Peptidionisierung, Peptidfragmentierung, Ionensuppression usw.). Kein Algorithmus kann die Quantität eines Peptids aus der Fläche des massenspektroskopischen Peaks messen. Wenn eine bekannte Menge des internen Standards zu dem zu analysierenden Peptid zugegeben wird, wird die Menge des Peptids durch Vergleichen seiner Peakfläche mit der Peakfläche des internen Standards bestimmt.
Eine Ausführungsform ist ein beschriebenes Peptid, welches mit einer Markierung modifiziert ist. Solch eine Markierung, welche zur Modifizierung des Peptids verwendet wird, unterscheidet sich von der schweren Isotopenmarkierung, welche erforderlich ist oder optional ist, um den Universalreporter U bzw. den Reporter R zu modifizieren. Die Markierung kann jedoch ein schweres Isotop sein, wie nachfolgend im ersten Beispiel beschrieben wird.
Ein Beispiel für eine solche Markierung ist ein schweres Isotop. Ein Beispiel für eine solche Markierung ist eine Isotopenmarkierung. Solche Markierungen umfassen Formen der gleichen chemischen Struktur, worin jede Markierung ein stufenweise um 5 Da schwererer Gewicht aufweist. Bei der Peptidfragmentierung bricht die Markierung unter Freisetzung eines unterschiedlichen, spezifischen Reporterpeptids, welches ein unterschiedliches Gewicht aufweist.
Ein Beispiel für eine solche Markierung ist ein unterschiedliches Isotop des gleichen Peptids. Bei diesem Beispiel wird als Markierung ein Element verwendet, welches natürlicherweise mehrere Isotope besitzt, und worin die Isotope eine unterschiedliche Masse aufweisen. Beispielsweise kann Chlor verwendet werden, da Chlor zwei natürliche Isotope besitzt, welche sich durch 1 Da unterscheiden.
Ein Beispiel für eine solche Markierung ist eine Massedefekt-Markierung. Bei diesem Beispiel wird als Markierung ein Element verwendet, welches einen bekannten Massendefekt aufweist, wie etwa Brom oder Fluor. Die Verwendung einer Massendefekt-Markierung verschiebt das Reporterpeptid in eine Region des Massenchromatogramms, worin die meisten Isotope nicht beobachtet werden, manchmal als ein Massenruhebereich („mass quiet space”) bezeichnet. Dieses Beispiel ist geeignet, um die Sensitiviät und Spezifität eines Nachweises in einer Massenregion mit vielen anderen Hintergrund-Ionen zu verbessern.
Ein Beispiel für eine solche Markierung ist eine Retentionszeit-Markierung. Bei Verwendung einer Retentionszeit-Markierung wird das Reporterpeptid in eine Region des Massenchromatogramms verschoben, worin die meisten Peptide nicht beobachtet werden, manchmal als ein chromatographischer Ruhebereich („chromatographic quiet space”) bezeichnet. Dieses Beispiel ist geeignet, um die Gradienteneffizienz und Brauchbarkeit für eine verbesserte Auftrennung zu verbessern. Beispielsweise benötigt eine Probe mit einer frühen Elution von einer chromatographischen Säule bei Anwendung eines Lösungsmittels oder eines Lösungsmittelgradienten weniger Zeit und Ressourcen, wodurch die Effizienz verbessert wird. Bei der Verwendung ermöglicht diese Ausführungsform die Bestimmung sowohl des individuell angepassten Peptids als auch des Universalreporterpeptids U, durch Verwendung speziell eingestellter Chromatographiebedingungen bei kurzen Flüssigchromatographie-Analysen, d. h. bei Laufzeiten von weniger als einer Minute. Beispielsweise würde bei einer Probe mit einer späten Elution von einer Chromatographiesäule bei Anwendung eines Lösungsmittels oder eines Lösungsmittelgradienten erwartet, dass eine verringerte Kreuzkontamination auftritt, da in diesem Bereich des Gradienten weniger eluierende Peptide auftreten. In allen Fällen ist der Arbeitszyklus des Apparates nicht verschwendet, und die Sensitivität und quantitative Genauigkeit werden während der kritischen Gradientenzeiten nicht beeinträchtigt. Die Verwendung eines solchen gerichteten Systems erfordert eine Verifizierung mit einem Universalreporterpeptid U, von dem gezeigt wurde, dass es unter diesen Bedingungen effizient und vorhersagbar eluiert.
Als ein Beispiel einer individuellen Anpassung wird das Universalreporterpeptid U für eine Verwendung bei einer stabilen Isotopmarkierung mit Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) individuell angepasst. Stabile, isotopenmarkierte Aminosäuren werden lebenden Zellen zugeführt, und die markierten Aminosäuren werden in Polypeptide eingebaut. Das Universalpeptid ist gestaltet für eine Quantifizierung von Peptiden von Strukturproteinen, Chaperonen oder Housekeeping-Enzymen, um Proteinmengen zwischen Proben zu quantifizieren und normieren. Bei SILAC und den im Fachgebiet bekannten Variationen davon wird eine Massenspektrometrie verwendet, um Proteine zwischen Proben zu quantifizieren und zu vergleichen, und die Normierung von Proben und Messung der biologischen Variation mit Strukturproteinen, Chaperonen oder Housekeeping-Enzymen ermöglicht die Bearbeitung und den Vergleich einer großen Anzahl von Proben. Bei einer Ausführungsform ist das Universalreporterpeptid U individuell angepasst für eine Verwendung mit einer isobaren Markierung unter Verwendung entweder von Tandem-Massenmarkierungen (TMT) oder isobaren Markierungen für eine relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) durch Markierung einer Reihe von Universalreportern für die Quantifizierung von Peptiden von üblicherweise in Zellen und Gewebelysaten, Serum und Plasma, und in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten beobachteten Proteinen. TMT und iTRAQ besitzen die allgemeine Struktur M-F-N-R, worin M = Massenreporterregion, F = Region der spaltbaren Verbindung, N = Massennormalisierungsregion und R = proteinreaktive Gruppe. Isotope mit Substitutionen an verschiedenen Positionen bei M und N bewirken, dass jede Markierung eine unterschiedliche molekulare Masse in der M-Region aufweist mit einer entsprechenden Massenänderung in der N-Region, so dass der Satz an Markierungen das gleiche Gesamtmolekulargewicht aufweist. Nur wenn die TMT eine zweite oder dritte Fragmentierung durchläuft (wie etwa bei der Tandem-Massenspektrometrie MS/MS oder der Triple-Massenspektrometrie MS/MS/MS), sind sie unterscheidbar, wobei zur Quantifizierung der Peptide eine durch die Fragmentierung des Grundgerüstes erhaltene Sequenz und durch die Fragmentierung der Markierung erhaltene Massenreporter-Ionen benötigt werden. Bei iTRAQ und TMT werden Amingruppen in Proteinverdaus kovalent markiert, und bei einer Cysteinreaktiven TMT werden Thiole von Cysteinen markiert, was individuelle Verdaue mit eindeutigen Massenmarkierungen ergibt. Die markierten Verdaue werden dann gepoolt und in Peptidgrundgerüst- und Reporter-Ionen fragmentiert. Die Peptidgrundgerüst-Ionen werden zur Identifizierung des Proteins verwendet, von welchem sie stammen. Die Reporter-Ionen werden zur Quantifizierung dieses Proteins in jeder der kombinierten Proben verwendet. Die bei der Auffindung von Biomarkern zur Erzeugung von potentiellen Markern verwendeten massenspektrometrischen Verfahren SILAC, TMT und iTRAQ werden auf Vorrichtungen verwendet, welche die Hybridmassenspektrometer LTQ Velos (Thermo Scientific) und LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific) umfassen. Die potentiellen Marker werden dann weiter evaluiert und unter Verwendung von SRM (Selected-Reaction-Monitoring) in Zielanalysen angewendet, um die Quantifizierung von Peptidmarkern in vielen Proben anzuvisieren. Für die Bestätigung und Validierung wird das Universalreporterpeptid U, wie unten erläutert, individuell für eine Verwendung angepasst, mit den zuvor identifizierten Markern, für eine absolute Quantifizierung mit synthetischen stabilen, isotopenmarkierten Peptidstandards (HeavyPeptide AQUA und Variationen davon, Thermo Scientific), unter Verwendung von bestehenden erfassten Daten, um die vorläufige Auswahl für eine zielgerichtete Analyse zu automatisieren (Pinpoint Software, Thermo Scientific; TSQ Vantage Triple-Stage-Quadrupol-Massenspektrometer (Thermo Scientific)). Die Daten werden in ein integriertes Datenmanagementsystem für klinische Anwendungen eingegeben.
Eine Ausführungsform ist ein Universalreporterpeptid U, welches so synthetisiert wurde, dass es ähnliche (z. B. ±10% bis 20%) Eigenschaften (z. B. Retentionszeit, Ionisierung, optimale Fragmentierungsenergie, Nachweisgrenze, Verdauungseffizienz usw.) wie ein individuell angepasstes Peptid aufweist. Bei einem Verfahren unter Verwendung dieser Ausführungsform wird das Universalreporterpeptid U zur Beurteilung der Effizienz des Verdaus verwendet. Bei der Verwendung ermöglicht diese Ausführungsform eine Beurteilung des proteotypischen Peptids, und sowohl des nicht verdauten als auch verdauten individuell angepassten Peptids und des Universalreporterpeptids U. Die Effizienz des Verdaus des individuell angepassten und des Universalpeptids bezüglich der einzelnen Peptide wird dann zur Korrektur des Levels des quantifizierten proteotypischen Peptids verwendet, was eine genauere absolute Quantifizierung des Proteins von Interesse ermöglicht, und eine genauere Quantifizierung zwischen Proben durch eine Korrektur im Hinblick auf die Effizienz des Verdaus zwischen den Proben.
Eine Ausführungsform ist ein Satz von Universalpeptiden U. Dieser Satz von Universalpeptiden U koeluiert auf vorhersagbare Art und Weise. Die Peptide in dem Satz können eine gemeinsame Sequenz teilen oder nicht. Die Peptide in dem Satz besitzen stabile Isotope, welche an eindeutigen Positionen eingebracht sind, um die spezifische Quantifizierung jedes Peptids zu ermöglichen.
Eine Ausführungsform ist ein Universalreporter U, welcher nicht auf ein Peptid beschränkt ist, oder welcher überhaupt keinen Peptidbestandteil umfasst. Bei dieser Ausführungsform wird ein Universalpolymer U^polymer verwendet. Ein Beispiel für einen solchen nicht auf Peptide beschränkten Universalreporter U ist eine Sequenz von natürlichen und nicht-natürlichen Aminosäuren. Ein Beispiel für einen solchen nicht auf Peptide beschränkten Universalreporter U ist eine Desoxyribonukleinsäure-(DNA)Sequenz. Ein Beispiel für einen solchen nicht auf Peptide beschränkten Universalreporter U ist eine LNA-(„Locked nucleic acid”)Sequenz. Ein Beispiel für einen solchen nicht auf Peptide beschränkten Universalreporter U ist eine Peptidnukleinsäure (PNA). Ein Beispiel für einen solchen nicht auf Peptide beschränkten Universalreporter U ist eine Threosenukleinsäure (TNA). Wie im Fachgebiet bekannt ist, ist eine PNA ein künstlich synthetisiertes Polymer. Seine Struktur ist ähnlich wie die Struktur der Desoxyribonukleinsäure (DNA) und der Ribonukleinsäure (RNA), aber anders als DNA, welche eine Desoxyribosetriphosphatstruktur mit angehefteten Basen besitzt, oder als RNA, welche eine Ribosetriphosphatstruktur mit angehefteten Basen besitzt, besitzt die PNA eine sich wiederholende N-(2-Aminoethyl)-Struktur, verbunden durch Peptidbindungen, worin die Basen durch Methylencarbonylbindungen verbunden sind. Wie im Fachgebiet bekannt ist, besitzt eine TNA eine sich wiederholende Threosestruktur, verbunden durch Phosphodiesterbindungen. Wie im Fachgebiet bekannt ist, ist eine LNA eine modifizierte Ribonukleinsäure (RNA), worin die Ribose zwischen dem 2'-Sauerstoff und dem 4'-Kohlenstoff eine zusätzliche Bindung enthält, was die Stapelung der Basen steigert und die Nukleinsäurehybridisierung durch Erhöhung der Schmelztemperatur T_m beeinflusst.
Bei dieser Ausführungsform wird zu einer Probe ein isotopenmarkierter proteotypischer Analyt gegeben, welcher durch eine spaltbare Stelle mit einem Reporteranalyten R verbunden ist. Die Spaltung an der spaltbaren Stelle entkoppelt den Reporteranalyten R von dem proteotypischen Analyten, was äquimolare Konzentrationen jeweils vom proteotypischen Analyten und dem Reporteranalyten R in der Probe ergibt. Die massenspektroskopische Analyse wird ohne Aminosäureanalyse durchgeführt, unter Bestimmung der Konzentration des Reporteranalyten R, unter Verwendung einer Menge eines zu der Probe zugegebenen Universalpolymers U^polymer. Das Universalpolymer U^polymer besitzt die gleiche Aminosäure- oder Monomersequenz, aber eine unterschiedliche Atommasse als der Reporteranalyt R, aufgrund der Anwesenheit einer stabilen Isotopenmarkierung in dem Universalpolymer U^polymer.
Eine Ausführungsform ist eine Universalpeptidverbindung, eine Zusammensetzung, eine Formulierung und/oder ein Kit. Bei einer Ausführungsform kann das schwere proteotypische Peptid-Reporterpeptid R trocken formuliert werden. Bei einer Ausführungsform kann das schwere proteotypische Peptid-Reporterpeptid R in Lösung formuliert werden. Das schwere proteotypische Peptid-Reporterpeptid R wird stabilisiert und die Solubilisierung wird erleichtert durch die Formulierung mit einem nicht-reduzierenden Zucker (z. B. Sorbitol, Mannitol usw.), unter Verwendung von Verfahren, welche einem Fachmann bekannt sind. In dieser Form ist es in attomolaren oder femtomolaren Mengen stabil. Bei einer Ausführungsform ist das schwere proteotypische Peptid-Reporterpeptid R als eine Tablette formuliert, welche bei Raumtemperatur transportiert und gelagert werden kann und bei Bedarf für eine flüssige Messung leicht in Behälter übertragen werden kann. Dieses Format beseitigt Bedenken, dass das Peptid unspezifisch an eine Gefäßwand bindet oder dass die Verdampfung von Lösungsmittel Veränderungen der Peptidkonzentration ergibt. Diese Ausführungsform reduziert die Zahl der erforderlichen Manipulationen und verringert somit Fehlerquellen. Diese Ausführungsform erleichtert eine Automatisierung.
Bei einer Ausführungsform wird das schwere proteotypische Peptid-Reporterpeptid R für Anwendungen der Lebensmittelüberwachung verwendet. Universalpeptide werden verwendet, um Proteine von Rückständen von Nahrungsmittelallergenen nachzuweisen, wie etwa Mandel, Ei, Gliadin/Gluten, Haselnuss, Lupine, Casein, β-Lactoglobulin (BLG), Gesamtmilch, Senf, Erdnuss, Sesam, Schalentiere, Soja- und Walnuss und/oder Verunreinigungen, wie etwa Salmonella, E. coli, Viren, Protozoenparasiten, Prionen und andere Zoonosen, Mykotoxine und Aflatoxine. Universalpeptide werden in MS-basierten Tests zum Nachweis des Zielallergens oder Toxins in Bestandteilen, Flüssigkeiten, „Clean-in-Place”-Spülungen, fertigen Nahrungsmitteln und/oder auf Umgebungsflächen verwendet.
Bei einer Ausführungsform wird das schwere proteotypische Peptid-Reporterpeptid R in Biobanken verwendet. Forscher erkennen, dass eine einwandfreie Sammlung, Bearbeitung, Lagerung und Nachverfolgung von Bioproben für Untersuchungen betreffend Biomarker entscheidend ist. Die Forscher haben Bedenken, dass die in Biobanken gelagerte Information ungenau und unvollständig ist, und somit für die Forschung von fragwürdigem Nutzen, was zu störenden Verbindungen zwischen Proteinen, Genen und Metaboliten-Biomarkern führt. Die Ergänzung eines Qualitätskontrollschritts qualifiziert den Zustand jeder verwendeten Probe vor den Untersuchungen zu dieser Probe. Die Qualitätskontrolle basiert auf dem Einbringen von genauen und bekannten Mengen von Isotopen-Peptidstandards zu einer biologischen Probe vor der endgültigen Lagerung. Diese Peptide besitzen unterschiedliche proteolytische Degradationskinetiken, sind mit stabilen, schweren Isotopen markiert und sind mit vorhandenen MS-Technologien quantifizierbar. Bei der Nachfrage nach einer Biobankprobe wird die Menge jedes Peptidstandards mittels MS gemessen und zur Evaluierung der Probenqualität verwendet. Die Formulierung des schweren Peptids-Reporterpeptids R wird stabilisiert. Die Solubilisierung wird erleichtert durch eine Formulierung mit einem nicht-reduzierenden Zucker (z. B. Sorbitol, Mannitol usw.) unter Verwendung von Verfahren, welche einem Fachmann bekannt sind. In dieser Form ist die Qualitätskontrollprobe in Attomol- oder Femtomolmengen stabil.
Wenn das zu quantifizierende Protein oder Polypeptid beispielsweise als A bezeichnet wird, wird der interne Standard als A* bezeichnet, wobei * die markierte Form bezeichnet, wenn das zu quantifizierende Protein oder Polypeptid als B bezeichnet wird, wird der interne Standard als B* bezeichnet usw. Bei einer Ausführungsform kann der interne Standard ein nicht-proteotypisches Peptid sein, beispielsweise kann ein β-Amyloidpeptid als ein interner Standard zur Quantifizierung eines β-Amyloidpeptids in einer biologischen Probe verwendet werden. Beispielsweise können die folgenden β-Amyloidpeptide und Peptidfragmente verwendet werden, die fettgedruckten Aminosäuren bezeichnen Mutationen in der β-Amyloidpeptidsequenz:
Beispiel 1
Stabile, isotopenmarkierte Peptide mit einem Universalreporterpeptid U und mehreren verbundenen Peptiden wurden angewendet, um Proteinbiomarker in klinischen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren, mit einem Schwerpunkt auf Markern für Lungenkrebs.
Für die Bewertung der Ausbeute des Probenpräparationsverfahrens wurden schwere, isotopenmarkierte synthetische Polypeptidstandards (umfassend bis zu drei proteotypische Peptide und einen Universalreporter U) von humanen Plasmaproteinen (LDH, NSE und Myo) vor und nach einer Proteolyse in Proben untergemischt. Die HPLC-MS-Analysen wurden im SRM-Modus auf einer Triple-Quadrupol-Apparatur (TSQ Ventage, ThermoFisher Scientific) durchgeführt. Eine Reihe von verbundenen Referenzpeptiden wurde auf Basis einer Liste von zuvor identifizierten Kandidaten synthetisiert. Die synthetischen Polypeptide wurden von ThermoFisher Scientific (Ulm, Deutschland) erhalten.
Das Reporterpeptid R wurde mit einer tryptischen Spaltungsstelle am C-Terminus ausgestattet. Die Kalibrierungskurven für die Universalreporterpeptide U wurden unter Verwendung von Verdünnungsreihen gebildet. Der relative Response-Faktor jedes Peptids im Vergleich zum Reporter wurde ohne Weiteres nach einer Trypsinbehandlung unter Ausnutzung der 1:1-Stöchiometrie bestimmt.
Um den Grundsatzbeweis („Proof-of-principle”) zu führen, wurde eine Reihe von Proteinen ausgewählt, welche einen Hinweis auf Lungenkrebs geben. Für die genaue Quantifizierung von spezifischen Proteinen wurden drei synthetische verbundene proteotypische Polypeptide erzeugt und analysiert. Es wurden Plasmaproben von Lungenkrebspatienten und Kontrollen analysiert.
Die verbundenen synthetischen Polypeptide mit einem Universalreporter ermöglichten eine genaue Bestimmung der Mengen der Zielproteine in der Probe unter gleichzeitiger Verwendung von mehreren Referenzpeptiden. Dieser Quantifizierungsansatz wurde ohne Weiteres in großem Maßstab in einem gezielten Proteomik-Arbeitsablauf umgesetzt.
Beispiel 2
Es wurden stabile, isotopenmarkierte Peptide mit einem Universalreporterpeptid U und mehrere verbundene Peptide verwendet, um Proteinbiomarker in klinischen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren, wobei ein Schwerpunkt auf Markern für Blasenkrebs lag.
Exogene Proteine von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) (ADH), Enolase und Carboxypeptidase) und Mensch (LDH, NSE, Myo) wurden als interne Standards in Urinproben zugegeben. Die isotopenmarkierten synthetischen Polypeptidstandards, welche proteotypische Peptide des Zielproteins und ein Universalreporterpeptid U darstellten, wurden vor der Proteolyse untergemischt. Die Urinproben wurden durch Proteinpräzipitation, Reduktion/Alkylierung, Trypsinproteolyse und Entsalzung unter Verwendung von C18-Kartuschen aufbereitet. Nach der Proteolyse wurde ein zweiter Satz von isotopenmarkierten synthetischen Peptiden zugegeben.
Die LC-MS/MS-Analysen wurden durchgeführt mittels RP-HPLC (Dionex), gekoppelt mit einem Triple-Quadrupol-Apparat (TSQ Vantage, ThermoFisher Scientific), betrieben im SRM-Modus. Für jedes Zielpeptid wurden mehrere Übergänge beobachtet. Isotopenmarkierte synthetische Polypeptide wurden von ThermoFisher Scientific (Ulm, Deutschland) erhalten.
Um die Methodik zu etablieren, wurden stabile, isotopenmarkierte Dipeptide mit einem Universalreporter U synthetisiert. Das Reporterpeptid R wurde mit einer tryptischen Spaltungsstelle am C-Terminus versehen. Die Kalibrierungskurven für die Universalreporterpeptide U wurden unter Verwendung von Verdünnungsreihen erstellt. Parallel wurde der relative Response-Faktor jedes Peptids im Vergleich mit dem Reporter nach einer Trypsinbehandlung unter Ausnutzung der 1:1 Stöchiometrie bestimmt. Die LC-MS-Analysen wurden im SRM-Modus durchgeführt.
Um die Methodik zu evaluieren, wurden genaue Mengen von Referenzpolypeptiden in die Urinproben untergemischt, mit Trypsin verdaut und mittels LC-SRM analysiert, um die humanen Zielproteine zu quantifizieren. Vorläufige Ergebnisse umfassten eine Analyse des Insulin-like-growth-factor-binding-protein-7 in Urinproben unter Verwendung von zwei einzelnen synthetischen, stabilen, isotopenmarkierten Peptiden, markiert mit einem Universalreporter U: Reporter-HEVTGWVLVSPLSK (SEQ ID NO. 46) und Reporter-ITVVDALHEIPVK (SEQ ID NO. 47). Die Verdünnungskurven wurden mittels gepoolter Urinproben erzeugt, um die Menge des entsprechenden Proteins genau zu bestimmen: die tatsächlich erhaltenen Konzentrationen betrugen 1,49 ng/ml bzw. 1,69 ng/ml für die zwei Peptide.
Beispiel 3
Um die Anwendbarkeit des Verfahrens weiter zu belegen, wurden durch Verbindung mehrerer Peptide große synthetische Polypeptide erzeugt, welche jeweils die Proteine von Interesse darstellen. Es wurden pro Protein drei proteotypische Peptide mit geeigneten massenspektroskopischen Eigenschaften (Vorläufer m/z, Ionisierungseffizienz, Retentionszeit, MS/MS-Spektrum) ausgewählt, um die verbundenen Standards herzustellen. Die Referenzpolypeptide, welche alle einen Universalreporter enthielten, ermöglichten eine Messung der genauen Menge von mehreren Referenzpeptiden in einem LC-MS-Lauf.
Beispiel 4
Das erfindungsgemäße Verfahren reduzierte die Verwendung der Massenspektrometrie auf die Erzeugung einer Kalibrierungskurve, was Einsparungen sowohl in der Verwendung des Apparatur, der Betriebszeit als auch der Betriebseffizienz ergibt. Bei der Herstellung einer Kalibrierungskurve werden unterschiedliche Peptidkonzentrationen in das LC-MS-System injiziert. Eine typische Kalibrierungskurve erfordert sechs Peptidinjektionen mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen. Jede Injektion wird dreifach durchgeführt (drei Wiederholungen). Die Gesamtzahl der LC-MS-Analysen zur Erzeugung einer Kalibrierungskurve beträgt somit mindestens 18 Analysen.
Das Peptid LVALV*R* (SEQ ID NO. 48) wurde injiziert (* bezeichnet eine schwere, isotopenmarkierte Aminosäure). Die folgenden Peptidisomere von SEQ ID NO. 18 wurden synthetisiert: LVALVR*, LV*ALV*R*, LVA*L*V*R*; LV*A*L*V*R*; L*V*A*L*V*R* und LVA*LVR (es sind andere Kombinationen möglich) und in äquimolarer Konzentration bereitgestellt. Zwei Gemische dieser synthetisierten Peptide wurden hergestellt. Jedes Gemisch besaß eine unterschiedliche Konzentration des schweren Isotops: ein Gemisch besaß eine dreifache oder dreimalige Verdünnung jedes Isomers, das andere Gemisch besaß eine fünffache oder fünfmalige Verdünnung zwischen jedem Isomer. Die Endgemische mit den Isomeren in unterschiedlichen Konzentrationen wurden in das LC-MS-System injiziert. Eine einzelne Injektion mit drei Wiederholungen war ausreichend, um eine vollständige Kalibrierungskurve zu erzeugen. Somit verringerte dieses Verfahren die für die Erzeugung der Kalibrierungskurve erforderliche Zeit und verbesserte auch die Variationskoeffizienten zwischen den drei Wiederholungen.
Beispiel 5
Isotopenmarkierte Peptide als interne Standards
Tabelle 1 listet humane Urin- und Hefeproteine und drei ausgewählte proteotypische Peptide zur Gestaltung von HeavyPeptide IGNIS^TM auf. Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, wurden zehn HeavyPeptide IGNIS^TM gestaltet, welche 30 proteotypischen Peptiden von neuen Proteinen (sieben humane Proteine, drei Hefeproteine) entsprachen. Stabile, isotopenmarkierte Aminosäuren von jedem HeavyPeptide IGNIS^TM (Reinheit > 95%, lyophilisiert in Sorbitol) wurden ausgewählt, um eine für eine MS-Analyse ausreichende Massenveränderung zu haben, mit den endogenen Peptiden und den entsprechenden individuellen synthetischen, stabilen, isotopenmarkierten Peptiden mit einem C-terminalen ¹⁵N- und ¹³C-markierten Arginin- oder Lysinrest (Reinheit, lyophilisiert > 99 Atom-% isotopische Anreicherung); Tabelle 2 listet die vollständige Sequenz von HeavyPeptide IGNIS^TM auf, wobei die Aminosäuren mit stabilen Isotopen gekennzeichnet sind.
Die proteotypischen Peptide wurden von Proteomik-Shotgun-Experimenten ausgewählt. Die beschriebene Zahl der Beobachtungen wurde als stellvertretender Indikator für die Häufigkeit von Proteinen in einem spezifischen Proteom verwendet. Die Einzigartigkeit des Peptidreporters wurde verifiziert durch Vergleichen der Aminosäuresequenz LVALVR mit der UniProt-Datenbank; diese Sequenz ist nicht mit einem Protein verbunden.
Kalibrierungskurve des Peptidreporters
Die Kalibrierungskurve wurde durchgeführt durch Mischen einer Lösung des Universalreporterpeptids U (Reinheit > 97%) mit verschiedenen Isotopenmarkierungen (R für schweres Arginin (¹³C₆, ¹⁵N₄); A für schweres Alanin (¹³C₃, ¹⁵N); L für schweres Leucin (¹³C₆, ¹⁵N); V für schweres Valin (¹³C₄, ¹⁵N)). 5 μl LVALVR (0,5 fmol/μl), 15 μl LVALVR (0,5 fmol/μl); 4,5 μl LVALVR (5 fmol/μl); 13,5 μl LVALVR (5 fmol/μl); 40,5 μl LVALVR (0,5 fmol/μl); 12,2 μl LVALVR (50 fmol/μl); 36,5 μl LVALVR (50 fmol/μl); 109,4 μl LVALVR (50 fmol/μl); und 13,6 μl 0,1% (v/v) Ameisensäure (in Wasser) wurden gemischt, um ein Endvolumen von 250 μl zu erhalten. Die Konzentrationen dieser Peptide in Lösung sind; 10,0 atmol/μl; 30,0 atmol/μl; 90,0 atmol/μl; 270,0 atmol/μl; 810,0 atmol/μl; 2,4 fmol/μl; 7,3 fmol/μl bzw. 21,9 fmol/μl. Die Analyse der Kalibrierungskurve wurde dreifach durchgeführt mit einem LC-SRM-Lauf auf der TSQ-Plattform. Die zwei intensivsten Übergänge des SRM-Assays wurden im Hinblick auf das Reporterpeptid überwacht.
Die Ergebnisse der „Verdünnungreihen” des Universalreporterpeptids U = LVALVR sind in 9 gezeigt. Verschiedene Isotopenmarkierungen im Bereich von 0,01 fmol (injiziert) bis 21,9 fmol (injiziert) werden in linearen (9A) und logarithmischen Skalen (9B) gezeigt. Die Verdünnungsreihe wurde in einem einzigen LC-MS-Lauf gemessen. Das Verhältnis der Peakflächen wurde aus dem Mittelwert von zwei SRM-Übergängen bestimmt. Jeder Datenpunkt entspricht der dreifach gemessenen Verdünnungsreihe. Zwischen 10,0 atmol/μl und 21,9 fmol/μl wurde eine lineare Standardkurve beobachtet (r² > 0,999).
Proteolyse von HeavyPeptide IGNIS^TM
Jedes HeavyPeptide IGNIS^TM wurde mit Acetonitril (ACN)/Wasser (15/85) (vol/vol) solubilisiert, um eine finale Proteinkonzentration von 5 pmol/μl zu erhalten, und dann für 20 Minuten beschallt. HeavyPeptide IGNIS^TM wurden einzeln verdaut mit Trypsin 1:20 (w/w) (Promega, Madison WI) für 3,5 Std. bei 38°C unter Bewegung (1400 rpm). Der kinetische Verdau wurde überwacht durch Extraktion des Reaktionsgemischs alle 15 Minuten. Um den Verdau zu stoppen, wurden alle Proben in 0,1% v/v Ameisensäure verdünnt, um eine finale Peptidkonzentration von 50 fmol/μl für die Analyse auf LC-MS (im SRM-Modus) zu erhalten.
Für die quantitativen Messungen mit der TSQ-Plattform wurden alle kinetischen Punkte des HeavyPeptide IGNIS^TM-Verdaus stöchiometrisch ergänzt mit den entsprechenden einzelnen synthetischen, stabilen, isotopenmarkierten Peptiden mit einem C-terminalen ¹⁵N/¹³C-markierten Arginin- oder Lysinrest (AquaUltimate) und dem Universalreporterpeptid U = LVALVR. Die zwei beim SRM-Assay beobachteten intensivsten Übergänge wurden bei allen Peptiden überwacht. 10 zeigt die Proteolyseeffizienz von HeavyPeptide IGNIS^TM UROM. Die proteolytische Kinetik von HeavyPeptide IGNIS^TM UROM wurde erstellt mittels nicht-linearer Regression von jedem schweren proteotypischen Peptid (UROM A, UROM B und UROM C) vom verdauten HeavyPeptide IGNIS^TM UROM/Universalreporterpeptid U Flächenverhältnis gegen die Proteolysezeit. Die letzten Punkte der Kinetik wurden verwendet, um die genaue Menge von jedem HeavyPeptide IGNIS^TM zu definieren.
Urinsammlung und Probenbehandlung
Es wurden Urinproben vom Mittelstrahl von zehn nicht rauchenden gesunden Freiwilligen gesammelt, fünf Frauen und fünf Männer im Alter von 30–40 Jahren. Bei keinem der Patienten gab es eine Vorgeschichte einer Nierenfunktionsstörung oder einer Arzneimitteleinnahme während der Probensammlung. Der Urin wurde bei 1000 g relativer Zentrifugenbeschleunigung (rcf) für 20 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 19 C–22 C) zentrifugiert. Die Überstände 1000 g wurden miteinander gepoolt, in Aliquotes in 50 Falcon^TM-Röhren portioniert und bei –80°C gelagert.
Die Menge an Urinprotein wurde durch einen Pyrogallolassay abgeschätzt. Proben mit entsprechend 250 μg Urinprotein wurden präzipitiert mit 100% Stammlösungen von Acetonitril (für HPLC) mit einem Verhältnis von 1:5 (v/v). Die Proben wurden bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Nach der Präzipitation wurden die Urinproben bei 14000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit Acetonitril gewaschen, luftgetrocknet und mit 250 μl 8 M Harnstoff und 0,1 M Ammoniumbicarbonat resuspendiert. Die Proben wurden mit 20 mM Dithiothreitol in 50 mM Ammoniumbicarbonat bei 37°C reduziert, bei 800 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, dann mit 80 mM Jodacetamid in 50 mM Ammoniumbicarbonat bei 37°C alkyliert und bei 800 rpm für 30 min zentrifugiert. Die Volumenproben wurden mit 100 mM BA bei 2 M Harnstoff eingestellt. Die Proben wurden dann mit Trypsin (Promega, Madison WI) unter Verwendung eines Verhältnisses von 1:20 (w/w) bei 37°C über Nacht verdaut. Der Verdau wurde gestoppt durch Zugabe von Ameisensäure, um einen pH von 2–3 zu erhalten. Sep-Pak C18-Umkehrphasenkartuschen, 100 mg (Waters, Milford MA) wurden verwendet, um die Proben nach dem Proteinverdau zu reinigen und zu entsalzen. Die Peptide wurden unter Verwendung von 1 ml 50% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure eluiert, getrocknet und bei –20°C bis zur LC-MS-Analyse gelagert.
Kalibrierungskurve von HeavyPeptide IGNIS^TM und AquaUltimate bei Urinproben
Die Verdünnungskurven der schweren proteotypischen Peptide von verdautem HeavyPeptide IGNIS^TM wurden in einem Gemisch der verdauten gepoolten Urinprobe (1 ug/ml Urinproteine) durchgeführt, welches drei verdaute exogene Hefeproteine (Carboxypeptidase Y, Enolase 1 und Alkoholhydrogenase 1) mit jeweils 100 ng/ml enthielt. Jede Verdünnungsreihe entsprach drei Datenpunkten über einen Konzentrationsbereich von 0,002 fmol/ul bis 40 fmol/ul. Die Proteinmengen der untergemischten verdauten Hefeproteine und humanen Urinproteine wurden mittels iSRM bestimmt, unter Verwendung der schweren proteotypischen Peptide vom verdauten HeavyPeptide IGNIS^TM. 11 zeigt eine Verdünnungskurve der schweren proteotypischen Peptide vom verdauten HeavyPeptide IGNIS^TM KNG1 von 0,002 fmol/μl bis 40 fmol/μl auf einer logarithmischen Skala. Das Verhältnis der Peakflächen wurde aus dem Mittelwert der zwei SRM-Übergänge bestimmt. Jeder Datenpunkt entsprach der Verdünnungsreihe, welche dreifach gemessen wurde. 11 und Tabelle 3 zeigen Daten für HeavyPeptide IGNIS^TM Kininogen 1 (KNG 1).
LC-MS-Bedingungen
Urin- und tryptische Hefepeptide wurden auf einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer TSQ Vantage (ThermoFisher, San Jose CA) analysiert. Die Apparate waren mit einer Nanoelektrospray-Ionenquelle ausgerüstet. Die chromatographische Auftrennung der Peptide wurde auf einem im Nanofluss-Modus betriebenen Hochdurchsatz-Flüssigchromatographen Ultimate 3000 (Dionex, Niederlande) durchgeführt. Die Proben wurden auf eine Trap-Säule (Acclaim PepMap C18, 3 μm, 100 Ǻ, 0,075 × 20 mm, Dionex) geladen und aufgetrennt auf einer analytischen Säule (Acclaim PepMap^® RSLC C18, 2 μm, 100 Ǻ, 0,075 × 150 mm, Dionex), gekoppelt mit einem PicoTip^TM Elektrospray-Emitter (30 μm) (New Objective, Woburn MA), bei gleichbleibend 1,2 kV. Die Säulentemperatur wurde bei 35°C festgelegt. Die Peptide wurden mit einem linearen Gradienten von Acetonitril/Wasser mit 0,1% Ameisensäure bei einer Fließrate von 300 nl/min aufgetrennt. Es wurde ein Gradient von 2% bis 35% Acetonitril in 33 Minuten verwendet. Ein μl jeder Probe wurde injiziert. Das Massenspektrometer wurde mit i-SRM (intelligentes Selected-Reaction-Monitoring) betrieben. Für die Erfassungen betrug das Massenselektionsfenster von Q1 und Q3 0,7 Unit Massenauflösung. Es wurde ein Erfassungszeitfenster von 2 min um die Elutionszeit des Peptids herum festgesetzt. Als Kollisionsgas wurde Argon mit einem nominalen Druck von 1,5 mTorr verwendet. Die Kollisionsenergien jedes Übergangs wurden berechnet gemäß den folgenden Gleichungen: CE = 0,033·(m/z) + 1,8 und CE = 0,038·(m/z) + 2,3 (CE, Kollisionsenergie und m/z Verhältnis Masse zu Ladung), für zweifach bzw. dreifach geladene Vorläufer-Ionen. Für die i-SRM-Erfassung wurden zwei primäre und sechs sekundäre Fragment-Ionen pro Peptid ausgewählt basierend auf dem in einer Datenbank gespeicherten vollständigen MS/MS-Spektrum. Die Scanzeit für die getriggerten SRM-Messungen betrug 200 ms. Der dynamische Ausschluss für das Triggern des datenabhängigen SRM wurde mit einer Schwellenwertintensität von 100 Zählern ermöglicht, bei einer Wiederholungsanzahl von drei Zyklen und einem dynamischen Ausschluss von 20 Sekunden. Die i-SRM-Daten wurden unter Verwendung einer Pinpoint-Software (Thermo Fisher, San Jose CA) verarbeitet.
Beispiel 6
In Tabelle 4 werden die Identifizierungen und Charakterisierungen für ausgewählte HeavyPeptide IGNIS^TM-Peptide von Mensch und Hefe aufgelistet, welche wie offenbart verwendet wurden. Die Peptide lagen in einer lyophilisierten Formulierung vor, Reinheit > 95%. Das Universalreporterpeptid U war LVALVR mit einer Massendifferenz (delta Masse) gegenüber der natürlichen Sequenz = 16. In Tabelle 5 werden kommerziell erhältliche Peptide aufgelistet, welche die gleiche Sequenz, aber eine andere Masse besitzen aufgrund eines Unterschieds in der schweren, markierten Aminosäure, welche als zusätzliche Peptide in dem offenbarten Verfahren verwendet werden können.
Die Anmelder ziehen durch Verweis das Material ein, welches in dem begleitenden computerlesbaren Sequenzprotokoll mit dem Titel „078672_3.txt” enthalten ist, welches am 31. Mai 2011 erstellt wurde und 31 227 Byte groß ist.

Tabelle 5
Die in der Beschreibung gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen sind lediglich spezielle Ausführungsformen des Erfinders, eines Fachmanns, und sind in keiner Weise einschränkend. Somit können verschiedene Veränderungen, Modifikationen oder Abänderungen dieser Ausführungsformen vorgenommen werden, ohne von der Erfindung im Umfang der folgenden Ansprüche abzuweichen.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 03/016861 [0002, 0041]
WO 2003/046148 [0039]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Krokhin, Molecular and Cellular Proteomics 3 (2004) 908 [0017]
Spicer et al. (2007) [0050]
”Sequence-specific retention calculator. A family of peptide retention time prediction algorithms in reversed-phase HPLC: applicabillity to various chromatographic conditions and columns”. Anal Chem. 79 (22): 8762–8 [0050]

Claims

Verfahren zur massenspektrometrischen (MS) Quantifizierung eines Analyten, umfassend Aufbereiten einer schweren, isotopenmarkierten Sequenz oder eines Teils davon, welche nach MS-Dissoziation in eine vorhersagbare Reihe von Ionen fragmentiert, aus einer Probe mit einem Analyten, worin der Analyt eine bekannte, definierte Sequenz aufweist, zur speziellen Identifizierung und Quantifizierung des Analyten, worin die Sequenz spaltbar mit einer Reportersequenz R verbunden ist; Bereitstellen eines schweren, isotopenmarkierten Universalreporters U mit einer Sequenz, welche identisch ist mit der Sequenz des Reporters R, jedoch unabhängig von der Sequenz des Analyten, Durchführen einer Spaltung, und Quantifizieren des Universalreportes U, um den Reporter R zu quantifizieren, welcher in äquimolarer Konzentration vorliegt wie der schwere, isotopenmarkierte Analyt, wobei die Menge des Analyten in der Probe bestimmt wird.
Massenspektrometrisches Verfahren, umfassend Quantifizieren eines proteotypischen Peptids in einer Probe unter Verwendung eines isotopenmarkierten Universalreporterpeptids U mit einer Peptidsequenz, welche identisch ist mit der Sequenz eines Reporterpeptids R, jedoch unabhängig von der Sequenz des proteotypischen Peptids; Spalten eines schweren, isotopenmarkierten proteotypischen Peptids, welches spaltbar mit dem Reporterpeptid R verbunden ist; und Verwenden des Universalreporterpeptids U zur Quantifizierung des Reporterpeptids R, welches in äquimolarer Konzentration vorliegt wie das schwere, isotopenmarkierte proteotypische Peptid, zur Bestimmung der Menge des protetypischen Peptids in Ermangelung einer Aminosäureanalyse.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–2, durchgeführt mittels einer einzelnen Reaktion mit mindestens zwei verbundenen proteotypischen Peptiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, durchgeführt in einer einzelnen Reaktion mit mindestens drei verbundenen proteotypischen Peptiden gemäß 4.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, durchgeführt in einer einzelnen Reaktion mit mindestens zwei verbundenen proteotypischen Peptiden, worin jedes proteotypische Peptid spaltbar mit einem unterschiedlichen Reporterpeptid R und mit einem einzelnen Universalreporterpeptid U verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, durchgeführt in einer einzelnen Reaktion mit mindestens drei verbundenen proteotypischen Peptiden, worin jedes proteotypische Peptid spaltbar mit einem unterschiedlichen Reporterpeptid R und mit einem einzelnen Universalreporterpeptid U verbunden ist, gemäß 5.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Universalreporter U ein Polymer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, worin das Universalreporterpeptid U ein Retentionszeit-Kalibrierungspeptid ist, ausgewählt aus:
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Peptid mit einem in die C-terminale Aminosäure eingefügten Isotop verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Peptid mit einem in eine andere Aminosäure als die C-terminale Aminosäure eingefügten Isotop verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–10, worin das Universalreporterpeptid U mindestens eine modifizierte Aminosäure enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die modifizierte Peptidsequenz des Universalreporterpeptids U bei einer chromatographischen Auftrennung eine unterschiedliche Retetionszeit zur Folge hat wie bei einem nicht modifizierten Universalreporterpeptid U.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, worin an den Universalreporter U eine Markierung angefügt wird, welche bei einer chromatographischen Auftrennung eine unterschiedliche Retetionszeit zur Folge hat wie bei einem nicht modifizierten Universalreporter U.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, worin der Universalreporter U vor dem Spaltungsschritt zu der Probe zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, worin der Universalreporter U nach dem Spaltungsschritt zu der Probe zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–15, weiter umfassend Zugeben von mindestens einem Bestandteil, welcher die Wasserlöslichkeit des Analyten verbessert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–15, weiter umfassend Zugeben von mindestens einem Bestandteil, welcher den Nachweis des Analyten verbessert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–15, weiter umfassend Zugeben von mindestens einem Bestandteil, welcher die Stabilität des Analyten verbessert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–18, weiter umfassend Markieren des Universalreporters U und des Reporters R mit einem Fluorophor und/oder Chromophor, und Messen des Absorptionsvermögens des Fluorophors und/oder Chromophors.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–19, worin der Universalreporter U mindestens ein Tryptophan enthält, und worin der Universalreporter U durch Messen des Absorptionsvermögens unter Verwendung des spezifischen Extinktionsfaktors von Tryptophan quantifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, worin als Reporterpeptid R zur Verbesserung der Löslichkeit die Sequenz PVVVPR (SEQ ID NO: 1) oder die Sequenz LVALVR (SEQ ID NO: 2) verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–21, welches in einem Multiplex-Assay durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–21, worin der Reporter R eine schwere Isotopenmarkierung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–21, worin der Reporter R keine schwere Isotopenmarkierung aufweist.
Universalreporterpeptid U mit der gleichen Aminosäuresequenz, aber einer aufgrund der Anwesenheit einer schweren Isotopenmarkierung unterschiedlichen Atommasse wie ein Reporterpeptid R, welches spaltbar mit einem isotopenmarkierten proteotypischen Peptid verbunden ist, welches in einer Probe quantifiziert werden soll, worin das Universalreporterpeptid U eine im wesentlichen gleiche chromatographische Retentionszeit aufweist wie ein in einer Probe zu quantifizierendes proteotypisches Peptid.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 25 als Reporter für eine Spaltung zwischen einem Reporterpeptid R und einem isotopenmarkierten proteotypischen Peptid.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 25 als Reporter für eine Elution in einer Region eines chromatographischen Gradienten, worin die meisten Peptide nicht eluieren.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 25 als Reporter der Vorhersagbarkeit oder/und Effizienz einer Chromatographie.
Array für eine Multiplex-Analyse, umfassend ein einzelnes Universalreporterpeptid U, welches geeignet ist für eine Quantifizierung mehrerer Reporterpeptide R mit der gleichen Aminosäuresequenz, aber einer aufgrund der Anwesenheit eines schweren Isotops unterschiedlichen Atommasse als das Universalreporterpeptid U, worin jedes Reporterpeptid mit einem unterschiedlichen isotopenmarkierten proteotypischen Peptid spaltbar verbunden ist, welches in einer Probe quantifiziert werden soll.
Array nach Anspruch 29, worin das Universalreporterpeptid U an mindestens einer anderen Aminosäure als der C-terminalen Aminosäure eine schwere Isotopenmarkierung aufweist.
Kit zur Quantifizierung von Proteinen, Polypeptiden oder Peptiden in einer Probe, worin das Kit umfasst: eine nicht definierte Menge eines nicht markierten Reporterpeptids R mit einer definierten Aminosäuresequenz, welches spaltbar verbunden ist mit einem isotopenmarkierten proteotypischen Peptid, eine definierte Menge eines isotopenmarkierten Universalreporterpeptids U mit genau der definierten Aminosäuresequenz, aber einer unterschiedlichen Atommasse wie das Reporterpeptid R, und Anleitungen zum Quantifizieren der Proteine, Polypeptide oder Peptide in der Probe mittels Massenspektrometrie unter Verwendung des Kits.
Kit nach Anspruch 31, worin die Anleitungen die Verwendung der Konzentration des Universalreporterpeptids U zu Quantifizierung des Reporterpeptids R fordern, worin die Menge des Reporterpeptids R gleich ist wie das in der Probe nachzuweisende Peptid.
Kit zum Quantifizieren von Proteinen, Polypeptiden oder Peptiden in einer Probe, worin das Kit umfasst: (a) ein einzelnes Universalreporterpeptid U, geeignet zur Quantifizierung von mehreren Reporterpeptiden R, durch das Vorliegenden der gleichen Aminosäuresequenz, aber einer unterschiedlichen Atommasse aufgrund der Anwesenheit eines schweren Isotops, worin das Universalreporterpeptid U weiter ein stabiles Isotop bei einer definierten Aminosäure in der Sequenz umfasst, (b) eine Position der Stelle des stabilen Isotops in der Aminosäuresequenz, (c) eine Informationen über das Elutionsschema von einer Chromatographiesäule, und (d) Anweisungen für die Verwendung des Universalreporterpeptids U zur spezifischen Quantifizierung der Reporterpeptide R.
Kit nach Anspruch 33, worin die Anleitung für eine Verwendung der Universalpeptide U in einem Multiplex-Assay geeignet ist.
Zusammensetzung eines schweren, isotopenmarkierten proteotypischen Peptids, verbunden mit einem Reporterpeptid R, worin eine Spaltungsstelle dazwischen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 35, umfassend mindestens einen Hilfsstoff, welcher eine Lösung ergibt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35–36, weiter umfassend ein Stabilisierungsmittel.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35–37, weiter umfassend einen nicht-reduzierenden Zucker.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 35, 37–38, formuliert als Tablette.