DE19724791B4

DE19724791B4 - Thrombin hemmende Peptide, deren Verwendung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

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Publication number: DE19724791B4
Application number: DE19724791A
Authority: DE
Inventors: Christiane Dr.-Chem. Noeske-Jungblut; Ursula Dr.-Phys. Egner; Peter Dr.-Biochem. Donner; Wolf-Dieter Dr. Schleuning; Wolfram Dr.-Chem. Bode; Pablo Fuentes Dipl.-Phys.Dr. Prior
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Paion Deutschland GmbH
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1997-06-06
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2017-06-07
Also published as: JP2002506432A; WO1998055506A2; WO1998055506A3; DE19724791A1; EP0983301A2

Abstract

Peptide der allgemeinen Formel I

in der
Y¹ Phe, Lys, Cys und Orn und
Y² Asp, Cys und Glu sind, und auch Y¹ die Bedeutung von Y², und Y² die Bedeutung von Y¹ hat, wobei Y¹ und Y² über eine Seitenkette oder ein beta-turn Mimetikum miteinander verknüpft sind und
X^1-14 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn, Cit, beta -Ala, homo-Cys, homo-Ser, Gaba, Can, Beta -CN-Ala, OH- Pro, OH-Lys, N-Met-Lys, Met-His, Desmosin und Djenkolsäure ist, die über Seitenketten miteinander verbunden sein können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, deren Verwendung zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, sowie sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.

Die Protease Thrombin hat eine Schlüsselrolle bei der Blutgerinnung. Sie spaltet Fibrinogen zu Fibrin, das dann ein Blutgerinnsel bildet. Dies führt unter physiologischen Bedingungen zu einem Blutungsstop und einem Wundverschluß. Unter pathologischen Zuständen jedoch, wenn z. B. Gefäßschädigungen aufgrund von arteriosklerotischen Veränderungen oder bedingt durch einen Herzinfarkt vorliegen, kann es zu einem vollständigen Gefäßverschluß kommen. Dies äußert sich z. B. im Auftreten von Thrombosen oder einem Herzinfarkt. Deshalb werden Thrombininhibitoren zur Thrombosebehandlung eingesetzt.

Ein bekannter Thrombininhibitor ist das Protein Hirudin, das ursprünglich aus Blutegeln gewonnen wurde (Markwardt, F. (1957) Z. Physiol. Chem. 308, 147-156). Seine dreidimensionale Struktur im Komplex mit Thrombin ist bekannt (Rydel, T. J. et al. (1990) Science 249, 277-280). Ein ebenso wirksamer Inhibitor ist das aus einer Raubwanze isolierte Triabin (Noeske-Jungblut, C. et al (1995) J Biol Chem 270, 28629-28634). Diese beiden Inhibitoren unterscheiden sich in ihrer Wirkungsweise. Während das Hirudin an zwei Stellen des Thrombins bindet, dem aktiven Zentrum und einer sogenannten Anionenbindungsstelle, bindet das Triabin nur an der Anionenbindungsstelle. Das aktive Zentrum wird in diesem Fall nicht blockiert; es wird aber trotzdem die Fibrinogenspaltung inhibiert, da für die Spaltung die Bindung des Fibrinogens an diese Anionenbindungsstelle notwendig ist. Ein vom Hirudin abgeleitetes Peptid ist das Hirulog, das ebenso wie Hirudin das aktive Zentrum und die Anionenbindungsstelle des Thrombins blockiert. (Maraganore, J.M. und Bourdon, P. (1990) Biochemistry 29, 7095-7101). Es ist etwa 100-fach schwächer wirksam als das Hirudin (J.M. Maraganore et al 1990, Biochemistry 29, 7095-7101).

Aus der WO 94/13807 sind Thrombininhibitoren aus Speichel von Protostomieren bekannt. In klinischen Studien hat sich gezeigt, daß Hirudin leicht überdosiert werden kann, (z. B. Studie TIMI 9A, Antman, E. M. (1994) Circulation 90, 1624-1630 oder Studie Gusto IIa (1994) Circulation 90, 1631-1637) und dann zu starken Blutungskomplikationen führt. Präklinische Daten zeigen, daß Triabin eine andere Hemmkinetik aufweist. Ebenso wie Hirudin hemmt es bei niedrigen Konzentrationen, zeigt aber bei hohen Konzentrationen keine vollständige Hemmung der Gerinnung (s. Anwendungsbeispiel 1). Für den klinischen Einsatz würde das bedeuten, daß Triabin in einem breiteren Dosisbereich angewendet werden kann, ohne zu starken Blutungen zu führen. Der Nachteil des Triabins ist, daß es ein relativ großes Protein ist und deshalb intravenös verabreicht werden muß. Kleinere Peptide, die dieselben Eigenschaften besitzt wie das Triabin, würde deshalb den Vorteil haben, daß sie auch oral oder transdermal verabreicht werden können. Die weiteren Vorteile kleinerer Peptide bestehen darin, daß sie einfacher hergestellt werden können und damit billiger sind. Weitere Vorteile gegenüber großen Proteinen bestehen darin, daß kleinere Peptide bessere Lagereigenschaften aufweisen.

Es wurden nun Peptide der allgemeinen Formel I

in der
Y¹ Phe, Lys, Cys und Orn und
Y² Asp, Cys und Glu sind, und auch Y¹ die Bedeutung von Y², und Y² die Bedeutung von Y¹ hat, wobei Y¹ und Y² über eine Seitenkette oder ein betaturn Mimetikum miteinander verknüpft sind und
X^1-14 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn, Cit, beta -Ala, homo-Cys, homo-Ser, Gaba, Can, beta -CN-Ala, OH- Pro, OH-Lys, N-Met-Lys, Met-His, Desmosin und Djenkolsäure ist, die über Seitenketten miteinander verbunden sein können.

Besonders bevorzugte Peptide der allgemeinen Formel I sind solche, in denen
Y¹ Phe, Lys, Cys und Orn und
Y² Asp, Cys und Glu sind, und auch Y¹ die Bedeutung von Y², und Y² die Bedeutung von Y¹ hat, wobei Y¹ und Y² über eine Seitenkette oder ein betaturn Mimetikum miteinander verknüpft sind und
X^1-14 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn und Cit ist, die über Seitenketten miteinander verbunden sein können.

Insbesondere bevorzugt sind solche Peptide der allgemeinen Formel I,
in der
Y¹ Lys, Cys und Orn und
Y² Asp, Cys und Glu sind, und auch Y¹ die Bedeutung von Y², und Y² die Bedeutung von Y¹ hat, wobei Y¹ und Y² über eine Seitenkette miteinander verknüpft sind und
X⁶ und X⁸ Leu,
X⁷ Val und
X^1-5 und X^9-14 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn und Cit sind, wobei falls X⁴ für Glu und X¹⁰ für Lys steht, diese über eine Seitenkette miteinander verknüpft sind.

Insbesondere sind ferner solche Peptide der allgemeinen Formel I bevorzugt,
in der
Y¹ Lys und
Y² Asp ist, und auch Y¹ die Bedeutung von Y², und Y² die Bedeutung von Y¹ hat, wobei Y¹ und Y² über ein beta-turn Mimetikum miteinander verknüpft sind und
X^1-14 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn und Cit ist, wobei, falls X⁴ für Glu und X¹⁰ für Lys steht, diese über eine Seitenkette miteinander verknüpft sind.

Davon insbesondere bevorzugt sind auch solche Peptide der allgemeinen Formel I,
in der
Y¹ Lys und
Y² Asp ist, und auch Y¹ die Bedeutung von Y², und Y² die Bedeutung von Y¹ hat, wobei Y¹ und Y² über ein beta-turn Mimetikum miteinander verknüpft sind und
X⁶ und X⁸ Leu,
X⁷ Val,
X^1-5 und X^9-14 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn und Cit sind, wobei falls X⁴ für Glu und X¹⁰ für Lys steht, diese über eine Seitenkette miteinander verknüpft sind.

Die am meisten bevorzugten Peptide der allgemeinen Formel I sind

wobei das Lys in Position 1 mit dem Asp in Position 13 über eine Seitenkette verknüpft ist,

wobei das Lys in Position 1 mit dem Asp in Position 13 und Glu in Position 7 mit Lys in Position 19 über eine Seitenkette verknüpft ist und

wobei das Lys in Position 1 mit dem Asp in Position 13 durch ein beta-turn Mimetikum und das Glu in Position 7 mit Lys in Position 19 über eine Seitenkette verknüpft sind.

Die erfindungsgemäßen Peptide kommen als pharmazeutische Wirkstoffe zur Anwendung und können alleine oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein oder mehrere Peptide der allgemeinen Formel I enthält, zusammen mit pharmazeutisch geeigneten Lösungen und Trägern appliziert werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können alleine, als Gemisch oder als Zusammensetzung gemeinsam mit pharmazeutisch geeigneten Lösungen und Trägern intravenös, subkutan, oral oder transdermal appliziert werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide und deren Zusammensetzungen und Gemische können zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina, Arteriosklerose, Prävention eines Wiederverschlußes von Gefäßen nach PTCA/PTA oder nach Thrombolyse zur Behandlung eines Herzinfarktes oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse verwendet werden. Die pharmazeutischen Wirkstoffe, Zusammensetzungen bzw. Gemische sowie deren Verwendungen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Geeignete Zusammensetzungen können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, wobei alle für eine Formulierung der Peptide in der Pharmazie verwendbaren Lösungen, Träger und Zusatzstoffe zum Einsatz kommen können (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania, 1980).

Für den therapeutischen Einsatz kommen verschiedene Dosen in Frage. So hängt die applizierbare Dosis von dem jeweiligen Peptid, dem Individuum, der Applikationsart (intravenös, subkutan, oral, transdermal) und von der Schwere der zu behandelnden Krankheit ab.

Beschreibung der Abbildungen

1 zeigt die Verlängerung der APTT durch die Inhibitoren Triabin und Hirudin.

Beschreibung der Abkürzungen

Ala

= Alanin

Val

= Valin

Leu

= Leucin

Ile

= Isoleucin

Pro

= Prolin

Phe

= Phenylalanin

Trp

= Tryptophan

Met

= Methionin

Gly

= Glycin

Ser

= Serin

Thr

= Threonin

Cys

= Cystein

Tyr

= Tyrosin

Asn

= Asparagin

Gln

= Glutamin

Asp

= Asparaginsäure

Glu

= Glutaminsäure

Lys

= Lysin

Arg

= Arginin

His

= Histidin

Orn

= Ornithin

Cit

= Citrullin

beta -Ala

= beta -Alanin

homo-Cys

= Homocystein

homo-Ser

= Homoserin

Gaba

= gamma -Aminobuttersäure

Can

= Canavanin

beta -CN-Ala

= beta -Cyanoalanin

OH-Pro

= Hydroxyprolin

OH-Lys

= Hydroxylysin

N-Met-Lys

= N-Methyllysin

Met-His

= Methylhistidin

DMSO

= Dimethylsulfoxid

DCM

= Dichlormethan

DPPF

= Bis(diphenylphosphino)ferrocen

DMF

= Dimethylformamid

DIPEA

= Diisopropylethylamin

TBTU

= Benzotriazolyl-tetramethyluroniumhexafluorborat

HOBT

= 1-Hydroxybenzotriazol

TF4

= Trifluoressigsäure

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Voruntersuchungen und die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide ohne diese auf die Beispiele zu beschränken.
Beispiel 1
1. Bestimmung der Kristallstruktur eines Komplexes aus Thrombin und Triabin
Gereinigtes Triabin und Thrombin wurden in 20 mM Natriumacetat, 25 mM Natriumchlorid, pH 5,5 zusammengegeben. In einem hängenden Tropfen, der 50 mM Natriumacetat, pH 4,7,100 mM Ammoniumsulfat, 0,01 % Natriumnitrit und 8% PEG 4000 enthielt, bildeten sich Kristalle des Komplexes aus Triabin und Thrombin. Die Struktur der Kristalle wurde mittels Röntgenanalyse ermittelt. Aus diesen Strukturdaten wurden die Aminosäuren ermittelt, die Wechselwirkungen mit dem Thrombin eingehen. Es zeigte sich, daß diese Aminosäuren sich in Bereichen befinden, die eine beta – Faltblattstruktur ausbilden.
Die Teilsequenzen des Triabins, die an Thrombin binden, lauten:
Durch gezielten Austausch einiger Aminosäuren und Verknüpfung der Sequenzen wurde ein Peptid entworfen, in dem die Aminosäuren ähnliche räumliche Abstände haben wie in den Teilsequenzen des Triabins, die an Thrombin binden. Im einzelnen wurde das Phenylalanin im Triabin an der Position 98 gegen Lysin ausgetauscht, das im Peptid nunmehr die erste Aminosäure darstellt. Das Cystein 110 im Triabin wurde im Peptid durch Asparaginsäure ersetzt. Die Carboxylseitengruppe der Asparaginsäure ist mit der Aminoseitengruppe des Lysins (Position 1 im Peptid) verknüpft, so daß eine zyklische Verbindung entsteht. Die Asparaginsäure ist mit der zweiten Teilsequenz des Triabins (124-135), die an Thrombin bindet, verbunden. Das Peptid hat folgende Sequenz:
Zunächst wurden Peptide entworfen, die diese Bereiche enthalten. Wichtig bei der Entwicklung der erfindungsgemäßen Peptide war die Nachahmung der dreidimensionalen Struktur der ursprünglichen Bereiche. Insbesondere mußte die beta – Faltblattstruktur des Bereichs der Aminosäuren 98-103 (genannt Kette 1), Aminosäuren 105-110 (Kette 2) und der Aminosäuren 124-135 (Kette 3) sterisch stabilisiert werden. Dies konnte durch verschiedene Modifikationen der ursprünglichen Bereiche gemäß folgenden Ansätzen erzielt werden.
2. Stabilisierung der Peptide
A. Stabilisierung von Kette 1 und 2
Die Stabilisierung erfolgte entweder durch

1. Austausch der Aminosäuren Phenylalanin, im Triabin in Position 98, und/oder Cystein in Position 110 gegen Aminosäuren, die eine Verknüpfung über die Seitenkette erlauben (z. B. Lys-Asp, Cys-Cys, Ornithin-Glu) oder durch
2. Austausch des Cys110 gegen Asp und Verknüpfung von Phe98 und diesem Asp durch ein "beta-turn Mimetikum". Die Strukturen von beta-turn Mimetika und ihre Anwendung sind ausführlich beschrieben in: U.Egner et al. (1997) Pesticide Science, in press.

B. Die Stabilisierung von Kette 2 und 3
Die Stabilisierung erfolgte entweder durch

1. Austausch des L-Tyr in Position 124 gegen ein D-Tyr (Konfigurationsisomer) und Verknüpfung der Aminosäuren in Position 110 (im Triabin Cys) mit der in Position 124 (im Triabin Tyr) durch eine Peptidbindung oder durch
2. Austausch des L-Tyr in Position 124 gegen ein D-Tyr und Verknüpfung der Aminosäure in Position 110 (im Triabin Cys) mit dem D-Tyr über ein " beta-turn Mimetikum" wie in U. Egner et al. (1997) Pesticide Science, in press beschrieben.

C. Zusätzliche Stabilisierung
Eine zusätzliche Stabilisierung der Ketten 2 und 3 kann erreicht werden durch Verknüpfung der Seitenketten der Aminosäuren 104 und 129. Dies kann z. B. durch Austausch von Asp104 durch Glu und Austausch von Arg129 durch Lys und Verknüpfung dieses Glu mit dem Lys durch die Seitenketten erfolgen.
Durch Kombination der beschriebenen Ansätze zur Stabilisierung der Struktur können die verschiedenen erfindungsgemäßen Peptide synthetisiert werden.
Beispiel 2
Herstellung der Peptide
Ein Peptid wurde anfangend vom C-Terminus (Asp25) nach der Merrifieldschen Festphasen-Methode mit Hilfe einer Peptid-Synthese-Maschine unter Benutzung der Fmoc-Chemie synthetisiert. Für die Zyklisierung mußten die Seitenketten des Lysins 1 und der Asparaginsäure 13 selektiv entschützt werden, deshalb wurde für die Position 1N-a-1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethyl-N-e-Fmoc-L-lysin (Dde-Lys) verwendet, während für das Lysin in Position 21 Boc-lysin (Fmoc) eingesetzt wurde. Für das Asp in Position 13 wurde Asp (O-All) und für die anderen Asp (O-tBu)- Asp (Fmoc) verwendet. Die Synthese gliederte sich in folgende Schritte:
1. Synthese des Peptids
Die Synthese erfolgte nach Standardmethoden in einer Peptid-Synthese Maschine von Applied Biosystems.
Sequenz: Lys-Ile-Ser-Val-Ser-Tyr-Asp-Asn-Phe-Ala-Leu-Val-Asp-D-Tyr-Leu-Val-Phe- Glu-Arg-Thr-Lys-Ser-Asp-Thr-Asp.
2. Abspaltung der Dde und O-All Gruppen
Dazu wurde das Harz 2× mit DMSO/DCM (1 : 1) gewaschen und 30 min in dieser Lösung quellen lassen. Dann wurde Palladium (0.1 mol/mol Peptid) und DPPF (0.1 mol/mol Peptid) und Essigsäure (10-facher Überschuß) zugegeben. Sn(Bu)₃H wurde in 5 Portionen (insgesamt 5-facher Überschuß) innerhalb von 10 min zugegeben. Die Mischung wurde 20 min gerührt, dann abgesaugt und mit DMSO/DCM und DCM gewaschen.
3. Zyklisierung
Das Harz wurde 30 min in DMF vorgequollen, dann wurde DIPEA (8-facher Überschuß), TBTU (2-facher Überschuß) und HOBT (2-fach) zugegeben und über Nacht gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und mit DMF und Ether gewaschen.
4. Abspalten vom Harz und Abspalten der restlichen Schutzgruppen
Zum Harz wurden Phenol, Ethyldithiol, Thioanisol, H₂O und TFA gegeben und die Reaktionsmischung 4 Stunden bei 37°C gerührt. Das Peptid wurde mit tButylether gefällt, abzentrifugiert und unter Stickstoff getrocknet.
Die nachfolgenden Anwendungsbeispiele zeigen die Anwendung der erfindungsgemäßen Peptide im Vergleich zu den bekannten Proteinen Triabin und Hirudin ohne die Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf diese Beispiele zu beschränken.
Anwendungsbeispiel 1
Wirkung von Triabin und Hirudin auf die Blutgerinnung
Die Wirkung von Triabin und Hirudin auf die Blutgerinnung wurde durch Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeit (APTT) gemessen. Dazu wurden 100 μl menschliches Citrat-Plasma, 10 μl Inhibitor (Triabin oder Hirudin) und 100 μl APTT- Reagenz (Pathromtin von der Firma Behring) für 3 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 100 μl einer 25 mM CaCl₂ Lösung wurde die Zeit bis zur Gerinnselbildung gemessen. Die Messung erfolgte in einem Fibrometer der Firma Sarstedt. Die Ergebnisse werden angegeben in Verlängerung der Gerinnungszeit, die ohne Zusatz von Inhibitor gemessen wurde.
Anwendungsbeispiel 2
Nach der gleichen Methode (APTT) wie unter Anwendungsbeispiel 1 beschrieben wurde auch die Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide auf die Blutgerinnung gemessen. Als Inhibitor wurde eine Lösung des in Beispiel 2 genannten Peptids in einer Konzentration von 0,1-100 μM zugesetzt. Anschließend wurde die Verlängerung der Gerinnungszeit wie oben beschrieben gemessen.

Claims

Peptide der allgemeinen Formel I
in der Y¹ Phe, Lys, Cys und Orn und Y² Asp, Cys und Glu sind, und auch Y¹ die Bedeutung von Y², und Y² die Bedeutung von Y¹ hat, wobei Y¹ und Y² über eine Seitenkette oder ein beta-turn Mimetikum miteinander verknüpft sind und X^1-14 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn, Cit, beta -Ala, homo-Cys, homo-Ser, Gaba, Can, Beta -CN-Ala, OH- Pro, OH-Lys, N-Met-Lys, Met-His, Desmosin und Djenkolsäure ist, die über Seitenketten miteinander verbunden sein können.
Peptide der allgemeinen Formel I, gemäß Anspruch 1, der Strukturen
wobei das Lys in Position 1 mit dem Asp in Position 13 über eine Seitenkette verknüpft ist,
wobei das Lys in Position 1 mit dem Asp in Position 13 und Glu in Position 7 mit Lys in Position 19 über eine Seitenkette verknüpft ist und
wobei das Lys in Position 1 mit dem Asp in Position 13 durch ein beta-turn Mimetikum und das Glu in Position 7 mit Lys in Position 19 über eine Seitenkette verknüpft sind.
Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel I nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Peptide der allgemeinen Formel I, zusammen mit pharmazeutisch geeigneten Lösungen und Trägern enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie intravenös, subkutan, oral oder transdermal applizierbar ist.