DE19943177C2

DE19943177C2 - Verfahren zur Herstellung von aktiven Serienproteasen und inaktiven Varianten

Info

Publication number: DE19943177C2
Application number: DE19943177A
Authority: DE
Inventors: Dieter Jenne; Elke Wilharm; Marina A A Parry; Wolfram Bode; Robert Huber
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Jenne Dieter 82061 Neuried De Max-Planck-Gesell
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2002-10-24
Anticipated expiration: 2019-09-10
Also published as: JP2003529330A; EP1214428A1; US20020192754A1; DE19943177A1; CA2403330A1; WO2001018215A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Serinproteasen und isolierter Serinprotease-Domänen sowie enzymatisch inaktiver Varianten dieser Serinproteasen/Serinprotease-Domänen in prokaryotischen Wirten.

Nachfolgend werden Dokumente aus dem Stand der Technik zitiert, deren Offenbarungs gehalt hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten ist.

Proteasen sind spezielle Proteine mit peptidolytischen und esterolytischen Eigenschaften und können in katalytischer Weise andere Substanzen und Proteine (Substrate) irreversibel verändern und umwandeln. Entsprechend der funktionell relevanten Molekülreste des katalytisch aktiven Zentrums werden diese Proteasen in vier verschiedene Hauptklassen eingeteilt: Serin-abhängige Proteasen, Cysteinproteasen, Aspartasen und Metalloproteasen. Proteasen vom Serin-Typus fallen in zwei große Familien, in die Familie der eigentlichen Serinproteasen und in die Subtilisin-Familie. Zu den bekanntesten Vertretern der Serinproteasen zählen die Verdauungsenzyme des Gastrointestinaltraktes, das Trypsin, Chymotrypsin und die Pankreas-Elastase, die bakteriziden und Matrix-abbauenden Enzyme der neutrophilen Granulozyten, Leukozyten-Elastase und Cathepsin G, die Kallikreine der Speicheldrüsen und die Serinproteasen des Gerinnungs- und Immunabwehrsystems. Serinproteasen in sekretorischen Granula von Mastzellen, Lymphozyten, Phagozyten oder natürlichen Killerzellen und die Serinproteasen des Komplementsystems spielen eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr von Viren, Parasiten, Bakterien und Tumorzellen und bei Autoimmunprozessen. Serinproteasen sind auf unterschiedliche Substrate spezialisiert und können nach Asparaginsäure-Resten (Granzym B, Induktion der DNA- Fragmentierung in lysierten Zielzellen), Arginin- und Lysin-Resten (Trypsin, Granzym A und Granzym K), Methionin-Resten (Granzym M, "Met-ase") oder nach hydrophoben Aminosäuren (Elastase, Proteinase 3, Pankreas-Elastase, Chymotrypsin) eine Peptidbindung hydrolysieren. Eine Reihe von Lymphozyten-spezifischen Serinproteasen (Granzyme genannt) werden bei der Zielzell-Lyse sezerniert und sind direkt und indirekt nach Aufnahme in das Zytosol der Zielzelle am Vorgang der Zielzell-Zerstörung durch aktivierte Killerzellen beteiligt. Bei Cathepsin G, Proteinase-3 und der Leukozyten- Elastase handelt es sich um Serinproteasen aus neutrophilen Granulozyten, die u. a. Elastin und andere Matrixkomponenten abbauen und als wichtige Pathogenitätsfaktoren bei verschiedenen chronischen Entzündungskrankheiten und Autoimmunreaktionen betrachtet werden. Die Proteinase-3 wurde ferner als das krankheitsspezifische Autoantigen der Wegenerschen Granulomatose identifiziert und könnte in Zukunft zur Behandlung von Patienten mit dieser Erkrankung eingesetzt werden.

Obwohl seit langem bekannt ist, daß Serinproteasen eine wesentliche Rolle in biologischen Prozessen wie der Immunabwehr spielen und daher medizinisch von größter Bedeutung sind, sind nur wenige Verfahren beschrieben worden, die gezielt eingesetzt werden könnten, um derartige Serinproteasen in technischem Maßstab herzustellen.

So beschrieben Smyth et al. (1995) J. Immunol. 154: 6299-6305, und Kummer et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 9281-9286, zwar die Expression von rekombinanten Proteasen, jedoch wurden hier eukaryotische Expressionssysteme verwendet, in denen diese Serinproteasen nur in geringen Mengen herstellbar sind. Die Effizienz einer biosynthetischen Herstellung in Eukaryoten ist unbefriedigend, ebenso die zu beobachtenden Kontaminierungen durch nicht-funktionelle Nebenprodukte und Zell- Bestandteile. Hinzu kommt ein aufwendiges Reinigungsprotokoll zur Abtrennung homologer zellulärer Proteine, das in der Regel mit weiteren Verlusten des zu reinigenden Proteins einhergeht.

Weitere Expressionsversuche wurden auch in einem Hefesystem (Pham et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 1629-1633) oder Baculosystem (Xia et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Com. 243: 384-389) beschrieben. Beide Systeme eignen sich ebenfalls nur bedingt zur Darstellung von homogen reinen Serinproteasen, da eine Kontamination mit unerwünschten eukaryotischen Proteasen ebenfalls nicht ausgeschlossen werden kann. Desweiteren wurde die Erfahrung gemacht, daß gewisse Serinproteasen bereits während der Biosynthese in Wirtszellen (Säuger- oder Insektenzell-Linien) aktivierbar sind und somit die Wirtszellen schädigen können.

Babé (Babé et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 27: 117-124) beschreibt eine Expressionsmethode einer Serinprotease in einem prokaryotischen System mit Sekretion ins extrazelluläre Medium. Jedoch wurde von diesen Autoren keine Rückfaltung des exprimierten Proteins und Prozessierung mit Cathepsin C vorgenommen. Ferner war nur eine geringe Ausbeute von 200 µg/l und eine geringe Lagerstabilität der gewonnenen Serinprotease beobachtet worden.

Beresford (Beresford et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9285-9290) hingegen zeigte die prokaryotische Herstellung von rekombinantem Granzym A in E. coli, das in vitro durch Spaltung an einer rekombinant eingeführten Enterokinasestelle gewonnen wird. Jedoch muß hierzu die natürliche Signalpeptidsequenz mit einer bakteriellen pelB- Signalsequenz rekombinant ersetzt werden, damit ein inaktives Proenzym in das bakterielle Periplasma exportiert werden kann. Wie in Xia et al. (loc. cit.) erwähnt, konnte jedoch mit dieser Methode eine ähnliche Protease, Granzym B, nicht hergestellt werden.

In Lu et al.: Protein Expression and Purification 8 (1996), Seiten 215 bis 226 wird die Herstellung von aktiven, rekombinanten humanen Kallikrein (Serinprotease) durch Expression desselben mit einer Helfersequenz Met-Ala-Pro-Pro-Ile-Gln-Ser-Arg am N-Terminus in den prokaryotischen Wirt E. coli, anschließender Renaturierung des rekombi nanten Enzyms und Aktivierung desselben durch protolytische Abspaltung der Propeptid- Sequenz mittels der Endopeptidase Thermolysin beschrieben.

Höpfner (Höpfner et al. (1997) EMBO J. 16: 6626-6635) stellt die Expression einer aktiven Serinprotease in E. coli vor, jedoch muß in diesem Verfahren eine Aktivierung durch Russel's Viper Venom vorgenommen werden. Das in diesem Gift enthaltene sehr sequenzspezifische Enzym (eine endoproteolytisch aktive Serinprotease) ist jedoch nicht allgemein erhältlich. Außerdem ist die Signalsequenz, die von der Protease erkannt wird, wesentlich länger und anders als die natürlich vorkommenden Propeptide, wodurch die Effektivität der Renaturierung beeinträchtigt werden könnte.

In US-Patent 5679552 wird die Generierung von biologisch aktiven Proteinen beschrieben, deren korrekter N-Terminus durch limitierte Proteolyse einer N-terminalen Helfersequenz mittels Cathepsin C erreicht wird. Die exakte Prozessierung der geradzahligen Aminosäurehelfersequenz mit Hilfe von Cathepsin C wird dadurch erreicht, daß sog. Cathepsin C-Stopsequenzen in den Aminoterminus des herzustellenden Proteins artifiziell eingefügt wurden. Die Methode ist jedoch auf solche Proteine beschränkt, die bestimmte Sequenzeigenschaften am reifen N-Terminus aufweisen, d. h. auf Proteine mit Lysin oder Arginin an erster Position, bzw. auf Proteine mit Prolin an zweiter oder dritter Position innerhalb der Sequenz des herzustellenden Proteins. Serinproteasen mit der N- terminalen Konsensus-Sequenz Ile-(Ile/Val)-Gly-Gly können mit dem in US 5679552 beschriebenen Verfahren nicht hergestellt werden. Die hochkonservierte N-terminale Sequenz von funktionell aktiven Serinproteasen entspricht keiner der bisher bekannten Cathepsin C-Stopsequenzen.

In EP-A1 0397420 ist die enzymatische Konvertierung von rekombinanten Proteinen mit Helfersequenzen mittels Cathepsin C unter Verwendung einer neuartigen N-terminalen Stopsequenz (Met-Tyr und Met-Arg) geschützt. Das in dieser Patentschrift erstmalig beschriebene N-terminale Ende (Met-Tyr bzw. Met-Arg) des herzustellenden rekombinanten Proteins kann durch Exopeptidasen wie dem Cathepsin C nicht abgespalten werden. Die im Patent EP 0397420 dargestellten Stopsequenzen sind ebenfalls für die Prozessierung und Darstellung eines funktionellen N-Terminus bei katalytisch aktiven Serinproteasen ungeeignet.

US Patent 4,861,868 beschreibt die Generierung von Proteinen mit Alanin am N- Terminus nach Abspaltung eines oder mehrerer Methionine durch eine Monoaminoexopeptidase aus E. coli, der Methionin-Aminopeptidase. Zur Darstellung einer aktiven Serinprotease ist jedoch ein N-terminales Alanin ungeeignet, da der hochkonservierte N-Terminus Ile-(Ile/Val)-Gly-Gly für die Erlangung der aktiven Konformation unerläßlich ist.

In der Patentschrift US 5,013,662 wird die Herstellung von N-terminal Methionin-freien Proteinen in E. coli beschrieben. Das durch das Startkodon bedingte N-terminale Methionin wird durch Methionin-Aminopeptidase in vitro oder in vivo abgespalten. Die N-Termini von Serinproteasen (ILe-(Ile/Val)-Gly-Gly) können auch nach diesem Verfahren nicht hergestellt werden, da die Methionin-Aminopeptidase Methionin nur vor kleinen Aminosäuren (Gly, Val, Ser, Ala) abspaltet, nicht jedoch vor großen, aliphatischen Aminosäuren wie dem absolut notwendigen Isoleucin.

E. Wilharm und D. Jenne publizierten (in Immunobiology, Vol. 197, 28th Annual Meeting 1997, S. 415), daß ein Tripeptides Met-Gly-Glu für die Herstellung von katalytisch aktiven Serinproteasen verwendet werden könnte. N-terminales Methionin wird vor Glycin in endogen exprimierten E. coli-Proteinen quantitativ entfernt. Das dann verbleibende Dipeptid, das Bestandteil der natürlichen Granzym B-Sequenz ist, sollte durch Cathepsin C abgespalten werden. Dieser Verfahrensweg hat sich jedoch nicht bewährt. Bei Überexpression in E. coli werden auch unter besten Kulturbedingungen nur etwa 60% bis 70% aller Methionine entfernt. Auch die Konvertierung der Methionin-freien Proform durch Cathepsin C verläuft nicht vollständig. Die erhaltenen Produkte wurden durch Ansequenzierung analysiert und u. a. als Met-Gly-Glu-GzmK, Gly-Glu-GzmK und (komplett prozessierten reifen) GzmK-Molekülen identifiziert. Hierbei zeigte sich eine nicht tolerierbare Produktheterogenität, die vielen Anwendungen entgegensteht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren bereitzustellen, das zur Herstellung von biologisch aktiven Serinproteasen oder Serinprotease-Domänen und katalytisch inaktiven, aber korrekt gefalteten Varianten oder sequenzmodifizierten Varianten gleicher biologischer Funktionalität in prokaryotischen Wirten verwendet werden kann. Das Verfahren wurde speziell für einfache Serinproteasen, die nur aus einer einzigen Domäne, der katalytischen, bestehen und allein dadurch eine spezifische peptidolytische oder esterolytische Funktion mit natürlicher oder artifizieller Spezifität (Designer-Aktivitäten) ausüben. Diese einfachen Serinproteasen sind in der Natur weitverbreitet und besitzen äußert unterschiedliche Aufgaben im Bereich der zellulären und humoralen Immunabwehr (Mastzell-, Granulozyten- und Lymphozyten-Proteasen, Komplement-Faktor D), der gastroenteralen Verdauung (Trypsine, Chymotrypsin und Elastasen), der exokrinen und endokrinen Organe (Kallikreine), für die normale Physiologie der Haut und des Nervensystems (Neuropsin, Kallikrein-Homologe). Das Verfahren eignet sich zur Herstellung solcher Serinproteasen und davon abgeleiteter Serinproteasen mit artifizieller Substratspezifität im industriellen Maßstab. Die Produkte können somit in unbegrenzten Mengen kostengünstig als Forschungsreagenzien, Therapeutika und für Inhibitorentwicklung und Erprobung dieser Inhibitoren in vivo bereitgestellt werden. Erfindungsgemäß wesentlich ist hierbei, daß im Gegensatz zum Stand der Technik im hier dargestellten Verfahren für die Terminierung von Exopeptidasereaktionen keine spezifischen, linearen Stopsequenzen am N-Terminus der herzustellenden Proteine erforderlich ist und daß eine präzise Abspaltung einer N- terminalen Helfersequenz trotz Fehlen einer bekannten Stopsequenz für Exopeptidasen selektiv und vollständig erfolgt.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Bei Versuchen zur Funktion und Spezifität des Cathepsin C wurde beobachtet, daß der natürlicherweise vorhandene stark konservierte N-Terminus von Serinproteasen und Serinprotease-Domänen gegenüber einem exopeptidolytischen Abbau z. B. durch Cathepsin C in vitro resistent ist und sich somit als neue Stopsequenz für die Prozessierung von Zymogenen in aktive Serinproteasen mit Hilfe von Cathepsin C oder ähnlichen Exopeptidasen nutzen läßt, wenn ein homogenes Ausgangsprodukt vorliegt und dieses Ausgangsprodukt eine Dipeptid-Helfersequenz vor dem Beginn des reifen Enzyms trägt.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Serinproteasen, isolierter Serinprotease-Domänen und deren Aminosäure- Varianten in einem prokaryotischen Wirt, das durch folgende Schritte charakterisiert ist:

a) N-terminale Addition einer Helfersequenz wobei die Helfersequenz ein Dipeptid mit der Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Prolin ist, oder die Helfersequenz ein Dipeptid mit der Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Prolin ist und C-terminal nachfolgend mindestens ein weiteres Exopeptidase spaltbares Dipeptid oder Vielfaches solcher Dipeptide in unterschiedlicher Kombination aufweist,
Expression dieser artifiziellen Nukleotidsequenz mit den Eigenschaften, sich ähnlich wie die entsprechenden natürlichen Serinproteasen aufzufalten und eine stabile dreidimensionale Struktur auszubilden, gegebenenfalls als Einschlußkörperchen;
b) Renaturierung der exprimierten Proteine; und
c) Aktivierung der Serinprotease(n), einer Serinproteasen-Domänen oder deren Aminosäure-Varianten durch Abspaltung der Helfersequenz durch eine Exopeptidase.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Serinproteasen all jene Proteine verstanden, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu Trypsin und Chymotrypsin aufweisen. Dazu gehören beispielsweise die Serinproteasen des Gerinnungs- und Komplementsystems, der Immunabwehrzellen, des Gastrointestinaltraktes und der exokrinen Drüsen. Mit dem Begriff Serinprotease-Domäne bezeichnet man unabhängig faltbare Teile von komplex aufgebauten Proteine mit struktureller, dreidimensionaler Ähnlichkeit zu Serinproteasen.

Serinproteasen besitzen überwiegend peptidolytische und esterolytsche Eigenschaften, bisweilen aber auch andere Funktionen. So bestehen die Serinproteasen des Gerinnungs- und Komplementsystems aus unterschiedlichen kovalent verbundenen Protein-Dömanen und einer carboxy terminal lokalisierten Serinprotease-Domäne mit katalytischen Eigenschaften. Wesentlich für die Aktivierung und thermodynamisch stabile Faltung von Serinproteasen ist ein korrekt prozessierter N-Terminus, der im allgemeinen mit einem Isoleucin oder Valin beginnt.

Prokaryotische Wirte, die im Sinne der Erfindung genutzt werden können, sind dem Fachmann bekannt und umfassen, inter alia, Organismen wie Escherichia-, Bacillus-, Erwinia- und Serratia-Spezies, insbesondere E. coli, Bacillus subtilis, Erwinia chrysanthemi, Erwinia carotovora oder Serratia marcescens. Vorzugsweise können hierbei eingesetzt werden: E. coli, Bacillus subtilis.

Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es möglich (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, NY oder Band 1 und 2 von Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, Current Protocols) das biotechnologische Verfahren der Erfindung zur Gewinnung und Aktivierung korrekt gefalteter und funktionell aktiver Serinproteasen durchzuführen. Die erfindungsgemäße Addition einer Helfersequenz am Amino- Terminus von Serinproteasen oder Serinprotease-Domänen wird mit Hilfe von Klonierungstechniken und gentechnische Manipulationen in prokaryotischen Zellen durchgeführt, wobei DNA-Moleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht und gegebenenfalls durch gezielte Mutagenese und Rekombination von DNA-Segmenten an die erforderliche Sequenz adaptiert werden. So können mit Hilfe von Standardverfahren, wie die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und Ligations reaktionen, Vektorenkonstrukte hergestellt werden, die zur Expression von Serinproteasen mit N-terminalen Helfersequenzen führen. Diese Standardverfahren (z. B. in Sambrook et al., loc. cit.; Mullis et al. (1994), The Polymerase Chain Reaction, Birkhäuser, Boston, beschrieben) erlauben nicht nur die Klonierung und Expression von heterologen Proteinen auf cDNA-Ebene, sondern auch den gezielten Austausch von Basen und die Addition von natürlichen oder synthetischen Sequenzen. Auf diese Weise kann mit Hilfe bekannter molekularbiologischer Methoden das hier vorgestellte Verfahren auch dazu genutzt werden, um Sequenzmodifizierte Serinproteasen mit neuen Eigenschaften in prokaryotischen Wirten herzustellen.

Für die Verknüpfung von DNA-Fragmenten können Adaptoren oder Linker an die zu klonierenden Fragmente angefügt werden. Ferner können zweckdienliche Restriktionsschnittstellen eingefügt oder überflüssige, z. B. nichtkodierende DNA oder unerwünschte Restriktionsschnittstellen entfernt werden. Werden Insertionen, Deletionen oder Substitutionen gewünscht, so kommen die Techniken der in vitro- Mutagenese, der Reparatur mit Hilfe modifizierter Primer, der PCR, des Restriktionsverdaus und der Ligation zum Einsatz. Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u. a. die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz der DNA- Sequenz an die Kodon-Präferenz des jeweiligen prokaryotischen Wirts anzupassen. Als analytische Methoden zur Beurteilung der Arbeitsergebnisse sind Restriktionsverdaue, Sequenzierungen und weitere biochemisch-molekularbiologische Tests erforderlich.

Die gewünschte, zu exprimierende Sequenz kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA- Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische DNA-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Prokaryoten bevorzugt werden. Diese von Prokaryoten bevorzugten Kodons können publizierten Tabellen (http://pegasus.uthct.edu) entnommen werden und finden sich in stark exprimierten endogenen Proteinen am häufigsten. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA- Subfragmente einzeln manipuliert und kombiniert werden, um eine DNA-Sequenz zu erhalten, die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist und in der korrekten Richtung translatiert wird. Auch hierbei können zwecks vereinfachter Verknüpfung von DNA-Fragmenten Adaptoren oder Linker eingesetzt werden.

Um eine N-terminale Addition von Helfersequenzen an Serinproteasen zu erreichen, werden, wie oben erwähnt, molekularbiologische DNA-Vektoren mit besonderen Kontrollbereichen eingesetzt, die die Transkription der Expressionskassette in prokaryotischen Zellen steuern. Diese Kontrollbereiche umfassen in der Regel den Promoter und spezielle regulatorische Elemente. Diese regulatorischen Elemente, wie z. B. der tac-lac, T7 oder trp Promotor, sind dem Fachmann vertraut und geläufig:. Entsprechende prokaryotische Expressionsvektoren können von verschiedenen Firmen bezogen werden: pET24c und andere pET-Vektoren von Novagen, lambda gt11 und pGBT9 von Clontech, pGX von Qiagen.

Unter "Expression der Serinprotease(n)" im Sinne der Erfindung versteht der Fachmann die Expression eines heterologen Fusionsproteins im prokaryotischen Wirt. Das Verfahren zur Herstellung von Serinproteasen und/oder ihrer Fragmente beinhaltet die Expression einer Proform im Zytosol des prokaryotischen Wirts, gegebenenfalls und vorzugsweise als Einschlußkörperchen ("IB, "inclusion bodies"). Dabei hängt die Einschlußkörperchenbildung in erster Linie von der Expressionsrate ab, wobei eine eindeutige Korrelation mit Größe, Hydrophobizität und anderen Eigenschaften des zu exprimierenden Proteins nicht zu erkennen ist (Lilie, H. et al. (1998), Current Opinion in Biotechnology 9: 497-501). Bei niedrigen Expressionstemperaturen sowie bei kleinen, hydrophilen Proteinen ist aber durchaus mit der Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu rechnen (z. B. Alkalische Phosphatase (Derman et al. (1993) Science 262, 1744- 1747; Proba et al. (1995) Gene 159, 203-207). Bei rekombinanten Proteinen, deren dreidimensionale Faltung nicht entscheidend durch die Ausbildung von Disulfidbrücken stablisiert wird (vielfach bei zytoplasmatischen Proteinen vorzufinden), kann auch im prokaryotischen Zytoplasma eine natürliche Konformation erreicht werden. In E. coli mit Thioredoxinreduktasedefizienz (z. B. Novagen AD494 DE 3) ist das Cytoplasma weniger reduzierend und erlaubt in einigen Fällen auch eine Ausbildung von Disulfidbrücken (Derman et al.; loc. cit.).

Neben der Expression der heterologen Fusionsproteine der Serinproteasen und/oder ihrer Fragmente als Einschlußkörperchen umfaßt daher die Erfindung auch ein Verfahren, bei dem die Expression als lösliche rekombinante Protein/Peptide durchgeführt wird. Unter "Renaturierung der exprimierten Fusionsproteine" im Sinne der Erfindung wird die Solubilisierung von Proteinaggregaten und Auffaltung in naturgleiche dreidimensionale Strukturen verstanden, die in physiologischen Pufferlösungen stabil sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt ferner eine Aktivierung der herzustellenden Serinproteasen oder ihrer Serinprotease-Domänen durch Abspaltung einer geeigneten Helfersequenz durch eine Exopeptidase. Dabei wird bei Exopeptidasen zwischen Dipeptidylexopeptidasen und Monoaminoexopeptidasen unterschieden, die bei jedem Prozessierungsschritt zwei bzw. eine Aminosäure abspalten. Insbesondere bevorzugt werden Dipeptidylexopeptidasen, wie unten genauer ausgeführt. Als Beispiele können gelten: Cathepsin C, Cathepsin W, Cathepsin B oder Diaminopeptidase IV, Cathepsin C-ähnliche Funktionshomologe in anderen Spezies wie z. B in Dictyolstelium discoideum und C. elegans. Kennzeichnend für die zu prozessierenden Exopeptidase- Substrate ist hierbei, daß sie die bekannten Exopeptidase-Stopsequenzen weder im Bereich der Helfersequenz noch im amino-terminalen Bereich des gewünschten Produktes tragen. Eine sequenzielle Konvertierung durch eine zweckmäßige Kombination unterschiedlicher Exopeptidasen könnte durchgeführt werden, bei der z. B. im ersten Schritt Methionin über eine spezifische Methioninaminoexopeptidase abgespalten und in weiteren Schritten Dipeptid(e) entfernt werden.

Es kann also auch eine Sequenz aus mehreren Met-Resten vor das abzuspaltende Helfer-Dipeptid angefügt werden. D. h. es können Sequenzen der Form (Met)n-Glu, wie z. B. Met-Met-Gly (wobei n eine natürliche Zahl bis 40 bedeuten kann) verwendet werden. Diese Methionine können während oder nach der Expression, d. h. in vitro, durch Methioninaminopeptidase(n) abgespalten werden. Erfindungsgemäß ist jedoch darauf zu achten, daß es nach der Abspaltung des Methionins/der Methionine zu einer Helfersequenz kommt, die eine gerade Anzahl von Aminosäuren ohne Stop- Aminosäuren aufweist. Käme es zu einer ungeraden Anzahl an Aminosäuren nach der Abspaltung des Startmethionins/der Methionine, wäre durch Einsatz von Dipeptidylaminoexopeptidasen eine Generierung eines exakten N-Terminus der herzustellenden Serinprotease(n) und/oder ihrer Fragmente nicht mehr gewährleistet.

Es ist daher erfindungsgemäß sinnvoll, eine Methioninaminopeptidase mit einer Diaminoexpeptidase zu kombinieren, wenn zusätzlich eingefügte Methionine vor der Dipeptidhelfersequenz entfernt werden müssen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im Schritt (a) vor der Sequenz des gewünschten Serinprotease-Produktes ein Dipeptid der Form Met-Y, beispielsweise Met-Glu, addiert, das im Schritt (c) unter Verwendung von bspw. Cathepsin C abgespalten wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren beginnt das N-terminal hinzugefügte Dipeptid mit einem Methionin. Da die Translation in Prokaryoten mit einem Formyl-Methionin-Rest beginnt, das im Zytosol der Bakterien in manchen Fällen durch die endogene E. coli Formylase in Verbindung mit der E. coli Methionin-Aminopeptidase entfernt wird, ist es notwendig, ein geeignetes, universell einsetzbares Propeptid zu identifizieren, das einerseits während der Biosynthese in E. coli nicht verändert wird, andererseits aber nach Rückfaltung des Vorläuferproduktes in einfacher und effizienter Weise selektiv enzymatisch abgespalten werden kann, ohne das rekombinante Protein anzugreifen. Somit sind die addierten Methionin-haltigen Dipeptide (Met-Y) einerseits resistent gegenüber posttranslationeller Prozessierung in E. coli, andererseits aber ein gutes Substrat für nur in Eukaryoten bisher nachgewiesenen Dipeptidylaminoexopeptidasen.

In einer Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Dipeptide oder eine Kombination von mehreren unterschiedlichen Dipeptiden aus einem Pool geeigneter Dipeptide ohne natürliche Stopsequenzen zusätzlich C-terminal nach dem Dipeptid Met-Y vor den N- Terminus der zu exprimierenden Serinprotease vorgeschaltet. Diese Peptidhelfer sequenzen umfassen jede Aminosäure-Kombination, jedoch kann Prolin, Lysin oder Arginin nicht an erster Stelle und Prolin nicht an zweiter Stelle dieses Dipeptides stehen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders die Dipeptidhelfersequenz Met-Glu, wobei dieser Dipeptidhelfersequenz einzelne oder mehrere Methionine vorangestellt werden können. Prolin muß an der zweiten Stelle des Dipeptids vermieden werden, da eine Abspaltung des Dipeptids durch einzelne Exopeptidasen, wie Cathepsin C, verhindert wird. Es ist zu erwähnen daß weiterhin Tyrosin oder Arginin an der zweiten Stelle nach einem Methionin vermieden werden soll, wenn als Exopeptidase im erfindungsgemäßen Verfahren Cathepsin C eingesetzt werden soll.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Dipeptid Met-Glu als Helfersequenz und das Konvertierungsenzym Cathepsin C angewendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren, bei dem in den bevorzugten Ausführungsformen die Exopeptidase eine Monoaminoexopeptidase und/oder eine Dipeptidylexopeptidase ist. Unter Monoaminoexopeptidase ist, inter alia, die oben erwähnte Methioninaminoexopeptidase aus E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 751-757) zu verstehen. In der besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Dipeptidylexopeptidase Cathepsin C oder ein Cathepsin C-Homolog (RCP, beschrieben in US 5,637,462).

Die Erfindung umfaßt auch jene Serinproteasen und deren Fragmente, die aufgrund von Aminosäuresubstitutionen und/oder Aminosäureinsertionen als katalytisch inaktive Serinprotease-Varianten in der Natur vorkommen und andere, nicht katalytische Aufgaben erfüllen.

Die Erfindung umfaßt auch durch Mutagenese entstandene Serinproteasen ohne katalytische Aktivität.

In einer bevorzugen Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Verfahren, bei dem die Serinprotease Leukozyten-Elastase, Proteinase-3, Komplementfaktor D, Azurozidin, Mastzell-Chymase, Pankreas-Trypsin, Pankreas-Chymotrypsin, Mastzell-Tryptase, glanduläres Kallikrein, Cathepsin G, ein Granzym, eine katalytische Domäne von Komplementproteasen oder von Gerinnungsproteasen ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Granzyms, wobei das Granzym Granzym A, B, K, H, M oder L ist. Dabei umfaßt Granzym L die hier in SEQ ID Nr. 1 (Abb. 5) dargestellte Nukleotidsequenz.

Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart. Weiterführende Literatur kann zu einer der oben angeführten Methoden, Produkte und therapeutischen Anwendungen dieser Produkte, die mit Hilfe der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, aus öffentlichen Bibliotheken unter Zuhilfenahme elektronischer Suchmaschinen aufgefunden werkten. Zu diesem Zweck bieten sich unter anderem öffentliche Datenbanken an wie die "Medline", die über Internet zur Verfügung stehen, z. B. unter der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen sind dem Fachmann geläufig und können aus dem Internet entnommen werden, z. B. unter der Adresse http:/ / www.lycos.com. Eine Übersicht über Quellen und Informationen zu Patenten bzw. Patentanmeldungen in der Biotechnologie ist in Berks, TIBTECH 12: 352-364 (1994) gegeben.

Beispiele

Die Durchführbarkeit der erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die nachstehenden Versuche belegt.

Beispiel 1

Konstruktion der Expressionskassetten unter

a.) Addition der N-terminalen Helfersequenz Met-Glu (am Beispiel von humanem Granzym K und Granzym K der Maus)

Der Vektor pET24c (Novagen) wurde für die Klonierung von humanem Granzym K mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und EcoRI geschnitten. Die für humanes Granzym K kodierende Sequenz wurde mittels zweistufiger PCR von humaner Knochenmark-cDNA amplifiziert. In der ersten PCR-Runde wurde mit einem Paar korrekt hybridisierender Oligonukleotide (sogenannte äußere Oligos, siehe P1 und P2 im Sequenzprotokoll) die humane Granzym K-cDNA zwischen der Mitte des ersten und dem Ende das fünften Exons von humaner Knochenmark-cDNA amplifiziert (PCR-Bedingungen: Matrizen-DNA: 1 µl einer mit reverser Transkriptase in cDNA umgeschriebenen mRNA (2 µg), Nukleotide: jeweils 0.2 mM; Oligos: jeweils 1 µM; Enzym 0.5 µl/50 µl-Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native Pfu-Polymerase (Stratagene); Puffer: Stratagene; Programm: nicht-zyklische Denaturierung: 5 Minuten bei 95°C, zyklische Schritte: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 56°C, 1 Minute bei 72°C, 35 Zyklen, nicht-zyklische Elongation: 5 Minuten bei 72°C). Das erhaltene PCR-Produkt diente als Matrizensequenz in der zweiten PCR-Runde, in der mittels eines zweiten Oligonukleotidpaares (innere Oligos, siehe P3 und P4 im Sequenzprotokoll) das Insert für die Klonierung in den pET24c Vektor amplifiziert wurde (PCR-Bedingungen: Matrizen-DNA: 5 ng; Oligos: jeweils 1 µM; Nukleotide: jeweils 0.2 mM; Enzym: 0.5 µl/50 µl Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native Pfu-Polymerase (Stratagene); Puffer: 10-facher Pfu-Polymerase Reaktionspuffer 100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 200 mM Tris-Cl (pH 8,75) 20 mM MgSO₄, 1% Triton® X-100, 1000 µg/ml BSA; Programm: nicht-zyklische Denaturierung: 5 Minuten bei 95°C, zyklische Schritte: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 58°C, 1 Minute bei 72°C, 24 Zyklen, nicht-zyklische Elongation: 5 Minuten bei 72°C). In die Oligos wurden dazu die NdeI und EcoRI Schnittstellen eingeführt. Das so erhaltene Amplifikat wurde aus dem Gel gereinigt (Qiaquick-Protokoll von Qiagen) mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und EcoRI geschnitten und in den Vektor ligiert (Ligationsbedingungen: Enzym: 1.5 µl/20 µl Ansatz [1 Einheit/µl] T4-Ligase (Boehringer Mannheim); Vektor: 50 ng/20 µl Ansatz; Insert: 50 ng/20 µl Ansatz; Puffer: Ligationspuffer, 10-fach konzentriert 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 10 mM Dithioerythrit 10 mM ATP, pH 7,5 (gemessen bei 20°C); Inkubation: 16 Stunden bei 15°C), so daß 8 Basen in 3' Richtung von der Ribosomenbindungsstelle die Translation des Transkripts mit dem Methionin des NdeI-Palindroms beginnt. Die N-terminale Sequenz setzt sich für beide Granzyme zusammen aus dem Pro(Di)peptid Met-Glu und der sich daran anschließenden konservierten Sequenz der reifen Granzyme Ile-Ile-Gly-Gly. Am 3'-Ende bricht die Translation mit dem natürlichen Stopcodon ab.

Die Amplifizierung von Granzym K der Maus erfolgte unter Verwendung des identischen Oligonukleotids im N-terminalen Bereich (P5 bzw. P3) und P6 als Rückwärts-Primer. Von Milz-cDNA der Maus ausgehend wurde in 35 Zyklen unter Einsatz von 5 ng DNA das Granzym K-Fragment der Maus für die Expressionskassette amplifiziert, aus dem Gel gereinigt (Qiaquick-Protokoll von Qiagen) mit der Restriktionsendonuklease NdeI geschnitten und das 3'-Ende kinasiert. Für diese PCR wurden jeweils 0.2 mM der vier Nukleotide, 1 µM von jedem Oligo und 0.5 µl/50 µl-Ansatz [2.5 Einheiten/µl] nativer Pfu-Polymerase (Stratagene) im Puffersystem von Stratagene und folgendes Thermocycler-Programm eingesetzt: nicht- zyklische Denaturierung: 5 Minuten bei 95°C, zyklische Arbeitschritte: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute 51°C, 1 Minute 72°C, 35 Zyklen, nicht-zyklische Elongation: 5 Minuten bei 72°C, Für die Klonierung in pET24c wurde der Vektor durch Verdau mit HindIII geöffnet, der Überhang aufgefüllt, so daß ein glattes Ende entstand, und der linearisierte Vektor anschließend mit dem Restriktionsenzym NdeI geschnitten. Das Insert wurde wie oben beschrieben in den so vorbereiteten Vektor ligiert.

Die resultierenden Klone wurden auf Kanamycin [30 µg/ml] selektioniert und über Restriktionsanalyse (Doppelverdau) mit Hilfe von NdeI und XhoI (New England Biolabs) und Sequenzierung verifiziert.

b.) sequenzneutraler Kodonoptimierung (am Beispiel von humanem Granzym M)

Der Vektor pET24c-His-Strep-tag (modifizierter Novagenvektor) wurde für die Klonierung von humanem Granzym M mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und PstI geschnitten. Die für humanes Granzym M kodierende Sequenz wurde mittels zweistufiger PCR von humaner Knochenmark-cDNA amplifiziert. In der ersten PCR- Runde wurde mit einem Paar korrekt hybridisierender Oligonukleotide (sogenannte äußere Oligos, siehe P7 und P8 im Sequenzprotokoll) die humane Granzym M-cDNA zwischen der Mitte des ersten und dem Ende das fünften Exons von humaner Knochenmark-cDNA amplifiziert (PCR-Bedingungen: Matrizen-DNA: 1 µl einer mit reverser Transkriptase in cDNA umgeschriebenen mRNA (2 µg); Nukleotide: jeweils 0.2 mM; Oligos: jeweils 1 µM; Enzym 0.5 µl/50 µl-Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native Pfu-Polymerase (Stratagene); Puffer: Stratagene; Programm: nicht-zyklische Denaturierung: 5 Minuten 95°C, zyklisch: 1 Minute 95°C, 1 Minute 56°C, 1 Minute 72°C, 24 Zyklen, nicht-zyklische Elongation: 5 Minuten 72°C). Das erhaltene PCR- Produkt diente als Matrizen-DNA in der zweiten PCR-Runde, in der mittels eines zweiten Oligonukleotidpaares (innere Oligos, siehe P9 und P10 im Sequenzprotokoll) das Insert für die Klonierung in den pET24c-His-Strep-tag Vektor amplifiziert wurde (PCR-Bedingungen: Matrizen-DNA: 5 ng; Oligos: jeweils 1 µM; Nukleotide: jeweils 0.2 mM; Enzym: 0.5 µl/50 µl Ansatz [2.5 Einheiten/µl] native Pfu-Polymerase (Stratagene); Puffer: Stratagene; Programm: nicht-zyklische Denaturierung: 5 Minuten 95°C, zyklisch: 1 Minute 95°C, 1 Minute 58°C, 1 Minute 72°C, 24 Zyklen, nicht- zyklische Elongation: 5 Minuten 72°C). In die Oligos wurden dazu die NdeI und NsiI Schnittstellen eingeführt. Im Oligo P9 wurde zusätzlich die für die ersten zehn Aminosäuren kodierende Sequenz hinsichtlich der Kodonfrequenz in E. coli optimiert (Abb. 3). Der Einfluß dieser Kodonoptimierung auf die Expressionsstärke veranschaulicht Abb. 2b. Das so erhaltene Amplifikat wurde aus dem Gel gereinigt (Qiaquick-Protokoll von Qiagen) und in den Vektor ligiert (Ligationsbedingungen: siehe Beispiel 1a). Als N-terminale Helfersequenz wurde auch für Granzym K der Maus das Pro(Di)peptid Met-Glu benutzt und daran der cDNA-Leserahmen des reifen murinen Granzym K angefügt. Am 3'-Ende brach die Translation mit dem natürlichen Stopcodon ab.

Die resultierenden Klone wurden auf Kanamycin [30 µg/ml] selektioniert und durch Restriktionsanalyse (Doppelverdau) mit NdeI und EcoRI (New England Biolabs) und DNA-Sequenzierung bestätigt.

Beispiel 2 Fermentation, Präparation von "inclusion bodies" und deren Solubilisierung Expression einer Serinprotease als Einschlußkörperchen

Die gemäß Beispiel 1a und 1b konstruierten Plasmide wurden in den Expressionsstamm E. coli B834 DE3 (Novagen) transformiert und die Expression zunächst im kleinen Maßstab getestet. 10 ml Kulturen wurden mit LB-Kanamycin (Konzentration siehe Beispiel 1) bis zu einer OD₆₀₀ von 0.5 angezogen, die Expression mit 1 mM IPTG induziert und 3 Stunden bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 1.5 inkubiert. IPTG aktiviert den lacUV-Promotor, der im B834 DE3-Stamm die chromosomal kodierte T7-Polymerase kontrolliert, die ihrerseits die Transkription des klonierten Granzym-Gens unter T7lac-Promotor Kontrolle aufnimmt.

Von 50 µl (= 0.075 OD) der induzierten Kultur und einer nicht-induzierten Kontrolle wurde ein Gesamtzell-Lysat hergestellt und mittels SDS-PAGE analysiert.

Von gut exprimierenden Klonen (deutliche Bande bei 25 kD im Coomassie-gefärbten SDS-Gel; Abb. 2a und b) wurde die Kultur im größeren Maßstab wiederholt und aus dem Gesamtzell-Lysat eine IB-Präparation durchgeführt.

Zur Präparation von Einschlußkörpern ("inclusion bodies") wurden folgende Puffer eingesetzt:

a) Lysepuffer
50 mM Tris
10 µg/ml DNase
2 mM MgCl₂
0.25 mg/ml Lysozyme
pH 7.2
b) Waschpuffer I
50 mM Tris
60 mM EDTA
1.5 M NaCl
6% Triton-X-100
pH 7.2
c) Waschpuffer II
50 mM Tris
60 mM EDTA
pH 7.2

Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet und das Pellet einmal mit PBS pH 7.4 gewaschen, bevor der Aufschluß in Lysepuffer bei Raumtemperatur erfolgte. Die bakteriellen Membranen wurden entweder durch zwei French-Press-Zyklen (1000- 1200 psi) oder drei Sonifizierungszyklen (jeweils 15 Minuten 320 W) aufgebrochen, das Lysat mit einem Drittel des Volumens Waschpuffer I versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler inkubiert. Die Suspension wurde 20 Minuten bei 17200 g bei 4°C zentrifugiert, das Pellet in Waschpuffer I resuspendiert, 1 Stunde bei Raumtemperatur im Schüttler inkubiert und erneut zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde zweimal mit Waschpuffer I und dreimal mit Waschpuffer II wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wurde ein kleines Aliquot der IB-Präparation mittels SDS- PAGE auf Reinheit analysiert, der Rest wurde solubilisiert. Hierzu wurden folgende Puffer verwendet:

a) Solubilisierungspuffer
6 M Guanidiniumchlorid
100 mM Tris
20 mM EDTA
15 mM GSH
150 mM GSSG
pH 8.0
b) Dialysepuffer
6 M Guanidiniumchlorid
pH 5.0

~2 g IB (Frischgewicht) wurden in 20 ml Solubilisierungspuffer im Potter resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur im Schüttler inkubiert. Unlösliche Bestandteile wurden abzentrifugiert und diese Proteinlösung anschließend gegen jeweils 20 Volumen Dialysepuffer 24 Stunden bei 4°C mit drei Pufferwechseln nach jeweils 8 Stunden dialysiert.

Beispiel 3 Renaturierung der exprimierten Proteine

Zur Renaturierung wurden folgende Puffer verwendet:

a) Renaturierungspuffer
50 mM Tris
0.5 M Arginin
20 mM CaCl₂
1 mM EDTA
0.1 M NaCl
0.5 mM Cystein
pH 8.5
b) Dialysepuffer
PBS
pH 7.0

Die Renaturierung erfolgte in drei Pulsen mit Zeitintervallen von jeweils 8 Stunden. Die Renaturierungsansätze von humanem Granzym K wurden bei Raumtemperatur, die von Granzym K der Maus und humanem Granzym M bei 4°C inkubiert. Die Proteinlösung (~10 mg/ml) aus Beispiel 2 wurde jeweils 1 : 100 (Vol/Vol) im Renaturierungspuffer unter Rühren verdünnt und bis zum nächsten Puls ohne Agitation inkubiert. Nach der dritten Zugabe der Proteinlösung wurde der Rückfaltungsansatz noch weitere zwei Tage bei Raumtemperatur bzw. 4°C ohne Agitation inkubiert. Nach der Renaturierung wurde das Reaktionsvolumen filtriert (über Celluloseacetat), auf ca. 50 ml konzentriert und bis zur Entfernung von Arginin bei 4°C dialysiert (Kontrolle über Leitfähigkeitsmessung). Auftretendes Präzipitat wurde durch Zentrifugation und anschließende Filtration entfernt. Das lösliche gefaltete Zymogen war enzymatisch inaktiv (Abb. 4) und wurde mittels Kationenaustauschchromatographie von kontaminierenden E. coli Proteinen gereinigt und dabei konzentriert. Es wurde dazu ein NaCl-Gradient von der physiologischen NaCl-Konzentration in PBS (137 mM) bis 2 M gefahren.

Beispiel 4 Aktivierung (Konvertierung) der herzustellenden Serinprotease(n) bzw. Konvertierung inaktiver Varianten dieser Serinprotease(n)

Zunächst wurden die Aktivierungsbedingungen von bovinem Cathepsin C, der zu verwendenden Exopeptidase, optimiert:
Cathepsin C wurde in Gegenwart einer Thiolkomponente und Halidionen durch Reduktion aktiviert, z. B. durch 10 mM Mercaptoethanolamin-HCl. Da es durch die Präsenz eines Reduktionsmittels im Konvertierungsansatz jedoch zu Reduktion der Disulfidbrücken des gefalteten Granzyms kommen kann, wurden die Aktivierungs- und Konvertierungsbedingungen zunächst hinsichtlich Thiolkonzentration, Zeitdauer der Aktivierung und der anschließenden Dialyse sowie des pH-Werts optimiert. Als optimale Parameter wurden 2 mM Mercaptoethanolamin zur Aktivierung bei pH 5.0 über 20 Minuten eingesetzt und anschließend für 20 Minuten gegen PBS, 75 mM NaAcetat bei pH 5.5 dialysiert.

Die FPLC Peakfraktion wurde gegen PBS pH 6.0 dialysiert und auf ca. 1 ml (~20 mg Protein/ml) konzentriert. 3 Einheiten Cathepsin C pro Milliliter [Stock: 5 U/ml in H₂O] wurden zunächst für 20 Minuten bei 37°C in 5 mM 2-Mercaptoethanolamin, PBS pH 5.0 aktiviert und anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur gegen PBS, 75 mM NaAcetat, pH 5.5 zur Entfernung von 2-Mercaptoethanolamin dialysiert. Das aktive Cathepsin C wurde 1 : 1 (Vol/Vol) mit dem Zymogen versetzt und 6 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, evtl. auftretende Präzipitationen durch Zentrifugation abgetrennt und die filtrierte Probe erneut einer Kationenaustauschchromatographie unterworfen (siehe Beispiel 3) zur Abtrennung von Cathepsin C.

In Aktivitätsassays wurde die enzymatische Aktivität der prozessierten Granzyme gegenüber den synthetischen Substraten Benzyloxycarbonyl-L-Lysin-Thiobenzylester (Z-Lys-SBzl) für Granzym K und t-Butyloxycarbonyl-Ala-Ala-Met-Thiobenzylester (Boc-Ala-Ala-Met-SBzl) für Granzym M demonstriert (Abb. 4). Diese Aktivitätstests wurden in Vertiefungen einer 96-Napf-Schale mit jeweils 150 µl Probenvolumen durchgeführt. Die Thiobenzylestersubstrate und Ellman's Reagenz wurden auf Endkonzentrationen von 0.3 mM in Testpuffer (150 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) verdünnt. Die verschiedenen Granzympräperationen wurden ebenfalls in Testpuffer auf 3-15 nM verdünnt. Der mit dem Umsatz der Substrate einhergehende Farbumschlag wurde bei 405 nm und Raumtemperatur über 5 Minuten im ELISA-Reader gemessen. Zur Berechnung der Umsatzrate wurde die Differenz der Absorptionen zu Beginn und nach 5 Minuten gebildet und auf die Zeit bezogen.

Die Ausmaß der Konvertierung in das gewünschte Endprodukt wurde durch aminoterminale Proteinsequenzierung (Edmann-Abbau) überprüft und belief sich auf über 90%. Ähnliche Forschungsarbeiten wurden auch mit Fusionproteinen unter Zuhilfenahme anderer Helfersequenzen (z. B. Met-Gly-Glu-GzmK) durchgeführt. Diese Versuche zeigten, daß verschiedene unerwünschte Nebenprodukte (Met-Gly- Glu-GzmK, Gly-Glu-GzmK, Glu-GzmK) neben der eigentlichen Zielsubstanz (GzmK) in beträchtlichen Mengen vorlagen und eine biochemische Separierung dieser Nebenprodukte nicht erreichbar war.

Ausbeuten für humanes Granzym K pro Liter E. coli Kultur

solubilisiertes Protein aus IB: 50-75 mg/l
gefaltetes Zymogen: 10-15 mg/l (20%)
aktives Granzym 6-8 mg/l (10-12%)

Prozentangaben beziehen sich auf die theoretische maximale Ausbeute von quantitativ renaturiertem Protein (= 100%)

Abbildungslegenden

Abb. 1: Beschreibung der verwendeten Primer

Abb. 2a: Analyse der Expression, Reinigung und Renaturierung von humanem Granzym K. Coomassie-gefärbtes 12% SDS-Gel mit Lysat nicht induzierter Kultur (Spur 1), Lysat IPTG-induzierter Kultur (Spur 2), Präparation der Einschlußkörper aus dem induzierten Lysat (Spur 3), renaturiertes Zymogen nach Ionenaustauschchromatographie (Spur 4) und natives humanes Granzym K nach Aktivierung mit Cathepsin C und Ionenaustauschchromatographie (Spur 5).

Abb. 2b: Analyse der Expression von humanem Granzym M (hGzmM) unter Verwendung verschiedener Expressionskonstrukte. 12% SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung von hGzmM mit natürlichem C-Terminus (Bezeichnung hGzmM/WT) und (His)₈-Strep-tag-C-Terminus (Bezeichnung hGzmM/HST), sowie von hGzmK als Expressionskontrolle. Die Aufschlußverfahren sind: 1: nicht-induzierte Kultur, Aufschluß in 2.5% SDS, 5% b- Mercaptoethanol; 2: induzierte Kultur, Aufschluß wie in 1; 3: induzierte Kultur, Aufschluß in 5% SDS, 200 mM DTT, 5% b-Mercaptoethanol; 4: induzierte Kultur mit idealisierten Kodons, Aufschluß wie in 1.

Abb. 3: N-terminaler Sequenzvergleich zwischen humanem Granzym K (hGzmK) und humanem Granzym M (hGzmM) auf Aminosäureebene (A) und Nukleotidebene (B). Die Kodonfrequenzen in E. coli (Ausubel et al., 1999) sind in % angegeben, seltene Kodons sind unterstrichen. Der für die N-terminale Optimierung der Expressionskonstrukte entworfene Oligo ist in (C) dargestellt, die veränderten Positionen sind unterstrichen.

Abb. 4a: Substratspezifität von humanem Granzym K (hGzmK). Es wurden jeweils 0.1 mM der Thiobenzylestersubstrate und jeweils 3 nM der Proform (schwarz), der konvertierten Form (schraffiert) und der konvertierten S195A-Mutante (grau) eingesetzt. Die Substratumsetzung wurde bei 405 nm und Raumtemperatur über 5 Minuten gemessen.

Abb. 4b: Substratspezifität von Granzym K der Maus (mgzmK). Es wurden jeweils 0.1 mM der Thiobenzylestersubstrate und jeweils 5 nM der Proform (schwarz) und der konvertierten Form (schraffiert) eingesetzt. Die Substratumsetzung wurde bei 405 nm und Raumtemperatur über 5 Minuten gemessen.

Abb. 4c: Substratspezifität von humanem Granzym M (hGzmM). Es wurden jeweils 0.1 mM der Thiobenzylestersubstrate und jeweils 15 nM der Proform (schwarz), der konvertierten Form (schraffiert) und der konvertierten S195A-Mutante (grau) eingesetzt. Die Substratumsetzung wurde bei 405 nm und Raumtemperatur über 5 Minuten gemessen.

Abb. 5: cDNA-Sequenz von Granzym L

Abb. 6: Aminosäure-Sequenz von Granzym L

Claims

1. Verfahren zur Herstellung (I) einer Serinprotease,
(II) einer katalytischen Domäne einer Serinprotease,
(III) einer enzymatisch inaktiven Variante von (I) oder (II) oder
(IV) einer sequenzmodifizierten Variante von (I) oder (II)
gleicher biologischer Funktionalität
in einem prokaryotischen Wirt, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die Serinprotease (I), die katalytische Serinprotease-Domäne (II), die enzymatisch inaktive Variante (III) oder die sequenzmodifizierte Variante (IV) mit einer Helfersequenz am N-Terminus als rekombinantes Protein exprimiert wird, wobei

- die Helfersequenz ein Dipeptid mit der Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Prolin, ist
- oder die Helfersequenz ein Dipeptid mit der Dipeptidsequenz Met-Y ist und Y eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Prolin, ist und C-terminal nachfolgend mindestens ein weiteres Exopeptidase spaltbares Dipeptid oder Vielfaches solcher Dipeptide in unterschiedlicher Kombination aufweist,

a) das rekombinante Protein gemäß (a) renaturiert wird und
b) die Helfersequenz des gemäß (b) erhaltenen Proteins durch eine oder mehrere Exopeptidase(n) abgespalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehr Dipeptidy lexopeptidasen in Verfahrenschritt (c) verwendet wird/werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dipeptidylexopepti dase Cathepsin C ist.

4. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Serinprotease Leu kozyten-Elastase, Proteinase-3, Komplementfaktor D, Azurozidin, Mastzell- Chymase, Mastzell-Tryptase, ein Gewebe-Kallikrein, Cathepsin G oder ein Gran zym ist.

5. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Granzym Granzym A, B, K, M oder L ist.

6. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Granzym L die in Abb. 5 dargestellte Nukleotidsequenz bzw. die in Abb. 6 dargestellte Aminosäure sequenz umfasst.

7. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekenn zeichnet, dass die Helfersequenz N-terminal von dem Dipeptid Met-Y eine oder mehrere Aminosäure(n) Methionin aufweist.