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DE202013012535U1 - Blutsammelvorrichtung für verbesserte Nukleinsäureregulierung - Google Patents

Blutsammelvorrichtung für verbesserte Nukleinsäureregulierung Download PDF

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DE202013012535U1
DE202013012535U1 DE202013012535.7U DE202013012535U DE202013012535U1 DE 202013012535 U1 DE202013012535 U1 DE 202013012535U1 DE 202013012535 U DE202013012535 U DE 202013012535U DE 202013012535 U1 DE202013012535 U1 DE 202013012535U1
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Abstract

Probensammelbehälter, enthaltend: eine Blutprobe oder Blutplasmaprobe; mindestens eine zirkulierende, zellfreie, erste Nukleinsäure, die DNA oder RNA ist; eine Schutzmittelzusammensetzung, welche ein Konservierungsmittel, ausgewählt aus Diazolidinylharnstoff, Imidazolidinylharnstoff, Dimethoylol-5,5-dimethylhydantoin, Dimethylolharnstoff, 2-Brom-2.-nitropropan-1,3-diol, Oxazolidinen, Natriumhydroxymethylglycinat, 5-Hydroxymethoxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxypoly[methylenoxy]-methyl-1-1aza-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octan, quaternärem Adamantin oder einer Kombination davon; ein Anticoagulans und ein Quentsch-Mittel enthält; ein Reaktionsprodukt, das durch die Probe und die Schutzmittelzusammensetzung gebildet wird, welches: (i) inert für die Nukleinsäure der biologischen Probe; und (ii) frei von Aldehyd ist; sodass die Nukleinsäuren darin dann für eine Polymerase-Kettenreaktion und DNA-Sequenzierung ohne Einfrieren der Probe für mindestens 7 Tage geeignet sind und die DNA frei von Aldehyd-induzierter (i) Nukleinsäure-Protein-Vernetzung, (ii) intramolekularen und/oder intermolekularen Nukleinsäure-Nukleinsäure-Vernetzungen oder sowohl (i) als auch (ii) ist, durch Quentschen von sämtlichem freien Formaldehyd, das vorhanden sein kann, mit dem Quentsch-Mittel aus der Schutzmittelzusammensetzung.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Lehren beziehen sich hier auf Vorrichtungen und Verfahren zum Stabilisieren und Konservieren zellfreier DNA, ohne DNA-Integrität zu beschädigen, für einen verbesserten Schutz und eine Regulierung von Nukleinsäurematerialien während Sammlung, Lagerung und Versand.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Zellfreie DNA (cfDNA) kommt von Natur aus in Blut vor und wird weitgehend apoptotischen und nekrotischen Prozessen zugeschrieben. Obwohl 1948 das Vorhandensein von cfDNA in Blut entdeckt wurde, wurden ihre Auswirkungen in der klinischen Medizin mehr als zwei Jahrzehnte nicht erkannt. Im Speziellen wurde gezeigt, dass cfDNA im Serum von Patienten mit systemischen Lupus erythematodes vorhanden war und dass cfDNA-Werte im Serum von Krebspatienten erhöht waren. Diese Befunde entzündeten ein Interesse an der möglichen Verwendung von cfDNA in Krankheitsdiagnose und Prognose. Untersuchungen, die an Patienten durchgeführt wurden, die an rheumatoider Arthritis, Dickdarm-, Brust-, Bauchspeicheldrüsen-, Kopf- und Halskrebs litten, haben alle einen deutlichen Anstieg in cfDNA-Konzentrationen gezeigt. Die von Plasma oder Serum von Krebspatienten gewonnene cfDNA hat für Tumor-DNA typische Charakteristika gezeigt und kann als nicht-invasiver Biomarker für einen Krebsnachweis und eine Behandlung dienen.
  • Es besteht auch zunehmendes Interesse an der möglichen Verwendung zellfreier fötaler Nukleinsäuren in einer nicht-invasiven pränatalen Diagnose. Lo et al. Lancet 350 (1997) 485–487 waren die ersten, die zeigten, dass Blutproben von schwangeren Spenderinnen erhöhte mütterliche cfDNA-Konzentrationen aufweisen, und zeigten auch das Vorhandensein von fötaler cfDNA in mütterlichem Plasma. Klinische Anwendungen, die eine fötale cfDNA-Analyse beinhalten, enthalten Geschlechtsbestimmung, Störung eines einzelnen Gens, schwangerschaftsbezogene Störungen und Aneuploidie-Nachweis.
  • Seit dieser Zeit haben kumulative Forschungsergebnisse cfDNA sowohl als prognostischen als auch diagnostischen Indikator für mehrere pathogene Zustände identifiziert; d.h., Krebs-assoziierte genetische und epigenetische Veränderungen, fötale DNA-Mutation und pränatale Diagnose und virale Infektion – durch Nachweis von viraler DNA in menschlichem Blut. Als solches wird ein exakter Nachweis von cfDNA in menschlichen biologischen Proben zu einer etablierten, nichtinvasiven Strategie, die eine Bewertung, ein Screening und eine Krankheitsklassifizierung und -überwachung während einer klinischen Routineanalyse ermöglicht.
  • cfDNA bezieht sich auf DNA-Fragmente, die in mehreren Körperflüssigkeiten nachweisbar sind. Plasma oder Serum werden am häufigsten für diesen Zweck verwendet, aber das Vorhandensein von cfDNA wurde in Harn, Speichel, Fäzes, Synovialflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit und Peritonealflüssigkeit nachgewiesen. Die durchschnittliche zirkulierende Konzentration von cfDNA für ein gesundes Individuum ist 30 ng/ml, die cfDNA ist im Allgemeinen doppelsträngig und etwa 0,18–21 Kilobasen groß (Wagner, J, "Free DNA – new potential analyte in clinical laboratory diagnostics?" (Biochem Med (Zagreb) 22(1); 24–38). Der Nachweis von cfDNA ist jedoch aus den folgenden Gründen eine besondere Herausforderung: (1) während der pränatalen Diagnose können die vorwiegend mütterlichen Zellmaterialien einen Nachweis fötaler cfDNA stören, (2) die Probenverarbeitung nach dem Sammeln kann eine Zelllyse auslösen, was zu einer aberranten Erhöhung in der Menge an zirkulierender cfDNA führt, und (3) der relativ geringe Wert an cfDNA unterstreicht die möglichen Risiken, falsch negative Ergebnisse aufgrund des Verlusts spärlicher Ziel-cfDNA-Sequenzen – aufgrund einer Probeninstabilität oder unangemessenen Probenverarbeitung – zu erzielen. Zu diesem Zweck haben Strategien zur Minimierung kontaminierender zellulärer DNA und Konservierung von cfDNA verschiedene präanalytische Faktoren enthalten, wie die Art von Blutsammelröhrchen, Probenlagerbedingungen und Zentrifugationsprotokolle. Zum Beispiel verhindern Antikoagulanzien, wie EDTA, Heparin und Citrat eine Gerinnung von Vollblutzellen, von der angenommen wird, dass sie die DNA-Freisetzung aus der Leukozytencellpopulation verringert. Ebenso ist die Optimierung von Zentrifugationsbedingungen erforderlich, um eine Lyse zu verhindern und vielmehr intakte Zellen angemessen aus zellfreiem Plasma zu trennen.
  • Aufgrund des geringen Vorkommens der cfDNA-Biomarker ist empfohlen, dass genomische DNA (gDNA) Hintergrundwerte minimiert werden, um exakte Messungen von cfDNA-Werten zu erhalten. Es ist ferner günstig, dass die strukturelle Integrität der cfDNA erhalten bleibt, da minimale Mengen für die Analyse zur Verfügung stehen. Es ist daher notwendig, mehrere präanalytische Themen zu behandeln, die während der Zeit zwischen der Blutabnahme und der folgenden DNA-Isolierung auftreten. Diese Themen enthalten Verzögerungen in der Blutverarbeitung, Blutlagertemperatur und Schütteln der Probe während des Transports und Versands von Blut. Solche Bedingungen können Plasma DNA-(pDNA)Werte verändern, indem sie eine gDNA-Freisetzung aus gelösten nukleierten Blutzellen verursachen und wahre cfDNA trüben. Infolgedessen ist es wichtig, die Art von Blutsammelvorrichtung und Post-Phlebotomiebedingungen bei der Arbeit mit cfDNA-Proben zu berücksichtigen.
  • Frühere Bemühungen haben sich auf chemische Verfahren konzentriert, wie die Verwendung einer Fixierung auf Formaldehydbasis, um die Konzentration der cfDNA-Fraktion anzureichern und die Zeit nach der Venenpunktion zu verlängern, in der eine Probe effektiv analysiert werden kann. Studien, die die Wirksamkeit einer Formaldehydkonservierung von Vollblut für eine langfristige Analyse von cfDNA-Konzentrationen in biologischen Proben untersucht haben, waren mit statistischen Widersprüche behaftet. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass eine Behandlung einer Blutprobe mit Formaldehyd unmittelbar nach der Blutabnahme keine günstigen Wirkungen auf die Konservierung des Anteils an fötaler cfDNA in mütterlichem Plasma hat. (Chinnapapagari SKR, Holzgreve W, Lapaire O, et al, 2004. Treatment of maternal blood samples with formaldehyde does not alter the proportion of circulatory fetal nucleic acids (DNA and RNA) in maternal plasma, Clin Chem 51: 652–655, und Chiu RWK, Chan KCA, Lau TK, et al, 2004. Lack of dramatic enrichment of fetal DNA in maternal plasma by formaldehyde treatment. Clin Chem 51: 655–658). Es wurde auch berichtet, dass Formaldehyd schädliche Wirkungen auf Plasmanukleinsäuren hat (Chung GTY, Chiu RWK, Chan KCA, Lau TK, Leung TN, Chan LW und LO YMD, 2005. Detrimental effect of formaldehyde on plasma RNA detection. Clin Chem 51: 1074–1076). Dies legt nahe, dass, obwohl eine Formaldehydfixierung eine Kontamination von cfDNA-Konzentrationen durch zelluläre DNA verhindern kann, Formaldehyd und chemische Stabilisatoren auf Basis von Formaldehyd alleine sowohl für die exakte als auch präzise Analyse einer cfDNA-Konzentration über längere Zeiträume vor einer Probenanalyse ungeeignet sein können.
  • Es besteht daher ein Bedarf an Verfahren zur Stabilisierung und zum Schutz von cfDNA, durch die eine strukturelle Integrität aufrechterhalten wird und genomische Hintergrund-DNA minimiert wird, so dass ein Versand und eine Lagerung mit minimaler Wirkung auf die cfDNA möglich sind. Es besteht ferner ein Bedarf an solchen Verfahren, in welchen die schädlichen Wirkungen einer Aldehydfixierung vermieden wird.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die Lehren verwenden hier ein Protokoll, das eine einzigartige Schutzmittelzusammensetzung verwendet, die erfolgreich Proben konserviert, während sie die DNA-Integrität für einen längeren Zeitraum (der z.B. mindestens 14 Tage und bei Raumtemperatur sein kann) unter Anwendung mehrerer analytischer Techniken stabilisiert. Die vorliegenden Lehren stellen ein beständiges und wirksames Verfahren zum Konservieren von Nukleinsäuren in biologischen Proben bereit und insbesondere zum Konservieren von DNA in Plasma. Daten, die hier präsentiert werden, beschreiben ein Verfahren, dass eine Blutzelllyse, Nuclease-Aktivität verringert und eine exakte und präzise analytische Analyse durch Konservierung der Endkonzentration von erzielbarer cfDNA im Laufe der Zeit ermöglicht. Somit stellen die Lehren eine neuartige Methode bereit, die die nachfolgende klinische Analyse von cfDNA in Plasma verbessert. Die vorliegende Erfindung verhindert eine Kontamination von Plasma cfDNA mit zellulärer DNA (z.B., genomischer DNA oder gDNA), die aus beschädigten Zellen freigesetzt wird, durch Stabilisieren von Blutzellen in einer Probe. Die vorliegenden Techniken beschreiben einen Schutz der cfDNA durch Hemmung der Desoxyribonuclease-Aktivität in Plasma. Infolge einer Stabilisierung nukleierter Blutzellen ist es nicht mehr länger notwendig, Plasma unmittelbar nach der Venenpunktion zu trennen. Ferner können Proben bei Raumtemperatur bis zu 14 Tage ohne schädliche Auswirkungen auf die Probenintegrität gelagert werden, wodurch die Notwendigkeit einer Kaltlagerung der Plasmaprobe entfällt.
  • Die vorliegenden Lehren stellen ferner Blutsammelvorrichtungen bereit, die Hintergrundwerte genomischer DNA (gDNA) in Plasma verglichen mit K3EDTA-Röhrchen verringern, wenn sie Bedingungen ausgesetzt werden, die während einer Probenlagerung und eines Versands auftreten können. In einem Aspekt ziehen die vorliegenden Lehren ein Verfahren zur Blutprobenbehandlung in Betracht, umfassend ein Anordnen eines Schutzmittels in den hier beschriebenen Blutsammelvorrichtungen. Das Schutzmittel kann ein Konservierungsmittel enthalten. Eine Blutprobe kann in die Blutsammelvorrichtung entnommen werden, wobei die Blutprobe eine erste pDNA-Konzentration hat. Die Blutsammelvorrichtung, die eine Blutprobe enthält, kann von einer ersten Stelle zu einer zweiten Stelle transportiert werden, wobei mindestens ein Teil des Transports bei einer Temperatur von mehr als etwa 0 °C stattfindet. Die cfDNA aus der Probe kann mindestens 24 Stunden nach der Blutabnahme isoliert werden, wobei die Probe eine zweite pDNA-Konzentration hat, wobei die zweite pDNA-Konzentration nicht um einen statistisch signifikanten Wert höher als die erste pDNA-Konzentration ist.
  • Die Lehren enthalten hier ferner, dass das Konservierungsmittel ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Diazolidinylharnstoff und Imidazolidinylharnstoff. Die Konzentration des Konser- vierungsmittels vor dem Kontaktierungsschritt kann zwischen etwa 0,1 g/ml und etwa 3 g/ml sein. Die zellfreie DNA kann aus der Probe mindestens 3 Tage nach Blutabnahme isoliert werden. Die zellfreie DNA kann aus der Probe mindestens 7 Tage nach Blutabnahme isoliert werden. Die zellfreie DNA kann aus der Probe mindestens 14 Tage nach Blutabnahme isoliert werden. Die Probe kann eine erste gDNA-Konzentration bei der Blutabnahme und eine zweite gDNA-Konzentration nach dem Transport haben und die zweite gDNA Konzentration ist nicht um einen statistisch signifikanten Wert höher als die erste gDNA-Konzentration. Der Transportschritt kann ohne Gefrieren der Blutprobe auf eine Temperatur unter etwa –30 °C erfolgen. Das Schutzmittel kann mit der zellfreien DNA so in Kontakt sein, dass nach einem Zeitraum von mindestens 7 Tagen nach dem Zeitpunkt der Blutprobenahme die Menge an zellfreier DNA mindestens etwa 90 % der Menge an zellfreier DNA zum Zeitpunkt der Blutprobenahme ist. Das Schutzmittel kann mit der zellfreien DNA so in Kontakt sein, dass nach einem Zeitraum von mindestens 7 Tagen nach dem Zeitpunkt der Blutprobenahme die Menge an zellfreier DNA, die in der Probe vorhanden ist, etwa 100 % der Menge an zellfreier DNA ist, die in der Probe zum Zeitpunkt der Blutprobenahme vorhanden ist.
  • Die Lehren ziehen hier Schutzmittelzusammensetzungen und Verfahren zum Stabilisieren einer biologischen Probe zur Analyse in Betracht. Die Schutzmittelzusammensetzung enthält im Allgemeinen ein Konservierungsmittel, wie hier beschrieben; und ein Quentsch-Mittel um im Wesentlichen eine Reaktion eines freien Aldehyds (z.B. Formaldehyd) mit DNA in einer Probe zu verringern. Solche Verfahren können einen Schritt zum Erhalten einer biologischen Probe von einem Subjekt in Blutsammelvorrichtung enthalten. Die biologische Probe enthält mindestens eine zirkulierende zellfreie erste Nukleinsäure von dem Subjekt. Die Verfahren können einen Schritt zum Kontaktieren der biologischen Probe, während sie sich in der Blutsammelvorrichtung befindet, mit einer Schutzmittelzusammensetzung enthalten, die ein Konservierungsmittel, ein optionales Antikoagulans und ein Quentsch-Mittel enthält, um ein Gemisch zu bilden, das die Schutzmittelzusammensetzung und die Probe enthält. Die Verfahren können einen Schritt zum Quentschen von jeglichem vorhandenen freien Formaldehyd mit dem Quentsch-Mittel aus der Schutzmittelzusammensetzung enthalten, so dass das freie Formaldehyd zur Bildung eines Reaktionsprodukts reagiert, das für die cfDNA der biologischen Probe inert ist. Das erhaltene Gemisch kann frei von Aldehyd sein und cfDNA oder andere Nukleinsäuren in der Probe können für eine Polymerase-Kettenreaktion, DNA-Sequenzierung und andere folgende Anwendungen geeignet sein. Das erhaltene Gemisch kann im Wesentlichen frei von Aldehyd-induzierter (i) Nukleinsäure-(z.B. DNA) zu Protein-Vernetzung, (ii) intramolekularen und/oder intermolekularen Nukleinsäure-(z.B., DNA) zu Nukleinsäure-(z.B., DNA)Vernetzungen; oder sowohl (i) als auch (ii) sein, um dadurch eine Probe zu bilden, die durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifizierbar ist, für eine DNA-Sequenzierung geeignet ist und durch Minisatelliten-(Variable Number Tandem Repeat, VNTR)Analyse analysierbar oder beides ist.
  • Für Proben, die aus Blut abgeleitet sind, kann ein Blutabnahmeschritt zur Blutabnahme von einem Patienten in eine Blutsammelvorrichtung erfolgen, in die die Schutzmittelzusammensetzung vor dem Blutabnahmeschritt eingebracht wird. Das Verfahren kann einen Schritt zum Transport der Probe, während sie mit der Schutzmittelzusammensetzung in Kontakt ist, von einer Blutabnahmestelle zu einem klinischen Labor enthalten (das z.B. mindestens 100 Meter, 1000 Meter, 10.000 Meter von der Blutabnahmestelle entfernt ist), wo eine Probenanalyse stattfinden wird. Das Quentschen erfolgt vor dem und/oder im Wesentlichen gleichzeitig mit dem Kontaktierungsschritt. Die Verfahren können einen Schritt zum Isolieren zellfreier DNA aus der Probe enthalten. Die Verfahren können frei von jeglichem Probenzentrifugationsschritt sein. Die Verfahren können frei von jedem Schritt zum Isolieren von zellfreier fötaler DNA aus mütterlichem Blut sein. Die Verfahren können frei von jeglichem Schritt zum Kühlen der Probe (z.B. auf eine Temperatur unter Raumtemperatur, wie etwa 10 °C oder kühler) sein, nachdem sie mit der Schutzmittelzusammensetzung in Kontakt gebracht wurde.
  • Wie aus dem Vorhergesagten hervorgeht, stellen die Lehren hier eine vorteilhafte Behandlung von DNA-haltigen Proben bereit und stellen stabilisierte Proben bereit, die im Wesentlichen frei von nachweisbaren kovalenten Modifizierungen sind, die eine PCR-Amplifizierung hemmen, wie durch Hemmung einer Polymerase-Bindung und -Verlängerung, einer Primer-Hybridisierung und/oder DNA-Farbstoffeinlagerung (wie mit SYBR-Grün oder Ethidiumbromid). Sämtliche Modifizierungen an Nukleinsäuren (z.B. DNA), die eine exakte PCR-Analyse und DNA-Sequenzierung infolge einer Behandlung mit den Schutzmittelzusammensetzungen der vorliegenden Lehren hemmen könnten, sind mindestens 24, 48, oder 96 Stunden, 1 Woche oder sogar zwei Wochen verzögert. Es fehlt deutlich jedes Anzeichen einer Wechselwirkung der Schutzmittelzusammensetzung mit DNA, die von zufälliger Art ist, im Laufe der Zeit zunimmt oder beidem. Somit ermöglicht die Anwendung der vorliegenden Lehren eine größere Vorhersagbarkeit, die dazu beiträgt sicherzustellen, dass jegliche DNA-Sequenz von Interesse, die amplifiziert oder sequenziert werden soll, nicht beschädigt wird. Dies bietet einen Vorteil gegenüber einer Behandlung von DNA nur mit Formaldehyd. Das heißt, es wird angenommen, dass eine Formaldehydmodifizierung unmittelbar eine Amplifizierung einiger Gene verhindert und die Anzahl von Genen, die nicht amplifiziert werden, im Laufe der Zeit zunimmt. Es gibt keine Vorhersage, welche Gene als erste modifiziert werden. Daher könnte ein Kliniker nicht imstande sein, gewisse Biomarker und/oder andere Geneigenschaften (wie kritische Genmutationen oder Deletionen, die eine fötale Entwicklung beeinflussen, im Zusammenhang mit einer zellfreien fötale DNA-Analyse) nachzuweisen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGE
  • 1a zeigt eine Grafik, die die Wirkung einer beispielhaften Schutzmittelzusammensetzung auf einen pDNA-Nachweis durch qPCR 3 und 6 Stunden nach Blutabnahme darstellt.
  • 1b zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung einer beispielhaften, Schutzmittelzusammensetzung gemäß den vorliegenden Lehren auf einen pDNA-Nachweis durch qPCR 7 und 14 Tage nach Blutabnahme.
  • 2a zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung erhöhter Hintergrund-gDNA in Plasma auf den Nachweis seltener DNA-Sequenzen.
  • 2b zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung erhöhter Hintergrund-gDNA in Plasma auf den Nachweis seltener DNA-Sequenzen und die Wirkung einer beispielhaften Schutzmittelzusammensetzung gemäß den vorliegenden Lehren.
  • 3a und 3b zeigen grafische Darstellungen der Wirkung von Schütteln und Versand auf die pDNA-Konzentration in Blutproben, enthaltend Blutproben, die mit einer beispielhaften Schutzmittelzusammensetzung in einer Blutsammelvorrichtung gemäß den vorliegenden Lehren behandelt wurden, und Blutproben in K3EDTA-Standardröhrchen.
  • 4a und 4b zeigen grafische Darstellungen der Wirkung einer Lagertemperatur auf die pDNA-Konzentration in Blutproben, enthaltend Blutproben, die mit einer beispielhaften Schutzmittelzusammensetzung in einer Blutsammelvorrichtung gemäß den vorliegenden Lehren behandelt wurden, und Blutproben in K3EDTA-Standardröhrchen.
  • 5 ist eine schematische Darstellung zur Veranschaulichung möglicher Wechselwirkungen zwischen einem Aldehyd (z.B. Formaldehyd) und einer genomischen DNA-Probe.
  • 6a und 6b zeigen die schematischen Darstellungen einer der mehreren Arten von DNA-DNA- und einer der mehreren Arten von DNA-Protein-Vernetzungsreaktionen.
  • 7a ist eine 13C Kernmagnetresonanz-(NMR)Ablesung für eine Probe, die mit einer beispielhaften Schutzmittelzusammensetzung gemäß den vorliegenden Lehren behandelt wurde, die das deutliche Fehlen einer Spitze bei 82 ppm zeigt, was bestätigt, dass die behandelte Probe im Wesentlichen frei von freiem Formaldehyd ist.
  • 7b ist eine 13C (NMR) Ablesung für eine Formaldehydprobe gemäß den vorliegenden Lehren, die das charakteristische Vorhandensein einer Spitze bei 82 ppm zeigt.
  • 8a ist eine Reihe von Fluoreszenz-(flr)Spektrometrie-Intensitätskurven für einen Vergleich einer DNA-haltigen Kontrollprobe ("DNA (Kontrolle)") und DNA-haltigen Proben, die mit einem von einer Schutzmittelzusammensetzung ("DNA + CF DNA – 1") gemäß den vorliegenden Lehren, Formaldehyd ("DNA + 0,1 % Form") oder Glutaraldehyd ("DNA + 0,1 % Glut") behandelt sind; wobei die Reihe Proben nach sieben Tagen bei Raumtemperatur (obere Kurve: "RT 7 Tage"), Proben nach sieben Tagen bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Erwärmung über eine Stunde bei 60 °C (mittlere Kurve: "RT 7 Tage + 60 °C – 1h) und Proben nach sieben Tagen bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Erwärmung über zwei Minuten bei 90 °C (mittlere Kurve: "RT 7 Tage + 90 °C – 2 min") zeigt.
  • 8b ist eine Reihe von Spektrometrie-Intensitätskurven für einen Vergleich Fluoreszenz-(flr)Spektrometrie-Intensitätskurven für einen Vergleich einer DNA-haltigen Kontrollprobe ("DNA (Kontrolle)") und DNA-haltigen Proben, die mit einem von einer Schutzmittelzusammensetzung ("DNA + CF DNA – 1") gemäß den vorliegenden Lehren, Formaldehyd ("DNA + 0,1 % Form") oder Glutaraldehyd ("DNA + 0,1 % Glut") behandelt sind; wobei die Reihe Proben nach vierzehn Tagen bei Raumtemperatur (obere Kurve: "RT 14 Tage"), Proben nach vierzehn Tagen bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Erwärmung über eine Stunde bei 60 °C (mittlere Kurve: "RT 14 Tage + 60 °C – 1h") und Proben nach vierzehn Tagen bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Erwärmung über zwei Minuten bei 90 °C (mittlere Kurve: "RT 14 Tage + 90 °C – 2 min") zeigt.
  • 9a–9c sind Gelelektrophorese-Bilder, die die PCR-Amplifizierung von unbehandelter DNA (Kontroll-DNA); DNA-Proben, die mit einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Lehre behandelt sind (bezeichnet als DNA + CF-DNA-BCT), DNA-Proben, die mit Formaldehyd behandelt sind (bezeichnet als DNA + Form), und DNA-Proben, die mit Glutaraldehyd behandelt sind (bezeichnet als DNA + Glut), veranschaulichen.
  • 10a–10d sind Kurven, die Ergebnisse einer quantitativen Echtzeitanalyse für eine Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)Amplifikation von DNA-Proben, die mit einem von einer Schutzmittelzusammensetzung ("DNA + cfDNA-BCT") gemäß den vorliegenden Lehren, wobei eine Probe in eine Blutsammelvorrichtung entnommen wird, die eine Schutzmittelzusammensetzung der vorliegenden Lehren enthält, Formaldehyd ("DNA + 0,1 % Form") oder Glutaraldehyd ("DNA + 0,1 % Glut) behandelt sind, und zum Vergleich für eine unbehandelte DNA-Kontrollprobe ("DNA Kontrolle") angeben.
  • 11 zeigt eine grafische Darstellung, die eine quantitative Echtzeitanalyse für eine Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)Amplifikation von DNA-Proben, die mit einem von einer Schutzmittelzusammensetzung ("DNA + cfDNA-BCT") gemäß den vorliegenden Lehren, wobei eine Probe in eine Blutsammelvorrichtung entnommen wird, die eine Schutzmittelzusammensetzung der vorliegenden Lehren enthält, Formaldehyd ("DNA + 0,1 % Formaldehyd") oder Glutaraldehyd ("DNA + 0,1 % Glutaraldehyd"), behandelt sind, und zum Vergleich für eine unbehandelte DNA-Kontrollprobe ("DNA Kontrolle") angibt.
  • 12a und 12b sind Kurven von Zirkulardichroismusspektren, die Kurven einer nativen DNA-Kontrolle (die Kurve, die mit "DNA-RT" bezeichnet ist, die ganz unten am Schnittpunkt y-Achse) beginnt; einer DNA-Probe, die gemäß den vorliegenden Lehren "behandelt ist (die Kurve, die mit "DNA + CF DNA BCT-RT bezeichnet ist, die an der höchsten Stelle ihres Schnittpunkts mit der y-Achse beginnt); und einer DNA-Probe, die mit Formaldehyd behandelt ist (die Kurve, die mit "DNA = 0,1 %Form RT" bezeichnet ist), darstellen.
  • 13a–13d sind Agarose-Gelelektrophores-Bilder, die eine Anzahl paralleler Bahnen zeigen und unbehandelte Kontrollproben (bezeichnet als "Native DNA"; Bahnen 1, 2, 8 und 9); DNA-Proben, die mit einer Schutzmittelzusammensetzung gemäß den vorliegenden Lehren behandelt sind (bezeichnet als "DNA + cfDNA"; Bahnen 3, 4, 10 und 11); DNA-Proben, die nur mit Imidazolidinylharnstoff behandelt sind (bezeichnet als "DNA + IDU"; Bahnen 5 und 12); Proben, die mit Formaldehyd behandelt sind (bezeichnet als "DNA + 0,1 % Form": Bahnen 6 und 13); und Proben, die mit Glutaraldehyd behandelt sind, (bezeichnet als "DNA + 0,1 % Glut"; Bahnen 7 und 14) darstellen.
  • 14 zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung einer DNase-Behandlung von Plasma auf die cfDNA-Konzentration.
  • 15 zeigt eine grafische Darstellung der Wirkung einer Lagerung auf die cfDNA-Konzentration in Blutproben in K3EDTA-Röhrchen.
  • 16 zeigt eine grafische Darstellung einer Auswirkung einer Lagerung auf die cfDNA-Konzentration in Blutproben in Blutsammelvorrichtungen gemäß den vorliegenden Lehren.
  • 17 zeigt die chemische Gleichung für einen beispielhaften Quentsch-Schritt gemäß den vorliegenden Lehren.
  • 18 zeigt die chemische Gleichung für einen zusätzlichen beispielhaften Quentsch-Schritt gemäß den vorliegenden Lehren.
  • 19 zeigt eine grafische Darstellung einer Formaldehydfreisetzung und Quentschen mit verschiedenen Mitteln.
  • 20 zeigt ein Vorhandensein von hydriertem Formaldehyd bei verschiedenen Quentsch-Mitteln.
  • 21 zeigt Formaldehydkonzentrationen in Gegenwart von verschiedenen Quentsch-Mitteln.
  • 22 zeigt mögliche chemische Gleichungen für die Freisetzung von hydriertem Formaldehyd.
  • 23 zeigt die chemische Präsenz in einem Glycin/Formaldehyd-Gemisch.
  • 24 zeigt die chemischen Gleichung für die Reaktion von Glycin und Formaldehyd bei Raumtemperatur.
  • 25 zeigt die chemischen Gleichung für die Reaktion von Glycin und Formaldehyd bei 50 °C über 4 Tage.
  • 26 zeigt mögliche chemische Gleichungen für eine Formaldehydfreisetzung und anschließende Formaldehyd/Glycin-Reaktion.
  • 27 zeigt die chemische Gleichung für eine Quentsch-Mittel/Formaldehyd-Reaktion.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Falls nicht anderes angegeben ist, beziehen sich hier angegebene Prozent auf Gewichtsprozent. Ferner, falls der Zusammenhang der Besprechung nicht das Gegenteil angibt, können Bezugnahmen auf eine Nukleinsäure Ribonukleinsäure (RNA), Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Fragmente von diesen enthalten. So bezieht sich zum Beispiel eine Besprechung von zellfreier DNA (cfDNA) nur auf zellfreie DNA, nicht aber auf DNA-Fragmente.
  • Die vorliegenden Lehren ziehen ein nichtinvasives genetisches Screening-Verfahren für die Identifizierung von DNA-Sequenzeigenschaften in Betracht, die möglicherweise auf verschiedene pathologische Zustände hinweisen, enthaltend, ohne aber darauf beschränkt zu sein: Krebs; eine neurogenerative Störung, eine psychiatrische Störung, Virusinfektion, pränatale Diagnose, Autoimmunkrankheiten, Mikrochimärismen, akuten Herzmuskelinfarkt, Schlaganfall, Mesenterialinfarkt und Bauchspeicheldrüsenentzündung. Die vorliegenden Lehren sehen nicht nur ein Konservieren des Zustands von Zellen in einer Probe (z.B. durch Stabilisieren der Zellmembrane, so dass eine Freisetzung von Nukleinsäure aus den Zellen verhindert wird) vor, sondern sehen auch einen Schutz der zellfreien DNA vor nachteiligen Wirkungen einer Desoxyribonuclease-Aktivität vor. Die Verfahren der vorliegenden Lehren beinhalten im Allgemeinen Schritte zum Kontaktieren einer biologischen Probe (wobei die Probe optional frei von jeglicher fötaler DNA ist (z.B. kann sie frei von jeglicher zellfreier fötaler DNA sein) und mehrere Blutzellen und zellfreie Biomoleküle enthalten kann), mit einer Aldehyd-freien (z.B. Formaldehyd-freien) Schutzmittelzusammensetzung in einer Menge und über eine Zeit, die ausreichend ist, um (1) die Freisetzung genomischer DNA in die Blutprobe und (2) eine Desoxyribonuclease-Aktivität, die zellfreie Nukleinsäuren (z.B. cfDNA) in der Probe abbaut, zu verhindern. Die Behandlung ist derart, dass sie im Wesentlichen verhindert, dass freies Aldehyd nachteilig mit den zellfreien Nukleinsäuren der Probe (z.B. cfDNA) reagiert, wie durch Verwenden eines Quentsch-Mittels. Auf diese Weise können wesentliche Mengen an cfDNA aus der Probe mit geringen Bedenken isoliert werden, dass die isolierte cfDNA DNA enthält, die von einer Zelle aus der Probe freigesetzt wird, nachdem die Probe erhalten wurde. Die Integrität der Nukleinsäure (z.B. die cfDNA-Integrität) ist im Wesentlichen in dem Zustand wie bereitgestellt konserviert (z.B. in dem Zustand zum Zeitpunkt der Blutabnahme), indem die schädlichen Wirkungen eines Aldehyds (z.B. Formaldehyd) verhindert werden. Somit kann eine exakte und präzise analytische Analyse der Nukleinsäure (z.B. cfDNA in Plasma) der Probe erreicht werden. Das Verfahren kann ferner Schritte zum Analysieren der Nukleinsäure (z.B. cfDNA) aus einer Probe enthalten, die wie oben angegeben behandelt wurde oder die sonst mit der Schutzmittelzusammensetzung und dem Quentsch-Mittel darin in Kontakt gebracht wurde. Wie angegeben, ermöglichen die vorliegenden Lehren eine Identifizierung von cfDNA-Eigenschaften für eine prognostische und diagnostische Verwendung verschiedener pathologischer Zustände in der Klinik.
  • Chemikalien auf Aldehydbasis, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd, reagieren mit einer Reihe von nukleophilen Zellbestandteilen, wobei sie zum Beispiel Methylolderivate der Mercaptangruppe von Glutathion und der Amingruppen von RNA, DNA und Protein bilden. Zusätzlich wirken diese Aldehyde als Vernetzungsmittel, die intra- und intermolekulare DNA-Protein- und DNA-DNA-Vernetzungen bilden. Die oben angegebene Kombination der Formaldehyd-ausgelösten DNA-Modifizierungen kann ein DNA-Schmelzen, eine DNA-Amplifizierbarkeit während der Polymerase-Kettenreaktion-(PCR)Analyse und DNA-Sequenzierung beeinflussen. Für genetische Studien, die um die PCR gestaltet sind, kann dies eine Verringerung in cfDNA-Konzentrationen bewirken und den Nachweis seltener DNA-Ziele nach einer längeren Fixierung mit Formaldehyd verhindern. Zusätzlich zu den schädlichen Wirkungen, die Fixierungsmittel auf Aldehydbasis auf eine PCR-basierte Analyse von cfDNA haben, zeigten Ganguly et al. Heterogeneitäten in den Fluoreszenzemissionsspektren von Formaldehyd-fixierten DNA-Proben, die sich in einem geringen gesamten fluoreszierenden Signal und falschen Daten manifestierten (Ganguly S, Clayton AHA und Chattopadhyay A. 2011 Bioche. Biophy. Res. Comm. 405: 234–237). Eine Fixierung verändert die Fluoreszenzlebensdauer und Anisotropie von Zellen, die EYFP-getaggten Serotonin1A Rezeptor exprimieren. Insgesamt lässt die Arbeit in diesem Bereich darauf schließen, dass Formaldehyd erfolgreich als Zellkonservierungsmittel dienen kann, aber für folgende analytische Analysen zur Messung exakter cfDNA-Konzentrationen, für einen Nachweis seltener DNA-Ziele und eine DNA-Sequenzierung schädlich ist, was wahrscheinlich eine Folge der nachteiligen chemischen Modifizierungen ist, die mit einer längeren Fixierung von Biomolekülen (d.h., DNA, RNA und Protein) einhergehen. Daher besteht zur Verbesserung einer qualitativen und quantitativen analytischen Analyse von cfDNA-Konzentrationen in humanem biologischen Fluid ein klarer Bedarf an einem zeit- und kosteneffektiven Verfahren, das Formaldehyd-frei ist und die biologische Probe konserviert, während die Probenintegrität, Quantität und Spezifität der zu analysierenden cfDNA beibehalten werden.
  • Die vorliegenden Lehren sehen vor, dass eine einzige Schutzmittelzusammensetzung verwendet werden kann, die eine konservierende Zusammensetzung und ein Quentsch-Mittel enthält. Eine solche Schutzmittelzusammensetzung kann im Voraus in eine Probensammelvorrichtung, wie ein Blutsammelröhrchen eingebracht werden (das auf einen Druck unter atmosphärischen Druck nach dem Beladen evakuiert werden kann). Somit ist es möglich, eine Probe von einem Subjekt – direkt in die Probensammelvorrichtung (z.B. ein Blutsammelröhrchen) zu entnehmen, wobei sie zu diesem Zeitpunkt mit der Schutzmittelzusammensetzung in Kontakt gelangt. Es ist auch möglich, dass eine Probe von einem Subjekt in einen ersten Behälter entnommen wird und die Probe anschließend in einen oder mehrere zweite Behälter überführt wird, in welchen die Schutzmittelzusammensetzung vorhanden ist.
  • Die Aldehyd-freie (z.B. Formaldehyd-freie) Schutzmittelzusammensetzung kann eine Konservierungsmittelzusammensetzung enthalten, wie eine, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Diazolidinylharnstoff, Imidazolidinylharnstoff, Dimethoylol-5,5-dimethylhydantoin, Diethylharnstoff, 2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol, Oxazolidinen, Natriumhydroxymethylglycinat, 5-Hydroxymethoxymethyl-1--1aza-3,7-dioxabicyclo [3.3.0] octan, 5-Hydroymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo [3.3.0] octan, 5-Hydroxypoly[methylenoxy]methyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo [3.3.0] octan, quaternärem Adamantin und jeder Kombination davon. Obwohl die Aldehyd-freie (z.B., Formaldehyd-freie) Schutzmittelzusammensetzung einen Aldehyd (z.B., Formaldehyd) freisetzen kann, sehen die vorliegenden Lehren einen spezifischen Schritt zum Quentschen des Aldehyds vor, um es für die cfDNA inert zu machen.
  • Die Konservierungsmittelzusammensetzung wird wünschenswerterweise in Kombination mit einem Quentsch-Mittel verwendet, das dazu beiträgt sicherzustellen, dass Nukleinsäure (z.B. DNA) in der Probe keinem freien Aldehyd (z.B. freiem Formaldehyd) ausgesetzt wird, das eine oder mehrere schädliche Wirkungen auf die Nukleinsäure verursachen könnte. Daher ziehen die vorliegenden Lehren eine Verwendung von mindestens einem Aldehyd-Quentsch-Mittel in Betracht, das in einer ausreichenden Menge verwendet wird, sodass jedes freie Aldehyd (z.B. Formaldehyd), das aus der Schutzmittelzusammensetzung freigesetzt wird, zur Bildung eines Reaktionsprodukts reagiert, das für die Nukleinsäure der biologischen Probe inert ist, das erhaltene Gemisch frei von Aldehyd ist und Nukleinsäuren in der Probe für eine Polymerase-Kettenreaktion und DNA Sequenzierung geeignet sind und eine strukturelle Integrität vergleichbar mit nativen Nukleinsäuren aufweist (z.B. weist DNA eine Elliptizität auf, die im Wesentlichen jener von nativer DNA ähnlich ist, wie durch Zirkulardichroismusspektroskopie gemessen, oder weist eine DNA-Farbstofffluoreszenz auf, die im Wesentlichen jener von nativer DNA ähnlich ist, wie durch Fluoreszenzspektroskopie gemessen).
  • Die Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung vor Probenkontakt kann bei einer Konzentration liegen, bei der keine Vernetzung von DNA zu DNA und DNA zu Proteinen beobachtet wird, wie durch Agarose-Gelelektrophorese gezeigt. Die Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung nach Probenkontakt kann höher als etwa 20 mg/ml, 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2 mg/ml oder sogar geringer als etwa 0,8 g/ml des Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung und biologischen (z.B. Blut-)Probe sein. Die Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung nach Probenkontakt kann mehr als etwa 0,1 g/ml des Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung und biologischen (z.B. Blut-)Probe sein. Beispielsweise kann die Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung nach Probenkontakt zwischen ungefähr 0,1 g/ml bis ungefähr 0,8 g/ml des Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung und biologischen (z.B. Blut-)Probe liegen. Die Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung nach Probenkontakt kann zwischen ungefähr 0,3 g/ml bis ungefähr 0,6 g/ml des Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung und biologischen (z.B. Blut-)Probe liegen. Die Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung sowohl vor als auch nach dem Kontakt mit einer Blutprobe kann abhängig von den diagnostischen Prozeduren, welchen eine Probe unterzogen werden kann, modifiziert werden. Beispielsweise kann die Konzentration für den Fall modifiziert werden, dass eine Probe einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen wird. Im Speziellen kann die Konzentration für den Fall erhöht sein, dass eine Probe einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen wird. Somit kann die Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung nach Probenkontakt höher als etwa 15 mg/ml, höher als etwa 25 mg/ml oder sogar höher als etwa 30 mg/ml nach Probenkontakt sein. Die Formulierung der Schutzmittelzusammensetzung (und der darin enthaltenen Konservierungsmittelzusammensetzung) kann auch so modifiziert werden, dass eine Probe, die einer Durchflusszytometrieanalyse unterzogen wird, Diazolidinylharnstoff enthalten kann. Die Schutzmittelzusammensetzung kann auch ein Quentsch-Mittel enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann auch EDTA enthalten.
  • Das Quentsch-Mittel kann eine oder mehrere Verbindungen sein, die mindestens eine funktionelle Gruppe enthalten, die imstande sind, mit einer elektronendefizienten funktionellen Gruppe eines Aldehyds zu reagieren (z.B. eine Aminverbindung, die mit Formaldehyd zur Bildung von Methylol und/oder Imin-Schiff-Base reagiert, oder eine cis-Diolverbindung, die mit Formaldehyd zur Bildung von zyklischem Acetal reagiert). Das Quentsch-Mittel kann ausgewählt sein aus Aminosäuren, Alkylaminen, Polyaminen, primären Aminen, sekundären Aminen, Ammoniumsalzen, Nukleobasen oder einer Kombination davon. Das Quentsch-Mittel kann ausgewählt sein aus Glycin, Lysin, Ethylendiamin, Arginin, Harnstoff, Adinin, Guanin, Cytosin, Thymin, Spermidin oder einer Kombination davon.
  • Die Konzentration des Quentsch-Mittels ist eine Menge, die ausreichend groß ist, dass nach Kontaktieren der Probe mit der Schutzmittelzusammensetzung freies Aldehyd fehlt (z.B. freies Formaldehyd fehlt). Die Konzentration ist jedoch ausreichend gering, dass eine Verdünnung der Probe eine analysierte Eigenschaft der Probe nicht wesentlich beeinflusst. Die Konzentration des Formaldehyd-Quentsch-Reagens nach dem Probenkontaktierungsschritt kann über etwa 0,001 g/ml, 0,002 g/ml oder sogar etwa 0,004 g/ml des Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung und biologischen (z.B. Blut-)Probe sein. Die Konzentration des Formaldehyd-Quentsch-Reagens nach dem Probenkontaktierungsschritt kann unter etwa 0,03 g/ml, 0,01 g/ml oder sogar etwa 0,008 g/ml des Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung und biologischen (z.B. Blut-)Probe sein. Beispielsweise kann die Konzentration des Formaldehyd-Quentsch-Reagens nach dem Probenkontaktierungsschritt zwischen etwa 0,004 g/ml bis etwa 0,008 g/ml sein.
  • Die vorliegenden Lehren sehen auch die Verwendung eines Quentsch-Mittels vor, dass eine Kombination von Glycin mit einem oder mehreren zusätzlichen Quentsch-Mitteln ist, oder eines Quentsch-Mittels einer Art und in einer Menge wie hier beschrieben, das nicht Glycin ist. Zum Beispiel kann ein solches Quentsch-Mittel (wie hier gelehrt) in Kombination mit einem Antikoagulans und mit der Konservierungsmittelzusammensetzung, wie beschrieben, zur Behandlung jeder Probe verwendet werden, die zellfreie DNA (z.B. fötale zellfreie DNA) enthalten kann.
  • Nach In-Kontakt-Bringen mit einer Probe zur Bildung eines Gemisches der Probe und der Schutzmittelzusammensetzung (z.B. zum Zeitpunkt der Blutabnahme in eine Blutsammelvorrichtung, die eine Schutzmittelzusammensetzung der vorliegenden Lehren enthält), kann die Schutzmittelzusammensetzung in einer insgesamt kleinen Fraktion des Gemischvolumens vorhanden sein. Zum Beispiel kann sie in einer Menge vorhanden sein, die kleiner als etwa 5 %, 2 %, 0,5 % oder sogar kleiner als etwa 0,3 % des gesamten Gemischvolumens ist. Zum Beispiel kann die Schutzmittelzusammensetzung in einer Menge von etwa 1:20 Volumenteilen bis etwa 1:300 Volumenteilen des Gemisches vorhanden sein. Die Menge der Schutzmittelzusammensetzung kann etwa 1:50 Volumenteile bis etwa 1:200 Volumenteile des Gemisches betragen.
  • Während mindestens des Kontaktierungsschritts beträgt die Menge der Schutzmittelzusammensetzung etwa 1:20 (1 Teil Schutzmittelzusammensetzung zu 20 Teilen des gesamten Gemisches) Volumenteile bis etwa 1:300 Volumenteile des gesamten Gemisches (das sowohl die Schutzmittelzusammensetzung als auch die biologische Probe enthält). Zum Beispiel beträgt während mindestens des Kontaktierungsschritts die Menge der Schutzmittelzusammensetzung etwa 1:100 Volumenteile bis etwa 1:200 Volumenteile des Gemisches.
  • Die Schutzmittelzusammensetzung kann mindestens eine Schutzmittelzusammensetzung enthalten, ausgewählt aus Diazolidinylharnstoff, Imidazolidinylharnstoff, Dimethoylol-5,5-dimethylhydantoin, Dimethylolharnstoff, 2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol, Oxazolidinen, Natriumhydroxymethylglycinat, 5-Hydroxymethoxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxymethyl-1-1aza-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxypoly[methylenoxy]methyl-1-1aza-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octan, quaternärem Adamantin, 2-aminosaurer Säure oder einer Kombination davon. Zur Veranschaulichung kann der Kontaktierungsschritt die Verwendung einer Zusammensetzung als Schutzmittelzusammensetzung enthalten, die Imidazolidinylharnstoff in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 2,0 Gew.-% des gesamten Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung plus eine biologische Probe enthält; optional Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Menge von etwa 0,05 bis etwa 0,75 Gew.-% des gesamten Gemisches der Schutzmittelzusammensetzung plus eine biologische Probe; und ein Quentsch-Mittel in einer ausreichenden Menge, um mit einem freien Aldehyd (z.B. Formaldehyd) zu reagieren, das aus dem Imidazolidinylharnstoff entstehen kann, um ein Reaktionsprodukt zu bilden, das nicht zur Denaturierung eines Proteins der biologischen Probe reagiert. Die Schutzmittelzusammensetzung kann (vor Kontakt mit einer biologischen Probe) etwa 20 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% Imidazolidinylharnstoff enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann mindestens etwa 30 Gew.-% Imidazolidinylharnstoff enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann mindestens: etwa 40 Gew.-% Imidazolidinylharnstoff und weniger als etwa 55 Gew.-% Imidazolidinylharnstoff enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann etwa 1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% des Quentsch-Mittels enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann mindestens etwa 2 Gew.-% des Quentsch-Mittels enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann mindestens etwa 4 Gew.-% des Quentsch-Mittels und weniger als etwa 8 Gew.-% des Quentsch-Mittels enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann etwa 1 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% EDTA enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann mindestens etwa 5 Gew.-% EDTA enthalten. Die Schutzmittelzusammensetzung kann mindestens etwa 7 Gew.-% EDTA und weniger als etwa 10 Gew.-% EDTA enthalten.
  • Die Schutzmittelzusammensetzung kann im Voraus in ein Röhrchen eingebracht werden und kann in einer Menge von etwa 50 bis etwa 400 μl Schutzmittelzusammensetzung im Voraus eingebracht werden. Die im Voraus eingebrachte Menge kann mindestens etwa 100 µl und weniger als etwa 300 µl sein. Die im Voraus eingebrachte Menge kann mindestens etwa 150 µl und weniger als etwa 250 µl sein. In der im Voraus eingebrachten Schutzmittelzusammensetzung kann die Schutzmittelzusammensetzung mindestens etwa 80 mg und weniger als etwa 100 mg der Schutzmittelzusammensetzung umfassen. Das Quentsch-Mittel kann mindestens etwa 1 mg und weniger als etwa 15 mg der Schutzmittelzusammensetzung umfassen. EDTA kann mindestens etwa 10 mg und weniger als etwa 25 mg der Schutzmittelzusammensetzung umfassen. Bezüglich der Schutzmittelzusammensetzung kann sie eine Menge von etwa 10 Gewichtsteilen der Schutzmittelzusammensetzung pro etwa 1 Gewichtsteil des Quentsch-Mittels umfassen. Das Quentsch-Mittel kann eine Verbindung enthalten, die mindestens eine funktionelle Gruppe enthält, die imstande ist, mit einer elektrondefizienten funktionellen Gruppe von Formaldehyd zu reagieren (z.B. eine Aminverbindung, die mit Formaldehyd zur Bildung von Methylol oder Imin-Schiff-Base reagiert, oder eine cis-Diolverbindung, die mit Formaldehyd zur Bildung von zyklischem Acetal reagiert). Das Quentsch-Mittel kann ein Inhaltsstoff sein, der ausgewählt ist aus Aminosäuren, Alkylaminen, Polyaminen, primären Aminen, sekundären Aminen, Ammoniumsalzen oder einer Kombination davon. Es kann ein Inhaltsstoff sein, der ausgewählt ist aus Glycin, Lysin, Ethylendiamin, Arginin, Harnstoff, Adinin, Guanin, Cytosin, Thymin, Spermidin oder einer Kombination davon. Es kann ein Inhaltsstoff sein, der ausgewählt ist aus Glycin, Lysin, Ethylendiamin, Harnstoff, oder einer Kombination davon. Der Quentsch-Schritt kann ein Reagieren von freiem Aldehyd (z.B. Formaldehyd) zur Bildung von Methylol, Imin-Schiff-Base, eines Schiff-Base-Quentsch-Mittel-Vernetzungsreaktionsprodukts, eines Schiff-Base-Dimers oder einer Kombination davon sein.
  • Die Isolierung von cfDNA aus Plasma kann ein Isolieren von cfDNA in Abwesenheit einer Zelle enthalten. Einer oder beide von dem Isolierungs- oder Analysierungsschritt können mindestens 2 Stunden, 7 Tage, oder 14 Tage nach Venenpunktion erfolgen. Einer oder beide von dem Isolierungs- oder Analysierungsschritt können ohne und/oder vor einem Einfrieren der Probe oder eines ihrer Inhaltsstoffe (d.h., auf eine Temperatur unter etwa –30 °C, bevorzugter unter etwa –70 °C) erfolgen.
  • Die Schutzmittelzusammensetzung kann optional einen Nuclease-Inhibitor enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Diethylpyrocarbonat, Ethanol, Aurintricarbonsäure (ATA), Formamid, Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen, Macaloid, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Proteinase K, Heparin, Hydroxylamin-Sauerstoff-Kupferionen, Bentonit, Ammoniumsulfat, Dithiothreitol (DTT), Beta-Mercaptoethanol (BME), Cystein, Dithioerythritol, tris(2-Carboxyethyl)phosphen-Hydrochlorid, einem divalenten Kation wie Mg2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+ und jeder Kombination davon. Die Schutzmittelzusammensetzung kann eine Konservierungsmittelzusammensetzung, ein Aldehyd-Quentsch-Mittel und ein Antikoagulans enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Schutzmittelzusammensetzung Imidazolidinylharnstoff, Glycin und Ethylendiamintetraessigsäure enthalten.
  • Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren ermöglichen ein Vermeiden von im Wesentlichen jedem freien Formaldehyd (oder anderen Aldehyd) in der Probe und tragen damit dazu bei, mögliche schädliche Wirkungen, die ein derartiges freies Formaldehyd (oder ein anderes Aldehyd) auf Nukleinsäuren haben kann (z.B. Denaturierung von Proteinen, unerwünschte kovalente Bindung (wie zwischen Strängen von DNA) oder beide), oder einige andere chemische Änderungen der cfDNA zu verhindern. Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren ermöglichen, Nukleinsäure-(z.B., DNA)Proben zu amplifizieren, die gemäß den vorliegenden Lehren behandelt wurden.
  • Eine Bestimmung hierin, dass eine Zusammensetzung im Wesentlichen frei von freiem Aldehyd (und insbesondere frei von jedem freien Formaldehyd, (das das hydrierte Formaldehyd sein kann)) und/oder Methylenglycol ist, kann unter Verwendung bekannter Techniken erfolgen, wie durch 13C Kernmagnetresonanz (NMR). Zum Beispiel kann sie durch 13C Kernmagnetresonanz (i) in einem Deuteriumoxidlösemittel (ii) unterstützt durch ein Entspannungsmittel (z.B. Gadopentetsäure (Gd-DTPA)) oder sowohl (i) als auch (ii) ausgeführt werden. Eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei von freiem Aldehyd (und insbesondere frei von jedem freien Formaldehyd) und/oder Methylenglycol ist, weist typischerweise keine Spitze In einem 13C NMR-Spektrum im Bereich von etwa 82–85 ppm auf.
  • Verschiedene Konzentrationen von Konservierungsmittelzusammensetzung und Quentsch-Mittel, die in der Schutzmittelzusammensetzung enthalten sein können, können auch durch 13C NMR analysiert werden um zu bestimmen, welche Konzentrationen zu verringerten Mengen an freiem Aldehyd, wie gewünscht, führen. Insbesondere wurden verschiedene Konservierungsmittelzusammensetzungen (enthaltend Imidazolidinylharnstoff (IDU), Diazolidinylharnstoff (DU), Nuosept 145 (Methanol, Formaldehyd) und Oxaban-A (4,4-Dimethyl-1,3-oxazolidin) bei verschiedenen Konzentrationen mit unterschiedlichen Konzentrationen eines Quentsch-Mittels (enthaltend Glycin) kombiniert. Zur Probenzubereitung wurden 16,7 mg Gd-DTPA in eine leere Ampulle überführt und 3,5 ml D2O wurden der Ampulle zugegeben. Jede Probe wurde durch Wiegen eines leeren Röhrchens, in das 15–17 μl THF überführt wurden, zubereitet, und das Gewicht des Röhrchens mit THF wurde aufgezeichnet. 300 μl Probenlösung in H2O wurden überführt, gefolgt von der Zugabe von 200 µl GD-DTPA/D2O-Lösung. Die 13C NMR-Spektren wurden dann erhalten. Folgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 1
    Proben ID Konzentration der Konservierungsmittelzusammensetzung Glycin (%) Menge der Schutzmittelzusammensetzung (mg) (in 300 µl NMR- Lösung) Formaldehyd (mg) (in 300 µl NMR-Lösung) Konz. von Formaldehyd in Originallösung (%)
    1 IDU (1 %) 0 3 0,0927 0,031
    2 IDU (1 %) 0,1 3 0,0799 0,027
    3 IDU (1 %) 0,2 3 0,0665* 0,022*
    4 DU (0,5 %) 0 1,5 0,1677 0,056
    5 DU (0,5 %) 0,05 1,5 0,1149 0,038
    6 DU (0,5 %) 0,1 1,5 0,0583 0,019
    7 Nuosept 145 (0,4 %) 0 1,2 0,1536 0,051
    8 Nuosept 145 (0,4 %) 0,04 1,2 0,1299 0,043
    9 Nuosept 145 (0,4 %) 0,08 1,2 0,0742 0,025
    10 Oxaban-A (0,3 %) 0 0,9 0,0940 0,031
    11 Oxaban-A (0,3 %) 0,03 0,9 0,0773* 0,026*
    12 Oxaban-A (0,3 %) 0,06 0,9 0,0534* 0,018*
    * Werte aufgrund eines signifikant niedrigen Signal/Rausch-Verhältnisses überschätzt.
  • Jede Bestimmung, dass eine chemische Änderung der Doppelhelixformation von DNA aufgetreten ist, kann ebenso unter Verwendung bekannter Techniken wie Spektrometrie (z.B. eine Nukleinsäurefärbung-vermittelte Spektrometrietechnik, wie SYBR-Grünfarbstoff-vermittelte Fluoreszenzspektrometrie) durchgeführt werden, die für einen Nachweis eines optischen Phänomens wie Fluoreszierung eingesetzt werden kann. Mit einer solchen Methode kann DNA aus einer Kontrollprobe (z.B. nativer DNA) gemessen und mit einer DNA aus einer behandelten Probe verglichen werden, um eine Wirkung auf eine Helixkonfiguration unter Verwendung von Zirkulardichroismus-(CD)Spektren festzustellen. Es wird erwartet, dass Proben, die gemäß den vorliegenden Lehren behandelt sind, ein CD-Spektrum aufweisen, dass im Allgemeinen jenem der nativen DNA entspricht, ohne Anzeichen einer Änderung von Sekundärstrukturen.
  • Ein resultierendes Gemisch, das gemäß den vorliegenden Lehren behandelt wurde, kann ein oder mehrere Reaktionsprodukte enthalten, die Methylol, Schiff-Base, eine Schiff-Base-Quentsch-Mittel-Vernetzungsstruktur oder ein Schiff-Base-Dimer enthalten. Zum Beispiel ziehen die vorliegenden Lehren für eine veranschaulichende Zusammensetzung das Vorhandensein (mit oder ohne biologische(r) Probe) einer Kombination von zwei oder mehr von IDU, einem IDU-Glycin-Reaktionsprodukt, Glycin, Glycinmethylol, einer Glycin Schiff-Base, einer Glycin-vernetzten Schiff-Base oder einem Schiff-Base-Dimer in Betracht.
  • Ein resultierendes Gemisch, das gemäß den vorliegenden Lehren behandelt wurde, kann Blutzellen enthalten, die frei von einer Denaturierung zellulärer Proteine sind. Die resultierenden Zellmembranen können derart sein, dass der Inhalt der Zellen während der Verarbeitung und des Versands ohne nachweisbares Lecken in der Membran gehalten werden kann. Daher kann die Probe von ausreichend hoher Integrität sein, dass die zellfreien Fluida tatsächlich und exakt extrazelluläres Fluid darstellen. Ferner, obwohl es möglich sein kann, dass eine gewisse Kombination mit Proteinen (nicht Nukleinsäuren) auftreten kann, ist die Kombination nicht irreversibel, sondern kann vielmehr durch Erwärmen (z.B. auf eine Temperatur von etwa 60 °C bis etwa 90°C) entfernt werden. Daher ziehen die vorliegenden Lehren auch einen optionalen Schritt zum Erwärmen von behandelten Proben über einen Zeitraum und bei einer Temperatur in Betracht, die ausreichend sind, um Proteine abzutrennen (z.B. auf eine Temperatur von etwa 60 °C bis etwa 90 °C). Ein Erwärmungsschritt kann wie hier beschrieben zum Reinigen einer Nukleinsäureprobe und Entfernen jeglicher Kontamination aus einer Nukleinsäureprobe verwendet werden. Ein solcher Erwärmungsschritt kann mit der Verwendung einer Protease kombiniert werden – die eine Serinprotease wie Proteinase K sein kann.
  • In einem Aspekt wird angenommen, dass die vorliegenden Lehren unerwartet besonders nützlich zur Analyse einer Minisatelliten-(Variable Number of Tandem Repeat ("VNTR"))Analyse sind. Dies macht die Lehren bei einer Tatortanalyse, einem Vaterschaftstest oder einer anderen forensischen DNA-Analyse anwendbar. In solchen Fällen ist es möglich, dass ein Verfahren eine Entnahme einer Blutprobe eines Subjekts in ein evakuiertes Blutsammelröhrchen verwenden kann, das eine Schutzmittelzusammensetzung gemäß den vorliegenden Lehren enthält. Blutzellen können daher stabilisiert werden, um eine Freisetzung ihrer Nukleinsäure zu verhindern, und jedes freie Aldehyd (z.B. Formaldehyd) kann abgeschreckt werden. Zellfreie DNA kann isoliert und optional einem oder mehreren geeignete Enzymen ausgesetzt werden, um DNA-Regionen zu schneiden, die die VNTRs umgeben. Solche VNTRs können analysiert und mit DNA verglichen werden, die von einem Tatort stammt. Im Fall eines Vaterschaftstests können Blutabnahmeverfahren wie oben sowohl für die Nachkommen als auch den potentiellen Vater von Interesse verwendet werden. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann zum Amplifizieren einer Probe verwendet werden. Die erhaltenen amplifizierten Proben können analysiert werden, wie durch geeignete optische Techniken zum spektralen Auflösen der Probe. Zum Beispiel können Short Tandem Repeat (STR) Stellen gemultiplext werden. Es wird angenommen, dass eine überraschend große Menge der Probe von den vorliegenden Schutzmittelzusammensetzungen unbeeinflusst ist, wie durch ein Fehlen einer Denaturierung der STR Stellen und eine fehlende Vernetzung an der Stelle gezeigt. Als solches wird ein relativ hohes Vertrauensmaß bezüglich der Probe erreicht. Ferner wird es aufgrund der relativ langfristigen Stabilisierungswirkungen der Zusammensetzungen (z.B. mindestens 1 Woche, 2 Wochen, 4 Wochen oder länger) möglich, die Probe über einen längeren Zeitraum zu verwenden, und es besteht keine Notwendigkeit mehrerer Blutabnahmen.
  • Die vorliegenden Lehren werden als nützlich für eine Analyse von einer, zwei, drei, fünf, acht, zehn oder dreizehn oder mehr der folgenden STR Stellen angesehen: ACTBP2 (SE33); Amelogenin (X oder Y); CD4; D2S1338; D3S1358; D3S1359; D7S809; D7S820; P8S347; D8S1179; D11S554; D12S391; D13S308; D13S317; D16S639; D18S51; D19S433; D21S11; F13A1; F13B; FABP; FES/FPS; FGA (FIBRA); FOLP23 (DHFRP2); HPRTB; LPL (LIPOL); TH01; TPOX; CSF1PO; D5S818; oder VWA (vWF).
  • Daten, die über die DNA eines Subjekts erhalten werden, können für eine anschließende Abfrage gespeichert werden, wie in einer DNA-Datenbank (z.B. Combined DNA Index System (CODIS)). Mit solchen Informationen kann ein anschließender Kreuzvergleich von DNA-Profilen durchgeführt werden. DNA-Informationen können zum Lösen ungelöster oder ungeklärter Fälle ("Cold Cases") (z.B. ungelöster Fälle), zur Lösung von Eigentumsdelikten, zur Identifizierung von Personen oder Opfern oder für einige andere Zwecke verwendet werden. Ein oder mehrere Probenbehälter mit einer im Voraus eingebrachten Schutzmittelzusammensetzung der vorliegenden Lehren (z.B. in einer evakuierten Blutsammelvorrichtung mit einer Schutzmittelzusammensetzung der vorliegenden Lehren) können als Teil eines forensischen Analyse-Kits bereitgestellt sein. Jeder der vorliegenden Kits kann eine oder mehrere zusätzliche Komponenten enthalten, die für eine Amplifikation und Typisierung ausgelegt sind. Er kann einen oder mehrere Sätze geeigneter Primer (z.B. fluoreszierend markierter Primer) enthalten, die zweckdienlich für eine Short Tandem Repeat (STR) Analyse angepasst sind. Er kann Probenbehälter (wie z.B. in der Anmeldung Seriennr. PCT/US2012/34506 beschrieben) zur Durchführung einer Sammel-PCR-Analyse enthalten (z.B. mit einem tragbaren Thermozykler-Instrument wie dem Philisa® Instrument, verkauft von Streck, Inc., oder einem Instrument, das sonst in Anmeldung Seriennr. PCT/US2012/040201, US Anmeldung Nr. 13/484,963 und US Anmeldung Veröffentlichungsnr. 2009/034446 beschrieben ist. Es kann eine Multiplexing Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, die ein Hinzufügen eines Satzes oder mehrere Sätze von PCR-Primern (z.B. fluoreszierend markierter Primer) zu einer zu analysierenden Probe enthalten kann, um eine selektive Ausrichtung auf mehrere Stellen im Genom zu erreichen.
  • Die vorliegenden Lehren ziehen andere Anwendungen in Betracht, enthaltend, ohne aber darauf beschränkt zu sein, ein Gewinnen zellfreier DNA zur Verwendung beim Nachweis von Krebs (enthaltend, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Karzinome, Leukämie und/oder Lymphom). Zum Beispiel können die vorliegenden Lehren für einen Nachweis einer abnormalen Methylierung für Brustkrebs, Prostatakrebs, Magenkrebs, Eierstock-, Dickdarmkrebs, Blasenkrebs, Hodenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Melanom oder andere Krebserkrankungen verwendet werden.
  • Gemäß den Lehren kann eine Blutprobe mit einer vorliegenden Schutzmittelzusammensetzung in Kontakt gebracht werden, jedes Aldehyd kann abgeschreckt und die erhaltene DNA zur Analyse gewonnen werden. Die Analyse kann ein Analysieren von Methylierungsmustern der DNA enthalten. Die Analyse kann zum Identifizieren von Biomarkern auf Methylierungsbasis (z.B. in einem oder mehreren GC-reichen Fragmenten) verwendet werden, die mit einem oder mehreren von Krebs, einer neurogenerativen Störung (z.B. Alzheimer-, Parkinson-Krankheit, Epilepsie, Multiple Sklerose oder andere) und/oder einer psychiatrischen Störung (z.B. Schizophrenie, Depression oder andere) verbunden sind. Zum Beispiel kann die Analyse zum Identifizieren des Auftretens von methyliertem Cytosin verwendet werden. Die Analyse kann für einen Nachweis und/oder ein Überwachen einer Virusinfektion, von Autoimmunkrankheiten, Mikrochimärismus, akutem Herzmuskelinfarkt, Schlaganfall, Mesenterialinfarkt, und Bauchspeicheldrüsenentzündung verwendet werden. Natürlich kann die Analyse auch für eine pränatale Diagnose verwendet werden (z.B. für einen Zustand oder mehrere Zustände, wie eine abnormale Trisomie 13, Trisomie 18 oder Trisomie 21 Pathologie, Klinefelter-Syndrom, Turner-Syndrom oder pränatale Geschlechtsbestimmung).
  • Die Analyse kann eine Amplifikation und einen Nachweis durch PCR, Massenspektroskopie, parallele DNA-Sequenzierung oder eine andere geeignete analytische Technik verwenden, durch die ein Krankheitszustand oder eine Bedingung nachgewiesen, diagnostiziert, behandelt und/oder überwacht wird.
  • Die vorliegenden Lehren ziehen auch die mögliche Verwendung von Schritten zum Überwachen von Therapien eines Patienten als Reaktion auf eine Behandlung (z.B. Strahlen- und/oder Arzneimitteltherapie) in Betracht. Blutproben können beim ersten Mal entnommen, nach den Lehren behandelt und DNA-analysiert werden. Blutproben können zu einem oder mehreren Zeitpunkten nach dem ersten Mal entnommen, nach den Lehren behandelt und DNA-analysiert werden. Ergebnisse der jeweiligen Analysen können verglichen werden und die Therapie kann als Reaktion auf einen Vergleich der Ergebnisse geändert werden.
  • Die vorliegenden Lehren können ferner zum Schützen biologischer Proben während des Versands und der Lagerung verwendet werden. Der Transport von Blutproben von der Stelle der Phlebotomie zu einer anderen Einrichtung ist allgemein für eine molekulare diagnostische Testung erforderlich. Wie hier besprochen, können mehrere prä-analytische Variable die Genauigkeit von cfDNA-Messungen beeinträchtigen, enthaltend die Auswahl von Blutsammelvorrichtungen und Probenlagerungs- und Versandbedingungen. Jeder dieser Parameter beeinflusst das Ausmaß nukleierter Blutzelllyse, das nach einer Phlebotomie eintritt. Eine nukleierte Zelllyse führt zur Freisetzung von gDNA, erhöhten pDNA-Hintergründen und einer Unterdrückung einer wahren cfDNA-Messung. Es ist daher wünschenswert, Erhöhungen der Hintergrund-gDNA zu minimieren, die allgemein während des Versands und der Lagerung aufgrund einer Probenbewegung und Temperaturänderungen auftreten.
  • Während des Transport kann ein Schütteln die Integrität nukleierter Blutzellen aufbrechen und die Genauigkeit beeinträchtigen, wie oben beschrieben. Unter simulierten Versandbedingungen (unter Verwendung eines Kreisschüttlers) über einen Zeitraum von 24 Stunden wurden Blutproben in K3EDTA- und Schutzmittelzusammensetzung-Blutsammelvorrichtungen für einen Vergleich eingebracht. Eine Erhöhung in der pDNA-Konzentration wurde nach 6 und 24 Stunden in K3EDTA-Blutproben beobachtet. Die Schutzmittelzusammensetzung stabilisierte die Blutzellen und zeigte keine beträchtliche Erhöhung in pDNA unter Schüttelbedingungen.
  • Wenn Proben versandt wurden, wurden ähnliche Trends wie beim Schütteln der Proben beobachtet. Proben wurden entweder in K3EDTA- oder Schutzmittelzusammensetzung-Blutsammelvorrichtungen versandt und die resultierende pDNA-Konzentration zwischen den zwei Röhrchen wurde verglichen. Die Schutzmittelzusammensetzungsproben zeigten stabile pDNA-Konzentrationen vor und nach dem Versand, während K3EDTA eine Erhöhung in pDNA unter Versandbedingungen zeigte. Dies legt nahe, dass ein Aufbrechen nukleierter Zellen in Blutproben auftrat, die in K3EDTA versandt wurden, was zu einer gDNA-Freisetzung führte, aber dies bei den Schutzmittelzusammensetzungsproben nicht der Fall war.
  • In der gegenwärtigen Praxis werden Blutproben im Allgemeinen zentrifugiert, um Plasma zu isolieren, und gefroren, um die gDNA-Kontaminierung von cfDNA während der Probeverarbeitung, des Transports und der Lagerung zu vermeiden. Die stabilisierenden Chemikalien in der Schutzmittelzusammensetzung verhindern die Freisetzung von gDNA in Plasma nach einer Phlebotomie bis zu 14 Tage, wodurch diese arbeitsintensiven Anforderungen vermieden werden. Unter Verwendung der hier offenbarten Blutsammelvorrichtung wird eine Ex vivo-Lagerung bei Raumtemperatur möglich, was eine Flexibilität für dezentrale Blutabnahmen bietet, die ohne vorherige Zentrifugationen oder Kryokonservierung zu zentralen Labors für eine anschließende Analyse der cfDNA gesendet werden können.
  • Proben können von einer oder mehreren biologischen Substanzen (z.B., Blut, Harn, Speichel, Fäzes, Synovialflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit oder anderes Fluid) stammen oder in dieser anfänglichen Form sein. Proben können Zellen enthalten oder können frei von Zellen sein. Im Allgemeinen wird erwartet, dass die Proben eine gewisse anfängliche Menge an zellfreier DNA haben, wobei im Wesentlichen der Wunsch besteht, die Menge einer solchen zellfreien DNA zu konservieren und die zellfreie DNA vor einer Desoxyribonuclease-Aktivität zu schützen, sodass sie effektiv analysiert werden kann.
  • Proben können auf zahlreiche Weise gesammelt werden. Sie können als Teil einer Venenpunktionsabnahme, durch Spritze, Tupfer, durch Ablass oder auf andere Weise gesammelt werden. Sie können in einem Behälter (z.B. einer Ampulle, einem Probensammelbecher, einem Sammelröhrchen, einem Kapillarröhrchen oder auf andere Weise) gesammelt werden. In dem Behälter kann eine Schutzmittelzusammensetzung der vorliegenden Lehren enthalten sein. Die Proben können Blutproben sein und die Verfahren können ein Einbringen einer frisch entnommenen Blutprobe in ein evakuiertes Blutsammelröhrchen enthalten, das die Schutzmittelzusammensetzung enthält, die im Voraus darin eingebracht wurde.
  • Die Verfahren können einen oder mehrere analytische Schritte zum Analysieren der Nukleinsäuren enthalten. Zum Beispiel können die Verfahren einen Schritt zum Unterziehen der Probe einer qualitativen Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation, quantitativen Polymerase-Kettenreaktion Amplifikation oder beiden nach dem Quentsch-Schritt enthalten. Die Verfahren können einen Schritt zum Unterziehen der Probe einer qualitativen Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation, quantitativen Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation oder beiden nach dem Quentsch-Schritt enthalten, die mindestens vier Tage, eine Woche oder zwei Wochen nach dem Quentsch-Schritt stattfindet. Das Verfahren kann einen Schritt zum Unterziehen der Probe einer Massenspektrometrie enthalten. Das Verfahren kann einen Schritt zum Unterziehen der Probe einer Massenspektrometrie enthalten, die mindestens vier Tage, eine Woche oder zwei Wochen nach dem Quentsch-Schritt stattfindet. Das Verfahren kann einen Schritt zum Unterziehen der Probe einer DNA-Sequenzierung enthalten. Das Verfahren kann einen Schritt zum Unterziehen der Probe einer DNA-Sequenzierung enthalten, die mindestens vier Tage, eine Woche oder zwei Wochen nach dem Quentsch-Schritt stattfindet. Das Verfahren kann alternativ einen Schritt zum Durchführen einer Durchflusszytometrieanalyse an der Probe enthalten.
  • Die Lehren sehen in ihrem Umfang auch die vorliegenden Schutzmittelzusammensetzungen vor, alleine und/oder in Kombination mit einem Probensammelbehälter (z.B. eine evakuierte Blutsammelvorrichtung), Kits, die die Schutzmittelzusammensetzung enthalten (z.B. in einem Probensammelbehälter wie einem Blutsammelröhrchen), forensischen Analysevorrichtungen und Artikeln, anderen Reagenzien, Polymerase-Kettenreaktion Probebehältern (z.B. Röhrchen) oder dergleichen. Ebenso sehen die Lehren in vorteilhafter Weise Verfahren zum Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion-Amplifikation einer Probe vor, umfassend ein Amplifizieren einer Nukleinsäure (z.B. Desoxyribonukleinsäure (DNA)) aus einer biologischen Probe, die nach einem der obengenannten Verfahren behandelt wurde. Zusätzlich ist in vorteilhafter Weise ein Verfahren zum Identifizieren von Minisatelliten (Variable Number Tandem Repeats (VNTR)) auf einer DNA-Probe vorgesehen, umfassend ein Behandeln einer Probe gemäß den vorliegenden Lehren; Bestimmen eines Proben-VNTR-Musters für die Probe; Vergleichen eines ersten VNTR-Musters von einer bekannten DNA-Quelle mit dem VNTR-Muster aus der Probe; und Bestimmen, ob das Proben-VNTR-Muster mit dem ersten VNTR-Muster übereinstimmt.
  • Die vorliegenden Lehren können für jede Anzahl von Anwendungen verwendet werden und können zum Verbessern der Lehren der veröffentlichten US Anmeldung Nr. 2010/0184069 eingesetzt werden, die ein genomweites Screening fötaler DNA enthält. Zum Beispiel können die vorliegenden Lehren geeignete Anwendung für quantitative Echtzeit PCR zur genetischen Identifizierung von Trisomie 21 (Down-Syndrom) finden, wonach es mindestens einen Schritt für den Nachweis einer Erhöhung in der DNA-Kopienzahl gibt (das heißt, ein chromosomales Duplizierungsereignis innerhalb des fötalen Genoms). Wie bei einer Analyse von Proben nach den vorliegenden Lehren kann diese im Allgemeinen an einer fernen Klinik durchgeführt werden (z.B. einer Stelle, die fern von der Stelle der mütterlichen Blutabnahme ist (z.B. mindestens 100 Meter, 1000 Meter, 10.000 Meter oder mehr)). Aufgrund der fernen Lage gibt es typischerweise einen Schritt zum Transport der Probe von der Entnahmestelle zu einer Stelle der klinischen Analyse. Ein solcher Transport kann (wieder wie bei der Analyse von Proben nach den vorliegenden Lehren im Allgemeinen) ohne Kühlung erfolgen.
  • Ferner stellen die Lehren, wie angegeben, eine nützliche Anwendung in forensischer DNA-Analyse bereit. Zur Veranschaulichung, zur forensischen Analyse kann die VNTR-DNA Primer, die dieselben VNTR-Regionen flankieren, im Verlauf einer Amplifizierung einer DNA-Probe verwenden. Amplifizierte VNTRs können gemeinsam auf einer einzelnen Bahn auf einem Agarosegel laufen, das die VNTR-DNA-Segmente anhand ihrer Größe und spezifisch für ein bekanntes VNTR-Muster eines Subjekts (z.B. eines Tatverdächtigen) auflöst. Qualitative Vergleiche der DNA-Größenmuster auf dem Agarosegel können mit einer am Tatort gesammelten DNA-Probe auf Übereinstimmung verglichen werden. Die vorliegenden Lehren können zum Erhalten und Präsentieren einer Blutprobe eines Verdächtigen, zum Erhalten und Konservieren einer Tatortprobe oder für beides verwendet werden.
  • Beispiele
  • Blutproben wurden gesunden Spendern in K3EDTAund Blutsammelröhrchen, die eine Schutzmittelzusammensetzung enthielten, entnommen. Zum Simulieren von Versandbedingungen wurden die Proben entweder geschüttelt oder nicht. In einer Versandstudie wurden die Proben entweder versandt oder nicht versandt. Zur Bewertung von Temperaturvariationen wurden Proben bei 6 °C, 22 °C und 37 °C inkubiert. In allen Fällen wurde Plasma durch Zentrifugation geerntet und Gesamt-Plasma-DNA (pDNA) durch quantitative Echtzeit PCR (qPCR) getestet. Ein Schütteln von Blut in K3EDTA-Röhrchen zeigte signifikante Erhöhungen in pDNA, während keine Änderung bei den Schutzmittelzusammensetzungsproben beobachtet wurde. Blut, das in K3EDTA-Röhrchen versandt wurde, zeigte signifikante Erhöhungen in pDNA gegenüber jenen, die in der Schutzmittelzusammensetzung versandt wurden. Blut In K3EDTA-Röhrchen, inkubiert bei 6 °C, 22 °C und 37 °C, zeigte signifikante Erhöhungen in pDNA, während pDNA von den Schutzmittelzusammensetzungsproben stabil blieb. Die Schutzmittelzusammensetzung verhindert Erhöhungen in HintergrundgDNA-Werten, die während Probenlagerung und Versand auftreten können. Somit stellt die Schutzmittelzusammensetzung eine neue Möglichkeit bereit, stabilisierte Proben hoher Qualität für einen Nachweis eines spärlichen DNA-Ziels und exakter cfDNA-Konzentrationen zu erhalten.
  • Ein PCR-Nachweis zellfreier DNA-Ziele innerhalb eines hohen gDNA-Hintergrunds ist eine Herausforderung und erfordert spezialisierte Protokolle und/oder große Volumina Ausgangsmaterial. Daher ist eine Minimierung der Freisetzung von gDNA aus nukleierten Zellen für eine exakte Analyse wahrer cfDNA essenziell. Durch Verwendung der Schutzmittelzusammensetzung ist es möglich, den ursprünglichen Anteil fötaler cfDNA zu konservieren, indem der mütterliche gDNA-Hintergrund minimiert wird. Erhöhte Hintergrund-gDNA beeinträchtigt den Nachweis spärlicher cfDNA-Ziele (2C). Da die pDNA-Konzentration an Tagen 7 und 14 in K3EDTA-Proben aufgrund einer gDNA-Freisetzung stieg, sank der Nachweis der eingeführten SRY-Fragmente (2a). Im Gegensatz dazu gab es keine signifikante Änderung in der pDNA-Konzentration aufgrund der gDNA-Freisetzung in den Schutzmittelzusammensetzungsproben an Tag 7 und eine minimale gDNA-Freisetzung an Tag 14, aber der Nachweis von SRY-Fragmenten blieb während des gesamten Zeitraums unverändert (2b).
  • Eine Variation in der Probenlagerungstemperatur ist ein weiterer Post-Phlebotomie-Zustand, der Änderungen in der gDNA-Konzentration verursachen kann. Die Wirkung von drei verschiedenen Lagerungstemperaturen auf die pDNA-Konzentration von Blutproben, die in K3EDTA und in die Schutzmittelzusammensetzung entnommen wurden, wurde überwacht. Nach der Blutabnahme wurden Proben 14 Tage bei 6 °C, 22 °C oder 37 °C inkubiert. Signifikante Erhöhungen in pDNA-Konzentrationen der Κ3ΕDΤA-Blutprobe wurden bei 6 °C und 37 °C an Tag 7 beobachtet und bei allen Temperaturen an Tag 14 (4A). Blut, das in die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen wurde, zeigte bei keiner Temperatur eine Erhöhung in der pDNA-Konzentration an Tag 7 und zeigte statistische Veränderungen in der pDNA-Konzentration an Tag 14 bei einer Inkubation bei 6 °C und 22 °C (4B). Jedoch Berechnungen des Vielfachen einer Veränderung für einen Vergleich von pDNA-Werten der K3EDTA- und Schutzmittelzusammensetzungsproben an Tag 0 gegenüber Tag 7 und Tag 14 (siehe 4A und 4B). Dies zeigt die Fähigkeit der Schutzmittelzusammensetzung pDNA-Werte zu stabilisieren und eine gDNA-Freisetzung über einen weiten Temperaturbereich für einen längeren Zeitraum zu verhindern.
  • Blutspender wurden mit Zustimmung nach Inkenntnissetzung von Streck, Inc. in Omaha, NE, rekrutiert. Spender waren sowohl männlich als auch weiblich und wurden als gesund angenommen. Alle Entnahmen wurden mit Venenpunktion vorgenommen. Für jeden Versuch wurden Spenderproben in verschiedene Blutsammelröhrchen entnommen. Kontrollproben wurden in K3EDTA Röhrchen (BD Vacutainer®, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) entnommen und mit Proben verglichen, die in die hier beschriebene Schutzmittelzusammensetzung entnommen wurde. Das Blut wurde unmittelbar nach der Entnahme durch zehnmaliges Umdrehen gemischt.
  • Probenverarbeitung
  • Nach der Phlebotomie wurden Blutproben bei Raumtemperatur (22 °C) gelagert, außer wenn anders angegeben, und Plasma wurde zu den angegebenen Zeitpunkten abgetrennt. Für die Abtrennung von Plasma wurden die Blutproben bei 22 °C bei 300 × g 20 Minuten zentrifugiert. Die Plasmaschicht wurde sorgfältig entfernt, ohne den Buffy Coat zu stören, mit einer Pipette in eine neue Ampulle überführt und dann 10 Minuten bei 22 °C bei 5000 × g zur Entfernung restlicher Zellen zentrifugiert.
  • Isolierung zellfreier DNA aus Plasma
  • Das QIAamp® Circulating. Nucleic Acid Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA) wurde zur Extraktion von pDNA verwendet. Das vom Hersteller empfohlene Protokoll wurde leicht modifiziert, indem die Dauer der Proteinase K-Behandlung von 30 Minuten auf 1 Stunde bei 60 °C erhöht wurde. Proben wurden in 50 µL sterilem nucleasefreien Wasser eluiert und bei –80 °C bis zur Analyse durch Echtzeit qPCR gelagert.
  • Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR)
  • Humane β-Actin Primer und Sonde und Primer für die humane Y-chromosomale Geschlechtsbestimmungsregion (SRY) wurden wie zuvor von Chan et al. (Chan KC, Ding C, Gerovassili A, et al. (2006) Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis, Clin. Chem 52: 2211–2218) und von Lee et al. (Lee TH, Paglieroni T, Ohto H, et al. (1999) Survival of donor leukocyte subpopulations in immunocompetent transfusion recipients; frequent long-term micro-chimerism in severe trauma patients. Blood 93: 3127–3139) beschrieben zubereitet. Die folgende Sonde wurde für die Quantifizierung der SRY-Sequenz gestaltet: 6FAM-ATG GCT CTA GAG AAT CCC AGA ATG CGA AAC TCA GAG ATAMRA. Für jeden Test wurden zehnfache Verdünnungen (300.000-30 Kopien) von Plasmid-DNA-Konstrukten zum Erstellen von qPCR Standardkurven verwendet. Konstrukte wurden durch Klonen einer einzigen Kopie von β-Actin oder SRY DNA-Sequenz hergestellt, die Amplicons von 136 bp bzw. 148 bp erzeugte. β-Actin genomische Äquivalente wurden aus der qPCR Kopienanzahl errechnet und dann in Nanogramm cfDNA pro Milliliter Plasma (ng/ml) umgerechnet. Die SRY DNA-Endkonzentration wurde als pro Milliliter Plasma gewonnene DNA-Kopien (Kopien/ml) angegeben. Alle Primer wurden von Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) gekauft. Die qPCR Sonden und TaqMan® Universal PCR Master Mix II wurden von Applied Biosystems (Foster City, CA) gekauft.
  • Wirkung von Lagerungstemperatur auf die pDNA-Konzentration in Blutproben
  • Blut wurde von acht Spendern in K3EDTA-Röhrchen und den Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen gesammelt. Blut wurde aliquotiert und dann in drei Sätze aufgeteilt, die jeweils aus drei K3EDTA- und drei Schutzmittelzusammensetzungs-Aliquoten bestanden. Ein Satz von Aliquoten wurde bei 6 °C gelagert, ein anderer Satz bei 22 °C und der letzte Satz bei 37 °C. Plasma wurde bei jeder Temperatur an Tag 0, 7 und 14 geerntet, bei –80 °C gelagert, bis pDNA extrahiert und durch qPCR mit dem β-Actin-Test getestet wurde.
  • Wirkung von Schütteln und Versand auf pDNA-Konzentration in Blutproben
  • Zum Simulieren eines Versands wurde Blut von acht Spendern in K3EDTA-Röhrchen und die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen. Röhrchen wurden auf einer Plattform eines Kreisschüttlers gesichert und bei 150 U/min bei 22 °C geschüttelt. Zu Zeitpunkten von 0, 3, 6 und 24 Stunden wurde Plasma von einem K3EDTA- und einem Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen geerntet und bei –80 °C bis zur Extraktion und Analyse eingefroren. Ein Kontrollversuch wurde durchgeführt, bei dem das Blut nicht geschüttelt wurde, während alle anderen Versuchsparameter dieselben blieben. In einer separaten Versandstudie wurde Blut von zehn Spendern in K3EDTA-Röhrchen und die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen. Die Röhrchen wurden in einer Rundfahrt durch Luftfracht zu einem Labor in Springfield, MA, versandt (die verstrichene Zeit war 4 Tage) und bei Rückkehr wurde das Plasma geerntet, bei –80 °C bis zur Extraktion und Analyse gelagert. Ein Kontrollsatz von Röhrchen wurde nicht versandt und Plasma an Tag 0 und 4 geerntet. Sowohl für geschüttelte als auch versandte Proben wurde pDNA durch qPCR mit dem β-Actin-Test gemessen.
  • Statistische Analyse
  • Es wurde eine statistische Analyse unter Verwendung der Tools for Science Website des College of Saint Benedict Physics Department, Saint John's University, St. Joseph, MN, USA (http://www.physics.csbsju.edu/) durchgeführt. Die Analyse wurde mit einem ungepaarten Student-t-Test durchgeführt und p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
  • Wirkung von Chemikalien, die in der Schutzmittelzusammensetzung vorhanden sind, auf pDNA Amplifikation
  • Wir untersuchten die Wirkung der Schutzmittelzusammensetzung auf die pDNA-Amplifikation durch qPCR (1). Blut wurde in K3EDTA-Röhrchen entnommen und Plasma wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Der Plasmaüberstand wurde aliquotiert und in zwei Behandlungsgruppen geteilt. Einer Gruppe von Plasmaproben (graue Balken) wurde die Schutzmittelzusammensetzung zu einer Endkonzentration gleich der Menge zugegeben, die in einer 10 mL Standardblutabnahme vorlag. Die andere Gruppe von Plasmaproben (schwarze Balken) war unbehandelt und diente als Kontrolle. Proben von jeder Gruppe wurden nach 3 und 6 Stunden (Tafel a) und 7 und 14 Tagen (Tafel b) behandelt. Die pDNA-Konzentration wurde mit dem β-Actin qPCR-Test bestimmt. Im Vergleich zu unbehandelten Proben zeigten Proben, die mit den Chemikalien behandelt waren, keine Abnahme, weder bei der DNA-Extraktion aus Plasma noch seiner Amplifikation durch qPCR. Fehlerbalken zeigen eine SD, n = 5, für beide Tafeln. In 1 zeigt ein Vergleich von pDNA-Konzentrationen in chemisch behandelten und unbehandelten Plasmaproben keine Verringerung in der Amplifikation nach 3 und 6 Stunden Inkubation bei 22 °C (1A, p = 0,44 bzw. p = 0,52); Proben, die 7 und 14 Tage inkubiert wurden, zeigten ähnliche Ergebnisse (1B, p = 0,0036 bzw. p = 0,23). Diese Befunde zeigen, dass die Chemikalien, die in der Schutzmittelzusammensetzung vorhanden sind, keine nachteiligen Wirkungen auf die DNA-Extraktion aus Plasma oder ihre Amplifikation durch qPCR haben.
  • Wirkung erhöhter Hintergrund-gDNA in Plasma auf den Nachweis seltener cfDNA-Sequenzen
  • Wir simulierten die Wirkung einer erhöhten gDNA-Konzentration, gemessen durch den β-Actin-Test, auf den Nachweis spärlicher cfDNA-Ziele durch Einführen einer männlich-spezifischen DNA (SRY) in nicht-schwangeres weibliches Blut (2). Das Blut wurde von weiblichen, nicht schwangeren Spendern in K3EDTA- und Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen und 0, 7 oder 14 Tage bei 22 °C gelagert. Zu jedem Zeitpunkt wurde Plasma durch Zentrifugation abgetrennt. Ein Plasmid DNA-Konstrukt, das ein SRY-Sequenzfragment (3000 Kopien) enthielt, wurde dann in alle Plasmaproben gespickt und pDNA wurde extrahiert. Die gesamte Plasma-DNA-Konzentration wurde mit dem β-Actin-PCR-Test
    Figure DE202013012535U1_0002
    bestimmt und Ychromosomale Sequenzkopiezahlen wurden durch den SRY qPCR-Test
    Figure DE202013012535U1_0003
    bestimmt. Für K3EDTA-Proben (2A) gab es signifikante Abnahmen im SRY-Sequenzkopienzahlennachweis (**p < 0,001), da β-Actin pDNA-Konzentrationen in K3EDTA-Proben stiegen (*p < 0,05, **p < 0,001). Für die Schutzmittelzusammensetzungsproben (2B) blieben pDNA-Konzentrationen nahe dem Anfangswert von Tag 0 (**p < 0,001) und die SRY-Sequenz war im gesamten Zeitverlauf von 14 Tagen nachweisbar. Tabelleneinschübe in jeder Figur zeigen das Veränderungsvielfache bei einem Vergleich von β-Actin und SRY-Werten an Tag 0 mit jenen an Tagen 7 und 14. Fehlerbalken zeigen SD, n = 5 für beide Tafeln.
  • 2a zeigt die DNA-Konzentration beider Genziele in geerntetem Plasma von K3EDTA-Proben, die 0, 7 und 14 Tage bei 22 °C gelagert wurden. Da gDNA im Laufe der Zeit in Plasma freigesetzt wurde, wurden signifikante Erhöhungen in gDNA-(β-Actin-)Werten an Tag 7 und 14, im Vergleich zur anfänglichen Konzentration an Tag 0 beobachtet (p = 0,0087 und p = 0,0002). Wenn gDNA-(β-Actin-)Werte stiegen, war der Nachweis des cfDNA-Ziels (SRY-Fragment) signifikant verringert (Tag 7, p = 0,0068 und Tag 14, p = < 0,0001).
  • 2b zeigt die pDNA-Konzentration der Schutzmittelzusammensetzung-Plasmaproben, die unter denselben Lagerungsbedingungen wie oben gelagert waren. Plasma, das aus den Schutzmittelzusammensetzungsproben geerntet wurde, zeigte keine signifikante Änderung in der β-Actin-Konzentration nach 7 Tagen (p = 0,55), zeigte aber statistische Änderungen zum Zeitpunkt Tag 14 (p = 0,0002). Mit der Schutzmittelzusammensetzung blieben gDNA-(β-Actin-)Werte annähernd jene vom Tag 0 Wert, cfDNA-(SRY-Fragment-)Werte änderten sich nicht und blieben während des gesamten Zeitverlaufs nachweisbar (Tag 7, p = 0,45 und Tag 14, p = 0,20).
  • Zur besseren Darstellung, wie Änderungen in gDNA-Werten einen cfDNA-Zielnachweis beeinflussen, wurden Berechnungen eines Änderungsvielfachen durchgeführt (2C). Wenn K3EDTA-gDNA-Werte stiegen (β-Actin, Tag 7 = 51-fache Änderung, Tag 14 = 92-fache Änderung), sank der cfDNA-Nachweis (SRY, Tag 7 = ~3-fache Änderung, Tag 14 = ~95-fache Änderung). Die Schutzmittelzusammensetzung-gDNA-Werte blieben relativ konstant (β-Actin, Tag 7 = 1-fache Änderung, Tag 14 = 8-fache Änderung), wie auch der cfDNA-Zielnachweis (SRY, Tag 7 = ~1-fache Änderung, Tag 14 = ~1-fache Änderung).
  • Wirkung von Schütteln und Versand auf die pDNA-Konzentration in Blutproben
  • Schüttelbedingungen, die während des Probentransports vorliegen, wurden mit einem Kreisschüttler simuliert. Ein Kontrollversuch wurde ebenso mit beiden Arten von Röhrchen ohne Schütteln durchgeführt (3). Blut wurde in K3EDTA-Röhrchen und die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen und dann bei 22 °C auf einem Kreisschüttler geschüttelt. Wie in Tafel A dargestellt, wurde zu den Zeitpunkten 0, 3, 6 und 24 Stunden ein Κ3EDTA-Röhrchen (o) und ein Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen
    Figure DE202013012535U1_0004
    entnommen und pDNA isoliert. Ein Kontrollversuch wurde auch mit Blutabnahmen von denselben Spendern in K3EDTA-Röhrchen
    Figure DE202013012535U1_0005
    und Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen
    Figure DE202013012535U1_0006
    über denselben Zeitraum ohne Schütteln durchgeführt. Die pDNA-Konzentration wurde mit dem β-Actin qPCR-Test bestimmt. K3EDTA-Röhrchen, die einem Schütteln unterzogen wurden, zeigten statistisch signifikante Erhöhungen in der pDNA-Konzentration nach 3, 6 und 24 Stunden im Vergleich zu Zeitpunkt 0 (*p < 0,05, **p < 0,001). Die Gesamtplasma-DNA-Konzentration blieb sowohl in geschüttelten Schutzmittelzusammensetzungsproben als auch ungeschüttelten Proben stabil. Fehlerbalken zeigen SD, n = 8 in Tafel A. In einer Versandstudie, wie in Tafel B dargestellt, wurde Blut in K3EDTA-Röhrchen (schwarze Balken) und Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen (graue Balken) entnommen und entweder in einer Rundfahrt zu einem Labor in Springfield, MA, versandt oder ohne Versand belassen. Bei der Rückkehr wurde Plasma von versandten und nicht versandten Proben isoliert und die pDNA-Konzentration unter Verwendung des β-Actin qPCR-Tests bestimmt. K3EDTA-Röhrchen, die versandt worden waren, zeigten eine signifikante Erhöhung in pDNA im Vergleich zu versandten Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen (*p < 0,05). K3EDTA-Röhrchen, die nicht versandt wurden, zeigten eine ähnliche Signifikanz bei einem Vergleich mit Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen, die nicht versandt wurden. Die pDNA-Konzentration in versandten und nicht versandten Schutzmittelzusammensetzungsproben zeigten keine statistische Änderung im Vergleich zu Zeitpunkt null. Fehlerbalken zeigen SD, n = 10 in Tafel B.
  • 3a zeigt, dass ein Schütteln von Blut, das in K3EDTA-Röhrchen entnommen wurde, eine signifikante Erhöhung in der pDNA-Konzentration 3, 6 und 24 Stunden nach der Blutabnahme verursacht (p = 0,031, 0,0003 und 0,001), während ein Schütteln von Blut, das in die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen wurde, keine Änderung zeigte (p = 0,14, 0,34 und 0,31). Ungeschüttelte Kontrollproben, die in K3EDTA- und die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen wurden, zeigen keine Änderung in der pDNA-Konzentration nach 3 (p = 0,14 und 0,22), 6 (p = 0,33 und 0,52) oder 24 Stunden Inkubation (p = 0,29 und 0,72).
  • Nach einer Nachahmung des Versands wurden neue Proben entweder in K3EDTA- oder die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen. Die Röhrchen wurden entweder zu einem Labor in Springfield, MA, und zurück im Verlauf von vier Tagen versandt oder nicht versandt bei 22 °C belassen. 3b zeigt eine signifikante Erhöhung in der pDNA-Konzentration zwischen versandten K3EDTA- und versandten Schutzmittelzusammensetzungsproben (p = 0,01), nach deren Rückkehr. Es gab auch eine signifikante Erhöhung in pDNA zwischen anfänglichem und versandtem K3EDTA (p = 0,015) und zwischen anfänglichem und nicht versandtem K3EDTA (p = 0,013). Es gab jedoch keine Änderung in der pDNA-Konzentration zwischen den anfänglichen und nicht versandten oder den nicht versandten und versandten Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen (p = 0,399 und 0,340).
  • Wirkung einer Lagerungstemperatur auf die pDNA-Konzentration in Blutproben
  • Zur Darstellung der Wirkung von Temperatur auf pDNA-Werte in Blutabnahmen in K3EDTA-Röhrchen und Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen wurden Proben bei entweder 6 °C, 22 °C oder 37 °C bis zu 14 Tage gelagert (4). Blut wurde in K3EDTA und die Schutzmittelzusammensetzung entnommen. Blut wurde aliquotiert und dann in drei Sätze geteilt, die jeweils 3 K3EDTA- und 3 Schutzmittelzusammensetzung-Aliquote enthielten. Ein Satz von Aliquoten wurde bei 6 °C
    Figure DE202013012535U1_0007
    inkubiert, ein Satz bei 22 °C
    Figure DE202013012535U1_0008
    und ein Satz bei 37 °C
    Figure DE202013012535U1_0009
    . Plasma wurde durch Zentrifugation von Aliquoten bei jeder Temperatur an Tag 0, 7 und 14 abgetrennt. Die pDNA-Konzentration wurde mit dem β-Actin-qPCR-Test bestimmt. Proben, die in K3EDTA (4A) entnommen und bei allen Temperaturen gelagert wurden, zeigten statistisch signifikante Erhöhungen in der pDNA-Konzentration verglichen mit dem Tag 0 Wert, während pDNA, isoliert aus Schutzmittelzusammensetzungsproben (4B) eine minimale Änderung während des 14-tägigen Zeitraums zeigte (*p < 0,05, **p < 0,001). Tabelleneinschübe in jeder Figur zeigen die vielfache Änderung bei einem Vergleich der pDNA-Werte von Tag 0 mit jenen an Tag 7 und 14. Fehlerbalken zeigen SD, n = 8, für beide Tafeln.
  • 4a zeigt signifikante Erhöhungen in der pDNA-Konzentration in K3EDTA-Proben an Tagen 7 und 14 bei einem Vergleich mit anfänglichen Werten bei 6 °C (Tag 7, p = 0,039, Tag 14, p = 0,041) und an Tag 14 bei einer Lagerung bei 22 °C (Tag 7, p = 0,056, Tag 14, p = 0,0002). K3EDTA-Proben, die bei 37 °C inkubiert wurden, zeigten einen hohen Grad an Hämolyse während des gesamten Zeitverlaufs und die pDNA-Konzentration an Tag 14 (Tag 7, p = 0,003, Tag 14, p = < 0,0001) war etwas niedriger verglichen mit Proben, die bei 6 °C und 22 °C inkubiert wurden. Es war keine Hämolysis in Schutzmittelzusammensetzungsproben sichtbar, wenn diese bei 37 °C gelagert wurden. Blutproben, die in die Schutzmittelzusammensetzungsröhrchen entnommen und bei 6 °C, 22 °C und 37 °C gelagert wurden, zeigten keine signifikante Änderung in der pDNA-Konzentration an Tag 7 verglichen mit dem 0 Wert (4B, p = 0,15, p = 0,32 bzw. p = 0,61). Statistische Änderungen wurden an Tag 14 in Schutzmittelzusammensetzungsproben beobachtet, die bei 6 °C (p = 0,048) und 22 °C (p = 0,039) gelagert wurden, nicht aber bei 37 °C (p = 0,070).
  • Berechnungen eines Änderungsvielfachen (4a und 4b, Tabelleneinschub) zeigen die Erhöhung in K3EDTA-pDNA-Werten an Tag 7 und 14 (6 °C = 10- und 78-fache Erhöhung, 22 °C = 75- und 233-fache Erhöhung, 37 °C = 30- und 53-fache Erhöhung), während Änderungen in pDNA-Werten aus den Schutzmittelzusammensetzungsproben minimal blieben (6 °C = 2- und 3-fache Erhöhung, 22 °C = 2- und 7-fache Erhöhung, 37 °C = 1- und 5-fache Erhöhung).
  • Unter Bezugnahme auf 5 wird Formaldehyd als Zellfixierungsmittel aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, Amino-, Amid-, Guanidino-, Thiol-, Phenol-, Imidazolyl- und Indolylgruppen auf Nukleinsäure und Protein zu vernetzen, um Hemi-Acetalderivate zu bilden. DNA-Protein- oder DNA-DNA-Vernetzungen sind eine spezielle, aber wichtige, Art von Schädigung, die die genetische Untersuchung einer enormen Anzahl gelagerter Proben blockiert. Die durch Formalin ausgelöste Vernetzung konserviert effektiv die strukturelle DNA-Morphologie, ist aber für eine anschließende DNA-Analyse extrem schädlich, da vernetzte Basen Polymerasen unterbinden und DNA-DNA-Vernetzungen eine Denaturierung hemmen können. Da das humane Genom so groß ist (3 Milliarden Desoxyribonukleotidpaare), ist es unmöglich zu bestimmen, welche Nukleotide vernetzt werden, wenn sie einer Formalinlösung ausgesetzt werden (d.h., Hemi-Acetalzugabe zu DNTPs durch Formalin erfolgt zufällig). Daher ist ein Nachweis einer durch Formalin ausgelösten DNA-Schädigung unter Verwendung einer einzigen Gen-Analyse nicht ausreichend. Zum Beispiel zeigt 5 drei verschiedene Reaktionen, die dieselbe Zubereitung genomischer DNA und Formaldehyd enthalten. Die Stelle der Formaldehyd-Vernetzung ist jedoch in jedem Röhrchen anders.
  • 6a und 6b zeigen schematische Darstellungen der chemischen Modifizierungen einer Methylenbrückenbildung zwischen zwei Adenin-Nukleobasen (ein Beispiel einer DNA-DNA-Vernetzung) und zwischen Adenin-Nukleobase und Lysin (ein Beispiel einer DNA-Protein-Vernetzung) die bei einer DNA-DNA- und DNA-Protein-Vernetzung auftritt.
  • 7a und 7b zeigen, wie die vorliegenden Lehren nachweisbares freies Formaldehyd vermeiden. In der oberen Kurve zeigt ein 13C NMR-Spektrum von cfDNA, die mit der Schutzmittelzusammensetzung in Kontakt gebracht wurde, keine Spitze von Formaldehyd (Methylenglycol) um 82–85 ppm (schattierte Region). In der unteren Kurve ist ein Vergleichsbeispiel der 13C NMR-Spitze von Formaldehyd in Formaldehydlösung (Methylenglycol) bei verschiedenen Konzentrationen dargestellt. Zur Veranschaulichung, eine Methode zum Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit eines Aldehyds, wie Formaldehyd, kann quantitative 13C NMR-Analysen verwenden, die in Gegenwart eines Gadoliniumdiethylentriaminpentaacetat-(Gd- DTPA)Komplexes durchgeführt werden. Die NMR-Daten können durch ein Instrument gewonnen werden, das relevante Fähigkeiten aufweist, die mit jenen des 500 MHz Avance DRX Serie NMR Spektrometers mit TXI Kryosonde, Bruker Biospin Corp (Billerica, MA), übereinstimmen. Die NMR-Daten können durch Software verarbeitet werden, die relevante Fähigkeiten aufweist, die mit jenen der Bruker Topspin Software übereinstimmen. Zum Erhalten von NMR-Daten können Borsilikat-NMR-Röhrchen mit einem Außendurchmesser von 5 mm (z.B. von New Era Enterprise, Inc., Vineland, NJ) verwendet werden. Ein geeignetes Spektrometer, wie ein Bruker Spektrometer, das bei 125 MHz 13C Beobachtungsfrequenz bei einer Sondentemperatur von 298 K arbeitet, kann verwendet werden. Eine inverse-gated Protonenentkopplungssequenz (zgig30) kann für die Gewinnung angewendet werden. Veranschaulichende Parameter für 13C{1H}-NMR waren Spektralbreite – 30030 Hz; Zeitdomänenpunkte – 32768; Gewinnungszeit – 0,5 Sekunden; Pulsverzögerung – 1 Sekunde, wonach eine geeignete Anzahl von Abtastungen (z.B. 2048 Abtastungen) gewonnen werden kann. Vor jedem NMR-Versuch kann Gd-DTPA in D2O aufgelöst werden, um die Lösung mit der gewünschten Konzentration zu erhalten. Für eine NMR-Gewinnung kann eine 250 µL Probenlösung mit 250 µL Gd-DTPA/D2O verdünnt werden. THF kann, auf das Gewicht bezogen, direkt in die NMR-Probenlösung zugegeben werden.
  • Eine herkömmliche NMR-chemische Verschiebungseinheit ppm (Teile je Million) kann für Spektralinterpretationen verwendet werden, wobei Spitzen auf der Basis von -CH2-CH2O- von Tetrahydrofuran-(THF, eine inerte interne Referenz)Spitzen bei
    Figure DE202013012535U1_0010
    = 24,9 ppm kalibriert werden. Die NMR-chemische Verschiebungseinheit ppm ist das Verhältnis der Differenz zwischen der chemischen Resonanz des Analyten und den Referenzsubstanzen zur Frequenz des Instruments, sie kann durch die dimensionslose Quantität
    Figure DE202013012535U1_0011
    angegeben und als:
    Figure DE202013012535U1_0012
    Figure DE202013012535U1_0013
    definiert werden.
  • Für den Nachweis der unteren Nachweisgrenze der NMR-Bedingungen können 13C NMR-Spektren von Formaldehydlösungen mit allmählich abnehmenden Formaldehydkonzentrationen gewonnen werden. In 7b zeigt zum Beispiel das 13C NMR-Spektrum, mit 2048 wiederholten Abtastungen und 1 Sekunde Entspannungsverzögerung von 0,01 % Formaldehydlösung, dass das Methylenglycol CH2-Signal bei –81,9 ppm ein Signal/Rausch-Verhältnis von fast 2 hat. Ein ähnliches Spektrum mit 0,005 % Formaldehyd zeigte keine Spitze in der 80–85 ppm Region. Daher liegt die untere Nachweisgrenze der angewendeten NMR-Technik für einen Nachweis von Formaldehyd zwischen 0,01 % und 0,005 %. 7A zeigt das repräsentative 13C NMR-Spektrum von zellfreien DNA BCT-Reagenzien (eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren) (250 µL) in D2O (250 µL) in Gegenwart von Gd-DTPA (~0,6 mg). Die 13C NMR-Spektren mehrerer Lots solcher Zusammensetzungen zeigen kein Signal in der 80–85 ppm Region. Es wird angenommen, dass ähnliche Ergebnisse mit Proben erreichbar sind, die gemäß den vorliegenden Lehren behandelt sind. Das heißt, es ist nicht nur die Schutzmittelzusammensetzung frei von nachweisbarem Formaldehyd durch 13C NMR-Analyse, sondern auch Proben, die mit der Zusammensetzung behandelt sind, sind gleichermaßen frei von nachweisbarem Formaldehyd durch 13C NMR-Analyse.
  • 8a zeigt, wie eine konformationale Schädigung an DNA unter Verwendung der vorliegenden Lehren vermieden werden kann. Es sind Fluoreszenzspektren nativer-DNA (Kontrolle), CF-DNA-BCT-(eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren)konservierter DNA, Formaldehyd-konservierter DNA und Glutaraldehyd-konservierter DNA dargestellt. Die obere Kurve ist für eine Probe, die 7 Tage bei Raumtemperatur gehalten wird. Die mittlere Kurve ist für eine Probe, die 7 Tage bei Raumtemperatur gehalten wird und dann 1 h bei 60 °C erwärmt wird. Die unterste Kurve ist für eine Probe, die 7 Tage bei Raumtemperatur gehalten wird und dann 2 min bei 90 °C erwärmt wird.
  • 8b zeigt ferner, wie eine konformationale Schädigung an DNA unter Verwendung der vorliegenden Lehren vermieden werden kann. Es sind Fluoreszenzspektren nativer-DNA (Kontrolle), CF-DNA-BCT-(eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren)konservierter DNA, Formaldehyd-konservierter DNA und Glutaraldehyd-konservierter DNA dargestellt. Die obere Kurve ist für eine Probe, die 14 Tage bei Raumtemperatur gehalten wird. Die mittlere Kurve ist für eine Probe, die 14 Tage bei Raumtemperatur gehalten wird und dann 1 h bei 60 °C erwärmt wird. Die unterste Kurve ist für eine Probe, die 14 Tage bei Raumtemperatur gehalten wird und dann 2 min bei 90 °C erwärmt wird.
  • 9 zeigt, wie eine Amplifikation von DNA-Proben von den vorliegenden Lehren profitieren kann. DNA-Proben werden mit verschiedenen Mitteln bei Raumtemperatur inkubiert. Eine DNA-Kontrolle wird verwendet. Behandelte Proben werden für einen Vergleich verwendet, enthaltend eine CF-DNA BCT-(eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren)behandelte Probe, eine Formaldehyd-(0,1 %)behandelte Probe und eine Glutaraldehyd-(0,1 %)behandelte Probe für einen Vergleich. Aliquote werden von jeder DNA-Probe zu verschiedenen Zeitpunkten genommen und durch PCR amplifiziert.
  • Unmittelbar nach Zugabe der Mittel zum Behandeln der Proben, laut 9a, sind PCR-Amplifikationen für alle DNA-Proben ähnlich, die mit verschiedenen Mitteln gemischt sind. Die PCR-Amplifizierung scheint durch das Vorhandensein der Fixierungsmittel unmittelbar bei Kontakt mit jeder Probe nicht beeinflusst zu sein. Etwa 18 Stunden nach Zugabe der Mittel jedoch, sind, laut 9b, PCR-Amplifikationen von Kontroll-DNA und CF-DNA BCT-behandelter DNA ähnlich. Die PCR-Amplifikation von Formaldehyd-fixierter DNA ist jedoch behindert und Glutaraldehyd-fixierte DNA ist stärker behindert. Es wird somit angenommen, dass die Verwendung von CF-DNA BCT (eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung wie hier beschrieben) gemäß den vorliegenden Lehren DNA nicht schädigt; während Formaldehyd und Glutaraldehyd DNA schädigen.
  • Nach etwa 72 Stunden sind, laut 9c, die PCR-Amplifikation von Kontroll-DNA und CF-DNA BCT-behandelter DNA ähnlich; die PCR-Amplifikation von Formaldehyd-fixierter DNA ist deutlich behindert; und Glutaraldehyd-fixierte DNA konnte nicht amplifiziert werden. Daher wird wieder angenommen, dass über längere Zeiträume (mehr als 24, 48 oder 72 Stunden), CF-DNA BCT DNA nicht schädigt; während Formaldehyd und Glutaraldehyd DNA schädigen.
  • 10a–10d zeigen eine quantitative Echtzeit-PCR Analyse eines 800 Basenpaar Genfragments von Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-(GAPDH)DNA, behandelt mit oder ohne Formaldehyd, Glutaraldehyd oder CF-DNA BCT-Reagens (eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren) bei den angegebenen Konzentrationen. Proben werden bei Raumtemperatur (RT: a und b) gehalten oder einer zusätzlichen Wärmebehandlung für 1 Stunde bei 60 °C vor PCR-Amplifizierung (c und d) unterzogen. Eine Quantifizierung einer DNA-Ausgangskonzentration, Post-Amplifikation, von GAPDH DNA-Fragmenten wird auf einem Bio-Rad iQ5TM Thermozykler unter Verwendung des TaqMan Universal Master Mix II mit UNG durchgeführt. Die dargestellten Daten stellen die Zeitpunkte Tag 0 (a und c) und 7 (b und d) dar. Die Ergebnisse zeigen, dass eine GAPDH DNA-Behandlung mit CF-DNA BCT (eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren) eine PCR-Amplifikation der GAPDH DNA nicht verhindert und quantifizierte DNA-Konzentrationen mit der nicht-behandelten DNA-Kontrolle zum Zeitpunkt 0 vergleichbar sind, was anzeigt, dass das CF-DNA BCT Reagens eine PCR-Analyse der Proben 7 Tage nach Probenentnahme nicht beeinträchtigt. Formaldehyd- oder Glutaraldehyd-Behandlungen beeinträchtigen jedoch teilweise oder vollständig die Amplifikation der GAPDH DNA. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass das CF-DNA BCT-Reagens, nicht aber Formaldehyd oder Glutaraldehyd, zur Stabilisierung und Aufrechterhaltung der DNA-Integrität für eine nachfolgende quantitative Analyse durch quantitative, auf PCR-basierende Methodologien verwendet werden kann.
  • 11 zeigt die Wirkungen verschiedener Stabilisierungsreagenzien auf die Plasma cfDNA-Amplifikation. Ein In vitro-Modell, in dem ein 800 Basenpaar DNA-Amplikon von humaner genomischer DNA in Plasma von gesundem humanen Blut gespickt ist. DNA-gespickte Plasmaproben wurden mit oder ohne verschiedene Stabilisierungsmittel bei Raumtemperatur inkubiert. Behandelte Proben wurden für einen Vergleich verwendet, enthaltend eine CF-DNA BCT-(eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren)behandelte Probe, eine Formaldehyd-(0,1 %)behandelte Probe und eine Glutaraldehyd-(0,1 %)behandelte Probe zum Vergleich. Aliquote wurden zu den angegebenen Zeitpunkten von jeder DNA-Probe genommen; DNA wurde mit einem Qiagen Extraktionskit extrahiert und durch quantitative Echtzeit PCR amplifiziert. Die Quantifizierung von behandelter und unbehandelter DNA wurde auf einem Bio-Rad iQ5TM Thermozykler unter Verwendung des Syber-Green Chemieprotokolls durchgeführt. 11 zeigt, dass die unbehandelte DNA (Kontrolle) und CF-DNA BCT-behandelte DNA weiterhin in einem im Wesentlichen ähnlichen Ausmaß amplifizieren; während sowohl Formaldehyd- als auch Glutaraldehyd-behandelte DNA eine kontinuierlich abnehmende Amplifikation im Lauf der Zeit hat.
  • 12 zeigt eine DNA-Doppelhelix-Konformationsschädigung durch Formaldehyd nach Erwärmung bei 60 °C für 1 Stunde (dies wurde gemacht, um den Proteinase K-Aufschlussschritt zu simulieren, der 1 Stunde bei 60 °C während der cfDNA-Extraktion aus Plasma vorgenommen wird), aber nicht mit dem CF-DNA-BCT Reagens nach den vorliegenden Lehren. Zirkulardichroismusspektren von nativer DNA (Kontrolle), CF-DNA-BCT-konservierter DNA (eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren) und Formaldehyd-konservierter DNA sind dargestellt.
  • 13a–13d zeigen, wie eine formale DNA-Ladung durch Formaldehyd beeinflusst wird, nicht aber mit CF-DNA-BCT-Reagens, einer beispielhaften Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren. Es sind Ergebnisse dargestellt, die von einer Gelelektrophorese einer nativen DNA (Kontrolle), CF-DNA-BCT-(einer beispielhaften Schutzmittelzusam- mensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren)konservierten DNA und Formaldehyd-konservierten DNA erwartet werden, die 7 Tage bei Raumtemperatur gehalten werden (13a); 7 Tage bei Raumtemperatur gehalten und 1 Stunde auf 60 °C erwärmt werden (13b); nach 14 Tagen bei Raumtemperatur (13c); und 14 Tage bei Raumtemperatur gehalten plus 1 Stunde auf 60 °C erwärmt werden (13d). Agarose-Gelelektrophorese genomischer DNA oder mit Fixierungsmittel behandelter DNA zur Bestimmung von Änderungen in DNA-Gel-Migrationsmustern, ausgelöst durch eine Reihe unterschiedlicher Fixierungsmittel. Fixierte oder unbehandelte DNA wurde bei Raumtemperatur 9 (a) und 14 Tage (b) vor Agarose-Gelelektrophorese behandelt. Für Versuche c und d werden die 7- und 14-tägigen Inkubationen einer zusätzlichen Wärmebehandlung für 1 h bei 60 °C unterzogen. Natives, unfixiertes CF-DNA-Reagens (eine beispielhafte Schutzmittelzusammensetzung innerhalb der vorliegenden Lehren) und IDU-behandelte DNA (9a–d, Bahnen 1–2; 8–9, Bahnen 3–4; 10–11 und 5; 12) sind von sämtlichen Unterschieden in Versuchsbedingungen nicht betroffen. Diese Daten bekräftigen, dass das CF-DNA BCT Reagens und IDU die formale DNA-Ladung nicht ändern und dadurch die elektrophoretische Migration der primären DNA-Bande nicht beeinflussen (unterer Pfeil, bezeichnet mit "Primäre DNA-Bande") verglichen mit der nicht fixierten Kontroll-DNA. Im Gegensatz dazu verringert eine Behandlung mit 0,1 % Formaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd die scheinbare Konzentration von DNA im Beladungs-Well (obere Pfeil, bezeichnet mit "Beladungs-Well": a und c; Bahn 6), was bei einer Glutaraldehydbehandlung drastischer war. Wenn die Proben einer Wärmebehandlung unterzogen werden, werden die scheinbaren DNA-Konzentrationen sowohl für den Beladungs-Well (oberer Pfeil) als auch die primäre DNA-Bande innerhalb des Gels drastisch verringert (b und d; Bahn 13 Formaldehyd, Bahn 14 Glutaraldehyd). Tatsächlich induzieren Formaldehyd und Glutaraldehyd den Großteil der oder die gesamte DNA, die im Beladungs-Well sichtbar ist. Ferner schien die DNA ein geringeres Molekulargewicht zu haben, was nahelegt, dass die formale DNA-Ladung durch Formaldehyd oder Glutaraldehyd geändert wird, die die Migrationsrate durch das Gel der durch das stärker elektronegative Fixierungsmittel modifizierten DNA erhöht, oder eine DNA-Fragmentierung, die durch Formaldehyd und Glutaraldehyd ausgelöst wird, eingetreten ist. Alternativ können Formaldehyd und Glutaraldehyd einen Abbau oder eine Schädigung bei der DNA auslösen, die deren Auflösung auf dem Gel beeinträchtigt.
  • In 14 wurde Blut 6 Spendern in K3EDTA-Standardentnahmeröhrchen entnommen. Zwei Plasmaproben von jedem Spender wurden abgetrennt. Eine Probe wurde mit Proteinase K (30mAU) bei 37 °C 10 Minuten behandelt und dann bei 75 °C 15 Minuten erwärmt, um die Proteinase zu inaktivieren. DNase I (136 U) und 6 mM MgCl2 wurden dann der deproteinierten Probe zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht wurde die cfDNA-Konzentration mit dem Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies, Grand Island, NY) gemessen und es wurde festgestellt, dass die Fluoreszenz des behandelten Plasmas um 93 % im Vergleich zum Kontrollplasma verringert war. Somit ist ein auf Fluoreszenz basierendes DNA Testsystem, das zum Quantifizieren von cfDNA in Plasma verwendet wird, praktisch, exakt und mit einer Blutabnahme in Blutsammelvorrichtungen kompatibel, die die hier beschriebene Schutzmittelzusammensetzung enthalten, die cfDNA über 14 Tage einer Lagerung bei Raumtemperatur stabilisiert.
  • Wie in 15 und 16 dargestellt, wurden Blutproben von 20 Spendern sowohl in K3EDTA-Röhrchen (15) als auch Blutsammelvorrichtungen gemäß den vorliegenden Lehren entnommen (16) und bei Raumtemperatur gelagert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde jedem Röhrchen eine Aliquote entnommen und Plasma wie zuvor beschrieben abgetrennt. Nach der Plasmatrennung wurde die cfDNA-Konzentration von Plasma unter Verwendung des Qubit dsDNA HS Tests bestimmt. Für den Lagerungszeitrahmen von 14 Tagen wurde eine statistisch signifikante Erhöhung einer cfDNA-Konzentration nur bei K3EDTA-Röhrchen und nicht bei den Blutsammelvorrichtungen beobachtet, die die Schutzmittelzusammensetzung der vorliegenden Lehren enthielten. Für die Kastenkurve zeigt die Linie im Inneren des Kastens den Medianwert an und Grenzen des Kastens stellen das 75. und 25. Perzentil dar. Der obere und untere Fehlerbalken zeigen das 10. zw. 90. Perzentil, während die meisten Punkte sämtliche Punkte außerhalb der Whisker angeben. *p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001 durch gepaarten Student-t-Test.
  • Unter Bezugnahme auf 17 kann eine Formaldehydfixierung durch Verwendung von Formaldehyd-Quentsch-Verbindungen reguliert werden (wie hier besprochen), wie durch Amine (z.B. Methylamin, CH3NH2) oder andere Amino-Derivate wie Amid (z.B. Harnstoff, H2NCONH2), Aminosäuren (z.B. Glycin, HOOCCH2NH2) oder Ammoniumsalze. Durch Reagieren des Quentsch-Mittels und Formaldehyds, wie dargestellt, werden Produkte, enthaltend Methylol und Schiff-Basen, wie dargestellt gebildet. Theoretisch kann jede Verbindung mit elektronenreicher funktioneller Gruppe die mit einer elektrondefizienten funktionellen Carbonylgruppe von Formaldehyd reagieren kann, Formaldehyd quentschen. Wie zum Beispiel in 18 dargestellt, können cis-Diolverbindungen Formaldehyd quentschen und zyklisches Acetal liefern.
  • 19 zeigt, dass Formaldehyd freigesetzt durch 47,5 Imidazolidinylharnstoff, vollständig durch Glycin, Lysin und Harnstoff abgeschreckt wird. Die 13C NMR-Spektren von Imidazolidinylharnstoff in Gegenwart von verschiedenen Quentsch-Mitteln sind dargestellt. Das 13C Signal von hydriertem Formaldehyd von Imidazolidinylharnstoff ist im schattieren Bereich an einer chemischen Verschiebungsposition von 81,9 ppm angegeben. Die Spitze ist nicht vorhanden, wenn Glycin, Lysin oder Harnstoff im Medium vorhanden sind. Quentsch-Effizienzen der verschiedenen hier besprochenen Quentsch-Mittel sind jedoch unterschiedlich. Diazolidinylharnstoff wird in 20 zur Bestimmung ihrer Quentsch-Effizienz verwendet. 20 zeigt eine relative Effizienz zum Quentschen von Formaldehyd, das aus einer 0,5 % Diazolidinylharnstofflösung freigesetzt wird, wie es in der hier offenbarten Schutzmittelzusammensetzung enthalten sein kann.
  • 21 zeigt Formaldehydkonzentrationen von Diazolidinylharnstoff (0,5 %) in Gegenwart von verschiedenen Quentsch-Mitteln. Die Konzentrationen werden unter Verwendung der NMR-Methode basierend auf einer Spitzenintegration berechnet.
  • 22 zeigt freie hydrierte Formaldehydprodukte, die sowohl in Diazolidinylharnstoff als auch Imidazolidinylharnstoff vorhanden sind. Eine NMR-spektroskopische Studie zeigte, dass, wenn Glycin (5 %) und Formaldehyd (5 %) zusammengemischt werden, Methylol gebildet wird, wie in 23 dargestellt. Wie ferner in 23 dargestellt, wenn das Glycin- und Formaldehydgemisch 4 Tage bei 50 °C erwärmt wird, werden ebenso zusätzliche Reaktionsprodukte wie Schiff-Base, Schiff Base-Glycinvernetztes Produkt und Schiff-Base-Dimer gebildet. Wenn Glycin einer Lösung von Diazolidinylharnstoff oder Imidazolidinylharnstoff zugegeben wird, reagiert es mit dem Formaldehyd, das aus Diazolidinylharnstoff und Imidazolidinylharnstoff freigesetzt wird, wie zum Beispiel in 24 dargestellt. NMR-Studien können das Vorhandensein von Glycin-Methylol und Schiff-Base in einem Gemisch aus Imidazolidinylharnstoff- und Glycinlösungen nachweisen, wie zum Beispiel in 25 gezeigt.
  • Wie hier besprochen, ist von Diazolidinylharnstoff in wässriger Lösung auch bekannt, dass er Formaldehyd freisetzt (siehe 26). Glycin wird zum Quentschen des aus Diazolidinylharnstoff freigesetzten Formaldehyds zugegeben. NMR-Studien zeigen, dass die Produkte, die aus Glycin und Formaldehyd gebildet werden, Glycin-Methylol, Glycin-Schiff-Base, Glycin-Schiff-Base-Dimer, vernetzte Glycin-Schiff-Base sind, wie zum Beispiel in Figur dargestellt 26. In einem Gemisch aus Diazolidinylharnstoff und Glycin können alle der obengenannten Chemikalien in verschiedenen Konzentrationen vorhanden sein.
  • Zusätzlich zu Glycin können mehrere Verbindungen als Formaldehyd-Quentsch-Mittel verwendet werden (siehe 27). Ein Beispiel für ein solches Formaldehyd-Quentsch-Mittel kann sämtliche reaktionsfähige Amingruppe-haltigen Verbindungen enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, enthaltend Harnstoff, Ammoniumsalze, primäre und sekundäre Amine, Lysin, Arginin und/oder Nukleobasen (d.h., Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin) und Polyamine (d.h., Spermidin). Die Produkte, die von der Reaktion von Formaldehyd, freigesetzt aus Diazolidinylharnstoff, mit den oben genannten oder anderen Amingruppe-haltigen Quentsch-Mitteln erhalten werden, können entsprechend Methylol und Schiff-Base enthalten. Die Art der anderen Nebenprodukte kann abhängig von dem Quentsch-Mittel variieren.
  • Wie aus dem Vorhergesagten ferner hervorgeht, sehen die vorliegenden Lehren Verfahren zum Analysieren von DNA in einer aldehydfreien biologischen Probe vor. Die Verfahren können einen oder mehrere Schritte zum Kontaktieren einer Probe, die DNA enthält, mit einer Schutzmittelzusammensetzung enthalten, die Imidazolidinylharnstoff und ein oder mehrere Quentsch-Mittel wie hier beschrieben enthält. Danach kann die Probe durch einen oder mehrere Schritte zum Analysieren von DNA behandelt werden.
  • Zum Beispiel kann ein Schritt zum Kontaktieren der Probe mit einem fluoreszierenden Farbstoff vorliegen, der selektiv mit der Doppelhelix-DNA bindet, und danach zum Durchführen eines Tests an der DNA, das ein Durchführen einer Fluoreszenzspektroskopie, Zirkulardichroismusspektroskopie oder beider enthält, um die DNA der Probe zu analysieren. Es wird erwartet, dass nach einem Zeitraum von mindestens etwa 6, 12, 24, 48, 96 Stunden oder länger (z.B., 1 Woche oder sogar zwei Wochen später) ab dem Zeitpunkt, zu dem die Probe mit der stabilisierenden Zusammensetzung in Kontakt gebracht wurde, diese eine Fluoreszenzintensität aufweist, die innerhalb von etwa 20 % der Intensität nativer DNA (zum Zeitpunkt der Probenbeschaffung) liegt, die dem obengenannten Kontaktierungsschritt nicht ausgesetzt wurde. Es wird erwartet, dass nach einem Zeitraum von mindestens etwa 6, 12, 24, 48, 96 Stunden oder länger (z.B., 1 Woche oder sogar zwei Wochen später) ab dem Zeitpunkt, zu dem die Probe mit der stabilisierenden Zusammensetzung in Kontakt gebracht wurde, diese eine Elliptizität aufweist, die im Wesentlichen jener von nativer DNA (zum Zeitpunkt der Probenbeschaffung) entspricht, die dem obengenannten Kontaktierungsschritt nicht ausgesetzt wurde.
  • Es kann ein Schritt zum Amplifizieren von DNA vorliegen, die aus dem Kontaktierungsschritt durch PCR resultiert, wobei nach einem Zeitraum von mindestens etwa 6, 12, 24, 48, 96 Stunden oder länger (z.B. 1 Woche oder sogar zwei Wochen später) ab dem Zeitpunkt, zu dem die Probe, die mit dem Mittel in Kontakt gebracht wurde, diese eine Amplifikationeffizienz aufwies, die innerhalb von etwa 20 % jener von nativer DNA (zum Zeitpunkt der Probenbeschaffung) lag, die keinem Kontaktierungsschritt unterzogen worden war.
  • Die hier angeführten Erklärungen und Darstellungen sollten andere Fachleute auf dem Gebiet mit der Erfindung, ihren Prinzipien und ihrer praktischen Anwendung vertraut machen. Fachleute auf dem Gebiet können die Erfindung in ihren zahlreichen Formen anpassen und anwenden, wie es am besten für die Anforderungen einer bestimmten Verwendung geeignet ist. Kann Daher sollen die speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie angegeben, nicht als erschöpfend oder Einschränkung der Erfindung ausgelegt werden. Der Umfang der Erfindung sollte daher nicht nur unter Bezugnahme auf die obenstehende Beschreibung festgelegt werden, sondern sollte stattdessen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Ansprüche festgelegt werden, gemeinsam mit dem vollen Umfang von Äquivalenten zu welchen solche Ansprüche berechtigt sind. Die Offenbarungen aller Artikel und Referenzen, enthaltend Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, werden hier für alle Zwecke zur Bezugnahme zitiert. Es sind auch andere Kombinationen möglich, wie aus den folgenden Ansprüchen hervorgeht, die hiermit ebenso durch Bezugnahme in dieser schriftlichen Beschreibung zitiert werden. In Bezug auf alle vorangehenden allgemeinen Lehren, wie hier verwendet, falls nicht anderes angegeben ist, sehen die Lehren vor, dass jedes Mitglied einer Gattung (Liste) von der Gattung ausgeschlossen werden kann; und/oder jedes Mitglied einer Markush-Gruppe aus der Gruppe ausgeschlossen werden kann.
  • Falls nicht anderes angeführt ist, enthalten sämtliche numerischen Werte hierin alle Werte vom niedrigsten Wert bis zum höchsten Wert in Schritten einer Einheit, vorausgesetzt, es gibt eine Trennung von mindestens 2 Einheiten zwischen einem niedrigsten Wert und einem höheren Wert. Wenn zum Beispiel angegeben ist, dass die Menge einer Komponente, einer Eigenschaft oder eines Werts einer Prozessvariable, wie zum Beispiel, Temperatur, Druck, Zeit und dergleichen zum Beispiel von 1 bis 90, vorzugsweise von 20 bis 80, bevorzugter von 30 bis 70 reicht, ist gemeint, dass Zwischenbereichswerte (zum Beispiel 15 bis 85, 22 bis 68, 43 bis 51, 30 bis 32 usw.) innerhalb der Lehren dieser Schrift liegen. Ebenso liegen auch einzelne Zwischen werte innerhalb der vorliegenden Lehren. Für werte, die kleiner eins sind, wird eine Einheit als 0,0001, 0,001, 0,01 oder 0,1 angesehen, wie zutreffend. Dies sind nur Beispiele für das, was im Speziellen beabsichtigt ist, und alle möglichen Kombinationen von numerischen Werten zwischen dem angegebenen niedrigsten Wert und höchsten Wert sind als ausdrücklich in dieser Anmeldung auf gleiche Weise anzusehen. Wie erkennbar ist, zieht die Lehre von Mengen, die hier als "Gewichtsteile" angegeben sind, auch dieselben Bereiche in Betracht, die in der Form von Gewichtsprozent angegeben sind, und umgekehrt. Somit zieht eine Angabe in "Ausführliche Beschreibung der Erfindung" einen Bereich im Sinne von "x" Gewichtsteilen der resultierenden polymeren Mischungszusammensetzung auch eine Lehre von Bereichen derselben angegebenen Menge von "x" in Gewichtsprozent der resultierenden polymeren Mischungszusammensetzung in Betracht.
  • Falls nicht anderes angegeben ist, enthalten alle Bereiche beide Endpunkte und alle Zahlen zwischen den Endpunkten. Die Verwendung von "etwa" oder "ungefähr" in Verbindung mit einem Bereich gilt für beiden Enden des Bereichs. Somit soll "etwa 20 bis 30" "etwa 20 bis etwa 30" inklusive der genannten Endpunkte enthalten. Konzentrationen von Inhaltsstoffen, die in den vorliegenden Tabellen angegeben sind, können ±10 % oder sogar 20 % oder mehr variieren und bleiben innerhalb der Lehren.
  • Die Offenbarungen aller Artikel und Referenzen, enthaltend Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, werden für alle Zwecke zur Bezugnahme zitiert. Der Begriff "im Wesentlichen bestehend aus" zur Beschreibung einer Kombination solle die genannten Elemente, Inhaltsstoffe, Komponenten oder Schritte und andere solche Elemente, Inhaltsstoffe, Komponenten oder Schritte enthalten, die die grundlegenden und neuartigen Eigenschaften der Kombination nicht wesentlich beeinträchtigen. Die Verwendung der Begriffe "umfassend" oder "enthaltend" hierin zur Beschreibung von Kombinationen von Elementen, Inhaltsstoffen, Komponenten oder Schritten zieht auch Ausführungsformen in Betracht, die im Wesentlichen aus den Elementen, Inhaltsstoffen, Komponenten oder Schritten bestehen oder sogar aus diesen bestehen. Mehrere Elemente, Inhaltsstoffe, Komponenten oder Schritte können durch ein einzelnes integriertes Element, einen Inhaltsstoff eine Komponente oder einen Schritt bereitgestellt sein. Alternativ kann ein einzelnes integriertes Element, ein Inhaltsstoff eine Komponente oder ein Schritt in mehrere Elemente, Inhaltsstoffe, Komponenten oder Schritte unterteilt sein. Die Offenbarung von "einer/eine/eines" oder "ein (1)" zur Beschreibung eines Elements, eines Inhaltsstoffs, einer Komponente oder eines Schritts soll zusätzliche Elemente, Inhaltsstoffe, Komponenten oder Schritte nicht ausschließen. Alle Bezugnahmen hier auf Elemente oder Metalle, die zu einer bestimmten Gruppe gehören, beziehen sich auf das Periodensystem, veröffentlich und urheberrechtlich geschützt durch CRC Press, Inc., 1989. Jede Bezugnahme auf die Gruppe oder Gruppen soll sich auf die Gruppe oder Gruppen, die in diesem Periodensystem der Elemente wiedergegeben sind, unter Verwendung des IUPAC-Systems zur Nummerierung von Gruppen beziehen.
  • Auch wenn nicht ausdrücklich angegeben, können Lehren aus einer Beschreibung einer Ausführungsform mit Lehren für andere Ausführungsformen kombiniert werden, falls die Beschreibung nicht klarstellt, dass solche Ausführungsformen wechselseitig ausschließend sind oder dass die erhaltene Kombination eindeutig ohne unzumutbare Versuche funktionsunfähig wäre.
  • Es ist klar, dass die vorangehende Beschreibung veranschaulichend und nicht einschränkend sein soll. Viele Ausführungsformen wie auch viele Anwendungen neben den bereitgestellten Beispielen sind für Fachleute auf dem Gebiet beim Lesen der vorangehenden Beschreibung offensichtlich. Der Umfang der Erfindung sollte daher nicht unter Bezugnahme auf die Beschreibung festgesetzt werden, sondern sollte vielmehr unter Bezugnahme auf die beiliegenden Ansprüche festgesetzt werden, gemeinsam mit dem vollen Umfang von Äquivalenten für die solche Ansprüche berechtigt sind. Die Offenbarungen aller Artikel und Referenzen, enthaltend Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, werden hier für alle Zwecke zur Bezugnahme zitiert. Die Unterlassung in den folgenden Ansprüchen eines Aspekts des hierin offenbarten Gegenstands ist keine Verzichtserklärung für einen solchen Gegenstand, noch sollte sie so ausgelegt werden, dass die Erfinder einen solchen Gegenstand nicht als Teil des offenbarten erfindungsgemäßen Gegenstands in Betracht gezogen haben.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (17)

  1. Probensammelbehälter, enthaltend: eine Blutprobe oder Blutplasmaprobe; mindestens eine zirkulierende, zellfreie, erste Nukleinsäure, die DNA oder RNA ist; eine Schutzmittelzusammensetzung, welche ein Konservierungsmittel, ausgewählt aus Diazolidinylharnstoff, Imidazolidinylharnstoff, Dimethoylol-5,5-dimethylhydantoin, Dimethylolharnstoff, 2-Brom-2.-nitropropan-1,3-diol, Oxazolidinen, Natriumhydroxymethylglycinat, 5-Hydroxymethoxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxypoly[methylenoxy]-methyl-1-1aza-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octan, quaternärem Adamantin oder einer Kombination davon; ein Anticoagulans und ein Quentsch-Mittel enthält; ein Reaktionsprodukt, das durch die Probe und die Schutzmittelzusammensetzung gebildet wird, welches: (i) inert für die Nukleinsäure der biologischen Probe; und (ii) frei von Aldehyd ist; sodass die Nukleinsäuren darin dann für eine Polymerase-Kettenreaktion und DNA-Sequenzierung ohne Einfrieren der Probe für mindestens 7 Tage geeignet sind und die DNA frei von Aldehyd-induzierter (i) Nukleinsäure-Protein-Vernetzung, (ii) intramolekularen und/oder intermolekularen Nukleinsäure-Nukleinsäure-Vernetzungen oder sowohl (i) als auch (ii) ist, durch Quentschen von sämtlichem freien Formaldehyd, das vorhanden sein kann, mit dem Quentsch-Mittel aus der Schutzmittelzusammensetzung.
  2. Probensammelbehälter nach Anspruch 1, wobei der Hintergrundwert von genomischer DNA im Behälter, der die Probe und das Schutzmittel enthält, kleiner als der Hintergrundwert von genomischer DNA ist, der in einem Behälter vorhanden wäre, der nur die Probe und kein Schutzmittel enthält.
  3. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Behälter frei von nachweisbaren kovalenten Modifizierungen ist, die eine PCR-Amplifikation hemmen, durch Hemmung einer Polymerase-bindung und -verlängerung, Hemmung einer Primerhybridisierung und/oder Hemmung einer DNA-Farbstoffeinlagerung.
  4. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Quentsch-Mittels nach dem Probenkontaktierungsschritt höher als 0,001 g/ml, höher als 0,002 g/ml oder sogar höher als 0,004 g/ml des Gemisches aus Schutzmittel und Probe ist.
  5. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Quentsch-Mittels nach dem Probenkontaktierungsschritt geringer als 0,03 g/ml, geringer als 0,01 g/ml oder sogar geringer als 0,008 g/ml des Gemisches aus Schutzmittel und Probe ist.
  6. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Schutzmittel etwa 1 % bis etwa 10 %, auf das Gewicht bezogen, des Quentsch-Mittels enthält.
  7. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Schutzmittel etwa 1 % bis etwa 20 %, auf das Gewicht bezogen, EDTA enthält.
  8. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Schutzmittel mindestens etwa 1 mg und weniger als etwa 15 mg des Quentsch-Mittels enthält.
  9. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Reaktionsprodukt frei von freiem Aldehyd ist, wie durch 13C NMR gemessen.
  10. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Reaktionsprodukt keine Spitze im Bereich von 82–85 ppm aufweist, wenn durch 13C NMR gemessen.
  11. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Schutzmittel Diazolidinylharnstoff, Imidazolidinylharnstoff und EDTA enthält.
  12. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Konservierungsmittel Diazolidinylharnstoff ist.
  13. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Konservierungsmittel Imidazolidinylharnstoff ist.
  14. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Schutzmittel eine Menge von etwa 10 Teilen, auf das Gewicht bezogen, des Konservierungsmittels pro etwa 1 Teil, auf das Gewicht bezogen, des Quentsch-Mittels enthält.
  15. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Quentsch-Mittel eine Verbindung ist, die mindestens eine funktionelle Gruppe enthält, die imstande ist, mit einer elektronendefizienten funktionellen Gruppe von Formaldehyd zu reagieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminverbindung, die mit Formaldehyd zur Bildung von Methylol und/oder Imin-Schiffbase reagiert, oder einer cis-Diolverbindung, die mit Formaldehyd zur Bildung eines zyklischen Acetals reagiert.
  16. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Quentsch-Mittel einen Inhaltsstoff enthält, ausgewählt aus Aminosäuren, Alkylaminen, Polyaminen, primären Aminen, sekundären Aminen, Ammoniumsalzen oder einer Kombination davon.
  17. Probensammelbehälter nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Quentsch-Mittel einen Inhaltsstoff enthält, ausgewählt aus Glycin, Lysin, Ethylendiamin, Arginin, Harnstoff, Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Spermidin oder einer Kombination davon.
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