DE202013012727U1

DE202013012727U1 - Microscope module for imaging a sample

Info

Publication number: DE202013012727U1
Application number: DE202013012727.9U
Authority: DE
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2018-11-28
Anticipated expiration: 2023-05-11

Abstract

Mikroskopmodul (300) für eine Mikroskopanordnung (200) zum Abbilden einer Probe (40, 270), wobei die Mikroskopanordnung (200) umfasst:- eine Lichtquelle (20) zum Erzeugen eines Beleuchtungsstrahls entlang eines Beleuchtungsstrahlpfads (215); und- einen Detektor (50) zum Detektieren von emittiertem Licht entlang eines Detektionspfads (225); wobei das Mikroskopmodul (300) umfasst:- einen Probenhalter (240), entfernbar angeordnet in der Mikroskopanordnung (200) und geeignet zum Halten der Probe (40, 270) an einer Oberseite des Probenhalters (240), sowie aufweisend einen für den Beleuchtungsstrahl und das von der Probe (40, 270) emittierte Licht transparenten Boden (260);- zumindest ein Beleuchtungsobjektiv (210), befindlich unterhalb des Probenhalters (240) und angeordnet in der Mikroskopanordnung (200) zum Leiten des Beleuchtungsstrahls durch den Boden (260) des Probenhalters (240); und- zumindest ein Detektionsobjektiv (220), befindlich unterhalb des Probenhalters (240) und angeordnet in der Mikroskopanordnung (200) zum Sammeln des von der Probe (40, 270) durch den Boden (260) des Probenhalters (240) entlang des Detektionspfads (225) emittierten Lichts; wobei das Beleuchtungsobjektiv (210) und das Detektionsobjektiv (220) in einem Immersionsmedium (230) befindlich sind, welches in Berührung steht bzw. gelangt mit dem zumindest teilweise transparenten Boden (260) des Probenhalters (240).A microscope module (300) for a microscope assembly (200) for imaging a sample (40, 270), the microscope assembly (200) comprising: - a light source (20) for generating an illumination beam along an illumination beam path (215); and - a detector (50) for detecting emitted light along a detection path (225); the microscope module (300) comprising: - a sample holder (240) removably disposed in the microscope assembly (200) and adapted to hold the sample (40, 270) at an upper surface of the sample holder (240), and having one for the illumination beam and the light emitted by the sample (40, 270) is transparent bottom (260); - at least one illumination objective (210) located below the sample holder (240) and arranged in the microscope assembly (200) for directing the illumination beam through the bottom (260) the sample holder (240); and at least one detection objective (220) located below the sample holder (240) and arranged in the microscope assembly (200) for collecting the sample (40, 270) through the bottom (260) of the sample holder (240) along the detection path (240). 225) emitted light; wherein the illumination objective (210) and the detection objective (220) are located in an immersion medium (230) which is in contact with the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240).

Description

Querverweis zu verwandten AnmeldungCross-reference to related application

KeineNone

Gebiet der ErfindungField of the invention

Das Gebiet der Erfindung betrifft ein Mikroskopmodul zum Abbilden einer Probe.The field of the invention relates to a microscope module for imaging a sample.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Lichtscheibenmikroskopie (SPIM) ist eine Technologie, welche die Erzeugung einer Lichtscheibe verwendet zum Beleuchten einer Probe, sowie ein senkrechtes Detektionssystem zum Ermöglichen eines Abbildens von optischen Schnitten der Proben, welche lebendig sein können oder nicht. In den meisten Ausführungsformen erfordert das SPIM-System eine umfangreiche Probenvorbereitung zum Halten der Probe in einer korrekten Position zum Abbilden. Zum Beispiel ist die Probe typischerweise eingebettet in einen Agarosezylinder, welcher eingetaucht wird in einer kleinen, mit einem Immersionsmedium, wie z. B. Wasser, gefüllten Kammer. Die Technologie ist seit über einhundert Jahren bekannt, hat jedoch erst kürzlich eine umfangreiche Anwendung im Abbilden von biologischen Proben gefunden. Ein Nachteil der Technologie ist, dass Agarose nicht mit allen biologischen Proben kompatibel ist. Die Proben sind ebenfalls eingebettet in vertikalen Agarosezylindern einer beschränkten Höhe in den gegenwärtigen SPIM-Systemen. Eine solche Anordnung erlaubt keinen Zugang zur Probe während des Abbildens sowie kein Repositionieren der Probe. Die Anordnung beschränkt die Anzahl von Proben, welche abgebildet werden können, da z. B. es nicht möglich ist, 50 Proben in der beschränkten Länge des Agarosezylinders zu stapeln.Lens microscopy (SPIM) is a technology that uses the generation of a lens to illuminate a sample, as well as a vertical detection system to allow imaging of optical sections of the samples, which may or may not be alive. In most embodiments, the SPIM system requires extensive sample preparation to hold the sample in a correct position for imaging. For example, the sample is typically embedded in an agarose cylinder which is immersed in a small immersion medium, such as an immersion medium. As water, filled chamber. The technology has been known for over a hundred years, but has recently found extensive use in mapping biological samples. A disadvantage of the technology is that agarose is not compatible with all biological samples. The samples are also embedded in vertical agarose cylinders of limited height in the current SPIM systems. Such an arrangement does not allow access to the sample during imaging or repositioning the sample. The arrangement limits the number of samples that can be imaged, e.g. For example, it is not possible to stack 50 samples in the limited length of the agarose cylinder.

SPIM-Systeme werden z. B. beschrieben in der internationalen Patentanmeldung mit der Nr. WO 2004/053558 (Stelzer et al., angemeldet durch European Molecular Biology Laboratory). Diese Offenbarung lehrt ein Mikroskop, in welchem ein dünner Lichtstreifen (Lichtscheibe) eine Probe beleuchtet und die Probe beobachtet wird mittels eines Detektors. Die Achse des Detektors ist im Wesentlichen senkrecht ausgerichtet zur Richtung eines Beleuchtungsstrahls. Die Probe wird durch den Lichtstreifen versetzt bzw. bewegt, und der Detektor nimmt gestreutes Licht von der Probe oder fluoreszentes Licht von der Probe in einer Reihe von Abbildungen auf. Dreidimensionale Abbildungen der Probe können kreiert werden durch optisches Schneiden der Probe sowie darauffolgendes Rekonstruieren der gesamten Abbildung der Probe.SPIM systems are z. As described in the international patent application with the no. WO 2004/053558 (Stelzer et al., Filed by the European Molecular Biology Laboratory). This disclosure teaches a microscope in which a thin strip of light (lens) illuminates a sample and the sample is observed by means of a detector. The axis of the detector is oriented substantially perpendicular to the direction of an illumination beam. The sample is displaced by the light strip and the detector picks up scattered light from the sample or fluorescent light from the sample in a series of images. Three-dimensional images of the sample can be created by optically cutting the sample and then reconstructing the entire image of the sample.

Shroff et al. haben ein Modul für ein herkömmliches Mikroskop entwickelt, welches gekoppelt wird an die Translationsbasis des herkömmlichen Mikroskops (internationale Patentanmeldung Nr. WO 2012/122027 , Shroff et al., angemeldet für die USA). Die Verbindung des Moduls und eines invertierten Mikroskops ermöglicht, dass dieselbe Probe in zwei Weisen abgebildet werden kann, welche einander ergänzen.Shroff et al. have developed a module for a conventional microscope which is coupled to the translation base of the conventional microscope (international patent application no. WO 2012/122027 , Shroff et al., Filed for the USA). The combination of the module and an inverted microscope allows the same sample to be imaged in two ways that complement each other.

Überblick über die ErfindungOverview of the invention

Ein Mikroskopmodul zum Abbilden einer oder mehrerer Proben wird offenbart. Das Mikroskopmodul umfasst eine Beleuchtungsvorrichtung zum Erzeugen eines Beleuchtungsstrahls entlang eines Beleuchtungsstrahlpfads und zumindest eine Detektionsvorrichtung, aufweisend einen Detektionspfad. Der Beleuchtungsstrahl ist angeordnet zum Beleuchten unterer Flächen einer oder mehrerer der Proben. Der Beleuchtungsstrahlpfad ist angeordnet unter einem Winkel zum Detektionspfad. In einem Aspekt der Offenbarung ist der Winkel im Wesentlichen orthogonal. Die Proben werden in einem Kulturmedium platziert. Es besteht keine Notwendigkeit, die Proben in einem festen oder viskosen Montagemedium zu lagern, was ein Überleben der biologischen Probe stören könnte, und ebenfalls eine Rückgewinnung und Manipulation der Proben verkompliziert.A microscope module for imaging one or more samples is disclosed. The microscope module comprises an illumination device for generating an illumination beam along an illumination beam path and at least one detection device, having a detection path. The illumination beam is arranged to illuminate lower surfaces of one or more of the samples. The illumination beam path is disposed at an angle to the detection path. In one aspect of the disclosure, the angle is substantially orthogonal. The samples are placed in a culture medium. There is no need to store the samples in a solid or viscous mounting medium, which could interfere with survival of the biological sample, and also complicate recovery and manipulation of the samples.

Die Probe ist in einem Probenhalter angeordnet. Der Boden des Probenhalters ist zumindest teilweise transparent für den Beleuchtungsstrahl, so dass der Beleuchtungsstrahl die Probe beleuchten kann. Ein Beispiel eines solchen transparenten Bodens ist eine Membran. Der Probenhalter umfasst zumindest einen Vorsprung bzw. eine Auswölbung, in welchem die Probe gehalten wird. In einem Aspekt der Offenbarung kann der Vorsprung in der Form eines länglichen Troges vorliegen, in welche eine Vielzahl von Proben in einem Kulturmedium gehalten wird.The sample is placed in a sample holder. The bottom of the sample holder is at least partially transparent to the illumination beam, so that the illumination beam can illuminate the sample. An example of such a transparent bottom is a membrane. The sample holder comprises at least one projection or a bulge, in which the sample is held. In one aspect of the disclosure, the protrusion may be in the form of an elongated trough in which a plurality of samples are held in a culture medium.

Der Probenhalter ist angeordnet zum Ermöglichen eines einfachen Entfernens vom Mikroskopmodul. Dies ermöglicht, dass die Proben im Probenhalter außerhalb des Mikroskopmoduls kultiviert werden und daraufhin ungestört in das Mikroskopmodul zum Abbilden angeordnet bzw. platziert werden.The sample holder is arranged to allow easy removal from the microscope module. This allows the samples to be cultured in the sample holder outside the microscope module and then placed undisturbed in the microscope module for imaging.

Die Anordnung dieser Offenbarung ermöglicht, dass das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv in einem Immersionsmedium angeordnet sind, welches getrennt ist vom Kulturmedium, in welchem die Proben angeordnet sind. Die Trennung des Kulturmediums vom Immersionsmedium ist hilfreich zum Aufrechterhalten von Sterilität und ermöglicht auch die Verwendung von kleinen Volumina des Kulturmediums. Der transparente Boden, das Immersionsmedium und das Kulturmedium weisen im Wesentlichen denselben Brechungsindex auf zum Minimieren von optischen Aberrationen.The arrangement of this disclosure enables the illumination lens and the detection lens to be disposed in an immersion medium which is separate from the culture medium in which the samples are arranged. The separation of the culture medium from the immersion medium is helpful in maintaining sterility and also allows the use of small volumes of the culture medium. The transparent bottom, the immersion medium and the culture medium have in the Substantially the same refractive index to minimize optical aberrations.

Die Offenbarung lehrt auch ein Verfahren eines Abbildens einer Vielzahl von Proben, welches ein Anordnen eines Beleuchtungsobjektivs zum Beleuchten unterer Flächen der Vielzahl von Proben umfasst sowie ein Anordnen eines Detektionsobjektivs zum Detektieren von von der Vielzahl von Proben emittiertem Licht bei einem näherungsweise orthogonalen Winkel zum Beleuchtungspfad. Das detektierte Licht kann verwendet werden zum Erzeugen einer Abbildung einer oder mehrerer der Vielzahl von Proben.The disclosure also teaches a method of imaging a plurality of samples, including placing an illumination objective to illuminate lower surfaces of the plurality of samples, and disposing a detection objective for detecting light emitted from the plurality of samples at an approximately orthogonal angle to the illumination path. The detected light may be used to generate an image of one or more of the plurality of samples.

Figurenlistelist of figures

1 shows an overview of a conventional SPIM arrangement for imaging samples.
2 FIG. 12 shows an overview of the SPIM arrangement used in one aspect of the disclosure. FIG.
3 shows an overview of a microscope module.
4 shows an elongated trough in which the samples are arranged.

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

Die Erfindung wird nun auf der Basis der Zeichnungen beschrieben werden. Es wird deutlich werden, dass die Ausführungsformen und Aspekte der Erfindung, wie hierin beschrieben, nur Beispiele sind und den Schutzumfang der Ansprüche in keiner Weise beschränken. Die Erfindung wird definiert durch die Ansprüche und ihre Äquivalente. Es wird deutlich werden, dass Merkmale eines Aspektes oder einer Ausführungsform der Erfindung kombiniert werden können mit einem Merkmal eines verschiedenen Aspekts, verschiedener Aspekte und/oder Ausführungsformen der Erfindung.The invention will now be described on the basis of the drawings. It will be understood that the embodiments and aspects of the invention as described herein are only examples and in no way limit the scope of the claims. The invention is defined by the claims and their equivalents. It will be appreciated that features of an aspect or embodiment of the invention may be combined with a feature of a different aspect, various aspects and / or embodiments of the invention.

1 stellt das fundamentale Prinzip von SPIM dar, welches umfangreicher um US-Patent Nr. 7,554,725 beschrieben wird, dessen Offenbarung durch Verweis hierin eingeschlossen ist. Die Anordnung 10 umfasst einen Laser 20, welcher mittels eines Beleuchtungsobjektives 25 eine Lichtscheibe 30 erzeugt zum Beleuchten von Abschnitten einer Probe 40. Die Lichtscheibe 30 wird entlang eines Beleuchtungsstrahlpfads 35 gerichtet. Ein Detektionsobjektiv 65 wird derart angeordnet, dass die Detektionsrichtung 55 im Wesentlichen orthogonal zur Ebene der Lichtscheibe 30 (d. h. senkrecht zum Beleuchtungsstrahlpfad 35) ist. 1 represents the fundamental principle of SPIM, which is more comprehensive U.S. Patent No. 7,554,725 is described, the disclosure of which is incorporated herein by reference. The order 10 includes a laser 20 , which by means of a lighting objective 25 a lens 30 generated for illuminating portions of a sample 40 , The lens 30 is along a lighting beam path 35 directed. A detection lens 65 is arranged such that the detection direction 55 essentially orthogonal to the plane of the lens 30 (ie perpendicular to the illumination beam path 35 ).

Die Probe 40 kann gedreht werden um eine Rotationsachse 45, und die Lichtscheibe 30 kann angeordnet werden zum Beleuchten von optischen Schnitten der Probe 40. Der Laser 20 regt typischerweise Fluorophore in der Probe 40 an zum Emittieren von fluoreszentem Licht in vielen Richtungen.The sample 40 can be rotated around a rotation axis 45 , and the lens 30 can be arranged to illuminate optical sections of the sample 40 , The laser 20 typically excites fluorophores in the sample 40 to emit fluorescent light in many directions.

Der Detektor 50 detektiert mittels eines Detektionsobjektivs 65 sowie einer optischen Anordnung 66 einen Teil des emittierten fluoreszenten Lichts von den Fluorophoren in der Probe 40, welche angeregt worden sind durch die Strahlung in der Lichtscheibe 30. Der Detektor 50 weist eine Abbildungsvorrichtung 60 auf, wie z. B. eine CCD-Kamera, welche verbunden ist an einen Prozessor 70 mit einem Speicher 80. Der Speicher 80 speichert die individuellen von jedem der optischen Schnitte der Probe 40, und der Prozessor 70 kann eine dreidimensionale Abbildung der Probe 40 erzeugen.The detector 50 detected by means of a detection lens 65 as well as an optical arrangement 66 a portion of the emitted fluorescent light from the fluorophores in the sample 40 , which have been excited by the radiation in the lens 30 , The detector 50 has an imaging device 60 on, such as B. a CCD camera, which is connected to a processor 70 with a memory 80 , The memory 80 saves the individual from each of the optical sections of the sample 40 , and the processor 70 can be a three-dimensional image of the sample 40 produce.

2 zeigt eine Ausführungsform der Mikroskopanordnung 200, wie verwendet in dieser Offenbarung. Identische Bezugszeichen werden verwendet zum Anzeigen identischer Elemente in 1 und 2. Es besteht kein Bedarf, die Probe 40 in dieser Offenbarung in Agarose einzubetten, da die Probe 40 ausreichend stabil im Apparat gehalten wird, wie im Folgenden erklärt wird. 2 shows an embodiment of the microscope assembly 200 as used in this disclosure. Identical reference numerals are used to indicate identical elements in FIG 1 and 2 , There is no need for the sample 40 embedded in agarose in this disclosure as the sample 40 is held sufficiently stable in the apparatus, as explained below.

Der Laser 20 erzeugt mittels von Spiegeln 67 und des Beleuchtungsobjektivs 25 eine Lichtscheibe 30 zum Beleuchten von Abschnitten der Probe 40. Die Lichtscheibe 30 tritt in die Probe 40 ein durch die untere Oberfläche der Probe 40. Ein großer Teil des von der Probe 40 emittierten fluoreszenten Lichts wird durch eine Detektionsobjektiv 65 geleitet, durch einen Spiegel 27 reflektiert, sowie mittels der optischen Anordnung 66 auf die Abbildungsvorrichtung 60 im Detektor 50 zum Ausformen einer Abbildung fokussiert. Die Abbildung wird vom Detektor 50 zum Prozessor 70 übertragen sowie daraufhin im Speicher 80 in der Form individueller Abbildungen gespeichert.The laser 20 generated by means of mirrors 67 and the illumination lens 25 a lens 30 for illuminating portions of the sample 40 , The lens 30 enters the sample 40 a through the lower surface of the sample 40 , A big part of the sample 40 emitted fluorescent light is transmitted through a detection lens 65 passed through a mirror 27 reflected, as well as by means of the optical arrangement 66 on the imaging device 60 in the detector 50 focused on forming an image. The picture is taken from the detector 50 to the processor 70 transferred and then in memory 80 stored in the form of individual pictures.

3 zeigt ein Beispiel des Mikroskopmoduls 300 mit einem Beleuchtungsobjektiv 210 sowie einem Detektionsobjektiv 220. Das Beleuchtungsobjektiv 210 beleuchtet mittels eines Beleuchtungsstrahls (Lichtscheibe) entlang eines Beleuchtungsstrahlpfads 215. Der Beleuchtungsstrahlpfad 215 durch das Beleuchtungsobjektiv 210 sowie der Detektionspfad 225 durch das Detektionsobjektiv 220 sind näherungsweise orthogonal zueinander angeordnet. Sowohl das Beleuchtungsobjektiv 210 als auch das Detektionsobjektiv 220 sind in einem Immersionsmedium 230 befindlich, welches typischerweise entgastes Wasser oder Immersionsöl umfasst. Ein Entgasen des Wassers stellt sicher, dass Blasen im Immersionsmedium 230 nicht vorhanden sind. 3 shows an example of the microscope module 300 with a lighting lens 210 as well as a detection lens 220 , The illumination lens 210 illuminated by means of an illumination beam (lens) along an illumination beam path 215 , The illumination beam path 215 through the illumination lens 210 as well as the detection path 225 through the detection lens 220 are arranged approximately orthogonal to each other. Both the illumination lens 210 as well as the detection lens 220 are in an immersion medium 230 which typically comprises degassed water or immersion oil. Degassing the water ensures bubbles in the immersion medium 230 are not available.

Der Beleuchtungsstrahlpfad 215 durch das Beleuchtungsobjektiv 210 ist befindlich unterhalb eines Probenhalters 240 bei näherungsweise 30° zur Ebene des Probenhalters 240. Der Detektionspfad 225 ist demnach befindlich bei näherungsweise 60° zur Ebene des Probenhalters 240. Flexible Kunststoffringe um das Beleuchtungsobjektiv 210 und das Detektionsobjektiv 220 verhindern bzw. hemmen ein Lecken des Immersionsmediums 230.The illumination beam path 215 through the illumination lens 210 is located below a sample holder 240 at approximately 30 ° to Level of the sample holder 240 , The detection path 225 is therefore located at approximately 60 ° to the plane of the sample holder 240 , Flexible plastic rings around the illumination lens 210 and the detection lens 220 Prevent or inhibit leakage of the immersion medium 230 ,

Der Probenhalter 240 mit Wänden 250 ist aus einem biokompatiblen Material hergestellt, wie, ohne hierauf beschränkt zu sein, z. B. PEEK, und weist einen Boden 260 auf, welcher aus einer dünnen transparenten Membran hergestellt ist, wie z. B. einem von Dupont hergestellten Teflon®-FEP-Film, aufweisend einen Brechungsindex, welcher im Wesentlichen ähnlich demjenigen des Immersionsmediums 230 und/oder des Kulturmediums 280 ist, zum Reduzieren von optischen Aberrationen. Die transparente Membran im Boden 260 erlaubt demnach den Durchtritt von Strahlung auf eine Probe 270, befindlich an der Oberseite der transparenten Membran 260. Die transparente Membran, welche den Boden 260 ausformt, ist befestigt an den Wänden 250 des Probenhalters 240 mittels eines biokompatiblen Silikonklebers oder mittels Klemmens. Die transparente Membran ist gekrümmt im Bereich, welcher nicht durch die Wände 250 gestützt ist, um die transparente Membran unter Spannung zu halten. Der Probenhalter 240 ist an der Oberseite offen, und die Öffnung ermöglicht einen einfachen Zugang zur sowie eine Entfernung der Probe 270, sofern erforderlich. Die transparente Membran ist plasmabehandelt, um sie hydrophil zu machen, und unterstützt demnach ein Verhindern einer Blasenbildung im Immersionsmedium.The sample holder 240 with walls 250 is made of a biocompatible material such as, but not limited to, e.g. B. PEEK, and has a bottom 260 on, which is made of a thin transparent membrane, such. A Teflon® FEP film made by Dupont, having a refractive index substantially similar to that of the immersion medium 230 and / or the culture medium 280 is to reduce optical aberrations. The transparent membrane in the ground 260 thus allows the passage of radiation to a sample 270 located at the top of the transparent membrane 260 , The transparent membrane covering the floor 260 forms, is attached to the walls 250 of the sample holder 240 using a biocompatible silicone adhesive or by means of clamps. The transparent membrane is curved in the area which does not pass through the walls 250 is supported to keep the transparent membrane under tension. The sample holder 240 is open at the top, and the opening allows easy access to and removal of the sample 270 , if necessary. The transparent membrane is plasma-treated to render it hydrophilic, and thus helps prevent blistering in the immersion medium.

Die Probe 270 ist befindlich im gekrümmten Bereich in der transparenten Membran in einem geeigneten Kulturmedium 280. Das Kulturmedium 280 ist ein Embryo- oder Gewebekulturmedium und kann eine Ölschicht auf dessen Oberfläche aufweisen zum Verhindern von Verdunstung. Der unterschiedliche Brechungsindex des Öls wird das Abbilden der Probe 270 nicht beeinträchtigen, da der Beleuchtungsstrahlpfad 215 und/oder der Detektionspfad 225 nicht durch das Öl hindurchtreten. Das Kulturmedium 280 kann ein sehr kleines Volumen aufweisen, wie z. B. 10 µl. Beispiele eines solchen Kulturmediums 280 schließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, KSOM, M16 (Mausembryo), DMEM und RPE (Zellkultur) ein. Es besteht kein Bedarf, die Probe 270 in einen Agarosezylinder (wie bekannt im Stand der Technik) einzubetten. Der Vorsprung bzw. die Auswölbung 290 kann länglich sein zum Ausformen eines Troges (s. 4).The sample 270 is located in the curved area in the transparent membrane in a suitable culture medium 280 , The culture medium 280 is an embryo or tissue culture medium and may have an oil layer on its surface to prevent evaporation. The different refractive index of the oil becomes the mapping of the sample 270 not affect, since the illumination beam path 215 and / or the detection path 225 do not pass through the oil. The culture medium 280 may have a very small volume, such as. B. 10 ul. Examples of such a culture medium 280 include, but are not limited to, KSOM, M16 (mouse embryo), DMEM and RPE (cell culture). There is no need for the sample 270 into an agarose cylinder (as known in the art). The projection or bulge 290 may be elongate for forming a trough (see FIG. 4 ).

Das Mikroskopmodul 300, gezeigt in 3, ermöglicht die Isolierung des Immersionsmediums 230 vom Kulturmedium 280. Es wird erkannt werden, dass dies ein Unterschied ist zur Anordnung 10 der 1, in welcher das Immersionsmedium dasselbe ist wie das wässrige Medium, welches die Probe 40 hält.The microscope module 300 , shown in 3 , allows the isolation of the immersion medium 230 from the culture medium 280 , It will be appreciated that this is a difference to the arrangement 10 of the 1 in which the immersion medium is the same as the aqueous medium containing the sample 40 holds.

Die Probe 270 kann auch einfach gehandhabt werden, da die Probe 270 zugänglich ist von der Oberseite durch das Kulturmedium 280. Eine Öffnung im Probenhalter 240 erlaubt einen Zugang zur Probe 270.The sample 270 can also be handled easily as the sample 270 is accessible from the top through the culture medium 280 , An opening in the sample holder 240 allows access to the sample 270 ,

Es wird erkannt werden von der Anordnung der 3, dass ausschließlich die unteren Oberflächen, einschließend eine bodenseitige Fläche sowie seitliche Flächen, der Probe 270 beleuchtet werden mittels der Strahlung vom Beleuchtungsobjektiv 210. In ähnlicher Weise wird das fluoreszente Licht von den unteren Oberflächen der Probe 270 gesammelt werden durch das Detektionsobjektiv 220 und so verwendet werden zum Erzeugen der im Speicher 80.It will be recognized by the arrangement of 3 in that only the lower surfaces, including a bottom surface and lateral surfaces, of the sample 270 be illuminated by the radiation from the illumination lens 210 , Similarly, the fluorescent light from the lower surfaces of the sample 270 be collected by the detection lens 220 and so used to generate the In the storage room 80 ,

Der Vorsprung bzw. die Auswölbung 290 kann in der Form eines länglichen Troges 295 vorliegen, wie gezeigt in 4. Dieser Aspekt der Erfindung erlaubt, mehrere der Proben 270 anzuordnen entlang des Troges und abgebildet zu werden unter Verwendung desselben Mikroskopmoduls 300. Eine solche Anordnung erlaubt ein Hochdurchsatz-Abbilden einer Vielzahl von Proben 270.The projection or the bulge 290 can be in the form of an elongated trough 295 present as shown in 4 , This aspect of the invention allows for multiple of the samples 270 to be arranged along the trough and to be imaged using the same microscope module 300 , Such an arrangement allows high throughput imaging of a plurality of samples 270 ,

Das Mikroskopmodul 300 ermöglicht langfristige Hochdurchsatz-Abbildungsexperimente von lebendigen Zellen und Embryos, z. B. von Säugetierembryos, sowie von in vitro abgebildeten Eizellen.The microscope module 300 allows long-term high-throughput imaging experiments of living cells and embryos, eg. B. of mammalian embryos, as well as in vitro imaged oocytes.

Ein Verfahren zum Ausführen langfristiger Hochdurchsatz-Abbildungsexperimente von lebendigen Zellen und Embryos kann ausgeführt werden durch das Mikroskopmodul 300. Das Verfahren umfasst ein Anordnen des Beleuchtungsobjektivs 210 derart, dass ein Beleuchtungsstrahl erzeugt wird zum Beleuchten der unteren Oberflächen der Vielzahl von Proben 270 entlang des Beleuchtungsstrahlpfads 215. Das Detektionsobjektiv 220 sammelt einen Teil des fluoreszenten Lichts, welches von der Vielzahl von Proben 270 emittiert wird. Das fluoreszente Licht wird in alle Richtungen emittiert, und fluoreszentes Licht in einem Bogen von näherungsweise 120° um den Detektionspfad 225 wird gesammelt werden. Das durch das Detektionsobjektiv 220 gesammelte fluoreszente Licht wird reflektiert mittels eines Spiegels 27 sowie auf die Abbildungsvorrichtung 60 im Detektor 50 fokussiert durch die optische Anordnung 66. Die Abbildungsvorrichtung 60 sendet an den Prozessor 70 Daten, betreffend die , und der Prozessor 70 ist fähig eines Erzeugens einer dreidimensionalen Abbildung einer oder mehrerer der Vielzahl von Proben 270.A method of performing long-term high-throughput imaging experiments on living cells and embryos can be performed by the microscope module 300 , The method comprises arranging the illumination objective 210 such that an illumination beam is generated to illuminate the lower surfaces of the plurality of samples 270 along the illumination beam path 215 , The detection lens 220 Collects a portion of the fluorescent light, which is from the large number of samples 270 is emitted. The fluorescent light is emitted in all directions, and fluorescent light in an arc of approximately 120 ° around the detection path 225 will be collected. That through the detection lens 220 collected fluorescent light is reflected by means of a mirror 27 as well as the imaging device 60 in the detector 50 focused by the optical arrangement 66 , The imaging device 60 sends to the processor 70 Data concerning the , and the processor 70 is capable of generating a three-dimensional image of one or more of the plurality of samples 270 ,

Es wird erkannt werden von 4, dass der längliche Trog 295 bewegt werden kann, derart dass das Detektionsobjektiv 220 und das Beleuchtungsobjektiv 210 den länglichen Trog 295 scannen bzw. abtasten zum Abbilden verschiedener der Vielzahl von Proben 270. Das Detektionsobjektiv 220 und das Beleuchtungsobjektiv 210 verbleiben fixiert an den optischen Tisch.It will be recognized by 4 that the elongated trough 295 can be moved, so that the detection lens 220 and the illumination lens 210 the elongated trough 295 scan for imaging various of the plurality of samples 270 , The detection lens 220 and the illumination lens 210 remain fixed to the optical table.

Das Kulturmedium 280 verbleibt ungestört durch entweder das Detektionsobjektiv oder das Beleuchtungsobjektiv und verbleibt steril, was langfristige Experimente erlaubt.The culture medium 280 remains undisturbed by either the detection lens or the illumination objective and remains sterile, allowing long-term experiments.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

1010: Anordnungarrangement
2020: Laserlaser
2525: Beleuchtungsobjektivlighting lens
2727: Spiegelmirror
3030: LichtscheibeLens
3535: BeleuchtungsstrahlpfadIllumination beam path
4040: Probesample
4545: Rotationsachseaxis of rotation
5050: Detektordetector
5555: Detektionsrichtungdetection direction
6060: Abbildungsvorrichtungimaging device
6565: Detektionsobjektivdetection objective
6666: Optische AnordnungOptical arrangement
6767: Spiegelmirror
7070: Prozessorprocessor
8080: SpeicherStorage
8585: Abbildungenpictures
200200: Mikroskopanordnungmicroscope arrangement
210210: Beleuchtungsobjektivlighting lens
215215: BeleuchtungsstrahlpfadIllumination beam path
220220: Detektionsobjektivdetection objective
225225: Detektionspfaddetection path
230230: ImmersionsmediumImmersion medium
240240: Probenhaltersample holder
250250: Wändewalls
260260: Bodenground
270270: Probesample
280280: Kulturmediumculture medium
290290: Vorsprunghead Start
295295: Trogtrough
300300: Mikroskopmodulmicroscope module

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

WO 2004/053558 [0003]
WO 2012/122027 [0004]
US 7554725 [0011]

Claims

A microscope module (300) for a microscope assembly (200) for imaging a sample (40, 270), the microscope assembly (200) comprising: a light source (20) for generating an illumination beam along an illumination beam path (215); and - a detector (50) for detecting emitted light along a detection path (225); wherein the microscope module (300) comprises: a sample holder (240) removably mounted in the microscope assembly (200) and adapted to hold the sample (40, 270) on an upper surface of the sample holder (240) and having one for the illumination beam and that of the sample (40, 270 ) emitted light transparent bottom (260); - at least one illumination objective (210) located below the sample holder (240) and arranged in the microscope assembly (200) for directing the illumination beam through the bottom (260) of the sample holder (240); and at least one detection objective (220) located below the sample holder (240) and arranged in the microscope assembly (200) for collecting the sample (40, 270) through the bottom (260) of the sample holder (240) along the detection path (225 ) emitted light; wherein the illumination objective (210) and the detection objective (220) are located in an immersion medium (230) which is in contact with the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240).

Microscope module (300) according to Claim 1 wherein the angle of the detection path (225) to the illumination beam path (215) is substantially orthogonal.

Microscope module (300) according to Claim 1 or 2 wherein a refractive index of the immersion medium (230) is substantially equal to a refractive index of the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240).

Microscope module (300) according to one of Claims 1 to 3 wherein the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240) is made of a membrane.

Microscope module (300) according to one of Claims 1 to 4 wherein the sample (40, 270) is in a culture medium (280).

Microscope module (300) according to Claim 5 wherein the culture medium (280) has a refractive index substantially similar to that of the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240).

Microscope module (300) one of Claims 1 to 6 wherein the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240) comprises a projection (290) in which the sample (40, 270) is held.

Microscope module (300) according to Claim 7 wherein the illumination beam is arranged to illuminate the sample (40) through a bottom of the projection (290).

Microscope module (300) according to Claim 7 or 8th wherein the projection (290) is elongate.

Microscope module (300) according to one of Claims 1 to 9 wherein the illumination beam path (215) is arranged at substantially 30 ° to the horizontal.

A microscope assembly (200) for imaging a sample (40, 270), the microscope assembly (200) comprising: at least one illumination objective (210); at least one detection object (220); - A light source (20) for generating an illumination beam along an illumination beam path (215) through the at least one illumination objective (210); - a detector (50) for detecting emitted light along a detection path (225) by the at least one detection element (220); in which: a sample holder (240) is removably arranged in the microscope assembly (200) and is suitable for holding the sample (40, 270) on an upper side of the sample holder (240) and having one for the illumination beam and the one for the sample (40, 270) emitted light transparent bottom (260), - The at least one illumination objective (210) is located below the sample holder (240) and arranged to guide the illumination beam through the bottom (260); - the at least one detection objective (220) is located below the sample holder (240) and arranged to collect the light emitted by the sample (40, 270) through the bottom (260) along the detection path (225); wherein the detection path (225) is substantially orthogonal to the illumination path (215), the illumination objective (210) and the detection objective (220) are located in an immersion medium (230) which is in contact with the at least partially transparent bottom ( 260) of the sample holder (240), and the refractive index of the immersion medium (230) similar to the refractive index of the at least one substantially partially transparent bottom (260) of the sample holder (240).

Microscope arrangement (200) according to Claim 11 , wherein the angle of the detection path (225) for Illumination beam path (215) is substantially orthogonal.

Microscope arrangement (200) according to Claim 11 or 12 wherein the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240) is made of a membrane attached to the walls (250) of the sample holder (240).

Microscope arrangement (200) according to one of Claims 11 to 13 further adapted so that the sample (40, 270) is in a culture medium (280).

Microscope arrangement (200) according to Claim 14 wherein the culture medium (280) has a refractive index which is similar to the refractive index of the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240) for reducing optical aberrations.

Microscope arrangement (200) one of Claims 11 to 15 wherein the at least partially transparent bottom (260) of the sample holder (240) comprises a projection (290) adapted to hold the sample (40, 270).

Microscope arrangement (200) according to Claim 16 wherein the illuminating beam is arranged to direct the illuminating beam through a bottom of the projection (290).

Microscope arrangement (200) according to Claim 17 wherein the projection (290) is elongate.

Microscope arrangement (200) according to one of Claims 11 to 18 wherein the illumination beam path is arranged at substantially 30 ° to the horizontal.