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DE212020000516U1 - CRISPR-CAS-Effektorpolypeptide - Google Patents

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DE212020000516U1
DE212020000516U1 DE212020000516.8U DE212020000516U DE212020000516U1 DE 212020000516 U1 DE212020000516 U1 DE 212020000516U1 DE 212020000516 U DE212020000516 U DE 212020000516U DE 212020000516 U1 DE212020000516 U1 DE 212020000516U1
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Abstract

Zusammensetzung, die Folgendes umfasst:a) eine Nuklease, die eine einzelne RuvC-aktive Stelle umfasst, die sowohl ein DNA-Molekül spalten als auch crRNA binden kann; undb) eine Führungs-RNA.

Description

  • QUERVERWEIS
  • Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/815,173 , eingereicht am 7. März 2019, der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/855,739 , eingereicht am 31. Mai 2019, der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/907,422 , eingereicht am 27. September 2019, und der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/948,470 , eingereicht am 16. Dezember 2019, von denen jede Anmeldung in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist.
  • EINLEITUNG
  • CRISPR-Cas-Systeme enthalten Cas-Proteine, die an der Akquisition, dem Targeting und der Spaltung von fremder DNA oder RNA beteiligt sind, und eine Guide-RNA(s), die ein Segment, das Cas-Proteine bindet, und ein Segment, das an eine Target-Nukleinsäure bindet, enthält. Beispielsweise umfassen CRISPR-Cas-Systeme der Klasse 2 ein einzelnes Cas-Protein, das an eine Guide-RNA gebunden ist, wobei das Cas-Protein an eine Target-Nukleinsäure bindet und diese spaltet. Die Programmierbarkeit dieser Systeme hat ihre Verwendung als vielseitige Technologie zur Modifizierung der Target-Nukleinsäure erleichtert.
  • KURZDLARSTELLUNG
  • Die vorliegende Offenbarung stellt RNA-geleitete CRISPR-Cas-Effektorproteine, Nukleinsäuren, die dieselben codieren, und Zusammensetzungen, die dieselben umfassen, bereit. Die vorliegende Offenbarung stellt Ribonukleoproteinkomplexe bereit, umfassend: ein RNA-geleitetes CRISPR-Cas-Effektorprotein der vorliegenden Offenbarung; und eine Guide-RNA. Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure unter Verwendung eines RNA-geleiteten CRISPR-Cas-Effektorproteins der vorliegenden Offenbarung und einer Guide-RNA bereit. Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zum Modulieren der Transkription einer Target-Nukleinsäure bereit.
  • Figurenliste
    • 1A zeigt die Größenverteilung vollständiger Bakteriophagengenome aus dieser Studie, Lak-Phagen, die kürzlich aus einer Untergruppe derselben Proben berichtet wurden, und Referenzquellen (alle dsDNA-Genome aus RefSeq v92 und nichtartefaktuelle Assemblies >200 kb von (Paez-Espino et al. (2016) Nature 536: 425).
    • 1B zeigt ein Histogramm der Genomgrößenverteilung von Phagen mit Genomen >200 kb aus dieser Studie, Lak und Referenzgenome. Box- und Whisker-Diagramme der tRNA-Zählungen pro Genom als Funktion der Genomgröße.
    • 2 zeigt einen phylogenetischen Baum, der unter Verwendung von Terminasesequenzen aus riesigen Phagengenomen dieser Studie und verwandten Datenbanksequenzen konstruiert wurde. Farbige Regionen des Baumes weisen auf große Phagenkladen hin, die alle riesige Genome aufweisen.
    • 3 zeigt ein Modell dafür, wie Phagen-codierte Kapazitäten das Translationssystem des Wirts umleiten könnten, um Phagenproteine zu produzieren. Kein großer Phage weist alle diese Gene auf, aber viele weisen tRNA (Kleeblattformen) und tRNA-Synthetasen (aaRS) auf. Phagenproteine mit bis zu 6 ribosomalen Protein-S1-Domänen kommen in einigen wenigen Genomen vor. Das S1 bindet mRNA, um es an die Stelle auf dem Ribosom zu bringen, wo sie decodiert wird. Das ribosomale Protein S21 (S21) könnte selektiv die Translation von Phagen-mRNA initiieren, und viele Sequenzen weisen N-terminale Verlängerungen auf, die an der Bindung von RNA beteiligt sein können (gestrichelte Linie im Ribosomeninsert, die auf PDB-Code 6bu8 und pmid: 29247757 für Ribosom und S1-Strukturmodell basiert). Einige Phagen weisen Initiationsfaktoren (IF) und Elongationsfaktor G (EF G) auf und andere weisen rpL7/L12 auf, was eine effiziente Ribosomenbindung vermitteln könnte. Abkürzung: RNA pol, RNA Polymerase.
    • 4A zeigt eine Bakterium-Phagen-Wechselwirkung, die ein CRISPR-Targeting beinhaltet (Zelldiagramm).
    • 4B zeigt das Interaktionsnetzwerk, das das Targeting von bakteriellen (von oben nach unten: SEQ ID NO: 163-164) und phagencodierten (von oben nach unten: SEQ ID NO: 163-164) CRISPR-Spacern zeigt.
    • 5 zeigt Ökosysteme mit Phagen und einige Plasmide mit >200 kbp-Genomen, gruppiert nach Typ der Probenahmestelle. Jede Box stellt ein Phagengenom dar, und die Boxen sind in der Reihenfolge abnehmender Genomgröße angeordnet; der Größenbereich für jeden Typ von Stelle ist rechts aufgeführt. Die Farben zeigen das mutmaßliche Wirtsphylum basierend auf dem phylogenetischen Profil des Genoms an, wobei dies durch CRISPR-Targeting (X) oder phylogenetische Analysen des Informationssystemgens (T) bestätigt wird.
    • 6A-6R stellen Aminosäuresequenzen von Beispielen von Cas12J-Polypeptiden der vorliegenden Offenbarung bereit.
    • 7 liefert Nukleotidsequenzen von Teilen konstanter Region von Cas12J-Guide-RNA (dargestellt als die für die RNA codierende DNA). Fettgedruckte Sequenzen sind die verwendete und/oder aus den Arbeitsbeispielen extrapolierte Ausrichtung (siehe z. B. die in Beispiel 3 verwendeten crRNA-Sequenzen‘). Durch ein „oder“ getrennte Sequenzen sind das reverse Komplement voneinander.
    • 8 zeigt Konsensussequenzen für Cas12J-Guide-RNA.
    • 9 stellt die Positionen von Aminosäuren in RuvC-I-, RuvC-II- und RuvC-III-Domänen von Cas12J-Polypeptiden bereit, die, wenn sie substituiert sind, zu einem Cas12J-Polypeptid führen, das eine Target-Nukleinsäure in der von einer Cas12J-Guide-RNA bindet, aber nicht spaltet.
    • 10 stellt einen Baum bereit, der verschiedene CRISPR-Cas-Effektorproteinfamilien zeigt.
    • 11A-11C zeigen die Effizienz des Transformationsplasmidinterferenzassays.
    • 12A-12B zeigen eine Demonstration, dass Cas12J (z. B. Cas12J-1947455, Cas12J-2071242 und Cas12J-3339380) lineare dsDNA-Fragmente, die von einer crRNA-Spacersequenz geleitet werden, spalten können.
    • 13 zeigt Ergebnisse, die die Aufklärung von PAM-Sequenzen zeigen.
    • 14A-14C veranschaulichen Ergebnisse aus dem Mapping von RNA-Sequenzen auf die Cas12J-CRISPR-Loci von pBAS::Cas12J-1947455, pBAS::Cas12J-2071242 und pBAS::Cas12J-3339380.
    • 15 zeigt die Cas12j-2- und Cas12j-3-vermittelte Gen-Editierung in menschlichen Zellen.
    • 16A-16B stellen Karten der Konstrukte pCas12J-3-hs (16A) und pCas12J-2-hs (16B) bereit.
    • 17A-17G legen Tabelle 1 dar, die Nukleotidsequenzen der Konstrukte pCas12J-2-hs und pCas12J-3-hs bereitstellt (von oben nach unten: SEQ ID NO: 161-162).
    • 18 zeigt die trans-Spaltung von ssDNA durch Cas12J, das durch Bindung an DNA aktiviert wird.
    • 19A-19F zeigen Daten, die zeigen, dass Cas12J (CasΦ) ein Bona-fide-CRISPR-Cas-System ist.
    • 20 zeigt einen phylogenetischen Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit der Typ-V-Subtypen a-k.
    • 21A-21B zeigen eine crRNA-Wiederholungsähnlichkeit (21A) zwischen verschiedenen Cas12J-crRNA und eine Cas12J-Aminosäuresequenzidentität (21B) zwischen verschiedenen Cas12J-Proteinen.
    • 22A-22C zeigen den CasΦ-3-vermittelten Schutz gegen Plasmidtransformation.
    • 23A-23D zeigen die Spaltung von DNA durch CasΦ.
    • 24A-24D zeigen die Reinigung von Apo CasΦ (CasΦ-Protein ohne Guide-RNA).
    • 25A-25C zeigen die Herstellung von versetzten Schnitten durch CasΦ.
    • 26A-26B zeigen die CasΦ-vermittelte Spaltung von dsDNA und ssDNA.
    • 27A-27B zeigen die Ergebnisse eines Spaltungsassays, bei dem die Target-Strang (TS)- und Nicht-Target-Strang (NTS)-Spaltungseffizienz durch CasΦ verglichen wurde.
    • 28A-28B zeigen Daten, die zeigen, dass CasΦ ssDNA, aber nicht RNA, bei Aktivierung in cis in trans spaltet.
    • 29A-29D zeigen die Prozessierung von prä-crRNA durch CasΦ innerhalb der aktiven Zentrums von RuvC.
    • 30A-30C zeigen die Prozessierung von prä-crRNA durch CasΦ-1 und durch CasΦ-2.
    • 31A-31B zeigen die Bildung von Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexen mit: a) prä-crRNA
    • 32A-32C zeigen eine durch CasΦ vermittelte Störung des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) in HEK293-Zellen.
    • 33A-33B zeigen Daten, die das CasΦ-vermittelte Genom-Editing in menschlichen Zellen zeigen.
    • 34 zeigt Tabelle 3, die eine Beschreibung einiger der in Beispiel 7 verwendeten Plasmide bereitstellt.
    • 35 zeigt Tabelle 4, die Guide-Sequenzen für in Beispiel 7 beschriebene Experimente bereitstellt.
    • 36 zeigt Tabelle 5, die Substratsequenzen für in Beispiel 7 beschriebene In-vitro-Experimente bereitstellt.
    • 37 zeigt Tabelle 6, die crRNA-Sequenzen für in Beispiel 7 beschriebene In-vitro-Experimente bereitstellt.
  • BEGRIFFSBESTIMMUNGEN
  • Die hierin synonym verwendeten Ausdrücke „Polynukleotid“ und „Nukleinsäure“ beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jeder beliebigen Länge, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide. Somit umfasst dieser Ausdruck unter anderem einzel-, doppel- oder mehrsträngige DNA oder RNA, genomische DNA, cDNA, DNA-RNA-Hybride oder ein Polymer, das Purin- und Pyrimidinbasen oder andere natürliche, chemisch oder biochemisch modifizierte Verbindungen, nicht natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen umfasst.
  • Mit „hybridisierbar“ oder „komplementär“ oder „im Wesentlichen komplementär“ ist gemeint, dass eine Nukleinsäure (z. B. RNA, DNA) eine Sequenz von Nukleotiden umfasst, die es ihr ermöglicht, nicht kovalent mit einer anderen Nukleinsäure in einer sequenzspezifischen, antiparallelen Weise (d. h. eine Nukleinsäure bindet spezifisch an eine komplementäre Nukleinsäure) unter den geeigneten In-vitro- und/oder In-vivo-Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke der Lösung zu binden, d. h. Watson-Crick-Basenpaare und/oder G/U-Basenpaare zu bilden, „zu annelieren“ oder „zu hybridisieren“. Die Standard-Watson-Crick-Basenpaarung umfasst: Adenin (A)-Paarung mit Thymidin (T), Adenin (A)-Paarung mit Uracil (U) und Guanin (G)-Paarung mit Cytosin (C) [DNA, RNA]. Zusätzlich zur Hybridisierung zwischen zwei RNA-Molekülen (z. B. dsRNA) und zur Hybridisierung eines DNA-Moleküls mit einem RNA-Molekül (z. B. wenn sich eine DNA-Target-Nukleinsäurebase mit einer Guide-RNA usw. paart): Guanin (G) kann auch mit Uracil (U) Basenpaarung bilden. Beispielsweise ist die G/U-Basenpaarung mindestens teilweise für die Entartung (d. h. Redundanz) des genetischen Codes im Zusammenhang mit der tRNA-Anti-Codon-Basenpaarung mit Codons in mRNA verantwortlich. Im Zusammenhang mit dieser Offenbarung wird daher ein Guanin (G) (z. B. eines dsRNA-Duplex eines Guide-RNA-Moleküls; einer Guide-RNA-Basenpaarung mit einer Target-Nukleinsäure usw.) als komplementär sowohl zu einem Uracil (U) als auch zu einem Adenin (A) erachtet. Wenn beispielsweise ein G/U-Basenpaar an einer gegebenen Nukleotidposition eines dsRNA-Duplex eines Guide-RNA-Moleküls hergestellt werden kann, wird die Position wird nicht als nicht komplementär, sondern als komplementär erachtet.
  • Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind bekannt und beispielhaft dargelegt in Sambrook, J., Fritsch, EF und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), insbesondere Kapitel 11 und Tabelle 11.1 darin; und Sambrook, J. und Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Die Bedingungen von Temperatur und der Ionenstärke bestimmen die „Stringenz“ der Hybridisierung.
  • Hybridisierung erfordert, dass die zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die Bedingungen, die für die Hybridisierung zwischen zwei Nukleinsäuren geeignet sind, hängen von der Länge der Nukleinsäuren und dem Grad der Komplementarität ab, Variablen, die in dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Je stärker der Grad der Komplementarität zwischen zwei Nukleinsäuren, desto größer ist der Wert der Schmelztemperatur (Tm) für Hybride von Nukleinsäuren, die diese Sequenzen aufweisen. Für Hybridisierungen zwischen Nukleinsäuren mit kurzen Komplementaritätsabschnitten (z. B. Komplementarität über 35 oder weniger, 30 oder weniger, 25 oder weniger, 22 oder weniger, 20 oder weniger, oder 18 oder weniger Nukleotiden) kann die Position von Fehlpaarungen wichtig werden (siehe Sambrook et al., oben, 11.7-11.8). Typischerweise beträgt die Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure 8 Nukleotide oder mehr (z. B. 10 Nukleotide oder mehr, 12 Nukleotide oder mehr, 15 Nukleotide oder mehr, 20 Nukleotide oder mehr, 22 Nukleotide oder mehr, 25 Nukleotide oder mehr oder 30 Nukleotide oder mehr). Die Temperatur, die Salzkonzentration der Waschlösung und andere Bedingungen können nach Bedarf gemäß Faktoren wie etwa der Länge der Komplementationsregion und dem Komplementationsgrad eingestellt werden.
  • Es versteht sich, dass die Sequenz eines Polynukleotids nicht 100 % komplementär zu der seiner Target-Nukleinsäure sein muss, um spezifisch hybridisierbar oder hybridisierbar zu sein. Zudem kann ein Polynukleotid über ein oder mehrere Segmente hybridisieren, sodass dazwischenliegende oder angrenzende Segmente nicht an dem Hybridisierungsereignis beteiligt sind (z. B. eine Ausbuchtung, eine Schleifenstruktur oder eine Haarnadelstruktur usw.). Ein Polynukleotid kann 60 % oder mehr, 65 % oder mehr, 70 % oder mehr, 75 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr, 99,5 % oder mehr oder 100 % Sequenzkomplementarität zu einer Target-Region innerhalb der Target-Nukleinsäuresequenz, mit der es hybridisieren wird, umfassen. Beispielsweise würde eine Antisense-Nukleinsäure, in der 18 von 20 Nukleotiden der Antisense-Verbindung zu einer Target-Region komplementär sind und daher spezifisch hybridisieren würden, eine 90-prozentige Komplementarität darstellen. In diesem Beispiel können die verbleibenden nicht komplementären Nukleotide geclustert oder mit komplementären Nukleotiden durchsetzt sein und müssen nicht aneinander oder an komplementäre Nukleotide angrenzen. Die prozentuale Komplementarität zwischen bestimmten Abschnitten von Nukleinsäuresequenzen innerhalb von Nukleinsäuren kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens bestimmt werden. Beispielverfahren umfassen BLAST-Programme (Basic Local Alignment Search Tools - grundlegende lokale Alignment-Suchwerkzeuge) und PowerBLAST-Programme (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang und Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656), das Gap-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), z. B. unter Verwendung von Standardeinstellungen, das den Algorithmus von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489) verwendet, und dergleichen.
  • Die Ausdrücke „Peptid“, „Polypeptid“ und „Protein“ werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Polymerform von Aminosäuren einer beliebigen Länge, zu welchen codierte und nicht codierte Aminosäuren, chemisch oder biochemisch modifizierte oder derivatisierte Aminosäuren und Polypeptide mit modifizierten Peptidrückgraten gehören können.
  • „Bindung“, wie hierin verwendet (z. B. unter Bezugnahme auf eine RNA-Bindungsdomäne eines Polypeptids, Bindung an eine Target-Nukleinsäure und dergleichen), bezieht sich auf eine nichtkovalente Wechselwirkung zwischen Makromolekülen (z. B. zwischen einem Protein und einer Nukleinsäure); zwischen einem Cas12J-Polypeptid/Guide-RNA-Komplex und eine Target-Nukleinsäure; und dergleichen). In einem Zustand nichtkovalenter Wechselwirkung werden die Makromoleküle als „assoziiert“ oder „wechselwirkend“ oder „bindend“ bezeichnet (z. B. wenn ein Molekül X mit einem Molekül Y wechselwirken soll, bedeutet dies, dass das Molekül X an Molekül Y auf eine nichtkovalente Weise bindet). Nicht alle Komponenten einer Bindungswechselwirkung müssen sequenzspezifisch sein (z. B. Kontakte mit Phosphatresten in einem DNA-Rückgrat), aber einige Teile einer Bindungswechselwirkung können sequenzspezifisch sein. Bindungswechselwirkungen sind in der Regel durch eine Dissoziationskonstante (KD) von weniger als 10-6 M, weniger als 10-7 M, weniger als 10-8 M, weniger als 10-9 M, weniger als 10-10 M, weniger als 10-11 M, weniger als 10-12 M, weniger als 10-13 M, weniger als 10-14 M oder weniger als 10-15 M gekennzeichnet. „Affinität“ bezieht sich auf die Bindungsstärke, wobei eine erhöhte Bindungsaffinität mit einem niedrigeren KD korreliert.
  • „Bindungsdomäne“ steht für eine Proteindomäne, die in der Lage ist, nichtkovalent an ein anderes Molekül zu binden. Eine Bindungsdomäne kann beispielsweise an ein DNA-Molekül (eine DNA-Bindungsdomäne), ein RNA-Molekül (eine RNA-Bindungsdomäne) und/oder ein Proteinmolekül (eine Proteinbindungsdomäne) binden. Im Fall eines Proteins mit einer Proteinbindungsdomäne kann es in einigen Fällen an sich selbst binden (um Homodimere, Homotrimere usw. zu bilden) und/oder es kann an eine oder mehrere Regionen eines oder mehrerer anderer Proteine binden.
  • Der Ausdruck „konservative Aminosäuresubstitution“ bezieht sich auf die Austauschbarkeit von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten in Proteinen. Beispielsweise besteht eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Hydroxylseitenketten besteht aus Serin und Threonin; eine Gruppe von Aminosäuren mit Amid enthaltenden Seitenketten, bestehend aus Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten besteht aus Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäuren mit basischen Seitenketten besteht aus Lysin, Arginin und Histidin; eine Gruppe von Aminosäuren mit sauren Seitenketten besteht aus Glutamat und Aspartat; und eine Gruppe von Aminosäuren mit schwefelhaltigen Seitenketten besteht aus Cystein und Methionin. Beispielhafte konservative Aminosäuresubstitutionsgruppen sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin-Glycin und Asparagin-Glutamin.
  • Ein Polynukleotid oder Polypeptid hat eine bestimmte prozentuale „Sequenzidentität“ zu einem anderen Polynukleotid oder Polypeptid, was bedeutet, dass, wenn aligniert, der Prozentsatz der Basen oder Aminosäuren beim Vergleich der beiden Sequenzen gleich und in derselben relativen Position ist. Die Sequenzidentität kann auf verschiedene Arten bestimmt werden. Um die Sequenzidentität zu bestimmen, können Sequenzen unter Verwendung verschiedener praktischer Verfahren und Computerprogramme (z. B. BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT usw.), die über das World Wide Web unter anderem auf Websites wie ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/ verfügbar sind, aligniert werden. Siehe z. B. Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10.
  • Eine DNA-Sequenz, die eine bestimmte RNA „codiert“, ist eine DNA-Nukleotidsequenz, die in RNA transkribiert wird. Ein DNA-Polynukleotid kann eine RNA (mRNA) codieren, die in Protein translatiert wird (und daher codieren sowohl die DNA als auch die mRNA das Protein), oder ein DNA-Polynukleotid kann eine RNA codieren, die nicht in Protein translatiert wird (z. B. tRNA, rRNA, microRNA (miRNA), eine „nicht-codierende“ RNA (ncRNA), eine Guide-RNA usw.).
  • Eine „Proteincodierungssequenz“ oder eine Sequenz, die ein bestimmtes Protein oder Polypeptid codiert, ist eine Nukleotidsequenz, die in mRNA (im Fall von DNA) transkribiert und (im Fall von mRNA) in vitro oder in vivo in ein Polypeptid translatiert wird, wenn es unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird.
  • Die Ausdrücke „DNA-Regulationssequenzen“, „Kontrollelemente“ und „Regulationselemente“, die hierin austauschbar verwendet werden, beziehen sich auf Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen, wie etwa Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren, Proteinabbausignale und dergleichen, die die Transkription einer nichtcodierenden Sequenz (z. B. Guide-RNA) oder einer codierenden Sequenz (z. B. RNA-geleitete Endonuklease, GeoCas9-Polypeptid, GeoCas9-Fusionspolypeptid und dergleichen) vorsehen und/oder regulieren und/oder die Translation eines codierten Polypeptids regulieren.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „Promotor“ oder eine „Promotorsequenz“ eine regulatorische DNA-Region, die zur Bindung von RNA-Polymerase und Einleiten der Transkription einer strangabwärts liegenden (3'-Richtung) Codierungs- oder Nicht-Codierungssequenz in der Lage ist. Zum Zwecke der vorliegenden Offenbarung wird die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung) so, dass sie die Mindestanzahl von Basen oder Elementen enthält, die zum Einleiten einer Transkription in Graden, die gegenüber dem Hintergrund nachweisbar sind, erforderlich ist. Innerhalb der Promotorsequenz befinden sich eine Transkriptionsinitiationsstelle sowie Proteinbindungsdomänen, die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten oftmals, aber nicht immer, „TATA“-Boxen und „CAT“-Boxen. Verschiedene Promotoren, einschließlich induzierbarer Promotoren, können dazu verwendet werden, die Expression durch die verschiedenen Vektoren der vorliegenden Offenbarung zu steuern.
  • Der Ausdruck „natürlich vorkommend“ oder „unmodifiziert“ oder „Wildtyp“, wie hierin in Bezug auf eine Nukleinsäure, ein Polypeptid, eine Zelle oder einen Organismus verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, ein Polypeptid, eine Zelle oder einen Organismus, der/die/das in der Natur gefunden wird. Beispielsweise kommt eine Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus vorhanden ist, der aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann, natürlich vor.
  • Der Ausdruck „Fusion“, wie hierin in Bezug auf eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid verwendet, bezieht sich auf zwei Komponenten, die durch Strukturen definiert sind, die aus verschiedenen Quellen stammen. Wenn beispielsweise „Fusion“ im Zusammenhang mit einem Fusionspolypeptid (z. B. einem Cas12J-Fusionsprotein) verwendet wird, umfasst das Fusionspolypeptid Aminosäuresequenzen, die von verschiedenen Polypeptiden abgeleitet sind. Ein Fusionspolypeptid kann entweder modifizierte oder natürlich vorkommende Polypeptidsequenzen umfassen (z. B. eine erste Aminosäuresequenz aus einem modifizierten oder unmodifizierten Cas12J-Protein und eine zweite Aminosäuresequenz aus einem anderen modifizierten oder unmodifizierten Protein als einem Cas12J-Protein usw.). In ähnlicher Weise umfasst „Fusion“ im Zusammenhang mit einem Polynukleotid, das ein Fusionspolypeptid codiert, Nukleotidsequenzen, die von verschiedenen codierenden Regionen abgeleitet sind (z. B. eine erste Nukleotidsequenz, die ein modifiziertes oder unmodifiziertes Cas12J-Protein codiert, und eine zweite Nukleotidsequenz, die ein anderes Polypeptid als ein Cas12J-Protein codiert).
  • Der Ausdruck „Fusionspolypeptid“ bezieht sich auf ein Polypeptid, das durch die Kombination (d. h. „Fusion“) von zwei ansonsten getrennten Segmenten der Aminosäuresequenz hergestellt wird, üblicherweise durch menschliches Eingreifen.
  • „Heterolog“, wie hierin verwendet, steht für eine Nukleotid- oder Polypeptidsequenz, die nicht in der nativen Nukleinsäure bzw. dem nativen Protein gefunden wird. Beispielsweise kann in einigen Fällen in einem varianten Cas12J-Protein der vorliegenden Offenbarung ein Teil des natürlich vorkommenden Cas12J-Polypeptids (oder einer Variante davon) an ein heterologes Polypeptid (d. h. eine Aminosäuresequenz aus einem anderen Protein als einem Cas12J-Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz eines anderen Organismus) kondensiert werden. Als ein anderes Beispiel kann ein Cas12J-Fusionspolypeptid die Gesamtheit oder einen Teil eines natürlich vorkommenden Cas12J-Polypeptids (oder einer Variante davon) umfassen, das an ein heterologes Polypeptid kondensiert ist, d. h. ein Polypeptid aus einem anderen Protein als einem Cas12J-Polypeptid oder ein Polypeptid aus einem anderen Organismus. Das heterologe Polypeptid kann eine Aktivität (z. B. enzymatische Aktivität) aufweisen, die auch von dem varianten Cas 12J-Protein oder dem Cas12J-Fusionsprotein (z. B. Biotinligaseaktivität; Kernlokalisierung usw.) gezeigt wird. Eine heterologe Nukleinsäuresequenz kann mit einer natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenz (oder einer Variante davon) (z. B. durch Gentechnik) verknüpft werden, um eine Nukleotidsequenz zu erzeugen, die ein Fusionspolypeptid (ein Fusionsprotein) codiert.
  • „Rekombinant“, wie hierin verwendet, bedeutet, dass eine bestimmte Nukleinsäure (DNA oder RNA) das Produkt verschiedener Kombinationen von Klonierung, Restriktion, Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Ligationsschritten ist, die zu einem Konstrukt mit einer strukturellen oder nicht codierenden Sequenz führen, die von endogenen Nukleinsäuren in natürlichen Systemen unterscheidbar ist. DNA-Sequenzen, die Polypeptide codieren, können aus cDNA-Fragmenten oder aus einer Reihe synthetischer Oligonukleotide assembliert werden, um eine synthetische Nukleinsäure bereitzustellen, die aus einer in einer Zelle enthaltenen rekombinanten Transkriptionseinheit oder in einem zellfreien Transkriptions- und Translationssystem exprimiert werden kann. Genomische DNA, die die relevanten Sequenzen umfasst, kann auch zur Bildung eines rekombinanten Gens oder einer Transkriptionseinheit verwendet werden. Sequenzen nicht translatierter DNA können 5 ‚oder 3‘ von dem offenen Leserahmen entfernt vorhanden sein, wobei solche Sequenzen die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen nicht stören und tatsächlich dazu dienen, die Produktion eines gewünschten Produkts durch verschiedene Mechanismen zu modulieren (siehe „regulatorische DNA-Sequenzen“).
  • Alternativ können DNA-Sequenzen, die für RNA codieren (z. B. Guide-RNA), die nicht translatiert ist, auch als rekombinant angesehen werden. So bezieht sich beispielsweise der Ausdruck „rekombinante“ Nukleinsäure auf eine, die nicht natürlich vorkommt, z. B. durch künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Sequenzsegmenten durch menschliches Eingreifen. Diese künstliche Kombination wird häufig entweder durch chemische Synthesemittel oder durch künstliche Manipulation isolierter Segmente von Nukleinsäuren erreicht, z. B. durch Gentechnik. Dies wird normalerweise durchgeführt, um ein Codon durch ein Codon, das dieselbe Aminosäure codiert, eine konservative Aminosäure oder eine nicht konservative Aminosäure zu ersetzen. Alternativ wird dies durchgeführt, um Nukleinsäuresegmente gewünschter Funktionen zusammenzufügen, um eine gewünschte Kombination von Funktionen zu erzeugen. Diese künstliche Kombination wird häufig entweder durch chemische Synthesemittel oder durch künstliche Manipulation isolierter Segmente von Nukleinsäuren erreicht, z. B. durch Gentechnik. Wenn ein rekombinantes Polynukleotid ein Polypeptid codiert, kann die Sequenz des codierten Polypeptids natürlich vorkommen („Wildtyp“) oder eine Variante (z. B. eine Mutante) der natürlich vorkommenden Sequenz sein. Ein Beispiel für einen solchen Fall ist eine DNA (eine rekombinante), die ein Wildtyp-Protein codiert, wobei die DNA-Sequenz für die Expression des Proteins in einer Zelle (z. B. einer eukaryotischen Zelle), in der das Protein nicht natürlich gefunden wird, codonoptimiert ist (z. B. Expression eines CRISPR/Cas-RNA-geleiteten Polypeptids wie etwa Cas12J (z. B. Wildtyp-Cas12J; variantes Cas12J; Fusions-Cas12J usw.) in einer eukaryotischen Zelle). Eine codonoptimierte DNA kann daher rekombinant sein und nicht natürlich vorkommen, während das von der DNA codierte Protein eine Wildtyp-Aminosäuresequenz aufweisen kann.
  • Somit bezieht sich der Ausdruck „rekombinantes“ Polypeptid nicht notwendigerweise auf ein Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz nicht natürlich vorkommt. Stattdessen wird ein „rekombinantes“ Polypeptid von einer rekombinanten, nicht natürlich vorkommenden DNA-Sequenz codiert, aber die Aminosäuresequenz des Polypeptids kann natürlich vorkommend („Wildtyp“) oder nicht natürlich vorkommend (z. B. eine Variante, eine Mutante usw.) sein. Somit ist ein „rekombinantes“ Polypeptid das Ergebnis eines menschlichen Eingreifens, kann jedoch eine natürlich vorkommende Aminosäuresequenz aufweisen.
  • Ein „Vektor“ oder ein „Expressionsvektor“ ist ein Replikon, wie z. B. ein Plasmid, Phage, Virus, künstliches Chromosom oder Cosmid, an das sich ein anderes DNA-Segment, d. h. ein „Insert“, anlagern kann, sodass die Replikation des angelagerten Segments in einer Zelle ausgelöst wird.
  • Eine „Expressionskassette“ umfasst eine DNA-Codierungssequenz, die mit einem Promotor wirkverbunden ist. „Wirkverbunden“ bezieht sich auf eine Juxtaposition, wobei sich die derart beschriebenen Komponenten in einer Beziehung befinden, die es ihnen erlaubt, auf deren beabsichtigte Weise zu funktionieren. Beispielsweise ist ein Promotor mit einer codierenden Sequenz wirkverbunden (oder die codierende Sequenz kann auch als mit dem Promotor wirkverbunden bezeichnet werden), wenn der Promotor ihre Transkription oder Expression beeinflusst.
  • Die Ausdrücke „rekombinanter Expressionsvektor“ oder „DNA-Konstrukt“ werden hierin austauschbar verwendet, um sich auf ein DNA-Molekül zu beziehen, das einen Vektor und ein Insert umfasst. Rekombinante Expressionsvektoren werden üblicherweise zum Zweck der Expression und/oder Verbreitung des/der Inserts oder zur Konstruktion anderer rekombinanter Nukleotidsequenzen erzeugt. Das Insert/die Inserts kann/können mit einer Promotorsequenz wirkverbunden sein oder nicht und kann/können mit DNA-Regulationssequenzen wirkverbunden sein oder nicht.
  • Eine Zelle wurde durch exogene DNA oder exogene RNA, z. B. einen rekombinanten Expressionsvektor, „genetisch modifiziert“ oder „transformiert“ oder „transfiziert“, wenn diese DNA in die Zelle eingebracht wurde. Das Vorhandensein der exogenen DNA führt zu einer dauerhaften oder vorübergehenden genetischen Veränderung. Die transformierende DNA kann in das Genom der Zelle eingebaut (kovalent damit verknüpft) sein oder nicht. Bei Prokaryoten, Hefe und Säugerzellen z. B. kann die transformierende DNA auf einem episomalen Element, wie z. B. einem Plasmid, vorliegen. In Bezug auf eukaryotische Zellen ist eine stabil transformierte eine, in der die transformierende DNA in ein Chromosom eingebaut wurde, sodass sie an Tochterzellen durch Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität zeigt sich durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle, Zelllinien oder Klone zu schaffen, die aus einer Population von Tochterzellen bestehen, welche die transformierende DNA enthalten. Ein „Klon“ ist eine Population von Zellen, die aus einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahren durch Mitose abgeleitet wird. Eine „Zelllinie“ ist ein Klon einer primären Zelle, die dazu imstande ist, in vitro über viele Generationen stabil zu wachsen.
  • Geeignete Verfahren zur genetischen Modifikation (auch als „Transformation“ bezeichnet) enthalten z. B. Virus- oder Bakteriophageninfektion, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Lipofektion, Elektroporation, Calciumphosphatfällung, Polyethylenimin (PEI)-vermittelte Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Liposomen-vermittelte Transfektion, Partikelkanonen-Technologie, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion, Nanopartikel-vermittelte Nukleinsäureabgabe (siehe z. B. Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 13. September 2012, pii: S0169-409X(12)00283-9. Doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) und dergleichen.
  • Die Wahl des Verfahrens zur genetischen Modifikation hängt im Allgemeinen von der Art der zu transformierenden Zelle und den Umständen ab, unter denen die Transformation stattfindet (z. B. in vitro, ex vivo oder in vivo). Eine allgemeine Erörterung dieser Verfahren findet sich in Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3. Auflage, Wiley & Sons, 1995.
  • Eine „Target-Nukleinsäure“, wie hierin verwendet, ist ein Polynukleotid (z. B. DNA wie etwa genomische DNA), das eine Stelle („Target-Stelle“ oder „Target-Sequenz“) enthält, auf die ein RNA-geleitetes Endonuklease-Polypeptid (z. B. Wildtyp-Cas12J; variantes Cas12J; Fusions-Cas12J usw.) abzielt. Die Target-Sequenz ist die Sequenz, an die die Guide-Sequenz einer Subjekt-Cas12J-Guide-RNA (z. B. eine duale Cas12J-Guide-RNA oder eine Einzelmolekül-Cas12J-Guide-RNA) hybridisiert. Beispielsweise wird die Target-Stelle (oder Target-Sequenz) 5'-GAGCAUAUC-3 ‚innerhalb einer Target-Nukleinsäure von der Sequenz 5‘-GAUAUGCUC-3' angesteuert (oder wird durch diese gebunden oder hybridisiert mit dieser oder ist komplementär zu dieser Sequenz). Geeignete Hybridisierungsbedingungen beinhalten physiologische Bedingungen, die üblicherweise in einer Zelle vorhanden sind. Für eine doppelsträngige Target-Nukleinsäure wird der Strang der Target-Nukleinsäure, der zu der Guide-RNA komplementär ist und mit dieser hybridisiert, als „komplementärer Strang“ oder „Target-Strang“ bezeichnet; während der Strang der Target-Nukleinsäure, der zu dem „Target-Strang“ komplementär ist (und daher nicht zur Guide-RNA komplementär ist), als „Nicht-Target-Strang“ oder „Nicht-Komplementärstrang“ bezeichnet wird.
  • „Spaltung“ steht für das Aufbrechen des kovalenten Rückgrats eines Target-Nukleinsäuremoleküls (z. B. RNA, DNA). Die Spaltung kann durch eine Vielzahl von Verfahren initiiert werden, einschließlich unter anderem die enzymatische oder chemische Hydrolyse einer Phosphodiesterbindung. Sowohl eine einzelsträngige Spaltung als auch eine doppelsträngige Spaltung sind möglich, und eine doppelsträngige Spaltung kann als Ergebnis von zwei unterschiedlichen einzelsträngigen Spaltungsereignissen auftreten.
  • „Nuklease“ und „Endonuklease“ werden hierin austauschbar verwendet, um ein Enzym zu bezeichnen, das eine katalytische Aktivität für die Nukleinsäurespaltung (z. B. Ribonukleaseaktivität (Ribonukleinsäurespaltung), Desoxyribonukleaseaktivität (Desoxyribonukleinsäurespaltung) usw.) besitzt.
  • „Spaltdomäne“ oder „aktive Domäne“ oder „Nuklease-Domäne“ einer Nuklease steht für die Polypeptidsequenz oder -domäne innerhalb der Nuklease, die die katalytische Aktivität für die Nukleinsäurespaltung besitzt. Eine Spaltdomäne kann in einer einzelnen Polypeptidkette enthalten sein, oder die Spaltungsaktivität kann aus der Assoziation von zwei (oder mehr) Polypeptiden resultieren. Eine einzelne Nuklease-Domäne kann aus mehr als einem isolierten Abschnitt von Aminosäuren innerhalb eines gegebenen Polypeptids bestehen.
  • Der Ausdruck „Stammzelle“ wird hierin verwendet, um eine Zelle (z. B. Pflanzenstammzelle, Wirbeltierstammzelle) zu bezeichnen, die die Fähigkeit besitzt, sich selbst zu erneuern und einen differenzierten Zelltyp zu erzeugen (siehe Morrison et al. (1997)). Cell 88:287-298). Im Kontext der Zellontogenese ist das Adjektiv „differenziert“ oder „differenzierend“ ein relativer Ausdruck. Eine „differenzierte Zelle“ ist eine Zelle, die auf dem Entwicklungsweg weiter fortgeschritten ist als die Zelle, mit der sie verglichen wird. Somit können pluripotente Stammzellen (nachfolgend beschrieben) in linienbeschränkte Vorläuferzellen (z. B. mesodermale Stammzellen) differenzieren, die wiederum in weiter eingeschränkte Zellen (z. B. Neuronenvorläufer) differenzieren können, die sich in Endstadiumszellen differenzieren können (d. h. terminal differenzierte Zellen, z. B. Neuronen, Kardiomyozyten usw.), die in einem bestimmten Gewebetyp eine charakteristische Rolle spielen, und können die Fähigkeit zur weiteren Proliferation beibehalten oder nicht. Stammzellen können sowohl durch das Vorhandensein spezifischer Marker (z. B. Proteine, RNA usw.) als auch durch das Fehlen spezifischer Marker gekennzeichnet sein. Stammzellen können auch durch funktionelle Assays sowohl in vitro als auch in vivo identifiziert werden, insbesondere durch Assays, die sich auf die Fähigkeit von Stammzellen beziehen, mehrere differenzierte Nachkommen hervorzubringen.
  • Zu den interessierenden Stammzellen gehören pluripotente Stammzellen (PSC). Der Ausdruck „pluripotente Stammzelle“ oder „PSC“ wird hierin verwendet, um eine Stammzelle zu bezeichnen, die alle Zelltypen des Organismus produzieren kann. Daher kann eine PSC Zellen aller Keimschichten des Organismus hervorbringen (z. B. Endoderm, Mesoderm und Ektoderm eines Wirbeltiers). Pluripotente Zellen sind in der Lage, Teratome zu bilden und zum Ektoderm-, Mesoderm- oder Endodermgewebe in einem lebenden Organismus beizutragen. Pluripotente Stammzellen von Pflanzen können alle Zelltypen der Pflanze hervorbringen (z. B. Zellen der Wurzel, des Stammes, der Blätter usw.).
  • PSC von Tieren können auf verschiedene Arten abgeleitet werden. Beispielsweise werden embryonale Stammzellen (ESC) aus der inneren Zellmasse eines Embryos abgeleitet (Thomson et al., Science. 1998 Nov. 6;282(5391):1145-7), wohingegen induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) von somatischen Zellen stammen (Takahashi et al., Cell. 2007 Nov. 30;131(5):861-72; Takahashi et. al., Nat Protoc. 2007;2(12):3081-9; Yu et. al, Wissenschaft. 21. Dez. 2007;318(5858):1917-20. Epub 20. Nov. 2007). Da sich der Ausdruck PSC auf pluripotente Stammzellen unabhängig von ihrer Ableitung bezieht, umfasst der Ausdruck PSC die Ausdrücke ESC und iPSC sowie den Ausdruck embryonale Keimstammzellen (EGSC), die ein weiteres Beispiel für ein PSC darstellen. PSC können in Form einer etablierten Zelllinie vorliegen, sie können direkt aus primärem embryonalen Gewebe erhalten werden oder sie können aus einer somatischen Zelle stammen. PSC können Target-Zellen der hier beschriebenen Verfahren sein.
  • „Embryonale Stammzelle“ (ESC) steht für eine PSC gemeint, die aus einem Embryo isoliert wurde, typischerweise aus der inneren Zellmasse der Blastozyste. ESC-Linien sind im NIH-Register für humane embryonale Stammzellen aufgeführt, z.B. hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN-03, hESBGN-04 (BresaGen, Inc.); HES-1, HES-2, HES-3, HES-4, HES-5, HES-6 (ES Cell International); Miz-hFS1 (MizMedi Hospital-Seoul National University); HSF-1, HSF-6 (University of California at San Francisco); und H1, H7, H9, H13, H14 (Wisconsin Alumni Research Foundation (WiCell Research Institute)). Zu den interessierenden Stammzellen gehören auch embryonale Stammzellen anderer Primaten, wie etwa Rhesus-Stammzellen und Seidenaffen-Stammzellen. Die Stammzellen können von jeder Säugerspezies erhalten werden, z. B. von Menschen, Pferden, Rindern, Schweinen, Hunden, Katzen, Nagetieren, z. B. Mäusen, Ratten, Hamstern, Primaten usw. (Thomson et al. (1998) Science 282:1145; Thomson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:7844; Thomson et al. (1996) Biol. Reprod. 55:254; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). In Kultur wachsen ESC typischerweise als flache Kolonien mit großen Nukleo-Cytoplasma-Verhältnissen, definierten Grenzen und prominenten Nukleoli. Zusätzlich exprimieren ESC SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 und alkalische Phosphatase, jedoch nicht SSEA-1. Beispiele für Verfahren zum Erzeugen und Charakterisieren von ESC finden sich beispielsweise in dem US-Patent Nr. 7,029,913 , dem US-Patent Nr. 5,843,780 und dem US-Patent Nr. 6,200,806 , auf deren Offenbarungen hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Verfahren zur Proliferation von hESC in undifferenzierter Form sind in WO 99/20741 , WO 01/51616 und WO 03/020920 beschrieben.
  • „Embryonale Keimstammzelle“ (EGSC) oder „embryonale Keimzelle“ oder „EG-Zelle“ ist eine PSC, die aus Keimzellen und/oder Keimzellvorläufern, z. B. Urkeimzellen, d. h., die zu Spermien und Eiern werden würden, abgeleitet sind. Es wird angenommen, dass embryonale Keimzellen (EG-Zellen) ähnliche Eigenschaften wie embryonale Stammzellen haben, wie vorstehend beschrieben. Beispiele für Verfahren zum Erzeugen und Charakterisieren von EG-Zellen finden sich beispielsweise in US-Patent Nr. 7,153,684 ; Y. Matsui et al. (1992) Cell 70:841; Shamblott, M. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113; Shamblott, M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726; und Koshimizu, U., et al. (1996) Development, 122:1235, auf deren Offenbarungen hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • „Induzierte pluripotente Stammzelle“ oder „iPSC“ steht für ein PSC, die von einer Zelle abgeleitet ist, die keine PSC ist (d. h. von einer Zelle, die relativ zu einer PSC differenziert ist). iPSC können von mehreren verschiedenen Zelltypen abgeleitet werden, einschließlich terminal differenzierter Zellen. iPSC haben eine ES-Zell-ähnliche Morphologie und wachsen als flache Kolonien mit großen Nukleo-Cytoplasma-Verhältnissen, definierten Grenzen und markanten Kernen. Zusätzlich exprimieren iPSC einen oder mehrere Schlüsselpluripotenzmarker, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf alkalische Phosphatase, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT und zfp42. Beispiele für Verfahren zum Erzeugen und Charakterisieren von iPSC finden sich beispielsweise in den US-Patentveröffentlichungen Nr. US20090047263 , US20090068742 , US20090191159 , US20090227032 , US20090246875 und US20090304646 , auf deren Offenbarungen hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Im Allgemeinen werden somatische Zellen zur Erzeugung von iPSC mit Reprogrammierungsfaktoren (z. B. Oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28 usw.) versehen, von denen im Stand der Technik bekannt ist, dass sie die somatischen Zellen so umprogrammieren, dass sie pluripotente Stammzellen werden.
  • „Somatische Zelle“ steht für eine beliebige Zelle in einem Organismus, die ohne experimentelle Manipulation normalerweise nicht alle Zelltypen in einem Organismus hervorbringt. Mit anderen Worten sind somatische Zellen Zellen, die sich ausreichend differenziert haben, so dass sie nicht auf natürliche Weise Zellen aller drei Keimschichten des Körpers, d. h. Ektoderm, Mesoderm und Endoderm, erzeugen. Beispielsweise würden somatische Zellen sowohl Neuronen als auch neurale Vorläufer enthalten, von denen letztere möglicherweise alle oder einige Zelltypen des Zentralnervensystems auf natürliche Weise hervorbringen können, aber keine Zellen der Mesoderm- oder Endoderm-Linien hervorbringen können.
  • „Mitotische Zelle“ steht für eine Zelle, die sich einer Mitose unterzieht. Mitose ist der Prozess, bei dem eine eukaryotische Zelle die Chromosomen in ihrem Kern in zwei identische Sätze in zwei getrennten Kernen aufteilt. Im Allgemeinen folgt unmittelbar eine Zytokinese, die die Kerne, das Zytoplasma, die Organellen und die Zellmembran in zwei Zellen aufteilt, die ungefähr gleiche Anteile dieser Zellkomponenten enthalten.
  • „Postmitotische Zelle“ steht für eine Zelle, die die Mitose verlassen hat, d. h. die „ruhend“ ist, d. h. sich nicht mehr teilt. Dieser Ruhezustand kann vorübergehend, d. h. reversibel, sein oder kann dauerhaft sein.
  • „Meiotische Zelle“ steht für eine Zelle, die sich einer Meiose unterzieht. Meiose ist der Prozess, bei dem eine Zelle ihr Kernmaterial teilt, um Gameten oder Sporen zu produzieren. Im Gegensatz zur Mitose durchlaufen die Chromosomen bei der Meiose einen Rekombinationsschritt, bei dem genetisches Material zwischen den Chromosomen gemischt wird. Zusätzlich ist das Ergebnis der Meiose vier (genetisch einzigartige) haploide Zellen im Vergleich zu den zwei (genetisch identischen) diploiden Zellen, die aus Mitose hergestellt werden.
  • In einigen Fällen beinhaltet eine Komponente (z. B. eine Nukleinsäurekomponente (z. B. eine Cas12J-Guide-RNA); eine Proteinkomponente (z. B. Wildtyp-Cas12J-Polypeptid; variantes Cas12J-Polypeptid; Cas12J-Fusionspolypeptid; usw.) und dergleichen) einen Markierungsrest. Die Ausdrücke „Markierung“, „nachweisbare Markierung“ oder „Markierungsrest“, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine beliebige Einheit, die den Signalnachweis ermöglicht und in Abhängigkeit von der besonderen Art des Assays stark variieren kann. Interessierende Markierungseinheiten enthalten sowohl direkt nachweisbare Markierungen (direkte Markierungen; z. B. eine fluoreszierende Markierung) als auch indirekt nachweisbare Markierungen (indirekte Markierungen; z. B. ein Bindungspaarelement). Eine fluoreszierende Markierung kann eine beliebige fluoreszierende Markierung sein (z. B. ein fluoreszierender Farbstoff (z. B. Fluorescein, Texas Red, Rhodamin, ALEXAFLUOR®-Markierungen und dergleichen), ein fluoreszierendes Protein (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP), verstärktes GFP (EGFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), rot fluoreszierendes Protein (RFP), cyan fluoreszierendes Protein (CFP), Kirsche, Tomate, Mandarine und ein beliebiges fluoreszierende Derivat davon) usw.). Geeignete (direkt oder indirekt) nachweisbare Markierungsreste zur Verwendung in den Verfahren enthalten eine beliebige Einheit, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische, chemische oder andere Mittel nachweisbar ist. Geeignete indirekte Markierungen umfassen beispielsweise Biotin (ein Bindungspaarelement), das durch Streptavidin (das selbst direkt oder indirekt markiert sein kann) gebunden werden kann. Markierungen können auch Folgendes enthalten: eine radioaktive Markierung (eine direkte Markierung) (z. B. 3H, 125I, 35S, 14C oder 32P); ein Enzym (eine indirekte Markierung) (z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase, Galactosidase, Luciferase, Glucoseoxidase und dergleichen); ein fluoreszierendes Protein (eine direkte Markierung) (z. B. grün fluoreszierendes Protein, rot fluoreszierendes Protein, gelb fluoreszierendes Protein und beliebige geeignete Derivate davon); eine Metallmarkierung (ein direkte Markierung); eine kolorimetrische Markierung; ein Bindungspaarelement; und dergleichen. „Partner eines Bindungspaars“ oder „Bindungspaarelement“ steht für einen erste und einen zweiten Rest, wobei der erste und der zweite Rest eine spezifische Bindungsaffinität zueinander aufweisen. Geeignete Bindungspaare beinhalten unter anderem: Antigen/Antikörper (beispielsweise Digoxigenin/Anti-Digoxigenin, Dinitrophenyl (DNP)/Anti-DNP, Dansyl-X-Anti-Dansyl, Fluorescein/Anti-Fluorescein, Luzifer-Gelb/Anti-Luzifer-Gelb und Rhodamin-Anti-Rhodamin), Biotin/Avidin (oder Biotin/Streptavidin) und Calmodulin-bindendes Protein (CBP)/Calmodulin. Jedes Bindungspaarelement kann zur Verwendung als indirekt nachweisbarer Markierungsrest geeignet sein.
  • Jede gegebene Komponente oder Kombination von Komponenten kann unmarkiert sein oder nachweisbar mit einem Markierungsrest markiert sein. In einigen Fällen, wenn zwei oder mehr Komponenten markiert sind, können diese mit Markierungseinheiten markiert werden, die voneinander unterscheidbar sind.
  • Allgemeine Verfahren in der molekularen und zellulären Biochemie finden sich in Standardlehrbüchern wie Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4. Auflage (Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. Hrsg., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy Hrsg., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits Hrsg., Academic Press 1997); und Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), auf deren Offenbarungen hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Im hier verwendeten Sinne beziehen sich die Ausdrücke „Behandlung“, „Behandeln“ und dergleichen auf das Erreichen einer gewünschten pharmakologischen und/oder physiologischen Wirkung. Die Wirkung kann prophylaktisch in Bezug auf das vollständige oder partielle Verhindern einer Krankheit oder eines Symptoms davon sein und/oder kann therapeutisch in Bezug auf eine partielle oder vollständige Heilung für eine Krankheit und/oder eine Nebenwirkung, die der Krankheit zuschreibbar ist, sein. Im hier verwendeten Sinne deckt „Behandlung“ eine beliebige Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, z. B. in einem Menschen, ab und beinhaltet: (a) Verhindern, dass die Krankheit in eine Subjekt auftritt, das für die Krankheit prädisponiert sein kann, sie aber noch nicht diagnostiziert wurde; (b) Hemmen der Krankheit, d. h. Stoppen ihrer Entwicklung; und (c) Lindern der Krankheit, d. h. Hervorrufen der Regression der Krankheit.
  • Die Ausdrücke „Individuum“, „Subjekt“, „Wirt“ und „Patient“, die hierin austauschbar verwendet werden, beziehen sich auf einen einzelnen Organismus, z. B. ein Säuger, einschließlich unter anderem auf Mäuse, Affen, Menschen, nichtmenschliche Primaten, Huftiere, Katzen, Hunde, Rinder, Schafe, Säuger-Nutztiere, Säuger-Sporttiere und Säuger-Haustiere.
  • Bevor die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben wird, versteht es sich, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte beschriebene Ausführungsformen beschränkt ist, sondern durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, da diese natürlich variieren können. Zudem versteht sich, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht einschränkend sein soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche eingeschränkt wird.
  • Wenn eine Bereich von Werten bereitgestellt wird, ist anzumerken, dass jeder intervenierende Wert, zum Zehntel der Einheit der Untergrenze, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas Anderweitiges vorgibt, zwischen der Ober- und Untergrenze dieses Bereichs und jeder andere angegebene oder intervenierende Wert in diesem angegebenen Bereich in der Erfindung inbegriffen ist. Die Ober- und Untergrenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig in den kleineren Bereichen enthalten sein und sind ebenfalls in der Erfindung inbegriffen, vorbehaltlich einer spezifisch ausgeschlossenen Grenze des angegebenen Bereichs. Wenn der angegebene Bereich eine oder beide der Grenzen beinhaltet, sind Bereiche, die beide der inbegriffenen Grenzen ausschließen, ebenfalls in der Erfindung enthalten.
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung wie sie von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, im Allgemeinen verstanden wird. Obwohl Verfahren und Materialien auch bei der praktischen Umsetzung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, die den in dieser Schrift beschriebenen ähneln oder entsprechen, werden nun die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Alle hierin erwähnten Veröffentlichungen werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen, um die Verfahren und/oder Materialien zu offenbaren und zu beschreiben, in Verbindung mit denen die Veröffentlichungen zitiert werden.
  • Es ist anzumerken, dass im hier verwendeten Sinne und in den beigefügten Ansprüchen die Singularformen „ein“, „eine“ und „der/die/das“ Pluralbezüge mit einschließen, sofern der Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes vorgibt. Somit schließt zum Beispiel ein Verweis auf „ein Cas12J CRISPR-Cas-Effektorpolypeptid“ eine Vielzahl von derartigen Polypeptiden ein und schließt ein Verweis auf „die Guide-RNA“ einen Verweis auf ein oder mehrere Guide-RNA und dem Fachmann bekannte Äquivalente davon usw. ein. Es ist ferner anzumerken, dass die Ansprüche so verfasst sein können, dass sie ein beliebiges optionales Element ausschließen. Folglich ist diese Aussage dazu gedacht, als vorangehende Basis für die Verwendung derartiger ausschließender Ausdrücke wie „lediglich“, „nur“ und dergleichen in Verbindung mit der Nennung von Anspruchselementen oder die Verwendung einer „negativen“ Einschränkung zu dienen.
  • Es versteht sich, dass bestimmte erfindungsgemäße Merkmale, die der Übersichtlichkeit halber im Kontext von separaten Ausführungsformen beschrieben sind, ebenso in Kombination in einer einzelnen Ausführungsform bereitgestellt werden können. Im umgekehrten Fall können verschiedene erfindungsgemäße Merkmale, welche der Kürze halber im Kontext einer einzelnen Ausführungsform beschrieben sind, ebenso separat oder in einer beliebigen Teilkombination bereitgestellt werden. Alle Kombinationen der Ausführungsformen, die zu der Erfindung gehören, werden durch die vorliegende Erfindung spezifisch eingeschlossen und werden hierin offenbart, als wäre jede einzelne Kombination individuell und explizit offenbart. Außerdem werden alle Teilkombinationen der verschiedenen Ausführungsformen und Elemente davon ebenfalls spezifisch durch die vorliegende Erfindung eingeschlossen und werden hierin offenbart, als wäre jede einzelne derartige Teilkombination individuell und explizit hierin offenbart.
  • Die hier erörterten Veröffentlichungen werden lediglich aufgrund ihrer Offenbarung vor dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Keine der hierin enthaltenen Angaben ist als Zugeständnis auszulegen, dass die vorliegende Erfindung nicht dazu berechtigt ist, eine derartige Veröffentlichung kraft einer vorhergehenden Erfindung vorwegzunehmen. Ferner können sich die bereitgestellten Veröffentlichungsdaten von den tatsächlichen Veröffentlichungsdaten unterscheiden, die unabhängig bestimmt werden müssen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Die vorliegende Offenbarung stellt RNA-geleitete CRISPR-Cas-Effektorproteine, hierin als „Cas12J“-Polypeptide, „CasΦ“-Polypeptide oder „CasXS“-Polypeptide bezeichnet; Nukleinsäuren, die dieselben codieren; und Zusammensetzungen, die dieselben umfassen, bereit. Die vorliegende Offenbarung stellt Ribonukleoproteinkomplexe bereit, umfassend: ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und eine Guide-RNA. Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure unter Verwendung eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung und einer Guide-RNA bereit. Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zum Modulieren der Transkription einer Target-Nukleinsäure bereit.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Guide-RNA (hierin als „Cas12J-Guide-RNA“ bezeichnet), die an die Cas12J-Proteine binden und Sequenzspezifität für diese bereitstellen; Nukleinsäuren, die die Cas12J-Guide-RNA codieren; und modifizierte Wirtszellen, die die Cas12J-Guide-RNA und/oder Nukleinsäuren, die für dasselbe codieren, umfassen, bereit. Cas12J-Guide-RNA sind in einer Vielzahl von Anwendungen, die bereitgestellt werden, nützlich.
  • Zusammensetzungen
  • CRISPR/Cas12J-Proteine und Guide-RNA
  • Ein Cas12J-CRISPR/Cas-Effektorpolypeptid (z. B. ein Cas12J-Protein; auch als „CasXS-Polypeptid“ oder „CasΦ-Polypeptid“ bezeichnet) interagiert mit einer entsprechenden Guide-RNA (z. B. einer Cas12J-Guide-RNA) (bindet daran), um ein Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex zu bilden, der über eine Basenpaarung zwischen der Guide-RNA und einer Target-Sequenz innerhalb des Target-Nukleinsäuremoleküls auf eine bestimmte Stelle in einer Target-Nukleinsäure (z. B. einer Target-DNA) gerichtet ist. Eine Guide-RNA enthält eine Nukleotidsequenz (eine Guide-Sequenz), die zu einer Sequenz (der Target-Stelle) einer Target-Nukleinsäure komplementär ist. Somit bildet ein Cas12J-Protein einen Komplex mit einer Cas12J-Guide-RNA und die Guide-RNA stellt über die Guide-Sequenz Sequenzspezifität für den RNP-Komplex bereit. Das Cas12J-Protein des Komplexes stellt die stellenspezifische Aktivität bereit. Mit anderen Worten wird das Cas12J-Protein zu einer Target-Stelle (z. B. stabilisiert an einer Target-Stelle) innerhalb einer Target-Nukleinsäuresequenz (z. B. einer chromosomalen Sequenz oder einer extrachromosomalen Sequenz, z. B. einer episomalen Sequenz, einer Minikreissequenz, einer Mitochondriensequenz, einer Chloroplastensequenz usw.) aufgrund ihrer Assoziation mit der Guide-RNA geleitet.
  • In einigen Fällen spaltet ein Cas12J-CRISPR/Cas-Effektorpolypeptid der vorliegenden Offenbarung doppelsträngige DNA oder einzelsträngige DNA, jedoch keine einzelsträngige RNA, spaltet, es mit einer Guide-RNA komplexiert ist.
  • In einigen Fällen katalysiert ein Cas12J-CRISPR/Cas-Effektorpolypeptid der vorliegenden Offenbarung die Prozessierung von prä-crRNA in einer Magnesiumabhängigen Weise.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Zusammensetzungen bereit, umfassend ein Cas12J-Polypeptid (und/oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Cas 12J-Polypeptid codiert) (z. B. wobei das Cas 12J-Polypeptid ein natürlich vorhandenes Protein, ein Cas12J-Nickase-Protein, ein katalytisch inaktives („totes“ Cas12J; hierin auch als „dCas12J-Protein“ bezeichnet), ein Cas12J-Fusionsprotein usw. sein kann). Die vorliegende Offenbarung stellt Zusammensetzungen bereit, die eine Cas12J-Guide-RNA umfassen (und/oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die Cas12J-Guide-RNA codiert). Die vorliegende Offenbarung stellt Zusammensetzungen bereit, umfassend (a) ein Cas12J-Polypeptid (und/oder eine Nukleinsäure, die das Cas12J-Polypeptid codiert) (z. B. wobei das Cas 12J-Polypeptid ein natürlich vorhandenes Protein, ein Cas12J-Nickase-Protein, ein dCas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein usw. sein kann) und (b) eine Cas12J-Guide-RNA (und/oder eine Nukleinsäure, die die Cas12J-Guide-RNA codiert). Die vorliegende Offenbarung stellt einen Nukleinsäure/Protein-Komplex (RNP-Komplex) bereit, umfassend (a) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung (z. B. wobei das Cas12J-Polypeptid ein natürlich vorhandenes Protein, ein Cas12J-Nickase-Protein, ein Cas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein usw. sein kann); und (b) eine Cas12J-Guide-RNA.
  • Cas 12J-Protein
  • Ein Cas12J-Polypeptid (dieser Ausdruck wird austauschbar mit dem Ausdruck „Cas12J-Protein“, „CasΦ-Polypeptid“ und „CasΦ-Protein“ verwendet) kann eine Target-Nukleinsäure und/oder ein Polypeptid, das mit der Target-Nukleinsäure assoziiert ist (z. B. Methylierung oder Acetylierung eines Histonschwanzes) binden und/oder modifizieren (z. B. spalten, nicken, methylieren, demethylieren usw.) (z. B. in einigen Fällen enthält das Cas12J-Protein einen Fusionspartner mit einer Aktivität, und in einigen Fällen liefert das Cas12J-Protein Nukleaseaktivität). In einigen Fällen ist das Cas12J-Protein ein natürlich vorkommendes Protein (z. B. kommt es natürlich in Bakteriophagen vor). In anderen Fällen ist das Cas12J-Protein kein natürlich vorkommendes Polypeptid (z. B. ist das Cas12J-Protein ein variantes Cas12J-Protein (z. B. ein katalytisch inaktives Cas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein und dergleichen).
  • Ein Cas12J-Polypeptid (z. B. nicht an einen heterologen Fusionspartner kondensiert) kann ein Molekulargewicht von etwa 65 Kilodalton (kDa) bis etwa 85 kDa aufweisen. Beispielsweise kann ein Cas12J-Polypeptid ein Molekulargewicht von etwa 65 kDa bis etwa 70 kDa, von etwa 70 kDa bis etwa 75 kDa oder von etwa 75 kDa bis etwa 80 kDa aufweisen. Beispielsweise kann ein Cas12J-Polypeptid ein Molekulargewicht von etwa 70 kDa bis etwa 80 kDa aufweisen.
  • Assays zur Bestimmung, ob ein gegebenes Protein mit einer Cas12J-Guide-RNA interagiert, können beliebige geeignete Bindungsassays sein, die die Bindung zwischen einem Protein und einer Nukleinsäure testen. Geeignete Bindungsassays (z. B. Gel-Shift-Assays) sind dem Fachmann bekannt (z. B. Assays, die das Hinzufügen einer Cas12J-Guide-RNA und eines Proteins zu einer Target-Nukleinsäure umfassen). Assays, um zu bestimmen, ob ein Protein eine Aktivität aufweist (z. B. um zu bestimmen, ob das Protein eine Nukleaseaktivität, die eine Target-Nukleinsäure spaltet, und/oder eine gewisse heterologe Aktivität aufweist) kann ein beliebiger geeigneter Assay sein (z. B. ein beliebiger geeigneter Nukleinsäurespaltungsassay, der auf Nukleinsäurespaltung testet). Geeignete Assays (z. B. Spaltungsassays) sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
  • Ein natürlich vorkommendes Cas12J-Protein fungiert als Endonuklease, die einen Doppelstrangbruch an einer bestimmten Sequenz in einer gezielten doppelsträngigen DNA (dsDNA) katalysiert. Die Sequenzspezifität wird durch die zugehörige Guide-RNA bereitgestellt, die mit einer Target-Sequenz innerhalb der Target-DNA hybridisiert. Die natürlich vorkommende Cas12J-Guide-RNA ist eine crRNA, wobei die crRNA (i) eine Guide-Sequenz, die mit einer Target-Sequenz in der Target-DNA hybridisiert, und (ii) ein Proteinbindungssegment, das eine Stammschleife (Haarnadel-dsRNA-Duplex) beinhaltet, die an das Cas12J-Protein bindet, enthält.
  • In einigen Fällen erzeugt ein C12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, wenn es mit einer Cas12J-Guide-RNA komplexiert wird, eine Produktnukleinsäure, die einen 5'-Überhang nach ortsspezifischer Spaltung einer Target-Nukleinsäure umfasst. Der 5'-Überhang kann ein 8 bis 12-Nukleotid (nt)-Überhang sein. Beispielsweise kann der 5'-Überhang 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt oder 12 nt lang sein.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Cas12J-Protein der zugrundeliegenden Verfahren und/oder Zusammensetzungen ein natürlich vorkommendes (Wildtyp-)Protein (oder ist von diesem abgeleitet). Beispiele für natürlich vorkommende Cas12J-Proteine sind in 6A-6R dargestellt. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit einer beliebigen der in 6 dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenzen (z. B. einer beliebigen der 6A-6R). In einigen Fällen enthält Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz, die in 6 dargestellt ist (z. B. eine beliebige der 6A-6R).
  • In einigen Fällen weist ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) mehr Sequenzidentität zu einer Aminosäuresequenz, die in 6 dargestellt ist (z. B. eine beliebige der in 6 dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenzen) auf als zu einem beliebigen der Folgenden:
    • Cas12a-Proteine, Cas12b-Proteine, Cas12c-Proteine, Cas12d-Proteine, Cas12e-Proteine, Cas 12g-Proteine, Cas12h-Proteine und Cas12i-Proteine. In einigen Fällen beinhaltet ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit einer RuvC-Domäne (die die Domänen RuvC-I, RuvC-II und RuvC-III enthält), die mehr Sequenzidentität zu der RuvC-Domäne einer Aminosäuresequenz, die in 6 dargestellt ist (z. B. die RuvC-Domäne einer beliebigen der in 6 dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenzen) aufweist als zu der RuvC-Domäne eines beliebigen der Folgenden: Cas12a-Proteine, Cas12b-Proteine, Cas12c-Proteine, Cas12d-Proteine, Cas12e-Proteine, Cas12g-Proteine, Cas12h-Proteine und Cas12i-Proteine.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der RuvC-Domäne (die die Domänen RuvC-I, RuvC-II und RuvC-III enthält) einer beliebigen der in 6 dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenzen (z. B. einer beliebigen der 6A-6R). In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 70 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 75 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der RuvC-Domäne (die die Domänen RuvC-I, RuvC-II und RuvC-III enthält) einer beliebigen der in 6 dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenzen (z. B. einer beliebigen der 6A-6R). In einigen Fällen enthält Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) die RuvC-Domäne (die die Domänen RuvC-I, RuvC-II und RuvC-III enthält) einer beliebigen der Cas12J-Aminosäuresequenzen, die in 6 dargestellt sind (z. B. eine beliebige der 6A-6R).
  • In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid bindet, eine in 7 dargestellte Nukleotidsequenz (oder in einigen Fällen das reverse Komplement derselben). In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nX oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist (z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30), und X eine beliebige der in 7 dargestellten Nukleotidsequenzen (oder in einigen Fällen das reverse Komplement derselben) ist.
  • In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid bindet, eine Nukleotidsequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit einer beliebigen der in 7 dargestellten Sequenzen (oder in einigen Fällen dem reversen Komplement derselben). In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nX oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist (z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30), und X eine Nukleotidsequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit einer beliebigen der in 7 dargestellten Sequenzen ist.
  • In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid bindet, eine Nukleotidsequenz mit 85 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit einer beliebigen der in 7 dargestellten Sequenzen (oder in einigen Fällen dem reversen Komplement derselben). In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nX oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist (z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30), und X eine Nukleotidsequenz mit 85 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit einer beliebigen der in 7 dargestellten Sequenzen ist.
  • In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid bindet, eine in 7 dargestellte Nukleotidsequenz (oder in einigen Fällen das reverse Komplement derselben). In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz X(N)n, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist (z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30), und X eine beliebige der in 7 dargestellten Nukleotidsequenzen (oder in einigen Fällen das reverse Komplement derselben) ist.
  • In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid bindet, eine Nukleotidsequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit einer beliebigen der in 7 dargestellten Sequenzen (oder in einigen Fällen dem reversen Komplement derselben). In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz X(N)n, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist (z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30), und X eine Nukleotidsequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit einer beliebigen der in 7 dargestellten Sequenzen ist.
  • Beispiele für Cas12J-Proteine sind in 6A-6R dargestellt. Wie vorstehend dargelegt, wird ein Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-Polypeptid“ bezeichnet. Beispielsweise:
    • 1) wird das als „Cas12J_1947455“ (oder „Cas12J_1947455_11“ in 9) bezeichnete und in 6A dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-1“ bezeichnet;
    • 2) wird das als „Cas12J_2071242“ bezeichnete und in 6B dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-2“ bezeichnet;
    • 3) wird das als „Cas12J_3339380“ (oder „Cas12J_3339380_12“ in 9) bezeichnete und in 6D dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-3“ bezeichnet;
    • 4) wird das als „Cas12J_3877103_16“ bezeichnete und in 6Q dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-4“ bezeichnet;
    • 5) wird das als „Cas12J_10000002_47“ oder „Cas12J_1000002_112“ bezeichnete und in 6G dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-5“ bezeichnet;
    • 6) wird das als „Cas12J_10100763_4“ bezeichnete und in 6H dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-6“ bezeichnet;
    • 7) wird das als „Cas12J_1000007_143“ oder „Cas12J_1000001_267“ bezeichnete und in 6P dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-7“ bezeichnet;
    • 8) wird das als „Cas12J_10000286_53“ bezeichnete und in 6L dargestellte (oder als „Cas12J_10000506_8“ bezeichnete und in 6O dargestellte) Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-8“ bezeichnet;
    • 9) wird das als „Cas12J_10001283_7“ bezeichnete und in 6M dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-9“ bezeichnet;
    • 10) wird das als „Cas12J_10037042_3“ bezeichnete und in 6E dargestellte Cas12J-Polypeptid hierin auch als „CasΦ-10“ bezeichnet;
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6A dargestellten und als „Cas12J_1947455“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6A dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6A dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6A dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6A dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6A dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 680 Aminosäuren (aa) bis 720 aa, z. B. von 680 aa bis 690 aa, von 690 aa bis 700 aa, von 700 aa bis 710 aa oder von 710 aa bis 720 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 707 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6A dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCTCGACTAATCGAGCAATCGTTTGAGATCTCTCC (SEQ ID NO: 1) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCTCGACTAATCGAGCAATCGTTTGAGATCTCTCC (SEQ ID NO: 2) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30. Das als Cas12J_1947455 (oder Cas12J_1947455_11 in 9) bezeichnete und in 6A dargestellte Cas12J-Protein wird hierin auch als „Ortholog #1“ oder „CasI2<D-l“ bezeichnet.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6B dargestellten und als „Cas12J_071242“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6B dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6B dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6B dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6B dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6B dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 740 Aminosäuren (aa) bis 780 aa, z. B. von 740 aa bis 750 aa, von 750 aa bis 760 aa, von 760 aa bis 770 aa oder von 770 aa bis 780 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 757 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6B dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCGGAACGCTCAACGATTGCCCCTCACGAGGGGAC (SEQ ID NO: 3) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCGGAACGCTCAACGATTGCCCCTCACGAGGGGAC (SEQ ID NO: 4) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30. Das als Cas12J_2071242 bezeichnete und in 6B dargestellte Cas12J-Protein wird hierin auch als „Ortholog #2“ oder „Cas12Φ-2“ bezeichnet.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6C dargestellten und als „Cas12J_1973640“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6C dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6C dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6C dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6C dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6C dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 740 Aminosäuren (aa) bis 780 aa, z. B. von 740 aa bis 750 aa, von 750 aa bis 760 aa, von 760 aa bis 770 aa oder von 770 aa bis 780 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 765 Aminosäuren.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6D dargestellten und als „Cas12J_3339380“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6D dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6D dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6D dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6D dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6D dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 740 Aminosäuren (aa) bis 780 aa, z. B. von 740 aa bis 750 aa, von 750 aa bis 760 aa, von 760 aa bis 770 aa oder von 770 aa bis 780 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 766 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6D dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCCCAGCGTACTGGGCAATCAATAGTCGTTTTGGT (SEQ ID NO: 5) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCCCAGCGTACTGGGCAATCAATAGTCGTTTTGGT (SEQ ID NO: 6) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30. Das als Cas12J_3339380 bezeichnete und in 6D dargestellte Cas12J-Protein wird hierin auch als „Ortholog #3“ oder „Cas12Φ-3“ bezeichnet.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6E dargestellten und als „Cas12J_10037042_3“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6E dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6E dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6E dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6E dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6E dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 780 Aminosäuren (aa) bis 820 aa, z. B. von 780 aa bis 790 aa, von 790 aa bis 800 aa, von 800 aa bis 810 aa oder von 810 aa bis 820 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 812 Aminosäuren.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6F dargestellten und als „Cas12J_10020921_9“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6F dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6F dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6F dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6F dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6F dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 780 Aminosäuren (aa) bis 820 aa, z. B. von 780 aa bis 790 aa, von 790 aa bis 800 aa, von 800 aa bis 810 aa oder von 810 aa bis 820 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 812 Aminosäuren.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6G dargestellten und als „Cas12J_10000002_47“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6G dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6G dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6G dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6G dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6G dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 770 Aminosäuren (aa) bis 810 aa, z. B. von 770 aa bis 780 aa, von 780 aa bis 790 aa, von 790 aa bis 800 aa oder von 800 aa bis 810 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 793 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6G dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GGATCCAATCCTTTTTGATTGCCCAATTCGTTGGGAC (SEQ ID NO: 7) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGGATCCAATCCTTTTTGATTGCCCAATTCGTTGGGAC (SEQ ID NO: 8) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6H dargestellten und als „Cas12J_10100763_4“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6H dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6H dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6H dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6H dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6H dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 420 Aminosäuren (aa) bis 460 aa, z. B. von 420 aa bis 430 aa, von 430 aa bis 440 aa, von 440 aa bis 450 aa oder von 450 aa bis 460 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 441 Aminosäuren.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6I dargestellten und als „Cas12J_10004149_10“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6I dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 61 dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6I dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6I dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6I dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 790 Aminosäuren (aa) bis 830 aa, z. B. von 790 aa bis 800 aa, von 800 aa bis 810 aa, von 810 aa bis 820 aa oder von 820 aa bis 830 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 812 Aminosäuren.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6J dargestellten und als „Cas12J_10000724_71“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6J dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6J dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6J dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6J dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas 12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6J dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 790 Aminosäuren (aa) bis 830 aa, z. B. von 790 aa bis 800 aa, von 800 aa bis 810 aa, von 810 aa bis 820 aa oder von 820 aa bis 830 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 812 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6J dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GGATCTGAGGATCATTATTGCTCGTTACGACGAGAC (SEQ ID NO: 9) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGGATCTGAGGATCATTATTGCTCGTTACGACGAGAC (SEQ ID NO: 10) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6J dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCTCGTCGTAACGAGCAATAATGATCCTCAGATCC (SEQ ID NO: 11) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCTCGTCGTAACGAGCAATAATGATCCTCAGATCC (SEQ ID NO: 12) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6K dargestellten und als „Cas12J_1000001_267“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6K dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6K dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6K dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6K dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6K dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 750 Aminosäuren (aa) bis 790 aa, z. B. von 750 aa bis 760 aa, von 760 aa bis 770 aa, von 770 aa bis 780 aa oder von 780 aa bis 790 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 772 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6K dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCTCAGCGTACTGAGCAATCAAAAGGTTTCGCAGG (SEQ ID NO: 13) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCTCAGCGTACTGAGCAATCAAAAGGTTTCGCAGG (SEQ ID NO: 14) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6L dargestellten und als „Cas12J_10000286_53“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6L dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6L dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6L dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6L dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6L dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 700 Aminosäuren (aa) bis 740 aa, z. B. von 700 aa bis 710 aa, von 710 aa bis 720 aa, von 720 aa bis 730 aa oder von 730 aa bis 740 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 717 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6L dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCTCCTCGTAAGGAGCAATCTATTAGTCTTGAAAG (SEQ ID NO: 15) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCTCCTCGTAAGGAGCAATCTATTAGTCTTGAAAG (SEQ ID NO: 16) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6M dargestellten und als „Cas12J_10001283_7“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6M dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6M dargestellten Cas 12J - Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6M dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6M dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6M dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 770 Aminosäuren (aa) bis 810 aa, z. B. von 770 aa bis 780 aa, von 780 aa bis 790 aa, von 790 aa bis 800 aa oder von 800 aa bis 810 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 793 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6M dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCTCGGCGCACCGAGCAATCAGCGAGGTCTTCTAC (SEQ ID NO: 17) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCTCGGCGCACCGAGCAATCAGCGAGGTCTTCTAC (SEQ ID NO: 18) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6N dargestellten und als „Cas12J_1000002_112“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6N dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6N dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6N dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6N dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6N dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 770 Aminosäuren (aa) bis 810 aa, z. B. von 770 aa bis 780 aa, von 780 aa bis 790 aa, von 790 aa bis 800 aa oder von 800 aa bis 810 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 793 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6N dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCCCAACGAATTGGGCAATCAAAAAGGATTGGATCC (SEQ ID NO: 19) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCCCAACGAATTGGGCAATCAAAAAGGATTGGATCC (SEQ ID NO: 20) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6O dargestellten und als „Cas12J_10000506_8“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6O dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6O dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6O dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6O dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6O dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 700 Aminosäuren (aa) bis 740 aa, z. B. von 700 aa bis 710 aa, von 710 aa bis 720 aa, von 720 aa bis 730 aa oder von 730 aa bis 740 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 717 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6O dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCTCCTCGTAAGGAGCAATCTATTAGTCTTGAAAG (SEQ ID NO: 15) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCTCCTCGTAAGGAGCAATCTATTAGTCTTGAAAG (SEQ ID NO: 16) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6P dargestellten und als „Cas12J_1000007_143“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6P dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6P dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6P dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6P dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6P dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 750 Aminosäuren (aa) bis 790 aa, z. B. von 750 aa bis 760 aa, von 760 aa bis 770 aa, von 770 aa bis 780 aa oder von 780 aa bis 790 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 772 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6P dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCTCAGCGTACTGAGCAATCAAAAGGTTTCGCAGG (SEQ ID NO: 13) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCTCAGCGTACTGAGCAATCAAAAGGTTTCGCAGG (SEQ ID NO: 14) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6Q dargestellten und als „Cas12J_3877103_16“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6Q dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6Q dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6Q dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6Q dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6Q dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 750 Aminosäuren (aa) bis 790 aa, z. B. von 750 aa bis 760 aa, von 760 aa bis 770 aa, von 770 aa bis 780 aa oder von 780 aa bis 790 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 765 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6Q dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: GTCGCGGCGTACCGCGCAATGAGAGTCTGTTGCCAT (SEQ ID NO: 21) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nGTCGCGGCGTACCGCGCAATGAGAGTCTGTTGCCAT (SEQ ID NO: 22) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (der zugrundeliegenden Zusammensetzungen und/oder Verfahren) eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6R dargestellten und als „Cas12J_877636_12“ bezeichneten Cas12J-Aminosäuresequenz. Beispielsweise enthält in einigen Fällen ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 50 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6R dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 80 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6R dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit 90 % oder mehr Sequenzidentität (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Sequenzidentität) mit der in 6R dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6R dargestellten Cas12J-Proteinsequenz. In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein eine Aminosäuresequenz mit der in 6R dargestellten Cas12J-Proteinsequenz, mit der Ausnahme, dass die Sequenz eine Aminosäuresubstitution (z. B. 1, 2 oder 3 Aminosäuresubstitutionen) enthält, die die natürlich vorkommende katalytische Aktivität des Proteins verringert. In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 750 Aminosäuren (aa) bis 790 aa, z. B. von 750 aa bis 760 aa, von 760 aa bis 770 aa, von 770 aa bis 780 aa oder von 780 aa bis 790 aa). In einigen Fällen hat das Cas12J-Polypeptid eine Länge von 766 Aminosäuren. In einigen Fällen enthält eine Guide-RNA, die ein Cas12J-Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit 20 % oder mehr, 30 % oder mehr, 40 % oder mehr, 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 % Aminosäuresequenzidentität zu der in 6R dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz) die folgende Nukleotidsequenz: ACCAAAACGACTATTGATTGCCCAGTACGCTGGGAC (SEQ ID NO: 23) oder das reverse Komplement derselben. In einigen Fällen umfasst die Guide-RNA die Nukleotidsequenz (N)nACCAAAACGACTATTGATTGCCCAGTACGCTGGGAC (SEQ ID NO: 24) oder das reverse Komplement derselben, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 30 ist, z. B. von 15 bis 20, von 17 bis 25, von 17 bis 22, von 18 bis 22, von 18 bis 20, von 20 bis 25 oder von 25 bis 30.
  • Cas12J-Varianten
  • Ein variantes Cas12J-Protein weist eine Aminosäuresequenz auf, die sich im Vergleich zur Aminosäuresequenz des entsprechenden Wildtyp-Cas 12J-Proteins, z. B. im Vergleich zu der Cas12J-Aminosäuresequenz, die in einer beliebigen der 6A-6R dargestellt ist, um mindestens eine Aminosäure unterscheidet (z. B. eine Deletion, Insertion, Substitution, Fusion aufweist). In einigen Fällen umfasst eine Cas12J-Variante im Vergleich zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz von 1 Aminosäuresubstitution bis zu 10 Aminosäuresubstitutionen. In einigen Fällen umfasst eine Cas12J-Variante im Vergleich zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Cas12J-Aminosäuresequenz von 1 Aminosäuresubstitution bis zu 10 Aminosäuresubstitutionen in der RuvC-Domäne.
  • Varianten - katalytische Aktivität
  • In einigen Fällen ist das Cas12J-Protein ein variantes Cas12J-Protein, z. B. relativ zu der natürlich vorkommenden katalytisch aktiven Sequenz mutiert, und zeigt eine verringerte Spaltungsaktivität (z. B. zeigt 90 % oder weniger, 80 % oder weniger, 70 % oder weniger, 60 % oder weniger, 50 % oder weniger, 40 % oder weniger oder 30 % oder weniger Spaltungsaktivität) im Vergleich zu der entsprechenden natürlich vorkommenden Sequenz. In einigen Fällen ist ein solches variantes Cas12J-Protein ein katalytisch „totes“ Protein (hat im Wesentlichen keine Spaltungsaktivität) und kann als „dCas12J“ bezeichnet werden. In einigen Fällen ist das variante Cas12J-Protein eine Nickase (spaltet nur einen Strang einer doppelsträngigen Target-Nukleinsäure, z. B. eine doppelsträngige Target-DNA). Wie hierin ausführlicher beschrieben, wird in einigen Fällen ein Cas12J-Protein (in einigen Fällen ein Cas 12J-Protein mit Wildtyp-Spaltungsaktivität und in einigen Fällen ein variantes Cas12J mit reduzierter Spaltungsaktivität, z. B. ein dCas12J oder ein Nickase-Cas12J) an ein heterologes Polypeptid, das eine interessierende Aktivität (z. B. eine interessierende katalytische Aktivität) aufweist, kondensiert (konjugiert), um ein Fusionsprotein (ein Cas12J-Fusionsprotein) zu bilden.
  • Aminosäuresubstitutionen, die zu einem Cas12J-Polypeptid führen, das, wenn es mit einer Cas12J-Guide-RNA komplexiert wird, eine Target-Nukleinsäure bindet, aber nicht spaltet, ist in 9 dargestellt. Beispielsweise führt eine Substitution des Asp an Position 464 von Cas12J_10037042_3 oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J zu einem dCas12J. Als ein weiteres Beispiel führt eine Substitution des Glu an Position 678 von Cas12J_10037042_3 oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J zu einem dCas12J. Als ein weiteres Beispiel führt eine Substitution des Asp an Position 769 von Cas12J_10037042_3 oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J zu einem dCas12J.
  • Eine Aminosäuresubstitution, die zu einem dCas12J-Polypeptid führt (d. h. Cas12J-Polypeptid, das eine Target-Nukleinsäure bindet, aber nicht spaltet, wenn es mit einer Guide-RNA komplexiert wird), beinhaltet eine Substitution des Asp an Position 413 von Cas12J_3339380 (6D) oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J mit einer anderen Aminosäure als Asp. Als ein Beispiel beinhaltet eine Aminosäuresubstitution, die zu einem dCas12J-Polypeptid führt (d. h. Cas12J-Polypeptid, das eine Target-Nukleinsäure bindet, aber nicht spaltet, wenn es mit einer Guide-RNA komplexiert wird), eine D413A-Substitution an Position 413 von Cas12J_3339380 ( 6D) oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J.
  • Eine Aminosäuresubstitution, die zu einem dCas12J-Polypeptid führt (d. h. Cas12J-Polypeptid, das eine Target-Nukleinsäure bindet, aber nicht spaltet, wenn es mit einer Guide-RNA komplexiert wird), beinhaltet eine Substitution des Asp an Position 371 von Cas12J_1947455 (6A) oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J mit einer anderen Aminosäure als Asp. Als ein Beispiel beinhaltet eine Aminosäuresubstitution, die zu einem dCas12J-Polypeptid führt (d. h. Cas12J-Polypeptid, das eine Target-Nukleinsäure bindet, aber nicht spaltet, wenn es mit einer Guide-RNA komplexiert wird), eine D371A-Substitution an Position 371 von Cas12J_1947455 ( 6A) oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J.
  • Eine Aminosäuresubstitution, die zu einem dCas12J-Polypeptid führt (d. h. Cas12J-Polypeptid, das eine Target-Nukleinsäure bindet, aber nicht spaltet, wenn es mit einer Guide-RNA komplexiert wird), beinhaltet eine Substitution des Asp an Position 394 von Casl2J_2071242 (6B) oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J mit einer anderen Aminosäure als Asp. Als ein Beispiel beinhaltet eine Aminosäuresubstitution, die zu einem dCas12J-Polypeptid führt (d. h. Cas12J-Polypeptid, das eine Target-Nukleinsäure bindet, aber nicht spaltet, wenn es mit einer Guide-RNA komplexiert wird), eine D394A-Substitution an Position 394 von Cas12J_2071242 (6B) oder einer entsprechenden Position in einem anderen Cas12J.
  • Aminosäurepositionen entsprechend dem Asp an Position 413 von Cas12J_3339380 (6D) (CasΦ-3), dem Asp an Position 371 von Cas12J_1947455 (6A) (CasΦ-1) und dem Asp an Position 394 von Cas12J_2071242 (6B) (CasΦ-2) können leicht bestimmt werden, indem z. B. die Aminosäuresequenzen der in 6A-6R dargestellten Cas12J-Polypeptide aligniert werden. Beispielsweise sind die Aminosäurepositionen entsprechend dem Asp an Position 413 von Cas12J_3339380 ( 6D), dem Asp an Position 371 von Cas12J_1947455 (6A) und dem Asp an Position 394 von Cas12J_2071242 (6B) in 9 dargestellt. Beispielsweise kann das Asp in Ruv-CI, wenn es durch eine andere Aminosäure als Asp substituiert wird, in einem dCas12J-Polypeptid Folgendes enthalten:
    • 1) Asp-371 des als „Cas12J_1947455“ (oder „Cas12J_1947455_11“ in 9) bezeichneten und in 6A dargestellten Cas12J-Polypeptid („CasΦ-1“);
    • 2) Asp-394 des als „Cas12J_2071242“ bezeichneten und in 6B dargestellten Cas12J-Polypeptids („CasΦ-2“);
    • 3) Asp-413 des als „Cas12J_3339380“ (oder „Cas12J_3339380_12“ in 9) bezeichneten und in 6D dargestellten Cas12J-Polypeptids („CasΦ-3“);
    • 4) Asp-419 des als „Cas12J_3877103_16“ bezeichneten und in 6Q dargestellten Cas12J-Polypeptids („CasΦ-4“);
    • 5) Asp-416 des als „Cas12J_10000002_47“ oder „Cas12J_1000002_112“ bezeichneten und in 6G dargestellten Cas12J-Polypeptids („CasΦ-5“);
    • 6) Asp-384 des als „Cas12J_10100763_4“ bezeichneten und in 6H dargestellten Cas12J-Polypeptids („CasΦ-6“);
    • 7) Asp-423 des als „Cas12J_1000007_143“ oder „Cas12J_1000001_267“ bezeichneten und in 6P dargestellten Cas12J-Polypeptids („Cas<D-7“);
    • 8) Asp-369 des als „Cas12J_10000286_53“ bezeichneten und in 6L dargestellten (oder als „Cas12J_10000506_8“ bezeichneten und in 6O dargestellten) Cas12J-Polypeptids („CasΦ-8“);
    • 9) Asp-426 des als „Cas12J_10001283_7“ bezeichneten und in 6M dargestellten Cas12J-Polypeptids („CasΦ-9“);
    • 10) Asp-464 des als „Cas12J_10037042_3“ bezeichneten und in 6E dargestellten Cas12J-Polypeptids („Cas<D-I0“);
  • Varianten - Fusions-Cas12J-Polypeptide
  • Wie vorstehend angemerkt, wird in einigen Fällen ein Cas12J-Protein (in einigen Fällen ein Cas12J-Protein mit Wildtyp-Spaltungsaktivität und in einigen Fällen ein variantes Cas12J mit reduzierter Spaltungsaktivität, z. B. ein dCas12J oder ein Nickase-Cas12J) an ein heterologes Polypeptid (d. h. ein oder mehrere heterologe Polypeptide), das eine interessierende Aktivität (z. B. eine interessierende katalytische Aktivität) aufweist, kondensiert (konjugiert), um ein Fusionsprotein zu bilden. Ein heterologes Polypeptid, an das ein Cas12J-Protein kondensiert werden kann, wird hierin als ein „Fusionspartner“ bezeichnet.
  • In einigen Fällen kann der Fusionspartner die Transkription einer Target-DNA modulieren (z. B. die Transkription hemmen, die Transkription erhöhen). In einigen Fällen ist der Fusionspartner beispielsweise ein Protein (oder eine Domäne eines Proteins), das die Transkription hemmt (z. B. ein Transkriptionsrepressor, ein Protein, das über die Rekrutierung von Transkriptionsinhibitorproteinen, die Modifikation von Target-DNA wie etwa Methylierung, die Rekrutierung eines DNA-Modifikators, die Modulation von Histonen, die mit Target-DNA assoziiert sind, die Rekrutierung eines Histonmodifikators, wie etwa solche, die die Acetylierung und/oder Methylierung von Histonen modifizieren, und dergleichen funktioniert). In einigen Fällen ist der Fusionspartner ein Protein (oder eine Domäne eines Proteins), das die Transkription erhöht (z. B. ein Transkriptionsaktivator, ein Protein, das über die Rekrutierung von Transkriptionsaktivatorproteinen, die Modifikation von Target-DNA wie etwa Demethylierung, die Rekrutierung eines DNA-Modifikators, die Modulation von Histonen, die mit Target-DNA assoziiert sind, die Rekrutierung eines Histonmodifikators, wie etwa solche, die die Acetylierung und/oder Methylierung von Histonen modifizieren, und dergleichen arbeitet). In einigen Fällen ist der Fusionspartner eine reverse Transkriptase. In einigen Fällen ist der Fusionspartner ein Basen-Editor. In einigen Fällen ist der Fusionspartner eine Deaminase.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas 12J-Fusionsprotein ein heterologes Polypeptid mit enzymatischer Aktivität, die eine Target-Nukleinsäure modifiziert (z. B. Nukleaseaktivität, Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, DNA-Reparaturaktivität, DNA-Schadensaktivität, Desaminierungsaktivität, Dismutaseaktivität, Alkylierungsaktivität, Depurinierungsaktivität, Oxidationsaktivität, Pyrimidindimer-Bildungsaktivität, Integraseaktivität, Transposaseaktivität, Rekombinaseaktivität, Polymeraseaktivität, Ligaseaktivität, Helikaseaktivität, Photolyaseaktivität oder Glycosylaseaktivität).
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Fusionsprotein ein heterologes Polypeptid mit enzymatischer Aktivität, das ein Polypeptid (z. B. ein Histon) modifiziert, das mit einer Target-Nukleinsäure assoziiert ist (z. B. Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, Acetyltransferaseaktivität, Deacetylaseaktivität, Kinaseaktivität, Phosphataseaktivität, Ubiquitinligaseaktivität, Deubiquitinierungsaktivität, Adenylierungsaktivität, Deadenylierungsaktivität, SUMOylierungsaktivität, DeSUMOylierungsaktivität, Ribosylierungsaktivität, Deribosylierungsaktivität, Myristoylierungsaktivität oder Demyristoylierungsaktivität).
  • Beispiele für Proteine (oder Fragmente davon), die zur Erhöhung der Transkription verwendet werden können, beinhalten unter anderem: Transkriptionsaktivatoren wie etwa VP16, VP64, VP48, VP160, p65-Subdomäne (z. B. von NFkB) und Aktivierungsdomäne von EDLL und/oder TAL-Aktivierungsdomäne (z. B. für die Aktivität in Pflanzen); Histon-Lysin-Methyltransferasen wie etwa SET1A, SETIB, MLL1 bis 5, ASH1, SYMD2, NSD1 und dergleichen; Histon-Lysin-Demethylasen wie etwa JHDM2a/b, UTX, JMJD3 und dergleichen; Histonacetyltransferasen wie etwa GCN5, PCAF, CBP, p300, TAF1, TIP60/PLIP, MOZ/MYST3, MORF/MYST4, SRC1, ACTR, P160, CLOCK und dergleichen; und DNA-Demethylasen wie etwa Ten-Eleven Translocation (TET)-Dioxygenase 1 (TET1CD), TET1, DME, DML1, DML2, ROS1 und dergleichen.
  • Beispiele für Proteine (oder Fragmente davon), die zur Verringerung der Transkription verwendet werden können, beinhalten unter anderem: Transkriptionsrepressoren wie etwa die Krüppel-assoziierte Box (KRAB oder SKD); KOXI-Repressionsdomäne; die Mad-mSIN3-Interaktionsdomäne (SID); die ERF-Repressordomäne (ERD), die SRDX-Repressionsdomäne (z. B. zur Repression in Pflanzen) und dergleichen; Histon-Lysin-Methyltransferasen wie etwa Pr-SET7/8, SUV4-20H1, RIZ1 und dergleichen; Histon-Lysin-Demethylasen wie etwa JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, JARID1A/RBP2, JARID1B/PLU-1, JARID1C/SMCX, JARID1D/SMCY und dergleichen; Histon-Lysin-Deacetylasen wie etwa HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, SIRT1, SIRT2, HDAC11 und dergleichen; DNA-Methylasen wie etwa HhaI-DNA-m5c-Methyltransferase (M.HhaI), DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1), DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a), DNA-Methyltransferase 3b (DNMT3b), METI, DRM3 (Pflanzen), ZMET2, CMT1, CMT2 (Pflanzen) und dergleichen; und Rekrutierungselemente für die Peripherie wie etwa Lamin A, Lamin B und dergleichen.
  • In einigen Fällen hat der Fusionspartner eine enzymatische Aktivität, die die Target-Nukleinsäure modifiziert (z. B. ssRNA, dsRNA, ssDNA, dsDNA). Beispiele für enzymatische Aktivität, die durch den Fusionspartner bereitgestellt werden können, beinhalten unter anderem: Nukleaseaktivität, wie etwa die durch ein Restriktionsenzym (z. B. FokI-Nuklease) bereitgestellte, Methyltransferaseaktivität, wie etwa die durch eine Methyltransferase (z. B. HhaI-DNA-m5c-Methyltransferase (M.HhaI), DNA-Methyltransferase 1 (DNMT1), DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3a), DNA-Methyltransferase 3b (DNMT3b), METI, DRM3 (Pflanzen), ZMET2, CMT1, CMT2 (Pflanzen) und dergleichen bereitgestellte); Demethylaseaktivität, wie etwa die durch eine Demethylase (z. B. Ten-Eleven Translocation (TET)-Dioxygenase 1 (TET1CD), TET1, DME, DML1, DML2, ROS1 und dergleichen) bereitgestellte, DNA-Reparaturaktivität, DNA-Schadensaktivität, Desaminierungsaktivität, wie etwa die durch eine Desaminase (z. B. ein Cytosindeaminaseenzym wie etwa Ratten-APOBEC1) bereitgestellte, Dismutaseaktivität, Alkylierungsaktivität, Depurinierungsaktivität, Oxidationsaktivität, Pyrimidindimer-Bildungsaktivität, Integraseaktivität, wie etwa die durch eine Integrase und/oder Resolvase (z. B. Gin-Invertase wie etwa die hyperaktive Mutante der Gin-Invertase, GinH106Y; Integrase des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (IN); Tn3-Resolvase und dergleichen) bereitgestellte, Transposaseaktivität, Rekombinaseaktivität, wie etwa die durch eine Rekombinase bereitgestellte (z. B. katalytische Domäne der Gin-Rekombinase), Polymeraseaktivität, Ligaseaktivität, Helikaseaktivität, Photolyaseaktivität und Glycosylaseaktivität.
  • In einigen Fällen weist der Fusionspartner eine enzymatische Aktivität auf, die ein mit der Target-Nukleinsäure assoziiertes Protein (z. B. ssRNA, dsRNA, ssDNA, dsDNA) (z. B. ein Histon, ein RNA-Bindungsprotein, ein DNA-Bindungsprotein und dergleichen) modifiziert. Beispiele für enzymatische Aktivität (die ein mit einer Target-Nukleinsäure assoziiertes Protein modifiziert), die durch den Fusionspartner bereitgestellt werden kann, beinhalten unter anderem: Methyltransferaseaktivität, wie etwa die, welche durch eine Histonmethyltransferase (HMT) bereitgestellt wird (z. B. Suppressor von Variegation 3-9 Homolog 1 (SUV39H1, auch bekannt als KMT1A), euchromatische Histon-Lysin-Methyltransferase 2 (G9A, auch bekannt als KMT1C und EHMT2), SUV39H2, ESET/SETDB1 und dergleichen, SET1A, SET1B, MLL1 bis 5, ASH1, SYMD2, NSD1, DOT1L, Pr-SET7/8, SUV4-20H1, EZH2, RIZ1), Demethylaseaktivität, wie etwa die, welche durch eine Histondemethylase bereitgestellt wird (z. B. Lysin-Demethylase 1A (KDM1A, auch bekannt als LSD1), JHDM2a/b, JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, JARID1A/RBP2, JARID1B/PLU-1, JARIDIC/SMCX, JARID1D/SMCY, UTX, JMJD3 und dergleichen), Acetyltransferaseaktivität, wie etwa die, welche durch eine Histonacetylasetransferase bereitgestellt wird (z. B. katalytischer Kern/Fragment der humanen Acetyltransferase p300, GCN5, PCAF, CBP, TAF1, TIP60/PLIP, MOZ/MYST3, MORF/MYST4, HB01/MYST2, HMOF/MYST1, SRC1, ACTR, P160, CLOCK und dergleichen), Deacetylaseaktivität, wie etwa die, welche durch eine Histondeacetylase bereitgestellt wird (z. B. HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8, HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9, SIRT1, SIRT2, HDAC11 und dergleichen), Kinaseaktivität, Phosphataseaktivität, Ubiquitinligaseaktivität, Deubiquitinierungsaktivität, Adenylierungsaktivität, Deadenylierungsaktivität, SUMOylierungsaktivität, DeSUMOylierungsaktivität, Ribosylierungsaktivität, Deribosylierungsaktivität, Myristoylierungsaktivität und Demyristoylierungsaktivität.
  • Zusätzliche Beispiele für geeignete Fusionspartner sind die Destabilisierungsdomäne der Dihydrofolatreduktase (DHFR) (z. B. zur Erzeugung eines chemisch kontrollierbaren Cas12J-Fusionsproteins) und ein Chloroplasten-Transitpeptid. Geeignete Chloroplasten-Transitpeptide beinhalten unter anderem:
  MASMISSSAVTTVSRASRGQSAAMAPFGGLKSMTGFPVRKVNTDITSITS
 NGGRVKCMQVWPPIGKKKFETLSYLPPLTRDSRA (SEQ ID NO: 25);
MASMISSSAVTTVSRASRGQSAAMAPFGGLKSMTGFPVRKVNTDITSITSNGGR
 VKS (SEQ ID NO: 26);
MASSMLSSATMVASPAQATMVAPFNGLKSSAAFPATRKANNDITSITSNGGRVN
 CMQVWPPIEKKKFETLSYLPDLTDSGGRVNC (SEQ ID NO: 27);
MAQVSRICNGVQNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSG
 MTLIGSELRPLKVMSSVSTAC (SEQ ID NO: 28);
MAQVSRICNGVWNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSG
 MTLIGSELRPLKVMSSVSTAC (SEQ ID NO: 29); 


MAQINNMAQGIQTLNPNSNFHKPQVPKSSSFLVFGSKKLKNSANSMLVLKKDSI
 FMQLFCSFRISASVATAC (SEQ ID NO: 30);
MAALVTSQLATSGTVLSVTDRFRRPGFQGLRPRNPADAALGMRTVGASAAPKQ
 SRKPHRFDRRCLSMVV (SEQ ID NO: 31);
MAALTTSQLATSATGFGIADRSAPSSLLRHGFQGLKPRSPAGGDATSLSVTTSAR
 ATPKQQRSVQRGSRRFPSVVVC (SEQ ID NO: 32);
MASSVLSSAAVATRSNVAQANMVAPFTGLKSAASFPVSRKQNLDITSIASNGGR
 VQC (SEQ ID NO: 33);
MESLAATSVFAPSRVAVPAARALVRAGTVVPTRRTSSTSGTSGVKCSAAVTPQA
 SPVISRSAAAA (SEQ ID NO: 34); und
MGAAATSMQSLKFSNRLVPPSRRLSPVPNNVTCNNLPKSAAPVRTVKCCASSW
 NSTINGAAATTNGASAASS (SEQ ID NO: 35).
  • In einigen Fällen umfasst ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung: a) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und b) ein Chloroplasten-Transitpeptid. So kann beispielsweise ein Cas12J-Polypeptid/Guide-RNA-Komplex auf den Chloroplasten gerichtet sein. In einigen Fällen kann dieses Targeting durch das Vorhandensein einer N-terminalen Verlängerung erreicht werden, die als Chloroplasten-Transitpeptid (CTP) oder Plastid-Transitpeptid bezeichnet wird. Chromosomale Transgene aus Bakterienquellen müssen eine Sequenz aufweisen, die eine CTP-Sequenz codiert, die an eine Sequenz kondensiert ist, die ein exprimiertes Polypeptid codiert, wenn das exprimierte Polypeptid in dem Pflanzenplastid (z. B. Chloroplast) unterteilt werden soll. Dementsprechend wird die Lokalisierung eines exogenen Polypeptids an einen Chloroplasten häufig durch die funktionelle Verknüpfung einer Polynukleotidsequenz, die eine CTP-Sequenz codiert, mit der 5'-Region eines Polynukleotids, das das exogene Polypeptid codiert, erreicht. Das CTP wird in einem Prozessierungsschritt während der Translokation in das Plastid entfernt. Die Prozessierungseffizienz kann jedoch durch die Aminosäuresequenz des CTP und benachbarte Sequenzen am Aminoterminus (NH2-Terminus) des Peptids beeinflusst werden. Andere Optionen für das Targeting auf den Chloroplasten, die beschrieben wurden, sind die Mais-cab-m7-Signalsequenz ( US-Patent Nr. 7,022,896 , WO 97/41228 ), eine Erbsenglutathionreduktase-Signalsequenz ( WO 97/41228 ) und das in US2009029861 beschriebene CTP.
  • In einigen Fällen kann ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung Folgendes umfassen: a) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und b) ein endosomales Escape-Peptid. In einigen Fällen umfasst ein endosomales Escape-Polypeptid die Aminosäuresequenz GLFXALLXLLXSLWXLLLXA (SEQ ID NO: 36), wobei jedes X unabhängig aus Lysin, Histidin und Arginin ausgewählt ist. In einigen Fällen umfasst ein endosomales Escape-Polypeptid die Aminosäuresequenz GLFHALLELLHSLWTILLLHA (SEQ ID NO: 37).
  • Beispiele für einige der vorstehenden Fusionspartner (und mehr), die im Zusammenhang mit Fusionen mit Cas9, Zinkfinger und/oder TALE-Proteinen (zur ortsspezifischen Modifikation des Target-Kerns, Modulation der Transkription und/oder Target-Proteinmodifikation, z. B. Histonmodifikation) verwendet werden, siehe z. B.: Nomura et al, J Am Chem Soc. 18. Jul 2007;129(28):8676-7; Rivenbark et al., Epigenetics. Apr 2012; 7(4):350-60; Nucleic Acids Res. 8. Jul 2016; 44(12):5615-28; Gilbert et al., Cell. 18. Jul 2013; 154(2):442-51; Kearns et al., Nat Methods. Mai 2015; 12(5):401-3; Mendenhall et al., Nat Biotechnol. Dez 2013; 31(12):1133-6; Hilton et al., Nat Biotechnol. Mai 2015; 33(5):510-7; Gordley et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 31. März 2009; 106(13):5053-8; Akopian et al., Proc Natl Acad Sci USA. 22. Jul 2003; 100(15):8688-91; Tan et., al., J Virol. Feb. 2006; 80(4):1939-48; Tan et al., Proc Natl Acad Sci USA. 14. Okt 2003; 100(21):11997-2002; Papworth et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 18. Feb 2003; 100(4):1621-6; Sanjana et al., Nat Protoc. 5. Jan 2012; 7(1):171-92; Beerli et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 8. Dez 1998; 95(25): 14628-33; Snowden et al., Curr Biol. 23. Dez 2002; 12(24):2159-66; Xu et.al., Xu et al., Cell Discov. 3. Mai 2016; 2:16009; Komor et al., Nature. 20. Apr 2016; 533(7603):420-4; Chaikind et al., Nucleic Acids Res. 11. Aug 2016; Choudhury at. al., Oncotarget. 23. Jun 2016; Du et al., Cold Spring Harb Protoc. 4. Jan 2016; Pham et al., Methods MolBiol. 2016; 1358:43-57; Balboa et al., Stem Cell Reports. 8. Sep 2015; 5(3):448-59; Hara et al., Sci Rep. 9. Jun 2015; 5:11221; Piatek et al., Plant Biotechnol J. Mai 2015; 13(4):578-89; Hu et al., Nucleic Acids Res. Apr 2014; 42(7):4375-90; Cheng et al., Cell Res. Okt 2013; 23(10):1163-71; und Maeder et al., Nat Methods. Okt 2013; 10(10):977-9.
  • Zusätzliche geeignete heterologe Polypeptide beinhalten unter anderem ein Polypeptid, das direkt und/oder indirekt für eine erhöhte oder verringerte Transkription und/oder Translation einer Target-Nukleinsäure sorgt (z. B. eines Transkriptionsaktivators oder eines Fragments davon, eines Proteins oder eines Fragments davon, das einen Transkriptionsaktivator rekrutiert, einen kleinen Molekül/Arzneimittelresponsiven Transkriptions- und/oder Translationsregulator, ein translatorisch regulierendes Protein usw.). Nicht einschränkende Beispiele für heterologe Polypeptide zur Erzielung einer erhöhten oder verringerten Transkription beinhalten Transkriptionsaktivator- und Transkriptionsrepressordomänen. In einigen solchen Fällen wird ein Cas12J-Fusionspolypeptid von der Guide-Nukleinsäure (Guide-RNA) auf eine bestimmte Position (d. h. eine Sequenz) in der Target-Nukleinsäure gerichtet und übt eine locusspezifische Regulation aus, wie etwa das Blockieren der Bindung der RNA-Polymerase an einen Promotor (die selektiv die Transkriptionsaktivatorfunktion hemmt) und/oder das Modifizieren des lokalen Chromatinstatus (z. B. wenn eine Fusionssequenz verwendet wird, die die Target-Nukleinsäure modifiziert oder ein mit der Target-Nukleinsäure assoziiertes Polypeptid modifiziert). In einigen Fällen sind die Änderungen vorübergehend (z. B. Repression oder Aktivierung der Transkription). In einigen Fällen sind die Änderungen vererbbar (z. B. wenn epigenetische Modifikationen an der Target-Nukleinsäure oder an Proteinen vorgenommen werden, die mit der Target-Nukleinsäure assoziiert sind, z. B. nukleosomale Histone).
  • Nicht einschränkende Beispiele für heterologe Polypeptide zur Verwendung beim Targeting von ssRNA-Target-Nukleinsäuren beinhalten (unter anderem): Spleißfaktoren (z. B. RS-Domänen); Proteintranslationskomponenten (z. B. Faktoren zur Initiierung, Verlängerung und/oder Freisetzung der Translation; z. B. eIF4G); RNA-Methylasen; RNA-Editing-Enzyme (z. B. RNA-Desaminasen, z. B. Adenosindeaminase, die auf RNA (ADAR) einwirkt, einschließlich A bis I und/oder C bis U-Editing-Enzyme); Helikasen; RNA-bindende Proteine; und dergleichen. Es versteht sich, dass ein heterologes Polypeptid das gesamte Protein oder in einigen Fällen ein Fragment des Proteins (z. B. eine funktionelle Domäne) enthalten kann.
  • Das heterologe Polypeptid eines zugrundeliegenden Casl2J-Fusionspolypeptids kann eine beliebige Domäne sein, die in der Lage ist, mit ssRNA zu interagieren (was für die Zwecke dieser Offenbarung intramolekulare und/oder intermolekulare Sekundärstrukturen beinhaltet, z. B. doppelsträngige RNA-Doppelstränge wie etwa Haarnadeln, Stammschleifen usw.), ob vorübergehend oder irreversibel, direkt oder indirekt, einschließlich unter anderem eine Effektordomäne, ausgewählt aus der Gruppe umfassend; Endonukleasen (beispielsweise RNase III, die CRR22-DYW-Domäne, Dicer und PIN-Domänen (PilT N-Terminus) aus Proteinen wie etwa SMG5 und SMG6); Proteine und Proteindomänen, die für die Stimulierung der RNA-Spaltung verantwortlich sind (beispielsweise CPSF, CstF, CFIm und CFIIm); Exonukleasen (beispielsweise XRN-1 oder Exonuklease T); Deadenylasen (beispielsweise HNT3); Proteine und Proteindomänen, die für den Nonsense-vermittelten RNA-Zerfall verantwortlich sind (beispielsweise UPF1, UPF2, UPF3, UPF3b, RNP S1, Y14, DEK, REF2 und SRm160), Proteine und Proteindomänen, die für die Stabilisierung der RNA verantwortlich sind (beispielsweise PABP); Proteine und Proteindomänen, die für die Unterdrückung der Translation verantwortlich sind (beispielsweise Ago2 und Ago4); Proteine und Proteindomänen, die für die Stimulierung der Translation verantwortlich sind (beispielsweise Staufen); Proteine und Proteindomänen, die für die Modulation der Translation verantwortlich sind (z. B. dazu in der Lage sind) (z. B. Translationsfaktoren wie etwa Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren, Freisetzungsfaktoren usw., z. B. eIF4G); Proteine und Proteindomänen, die für die Polyadenylierung von RNA verantwortlich sind (beispielsweise PAP1, GLD-2 und Star-PAP); Proteine und Proteindomänen, die für die Polyuridinylierung von RNA verantwortlich sind (beispielsweise CI D1 und terminale Uridylattransferase); Proteine und Proteindomänen, die für die RNA-Lokalisierung verantwortlich sind (beispielsweise IMP1, ZBP1, She2p, She3p und Bicaudal-D); Proteine und Proteindomänen, die für die nukleare Retention von RNA verantwortlich sind (beispielsweise Rrp6); Proteine und Proteindomänen, die für den nuklearen Export von RNA verantwortlich sind (beispielsweise TAP, NXF1, THO, TREX, REF und Aly); Proteine und Proteindomänen, die für die Unterdrückung des RNA-Spleißens verantwortlich sind (beispielsweise PTB, Sam68 und hnRNP A1); Proteine und Proteindomänen, die für die Stimulierung des RNA-Spleißens verantwortlich sind (beispielsweise Serin/Arginin-reiche (SR-) Domänen); Proteine und Proteindomänen, die für die Verringerung der Transkriptionseffizienz verantwortlich sind (beispielsweise FUS (TLS)); und Proteine und Proteindomänen, die für die Stimulierung der Transkription verantwortlich sind (beispielsweise CDK7 und HIV Tat). Alternativ kann die Effektordomäne ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend Endonukleasen; Proteine und Proteindomänen, die die RNA-Spaltung stimulieren können; Exonukleasen; Deadenylasen; Proteine und Proteindomänen mit Nonsense-vermittelter RNA-Zerfallsaktivität; Proteine und Proteindomänen, die in der Lage sind, RNA zu stabilisieren; Proteine und Proteindomänen, die die Translation unterdrücken können; Proteine und Proteindomänen, die die Translation stimulieren können; Proteine und Proteindomänen, die die Translation modulieren können (z. B. Translationsfaktoren wie etwa Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren, Freisetzungsfaktoren usw., z. B. eIF4G); Proteine und Proteindomänen, die zur Polyadenylierung von RNA fähig sind; Proteine und Proteindomänen, die zur Polyuridinylierung von RNA fähig sind; Proteine und Proteindomänen mit RNA-Lokalisierungsaktivität; Proteine und Proteindomänen, die zur nuklearen Retention von RNA fähig sind; Proteine und Proteindomänen mit RNA-Kernexportaktivität; Proteine und Proteindomänen, die das RNA-Spleißen unterdrücken können; Proteine und Proteindomänen, die das RNA-Spleißen stimulieren können; Proteine und Proteindomänen, die die Effizienz der Transkription verringern können; und Proteine und Proteindomänen, die die Transkription stimulieren können. Ein weiteres geeignetes heterologes Polypeptid ist eine PUF-RNA-Bindungsdomäne, die ausführlicher in WO2012068627 beschrieben ist, auf die hiermit in ihrer Gesamtheit Bezug genommen wird.
  • Einige RNA-Spleißfaktoren, die (als Ganzes oder als Fragmente davon) als heterologe Polypeptide für ein Cas12J-Fusionspolypeptid verwendet werden können, sind modular organisiert, mit separaten sequenzspezifischen RNA-Bindungsmodulen und Spleißeffektordomänen. Beispielsweise enthalten Mitglieder der Serin/Arginin-reichen (SR) Proteinfamilie N-terminale RNA-Erkennungsmotive (RRM), die an exonische Spleißverstärker (ESE) in prä-mRNA und C-terminalen RS-Domänen binden, die den Exon-Einschluss fördern. Als weiteres Beispiel bindet das hnRNP-Protein hnRNP A1 über seine RRM-Domänen an exonische Spleißschalldämpfer (ESS) und hemmt den Exon-Einschluss über eine C-terminale Glycin-reiche Domäne. Einige Spleißfaktoren können die alternative Verwendung von Spleißstellen regulieren, indem sie an regulatorische Sequenzen zwischen den beiden alternativen Stellen binden. Beispielsweise, ASF/SF2 kann ESE erkennen und die Verwendung von proximalen Intronstellen fördern, während hnRNP A1 an ESS binden und das Spleißen in Richtung der Verwendung von distalen Intronstellen verschieben kann. Eine Anwendung für solche Faktoren ist die Erzeugung von ESF, die das alternative Spleißen endogener Gene, insbesondere krankheitsassoziierter Gene, modulieren. Beispielsweise erzeugt Bcl-x-prä-mRNA zwei Spleißisoformen mit zwei alternativen 5'-Spleißstellen, um Proteine mit entgegengesetzten Funktionen zu codieren. Die lange Spleißisoform Bcl-xL ist ein starker Apoptosehemmer, der in langlebigen postmitotischen Zellen exprimiert wird und in vielen Krebszellen hochreguliert ist, wodurch die Zellen vor apoptotischen Signalen geschützt werden. Die kurze Isoform Bcl-xS ist eine proapoptotische Isoform und wird in hohen Mengen in Zellen mit einer hohen Umsatzrate (z. B. sich entwickelnden Lymphozyten) exprimiert. Das Verhältnis der beiden Bcl-x-Spleißisoformen wird durch mehrere cώ-Elemente reguliert, die sich entweder in der Kern-Exon-Region oder in der Exon-Verlängerungsregion befinden (d. h. zwischen den beiden alternativen 5'-Spleißstellen). Für weitere Beispiele siehe WO2010075303 , auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
  • Weitere geeignete Fusionspartner beinhalten unter anderem Proteine (oder Fragmente davon), die Grenzelemente sind (z. B. CTCF), Proteine und Fragmente davon, die eine Rekrutierung der Peripherie ermöglichen (z. B. Lamin A, Lamin B usw.), Protein Docking-Elemente (z. B. FKBP/FRB, Pil1/Aby1 usw.).
  • Nukleasen
  • In einigen Fällen umfasst ein zugrundeliegendes Cas12J-Fusionspolypeptid: i) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und ii) ein heterologes Polypeptid (einen „Fusionspartner“), wobei das heterologe Polypeptid eine Nuklease ist. Geeignete Nukleasen beinhalten unter anderem ein Homing-Nuklease-Polypeptid; ein FokI-Polypeptid; ein Transkriptionsaktivator-ähnliches Effektor-Nuklease (TALEN)-Polypeptid; ein MegaTAL-Polypeptid; ein Meganuclease-Polypeptid; eine Zinkfinger-Nuklease (ZFN); eine ARCUS-Nuklease; und dergleichen. Die Meganuklease kann aus einer LADLIDADG-Homing-Endonuklease (LHE) hergestellt sein. Ein MegaTAL-Polypeptid kann eine TALE-DNA-Bindungsdomäne und eine manipulierte Meganuclease umfassen. Siehe z. B. WO 2004/067736 (Homing-Endonuklease); Urnov et al. (2005) Nature 435:646 (ZFN); Mussolino et al. (2011) Nucle. Acids Res. 39:9283 (TALE-Nuklease); Boissel et al. (2013) Nucl. Acids Res. 42:2591 (MegaTAL).
  • Reverse Transkriptasen
  • In einigen Fällen umfasst ein zugrundeliegendes Cas12J-Fusionspolypeptid: i) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und ii) ein heterologes Polypeptid (einen „Fusionspartner“), wobei das heterologe Polypeptid ein reverses Transkriptase-Polypeptid ist. In einigen Fällen ist das Cas12J-Polypeptid katalytisch inaktiv. Geeignete reverse Transkriptasen beinhalten z. B. eine reverse Transkriptase des murinen Leukämievirus; eine reverse Transkriptase des Rous-Sarkom-Virus; eine reverse Transkriptase des humanen Immundefizienzvirus Typ I; eine reverse Transkriptase des Moloney-Mausleukämievirus; und dergleichen.
  • Basen-Editoren
  • In einigen Fällen umfasst ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung: i) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und ii) ein heterologes Polypeptid (einen „Fusionspartner“), wobei das heterologe Polypeptid ein Basen-Editor ist. Geeignete Basen-Editoren beinhalten z. B. eine Adenosindeaminase; eine Cytidin-Desaminase (z. B. eine aktivierungsinduzierte Cytidin-Desaminase (AID)); APOBEC3G; und dergleichen); und dergleichen.
  • Eine geeignete Adenosindeaminase ist ein beliebiges Enzym, das Adenosin in DNA desaminieren kann. In einigen Fällen ist die Desaminase eine TadA-Desaminase.
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Aminosäuresequenz:
    • MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRH
 DPTAHAEIMALRQGGL VMQNYRLIDATL YVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFG
 ARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKA
 QKKAQSSTD (SEQ ID NO: 38)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Aminosäuresequenz:
    • MRRAFITGVFFLSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIG
 EGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMI
 HSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFF
 RMRRQEIKAQKKAQSSTD (SEQ ID NO: 39)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Staphylococcus aureus-TadA-Aminosäuresequenz:
    • MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPT
 AHAEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDP
 KGGCSGSLMNLLQQSNFNHRAIVDKGVLKEACSTLL TTFFK
 NLRANKKSTN(SEQ ID NO: 40)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Bacillus subtilis-TadA-Aminosäuresequenz:
    • MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAE
 MLVIDEACKALGTWRLEGATLYVTLEPCPMCAGAVVLSRVEKVVFGAFDPKG
 GCSGTLMNLLQEERFNHQAEWSGVLEEECGGMLSAFFRELRKKKKAARKNLS
 E (SEQ ID NO: 41)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Salmonella typhimurium-TadA:
    • MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVI
 GEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGA
 MVHSRIGRVW GARD AKT GAAGSLID VLHHPGMNHRVEIIEGVLRDEC ATLLSD
 FFRMRRQEIKALKKADRAEGAGPAV (SEQ ID NO: 42)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Shewanella putrefaciens-TadA-Aminosäuresequenz:
    • MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAH
 AEILCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARWYGARDEKT
 GAAGTVVNLLQHPAFNHQVEVTS GVLAEAC SAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQR
 AQQGIE (SEQ ID NO: 43)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Haemophilus influenzae-F3031-TadA-Aminosäuresequenz:
    • MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSI
 VQSDPTAHAEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVF
 GASDYKTGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLS
 TFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK (SEQ ID NO: 44)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Caulobacter crescentus-TadA-Aminosäuresequenz:
    • MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGA VILDPSTGEVIATAGNGPI
 AAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLWTLEPCAMCAGAISHARIGRV
 VFGADDPKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRK
 AKI (SEQ ID NO: 45)
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Adenosindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Geobacter sulfurreducens-TadA-Aminosäuresequenz:
    • MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLRE
 GSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERW
 FGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRK
 KAKATPALFIDERKVPPEP (SEQ ID NO: 46)
  • Cytidin-Desaminasen, die zum Einschluss in ein CRISPR/Cas-Effektorpolypeptid-Fusionspolypeptid geeignet sind, enthalten ein beliebiges Enzym, das Cytidin in DNA desaminieren kann.
  • In einigen Fällen ist die Cytidin-Desaminase eine Desaminase aus der Familie der Desaminasen des Apolipoprotein B-mRNA-Editing-Komplexes (APOBEC). In einigen Fällen ist die APOBEC-Familien-Deaminase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus APOBECI-Deaminase, APOBEC2-Ddeaminase, APOBEC3A-Deaminase, APOBEC3B-Deaminase, APOBEC3C-Deaminase, APOBEC3D-Deaminase, APOBEC3F-Deaminase, APOBEC3G-Deaminase und APOBEC3H-deaminase. In einigen Fällen ist die Cytidin-Desaminase eine aktivierungsinduzierte Desaminase (AID).
  • In einigen Fällen umfasst eine geeignete Cytidindeaminase eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Aminosäuresequenz:
    •   MD SLLMNRRKFLYQFKNYRWAKGRRETYLCYWKRRD SAT SFSLDFGYLRNK
 NGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLS
 LRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTF
 KAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL (SEQ ID NO: 47)
  • In einigen Fällen ist eine geeignete Cytidindeaminase eine AID und umfasst eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Aminosäuresequenz: mdsllmnrrk flyqfknvrw akgrretylc yvvkrrdsat sfsldfgylr nkngchvell flryisdwdl dpgrcyrvtw ftswspcydc arhvadflrg npnlslrift arlyfcedrk aepeglrrlh ragvqiaimt fkenhertfk aweglhensv rlsrqlrril lplyevddlr dafrtlgl (SEQ ID NO: 48).
  • In einigen Fällen ist eine geeignete Cytidindeaminase eine AID und umfasst eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 98 %, mindestens 99 % oder 100 % zu der folgenden Aminosäuresequenz: mdsllmnrrk flyqfknvrw akgrretylc yvvkrrdsat sfsldfgylr nkngchvell flryisdwdl dpgrcyrvtw ftswspcydc arhvadflrg npnlslrift arlyfcedrk aepeglrrlh ragvqiaimt fkdyfycwnt fvenhertfk aweglhensv rlsrqlrril lplyevddlr dafrtlgl (SEQ ID NO: 47).
  • Transkriptionsfaktoren
  • In einigen Fällen umfasst ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung: i) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und ii) ein heterologes Polypeptid (einen „Fusionspartner“), wobei das heterologe Polypeptid ein Transkriptionsfaktor ist. Ein Transkriptionsfaktor kann Folgendes enthalten: i) eine DNA-Bindungsdomäne; und ii) einen Transkriptionsaktivator. Ein Transkriptionsfaktor kann Folgendes enthalten: i) eine DNA-Bindungsdomäne; und ii) einen Transkriptionsrepressor. Geeignete Transkriptionsfaktoren enthalten Polypeptide, die einen Transkriptionsaktivator oder eine Transkriptionsrepressordomäne enthalten (z. B. die Kruppel-assoziierte Box (KRAB oder SKD), die Mad-mSIN3-Interaktionsdomäne (SID), die ERF-Repressordomäne (ERD) usw.); künstliche Transkriptionsfaktoren auf Zinkfinger-Basis (siehe z.B. Sera (2009) Adv. Drug Deliv. 61:513); TALE-basierte künstliche Transkriptionsfaktoren (siehe z. B. Liu et al. (2013) Nat. Rev. Genetics 14:781); und dergleichen. In einigen Fällen umfasst der Transkriptionsfaktor ein VP64-Polypeptid (Transkriptionsaktivierung). In einigen Fällen umfasst der Transkriptionsfaktor ein Krüppel-assoziierte Box (KRAB)-Polypeptid (Transkriptionsrepression). In einigen Fällen umfasst der Transkriptionsfaktor ein MadmSIN3-Interaktionsdomäne (SID)-Polypeptid (Transkriptionsrepression). In einigen Fällen umfasst der Transkriptionsfaktor ein ERF-Repressordomänen (ERD)-Polypeptid (Transkriptionsrepression). Beispielsweise ist in einigen Fällen der Transkriptionsfaktor ein Transkriptionsaktivator, wobei der Transkriptionsaktivator GAL4-VPI6 ist.
  • Rekombinasen
  • In einigen Fällen umfasst ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung: i) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und ii) ein heterologes Polypeptid (einen „Fusionspartner“), wobei das heterologe Polypeptid eine Rekombinase ist. Geeignete Rekombinasen enthalten z. B. eine Cre-Rekombinase; eine Hin-Rekombinase; eine Tre-Rekombinase; eine FLP-Rekombinase; und dergleichen.
  • Beispiele für verschiedene zusätzliche geeignete heterologe Polypeptide (oder Fragmente davon) für ein zugrundeliegendes Cas12J-Fusionspolypeptid beinhalten unter anderem solche, die in den folgenden Anmeldungen beschrieben sind (deren Veröffentlichungen sich auf andere CRISPR-Endonukleasen wie etwa Cas9 beziehen, die beschriebenen Fusionspartner aber auch mit Cas12J verwendet werden können): PCT-Patentanmeldungen: WO2010075303 , WO2012068627 und WO2013155555 und finden sich beispielsweise in US-Patenten und Patentanmeldungen: 8,906,616 ; 8,895,308 ; 8,889,418 ; 8,889,356 ; 8,871,445 ; 8,865,406 ; 8,795,965 ; 8,771,945 ; 8,697,359 ; 20140068797 ; 20140170753 ; 20140179006 ; 20140179770 ; 20140186843 ; 20140186919 ; 20140186958 ; 20140189896 ; 20140227787 ; 20140234972 ; 20140242664 ; 20140242699 ; 20140242700 ; 20140242702 ; 20140248702 ; 20140256046 ; 20140273037 ; 20140273226 ; 20140273230 ; 20140273231 ; 20140273232 ; 20140273233 ; 20140273234 ; 20140273235 ; 20140287938 ; 20140295556 ; 20140295557 ; 20140298547 ; 20140304853 ; 20140309487 ; 20140310828 ; 20140310830 ; 20140315985 ; 20140335063 ; 20140335620 ; 20140342456 ; 20140342457 ; 20140342458 ; 20140349400 ; 20140349405 ; 20140356867 ; 20140356956 ; 20140356958 ; 20140356959 ; 20140357523 ; 20140357530 ; 20140364333 ; und 20140377868 ; welche hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
  • In einigen Fällen sorgt ein heterologes Polypeptid (ein Fusionspartner) für eine subzelluläre Lokalisierung, d. h. das heterologe Polypeptid enthält eine subzelluläre Lokalisierungssequenz (z. B. ein Kernlokalisierungssignal (NLS) zum Targeting auf den Kern, eine Sequenz zum Halten des Fusionsproteins außerhalb des Kerns, z. B. eine Kernexportsequenz (NES), eine Sequenz, um das Fusionsprotein im Zytoplasma zurückzuhalten, ein mitochondriales Lokalisierungssignal zum Targeting auf die Mitochondrien, ein Chloroplastenlokalisierungssignal zum Targeting auf einen Chloroplasten, eine ER-Rückhaltesignal und dergleichen). In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Fusionspolypeptid kein NLS, so dass das Protein nicht auf den Kern gerichtet ist (was vorteilhaft sein kann, z. B. wenn die Target-Nukleinsäure eine im Cytosol vorhandene RNA ist). In einigen Fällen kann das heterologe Polypeptid ein Tag bereitstellen (d. h. das heterologe Polypeptid ist eine nachweisbare Markierung), um die Verfolgung und/oder Reinigung zu erleichtern (z. B. ein fluoreszierendes Protein, z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP), gelb fluoreszierendes Protein (YFP), rot fluoreszierendes Protein (RFP), cyan fluoreszierendes Protein (CFP), mCherry, tdTomato und dergleichen; ein Histidin-Tag, z. B. ein 6XHis-Tag, ein Hämagglutinin (HA)-Tag, ein FLAG-Tag, ein Myc-Tag und dergleichen).
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (z. B. ein Wildtyp-Cas 12J-Protein, ein variantes Cas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein, ein dCas12J-Protein und dergleichen) ein Kernlokalisierungssignal (NLS) (z. B. in einigen Fällen 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS) (oder ist damit kondensiert). Somit enthält ein Cas12J-Polypeptid in einigen Fällen ein oder mehrere NLS (z. B. 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS). In einigen Fällen sind ein oder mehrere NLS (2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS) an dem oder in der Nähe (z. B. innerhalb von 50 Aminosäuren) des N-Terminus und/oder C-Terminus positioniert. In einigen Fällen sind ein oder mehrere NLS (2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS) an dem oder in der Nähe (z. B. innerhalb von 50 Aminosäuren) des N-Terminus positioniert. In einigen Fällen sind ein oder mehrere NLS (2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS) an dem oder in der Nähe (z. B. innerhalb von 50 Aminosäuren) des C-Terminus positioniert. In einigen Fällen sind ein oder mehrere NLS (3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS) sowohl an dem oder in der Nähe (z. B. innerhalb von 50 Aminosäuren) des N-Terminus als auch des C-Terminus positioniert. In einigen Fällen befindet sich ein NLS am N-Terminus und ein NLS am C-Terminus.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (z. B. ein Wildtyp-Cas 12J-Protein, ein variantes Cas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein, ein dCas12J-Protein und dergleichen) zwischen 1 und 10 NLS (z. B. 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6 oder 2-5 NLS) (oder ist damit kondensiert). In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Protein (z. B. ein Wildtyp-Cas12J-Protein, ein variantes Cas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein, ein dCas12J-Protein und dergleichen) zwischen 2 und 5 NLS (z. B. 2-4 oder 2-3 NLS) (oder ist damit kondensiert).
  • Nicht einschränkende Beispiele für NLS beinhalten eine NLS-Sequenz, abgeleitet von: dem NLS des großen T-Antigens des SV40-Virus mit der Aminosäuresequenz PKKKRKV (SEQ ID NO: 49); dem NLS aus Nukleoplasmin (z. B. das bipartite NLS aus Nukleoplasmin mit der Sequenz KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 50)); dem c-myc-NLS mit der Aminosäuresequenz PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 51) oder RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 52); dem hRNPA1 M9 NLS mit der Sequenz NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 53); der Sequenz RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: 54) der IBB-Domäne aus Importin-Alpha; den Sequenzen VSRKRPRP (SEQ ID NO: 55) und PPKKARED (SEQ ID NO: 98) des Myom-T-Proteins; der Sequenz PQPKKKPL (SEQ ID NO: 56) von menschlichem p53; der Sequenz SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: 57) von Maus-c-abl IV; den Sequenzen DRLRR (SEQ ID NO: 58) und PKQKKRK (SEQ ID NO: 59) des Influenzavirus NS1; der Sequenz RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: 60) des Hepatitis-Virus-Delta-Antigens; der Sequenz REKKKFLKRR (SEQ ID NO: 61) des Maus-Mx1-Proteins; der Sequenz KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: 62) der menschlichen Poly (ADP-Ribose)-Polymerase; und der Sequenz RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: 63) der Steroidhormonrezeptoren (menschlich) Glucocorticoid. Im Allgemeinen sind NLS (oder mehrere NLS) von ausreichender Stärke, um die Akkumulation des Cas12J-Proteins in einer nachweisbaren Menge im Kern einer eukaryotischen Zelle voranzutreiben. Der Nachweis der Akkumulation im Kern kann durch jede geeignete Technik durchgeführt werden.
  • Beispielsweise kann ein nachweisbarer Marker an das Cas12J-Protein kondensiert werden, so dass die Position innerhalb einer Zelle sichtbar gemacht werden kann. Zellkerne können auch aus Zellen isoliert werden, deren Inhalt dann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren zum Nachweis von Protein analysiert werden kann, wie etwa Immunhistochemie, Western Blot oder Enzymaktivitätsassay. Die Akkumulation im Kern kann auch indirekt bestimmt werden.
  • In einigen Fällen enthält ein Cas12J-Fusionspolypeptid eine „Proteintransduktionsdomäne“ oder PTD (auch als CPP - Zellpenetrationspeptid bekannt), die sich auf ein Polypeptid, Polynukleotid, Kohlenhydrat oder eine organische oder anorganische Verbindung bezieht, die das Durchqueren einer Lipiddoppelschicht, Mizelle, Zellmembran, Organellenmembran oder Vesikelmembran ermöglicht. Eine an ein anderes Molekül gebundene PTD, die von einem kleinen polaren Molekül bis zu einem großen Makromolekül und/oder einem Nanopartikel reichen kann, ermöglicht es dem Molekül, eine Membran zu durchqueren, beispielsweise vom extrazellulären Raum in den intrazellulären Raum oder von Cytosol in eine Organelle. In einigen Ausführungsformen ist eine PTD kovalent an den Amino-Terminus eines Polypeptids gebunden (z. B. an ein Wildtyp-Cas12J gebunden, um ein Fusionsprotein zu erzeugen, oder an ein variantes Cas12J-Protein wie etwa ein dCas12J-, Cas12J-Nickase- oder Casl2J-Fusionsprotein gebunden, um ein Fusionsprotein zu erzeugen). In einigen Ausführungsformen ist eine PTD kovalent an den Carboxyl-Terminus eines Polypeptids gebunden (z. B. an ein Wildtyp-Cas12J gebunden, um ein Fusionsprotein zu erzeugen, oder an ein variantes Cas12J-Protein wie etwa ein dCas12J-, Cas12J-Nickase- oder Cas12J-Fusionsprotein gebunden, um ein Fusionsprotein zu erzeugen). In einigen Fällen wird die PTD an einer geeigneten Insertionsstelle intern in das Cas12J-Fusionspolypeptid eingefügt (d. h. sie befindet sich nicht am N- oder C-Terminus des Cas12J-Fusionspolypeptids). In einigen Fällen beinhaltet ein zugrundeliegendes Cas12J-Fusionspolypeptid eine oder mehrere PTD (z. B. zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr PTD) (ist an diese konjugiert, ist an diese kondensiert). In einigen Fällen enthält eine PTD ein Kernlokalisierungssignal (NLS) (z. B. in einigen Fällen 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS). Somit enthält ein Cas12J-Fusionspolypeptid in einigen Fällen ein oder mehrere NLS (z. B. 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr oder 5 oder mehr NLS). In einigen Ausführungsformen ist eine PTD kovalent an eine Nukleinsäure gebunden (z. B. eine Cas12J-Guide-Nukleinsäure, ein Polynukleotid, das eine Cas12J-Guide-Nukleinsäure codiert, ein Polynukleotid, das ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, ein Donor-Polynukleotid usw.). Beispiele für PTD beinhalten unter anderem eine minimale Undecapeptid-Proteintransduktionsdomäne (entsprechend den Resten 47-57 von HIV-1 TAT, umfassend YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 64); eine Polyargininsequenz, umfassend eine Anzahl von Argininen, die ausreichen, um den Eintritt in eine Zelle zu lenken (z. B. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 10-50 Arginine); eine VP22-Domäne (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); eine Drosophila Antennapedia-Proteintransduktionsdomäne (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); ein verkürztes menschliches Calcitoninpeptid (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); Polylysin (Wender et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO: 65); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 66); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO: 67); und RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 68). Beispielhafte PTD beinhalten unter anderem YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 64), RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 70); ein Argininhomopolymer von 3 Argininresten bis 50 Argininresten. Beispielhafte Aminosäuresequenzen der PTD-Domäne beinhalten unter anderem eine beliebige der folgenden: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 64); RKKRRQRR (SEQ ID NO: 70); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 71); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO: 72); und GGRRARRRRRR (SEQ ID NO: 73). In einigen Ausführungsformen ist die PTD ein aktivierbares CPP (ACPP) (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1(5-6): 371-381). ACPP umfassen ein polykationisches CPP (z. B. Arg9 oder „R9“), das über einen spaltbaren Linker mit einem passenden Polyanion (z. B. Glu9 oder „E9“) verbunden ist, wodurch die Nettoladung auf nahezu Null reduziert wird und dadurch die Adhäsion und Aufnahme in Zellen gehemmt werden. Bei der Spaltung des Linkers wird das Polyanion freigesetzt, wodurch das Polyarginin und seine inhärente Haftfähigkeit lokal demaskiert werden, wodurch das ACPP „aktiviert“ wird, um die Membran zu durchqueren. Linker (z. B. für Fusionspartner)
  • In einigen Ausführungsformen kann ein zugrundeliegendes Cas12J-Protein über ein Linkerpolypeptid (z. B. ein oder mehrere Linkerpolypeptide) an einen Fusionspartner kondensiert sein. Das Linkerpolypeptid kann eine beliebige aus einer Vielzahl von Aminosäuresequenzen aufweisen. Proteine können durch ein Spacer-Peptid verbunden sein, das im Allgemeinen flexibler Natur ist, obwohl andere chemische Bindungen nicht ausgeschlossen sind. Geeignete Linker beinhalten Polypeptide mit einer Länge zwischen 4 Aminosäuren und 40 Aminosäuren oder mit einer Länge zwischen 4 Aminosäuren und 25 Aminosäuren. Diese Linker können unter Verwendung synthetischer, Linkercodierender Oligonukleotide hergestellt werden, um die Proteine zu koppeln, oder sie können durch eine Nukleinsäuresequenz codiert werden, die das Fusionsprotein codiert. Peptidlinker mit einem gewissen Grad an Flexibilität können verwendet werden. Die Linkerpeptide können praktisch eine beliebige Aminosäuresequenz aufweisen, wobei zu berücksichtigen ist, dass die bevorzugten Linker eine Sequenz aufweisen werden, die zu einem allgemein flexiblen Peptid führt. Die Verwendung kleiner Aminosäuren wie etwa Glycin und Alanin ist bei der Erzeugung eines flexiblen Peptids von Nutzen. Die Erstellung solcher Sequenzen ist für Fachleute Routine. Eine Vielzahl verschiedener Linker ist im Handel erhältlich und wird als zur Verwendung geeignet angesehen.
  • Beispiele für Linkerpolypeptide beinhalten Glycinpolymere (G)n, Glycin-Serin-Polymere (einschließlich beispielsweise (GS)n, GSGGSn (SEQ ID NO: 74), GGSGGSn (SEQ ID NO: 75) und GGGSn (SEQ ID NO: 76), wobei n eine ganze Zahl von mindestens eins ist), Glycin-Alanin-Polymere, Alanin-Serin-Polymere. Beispielhafte Linker können Aminosäuresequenzen umfassen, einschließlich unter anderem GGSG (SEQ ID NO: 77), GGSGG (SEQ ID NO: 78), GSGSG (SEQ ID NO: 79), GSGGG (SEQ ID NO: 80), GGGSG (SEQ ID NO: 81), GSSSG (SEQ ID NO: 82) und dergleichen. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass das Design eines Peptids, das an ein beliebiges gewünschtes Element konjugiert ist, Linker umfassen kann, die alle oder teilweise flexibel sind, sodass der Linker einen flexiblen Linker sowie einen oder mehrere Teile, die eine weniger flexible Struktur verleihen, beinhalten kann.
  • Nachweisbare Markierung
  • In einigen Fällen umfasst ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung eine nachweisbare Markierung. Geeignete nachweisbare Markierungen und/oder Einheiten, die ein nachweisbares Signal bereitstellen können, können unter anderem ein Enzym, ein Radioisotop, ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars; ein Fluorophor; ein fluoreszierendes Protein; ein Quantenpunkt; und dergleichen beinhalten.
  • Geeignete fluoreszierende Proteine beinhalten unter anderem grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder Varianten davon, blau fluoreszierende Variante von GFP (BFP), cyan fluoreszierende Variante von GFP (CFP), gelb fluoreszierende Variante von GFP (YFP), verstärktes GFP (EGFP), verstärktes CFP (ECFP), verstärktes YFP (EYFP), GFPS65T, Emerald, Topaz (TYFP), Venus, Citrine, mCitrine, GFPuv, destabilisiertes EGFP (dEGFP), destabilisiertes ECFP (dECFP), destabilisiertes EYFP (dEYFP), mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-Monomer, J-Rot, Dimer2, t-Dimer2 (12), mRFP1, Pocilloporin, Renilla GFP, Monster GFP, paGFP, Kaede-Protein und Kindling-Protein, Phycobiliproteine und Phycobiliprotein-Konjugate, einschließlich B-Phycoerythrin, R-Phycoerythrin und Allophycocyanin. Andere Beispiele für fluoreszierende Proteine umfassen mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrape1, mRaspberry, mGrape2, mPlum (Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909) und dergleichen. Beliebige fluoreszierende und gefärbte Proteine von Anthozoan-Arten, wie z. B. in Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973, sind zur Verwendung geeignet.
  • Geeignete Enzyme beinhalten unter anderem Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase (AP), Beta-Galactosidase (GAL), Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Beta-N-Acetylglucosaminidase, β-Glucuronidase, Invertase, Xanthin Oxidase, Firefly-Luciferase, Glucoseoxidase (GO) und dergleichen.
  • Protospacer Adjacent Motif (PAM)
  • Ein Cas12J-Protein bindet an Target-DNA an einer Target-Sequenz, die durch den Bereich der Komplementarität zwischen der DNA-abzielenden RNA und der Target-DNA definiert ist. Wie bei vielen CRISPR-Endonukleasen erfolgt die stellenspezifische Bindung (und/oder die Spaltung) einer doppelsträngigen Target-DNA an Positionen, die sowohl durch (i) Basenpaarungskomplementarität zwischen der Guide-RNA und der Target-DNA; und (ii) ein kurzes Motiv [bezeichnet als Protospacer Adjacent Motif (PAM)] in der Target-DNA bestimmt werden.
  • In einigen Ausführungsformen ist das PAM für ein Cas12J-Protein unmittelbar 5' der Target-Sequenz des nichtkomplementären Strangs der Target-DNA (der komplementäre Strang: (i) hybridisiert mit der Guide-Sequenz der Guide-RNA, während der nichtkomplementäre Strang nicht direkt mit der Guide-RNA hybridisiert; und (ii) ist das reverse Komplement des nichtkomplementären Strangs.
  • In einigen Fällen (z. B. wenn Cas12J-1947455 - hierin auch bezeichnet als „Ortholog #1“ - wie hierin beschrieben verwendet wird) ist die PAM-Sequenz des nichtkomplementären Strangs 5'-VTTR-3' (wobei V G, A oder C ist und R A oder G ist) - siehe z. B. 13A. Daher können in einigen Fällen geeignete PAM GTTA, GTTG, ATTA, ATTG, CTTA und CTTG enthalten.
  • In einigen Fällen (z. B. wenn Cas12J-2071242 - hierin auch bezeichnet als „Ortholog #2“ - wie hierin beschrieben verwendet wird) ist die PAM-Sequenz des nichtkomplementären Strangs 5'-TBN-3' (wobei B T, C oder G ist) - siehe z. B. 13A. Somit können in einigen Fällen geeignete PAM TTA, TTC, TTT, TTG, TCA, TCC, TCT, TCG, TGA, TGC, TGT und TGG enthalten. In einigen Ausführungsformen (z. B. wenn Cas12J-2071242 - hierin auch bezeichnet als „Ortholog #2“ - wie hierin beschrieben verwendet wird) ist die PAM-Sequenz des nichtkomplementären Strangs 5'-TNN-3'.
  • In einigen Fällen (z. B. wenn Cas12J-3339380 - hierin auch bezeichnet als „Ortholog #3“ - wie hierin beschrieben verwendet wird) ist die PAM-Sequenz des nichtkomplementären Strangs 5'-VTTB-3' (wobei V G, A oder C ist und B T, C oder G ist) - siehe z. B. 13A. Daher können in einigen Fällen geeignete PAM GTTT, GTTC, GTTG, ATTT, ATTC, ATTG, CTTT, CTTC, CTTG enthalten. In einigen Fällen (z. B. wenn Cas12J-3339380 - hierin auch bezeichnet als „Ortholog #3“ - wie hierin beschrieben verwendet wird) ist die PAM-Sequenz des nichtkomplementären Strangs 5'-NTTN-3'. In einigen Fällen (z. B. wenn Cas12J-3339380 - hierin auch bezeichnet als „Ortholog #3“ - wie hierin beschrieben verwendet wird) ist die PAM-Sequenz des nichtkomplementären Strangs 5'-VTTN-3' (wobei V G, A oder C ist). In einigen Ausführungsformen (z. B. wenn Cas12J-3339380 - hierin auch bezeichnet als „Ortholog #3“ - wie hierin beschrieben verwendet wird) ist die PAM-Sequenz des nichtkomplementären Strangs 5'-VTTC-3'.
  • In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, verschiedene Cas12J-Proteine (d. h. Cas12J-Proteine aus verschiedenen Spezies) in den verschiedenen bereitgestellten Verfahren zu verwenden, um verschiedene enzymatische Eigenschaften der unterschiedlichen Cas12J-Proteine zu nutzen (z. B. für unterschiedliche PAM-Sequenzpräferenzen; für erhöhte oder verminderte enzymatische Aktivität, für ein erhöhtes oder erniedrigtes Maß an Zelltoxizität; um das Gleichgewicht zwischen NHEJ, homologiegesteuerter Reparatur, Einzelstrangbrüchen, Doppelstrangbrüchen usw. zu verändern; um eine kurze Gesamtsequenz auszunutzen; und dergleichen). Cas12J-Proteine aus unterschiedlichen Spezies erfordern möglicherweise unterschiedliche PAM-Sequenzen in der Target-DNA. Somit kann für ein bestimmtes Cas12J-Protein der Wahl die PAM-Sequenzpräferenz anders sein als die vorstehend beschriebenen Sequenzen. Verschiedene Verfahren (auch In-silico- und/oder Nasslaborverfahren) zur Identifizierung der geeigneten PAM-Sequenz sind dem Fachmann bekannt und Routine, und es kann ein beliebiges geeignetes Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel wurden hierin beschriebene PAM-Sequenzen unter Verwendung eines PAM-Depletionsassays identifiziert (siehe z. B. nachfolgende Arbeitsbeispiele), könnten aber auch unter Verwendung einer Vielzahl unterschiedlicher Verfahren (einschließlich rechnerischer Analyse von Sequenzierungsdaten - wie dem Fachmann bekannt) identifiziert worden sein.
  • Cas12J-Guide-RNA
  • Eine Nukleinsäure, die an ein Cas12J-Protein bindet, was einen Ribonukleoproteinkomplex (RNP) bildet, und den Komplex auf eine bestimmte Position innerhalb einer Target-Nukleinsäure (z. B. eine Target-DNA) abzielt, wird hierin als „Cas12J-Guide-RNA“ oder einfach als „Guide-RNA“ bezeichnet. Es versteht sich, dass in einigen Fällen eine Hybrid-DNA/RNA so hergestellt werden kann, dass eine Cas12J-Guide-RNA zusätzlich zu RNA-Basen DNA-Basen enthält, wobei aber der Ausdruck „Cas12J-Guide-RNA“ immer noch verwendet wird, um ein derartiges Molekül hierin zu umfassen.
  • Man kann sagen, dass eine Cas12J-Guide-RNA zwei Segmente enthält, ein Target-Segment und ein Proteinbindungssegment. Das Proteinbindungssegment wird hierin auch als „konstante Region“ der Guide-RNA bezeichnet. Das Target-Segment einer Cas12J-Guide-RNA enthält eine Nukleotidsequenz (eine Guide-Sequenz), die zu einer bestimmten Sequenz (einer Target-Stelle) innerhalb einer Target-Nukleinsäure (z. B. einer Target-dsDNA, einer Target-ssRNA, einer Target-ssDNA, dem komplementären Strang einer doppelsträngigen Target-DNA usw.) komplementär ist (und daher mit dieser hybridisiert). Das Proteinbindungssegment (oder die „Proteinbindungssequenz“) interagiert mit einem Cas12J-Polypeptid (bindet an dieses). Das Proteinbindungssegment einer zugrundeliegenden Cas12J-Guide-RNA kann zwei komplementäre Abschnitte von Nukleotiden enthalten, die miteinander hybridisieren, um einen doppelsträngigen RNA-Duplex (dsRNA-Duplex) zu bilden. Stellenspezifische Bindung und/oder Spaltung einer Target-Nukleinsäure (z. B. genomische DNA, ds-DNA, RNA usw.) kann an Positionen (z. B. Target-Sequenz eines Target-Locus) erfolgen, die durch Basenpaarungskomplementarität zwischen der Cas12J-Guide-RNA (der Guide-Sequenz der Cas12J-Guide-RNA) und der Target-Nukleinsäure bestimmt werden.
  • Eine Cas12J-Guide-RNA und ein Cas12J-Protein (z. B. ein Wildtyp-Cas12J-Protein; ein variantes Cas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionspolypeptid usw.) bilden einen Komplex (z. B. Bindung über nichtkovalente Wechselwirkungen). Die Cas12J-Guide-RNA stellt dem Komplex eine Target-Spezifität bereit, indem sie ein Target-Segment enthält, das eine Guide-Sequenz enthält (eine Nukleotidsequenz, die zu einer Sequenz einer Target-Nukleinsäure komplementär ist). Das Cas12J-Protein des Komplexes stellt die stellenspezifische Aktivität bereit (z. B. die durch das Cas12J-Protein bereitgestellte Spaltungsaktivität und/oder eine Aktivität, die vom Fusionspartner im Fall eines Cas12J-Fusionsproteins bereitgestellt wird). Mit anderen Worten wird das Cas12J-Protein aufgrund seiner Assoziation mit der Cas12J-Guide-RNA zu einer Target-Nukleinsäuresequenz (z. B. einer Target-Sequenz) geleitet.
  • Die „Guide-Sequenz“, die auch als „Target-Sequenz“ einer Cas12J-Guide-RNA bezeichnet wird, kann so modifiziert werden, dass die Cas12J-Guide-RNA auf ein Cas12J-Protein (z. B. ein natürlich vorkommendes Cas12J-Protein, ein Cas 12J-Fusionspolypeptid und dergleichen) auf eine beliebige gewünschte Sequenz einer beliebigen Target-Nukleinsäure abzielen kann, mit der Ausnahme (z. B. wie hierin beschrieben), dass die PAM-Sequenz berücksichtigt werden kann. So kann beispielsweise eine Cas12J-Guide-RNA eine Guide-Sequenz aufweisen, die komplementär zu einer Sequenz in einer Nukleinsäure in einer eukaryotischen Zelle ist (z. B. mit dieser hybridisieren kann), z. B. einer viralen Nukleinsäure, einer eukaryotischen Nukleinsäure (z. B. ein eukaryotisches Chromosom, eine chromosomale Sequenz, eine eukaryotische RNA usw.) und dergleichen.
  • Guide-Sequenz einer Cas12J-Guide-RNA
  • Eine zugrundeliegende Cas 12J-Guide-RNA enthält eine Guide-Sequenz (d. h. eine Target-Sequenz), die eine Nukleotidsequenz ist, die zu einer Sequenz (der Target-Stelle) in einer Target-Nukleinsäure komplementär ist. Mit anderen Worten kann die Guide-Sequenz einer Cas12J-Guide-RNA mit einer Target-Nukleinsäure (z. B. doppelsträngige DNA (dsDNA), einzelsträngige DNA (ssDNA), einzelsträngige RNA (ssRNA) oder doppelsträngige RNA (dsRNA)) sequenzspezifisch durch Hybridisierung (d. h. Basenpaarung) interagieren. Die Guide-Sequenz einer Cas12J-Guide-RNA kann modifiziert (z. B. Gentechnik)/entwickelt werden, um mit einer beliebigen gewünschten Target-Sequenz (z. B. unter Berücksichtigung der PAM, z. B. beim Targeting eines dsDNA-Target) innerhalb einer Target-Nukleinsäure (z. B. einer eukaryotischen Target-Nukleinsäure wie etwa genomischer DNA) zu hybridisieren.
  • In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 60 % oder mehr (z. B. 65 % oder mehr, 70 % oder mehr, 75 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %). In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 80 % oder mehr (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %). In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 90 % oder mehr (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %). In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 100 %.
  • In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 100 % über den sieben benachbarten 3'-nächsten Nukleotiden der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure.
  • In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 60 % oder mehr (z. B. 70 % oder mehr, 75 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 17 oder mehr (z. B. 18 oder mehr, 19 oder mehr, 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 80 % oder mehr (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 17 oder mehr (z. B. 18 oder mehr, 19 oder mehr, 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 90 % oder mehr (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 17 oder mehr (z. B. 18 oder mehr, 19 oder mehr, 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 100 % über 17 oder mehr (z. B. 18 oder mehr, 19 oder mehr, 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide.
  • In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 60 % oder mehr (z. B. 70 % oder mehr, 75 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 19 oder mehr (z. B. 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 80 % oder mehr (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 19 oder mehr (z. B. 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 90 % oder mehr (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 19 oder mehr (z. B. 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 100 % über 19 oder mehr (z. B. 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr) benachbarte Nukleotide.
  • In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 60 % oder mehr (z. B. 70 % oder mehr, 75 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 17-25 benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 80 % oder mehr (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 17-25 benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 90 % oder mehr (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 17-25 benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 100 % über 17-25 benachbarte Nukleotide.
  • In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 60 % oder mehr (z. B. 70 % oder mehr, 75 % oder mehr, 80 % oder mehr, 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 19-25 benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 80 % oder mehr (z. B. 85 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 19-25 benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 90 % oder mehr (z. B. 95 % oder mehr, 97 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr oder 100 %) über 19-25 benachbarte Nukleotide. In einigen Fällen beträgt die prozentuale Komplementarität zwischen der Guide-Sequenz und der Target-Stelle der Target-Nukleinsäure 100 % über 19-25 benachbarte Nukleotide.
  • In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge in einem Bereich von 17-30 Nukleotiden (nt) (z. B. von 17-25, 17-22, 17-20, 19-30, 19-25, 19-22, 19-20, 20-30, 20-25 oder 20-22 nt). In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge in einem Bereich von 17-25 Nukleotiden (nt) (z. B. von 17-22, 17-20, 19-25, 19-22, 19-20, 20-25 oder 20-22 nt). In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 17 oder mehr nt (z. B. 18 oder mehr, 19 oder mehr, 20 oder mehr, 21 oder mehr oder 22 oder mehr nt; 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt usw.). In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 19 oder mehr nt (z. B. 20 oder mehr, 21 oder mehr, 22 oder mehr nt; 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt usw.). In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 17 nt. In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 18 nt. In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 19 nt. In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 20 nt. In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 21 nt. In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 22 nt. In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz eine Länge von 23 nt.
  • In einigen Fällen hat die Guide-Sequenz (auch als „Spacer-Sequenz“ bezeichnet) eine Länge von 15 bis 50 Nukleotiden (z. B. von 15 Nukleotiden (nt) bis 20 nt, von 20 nt bis 25 nt, von 25 nt bis 30 nt, von 30 nt bis 35 nt, von 35 nt bis 40 nt, von 40 nt bis 45 nt oder von 45 nt bis 50 nt).
  • Proteinbindendes Segment einer Cas12J-Guide-RNA
  • Das Proteinbindungssegment (die „konstante Region“) einer zugrundeliegenden Cas12J-Guide-RNA interagiert mit einem Cas 12J-Protein. Die Cas12J-Guide-RNA leitet das gebundene Cas12J-Protein über die vorstehend dargelegte Guide-Sequenz zu einer spezifischen Nukleotidsequenz innerhalb der Target-Nukleinsäure. Das Proteinbindungssegment einer Cas12J-Guide-RNA kann zwei Abschnitte von Nukleotiden enthalten, die zueinander komplementär sind und hybridisieren, um einen doppelsträngigen RNA-Duplex (dsRNA-Duplex) zu bilden. Somit enthält das Proteinbindungssegment in einigen Fällen einen dsRNA-Duplex.
  • In einigen Fällen enthält die dsRNA-Duplexregion einen Bereich von 5 bis 25 Basenpaaren (bp) (z. B. von 5-22, 5-20, 5-18, 5-15, 5-12, 5-10, 5-8, 8-25, 8-22, 8-18, 8-15, 8-12, 12-25, 12-22, 12-18, 12-15, 13-25, 13-22, 13-18, 13-15, 14-25, 14-22, 14-18, 14-15, 15-25, 15-22, 15-18, 17-25, 17-22 oder 17-18 bp, z. B. 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp usw.). In einigen Fällen enthält die dsRNA-Duplexregion einen Bereich von 6-15 Basenpaaren (bp) (z. B. 6-12, 6-10 oder 6-8 bp, z. B. 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp usw.). In einigen Fällen enthält die Duplexregion 5 oder mehr bp (z. B. 6 oder mehr, 7 oder mehr oder 8 oder mehr bp). In einigen Fällen enthält die Duplexregion 6 oder mehr bp (z. B. 7 oder mehr oder 8 oder mehr bp). In einigen Fällen sind nicht alle Nukleotide der Duplexregion gepaart, und daher kann die Duplexbildungsregion eine Ausbuchtung enthalten. Der Ausdruck „Ausbuchtung“ wird hierin verwendet, um einen Abschnitt von Nukleotiden (die ein Nukleotid sein können) zu bezeichnen, die nicht zu einem doppelsträngigen Duplex beitragen, sondern die 5 ‚und 3‘ von Nukleotiden umgeben sind, die dazu beitragen, und somit wird eine Ausbuchtung wird als Teil der Duplexregion erachtet. In einigen Fällen enthält die dsRNA 1 oder mehr Ausbuchtungen (z. B. 2 oder mehr, 3 oder mehr, 4 oder mehr Ausbuchtungen). In einigen Fällen enthält der dsRNA-Duplex 2 oder mehr Ausbuchtungen (z. B. 3 oder mehr, 4 oder mehr Ausbuchtungen). In einigen Fällen enthält der dsRNA-Duplex 1-5 Ausbuchtungen (z. B. 1-4, 1-3, 2-5, 2-4 oder 2-3 Ausbuchtungen).
  • Somit haben in einigen Fällen die Abschnitte von Nukleotiden, die miteinander hybridisieren, um den dsRNA-Duplex zu bilden, 70 %-100 % Komplementarität (z. B. 75 %-100 %, 80 %-10 %, 85 %-100 %, 90 %-100 %, 95 %-100 % Komplementarität) miteinander. In einigen Fällen haben die Abschnitte von Nukleotiden, die miteinander hybridisieren, um den dsRNA-Duplex zu bilden, 70 %-100 % Komplementarität (z. B. 75 %-100 %, 80 %-10 %, 85 %-100 %, 90 %-100 %, 95 %-100 % Komplementarität) miteinander. In einigen Fällen haben die Abschnitte von Nukleotiden, die miteinander hybridisieren, um den dsRNA-Duplex zu bilden, 85 %-100 % Komplementarität (z. B. 90 %-100 %, 95 %-100 % Komplementarität) miteinander. In einigen Fällen haben die Abschnitte von Nukleotiden, die miteinander hybridisieren, um den dsRNA-Duplex zu bilden, 70 %-95 % Komplementarität (z. B. 75 %-95 %, 80 %-95 %, 85 %-95 %, 90 %-95 % Komplementarität) miteinander.
  • In anderen Worten enthält in einigen Ausführungsformen der dsRNA-Duplex zwei Abschnitte von Nukleotiden, die 70 %-100 % Komplementarität (z. B. 75 %-100 %, 80 %-10 %, 85 %-100 %, 90 %-100 %, 95 %-100 % Komplementarität) miteinander haben. In einigen Fällen enthält der dsRNA-Duplex zwei Abschnitte von Nukleotiden, die 85 %-100 % Komplementarität (z. B. 90 %-100 %, 95 %-100 % Komplementarität) miteinander haben. In einigen Fällen enthält der dsRNA-Duplex zwei Abschnitte von Nukleotiden, die 70 %-95 % Komplementarität (z. B. 75 %-95 %, 80 %-95 %, 85 %-95 %, 90 %-95 % Komplementarität) miteinander haben.
  • Die Duplexregion einer zugrundeliegenden Cas12J-Guide-RNA kann eine oder mehrere (1, 2, 3, 4, 5 usw.) Mutationen relativ zu einer natürlich vorkommenden Duplexregion enthalten. Beispielsweise kann in einigen Fällen ein Basenpaar aufrechterhalten werden, während die Nukleotide, die aus jedem Segment zum Basenpaar beitragen, unterschiedlich sein können. In einigen Fällen umfasst die Duplexregion einer zugrundeliegenden Cas12J-Guide-RNA mehr gepaarte Basen, weniger gepaarte Basen, eine kleinere Ausbuchtung, eine größere Ausbuchtung, weniger Ausbuchtungen, mehr Ausbuchtungen oder eine geeignete Kombination davon im Vergleich zu einer natürlich vorkommenden Duplexregion (einer natürlich vorkommenden Cas12J-Guide-RNA).
  • Beispiele für verschiedene Cas9-Guide-RNA sind im Stand der Technik zu finden, und in einigen Fällen können Variationen, die denen ähnlich sind, die in Cas9-Guide-RNA eingebracht wurden, auch in Cas12J-Guide-RNA der vorliegenden Offenbarung eingeführt werden (z. B. Mutationen in der dsRNA-Duplex-Region, Erweiterung des 5'- oder 3'-Endes für zusätzliche Stabilität, um eine Wechselwirkung mit einem anderen Protein bereitzustellen, und dergleichen). Beispielsweise siehe Jinek et al., Science. 17. Aug 2012; 337(6096):816-21; Chylinski et al., RNA Biol. Mai 2013; 10(5):726-37; Ma et al., Biomed Res Int. 2013; 2013:270805; Hou et al., Proc Natl Acad Sci USA. 24. Sep 2013; 110(39):15644-9; Jinek et al., Elife. 2013; 2:e00471; Pattanayak et al., Nat Biotechnol. Sep. 2013; 31(9):839-43; Qi et al, Cell. 28. Feb 2013; 152(5):1173-83; Wang et al., Cell. 9. Mai 2013; 153(4):910-8; Auer et al., Genome Res. 31. Okt 2013; Chen et al., Nucleic Acids Res. 1. Nov 2013; 41(20):e19; Cheng et al., Cell Res. Okt 2013; 23(10):1163-71; Cho et al., Genetics. Nov 2013; 195(3):1177-80; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. Apr 2013; 41(7):4336-43; Dickinson et al., Nat Methods. Okt 2013; 10(10):1028-34; Ebina et al., Sci Rep. 2013; 3:2510; Fujii et. al, Nucleic Acids Res. 1. Nov 2013; 41(20):e187; Hu et al., Cell Res. Nov 2013; 23(11):1322-5; Jiang et al., Nucleic Acids Res. 1. Nov 2013; 41(20):el88; Larson et al., Nat Protoc. Nov 2013; 8(11):2180-96; Mali et. at., Nat Methods. Okt 2013; 10(10):957-63; Nakayama et al., Genesis. Dez 2013; 51(12):835-43; Ran et al., Nat Protoc. Nov 2013; 8(11):2281-308; Ran et al., Cell. 12. Sep 2013; 154(6):1380-9; Upadhyay et al., G3 (Bethesda). 9. Dez 2013; 3(12):2233-8; Walsh et al., Proc Natl Acad Sci USA. 24. Sep 2013; 110(39):15514-5; Xie et al., Mol Plant. 9. Okt 2013; Yang et al., Cell. 12. Sep 2013; 154(6):1370-9; Briner et al., Mol Cell. 23. Okt 2014; 56(2):333-9; und US-Patente und Patentanmeldungen: 8,906,616 ; 8,895,308 ; 8,889,418 ; 8,889,356 ; 8,871,445 ; 8,865,406 ; 8,795,965 ; 8,771,945 ; 8,697,359 ; 20140068797 ; 20140170753 ; 20140179006 ; 20140179770 ; 20140186843 ; 20140186919 ; 20140186958 ; 20140189896 ; 20140227787 ; 20140234972 ; 20140242664 ; 20140242699 ; 20140242700 ; 20140242702 ; 20140248702 ; 20140256046 ; 20140273037 ; 20140273226 ; 20140273230 ; 20140273231 ; 20140273232 ; 20140273233 ; 20140273234 ; 20140273235 ; 20140287938 ; 20140295556 ; 20140295557 ; 20140298547 ; 20140304853 ; 20140309487 ; 20140310828 ; 20140310830 ; 20140315985 ; 20140335063 ; 20140335620 ; 20140342456 ; 20140342457 ; 20140342458 ; 20140349400 ; 20140349405 ; 20140356867 ; 20140356956 ; 20140356958 ; 20140356959 ; 20140357523 ; 20140357530 ; 20140364333 ; und 20140377868 ; welche hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
  • Beispiele für konstante Regionen, die zum Einschluss in eine Cas12J-Guide-RNA geeignet sind, sind in 7 angegeben (z. B. wo T durch U ersetzt ist). Eine Cas12J-Guide-RNA kann eine konstante Region mit 1 bis 5 Nukleotidsubstitutionen im Vergleich zu einer beliebigen der in 7 dargestellten Nukleotidsequenzen enthalten. Als ein Beispiel kann die konstante Region einer Cas12J-Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz umfassen: GUCUCGACUAAUCGAGCAAUCGUUUGAGAUCUCUCC (SEQ ID NO: 83). Als weiteres Beispiel kann die konstante Region einer Cas12J-Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz umfassen: GUCGGAACGCUCAACGAUUGCCCCUCACGAGGGGAC (SEQ ID NO: 84). Als weiteres Beispiel kann die konstante Region einer Cas12J-Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz umfassen: GUCCCAGCGUACUGGGCAAUCAAUAGTCGUUUUGGU (SEQ ID NO: 85). Als weiteres Beispiel kann die konstante Region einer Cas12J-Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz umfassen: CACAGGAGAGAUCUCAAACGAUUGCUCGAUUAGUCGAGAC (SEQ ID NO: 86). Als weiteres Beispiel kann die konstante Region einer Cas12J-Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz umfassen: UAAUGUCGGAACGCUCAACGAUUGCCCCUCACGAGGGGAC (SEQ ID NO: 87). Als weiteres Beispiel kann die konstante Region einer Cas12J-Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz umfassen: AUUAACCAAAACGACUAUUGAUUGCCCAGUACGCUGGGAC (SEQ ID NO: 88).
  • Eine konstante Cas12J-Guide-RNA-Region kann eine beliebige der in 8 dargestellten Nukleotidsequenzen enthalten. Eine konstante Cas12J-Guide-RNA-Region kann eine Nukleotidsequenz innerhalb der in 8 dargestellten Konsensussequenz(en) enthalten.
  • Die Nukleotidsequenzen (wobei T durch U substituiert ist) können mit einer Spacer-Sequenz (wobei die Spacer-Sequenz eine Target-Nukleinsäurebindungssequenz („Guide-Sequenz“) umfasst) der Wahl kombiniert sein, die 15 bis 50 Nukleotide aufweist (z. B. 15 Nukleotide (nt) bis 20 nt, von 20 nt bis 25 nt, von 25 nt bis 30 nt, von 30 nt bis 35 nt, von 35 nt bis 40 nt, von 40 nt bis 45 nt oder von 45 nt bis 50 nt in der Länge). In einigen Fällen ist die Spacer-Sequenz 35-38 Nukleotide lang. Beispielsweise kann eine beliebige der in 7 dargestellten Nukleotidsequenzen (wobei T durch U substituiert ist) in einer Guide-RNA enthalten sein, die eine (N)n-konstante Region umfasst, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 50 ist (z. B. von 15 bis 20, von 20 bis 25, von 25 bis 30, von 30 bis 35, von 35 bis 38, von 35 bis 40, von 40 bis 45 oder von 45 bis 50). Dieses reverse Komplement einer beliebigen der in 7 dargestellten Nukleotidsequenzen (wobei jedoch T durch U substituiert ist) kann in einer Guide-RNA enthalten sein, die eine konstante Region-(N)n umfasst, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und n eine ganze Zahl von 15 bis 50 ist (z. B. von 15 bis 20, von 20 bis 25, von 25 bis 30, von 30 bis 35, von 35 bis 38, von 35 bis 40, von 40 bis 45 oder von 45 bis 50).
  • Als ein Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUCUCGACUAAUCG AGCAAUCGLTCTCTGAGAUCUCUCC (SEQ ID NO: 89) oder in einigen Fällen das reverse Komplement, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, z. B. wobei der Abschnitt von N eine Target-Nukleinsäure-bindende Sequenz enthält. Als ein weiteres Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUCGGAACGCUCAA CGAUUGCCCCUCACGAGGGGAC (SEQ ID NO: 90) oder in einigen Fällen das reverse Komplement, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist, z. B. wobei der Abschnitt von N eine Target-Nukleinsäure-bindende Sequenz enthält.
  • Als ein Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: GUCUCGACUAAUCGAGCAAUCGUUUGAGAUCUCUCC-‚Guide-Sequenz‘ (z. B. GUCUCGACUAAUCGAGCAAUCGUUUGAGAUCUCUCCNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 91), wobei der Abschnitt von N die Guide-Sequenz/Target-Sequenz darstellt und N ein beliebiges Nukleotid ist). Als ein weiteres Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: GGAGAGAUCUCAAACGAUUGCUCGAUUAGUCGAGAC-‚Guide-Sequenz‘ (z. B. GGAGAGAUCUCAAACGAUUGCUCGAUUAGUCGAGACNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 92), wobei der Abschnitt von N die Guide-Sequenz/Target-Sequenz darstellt und N ein beliebiges Nukleotid ist).
  • Als ein weiteres Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: GUCGGAACGCUCAACGALTCTGCCCCUCACGAGGGGAC-`Guide-Sequenz' (z. B. GUCGGAACGCUCAACGAUUGCCCCUCACGAGGGGACNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 93), wobei der Abschnitt von N die Guide-Sequenz/Target-Sequenz darstellt und N ein beliebiges Nukleotid ist). Als ein weiteres Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: GUCCCCUCGUGAGGGGCAAUCGUUGAGCGUUCCGAC-‚Guide-Sequenz‘ (z. B. GUCCCCUCGUGAGGGGCAAUCGUUGAGCGUUCCGACNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 94), wobei der Abschnitt von N die Guide-Sequenz/Target-Sequenz darstellt und N ein beliebiges Nukleotid ist).
  • Als ein weiteres Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: CACAGGAGAGAUCUCAAACGALTCTGCUCGALTCTAGUCGAGAC-‚Guide-Sequenz‘ (z. B. CACAGGAGAGAUCUCAAACGAUUGCUCGAUUAGUCGAGACNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 95), wobei der Abschnitt von N die Guide-Sequenz/Target-Sequenz darstellt und N ein beliebiges Nukleotid ist). Als ein weiteres Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: UAAUGUCGGAACGCUCAACGAUUGCCCCUCACGAGGGGAC-‚Guide-Sequenz‘ (z. B. UAAUGUCGGAACGCUCAACGAUUGCCCCUCACGAGGGGACNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 96), wobei der Abschnitt von N die Guide-Sequenz/Target-Sequenz darstellt und N ein beliebiges Nukleotid ist). Als ein weiteres Beispiel kann eine Guide-RNA die folgende Nukleotidsequenz aufweisen: AUUAACCAAAACGACUAUUGAUUGCCCAGUACGCUGGGAC-‚Guide-Sequenz‘ (z. B. AUUAACCAAAACGACUAUUGAUUGCCCAGUACGCUGGGACNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 97), wobei der Abschnitt von N die Guide-Sequenz/Target-Sequenz darstellt und N ein beliebiges Nukleotid ist).
  • Cas 1 2J-Guide-Polynukleotide
  • In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure, die an ein Cas12J-Protein bindet, was einen Nukleinsäure/Cas12J-Polypeptid-Komplex bildet, und die den Komplex auf eine bestimmte Position innerhalb einer Target-Nukleinsäure (z. B. einer Target-DNA) abzielt, nur Ribonukleotide, nur Desoxyribonukleotide oder eine Mischung aus Ribonukleotiden und Desoxyribonukleotiden. In einigen Fällen umfasst ein Guide-Polynukleotid nur Ribonukleotide und wird hierin als „Guide-RNA“ bezeichnet. In einigen Fällen umfasst ein Guide-Polynukleotid nur Desoxyribonukleotide und wird hierin als „Guide-DNA“ bezeichnet. In einigen Fällen umfasst ein Guide-Polynukleotid sowohl Ribonukleotide als auch Desoxyribonukleotide. Ein Guide-Polynukleotid kann Kombinationen von Ribonukleotidbasen, Desoxyribonukleotidbasen, Nukleotidanaloga, modifizierten Nukleotiden und dergleichen umfassen; und kann ferner natürlich vorkommende Rückgratreste und/oder Verknüpfungen und/oder nicht natürlich vorkommende Rückgratreste und/oder Verknüpfungen enthalten.
  • Cas12J-Systeme
  • Die vorliegende Offenbarung stellt ein Cas12J-System bereit. Ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung kann Folgendes umfassen: a) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guide-RNA; b) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; c) ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guideeit-RNA; d) ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; e) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; f) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; g) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; h) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; i) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas 12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; j) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; k) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNAcodiert; 1) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas 12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas 12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; m) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNAcodiert; n) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; o) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; p) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; q) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder r) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder eine Variation von einem von (a) bis (r). Nukleinsäuren
  • Die vorliegende Offenbarung stellt eine oder mehrere Nukleinsäuren bereit, umfassend eine oder mehrere von: einer Donor-Polynukleotidsequenz, einer Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid codiert (z. B. ein Cas12J-Wildtyp-Protein, ein Cas12J-Nickase-Protein, ein dCas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein und dergleichen), einer Cas12J-Guide-RNA und einer Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert. Die vorliegende Offenbarung stellt eine Nukleinsäure bereit, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert. Die vorliegende Offenbarung stellt einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Cas12J-Polypeptid codiert. Die vorliegende Offenbarung stellt einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert. Die vorliegende Offenbarung stellt einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der Folgendes umfasst: a) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid codiert; und b) eine Nukleotidsequenz, die (ein) Cas12J-Guide-RNA codiert. Die vorliegende Offenbarung stellt einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der Folgendes umfasst: a) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert; und b) eine Nukleotidsequenz, die (ein) Cas12J-Guide-RNA codiert. In einigen Fällen ist die Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Protein codiert, und/oder die Nukleotidsequenz, die die Cas12J-Guide-RNA codiert, mit einem Promotor wirkverbunden, der in einem Zelltyp der Wahl verwendet werden kann (z. B. eine prokaryotische Zelle, eine eukaryotische Zelle, eine Pflanzenzelle, eine tierische Zelle, eine Säugerzelle, eine Primatenzelle. eine Nagetierzelle, eine menschliche Zelle usw.).
  • In einigen Fällen ist eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, codonoptimiert. Diese Art der Optimierung kann eine Mutation einer Cas12J-codierenden Nukleotidsequenz zur Folge haben, um die Codonpräferenzen des beabsichtigten Wirtsorganismus oder der beabsichtigten Wirtszelle nachzuahmen, während das gleiche Protein codiert wird. Somit können die Codons geändert werden, aber das codierte Protein bleibt unverändert. Wenn beispielsweise die beabsichtigte Target-Zelle eine menschliche Zelle wäre, könnte eine für ein menschliches Codon optimierte Cas12J-codierende Nukleotidsequenz verwendet werden. Als ein weiteres nicht einschränkendes Beispiel könnte, wenn die beabsichtigte Wirtszelle eine Mauszelle wäre, eine Mauscodon-optimierte Cas12J-codierende Nukleotidsequenz erzeugt werden. Als ein weiteres nicht einschränkendes Beispiel könnte, wenn die beabsichtigte Wirtszelle eine Pflanzenzelle wäre, eine Pflanzencodon-optimierte Cas12J-codierende Nukleotidsequenz erzeugt werden. Als ein weiteres nicht einschränkendes Beispiel könnte, wenn die beabsichtigte Wirtszelle eine Insektenzelle wäre, eine Insektencodon-optimierte Cas12J-codierende Nukleotidsequenz erzeugt werden.
  • Tabellen für die Codonverwendung sind ohne Weiteres verfügbar, beispielsweise in der „Codon Usage Database“, verfügbar unter www[Punkt]kazusa[Punkt]or[Punkt]jp[Vorwärtsschrägstrich]codon. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer eukaryotischen Zelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas 12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Tierzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Pilzzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Pflanzenzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer einkeimblättrigen Pflanzenspezies codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer zweikeimblättrigen Pflanzenspezies codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Nacktsamer-Pflanzenspezies codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Angiospermen-Pflanzenspezies codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Maiszelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Sojabohnenzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Reiszelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Weizenzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Baumwollzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Sorghumzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Alfalfazelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Zuckerrohrzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Schotenkressenzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Tomatenzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Gurkenzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Kartoffelzelle codonoptimiert ist. In einigen Fällen umfasst eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung eine Cas12J-Polypeptid-codierende Nukleotidsequenz, die zur Expression in einer Algenzelle codonoptimiert ist.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt einen oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren bereit, die (in einigen Fällen in verschiedenen rekombinanten Expressionsvektoren und in einigen Fällen in demselben rekombinanten Expressionsvektor) Folgendes enthalten: (i) eine Nukleotidsequenz einer Donorvorlagen-Nukleinsäure (wobei die Donorvorlage eine Nukleotidsequenz mit Homologie zu einer Target-Sequenz einer Target-Nukleinsäure (z. B. einem Target-Genom) umfasst; (ii) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, die mit einer Target-Sequenz des Target-Locus des Target-Genoms hybridisiert (z. B. wirkverbunden mit einem Promotor, der in einer Target-Zelle wie etwa einer eukaryotischen Zelle verwendet werden kann); und (iii) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Protein codiert (z. B. wirkverbunden mit einem Promotor, der in einer Target-Zelle wie etwa einer eukaryotischen Zelle verwendet werden kann). Die vorliegende Offenbarung stellt einen oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren bereit, die (in einigen Fällen in verschiedenen rekombinanten Expressionsvektoren und in einigen Fällen in demselben rekombinanten Expressionsvektor) Folgendes enthalten: (i) eine Nukleotidsequenz einer Donorvorlagen-Nukleinsäure (wobei die Donorvorlage eine Nukleotidsequenz mit Homologie zu einer Target-Sequenz einer Target-Nukleinsäure (z. B. einem Target-Genom) umfasst; und (ii) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, die mit einer Target-Sequenz des Target-Locus des Target-Genoms hybridisiert (z. B. wirkverbunden mit einem Promotor, der in einer Target-Zelle wie etwa einer eukaryotischen Zelle verwendet werden kann). Die vorliegende Offenbarung stellt einen oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren bereit, die (in einigen Fällen in verschiedenen rekombinanten Expressionsvektoren und in einigen Fällen in demselben rekombinanten Expressionsvektor) Folgendes enthalten: (i) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, die mit einer Target-Sequenz des Target-Locus des Target-Genoms hybridisiert (z. B. wirkverbunden mit einem Promotor, der in einer Target-Zelle wie etwa einer eukaryotischen Zelle verwendet werden kann); und (ii) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Protein codiert (z. B. wirkverbunden mit einem Promotor, der in einer Target-Zelle wie etwa einer eukaryotischen Zelle verwendet werden kann).
  • Zu geeigneten Expressionsvektoren gehören virale Expressionsvektoren (z. B. virale Vektoren auf der Grundlage des Vacciniavirus; Poliovirus; Adenovirus (siehe z. B. Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li und Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995, Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649 , WO 93/03769 ; WO 93/19191 ; WO 94/28938 ; WO 95/11984 und WO 95/00655 ); adeno-assoziierten Virus (AAV) (siehe z. B. Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996, Srivastava in WO 93/09239 , Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; und Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; Herpes-simplex-Virus; menschlichen Immundefizienzvirus (siehe z. B. Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); eines Retrovirusvektors (z. B. murines Leukämievirus, Milznekrosevirus, und Vektoren, die von Retroviren abgeleitet sind, wie zum Beispiel dem Rous-Sarkom-Virus, dem Harvey-Sarkom-Virus, dem aviären Leukosevirus, einem Lentivirus, menschlichen Immundefizienzvirus, myeloproliferativen Sarkom-Virus und Mammatumorvirus); und dergleichen. In einigen Fällen ist ein rekombinanter Expressionsvektor der vorliegenden Offenbarung ein rekombinanter adeno-assoziierter Virus (AAV)-Vektor. In einigen Fällen ist ein rekombinanter Expressionsvektor der vorliegenden Offenbarung ein rekombinanter Lentivirusvektor. In einigen Fällen ist ein rekombinanter Expressionsvektor der vorliegenden Offenbarung ein rekombinanter retroviraler Vektor.
  • Für Pflanzenanwendungen können virale Vektoren auf der Grundlage von Tobamoviren, Potexviren, Potyviren, Tobraviren, Tombusviren, Geminiviren, Bromoviren, Carmoviren, Alfamoviren oder Cucumoviren verwendet werden. Siehe z. B. Peyret und Lomonossoff (2015) Plant Biotechnol. J. 13:1121. Geeignete Tobamovirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Tomato mosaic virus (ToMV), einen Vektor des Tobacco mosaic virus (TMV), einen Vektor des Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV), einen Vektor des Pepper mild mottle virus (PMMoV), einen Vektor des Paprika mild mottle virus (PaMMV), einen Vektor des Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), einen Vektor des Kyuri green mottle mosaic virus (KGMMV), einen Vektor des Hibiscus latent fort pierce virus (HLFPV), einen Vektor des Odontoglossum ringspot virus (ORSV), einen Vektor des Rehmannia mosaic virus (ReMV), einen Vektor des Sammon's opuntia virus (SOV), einen Vektor des Wasabi mottle virus (WMoV), einen Vektor des Youcai mosaic virus (YoMV), einen Vektor des Sunn-hemp mosaic virus (SHMV) und dergleichen ein. Geeignete Potexvirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Potato virus X (PVX), einen Vektor des Potato aucubamosaicvirus (PAMV), einen Vektor des Alstroemeria virus X (AlsVX), einen Vektor des Cactus virus X (CVX), einen Vektor des Cymbidium mosaic virus (CymMV), einen Vektor des Hosta virus X (HVX), einen Vektor des Lily virus X (LVX), einen Vektor des Narcissus mosaic virus (NMV), einen Vektor des Nerine virus X (NVX), einen Vektor des Plantago asiatica mosaic virus (P1AMV), einen Vektor des Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV), einen Vektor des Tulip virus X (TVX), einen Vektor des White clover mosaic virus (WC1MV), einen Vektor des Bamboo mosaic virus (BaMV) und dergleichen ein. Geeignete Potyvirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Potato virus Y (PVY), einen Vektor des Bean common mosaic virus (BCMV), einen Vektor des Clover yellow vein virus (C1YW), einen Vektor des East Asian Passiflora virus (EAPV), einen Vektor des Freesia mosaic virus (FreMV), einen Vektor des Japanese yam mosaic virus (JYMV), einen Vektor des Lettuce mosaic virus (LMV), einen Vektor des Maize dwarf mosaic virus (MDMV), einen Vektor des Onion yellow dwarf virus (OYDV), einen Vektor des Papaya ringspot virus (PRSV), einen Vektor des Pepper mottle virus (PepMoV), einen Vektor des Perilla mottle virus (PerMoV), einen Vektor des Plum pox virus (PPV), einen Vektor des Potato virus A (PVA), einen Vektor des Sorghum mosaic virus (SrMV), einen Vektor des Soybean mosaic virus (SMV), einen Vektor des Sugarcane mosaic virus (SCMV), einen Vektor des Tulip mosaic virus (TuIMV), einen Vektor des Turnip mosaic virus (TuMV), einen Vektor des Watermelon mosaic virus (WMV), einen Vektor des Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), einen Vektor des Tobacco etch virus (TEV) und dergleichen ein. Geeignete Tobravirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Tobacco rattle virus (TRV) und dergleichen ein. Geeignete Tombusvirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Tomato bushy stunt virus (TBSV), einen Vektor des Eggplant mottled crinkle virus (EMCV), einen Vektor des Grapevine Algerian latent virus (GALV) und dergleichen ein. Geeignete Cucumovirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Cucumber mosaic virus (CMV), einen Vektor des Peanut stunt virus (PSV), einen Vektor des Tomato aspermy virus (TAV) und dergleichen ein. Geeignete Bromovirusvektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Brome mosaic virus (BMV), einen Vektor des Cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) und dergleichen ein. Geeignete Carmovirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Carnation mottle virus (CarMV), einen Vektor des Melon necrotic spot virus (MNSV), einen Vektor des Pea stem necrotic virus (PSNV), einen Vektor des Turnip crinkle virus (TCV) und dergleichen ein. Geeignete Alfamovirus-Vektoren schließen beispielsweise einen Vektor des Alfalfa mosaic virus (AMV) und dergleichen ein.
  • Je nach verwendetem Wirts-/Vektorsystem können beliebige von mehreren geeigneten Transkriptions- und Translationskontrollelementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, Transkriptions-Enhancer-Elemente, Transkriptionsterminatoren usw., in dem Expressionsvektor verwendet werden.
  • In einigen Ausführungsformen ist eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, mit einem Kontrollelement, z. B. einem Transkriptionskontrollelement, wie etwa einem Promotor, wirkverbunden. In einigen Ausführungsformen ist eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Protein oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, mit einem Kontrollelement, z. B. einem Transkriptionskontrollelement, wie etwa einem Promotor, wirkverbunden.
  • Das Transkriptionskontrollelement kann ein Promotor sein. In einigen Fällen ist der Promotor ein konstitutiv aktiver Promotor. In einigen Fällen ist der Promotor ein regulierbarer Promotor. In einigen Fällen ist der Promotor ein induzierbarer Promotor. In einigen Fällen ist der Promotor ein gewebespezifischer Promotor. In einigen Fällen ist der Promotor ein zelltypspezifischer Promotor. In einigen Fällen wirkt das Transkriptionskontrollelement (z. B. der Promotor) in einem Target-Zelltyp oder einer Target-Zellpopulation. Beispielsweise kann in einigen Fällen das Transkriptionskontrollelement in eukaryotischen Zellen, z. B. hämatopoetischen Stammzellen (z. B. mobilisiertes peripheres Blut (mPB)-CD34(+)-Zelle, Knochenmark (BM)-CD34(+)-Zelle usw.) wirken.
  • Nicht einschränkende Beispiele für geeignete eukaryotische Promotoren (Promotoren, die in einer eukaryotischen Zelle funktionell sind) beinhalten EF1α, diejenigen aus unmittelbar frühem Cytomegalovirus (CMV), Herpes-simplex-Virus(HSV)-Thymidinkinase, frühem und spätem SV40, langen endständigen Wiederholungen (Long Terminal Repeats - LTR) aus Retrovirus und Maus-Metallothionein-I. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt im Bereich des Durchschnittsfachmanns. Der Expressionsvektor kann ebenfalls eine Ribosombindungsstelle für die Einleitung der Translation und einen Transkriptionsterminator enthalten. Der Expressionsvektor kann ebenfalls geeignete Sequenzen zum Amplifizieren der Expression beinhalten. Der Expressionsvektor kann auch Nukleotidsequenzen enthalten, die Protein-Tags codieren (z. B. 6xHis-Tag, Hämagglutinin-Tag, fluoreszierendes Protein usw.), die an das Cas12J-Protein kondensiert werden können, was zu einem Cas12J-Fusionspolypeptid führt.
  • In einigen Ausführungsformen ist eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA und/oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, mit einem induzierbaren Promotor wirkverbunden. In einigen Ausführungsformen ist eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA und/oder ein Cas12J-Fusionsprotein codiert, mit einem konstitutiven Promotor wirkverbunden.
  • Ein Promotor kann ein konstitutiv aktiver Promotor sein (d. h. ein Promotor, der konstitutiv in einem Zustand aktiv/„AN“ ist), er kann ein induzierbarer Promotor sein (d. h. ein Promotor, dessen Zustand aktiv/„AN“ oder inaktiv/„AUS“, durch einen externen Stimulus gesteuert wird, z. B. das Vorhandensein einer bestimmten Temperatur, Verbindung oder eines bestimmten Proteins), er kann ein räumlich begrenzter Promotor sein (d. h. ein Transkriptionskontrollelement, einen Enhancer usw.) (z. B. ein gewebespezifischer Promotor, ein zelltypspezifischer Promotor usw.) und er kann ein zeitlich begrenzter Promotor sein (d. h. der Promotor befindet sich während bestimmter Stadien der Embryonalentwicklung oder während bestimmter Stadien eines biologischen Prozesses, z. B. Haarfollikelzyklus bei Mäusen, in dem „AN“-Zustand oder dem „AUS“-Zustand).
  • Geeignete Promotoren können von Viren abgeleitet sein und können daher als virale Promotoren bezeichnet werden, oder sie können von einem beliebigen Organismus abgeleitet sein, einschließlich prokaryotischer oder eukaryotischer Organismen. Geeignete Promotoren können dazu verwendet werden, die Expression durch eine beliebige RNA-Polymerase (z. B. pol I, pol II, pol III) zu steuern. Beispielhafte Promotoren schließen unter anderem den SV40-Frühpromotor, den Maus-Mammatumorvirus-Long-Terminal-Repeat (LTR)-Promotor; den Adenovirus-Major-Late Promotor (Ad MLP); einen Herpes-simplex-Virus (HSV)-Promotor, einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor wie etwa die CMV-Immediate-Early-Promotorregion (CMVIE), einen Rous-Sarkom-Virus (RSV)-Promotor, einen Human-U6-Kleinkernpromotor (U6) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), einen verstärkten U6-Promotor (z. B. Xia et al., Nucleic Acids Res. 1. Sep 2003; 31(17)), einen Human-H1-Promotor (H1) und dergleichen ein.
  • In einigen Fällen ist eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, einem in einer eukaryotischen Zelle verwendbaren Promotor (z. B. einem U6-Promotor, einem verstärkten U6-Promotor, einem H1-Promotor und dergleichen) wirkverbunden (unter der Kontrolle von diesem). Wie ein Durchschnittsfachmann verstehen würde, muss, wenn eine RNA (z. B. eine Guide-RNA) aus einer Nukleinsäure (z. B. einem Expressionsvektor) unter Verwendung eines U6-Promotors (z. B. in einer eukaryotischen Zelle) oder eines anderen PolIII-Promotors exprimiert wird, die RNA möglicherweise mutiert werden, wenn mehrere T in einer Reihe vorhanden sind (codiert für U in der RNA). Dies liegt daran, dass eine Kette von T (z. B. 5 T) in der DNA als Terminator für die Polymerase III (PolIII) fungieren kann. Um die Transkription einer Guide-RNA in einer eukaryotischen Zelle sicherzustellen, kann es manchmal erforderlich sein, die für die Guide-RNA codierende Sequenz zu modifizieren, um T-Läufe zu eliminieren. In einigen Fällen ist eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Protein codiert (z. B. ein Cas12J-Wildtyp-Protein, ein Cas12J-Nickase-Protein, ein dCas12J-Protein, ein Cas12J-Fusionsprotein und dergleichen), mit einem Promotor, der in einer eukaryotischen Zelle verwendet werden kann (z. B. ein CMV-Promotor, ein EF1α-Promotor, ein Östrogenrezeptor-regulierten Promotor und dergleichen) wirkverbunden.
  • Beispiele für induzierbare Promotoren schließen unter anderem T7-RNA-Polymerase-Promotor, T3-RNA-Polymerase-Promotor, Isopropyl-beta-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)-regulierten Promotor, Lactose-induzierten Promotor, Hitzeschock-Promotor, Tetracyclin-regulierten Promotor, Steroid-regulierten Promotor, metallregulierten Promotor, Östrogenrezeptor-regulierten Promotor usw. ein. Induzierbare Promotoren können daher durch Moleküle reguliert werden, einschließlich unter anderem Doxycyclin; Östrogen und/oder ein Östrogenanalogon; IPTG usw.
  • Zur Verwendung geeignete induzierbare Promotoren schließen jeden hierin beschriebenen oder dem Fachmann bekannten induzierbaren Promotor ein. Beispiele für induzierbare Promotoren beinhalten unter anderem chemisch/biochemisch-regulierte und physikalisch regulierte Promotoren wie etwa alkoholregulierte Promotoren, Tetracyclinregulierte Promotoren (z. B. auf Anhydrotetracyclin (aTc) ansprechende Promotoren und andere auf Tetracyclin ansprechende Promotorsysteme, die ein Tetracyclin-Repressor-Protein (tetR), eine Tetracyclin-Operator-Sequenz (tetO) und ein Tetracyclin-Transaktivator-Fusionsprotein (tTA) enthalten), steroidregulierte Promotoren (z. B. Promotoren basierend auf dem Ratten-Glucocorticoid-Rezeptor, Human-Östrogenrezeptor, Motten-Ecdyson-Rezeptoren und Promotoren aus der Steroid/Retinoid/Thyroid-Rezeptor-Superfamilie), metallregulierte Promotoren (z. B. Promotoren, die von Metallothionein-Genen (Proteinen, die Metallionen binden und sequestrieren) aus Hefe, Maus und Mensch stammen), Pathogenese-regulierte Promotoren (z. B. induziert durch Salicylsäure, Ethylen oder Benzothiadiazol (BTH)), temperatur/wärme-induzierbare Promotoren (z. B. Hitzeschock-Promotoren) und lichtregulierte Promotoren (z. B. lichtempfindliche Promotoren aus Pflanzenzellen).
  • In einigen Fällen ist der Promotor ein räumlich begrenzter Promotor (d. h. ein zelltypspezifischer Promotor, ein gewebespezifischer Promotor usw.), so dass in einem mehrzelligen Organismus der Promotor in einer Untergruppe von spezifische Zellen aktiv (d. h. „AN“) ist. Räumlich beschränkte Promotoren können auch als Enhancer, Transkriptionskontrollelemente, Kontrollsequenzen usw. bezeichnet werden. Es kann ein beliebiger geeigneter, räumlich beschränkter Promotor verwendet werden, solange der Promotor in der Target-Wirtszelle (z. B. eukaryotische Zelle; prokaryotische Zelle) wirkt.
  • In einigen Fällen ist der Promotor ein reversibler Promotor. Geeignete reversible Promotoren, einschließlich reversibler induzierbarer Promotoren, sind dem Fachmann bekannt. Solche reversiblen Promotoren können von vielen Organismen, z. B. Eukaryoten und Prokaryoten, isoliert und abgeleitet sein. Die Modifikation von reversiblen Promotoren, die von einem ersten Organismus zur Verwendung in einem zweiten Organismus abgeleitet sind, z. B. ein erster Prokaryot und ein zweiter Eukaryot, ein erster Eukaryoten und ein zweiter Prokaryot usw., ist dem Fachmann gut bekannt. Solche reversiblen Promotoren und Systeme, die auf solchen reversiblen Promotoren basieren, aber auch zusätzliche Kontrollproteine umfassen, beinhalten unter anderem alkoholregulierte Promotoren (z. B. Alkoholdehydrogenase I (alcA)-Genpromotor, Promotoren, die auf Alkoholtransaktivatorproteine (AlcR) ansprechen usw.), Tetracyclinregulierte Promotoren (z. B. Promotorsysteme einschließlich TetActivators, TetON, TetOFF usw.), steroidregulierte Promotoren (z. B. Ratten-Glucocorticoidrezeptor-Promotorsysteme, Human-Östrogenrezeptor-Promotorsysteme, Retinoid-Promotorsysteme, Schilddrüsenpromotorsysteme, Ecdyson-Promotorsysteme, Mifepriston-Promotorsysteme usw.), metallregulierte Promotoren (z. B. Metallothionein-Promotorsysteme usw.), pathogenesebezogene regulierte Promotoren (z. B. Salicylsäureregulierte Promotoren, Ethylen-regulierte Promotoren, Benzothiadiazol-regulierte Promotoren usw.), temperaturregulierte Promotoren (z. B. durch Hitzeschock induzierbare Promotoren (z. B. HSP-70, HSP-90, Sojabohnen-Hitzeschock-Promotor usw.), lichtregulierte Promotoren, synthetisch induzierbare Promotoren und dergleichen.
  • RNA-Polymerase III (Pol III)-Promotoren können dazu verwendet werden, die Expression von Nicht-Protein-codierenden RNA-Molekülen (z. B. Guide-RNA) zu steuern. In einigen Fällen ist ein Pol III-Promotor ein geeigneter Promotor. In einigen Fällen ist ein Pol III-Promotor mit einer Nukleotidsequenz, die eine Guide-RNA (gRNA) codiert, wirkverbunden. In einigen Fällen ist ein Pol III-Promotor mit einer Nukleotidsequenz, die eine Single-Guide-RNA (sgRNA) codiert, wirkverbunden. In einigen Fällen ist ein Pol III-Promotor mit einer Nukleotidsequenz, die eine CRISPR-RNA (crRNA) codiert, wirkverbunden. In einigen Fällen ist ein Pol III-Promotor mit einer Nukleotidsequenz, die eine tracrRNA codiert, wirkverbunden.
  • Nicht einschränkende Beispiele für Pol III-Promotoren beinhalten einen U6-Promotor, einen Hl-Promotor, einen 5S-Promotor, einen Adenovirus 2 (Ad2) VAI-Promotor, einen tRNA-Promotor und einen 7SK-Promotor. Siehe zum Beispiel Schramm und Hernandez (2002) Genes & Development 16:2593-2620. In einigen Fällen ist ein Pol III-Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem U6-Promotor, einem HI-Promotor, einem 5S-Promotor, einem Adenovirus 2 (Ad2) VAI-Promotor, einem tRNA-Promotor und einem 7SK-Promotor. In einigen Fällen ist ein eine Guide-RNA-codierende Nukleotidsequenz mit einem Promotor wirkgekoppelt, der aus der Gruppe bestehend aus einem U6-Promotor, einem Hl-Promotor, einem 5S-Promotor, einem Adenovirus 2 (Ad2) VAI-Promotor, einem tRNA-Promotor und einem 7SK-Promotor ausgewählt ist. In einigen Fällen ist ein eine Single-Guide-RNA-codierende Nukleotidsequenz mit einem Promotor wirkgekoppelt, der aus der Gruppe bestehend aus einem U6-Promotor, einem Hl-Promotor, einem 5S-Promotor, einem Adenovirus 2 (Ad2) VAI-Promotor, einem tRNA-Promotor und einem 7SK-Promotor ausgewählt ist.
  • Beispiele, die einen Promotor beschreiben, der hierin in Verbindung mit der Expression in Pflanzen, Pflanzengeweben und Pflanzenzellen verwendet werden kann, beinhalten unter anderem Promotoren, beschrieben in: US-Pat. Nr. 6,437,217 (Mais-RS81-Promotor), US-Pat. Nr. 5,641,876 (Reis-Actin-Promotor), US-Pat. Nr. 6,426,446 (Mais-RS324-Promotor), US-Pat. Nr. 6,429,362 (Mais-PR-1-Promotor), US-Pat. Nr. 6,232,526 (Mais-A3-Promotor), US-Pat. Nr. 6,177,611 (konstitutive Maispromotoren), US-Pat. Nr. 5,322,938 , 5,352,605 , 5,359,142 und 5,530,196 (35S-Promotor), US-Pat. Nr. 6,433,252 (Mais-L3-Oleosin-Promotor), US-Pat. Nr. 6,429,357 (Reis-Actin-2-Promotor sowie ein Reis-Actin-2-Intron), US-Pat. Nr. 5,837,848 (wurzelspezifischer Promotor), US-Pat. Nr. 6,294,714 (lichtinduzierbare Promotoren), US-Pat. Nr. 6,140,078 (salzinduzierbare Promotoren), US-Pat. Nr. 6,252,138 (Pathogen-induzierbare Promotoren), US-Pat. Nr. 6,175,060 (durch Phosphormangel induzierbare Promotoren), US-Pat. Nr. 6,635,806 (Gamma-Coixin-Promotor) und US-Patentanmeldung Ser. Nr. 09/757,089 (Mais-Chloroplasten-Aldolase-Promotor). Zusätzliche Promotoren, die Verwendung finden können, umfassen einen Nopalinsynthase (NOS)-Promotor (Ebert et al., 1987), den Octopinsynthase (OCS)-Promotor (der auf Tumor-induzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens getragen wird), die Caulimovirus-Promotoren wie etwa den 19S-Promotor des Cauliflower mosaic virus (CaMV) (Lawton et al. Plant Molecular Biology (1987) 9: 315-324), den CaMV 35S-Promotor (Odell et al., Nature (1985) 313: 810-812), der Figwort mosaic Virus 35S-Promotor (US-Patente Nr. 6,051,753 ; 5,378,619 ), den Saccharosesynthase-Promotor (Yang und Russell, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA (1990) 87: 4144-4148), den Promotor des R-Genkomplexes (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183) und den Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein-Genpromotor, die Promotoren PC1SV (US-Patent Nr. 5,850,019 ) und AGRtu.nos (GenBank Accession V00087; Depicker et al., Journal of Molecular and Applied Genetics (1982)1:561-573; Bevan et al., 1983).
  • Verfahren zum Einbringen einer Nukleinsäure (z. B. einer Nukleinsäure, umfassend eine Donor-Polynukleotidsequenz, eine oder mehrere Nukleinsäuren, die ein Cas12J-Protein und/oder eine Cas12J-Guide-RNA codieren und dergleichen) in eine Wirtszelle sind dem Fachmann bekannt, und es kann ein beliebiges geeignetes Verfahren verwendet werden, um eine Nukleinsäure (z. B. ein Expressionskonstrukt) in eine Zelle einzuführen. Geeignete Verfahren enthalten z. B. Virusinfektion, Transfektion, Lipofektion, Elektroporation, Calciumphosphatfällung, Polyethylenimin (PEI)-vermittelte Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Liposomenvermittelte Transfektion, Partikelkanonen-Technologie, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion, Nanopartikel-vermittelte Nukleinsäureabgabe und dergleichen.
  • Das Einbringen des rekombinanten Expressionsvektors in Zellen kann in einem beliebigen Kulturmedium und unter beliebigen Kulturbedingungen, die das Überleben der Zellen fördern, erfolgen. Das Einbringen des rekombinanten Expressionsvektors in eine Target-Zelle kann in vivo oder ex vivo erfolgen. Das Einbringen des rekombinanten Expressionsvektors in eine Target-Zelle kann in vitro erfolgen.
  • In einigen Ausführungsformen kann ein Cas12J-Protein als RNA bereitgestellt sein. Die RNA kann durch direkte chemische Synthese bereitgestellt werden oder kann in vitro aus einer DNA (z. B. codierend für das Cas12J-Protein) transkribiert werden. Nach der Synthese kann die RNA durch eine beliebige der gut bekannten Techniken zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen (z. B. Mikroinjektion, Elektroporation, Transfektion usw.) in eine Zelle eingebracht werden.
  • Nukleinsäuren können den Zellen unter Verwendung gut entwickelter Transfektionstechniken bereitgestellt werden; siehe z. B. Angel und Yanik (2010) PLoS ONE 5 (7): e11756 und die im Handel erhältlichen TransMessenger®-Reagenzien von Qiagen, das Stemfect™ RNA Transfection Kit von Stemgent und das TransIT®-mRNA Transfection Kit von Mirus Bio LLC. Siehe auch Beumer et al. (2008) PNAS 105(50):19821-19826.
  • Vektoren können direkt einer Target-Wirtszelle bereitgestellt werden. Mit anderen Worten werden die Zellen mit Vektoren in Kontakt gebracht, die die betreffenden Nukleinsäuren umfassen (z. B. rekombinante Expressionsvektoren mit der Donorvorlagensequenz und die die Cas12J-Guide-RNAcodieren; rekombinante Expressionsvektoren, die das Cas12J-Protein codieren; usw.), so dass die Vektoren durch die Zellen aufgenommen werden. Verfahren zum Kontaktieren von Zellen mit Nukleinsäurevektoren, die Plasmide sind, beinhalten Elektroporation, Calciumchloridtransfektion, Mikroinjektion und Lipofektion und sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zur Abgabe viraler Vektoren können Zellen mit viralen Partikeln in Kontakt gebracht werden, die die betreffenden viralen Expressionsvektoren umfassen.
  • Retroviren, beispielsweise Lentiviren, sind zur Verwendung in Verfahren der vorliegenden Offenbarung geeignet. Häufig verwendete retrovirale Vektoren sind „defekt“, d. h. sie können keine viralen Proteine produzieren, die für eine produktive Infektion erforderlich sind. Vielmehr erfordert die Replikation des Vektors das Wachstum in einer Verpackungszelllinie. Um virale Partikel zu erzeugen, die interessierende Nukleinsäuren umfassen, werden die retroviralen Nukleinsäuren, die die Nukleinsäure umfassen, durch eine Verpackungszelllinie in virale Kapside verpackt. Verschiedene Verpackungszelllinien stellen ein unterschiedliches Hüllprotein (ökotrop, amphotrop oder xenotrop) bereit, das in das Kapsid eingebaut werden kann, wobei dieses Hüllprotein die Spezifität des Viruspartikels für die Zellen bestimmt (ökotrop für Maus und Ratte, amphotrop für die meisten Säugerzelltypen, einschließlich Mensch, Hund und Maus, und xenotrop für die meisten Säugerzelltypen außer Mauszellen). Die geeignete Verpackungszelllinie kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass die verpackten Viruspartikel auf die Zellen abzielen. Verfahren zum Einbringen von Subjektvektor-Expressionsvektoren in Verpackungszelllinien und zum Sammeln der von den Verpackungslinien erzeugten Viruspartikel sind dem Fachmann gut bekannt. Nukleinsäuren können auch durch direkte Mikroinjektion (z. B. Injektion von RNA) eingebracht werden.
  • Vektoren, die zur Bereitstellung der Cas12J-Guide-RNA und/oder ein Cas12J-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren für eine Target-Wirtszelle verwendet werden, können geeignete Promotoren enthalten, um die Expression, d. h. die Transkriptionsaktivierung, der interessierenden Nukleinsäure zu steuern. Mit anderen Worten wird in einigen Fällen die interessierende Nukleinsäure mit einem Promotor wirkverbunden sein. Dies kann allgegenwärtig wirkende Promotoren umfassen, beispielsweise den CMV-β-Actin-Promotor, oder induzierbare Promotoren, wie etwa Promotoren, die in bestimmten Zellpopulationen aktiv sind oder auf das Vorhandensein von Arzneimitteln wie Tetracyclin reagieren. Durch Transkriptionsaktivierung soll die Transkription in der Target-Zelle um das 10-fache, um das 100-fache, üblicherweise um das 1000-fache über die Grundwerte erhöht werden. Zusätzlich Vektoren, die zur Bereitstellung der Cas12J-Guide-RNA und/oder ein Cas12J-Protein codierenden Nukleinsäuren für eine Zelle verwendet werden, können Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für selektierbare Marker in den Target-Zellen codieren, um so Zellen zu identifizieren, die die Cas12J-Guide-RNA und/oder das Cas12J-Protein aufgenommen haben.
  • Eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, ist in einigen Fällen eine RNA. Somit kann ein Cas12J-Fusionsprotein als RNA in Zellen eingebracht werden. Verfahren zum Einbringen von RNA in Zellen sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise eine direkte Injektion, Transfektion oder ein beliebiges anderes Verfahren zum Einbringen von DNA umfassen. Stattdessen kann den Zellen ein Cas12J-Protein als Polypeptid zur Verfügung gestellt werden. Ein solches Polypeptid kann gegebenenfalls an eine Polypeptiddomäne, die die Löslichkeit des Produkts erhöht, kondensiert sein. Die Domäne kann über eine definierte Protease-Spaltungsstelle, z. B. eine TEV-Sequenz, die durch TEV-Protease gespalten wird, mit dem Polypeptid verbunden sein. Der Linker kann auch eine oder mehrere flexible Sequenzen enthalten, z. B. 1 bis 10 Glycinreste. In einigen Ausführungsformen wird die Spaltung des Fusionsproteins in einem Puffer durchgeführt, der die Löslichkeit des Produkts aufrechterhält, z. B. in Gegenwart von 0,5 bis 2 M Harnstoff, in Gegenwart von Polypeptiden und/oder Polynukleotiden, die die Löslichkeit erhöhen, und dergleichen. Interessierende Domänen beinhalten endosomolytische Domänen, z. B. Influenza-HA-Domäne; und andere Polypeptide, die die Produktion unterstützen, z. B. IF2-Domäne, GST-Domäne, GRPE-Domäne und dergleichen. Das Polypeptid kann zur Verbesserung der Stabilität formuliert sein. Beispielsweise können die Peptide PEGyliert sein, wobei die Polyethylenoxygruppe für eine längere Lebensdauer im Blutstrom sorgt.
  • Zusätzlich oder alternativ kann ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung an eine Polypeptidpermeantdomäne kondensiert sein, um die Aufnahme durch die Zelle zu fördern. Eine Anzahl von durchgängigen Domänen ist dem Fachmann bekannt und kann in den nicht integrierenden Polypeptiden der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, einschließlich Peptiden, Peptidomimetika und Nicht-Peptidträgern. Beispielsweise kann ein durchgängiges Peptid von der dritten Alpha-Helix des Drosophila melanogaster- Transkriptionsfaktors Antennapaedia abgeleitet sein, der als Penetratin bezeichnet wird und die Aminosäuresequenz RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 68) umfasst. Als ein weiteres Beispiel umfasst das durchgängige Peptid die Aminosäuresequenz der basischen Region HIV-1 tat, die beispielsweise die Aminosäuren 49-57 des natürlich vorkommenden tat-Proteins umfassen kann. Andere durchgängige Domänen schließen Polyargininmotive, beispielsweise die Region der Aminosäuren 34-56 von HIV-1 rev-Protein, Nona-Arginin, Octa-Arginin und dergleichen, ein. (Siehe zum Beispiel Futaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci. Apr 2003; 4(2):87-9 und 446; und Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 21. Nov. 2000; 97(24):13003-8; veröffentlichte US-Patentanmeldungen 20030220334 ; 20030083256 ; 20030032593 ; und 20030022831 , hierin ausdrücklich durch Bezugnahme für die Lehren von Translokationspeptiden und Peptoiden aufgenommen). Die Nona-Arginin (R9)-Sequenz ist eine der effizienteren PTD, die charakterisiert wurden (Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002). Die Stelle, an der die Fusion durchgeführt wird, kann ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften des Polypeptids zu optimieren. Die optimale Stelle wird durch Routineexperimente bestimmt.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist in einigen Fällen die Target-Zelle eine Pflanzenzelle. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren zur Transformation von Chromosomen oder Plastiden in einer Pflanzenzelle mit einer rekombinanten Nukleinsäure bekannt, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Anmeldung zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle und/oder einer transgenen Pflanze verwendet werden können. Ein beliebiges geeignetes Verfahren oder eine beliebige geeignete Technik zur Transformation einer dem Fachmann bekannten Pflanzenzelle kann verwendet werden. Effektive Verfahren zur Transformation von Pflanzen beinhalten eine bakteriell vermittelte Transformation, wie etwa eine Agrobacterium-vermittelte oder Rhizobiumvermittelte Transformation und eine durch Mikroprojektilbeschuss vermittelte Transformation. Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren bekannt, um Explantate mit einem Transformationsvektor durch bakteriell vermittelte Transformation oder Beschuss mit Mikroprojektilen zu transformieren und anschließend diese Explantate zu kultivieren usw., um transgene Pflanzen zu regenerieren oder zu entwickeln. Andere Verfahren zur Pflanzentransformation, wie etwa Mikroinjektion, Elektroporation, Vakuuminfiltration, Druck, Ultraschallbehandlung, Rühren von Siliciumcarbidfasern, PEG-vermittelte Transformation usw., sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Transgene Pflanzen, die durch diese Transformationsverfahren hergestellt werden, können abhängig von den verwendeten Verfahren und Explantaten für das Transformationsereignis chimär oder nicht chimär sein.
  • Verfahren zum Transformieren von Pflanzenzellen sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Zum Beispiel finden sich spezifische Anweisungen zum Transformieren von Pflanzenzellen durch Mikroprojektilbeschuss mit Partikeln, die mit rekombinanter DNA beschichtet sind (z. B. biolistische Transformation), in den US-Patenten Nr. 5,550,318 ; 5,538,880 6,160,208 ; 6.399.861 ; und 6,153,812 und Agrobacterium-vermittelte Transformation ist in den US-Patenten Nr. 5,159,135 ; 5,824,877 ; 5,591,616 ; 6,384,301 ; 5,750,871 ; 5,463,174 ; und 5,188,958 beschrieben. Weitere Verfahren zur Transformation von Pflanzen finden sich beispielsweise im Compendium of Transgenic Crop Plants (2009) Blackwell Publishing. Ein beliebiges, dem Fachmann bekannte geeignete Verfahren kann dazu verwendet werden, eine Pflanzenzelle mit einer beliebigen der hierin bereitgestellten Nukleinsäuren zu transformieren.
  • Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kann in vitro oder durch eukaryotische Zellen oder durch prokaryotische Zellen hergestellt werden, und es kann durch Entfalten, z. B. Hitzedenaturierung, Dithiothreitolreduktion usw., weiterverarbeitet und unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren weiter gefaltet werden.
  • Modifikationen von Interesse, die die Primärsequenz nicht verändern, beinhalten die chemische Derivatisierung von Polypeptiden, z. B. Acylierung, Acetylierung, Carboxylierung, Amidierung usw. Ebenfalls beinhaltet sind Modifikationen der Glykosylierung, z. B. solche, die durch Modifizieren der Glykosylierungsmuster eines Polypeptids während seiner Synthese und Prozessierung oder in weiteren Prozessierungsschritten vorgenommen werden; z. B. indem das Polypeptid Enzymen ausgesetzt wird, die die Glykosylierung beeinflussen, wie etwa glykosylierenden oder deglykosylierenden Enzymen von Säugern. Ebenfalls eingeschlossen sind Sequenzen, die phosphorylierte Aminosäurereste aufweisen, z. B. Phosphotyrosin, Phosphoserin oder Phosphothreonin.
  • Ebenfalls zur Aufnahme in Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung geeignet sind Nukleinsäuren (z. B. eine Cas12J-Guide-RNA codierend, ein Cas12J-Fusionsprotein codierend usw.) und Proteine (z. B. ein Cas12J-Fusionsprotein, das von einem Wildtyp-Protein oder einem varianten Protein abgeleitet ist), die unter Verwendung gewöhnlicher molekularbiologischer Techniken und synthetischer Chemie modifiziert wurden, um ihre Beständigkeit gegen proteolytischen Abbau zu verbessern, die Target-Sequenzspezifität zu ändern, die Löslichkeitseigenschaften zu optimieren, die Proteinaktivität zu verändern (z. B. transkriptionsmodulierende Aktivität, enzymatische Aktivität usw.) oder um sie geeigneter zu machen. Analoga solcher Polypeptide schließen solche ein, die andere Reste als natürlich vorkommende L-Aminosäuren enthalten, z. B. D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende synthetische Aminosäuren. Einige oder alle Aminosäurereste können durch D-Aminosäuren ersetzt werden.
  • Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kann durch In-vitro-Synthese unter Verwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, wie sie in der Technik bekannt sind. Verschiedene kommerzielle Synthesegeräte sind verfügbar, beispielsweise automatisierte Synthesizer von Applied Biosystems, Inc., Beckman usw. Durch Verwendung von Synthesizern können natürlich vorkommende Aminosäuren durch unnatürliche Aminosäuren ersetzt werden. Die spezielle Reihenfolge und die Art der Herstellung werden durch Zweckmäßigkeit, Wirtschaftlichkeit, erforderliche Reinheit und dergleichen bestimmt.
  • Falls gewünscht, können während der Synthese oder während der Expression verschiedene Gruppen, die die Verknüpfung mit anderen Molekülen oder mit einer Oberfläche ermöglichen, in das Peptid eingebracht werden. So können beispielsweise Cysteine verwendet werden, um Thioether, Histidine zur Bindung an einen Metallionenkomplex, Carboxylgruppen zur Bildung von Amiden oder Estern, Aminogruppen zur Bildung von Amiden und dergleichen herzustellen.
  • Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kann auch gemäß herkömmlichen Verfahren der rekombinanten Synthese isoliert und gereinigt werden. Ein Lysat kann aus dem Expressionswirt hergestellt werden und unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography - HPLC), Ausschlusschromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie oder einer anderen Reinigungstechnik gereinigt werden. Zum größten Teil umfassen die Zusammensetzungen, die verwendet werden, 20 Gew.-% oder mehr des gewünschten Produkts, üblicherweise 75 Gew.-% oder mehr, bevorzugt 95 Gew.-% oder mehr, und für therapeutische Zwecke normalerweise 99,5 Gew.-% oder mehr in Relation zu Verunreinigungen in Bezug auf das Herstellungsverfahren des Produkts und seine Reinigung. Normalerweise basieren die Prozentsätze auf dem Gesamtprotein. Somit ist in einigen Fällen ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung mindestens 80 % rein, mindestens 85 % rein, mindestens 90 % rein, mindestens 95 % rein, mindestens 98 % rein oder mindestens 99 % rein (z. B. frei von Verunreinigungen, Nicht-Cas12J-Proteinen oder anderen Makromolekülen usw.).
  • Um eine Spaltung oder eine beliebige gewünschte Modifikation einer Target-Nukleinsäure (z. B. genomische DNA) oder eine beliebige gewünschte Modifikation eines mit der Target-Nukleinsäure assoziierten Polypeptids zu induzieren, wird die Cas12J-Guide-RNA und/oder das Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und/oder die Donorvorlagensequenz, unabhängig davon, ob sie als Nukleinsäuren oder Polypeptide eingebracht werden, den Zellen für etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden bereitgestellt, z. B. 1 Stunde, 1,5 Stunden, 2 Stunden, 2,5 Stunden, 3 Stunden, 3,5 Stunden 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden, 12 Stunden, 16 Stunden, 18 Stunden, 20 Stunden oder einen beliebigen anderen Zeitraum von etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden, der mit einer Häufigkeit von etwa jeden Tag bis etwa alle 4 Tage wiederholt werden kann, z. B. alle 1,5 Tage, alle 2 Tage, alle 3 Tage oder eine beliebige andere Häufigkeit von etwa jedem Tag bis etwa alle vier Tage. Das/die Mittel kann/können den betroffenen Zellen ein- oder mehrmals, z. B. einmal, zweimal, dreimal oder mehr als dreimal, zur Verfügung gestellt werden, und die Zellen können anschließend einige Zeit mit dem Mittel/den Mitteln für eine gewisse Zeitdauer nach jedem Kontaktereignis inkubiert werden, z.B. 16 bis 24 Stunden, wobei nach diesem Zeitraum das Medium durch frisches Medium ersetzt wird und die Zellen weiter kultiviert werden.
  • In Fällen, in denen der Zelle zwei oder mehr unterschiedliche Target-Komplexe bereitgestellt werden (z. B. zwei unterschiedliche Cas12J-Guide-RNA, die zu unterschiedlichen Sequenzen innerhalb derselben oder unterschiedlicher Target-Nukleinsäure komplementär sind), können die Komplexe gleichzeitig bereitgestellt werden (z. B. als zwei Polypeptide und/oder Nukleinsäuren) oder gleichzeitig abgegeben werden. Alternativ können sie nacheinander bereitgestellt werden, z. B. wenn der Target-Komplex zuerst bereitgestellt wird, gefolgt von dem zweiten Target-Komplex usw. oder umgekehrt.
  • Um die Abgabe eines DNA-Vektors in eine Target-Zelle zu verbessern, kann die DNA vor Beschädigung geschützt und ihr Eintritt in die Zelle erleichtert werden, beispielsweise durch Verwendung von Lipoplexen und Polyplexen. Somit kann in einigen Fällen eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung (z. B. ein rekombinanter Expressionsvektor der vorliegenden Offenbarung) mit Lipiden in einer organisierten Struktur wie einer Mizelle oder einem Liposom bedeckt sein. Wenn die organisierte Struktur mit DNA komplexiert ist, wird dies als ein Lipoplex bezeichnet. Es gibt drei Arten von Lipiden: anionische (negativ geladene), neutrale oder kationische (positiv geladene). Lipoplexe, die kationische Lipide verwenden, haben sich als nützlich für den Gentransfer erwiesen. Kationische Lipide bilden aufgrund ihrer positiven Ladung einen natürlichen Komplex mit der negativ geladenen DNA. Aufgrund ihrer Ladung interagieren sie auch mit der Zellmembran. Dann tritt eine Endozytose des Lipoplex auf und die DNA wird in das Zytoplasma freigesetzt. Die kationischen Lipide schützen auch vor dem Abbau der DNA durch die Zelle.
  • Komplexe von Polymeren mit DNA werden Polyplexe genannt. Die meisten Polyplexe bestehen aus kationischen Polymeren und ihre Produktion wird durch ionische Wechselwirkungen reguliert. Ein großer Unterschied zwischen den Wirkverfahren von Polyplexen und Lipoplexen besteht darin, dass Polyplexe ihre DNA-Last nicht in das Zytoplasma abgeben können, so dass in diesem Fall eine Co-Transfektion mit endosomlytischen Mitteln (um das Endosom, das während der Endozytose hergestellt wird, zu lysieren), wie etwa inaktiviertem Adenovirus, erfolgen muss. Dies ist jedoch nicht immer der Fall; Polymere wie etwa Polyethylenimin haben ebenso wie Chitosan und Trimethylchitosan ihr eigene Verfahren zur Zerstörung von Endosomen.
  • Dendrimere, ein hochverzweigtes Makromolekül mit einer Kugelform, können auch verwendet werden, um Stammzellen genetisch zu modifizieren. Die Oberfläche des Dendrimerteilchens kann funktionalisiert werden, um seine Eigenschaften zu verändern. Insbesondere ist es möglich, ein kationisches Dendrimer (d. h. eines mit einer positiven Oberflächenladung) zu konstruieren. In Gegenwart von genetischem Material wie etwa einem DNA-Plasmid führt die Ladungskomplementarität zu einer vorübergehenden Assoziation der Nukleinsäure mit dem kationischen Dendrimer. Bei Erreichen seines Bestimmungsortes kann der Dendrimer-Nukleinsäure-Komplex durch Endozytose in eine Zelle aufgenommen werden.
  • In einigen Fällen enthält eine Nukleinsäure der Offenbarung (z. B. ein Expressionsvektor) eine Insertionsstelle für eine interessierende Guide-Sequenz. Beispielsweise kann eine Nukleinsäure eine Insertionsstelle für eine interessierende Guide-Sequenz enthalten, wobei die Insertionsstelle unmittelbar neben einer Nukleotidsequenz liegt, die den Teil einer Cas12J-Guide-RNA codiert, der sich nicht ändert, wenn die Guide-Sequenz zu hybridisiert zu einer gewünschten Target-Sequenz (z. B. Sequenzen, die zum Cas12J-Bindungsaspekt der Guide-RNA beitragen, z. B. die Sequenzen, die zu dem/den dsRNA-Duplex(en) der Cas12J-Guide-RNA beitragen - auf diesen Teil der Guide-RNA kann auch als „Gerüst“ oder „konstante Region“ der Guide-RNA bezeichnet werden) geändert wird. Somit enthält in einigen Fällen eine Subjektnukleinsäure (z. B. ein Expressionsvektor) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, mit der Ausnahme, dass der Teil, der den Guide-Sequenzabschnitt der Guide-RNA codiert, eine Insertionssequenz (eine Insertionsstelle) ist. Eine Insertionsstelle ist eine beliebige Nukleotidsequenz, die zur Insertion der gewünschten Sequenz verwendet wird. „Insertionsstellen“ zur Verwendung mit verschiedenen Technologien sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und es kann eine beliebige geeignete Insertionsstelle verwendet werden. Eine Insertionsstelle kann für jedes Verfahren zur Manipulation von Nukleinsäuresequenzen dienen. Beispielsweise ist in einigen Fällen die Insertionsstelle eine Mehrfachklonierungsstelle (multiple cloning site - MCS) (z. B. eine Stelle, die eine oder mehrere Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen enthält), eine Stelle zur ligationsunabhängigen Klonierung, eine Stelle zur rekombinationsbasierten Klonierung (z. B. rekombinationsbasiert) an att-Stellen), eine Nukleotidsequenz, die durch eine auf CRISPR/Cas (z. B. Cas9) basierende Technologie erkannt wird, und dergleichen.
  • Eine Insertionsstelle kann eine beliebige gewünschte Länge haben und kann von der Art der Insertionsstelle abhängen (z. B. kann davon abhängen, ob die Stelle eine oder mehrere Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen enthält (und wie viele), ob die Stelle eine Target-Stelle für ein CRISPR/Cas-Protein enthält usw.). In einigen Fällen hat eine Insertionsstelle einer Subjektnukleinsäure eine Länge von 3 oder mehr Nukleotiden (nt) (z. B. 5 oder mehr, 8 oder mehr, 10 oder mehr, 15 oder mehr, 17 oder mehr, 18 oder mehr, 19 oder mehr, 20 oder mehr oder 25 oder mehr oder 30 oder mehr nt Länge). In einigen Fällen hat die Länge einer Insertionsstelle einer Subjektnukleinsäure eine Länge in einem Bereich von 2 bis 50 Nukleotiden (nt) (z. B. von 2 bis 40 nt, von 2 bis 30 nt, von 2 bis 25 nt von 2 bis 20 nt, von 5 bis 50 nt, von 5 bis 40 nt, von 5 bis 30 nt, von 5 bis 25 nt, von 5 bis 20 nt, von 10 bis 50 nt, von 10 bis 40 nt, von 10 bis 30 nt, von 10 bis 25 nt, von 10 bis 20 nt, von 17 bis 50 nt, von 17 bis 40 nt, von 17 bis 30 nt, von 17 bis 25 nt). In einigen Fällen hat die Länge einer Insertionsstelle einer Subjektnukleinsäure eine Länge in einem Bereich von 5 bis 40 nt.
  • Nukleinsäuremodifikationen
  • In einigen Ausführungsformen weist eine Subjektnukleinsäure (z. B. eine Cas12J-Guide-RNA) eine oder mehrere Modifikationen auf, z. B. eine Basenmodifikation, eine Rückgratmodifikation usw., um der Nukleinsäure ein neues oder verbessertes Merkmal bereitzustellen (z. B. verbesserte Stabilität). Ein Nukleosid ist eine Basen-Zucker-Kombination. Der Basenanteil des Nukleosids ist gewöhnlich eine heterocyclische Base. Die beiden am meisten verbreiteten Klassen solcher heterocyclischen Basen sind die Purine und die Pyrimidine. Nukleotiden sind Nukleoside, die ferner eine Phosphat-Gruppe umfassen, die kovalent an den Zuckerabschnitt des Nukleosids gebunden ist. Für diejenigen Nukleoside, die einen Pentofuranosylzucker beinhalten, kann die Phosphat-Gruppe an den 2'-, den 3'- oder den 5'-Hydroxyl-Rest des Zuckers gebunden sein. Bei der Bildung von Oligonukleotiden binden die Phosphat-Gruppen kovalent benachbarte Nukleoside zur Bildung einer linearen polymeren Verbindung. Die jeweiligen Enden dieser linearen Polymerverbindung können wiederum weiter verbunden sein, um eine kreisförmige Verbindung zu bilden, wobei jedoch lineare Verbindungen geeignet sind. Zusätzlich können lineare Verbindungen eine interne Nukleotidbasen-Komplementarität aufweisen und sich daher so falten, dass eine vollständig oder teilweise doppelsträngige Verbindung entsteht. Innerhalb der Oligonukleotiden werden die Phosphatgruppen gewöhnlich so betrachtet, dass sie das Internukleosid-Rückgrat des Oligonukleotids bilden. Die normale Verbindung oder das normale Rückgrat von RNA oder DNA ist eine 3'- an 5'-Phosphodiester-Bindung.
  • Geeignete Nukleinsäuremodifikationen beinhalten unter anderem 2'-O-Methyl-modifizierte Nukleotide, 2'-Fluor-modifizierte Nukleotide, Locked-Nukleinsäure (LNA)-modifizierte Nukleotide, Peptidnukleinsäure (PNA)-modifizierte Nukleotide, Nukleotide mit Phosphorothioatbindungen und eine 5'-Kappe (z. B. eine 7-Methylguanylat-Kappe (m7G)). Zusätzliche Details und zusätzliche Modifikationen sind nachfolgend beschrieben.
  • Ein 2'-O-Methyl-modifiziertes Nukleotid (auch als 2'-O-Methyl-RNA bezeichnet) ist eine natürlich vorkommende Modifikation von RNA, die in tRNA und anderen kleinen RNA gefunden wird und als posttranskriptionelle Modifikation auftritt. Oligonukleotide können direkt synthetisiert werden, die 2'-O-Methyl-RNA enthalten. Diese Modifikation erhöht die Tm von RNA:RNA-Duplexen, führt aber nur zu kleinen Änderungen in der RNA:DNA-Stabilität. Sie ist stabil in Bezug auf den Angriff durch einzelsträngige Ribonukleasen und ist typischerweise 5- bis 10-fach weniger anfällig für DNasen als DNA. Sie wird üblicherweise in Antisense-Oligos als Mittel zur Erhöhung der Stabilität und Bindungsaffinität zur Target-Botschaft verwendet.
  • 2'-Fluor-modifizierte Nukleotide (z. B. 2'-Fluor-Basen) haben eine Fluor-modifizierte Ribose, die die Bindungsaffinität (Tm) erhöht und im Vergleich zu nativer RNA auch eine gewisse relative Nuklease-Resistenz verleiht. Diese Modifikationen werden üblicherweise in Ribozymen und siRNA eingesetzt, um die Stabilität in Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten zu verbessern.
  • LNA-Basen haben eine Modifikation des Ribose-Rückgrats, die die Base in der C3'-Endoposition verriegelt, was die Helix-Duplex-Geometrie vom RNA-A-Typ begünstigt. Diese Modifikation erhöht die Tm signifikant und ist auch sehr nukleasebeständig. Mehrere LNA-Insertionen können an jeder Position außer am 3'-Ende in einem Oligo platziert werden. Es wurden Anwendungen beschrieben, die von Antisense-Oligos über Hybridisierungssonden bis hin zum SNP-Nachweis und allelspezifischer PCR reichen. Aufgrund des starken Anstiegs der Tm, der durch LNA gewährt wird, können sie auch einen Anstieg der Primer-Dimer-Bildung sowie der Selbst-Haarnadel-Bildung verursachen. In einigen Fällen beträgt die Anzahl der in ein einzelnes Oligo eingebauten LNA 10 Basen oder weniger.
  • Die Phosphorothioat (PS)-Bindung (d. h. eine Phosphorothioatbindung) ersetzt ein Schwefelatom durch einen nicht verbrückenden Sauerstoff im Phosphatrückgrat einer Nukleinsäure (z. B. eines Oligos). Diese Modifikation macht die Internukleotidbindung resistent gegen Nuklease-Abbau. Phosphorothioatbindungen können zwischen den letzten 3-5 Nukleotiden am 5'- oder 3'-Ende des Oligos eingebracht werden, um den Abbau der Exonuklease zu hemmen. Das Einbeziehen von Phosphorothioatbindungen in das Oligo (z. B. im gesamten Oligo) kann ebenfalls dazu beitragen, den Angriff durch Endonukleasen zu verringern.
  • In einigen Ausführungsformen weist eine Subjektnukleinsäure ein oder mehrere Nukleotide auf, die 2'-O-Methyl-modifizierte Nukleotide sind. In einigen Ausführungsformen weist eine Subjektnukleinsäure (z. B. eine dsRNA, eine siNA usw.) ein oder mehrere 2'-Fluor-modifizierte Nukleotide auf. In einigen Ausführungsformen weist eine Subjektnukleinsäure (z. B. eine dsRNA, eine siNA usw.) ein oder mehrere LNA-Basen auf. In einigen Ausführungsformen weist eine Subjektnukleinsäure (z. B. eine dsRNA, eine siNA usw.) ein oder mehrere Nukleotide auf, die durch eine Phosphorothioatbindung verbunden sind (d. h. die Subjektnukleinsäure hat eine oder mehrere Phosphorothioatbindungen). In einigen Ausführungsformen weist eine Subjektnukleinsäure (z. B. eine dsRNA, eine siNA usw.) eine 5'-Kappe (z. B. eine 7-Methylguanylat-Kappe (m7G)) auf. In einigen Ausführungsformen weist eine Subjektnukleinsäure (z. B. eine dsRNA, eine siNA usw.) eine Kombination von modifizierten Nukleotiden auf. Beispielsweise kann eine Subjektnukleinsäure (z. B. eine dsRNA, eine siNA usw.) zusätzlich zum Aufweisen eines oder mehrerer Nukleotide mit anderen Modifikationen (z. B. ein 2'-O-Methylnukleotid und/oder ein 2'-Fluormodifiziertes Nukleotid und/oder eine LNA-Base und/oder eine Phosphorothioatbindung) eine 5'-Kappe aufweisen (z. B. eine 7-Methylguanylatkappe (m7G)) aufweisen.
  • Modifizierte Rückgrate und modifizierte Internukleosidbindungen
  • Beispiele für geeignete Nukleinsäuren (z. B. eine Cas12J-Guide-RNA), die Modifikationen enthalten, beinhalten Nukleinsäuren, die modifizierte Rückgrate oder nicht natürliche Internukleosidbindungen enthalten. Nukleinsäuren mit modifizierten Rückgraten beinhalten solche, die ein Phosphoratom im Rückgrat behalten, und solche, die kein Phosphoratom im Rückgrat haben.
  • Geeignete modifizierte Oligonukleotid-Rückgrate, die ein Phosphoratom darin enthalten, enthalten beispielsweise Phosphorothioate, chirale Phosphorothioate, Phosphordithioate, Phosphotriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl- und andere Alkylphosphonate, einschließlich 3'-Alkylenphosphonate, 5'-Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate, einschließlich 3'-Aminophosphoramidat und -Aminoalkylphosphoramidate, Phosphordiamidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalkylphosphotriester, Selenophosphate und Boranophosphate mit normalen 3'-5'-Bindungen, 2'-5'-verknüpften Analoga davon und solche mit invertierter Polarität, wobei eine oder mehrere Internukleotidbindungen 3' zu 3', 5' zu 5' oder 2' zu 2'-Bindung ist. Geeignete Oligonukleotide mit invertierter Polarität umfassen eine einzelne 3' zu 3'-Bindung an der am meisten 3'-gelegenen Internukleotidbindung, d. h. ein einzeln invertierter Nukleosidrest, der basisch sein kann (die Nukleobase fehlt oder hat an der Stelle eine Hydroxyl-Gruppe). Verschiedene Salze (wie etwa beispielsweise Kalium oder Natrium), gemischte Salze und freie Säureformen sind ebenfalls enthalten.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst eine betreffende Nukleinsäure ein oder mehrere Phosphorothioat- und/oder Heteroatom-Internukleosidbindungen, insbesondere - CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N (CH3) -O-CH2- (bekannt als Methylen- (Methylimino) oder MMI-Grundgerüst), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- und -O-N(CH3)-CH2-CH2- (wobei die native Phosphodiester-Internukleotidbindung als -O-P(=O)(OH)-O-CH2- dargestellt wird). Internukleosidbindungen vom MMI-Typ sind in dem vorstehend genannten US-Pat. Nr. 5,489,677 , dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird, offenbart. Geeignete Amid-Internukleosidbindungen vom MMI-Typ sind in US-Pat. Nr. 5,602,240 , dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird, offenbart.
  • Ebenfalls geeignet sind Nukleinsäuren mit Morpholino-Rückgratstrukturen, wie z. B. in US-Pat. Nr. 5,034,506 beschrieben. Beispielsweise umfasst in einigen Ausführungsformen eine Subjektnukleinsäure einen 6-gliedrigen Morpholino-Ring anstelle eines Ribose-Rings. In einigen dieser Ausführungsformen ersetzt eine Phosphordiamidat- oder eine andere Nicht-Phosphodiester-Internukleosidbindung eine Phosphodiesterbindung.
  • Geeignete modifizierte Polynukleotid-Rückgrate, die kein Phosphoratom einschließen, weisen Rückgrate auf, die durch kurzkettige Alkyl- oder Cykloalkyl-Internukleosidbindungen, gemischte Heteroatom- und Alkyl- oder Cykloalkyl-Internukleosidbindungen, oder eine oder mehrere kurzkettige heteromatme oder heterocyclische Internukleosidbindungen gebildet werden. Diese umfassen diejenigen mit Morpholino-Bindungen (die zum Teil aus dem Zuckerteil eines Nukleosids gebildet werden); Siloxan-Rückgrate; Sulfid-, Sulfoxid- und Sulfon-Rückgrate; Formacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Methylenformacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Riboacetyl-Rückgrate; Alken-enthaltende Rückgrate; Sulfamat-Rückgrate; Methylenimino- und Methylenhydrazino-Rückgrate; Sulfonate- und Sulfonamid-Rückgrate; Amid-Rückgrate; und weitere mit gemischten N-, O-, S- und CH2-Komponententeilen.
  • Mimetika
  • Eine Subjektnukleinsäure kann ein Nukleinsäuremimetikum sein. Der Ausdruck „Mimetikum“, wie auf Polynukleotide angewendet, soll Polynukleotide einschließen, wobei nur der Furanosering oder sowohl der Furanosering als auch die Internukleotidbindung durch Nicht-Furanosegruppen ersetzt sind, wobei die Ersetzung nur des Furanoserings im Stand der Technik auch als ein Zuckersurrogat bezeichnet wird. Der heterocyclische Basenrest oder ein modifizierter heterocyclischer Basenrest wird zur Hybridisierung mit einer geeigneten Target-Nukleinsäure beibehalten. Eine solche Nukleinsäure, ein Polynukleotid-Mimetikum, die, wie gezeigt wurde, hervorragende Hybridisierungseigenschaften besitzt, wird als Peptid-Nukleinsäure (PNA) bezeichnet. Bei PNA ist das Zucker-Rückgrat eines Polynukleotids durch ein Amid enthaltendes Rückgrat, insbesondere durch ein Aminoethylglycin-Rückgrat, ersetzt. Die Nukleotide werden beibehalten und sind direkt oder indirekt an Aza-Stickstoffatome des Amid-Abschnitts des Rückgrats gebunden.
  • Ein Polynukleotid-Mimetikum, für das gezeigt wurde, dass es hervorragende Hybridisierungseigenschaften besitzt, ist eine Peptid-Nukleinsäure (PNA). Das Rückgrat in PNA-Verbindungen besteht aus zwei oder mehr verknüpften Aminoethylglycin-Einheiten, wodurch PNA ein Amid enthaltendes Rückgrat erhält. Die heterocyclischen Basen-Einheiten werden beibehalten und sind direkt oder indirekt an Aza-Stickstoffatome des Amid-Abschnitts des Rückgrats gebunden. Repräsentative US-Patente, die die Herstellung von PNA-Verbindungen beschreiben, schließen unter anderem Folgende ein: US-Pat. Nr. 5,539,082 ; 5,714,331 ; und 5,719,262 , deren Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen werden.
  • Eine andere Klasse von Polynukleotid-Mimetika, die untersucht wurde, basiert auf verknüpften Morpholino-Einheiten (Morpholino-Nukleinsäure) mit heterocyclischen Basen, die an den Morpholino-Ring gebunden sind. Es wurde über eine Reihe von Bindungsgruppen berichtet, die die Morpholino-Monomereinheiten in einer Morpholino-Nukleinsäure verbinden. Eine Klasse von Bindungsgruppen wurde ausgewählt, um eine nichtionische oligomere Verbindung zu ergeben. Für die nichtionischen oligomeren Verbindungen auf Morpholino-Basis ist es weniger wahrscheinlich, dass sie unerwünschte Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen aufweisen. Polynukleotide auf Morpholino-Basis sind nichtionische Nachahmer von Oligonukleotiden, bei denen es weniger wahrscheinlich ist, dass sie unerwünschte Wechselwirkungen mit zellulären Proteinen eingehen (Dwaine A. Braasch und David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). Polynukleotide auf Morpholino-Basis sind in US-Pat. Nr. 5,034,506 , dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird, offenbart. Es wurde eine Vielzahl von Verbindungen innerhalb der Morpholino-Klasse von Polynukleotiden hergestellt, die eine Vielzahl verschiedener Bindungsgruppen aufweisen, die die monomeren Untereinheiten verbinden.
  • Eine weitere Klasse von Polynukleotid-Mimetika wird als Cyclohexenylnukleinsäuren (CeNA) bezeichnet. Der Furanosering, der normalerweise in einem DNA/RNA-Molekül vorhanden ist, wird durch einen Cyclohexenylring ersetzt. CeNA-DMT-geschützte Phosphoramidit-Monomere wurden hergestellt und für die Synthese oligomerer Verbindungen nach der klassischen Phosphoramidit-Chemie verwendet. Vollmodifizierte oligomere CeNA-Verbindungen und Oligonukleotide mit spezifischen Positionen, die mit CeNA modifiziert wurden, wurden hergestellt und untersucht (siehe Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird). Im Allgemeinen erhöht der Einbau von CeNA-Monomeren in eine DNA-Kette seine Stabilität eines DNA/RNA-Hybrids. CeNA-Oligoadenylate bildeten Komplexe mit RNA- und DNA-Komplementen mit ähnlicher Stabilität wie die nativen Komplexe. Für die Untersuchung des Einbaus von CeNA-Strukturen in natürliche Nukleinsäurestrukturen wurde durch NMR und Zirkulardichroismus gezeigt, dass eine einfache Konformationsanpassung möglich ist.
  • Eine weitere Modifikation beinhaltet Locked Nucleic Acids (LNA), bei denen die 2'-Hydroxyl-Gruppe an das 4'-Kohlenstoffatom des Zuckerrings gebunden ist, wodurch eine 2'-C, 4'-C-Oxymethylenbindung gebildet wird, wodurch ein bicyclischer Zuckerrest gebildet wird. Die Bindung kann ein Methylen (-CH2-)-Gruppe sein, die das 2'-Sauerstoffatom und das 4'-Kohlenstoffatom verbrückt, wobei n 1 oder 2 ist (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456), dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird). LNA- und LNA-Analoga zeigen sehr hohe thermische Duplexstabilitäten mit komplementärer DNA und RNA (Tm=+3 zu +10 °C), Stabilität gegenüber 3'-exonukleolytischem Abbau und gute Löslichkeitseigenschaften. Potente und ungiftige Antisense-Oligonukleotide, die LNAenthalten, wurden beschrieben (z. B. Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5633-5638, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird).
  • Die Synthese und Herstellung der LNA-Monomere Adenin, Cytosin, Guanin, 5-Methylcytosin, Thymin und Uracil sowie deren Oligomerisierungs- und Nukleinsäureerkennungseigenschaften wurden beschrieben (z. B. Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54) 3607-3630, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird). LNA und deren Herstellung sind ebenfalls in WO 98/39352 und WO 99/14226 , sowie den US-Anmeldungen 20120165514 , 20100216983 , 20090041809 , 20060117410 , 20040014959 , 20020094555 und 20020086998 beschreiben, deren Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen werden.
  • Modifizierte Zuckereinheiten
  • Eine Subjektnukleinsäure kann auch einen oder mehrere substituierte Zuckerreste enthalten. Geeignete Polynukleotide umfassen eine Zuckersubstituentengruppe, ausgewählt aus: OH; F; O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; O-, S- oder N-Alkinyl; oder O-Alkyl-O-alkyl, wobei das Alkyl, Alkenyl und Alkinyl substituiertes oder unsubstituiertes C1 bis C10-Alkyl oder C2 bis C10-Alkenyl und -Alkinyl sein kann. Besonders geeignet sind O ((CH2)nO)mCH3, O (CH2)nOCH3, O (CH2)nNH2, O (CH2)nCH3, O (CH2)nONH2 und O (CH2)nON ((CH2)nCH3)2, wobei n und m von 1 bis etwa 10 sind. Andere geeignete Polynukleotide umfassen eine Zuckersubstituentengruppe, ausgewählt aus: C1 bis C10-Niederalkyl, substituiertem Niederalkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl, Aralkyl, O-Alkaryl oder O-Aralkyl, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, Heterocycloalkyl, Heterocycloalkaryl, Aminoalkylamino, Polyalkylamino, substituiertem Silyl, einer RNA-Spaltgruppe, einer Reportergruppe, einem Interkalator, einer Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids oder einer Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids und anderen Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Eine geeignete Modifikation beinhaltet 2'-Methoxyethoxy (2'-O-CH2 CH2OCH3, auch bekannt als 2'-0-(2-Methoxyethyl) oder 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird) d. h. eine Alkoxyalkoxygruppe. Eine weitere geeignete Modifikation umfasst 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d. h. eine O(CH2)2ON(CH3)2-Gruppe, auch bekannt als 2'-DMAOE, wie in den hierin nachfolgenden Beispielen beschrieben, und 2'-Dimethylaminoethoxyethoxy (im Stand der Technik auch bekannt als 2'-O-Dimethylaminoethoxyethyl oder 2'-DMAEOE), d. h. 2'-O-CH2-O-CH2-N (CH3)2.
  • Andere geeignete Zuckersubstituentengruppen schließen Methoxy (-O-CH3), Aminopropoxy (--O CH2 CH2 CH2NH2), Allyl (-CH2-CH=CH2), --O--Allyl (--O-- CH2-CH=CH2) und Fluor (F) ein. 2'-Zuckersubstituentengruppen können sich in der Arabino-Position (oben) oder Ribo-Position (unten) befinden. Eine geeignete 2'-Arabino-Modifikation ist 2'-F. Ähnliche Modifikationen können auch an anderen Positionen an der oligomeren Verbindung vorgenommen werden, insbesondere an der 3'-Position des Zuckers am terminalen Nukleosid an 3' oder in 2'-5' verknüpften Oligonukleotiden und der 5'-Position des terminalen Nukleotids an 5'. Oligomere Verbindungen können auch Zucker-Mimetika wie etwa Cyclobutyl-Anteile anstelle des Pentofuranosyl-Zuckers aufweisen.
  • Basenmodifikationen und -substitutionen
  • Eine Subjektnukleinsäure kann auch Nukleobase- (in der Technik oft einfach als „Base“ bezeichnet) -modifizierungen oder -substitutionen einschließen. Wie hierein verwendet, schließen „unmodifizierte“ oder „natürliche“ Nukleobasen Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) sowie die Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U) ein. Modifizierte Nukleobasen schließen andere synthetische oder natürliche Nukleobasen ein, so wie 5-Methylcytosin (5-Me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2- Thiouracil, 2-Thiothymin und 2-Thiocytosin, 5-Halo-Uracil und -Cytosin, 5-Propynyl (-C=C-CH3) Uracil und Cytosin und andere Alkynylderivate von Pyrimidinbasen, 6-Azo-Uracil, -Cytosin und Thymine, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo, 8-Amino, 8-Thiol, 8-Thioalkyl, 8-Hydroxyl und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halo insbesondere 5-Bromo, 5-Trifluoromethyl und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 2-F-Adenin, 2-Aminoadenin, 8-Azaguanin und 8-Azaadenin, 7-Deazaguanin und 7-Deazaadenin und 3-Deazaguanin und 3-Deazaadenin. Weitere modifizierte Nukleobasen schließen Pyrimidine wie etwa Phenoxazincytidin (1H-Pyrimido (5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-on), Phenothiazincytidin (1H-Pyrimido (5,4-b)(1,4)benzothiazin-2(3H)-on), G-Klammern wie etwa ein substituiertes Phenoxazincytidin (z. B. 9-(2-Aminoethoxy)-H-pyrimido(5,4-(b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-on), Carbazolcytidin (2H-Pyrimido(4,5-b)indol-2-on), Pyridoindolcytidin(H-pyrido(3',2' :4,5)pyrrolo(2,3-d)pyrimidin-2-on) ein.
  • Heterocyclische Basenreste können auch solche einschließen, bei denen die Purin- oder Pyrimidinbase durch andere Heterocyclen ersetzt ist, beispielsweise 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanosin, 2-Aminopyridin und 2-Pyridon. Weitere Nukleobasen schließen solche ein, die in US-Patent Nr. 3 687 808 offenbart sind, solche, die in The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Seiten 858-859, Kroschwitz, J. I., Hrsg. John Wiley & Sons, 1990, offenbart sind, solche, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, offenbart sind, und soclhe, die von Sanghvi, Y.S., Kapitel 15, Antisense Research and Applications, Seiten 289-302, Crooke, S.T. und Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993, offenbart sind; deren Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen werden. Bestimmte dieser Nukleobasen sind nützlich, um die Bindungsaffinität einer oligomeren Verbindung zu erhöhen. Dazu gehören 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6-substituierte Purine, einschließlich 2-Aminopropyladenin, 5-Propynyluracil und 5-Propinylcytosin. Es wurde gezeigt, dass 5-Methylcytosin-Substitutionen die Stabilität des Nukleinsäureduplex um 0,6-1,2 °C erhöhen (Sanghvi et al., Hrsg., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, S. 276-278; dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen wird) und geeignete Basensubstitutionen sind, z. B. wenn sie mit 2'-O-Methoxyethylzuckermodifikationen kombiniert werden.
  • Konjugate
  • Eine andere mögliche Modifikation einer Subjektnukleinsäure beinhaltet die chemische Verknüpfung eines oder mehrerer Molekülteile, welche die Aktivität, zelluläre Verteilung oder zelluläre Aufnahme des Oligonukleotids verstärken, mit dem Polynukleotid. Diese Reste oder Konjugate können Konjugatgruppen, welche kovalent an funktionelle Gruppen wie primäre oder sekundäre Hydroxylgruppen gebunden sind, einschließen. Konjugatgruppen schließen unter anderem Interkalatoren, Reportermoleküle, Polyamine, Polyamide, Polyethylenglycole, Polyether, Gruppen, die die pharmakodynamischen Eigenschaften von Oligomeren verstärken und Gruppen, die die pharmakokinetischen Eigenschaften von Oligomeren verstärken, ein. Geeignete Konjugatgruppen schließen unter anderem Cholesterine, Lipide, Phospholipide, Biotin, Phenazin, Folsäure, Phenanthridin, Anthrachinon, Acridin, Flouresceine, Rhodamine, Couramine und Farbstoffe ein. Gruppen, die die pharmakodynamischen Eigenschaften verstärken, umfassen Gruppen, welche die Aufnahme verbessern, die Beständigkeit gegenüber Abbau verbessern und/oder die sequenzspezifische Hybridisierung mit der Target-Nukleinsäure verstärken. Gruppen, die die pharmakokinetischen Eigenschaften verstärken, schließen Gruppen ein, welche die Aufnahme, die Verteilung, den Metabolismus oder die Ausscheidung einer Subjektnukleinsäure verbessern.
  • Konjugatreste schließen unter anderem Lipidreste wie etwa einen Cholesterinrest (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), Cholsäure (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), einen Thioether, z. B. Hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), ein Thiocholesterin (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), eine aliphatische Kette, z. B. Dodecandiol- oder Undecylreste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al.,FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), ein Phospholipid, z. B. Dihexadecyl-rac-glycerin oder Triethylammonium-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), ein Polyamin oder eine Polyethylenglykolkette (Manoharan et al., Nucleosides& Nucleotides, 1995, 14, 969-973) oder Adamantanessigsäure (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), einen Palmitylrest (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) oder einen Octadecylamin- oder Hexylamino-Carbonyl-Oxycholesterin-Rest (Crooke etal., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937) ein.
  • Ein Konjugat kann eine „Proteintransduktionsdomäne“ oder PTD (auch als CPP - Zellpenetrationspeptid bekannt) beinhalten, die sich auf ein Polypeptid, Polynukleotid, Kohlenhydrat oder eine organische oder anorganische Verbindung beziehen kann, die das Durchqueren einer Lipiddoppelschicht, Mizelle, Zellmembran, Organellenmembran oder Vesikelmembran ermöglicht. Eine an ein anderes Molekül gebundene PTD, die von einem kleinen polaren Molekül bis zu einem großen Makromolekül und/oder einem Nanopartikel reichen kann, ermöglicht es dem Molekül, eine Membran zu durchqueren, beispielsweise vom extrazellulären Raum in den intrazellulären Raum oder von Cytosol in eine Organelle (z. B. der Kern). In einigen Ausführungsformen ist eine PTD kovalent an das 3'-Ende eines exogenen Polynukleotids gebunden. In einigen Ausführungsformen ist eine PTD kovalent an das 5'-Ende eines exogenen Polynukleotids gebunden. Beispielhafte PTD beinhalten unter anderem eine minimale Undecapeptid-Proteintransduktionsdomäne (entsprechend den Resten 47-57 von HIV-1 TAT, umfassend YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 64); eine Polyargininsequenz, umfassend eine Anzahl von Argininen, die ausreichen, um den Eintritt in eine Zelle zu lenken (z. B. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 10-50 Arginine); eine VP22-Domäne (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); eine Drosophila Antennapedia-Proteintransduktionsdomäne (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7):1732-1737); ein verkürztes menschliches Calcitoninpeptid (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); Polylysin (Wender et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO: 65); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 66); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO: 67); und RQIKIWFQNRRN1KWKK (SEQ ID NO: 68). Beispielhafte PTD beinhalten unter anderem YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 64), RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 69); ein Argininhomopolymer von 3 Argininresten bis 50 Argininresten. Beispielhafte Aminosäuresequenzen der PTD-Domäne beinhalten unter anderem eine beliebige der folgenden: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 64); RKKRRQRR (SEQ ID NO: 69); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 71); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO: 72); und GGRRARRRRRR (SEQ ID NO: 73). In einigen Ausführungsformen ist die PTD ein aktivierbares CPP (ACPP) (Aguilera et al. (2009) Integr Biol (Camb) June; 1 (5-6): 371-381). ACPP umfassen ein polykationisches CPP (z. B. Arg9 oder „R9“), das über einen spaltbaren Linker mit einem passenden Polyanion (z. B. Glu9 oder „E9“) verbunden ist, wodurch die Nettoladung auf nahezu Null reduziert wird und dadurch die Adhäsion und Aufnahme in Zellen gehemmt werden. Bei der Spaltung des Linkers wird das Polyanion freigesetzt, wodurch das Polyarginin und seine inhärente Haftfähigkeit lokal demaskiert werden, wodurch das ACPP „aktiviert“ wird, um die Membran zu durchqueren.
  • Einbringung von Komponenten in eine Target-Zelle
  • Eine Cas12J-Guide-RNA (oder eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die dieselbe codiert) und/oder ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung (oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die dieselbe codiert) und/oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung (oder eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert) und/oder ein Donor-Polynukleotid (Donorvorlage) kann durch eine beliebige aus einer Vielzahl bekannter Verfahren in eine Wirtszelle eingebracht werden.
  • Eine beliebige aus einer Vielzahl von Verbindungen und Verfahren kann dazu verwendet werden, an eine Target-Zelle ein Cas 1 2J-System der vorliegenden Offenbarung bereitzustellen (z. B. wobei ein Cas12J-System Folgendes umfasst: a) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guide-RNA; b) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; c) ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guideeit-RNA; d) ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; e) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; f) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; g) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; h) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; i) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; j) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; k) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; 1) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; m) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; n) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; o) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; p) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; q) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder r) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder eine Variation von einem von (a) bis (r). Als nicht einschränkendes Beispiel kann ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung mit einem Lipid kombiniert werden. Als weiteres nicht einschränkendes Beispiel kann ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung mit einem Partikel kombiniert werden oder zu einem Partikel formuliert werden.
  • Verfahren zum Einbringen einer Nukleinsäure in eine Wirtszelle sind im Stand der Technik bekannt und es kann ein beliebiges geeignetes Verfahren verwendet werden, um eine Subjektnukleinsäure (z. B. ein Expressionskonstrukt/-vektor) in eine Target-Zelle (z. B. prokaryotische Zelle, eukaryotische Zelle, Pflanzenzelle, tierische Zelle, Säugerzelle, menschliche Zelle und dergleichen) einzubringen. Geeignete Verfahren enthalten z. B. Virusinfektion, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Lipofektion, Elektroporation, Calciumphosphatfällung, Polyethylenimin (PEI)-vermittelte Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Liposomenvermittelte Transfektion, Partikelkanonen-Technologie, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion, Nanopartikel-vermittelte Nukleinsäureabgabe (siehe z. B. Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 13. September 2012, pii: S0169-409X(12)00283-9. Doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) und dergleichen.
  • In einigen Fällen ist ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung als eine Nukleinsäure (z. B. eine mRNA, eine DNA, ein Plasmid, ein Expressionsvektor, ein viraler Vektor usw.) bereitgestellt, die das Cas12J-Polypeptid codiert. In einigen Fällen ist das Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung direkt als Protein bereitgestellt (z. B. ohne eine assoziierte Guide-RNA oder mit einer assoziierten Guide-RNA, d. h. als Ribonukleoprotein-Komplex). Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kann durch ein beliebiges geeignete Verfahren in eine Zelle eingebracht werden (der Zelle bereitgestellt werden); solche Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Als veranschaulichendes Beispiel kann ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung direkt in eine Zelle injiziert werden (z. B. mit oder ohne Cas12J-Guide-RNA oder Nukleinsäure, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und mit oder ohne ein Donor-Polynukleotid). Als ein anderes Beispiel kann ein vorgeformter Komplex eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung und einer Cas12J-Guide-RNA (ein RNP) in eine Zelle (z. B. eine eukaryotische Zelle) eingebracht werden (z. B. durch Injektion, über Nukleofektion; über eine Proteintransduktionsdomäne (PTD), konjugiert an eine oder mehrere Komponenten, z. B. konjugiert an das Cas12J-Protein, konjugiert an eine Guide-RNA, konjugiert an ein Cas 12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Guide-RNA; usw.).
  • In einigen Fällen ist ein Cas12J-Fusionspolypeptid (z. B. dCas12J, kondensiert mit einem Fusionspartner, Nickase-Cas12J, kondensiert mit einem Fusionspartner usw.) der vorliegenden Offenbarung als eine Nukleinsäure (z. B. eine mRNA, eine DNA, ein Plasmid, ein Expressionsvektor, ein viraler Vektor usw.) bereitgestellt, die das Cas12J-Fusionspolypeptid codiert. In einigen Fällen ist das Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung direkt als Protein bereitgestellt (z. B. ohne eine assoziierte Guide-RNA oder mit einer assoziierten Guide-RNA, d. h. als Ribonukleoprotein-Komplex). Ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung kann durch ein beliebiges geeignete Verfahren in eine Zelle eingebracht werden (der Zelle bereitgestellt werden); solche Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Als veranschaulichendes Beispiel kann ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung direkt in eine Zelle injiziert werden (z. B. mit oder ohne Nukleinsäure, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und mit oder ohne ein Donor-Polynukleotid). Als ein anderes Beispiel kann ein vorgeformter Komplex eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung und einer Cas12J-Guide-RNA (ein RNP) in eine Zelle eingebracht werden (z. B. durch Injektion, über Nukleofektion; über eine Proteintransduktionsdomäne (PTD), konjugiert an eine oder mehrere Komponenten, z. B. konjugiert an das Cas12J-Fusionsprotein, konjugiert an eine Guide-RNA, konjugiert an ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Guide-RNA; usw.).
  • In einigen Fällen wird eine Nukleinsäure (z. B. eine Cas12J-Guide-RNA; eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert usw.) an eine Zelle (z. B. eine Target-Wirtszelle) und/oder ein Polypeptid (z. B. ein Cas12J-Polypeptid; ein Cas12J-Fusionspolypeptid) in einem Partikel bereitgestellt oder mit einem Partikel assoziiert. In einigen Fällen wird ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Zelle in einem Partikel bereitgestellt oder mit einem Partikel assoziiert. Die Ausdrücke „Partikel“ und „Nanopartikel“ können gegebenenfalls austauschbar verwendet werden. Ein rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und/oder eine Cas12J-Guide-RNA, eine mRNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und Guide-RNA können gleichzeitig unter Verwendung von Partikeln oder Lipidhüllen bereitgestellt werden; zum Beispiel können ein Cas12J-Polypeptid und eine Cas12J-Guide-RNA, z. B. als ein Komplex (z. B. ein Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex), über einen Partikel, z. B. einen Bereitstellungspartikel, der Lipid oder Lipidoid und ein hydrophiles Polymer umfasst, z. B. ein kationisches Lipid und ein hydrophiles Polymer, bereitgestellt werden, wobei zum Beispiel das kationische Lipid 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan (DOTAP) oder 1,2-Ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) umfasst und/oder wobei das hydrophile Polymer Ethylenglykol oder Polyethylenglykol (PEG) umfasst; und/oder wobei der Partikel ferner Cholesterin umfasst (z. B. Partikel aus der Formulierung 1=DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, Cholesterin 0; Formulierungsnummer 2=DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, Cholesterin 0; Formulierungsnummer 3=DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, Cholesterin 5). Zum Beispiel kann ein Partikel unter Verwendung eines mehrstufigen Prozesses gebildet werden, bei dem ein Cas12J-Polypepid und eine Cas12J-Guide-RNA zusammengemischt werden, z.B. in einem Molverhältnis von 1:1, z.B. bei Raumtemperatur, z. B. 30 Minuten lang, z. B. in steriler, nukleasefreier 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS); und getrennt werden DOTAP, DMPC, PEG und Cholesterin, wie sie für die Formulierung anwendbar sind, in Alkohol gelöst, z. B. 100 % Ethanol; und die zwei Lösungen werden zusammengemischt, um Partikel zu bilden, die die Komplexe enthalten).
  • Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung (oder eine mRNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, oder ein rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert) und/oder Cas12J-Gudie-RNA (oder eine Nukleinsäure wie etwa ein oder mehrere Expressionsvektoren, die die Cas12J-Guide-RNA codieren) kann gleichzeitig unter Verwendung von Partikeln oder Lipidhüllen bereitgestellt werden. Beispielsweise kann ein biologisch abbaubarer, Core-Shell-strukturierter Nanopartikel mit einem Poly-(β-Aminoester) (PBAE)-Kern verwendet werden, der von einer Phospholipid-Doppelschichthülle umhüllt ist. In manchen Fällen werden Partikel/Nanopartikel basierend auf selbstorganisierenden bioadhäsiven Polymeren verwendet; solche Partikel/Nanopartikel können auf die orale Bereitstellung von Peptiden, die intravenöse Bereitstellung von Peptiden und die nasale Bereitstellung von Peptiden, z. B. an das Gehirn, angewendet werden. Andere Ausführungsformen, wie etwa die orale Absorption und die Bereitstellung an die Augen von hydrophoben Arzneimitteln, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Eine molekulare Hüllentechnologie, die eine konstruierte Polymerhülle umfasst, die geschützt und an die Stelle der Krankheit bereitgestellt wird, kann verwendet werden. Dosen von etwa 5 mg/kg können in Einzel- oder Mehrfachdosen verwendet werden, abhängig von verschiedenen Faktoren, z. B. dem Target-Gewebe.
  • Lipidoidverbindungen (z. B. wie in US-Patentanmeldung 20110293703 beschrieben) sind ebenfalls bei der Verabreichung von Polynukleotiden nützlich und können dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptide der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung bereitzustellen (z. B. wobei ein Cas12J-System Folgendes umfasst: a) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guide-RNA; b) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; c) ein Cas 12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guideeit-RNA; d) ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; e) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; f) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; g) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; h) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; i) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; j) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; k) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; 1) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; m) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; n) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; o) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; p) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; q) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder r) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder eine Variation von einem von (a) bis (r). In einem Aspekt werden die Aminoalkohol-Lipidoidverbindungen mit einem Mittel kombiniert, das an eine Zelle oder ein Subjekt abgegeben wird, um Mikropartikel, Nanopartikel, Liposomen oder Mizellen zu bilden. Die Aminoalkohollipidoidverbindungen können mit anderen Aminoalkohollipidoidverbindungen, Polymeren (synthetisch oder natürlich), Tensiden, Cholesterin, Kohlenhydraten, Proteinen, Lipiden usw. kombiniert werden, um die Partikel zu bilden. Diese Partikel können dann gegebenenfalls mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff kombiniert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden.
  • Ein Poly-(beta-Aminoalkohol) (PBAA) kann dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Die US-Patentveröffentlichung Nr. 20130302401 betrifft eine Klasse von Poly-(beta-Aminoalkoholen) (PBAA), die unter Verwendung kombinatorischer Polymerisation hergestellt wurde.
  • Partikel auf Zuckerbasis können verwendet werden, beispielsweise GalNAc, wie unter Bezugnahme auf WO2014118272 (hierin durch Bezugnahme aufgenommen) und Nair, JK et al., 2014, Journal of American Chemical Society 136 (49), 16958-16961 beschrieben, können verwendet werden, um ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen.
  • In einigen Fällen werden Lipid-Nanopartikel (LNP) dazu verwendet, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Negativ geladene Polymere wie etwa RNA können bei niedrigen pH-Werten (z. B. pH 4) in LNP geladen werden, wobei die ionisierbaren Lipide eine positive Ladung zeigen. Bei physiologischen pH-Werten weisen die LNP jedoch eine geringe Oberflächenladung auf, die mit längeren Zirkulationszeiten vereinbar ist. Es wurden vier Arten ionisierbarer kationischer Lipide untersucht, nämlich 1,2-Dilineoyl-3-dimethylammoniumpropan (DLinDAP), 1,2-Dilinoleyloxy-3-N,N-dimethylaminopropan (DLinDMA), 1,2-Dilinoleyloxy-keto-N,N-Dimethyl-3-aminopropan (DLinKDMA) und 1,2-Dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane (DLinKC2-DMA). Die Herstellung von LNP ist z. B. in Rosin et al. (2011) Molekulare Therapie 19:1286-2200 beschrieben. Die kationischen Lipide 1,2-Dilineoyl-3-dimethylammoniumpropan (DLinDAP), 1,2-Dilinoleyloxy-3-N,N-dimethylaminopropan (DLinDMA), 1,2-Dilinoleyloxyketo-N,N-dimethyl-3-aminopropan (DLinK-DMA), 1,2-Dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane (DLinKC2-DMA), (3-0-[2"-(Methoxypolyethyleneglycol-2000)succinoyl]-1,2-dimyristoyl-sn-glycol (PEG-S-DMG) und R-3-[(.omega.-methoxy-poly(ethylenglycol)2000)carbamoyl]-1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amin (PEG-C-DOMG) können verwendet werden. Eine Nukleinsäure (z. B. eine Cas12J-Guide-RNA; eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung usw.) kann in LNP eingekapselt sein, die DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA und DLinKC2-DMA enthalten (kationisches Lipid:DSPC:CHOL: PEGS-DMG oder PEG-C-DOMG bei Molverhältnissen 40:10:40:10). In einigen Fällen ist 0, 2% SP-DiOC18 enthalten.
  • Kreisförmige Nukleinsäure (Spherical Nucleic Acid - SNA™)-Konstrukte und andere Nanopartikel (insbesondere Goldnanopartikel) können dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Siehe z. B. Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19): 7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013) und Mirkin, et al., Small, 10:186-192.
  • Selbstorganisierende Nanopartikel mit RNA können mit Polyethylenimin (PEI) konstruiert werden, das mit einem Arg-Gly-Asp (RGD)-Peptidliganden, der am distalen Ende des Polyethylenglykols (PEG) angebracht ist, PEGyliert ist.
  • Im Allgemeinen bezieht sich ein „Nanopartikel“ auf jeden Partikel mit einem Durchmesser von weniger als 1000 nm. In einigen Fällen haben Nanopartikel, die zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines RNP der vorliegenden Offenbarung, einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle geeignet sind, einen Durchmesser von 500 nm oder weniger, z. B. von 25 nm bis 35 nm, von 35 nm bis 50 nm, von 50 nm bis 75 nm, von 75 nm bis 100 nm, von 100 nm bis 150 nm von 150 nm bis 200 nm, von 200 nm bis 300 nm, von 300 nm bis 400 nm oder von 400 nm bis 500 nm. In einigen Fällen haben Nanopartikel, die zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines RNP der vorliegenden Offenbarung, einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle geeignet sind, einen Durchmesser von 25 nm bis 200 nm. In einigen Fällen haben Nanopartikel, die zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines RNP der vorliegenden Offenbarung, einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle geeignet sind, einen Durchmesser von 100 nm oder weniger. In einigen Fällen haben Nanopartikel, die zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines RNP der vorliegenden Offenbarung, einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle geeignet sind, einen Durchmesser von 35 nm bis 60 nm.
  • Nanopartikel, die zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines RNP der vorliegenden Offenbarung, einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle geeignet sind, können in verschiedenen Formen bereitgestellt sein, z. B. als feste Nanopartikel (z. B. Metall wie etwa Silber, Gold, Eisen, Titan), Nichtmetall, Feststoffe auf Lipidbasis, Polymere), Suspensionen von Nanopartikeln oder Kombinationen davon. Metall-, Dielektrikum- und Halbleiternanopartikel können hergestellt werden, sowie Hybridstrukturen (z. B. Core-Shell-Nanopartikel). Nanopartikel aus halbleitendem Material können auch als Quantenpunkte bezeichnet werden, wenn sie klein genug sind (typischerweise unter 10 nm), dass eine Quantisierung der elektronischen Energieniveaus auftritt. Solche nanoskaligen Partikel werden in biomedizinischen Anwendungen als Wirkstoffträger oder Bildgebungsmittel verwendet und können in der vorliegenden Offenbarung für ähnliche Zwecke angepasst werden.
  • Halbfeste udn weiche Nanopartikel sind auch zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines RNP der vorliegenden Offenbarung, einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle geeignet. Ein Prototyp eines halbfesten Nanopartikels ist das Liposom.
  • In einigen Fällen wird ein Exosom dazu verwendet, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Exosomen sind endogene Nano-Vesikel, die RNA und Proteine transportieren und RNA an das Gehirn und andere Target-Organe abgeben können.
  • In einigen Fällen wird ein Liposom dazu verwendet, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Liposomen sind kugelförmige Vesikelstrukturen, die aus einer uni- oder multilamellaren Lipiddoppelschicht, die innere wässrige Kompartimente umgibt, und einer relativ undurchlässigen äußeren lipophilen Phospholipiddoppelschicht bestehen. Liposomen können aus verschiedenen Arten von Lipiden hergestellt werden; Phospholipide werden jedoch am häufigsten zur Erzeugung von Liposomen verwendet. Obwohl die Liposomenbildung spontan ist, wenn ein Lipidfilm mit einer wässrigen Lösung gemischt wird, kann sie auch durch Aufbringen einer Kraft in Form eines Schüttelns unter Verwendung eines Homogenisators, eines Ultraschallgeräts oder einer Extrusionsvorrichtung beschleunigt werden. Liposomen können mehrere andere Additive zugesetzt werden, um ihre Struktur und Eigenschaften zu modifizieren. Beispielsweise kann der liposomalen Mischung entweder Cholesterin oder Sphingomyelin zugesetzt werden, um die Stabilisierung der liposomalen Struktur zu unterstützen und das Austreten des liposomalen inneren Cargo zu verhindern. Eine Liposomenformulierung kann hauptsächlich aus natürlichen Phospholipiden und Lipiden wie etwa 1,2-Distearoryl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DSPC), Sphingomyelin, Ei-Phosphatidylcholinen und Monosialogangliosid bestehen.
  • Ein stabiler Nukleinsäure-Lipid-Partikel (stable nucleic-acid-lipid particle - SNALP) kann dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Die SNALP-Formulierung kann die Lipide 3-N-[(Methoxypoly(ethylenglycol)2000)carbamoyl]-l,2-dimyristyloxy-propylamin (PEG-C-DMA), 1,2-Dilinoleyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropan (DLinDMA), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) und Cholesterin in einem Molprozentverhältnis von 2:40:10:48 enthalten. Die SNALP-Liposomen können hergestellt werden, indem D-Lin-DMA und PEG-C-DMA mit Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Cholesterin und siRNA unter Verwendung eines Lipid/siRNA-Verhältnisses von 25:1 und einem Molverhältnis von 48/40/10/2 von Cholesteroin/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA formuliert wird. Die resultierenden SNALP-Liposomen können eine Größe von etwa 80 bis 100 nm haben. Ein SNALP kann synthetisches Cholesterin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Dipalmitoylphosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Ala., USA), 3-N-[(w-Methoxy-poly(ethylenglycol)2000)carbamoyl]-1,2-dimyrestyloxypropylamin und kationisches 1,2-Dilinoleyloxy-3-N,N-dimethylaminopropan umfassen. Ein SNALP kann synthetisches Cholesterin (Sigma-Aldrich), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA und 1,2-Dilinoleyloxy-3-(N,N-dimethyl)aminopropan (DLinDMA) umfassen.
  • Andere kationische Lipide, wie etwa das Aminolipid 2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolan (DLin-KC2-DMA), können dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Ein vorgeformtes Vesikel mit der folgenden Lipidzusammensetzung kann in Betracht gezogen werden: Aminolipid, Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Cholesterin und (R)-2,3-bis(Octadecyloxy)propyl-1-(methoxypoly(ethylenglycol)2000)propylcarbamat (PEG)-Lipid) jeweils im Molverhältnis 40/10/40/10 und ein FVII-siRNA/Gesamtlipid-Verhältnis von etwa 0,05 (w/w). Um eine enge Partikelgrößenverteilung im Bereich von 70-90 nm und einen niedrigen Polydispersitätsindex von 0,11 +- 0,04 (n=56) sicherzustellen, können die Partikel vor der Zugabe der Gudie-RNA bis zu dreimal durch 80-nm-Membranen extrudiert werden. Partikel, die das hochwirksame Aminolipid 16 enthalten, können verwendet werden, bei denen das Molverhältnis der vier Lipidkomponenten 16, DSPC, Cholesterin und PEG-Lipid (50/10/38,5/1,5) weiter optimiert werden kann, um die In-vivo-Aktivität zu verbessern.
  • Lipide können mit einem Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung oder Komponenten davon oder Nukleinsäuren, die diese codieren, formuliert werden, um Lipidnanopartikel (LNP) zu bilden. Geeignete Lipide schließen unter anderem DLin-KC2-DMA4, C12-200 und Colipide, Disteroylphosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-DMG ein, und können mit einem Cas12J-System, oder einer Komponente davon, der vorliegenden Offenbarung unter Verwendung eines spontanen Vesikelbildungsverfahrens formuliert werden. Das Molverhältnis der Komponente kann etwa 50/10/38,5/1,5 (DLin-KC2-DMA oder C12-200/Disteroylphosphatidylcholin/Cholesterin/PEG-DMG) betragen.
  • Ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung oder eine Komponente davon kann in PLGA-Mikrokugeln eingekapselt, wie sie in den in den USA veröffentlichten Anmeldungen 20130252281 und 20130245107 und 20130244279 näher beschrieben sind, bereitgestellt werden.
  • Aufgeladene Proteine können dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. Aufgeladene Proteine sind eine Klasse von gentechnisch veränderten oder natürlich vorkommenden Proteinen mit ungewöhnlich hoher positiver oder negativer theoretischer Nettoladung. Sowohl übernegativ als auch superpositiv geladene Proteine zeigen die Fähigkeit, thermisch oder chemisch induzierter Aggregation zu widerstehen. Superpositiv geladene Proteine können auch Säugerzellen durchdringen. Das Assoziieren von Cargo mit diesen Proteinen, wie etwa Plasmid-DNA, RNA oder anderen Proteinen, kann die funktionelle Bereitstellung dieser Makromoleküle in Säugerzellen sowohl in vitro als auch in vivo ermöglichen.
  • Zellpenetrierende Peptide (CPP) können dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle bereitzustellen. CPP haben typischerweise eine Aminosäurezusammensetzung, die entweder eine hohe relative Häufigkeit positiv geladener Aminosäuren wie etwa Lysin oder Arginin enthält oder Sequenzen aufweist, die ein alternierendes Muster von polaren/geladenen Aminosäuren und unpolaren, hydrophoben Aminosäuren enthalten.
  • Eine implantierbare Vorrichtung kann dazu verwendet werden, ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, ein RNP der vorliegenden Offenbarung, eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung (z. B. eine Cas12J-Guide-RNA, eine Nukleinsäure, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, eine Nukleinsäure, die ein Cas12J-Polypeptid codiert, einer Donorvorlage und dergleichen) oder ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle (z. B. eine Target-Zelle in vivo, wobei die Target-Zelle eine Target-Zelle im Kreislauf, eine Target-Zelle in einem Gewebe, eine Target-Zelle in einem Organ usw. ist) bereitzustellen. Eine implantierbare Vorrichtung, die zur Verwendung beim Bereitstellen eines Cas12J-Polypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung, eines RNP der vorliegenden Offenbarung, einer Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung oder eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung an eine Target-Zelle (z. B. eine Target-Zelle in vivo, wobei die Target-Zelle eine Target-Zelle im Kreislauf, eine Target-Zelle in einem Gewebe, eine Target-Zelle in einem Organ usw. ist) geeignet ist, kann einen Behälter beinhalten (z. B. ein Reservoir, eine Matrix usw.), der das Cas12J-Polypeptid, das Cas12J-Fusionspolypeptid, das RNP oder das Cas12J-System (oder eine Komponente davon, z. B. eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung) enthält.
  • Eine geeignete implantierbare Vorrichtung kann ein polymeres Substrat, wie beispielsweise eine Matrix, die als der Vorrichtungskörper verwendet wird, und in einigen Fällen zusätzliche Gerüstmaterialien, wie etwa Metalle oder zusätzliche Polymere, und Materialien zur Verbesserung der Sichtbarkeit und Bildgebung umfassen. Eine implantierbare Bereitstellungsvorrichtung kann vorteilhaft sein, um die Freisetzung lokal und über einen längeren Zeitraum bereitzustellen, wobei das Polypeptid und/oder die Nukleinsäure, das/die bereitgestellt werden soll, wird direkt an eine Target-Stelle freigesetzt wird, z. B. die extrazelluläre Matrix (ECM), das einen Tumor umgebende Gefäßsystem, ein krankes Gewebe usw. Geeignete implantierbare Bereitstellungsvorrichtungen beinhalten Vorrichtungen, die zur Abgabe an einen Hohlraum geeignet sind, wie etwa die Bauchhöhle und/oder eine beliebige andere Art der Verabreichung, bei der das Arzneimittelabgabesystem nicht verankert oder gebunden ist, umfassend ein biostabiles und/oder abbaubar und/oder bioabsorbierbares Polymersubstrat, das beispielsweise gegebenenfalls eine Matrix sein kann. In einigen Fällen umfasst eine geeignete implantierbare Arzneimittelabgabevorrichtung abbaubare Polymere, wobei der Hauptfreisetzungsmechanismus die Massenerosion ist. In einigen Fällen umfasst eine geeignete implantierbare Arzneimittelabgabevorrichtung nicht abbaubare oder langsam abgebaute Polymere, wobei der Hauptfreisetzungsmechanismus eher die Diffusion als die Massenerosion ist, so dass der äußere Teil als Membran fungiert und sein innerer Teil als Arzneimittelreservoir fungiert, das über einen längeren Zeitraum (z. B. von etwa einer Woche bis etwa einigen Monaten) praktisch nicht von der Umgebung beeinflusst wird. Optional können auch Kombinationen verschiedener Polymere mit unterschiedlichen Freisetzungsmechanismen verwendet werden. Der Konzentrationsgradient kann während eines signifikanten Zeitraums der gesamten Freisetzungsperiode effektiv konstant gehalten werden, und daher ist die Diffusionsrate effektiv konstant (als „Nullmodus“-Diffusion bezeichnet). Mit dem Ausdruck „konstant“ ist eine Diffusionsrate gemeint, die über dem unteren Schwellenwert der therapeutischen Wirksamkeit gehalten wird, die jedoch optional noch einen anfänglichen Ausbruch aufweisen kann und/oder schwanken kann, zum Beispiel bis zu einem gewissen Grad zunehmen und abnehmen. Die Diffusionsrate kann so über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden, und sie kann als konstant bis zu einem bestimmten Niveau angesehen werden, um die therapeutisch wirksame Periode, beispielsweise die effektive Silencing-Periode, zu optimieren.
  • In einigen Fällen ist das implantierbare Abgabesystem so ausgelegt, dass es das auf Nukleotiden basierende Therapeutikum vor Abbau schützt, sei es chemischer Natur oder aufgrund eines Angriffs durch Enzyme und anderer Faktoren im Körper des Patienten.
  • Die Stelle für die Implantation der Vorrichtung oder die Target-Stelle kann für maximale therapeutische Wirksamkeit ausgewählt werden. Beispielsweise kann eine Bereitstellungsvorrichtung in oder in der Nähe einer Tumorumgebung oder der mit einem Tumor verbundenen Blutversorgung implantiert werden. Der Target-Ort kann z. B. Folgendes sein: 1) das Gehirn an degenerativen Stellen wie etwa bei der Parkinson- oder Alzheimer-Krankheit an den Basalganglien, weißer und grauer Substanz; 2) die Wirbelsäule, wie im Fall der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS); 3) Gebärmutterhals; 4) aktive und chronisch entzündliche Gelenke; 5) Dermis wie im Fall von Psoriasis; 7) sympathische und sensorische Nervenstellen für die analgetische Wirkung; 7) ein Knochen; 8) eine Stelle mit akuter oder chronischer Infektion; 9) intravaginal; 10) Innenohr-Hörsystem, Labyrinth des Innenohrs, Vestibularsystem; 11) intratracheal; 12) intrakardial; koronar, epikardial; 13) Harnwege oder Blase; 14) Gallensystem; 15) Parenchymgewebe, einschließlich unter anderem Niere, Leber, Milz; 16) Lymphknoten; 17) Speicheldrüsen; 18) Zahnfleisch; 19) intraartikulär (in Gelenke); 20) intraokular; 21) Gehirngewebe; 22) Gehirnventrikel; 23) Hohlräume, einschließlich Bauchhöhle (beispielsweise bei Eierstockkrebs, jedoch nicht darauf beschränkt); 24) intraösophageal; und 25) intrarektal; und 26) in das Gefäßsystem.
  • Das Insertionsverfahren, wie beispielsweise die Implantation, kann gegebenenfalls bereits für andere Arten der Gewebeimplantation und/oder für Einfügungen und/oder zur Probenahme von Geweben, gegebenenfalls ohne Modifikationen oder alternativ gegebenenfalls nur mit nicht wesentlichen Modifikationen bei solchen Verfahren, verwendet werden. Solche Verfahren umfassen gegebenenfalls unter anderem Brachytherapieverfahren, Biopsie, Endoskopie mit und/oder ohne Ultraschall, wie etwa stereotaktische Verfahren in das Gehirngewebe, Laparoskopie, einschließlich Implantation eines Laparoskops in Gelenke, Bauchorgane, Blasenwand und Körperhöhlen.
  • Modifizierte Wirtszellen
  • Die vorliegende Offenbarung stellt eine modifizierte Zelle bereit, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und/oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, umfasst. Die vorliegende Offenbarung stellt eine modifizierte Zelle bereit, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung umfasst, wobei die modifizierte Zelle eine Zelle ist, die normalerweise kein Cas 12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung umfasst. Die vorliegende Offenbarung stellt eine modifizierte Zelle (z. B. eine genetisch modifizierte Zelle) bereit, die eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, umfasst. Die vorliegende Offenbarung stellt eine genetisch modifizierte Zelle bereit, die mit einer mRNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, genetisch modifiziert ist. Die vorliegende Offenbarung stellt eine genetisch modifizierte Zelle bereit, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, genetisch modifiziert ist. Die vorliegende Offenbarung stellt eine genetisch modifizierte Zelle bereit, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor, umfassend: a) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und b) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA der vorliegenden Offenbarung codiert. Die vorliegende Offenbarung stellt eine genetisch modifizierte Zelle bereit, die mit einem rekombinanten Expressionsvektor, umfassend: a) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; b) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA der vorliegenden Offenbarung codiert; und c) eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlage codiert.
  • Eine Zelle, die als ein Empfänger für ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und/oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und/oder eine Cas12J-Guide-RNA der vorliegenden Offenbarung dient, kann eine beliebige aus einer Vielfalt von Zellen sein, einschließlich z. B. In-vitro-Zellen; In-vivo-Zellen; Ex-vivo-Zellen; Primärzellen; Krebszellen; Tierzellen; Pflanzenzellen; Algenzellen; Pilzzellen; usw. Eine Zelle, die als Empfänger für ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und/oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und/oder eine Cas12J-Guide-RNA der vorliegenden Offenbarung dient, wird als eine „Wirtszelle“ oder eine „Target-Zelle“ bezeichnet. Eine Wirtszelle oder eine Target-Zelle kann ein Empfänger eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung sein. Eine Wirtszelle oder eine Target-Zelle kann ein Empfänger eines Cas12J-RNP der vorliegenden Offenbarung sein. Eine Wirtszelle oder eine Target-Zelle kann ein Empfänger einer Einzelkomponente eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung sein.
  • Nicht einschränkende Beispiele für Zellen (Target-Zellen) beinhalten: eine prokaryotische Zelle, eine eukaryotische Zelle, eine Bakterienzelle, eine Archaeenzelle, eine Zelle eines einzelligen eukaryotischen Organismus, eine Protozoenzelle, eine Zelle aus einer Pflanze (z. B. Zellen aus Kulturpflanzen, Obst, Gemüse, Getreide, Sojabohnen, Mais, Weizen, Samen, Tomaten, Reis, Maniok, Zuckerrohr, Kürbis, Heu, Kartoffeln, Baumwolle, Cannabis, Tabak, Blütenpflanzen, Nadelbäume, Gymnospermen, Angiospermen, Farne, Bärlappgewächse, Hornmoose, Leberblümchen, Moose, Dikotyledonen, Monokotyledonen usw.), eine Algenzelle (z. B. Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh und dergleichen), Seegräser (z. B. Seetang), eine Pilzzelle (z. B. eine Hefezelle, eine Zelle aus einem Pilz), eine Tierzelle, eine Zelle aus einem wirbellosen Tier (z. B. Fruchtfliege, Nesseltier, Stachelhäuter, Nematode usw.), eine Zelle aus ein Wirbeltier (z. B. Fisch, Amphibie, Reptil, Vogel, Säuger), eine Zelle eines Säugers (z. B. ein Huftier (z. B. ein Schwein, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf); ein Nagetier (z. B. eine Ratte, eine Maus); ein nichtmenschlicher Primat; ein Mensch; Katzenartige (z. B. eine Katze); Hundeartige (z. B. ein Hund); usw.) und dergleichen. In einigen Fällen ist die Zelle eine Zelle, die nicht von einem natürlichen Organismus stammt (z. B. kann die Zelle eine synthetisch hergestellte Zelle sein; auch als künstliche Zelle bezeichnet).
  • Eine Zelle kann eine In-vitro-Zelle sein (z. B. eine etablierte kultivierte Zelllinie). Eine Zelle kann eine Ex-vivo-Zelle sein (kultivierte Zelle aus einem Individuum). Eine Zelle kann eine In-vivo-Zelle sein (z. B. eine Zelle in einem Individuum). Eine Zelle kann eine isolierte Zelle sein. Eine Zelle kann eine Zelle innerhalb eines Organismus sein. Eine Zelle kann ein Organismus sein. Eine Zelle kann eine Zelle in einer Zellkultur sein (z. B. In-vitro-Zellkultur). Eine Zelle kann Teil einer Sammlung von Zellen sein. Eine Zelle kann eine prokaryotische Zelle sein oder von einer prokaryotischen Zelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Bakterienzelle sein oder von einer Bakterienzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Archaeenzelle sein oder von einer Archaeenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine eukaryotische Zelle sein oder von einer eukaryotischen Zelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Pflanzenzelle sein oder von einer Pflanzenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Tierzelle sein oder von einer Tierzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Wirbellosenzelle sein oder von einer Wirbellosenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Wirbeltierzelle sein oder von einer Wirbeltierzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Säugerzelle sein oder von einer Säugerzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Nagetierzelle sein oder von einer Nagetierzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine menschliche Zelle sein oder von einer menschlichen Zelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Mikrobenzelle sein oder von einer Mikrobenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Pilzzelle sein oder von einer Pilzzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Insektenzelle sein. Eine Zelle kann ein Anthropodenzelle sein. Eine Zelle kann eine Protozoenzelle sein. Eine Zelle kann eine Helminthenzelle sein.
  • Geeignete Zellen beinhalten eine Stammzelle (z. B. eine embryonale Stammzelle (ES), eine induzierte pluripotente Stammzelle (iPS); eine Keimzelle (z. B. eine Eizelle, ein Spermium, eine Oogonie, eine Spermatogonie usw.); eine somatische Zelle, z. B. ein Fibroblast, ein Oligodendrozyt, eine Gliazelle, eine hämatopoetische Zelle, ein Neuron, eine Muskelzelle, eine Knochenzelle, ein Hepatozyt, eine Pankreaszelle usw.
  • Geeignete Zellen beinhalten humane embryonale Stammzellen, fetale Kardiomyozyten, Myofibroblasten, mesenchymale Stammzellen, Kardiomyozyten, Adipozyten, totipotente Zellen, pluripotente Zellen, Blutstammzellen, Myoblasten, adulte Stammzellen, Knochenmarkzellen, mesenchymale Zellen, embryonale Stammzellen, Parenchymzellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Mesothelzellen, Fibroblasten, Osteoblasten, Chondrozyten, exogene Zellen, endogene Zellen, Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, Vorläuferzellen aus dem Knochenmark, Myokardzellen, Skelettzellen, Fötuszellen, undifferenzierte Zellen, multipotente Vorläuferzellen, unipotente Vorläuferzellen, Monozyten, Herzmyoblasten, Skelettmyoblasten, Makrophagen, Kapillarendothelzellen, xenogene Zellen, allogene Zellen und postnatale Stammzellen.
  • In einigen Fällen ist die Zelle eine Immunzelle, ein Neuron, eine Epithelzelle, eine Endothelzelle oder eine Stammzelle. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine T-Zelle, eine B-Zelle, ein Monozyt, eine natürliche Killerzelle, eine dendritische Zelle oder ein Makrophage. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine zytotoxische T-Zelle. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine Helfer-T-Zelle. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine regulatorische -T-Zelle (Treg).
  • In einigen Fällen ist die Zelle eine Stammzelle. Stammzellen schließen adulte Stammzellen ein. Adulte Stammzellen werden auch als somatische Stammzellen bezeichnet.
  • Adulte Stammzellen befinden sich in differenziertem Gewebe, behalten jedoch die Eigenschaften der Selbsterneuerung und die Fähigkeit, mehrere Zelltypen hervorzubringen, üblicherweise Zelltypen, die für das Gewebe typisch sind, in dem sich die Stammzellen befinden. Dem Fachmann sind zahlreiche Beispiele für somatische Stammzellen bekannt, einschließlich Muskelstammzellen; hämatopoetische Stammzellen; epitheliale Stammzellen; neurale Stammzellen; mesenchymale Stammzellen; Bruststammzellen; Darmstammzellen; mesodermale Stammzellen; endotheliale Stammzellen; olfaktorische Stammzellen; Stammzellen des Nervenkamms und dergleichen.
  • Stammzellen von Interesse umfassen Säugerstammzellen, wobei sich der Ausdruck „Säuger“ auf jedes Tier bezieht, das als Säuger klassifiziert ist, einschließlich Menschen; nichtmenschliche Primaten; Haus- und Nutztiere; und Zoo-, Labor-, Sport- oder Heimtiere wie etwa Hunde, Pferde, Katzen, Kühe, Mäuse, Ratten, Kaninchen usw. In einigen Fällen ist die Stammzelle eine menschliche Stammzelle. In einigen Fällen ist die Stammzelle eine Nagetierstammzelle (z. B. einer Maus; einer Ratte). In einigen Fällen ist die Stammzelle eine Stammzelle eines nichtmenschlichen Primaten.
  • Stammzellen können einen oder mehrere Stammzellmarker exprimieren, z. B. SOX9, KRT19, KRT7, LGR5, CA9, FXYD2, CDH6, CLDN18, TSPAN8, BPIFB1, OLFM4, CDH17 und PPARGC1A.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Stammzelle eine hämatopoetische Stammzelle (HSC). HSC sind von Mesoderm abgeleitete Zellen, die aus Knochenmark, Blut, Nabelschnurblut, fötaler Leber und Dottersack isoliert werden können. HSC sind als CD34+ und CD3- charakterisiert. HSC können in vivo die Erythroid-, Neutrophilen-Makrophagen-, Megakaryozyten- und lymphoiden hämatopoetischen Zelllinien neu bevölkern. In vitro können HSC dazu gebracht werden, mindestens einige sich selbst erneuernde Zellteilungen zu durchlaufen, und sie können dazu gebracht werden, sich zu denselben Linien zu differenzieren, wie dies in vivo zu sehen ist. Somit können HSC induziert werden, um in eine oder mehrere von Erythroidzellen, Megakaryozyten, Neutrophilen, Makrophagen und lymphoiden Zellen zu differenzieren.
  • In anderen Ausführungsformen ist die Stammzelle eine neurale Stammzelle (NSC). Neurale Stammzellen (NSC) können in Neuronen und Glia (einschließlich Oligodendrozyten und Astrozyten) differenzieren. Eine neurale Stammzelle ist eine multipotente Stammzelle, die sich mehrfach teilen kann und unter bestimmten Bedingungen Tochterzellen produzieren kann, die neurale Stammzellen sind, oder neurale Vorläuferzellen, die Neuroblasten oder Glioblasten sein können, z. B. Zellen, die darauf festgelegt sind, zu einer oder mehreren Arten von Neuronen bzw. Gliazellen zu werden. Verfahren zum Erhalten von NSC sind im Stand der Technik bekannt.
  • In anderen Ausführungsformen ist die Stammzelle eine mesenchymale Stammzelle (MSC). MSC, die ursprünglich aus dem embryonalen Mesoderm stammen und aus adulten Knochenmark isoliert wurden, können differenzieren, um Muskeln, Knochen, Knorpel, Fett, Markstroma und Sehnen zu bilden. Verfahren zum Isolieren von MSC sind im Stand der Technik bekannt; und es kann ein beliebiges bekanntes Verfahren verwendet werden, um MSC zu erhalten. Siehe z. B. US-Pat. Nr. 5,736,396 , das die Isolierung von menschlichem MSC beschreibt.
  • Eine Zelle ist in einigen Fällen eine Pflanzenzelle. Eine Pflanzenzelle kann eine Zelle eines Monokotyledons sein. Eine Pflanzenzelle kann eine Zelle eines Dikotyledons sein.
  • In einigen Fällen ist die Zelle eine Pflanzenzelle. Zum Beispiel kann die Zelle eine Zelle einer großen landwirtschaftlichen Pflanze sein, z. B. Gerste, Bohnen (trocken essbar), Raps, Mais, Baumwolle (Pima), Baumwolle (Upland), Leinsamen, Heu (Alfalfa), Heu (Nicht-Alfalfa), Hafer, Erdnüsse, Reis, Sorghum, Sojabohnen, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Sonnenblumen (Öl), Sonnenblumen (Nichtöl), Süßkartoffeln, Tabak (Burley), Tabak (heißluftgetrocknet), Tomaten, Weizen (Hartweizen), Weizen (Frühling), Weizen (Winter) und dergleichen. Als ein weiteres Beispiel ist die Zelle eine Zelle einer Gemüsekultur, zu der unter anderem Alfalfasprossen, Aloe-Blätter, Pfeilwurz, Pfeilkraut, Artischocken, Spargel, Bambussprossen, Bananenblüten, Bohnensprossen, Bohnen, Rübenblätter, Rüben, Bittermelone, Bok Choy, Brokkoli, Wildbrokkoli (Rappini), Rosenkohl, Kohl, Kohlsprossen, Kaktusblatt (Nopales), Calabaza, Kardone, Karotten, Blumenkohl, Sellerie, Chayote, chinesische Artischocke (Crosnes), Chinakohl, chinesischer Sellerie, chinesischer Schnittlauch, Choy Sum, Chrysanthemenblätter (Tung Ho), Blattkohl, Maisstängel, Zuckermais, Gurken, Daikon, Löwenzahngrün, Taro, Dau Mue (Erbsenspitzen), Donqua (Wintermelone), Auberginen, Endivien, Eskariol, Straußenfarne, Feldkresse, Frisee, Gai Choy (chinesischer Senf), Gailon, Galanga (Siam, thailändischer Ingwer), Knoblauch, Ingwerwurzel, Gobo, Grüngemüse, Winterrapsgrün, Huauzontle, Jerusalem-Artischocken, Jicama, Grünkohl, Kohlrabi, Weißer Gänsefuß (Quilete), Salat (Bibb), Salat (Boston), Salat (Boston Red), Salat (Grünsalat), Salat (Eisberg), Salat (Lolla Rossa), Salat (Eichblatt - grün), Salat (Eichblatt - rot), Salat (verarbeitet), Salat (Rotblatt), Salat (Römer), Salat (Römer rubin), Salat (russischer roter Senf), Linkok, Lo Bok, Spargelbohnen, Lotuswurzel, Feldsalat, Maguey-Blätter (Agave), Goldnarbe, Mesclun-Mix, Mizuna, Moap (Schwammgurke), Moo, Moqua (Fuzzy-Kürbis), Pilze, Senf, Nagaimo, Okra, Ong Choy, Zwiebelgrün, Opo (Flaschenkürbis), Ziermais, Zierkürbisse, Petersilie, Pastinaken, Erbsen, Paprika (Glockentyp), Paprika, Kürbisse, Radicchio, Radieschensprossen, Radieschen, Rapsgrün, Rapsgrün, Rhabarber, Römersalat (Babyrot), Rutabagas, Salicornia (Meerbohne), Sinqua (Flügelgurke), Spinat, Speisekürbis, Strohballen, Zuckerrohr, Süßkartoffel, Mangold, Tamarindo, Taro, Taro-Blatt, Taro-Triebe, Tatsoi, Tepeguaje (Guaje), Tindora, Tomatillos, Tomaten, Tomaten (Kirschtomate), Tomaten (Strauchtomate), Tomaten (Eiertomate), Kurkuma, Rübengrün, Rüben, Wasserkastanien, Yampi, Yamswurzeln (Yams), Yu Choy, Yuca (Maniok) und dergleichen gehören.
  • In einigen Fällen ist die Pflanzenzelle eine Zelle eines Pflanzenbestandteils wie etwa eines Blattes, eines Stammes, einer Wurzel, eines Samens, einer Blüte, eines Pollens, eines Staubbeutels, einer Eizelle, eines Stiels, einer Frucht, eines Meristems, eines Keimblatts, eines Hypokotyls, einer Schote, eines Embryos, eines Endospermiums, eines Explantats, eines Kallus oder eines Sprosses.
  • Eine Zelle ist in einigen Fällen eine Arthropodenzelle. Beispielsweise kann die Zelle eine Zelle einer Unterordnung, einer Familie, einer Unterfamilie, einer Gruppe, einer Untergruppe oder einer Art von z. B. Chelicerata, Myriapodia, Hexipodia, Arachnida, Insecta, Archaeognatha, Thysanura, Palaeoptera, Ephemeroptera, Odonata, Anisoptera, Zygoptera, Neoptera, Exopterygota, Plecoptera, Embioptera, Orthoptera, Zoraptera, Dermaptera, Dictyoptera, Notoptera, Grylloblattidae, Mantophasmatidae, Phasmatodea , Blattaria, Isoptera, Mantodea, Parapneuroptera, Psocoptera, Thysanoptera, Phthiraptera, Hemiptera, Endopterygota oder Holometabola, Hymenoptera, Coleoptera, Strepsiptera, Raphidioptera, Megaloptera, Neuroptera , Mecoptera , Siphonaptera, Diptera, Trichoptera oder Lepidoptera sein.
  • Eine Zelle ist in einigen Fällen eine Insektenzelle. In einigen Fällen ist die Zelle beispielsweise eine Zelle einer Mücke, einer Heuschrecke, einer Wanze, einer Fliege, eines Flohs, einer Biene, einer Wespe, einer Ameise, einer Laus, einer Motte oder eines Käfers.
  • Kits
  • Die vorliegende Offenbarung stellt ein Kit bereit, das ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung oder eine Komponente eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung umfasst.
  • Ein Kit der vorliegenden Offenbarung kann Folgendes umfassen: a) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guide-RNA; b) ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; c) ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung und eine Cas12J-Guideeit-RNA; d) ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; e) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; f) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; g) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; und eine Cas12J-Guide-RNA; h) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; i) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; j) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; k) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; 1) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine Donorvorlagen-Nukleinsäure codiert; m) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; n) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; o) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; p) einen ersten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, und einen zweiten rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine Donorvorlagen-Nukleinsäure; q) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder r) einen rekombinanten Expressionsvektor, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert, eine Nukleotidsequenz, die eine erste Cas12J-Guide-RNA codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine zweite Cas12J-Guide-RNA codiert; oder eine Variation von einem von (a) bis (r).
  • Ein Kit der vorliegenden Offenbarung kann Folgendes umfassen: a) eine Komponente, wie vorstehend beschrieben, eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung, oder kann ein Cas12J-System der vorliegenden Offenbarung umfassen; und b) ein oder mehrere zusätzliche Reagenzien, z. B. i) einen Puffer; ii) einen Proteasehemmer; iii) einen Nukleasehemmer; iv) ein Reagenz, das erforderlich ist, um eine nachweisbare Markierung zu entwickeln oder sichtbar zu machen; v) eine positive und/oder negative Kontrolle der Target-DNA; vi) eine positive und/oder negative Kontrolle der Cas12J-Guide-RNA; und dergleichen. Ein Kit der vorliegenden Offenbarung kann Folgendes umfassen: a) eine Komponente, wie vorstehend beschrieben, eines Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung oder kann ein Cas12J-Systems der vorliegenden Offenbarung umfassen; und b) ein Therapeutikum.
  • Ein Kit der vorliegenden Offenbarung kann einen rekombinanten Expressionsvektor umfassen, umfassend: a) eine Insertionsstelle zum Einfügen einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die einen Teil einer Cas12J-Guide-RNA codiert, die mit einer Target-Nukleotidsequenz in einer Target-Nukleinsäure hybridisiert; und b) eine Nukleotidsequenz, die den Cas12J-bindenden Abschnitt einer Cas12J-Guide-RNA codiert. Ein Kit der vorliegenden Offenbarung kann einen rekombinanten Expressionsvektor umfassen, umfassend: a) eine Insertionsstelle zum Einfügen einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die einen Teil einer Cas12J-Guide-RNA codiert, die mit einer Target-Nukleotidsequenz in einer Target-Nukleinsäure hybridisiert; b) eine Nukleotidsequenz, die den Cas12J-bindenden Abschnitt einer Cas12J-Guide-RNA codiert; und c) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert.
  • Nützlichkeit
  • Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung findet Verwendung in einer Vielzahl von Verfahren (z. B. in Kombination mit einer Cas12J-Guide-RNA und in einigen Fällen weiter in Kombination mit einer Donorvorlage). Beispielsweise kann ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung dazu werden, (i) die Target-Nukleinsäure (DNA oder RNA; einzelsträngig oder doppelsträngig) zu modifizieren (z. B. zu spalten, z. B. zu nicken, zu methylieren usw.); (ii) die Transkription einer Target-Nukleinsäure zu modulieren; (iii) eine Target-Nukleinsäure zu markieren; (iv) eine Target-Nukleinsäure zu binden (z. B. zum Zwecke der Isolierung, Markierung, Bildgebung, Verfolgung usw.); (v) ein Polypeptid (z. B. eines Histon), das mit einer Target-Nukleinsäure assoziiert ist, zu modifizieren; und dergleichen. Somit stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Modulieren einer Target-Nukleinsäure bereit. In einigen Fällen umfasst ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Kontaktieren der Target-Nukleinsäure mit: a) einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und b) einer oder mehreren (z. B. zwei) Cas12J-Guide-RNA. In einigen Fällen umfasst ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Kontaktieren der Target-Nukleinsäure mit: a) einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; b) einer Cas12J-Guide-RNA; und c) einer Donor-Nukleinsäure (z. B. einer Donorvorlage). In einigen Fällen wird der Schritt des Kontaktierens in einer Zelle in vitro durchgeführt. In einigen Fällen wird der Schritt des Kontaktierens in einer Zelle in vivo durchgeführt. In einigen Fällen wird der Schritt des Kontaktierens in einer Zelle ex vivo durchgeführt.
  • Da ein Verfahren, das ein Cas12J-Polypeptid verwendet, die Bindung des Cas12J-Polypeptids an eine bestimmte Region in einer Target-Nukleinsäure umfasst (da dort eine assoziierte Cas12J-Guide-RNA auf es abzielt), werden die Verfahren hierin allgemein als Verfahren zum Binden bezeichnet (z. B. ein Verfahren zum Binden einer Target-Nukleinsäure). Es versteht sich jedoch, dass in einigen Fällen, während ein Verfahren zum Binden nur zu einer Bindung der Target-Nukleinsäure führen kann, in anderen Fällen das Verfahren andere Endergebnisse haben kann (z. B. kann das Verfahren zu einer Modifikation der Target-Nukleinsäure führen, z. B. Spaltung/Methylierung/usw., Modulation der Transkription von der Target-Nukleinsäure; Modulation der Translation der Target-Nukleinsäure; Genom-Editing; Modulation eines mit der Target-Nukleinsäure assoziierten Proteins; Isolierung der Target-Nukleinsäure; usw.).
  • Für Beispiele von geeigneten Verfahren, siehe beispielsweise Jinek et al., Science. 17. Aug 2012; 337(6096):816-21; Chylinski et al., RNA Biol. Mai 2013; 10(5):726-37; Ma et al., Biomed Res Int. 2013; 2013:270805; Hou et al., Proc Natl Acad Sci USA. 24. Sep 2013; 110(39):15644-9; Jinek et al., Elife. 2013; 2:e00471; Pattanayak et al., Nat Biotechnol. Sep. 2013; 31(9):839-43; Qi et al, Cell. 28. Feb 2013; 152(5):1173-83; Wang et al., Cell. 9. Mai 2013; 153(4):910-8; Auer et al., Genome Res. 31. Okt 2013; Chen et al., Nucleic Acids Res. 1. Nov 2013; 41(20):e19; Cheng et al., Cell Res. Okt 2013; 23(10):1163-71; Cho et al., Genetics. Nov 2013; 195(3):1177-80; DiCarlo et al., Nucleic Acids Res. Apr 2013; 41(7):4336-43; Dickinson et al., Nat Methods. Okt 2013; 10(10):1028-34; Ebina et al., Sci Rep. 2013; 3:2510; Fujii et. al, Nucleic Acids Res. 1. Nov 2013; 41(20):e187; Hu et al., Cell Res. Nov 2013; 23(11):1322-5; Jiang et al., Nucleic Acids Res. 1. Nov 2013; 41(20):e188; Larson et al., Nat Protoc. Nov 2013; 8(11):2180-96; Mali et. at., Nat Methods. Okt 2013; 10(10):957-63; Nakayama et al., Genesis. Dez 2013; 51(12):835-43; Ran et al., Nat Protoc. Nov 2013; 8(11):2281-308; Ran et al., Cell. 12. Sep 2013; 154(6):1380-9; Upadhyay et al., G3 (Bethesda). 9. Dez 2013; 3(12):2233-8; Walsh et al., Proc Natl Acad Sci USA. 24. Sep 2013; 110(39):15514-5; Xie et al., Mol Plant. 9. Okt 2013; Yang et al., Cell. 12. Sep 2013; 154(6):1370-9; und US-Patente und Patentanmeldungen: 8,906,616 ; 8,895,308 ; 8,889,418 ; 8,889,356 ; 8,871,445 ; 8,865,406 ; 8,795,965 ; 8,771,945 ; 8,697,359 ; 20140068797 ; 20140170753 ; 20140179006 ; 20140179770 ; 20140186843 ; 20140186919 ; 20140186958 ; 20140189896 ; 20140227787 ; 20140234972 ; 20140242664 ; 20140242699 ; 20140242700 ; 20140242702 ; 20140248702 ; 20140256046 ; 20140273037 ; 20140273226 ; 20140273230 ; 20140273231 ; 20140273232 ; 20140273233 ; 20140273234 ; 20140273235 ; 20140287938 ; 20140295556 ; 20140295557 ; 20140298547 ; 20140304853 ; 20140309487 ; 20140310828 ; 20140310830 ; 20140315985 ; 20140335063 ; 20140335620 ; 20140342456 ; 20140342457 ; 20140342458 ; 20140349400 ; 20140349405 ; 20140356867 ; 20140356956 ; 20140356958 ; 20140356959 ; 20140357523 ; 20140357530 ; 20140364333 ; und 20140377868 ; von denen jedes hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen ist.
  • Beispielsweise stellt die vorliegende Offenbarung (unter anderem) Verfahren zum Spalten einer Target-Nukleinsäure; Verfahren zum Editieren einer Target-Nukleinsäure; Verfahren zum Modulieren der Transkription von einer Target-Nukleinsäure; Verfahren zum Isolieren einer Target-Nukleinsäure, Verfahren zum Binden einer Target-Nukleinsäure, Verfahren zum Abbilden einer Target-Nukleinsäure, Verfahren zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure und dergleichen bereit.
  • Wie hierin verwendet, schließen die Ausdrücke/Begriffe „eine Target-Nukleinsäure in Kontakt bringen“ und „Kontaktieren einer Target-Nukleinsäure“, beispielsweise mit einem Cas12J-Polypeptid oder mit einem Cas12J-Fusionspolypeptid usw., alle Verfahren zum Kontaktieren der Target-Nukleinsäure ein. Beispielsweise kann ein Cas12J-Polypeptid einer Zelle als Protein, RNA (das Cas12J-Polypeptid codierend) oder DNA (das Cas12J-Polypeptid codierend) bereitgestellt werden, während eine Cas12J-Guide-RNA als Guide-RNA oder als die Guide-RNA codierende Nukleinsäure bereitgestellt werden kann. Wenn beispielsweise ein Verfahren in einer Zelle durchgeführt wird (z. B. innerhalb einer Zelle in vitro, innerhalb einer Zelle in vivo, innerhalb einer Zelle ex vivo), schließt ein Verfahren, das das Kontaktieren der Target-Nukleinsäure beinhaltet, die Einbringung beliebiger oder aller Komponenten in ihrem aktiven/endgültigen Zustand (z. B. in Form eines Proteins (von Proteinen) für das Cas12J-Polypeptid; in Form eines Proteins für ein Cas12J-Fusionspolypeptid; in Form einer RNA in einigen Fällen für die Guide-RNA) in die Zelle ein und schließt auch die Einbringung einer oder mehrerer Nukleinsäuren, die eine oder mehrere der Komponenten codieren (z. B. Nukleinsäure(n), die eine oder mehrere Nukleotidsequenzen umfasst/umfassen, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid codieren, Nukleinsäure(n), die eine oder mehrere Nukleotidsequenzen umfasst/umfassen, die Guide-RNA codieren, Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine Donorvorlage codiert, und dergleichen), in die Zelle ein. Da die Verfahren auch in vitro außerhalb einer Zelle durchgeführt werden können, schließt ein Verfahren, das das Kontaktieren einer Target-Nukleinsäure beinhaltet, (sofern nicht anders angegeben) das Kontaktieren außerhalb einer Zelle in vitro, innerhalb einer Zelle in vitro, innerhalb einer Zelle in vivo, innerhalb einer Zelle ex vivo usw. ein.
  • In einigen Fällen schließt ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Einbringen eines Cas12J-Locus in eine Target-Zelle ein, z. B. einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid codiert, sowie Nukleotidsequenzen von etwa 1 Kilobase (kb) bis 5 kb Länge, die die Cas12J-codierende Nukleotidsequenz umgeben, von einer Zelle (z. B. in einigen Fällen eine Zelle, die in ihrem natürlichen Zustand (dem Zustand, in dem sie in der Natur vorkommt) einen Cas12J-Locus umfasst), umfassend einen Cas12J-Locus, wobei die Target-Zelle normalerweise (in ihrem natürlichen Zustand) keinen Cas12J-Locus umfasst. Eine oder mehrere Spacer-Sequenzen, die Guide-Sequenzen für die codierte(n) crRNA codieren, können jedoch so modifiziert werden, dass auf eine oder mehrere interessierende Target-Sequenzen abgezielt wird. So umfasst beispielsweise in einigen Fällen ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Einbringen, in eine Target-Zelle, eines Cas12J-Locus, z. B. einer Nukleinsäure, die aus einer Quellzelle erhalten wurde (z. B. in einigen Fällen eine Zelle, die in ihrem natürlichen Zustand (dem Zustand, in dem sie in der Natur vorkommt) einen Cas12J-Locus umfasst), wobei die Nukleinsäure eine Länge von 100 Nukleotiden (nt) bis 5 kb Länge hat (z. B. von 100 nt bis 500 nt, von 500 nt bis 1 kb, von 1 kb bis 1,5 kb, von 1,5 kb bis 2 kb, von 2 kb bis 2,5 kb, von 2,5 kb bis 3 kb, von 3 kb bis 3,5 kb, von 3,5 kb bis 4 kb oder von 4 kb bis 5 kb Länge) und umfasst eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid codiert. Wie vorstehend dargelegt, können in einigen dieser Fälle eine oder mehrere Spacer-Sequenzen, die Guide-Sequenzen für die codierte(n) crRNA codieren, jedoch so modifiziert werden, dass auf eine oder mehrere interessierende Target-Sequenzen abgezielt wird. In einigen Fällen umfasst das Verfahren das Einbringen in eine Target-Zelle: i) einen Cas12J-Locus; und ii) einer Donor-DNA-Vorlage. In einigen Fällen liegt die Target-Nukleinsäure in vitro in einer zellfreien Zusammensetzung vor. In einigen Fällen ist die Target-Nukleinsäure in einer Target-Zelle vorhanden. In einigen Fällen ist die Target-Nukleinsäure in einer Target-Zelle vorhanden, wobei die Target-Zelle eine prokaryotische Zelle ist. In einigen Fällen ist die Target-Nukleinsäure in einer Target-Zelle vorhanden, wobei die Target-Zelle eine eukaryotische Zelle ist. In einigen Fällen ist die Target-Nukleinsäure in einer Target-Zelle vorhanden, wobei die Target-Zelle eine Säugerzelle ist. In einigen Fällen ist die Target-Nukleinsäure in einer Target-Zelle vorhanden, wobei die Target-Zelle eine Pflanzenzelle ist.
  • In einigen Fällen umfasst ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Kontaktieren einer Target-Nukleinsäure mit einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung oder mit einem Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung. In einigen Fällen umfasst ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Kontaktieren einer Target-Nukleinsäure mit einem Cas12J-Polypeptid und einer Cas12J-Guide-RNA. In einigen Fällen umfasst ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Kontaktieren einer Target-Nukleinsäure mit einem Cas12J-Polypeptid, einer ersten Cas12J-Guide-RNA und einer zweiten Cas12J-Guide-RNA. In einigen Fällen umfasst ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure ein Kontaktieren einer Target-Nukleinsäure mit einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung und einer Cas12J-Guide-RNA und einer Donor-DNA-Vorlage.
  • Target-Nukleinsäuren und Target-Zellen von Interesse
  • Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung kann, wenn es an eine Cas12J-Guide-RNA gebunden ist, an eine Target-Nukleinsäure binden und in einigen Fällen an eine Target-Nukleinsäure binden und diese modifizieren. Eine Target-Nukleinsäure kann eine beliebige Nukleinsäure (z. B. DNA, RNA) sein, kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, kann eine beliebige Art von Nukleinsäure sein (z. B. ein Chromosom (genomische DNA), abgeleitet von einem Chromosom, chromosomale DNA, Plasmid, viral, extrazellulär, intrazellulär, mitochondrial, Chloroplasten, linear, zirkulär usw.) und kann von einem beliebigen Organismus stammen (z. B. solange die Cas12J-Guide-RNA eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit einer Target-Sequenz in einer Target-Nukleinsäure hybridisiert, so dass auf die Target-Nukleinsäure gezielt werden kann).
  • Eine Target-Nukleinsäure kann DNA oder RNA sein. Eine Target-Nukleinsäure kann doppelsträngig (z. B. dsDNA, dsRNA) oder einzelsträngig (z. B. ssRNA, ssDNA) sein. In einigen Fällen ist eine Target-Nukleinsäure einzelsträngig. In einigen Fällen ist eine Target-Nukleinsäure eine einzelsträngige RNA (ssRNA). In einigen Fällen wird eine Target-ssRNA (z. B. eine Target-Zell-ssRNA, eine virale ssRNA usw.) ausgewählt aus: mRNA, rRNA, tRNA, nicht-codierende RNA (ncRNA), lange nicht-codierende RNA (IncRNA) und microRNA (miRNA). In einigen Fällen ist eine Target-Nukleinsäure eine einzelsträngige DNA (ssDNA) (z. B. virale DNA). Wie vorstehend dargelegt, ist in einigen Fällen eine Target-Nukleinsäure einzelsträngig.
  • Eine Target-Nukleinsäure kann sich an einer beliebigen Position befinden, beispielsweise außerhalb einer Zelle in vitro, innerhalb einer Zelle in vitro, innerhalb einer Zelle in vivo, innerhalb einer Zelle ex vivo. Geeignete Target-Zellen (die Target-Nukleinsäuren wie etwa genomische DNA umfassen können) beinhalten unter anderem: eine Bakterienzelle; eine Archaeenzelle; eine Zelle eines einzelligen eukaryotischen Organismus; eine Pflanzenzelle; eine Algenzelle, z. B. Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorellapyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh und dergleichen; eine Pilzzelle (z. B. eine Hefezelle); eine Tierzelle; eine Zelle eines wirbellosen Tieres (z. B. Fruchtfliege, ein Nesseltier, ein Stachelhäuter, ein Nematode usw.); eine Zelle eines Insekts (z. B. eine Mücke, eine Biene, ein landwirtschaftlicher Schädling usw.); eine Zelle eines Spinnentiers (z. B. eine Spinne, eine Zecke usw.); eine Zelle eines Wirbeltieres (z. B. ein Fisch, eine Amphibie, ein Reptil, ein Vogel, ein Säuger); eine Zelle eines Säugers (z. B. eine Zelle eines Nagetiers; eine Zelle eines Menschen; eine Zelle eines nichtmenschlichen Säugers; eine Zelle eines Nagetiers (z. B. eine Maus, eine Ratte); eine Zelle eines Hasenartigen (z. B. ein Kaninchen), eine Zelle eines Huftiers (z. B. eine Kuh, ein Pferd, ein Kamel, ein Lama, eine Vicuña, ein Schaf, eine Ziege usw.), eine Zelle eines Meeressäugers (z. B. ein Wal, ein Seehund, ein Seeelefant, ein Delphin, ein Seelöwe usw.) und dergleichen. Eine beliebige Art von Zelle kann von Interesse sein (z. B. eine Stammzelle, z. B. eine embryonale Stammzelle (ES), eine induzierte pluripotente Stammzelle (iPS), eine Keimzelle (z. B. eine Eizelle, ein Spermium, eine Oogonie, eine Spermatogonie usw.), eine adulte Stammzelle, eine somatische Zelle, z. B. ein Fibroblast, eine hämatopoetische Zelle, ein Neuron, eine Muskelzelle, eine Knochenzelle, ein Hepatozyt, eine Pankreaszelle; eine In-vitro- oder In-vivo-Embryozelle eines Embryos in einem beliebigen Stadium, z.B. ein 1-zelliges, 2-zelliges, 4-zelliges, 8-zelliges usw. Stadium eines Zebrafisch-Embryos usw.).
  • Zellen können aus etablierten Zelllinien stammen oder sie können Primärzellen sein, wobei „Primärzellen“, „Primärzelllinien“ und „Primärkulturen“ hierin austauschbar verwendet werden, um sich auf Zellen und Zellkulturen zu beziehen, die von einem Subjekt abgeleitet wurden und in vitro für eine begrenzte Anzahl von Passagen, d. h. Teilungen, der Kultur wachsen gelassen werden. Zum Beispiel sind Primärkulturen Kulturen, die 0-mal, 1-mal, 2-mal, 4-mal, 5-mal, 10-mal oder 15-mal passagieren, aber nicht genügend mal die Krisenphase durchlaufen. Typischerweise werden die primären Zelllinien in vitro für weniger als 10 Passagen gehalten. Target-Zellen können einzellige Organismen sein und/oder können in Kultur gezüchtet werden. Wenn die Zellen Primärzellen sind, können sie durch ein beliebiges geeignetes Verfahren von einem Individuum geerntet werden. Beispielsweise können Leukozyten einfach durch Apherese, Leukozytapherese, Dichtegradiententrennung usw. geerntet werden, während Zellen aus Geweben wie etwa Haut, Muskel, Knochenmark, Milz, Leber, Bauchspeicheldrüse, Lunge, Darm, Magen usw. einfach durch Biopsie geerntet werden können.
  • In einigen der vorstehenden Anwendungen können die vorliegenden Verfahren angewendet werden, um eine Target-Nukleinsäurespaltung zu induzieren, um eine Target-Nukleinsäuremodifikation zu induzieren und/oder um Target-Nukleinsäuren (z. B. zur Visualisierung, zum Sammeln und/oder zum Analysieren usw.) in mitotischen oder postmitotischen Zellen in vivo und/oder ex-vivo und/oder in vitro zu binden (z. B. um die Produktion eines Proteins zu stören, das von einer Target-mRNA codiert wird, um Target-DNA zu spalten oder auf andere Weise zu modifizieren, um eine Target-Zelle genetisch zu modifizieren und dergleichen). Weil die Guide-RNA durch Hybridisierung mit der Target-Nukleinsäure Spezifität bereitstellt, kann eine mitotische und/oder postmitotische Zelle, die für die offenbarten Verfahren von Interesse ist, eine Zelle aus einem beliebigen Organismus enthalten (z. B. eine Bakterienzelle, eine Archaeenzelle, eine Zelle eines einzelligen eukaryotischen Organismus, eine Pflanzenzelle, eine Algenzelle, z. B. Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh und dergleichen, eine Pilzzelle (z. B. eine Hefezelle), eine Tierzelle, eine Zelle eines wirbellosen Tieres (z. B. Fruchtfliege, Nesseltier, Stachelhäuter, Nematode usw.), eine Zelle eines Wirbeltieres (z. B. Fisch, Amphibie, Reptil, Vogel, Säuger), eine Zelle eines Säugers, eine Zelle eines Nagetiers, eine Zelle eines Menschen usw.). In einigen Fällen kann ein Subjekt-Cas12J-Protein (und/oder eine Nukleinsäure, die das Protein codiert, wie etwa DNA und/oder RNA) und/oder Cas12J-Guide-RNA (und/oder eine DNA, die die Guide-RNA codiert) und/oder eine Donorvorlage und/oder RNP in ein Individuum eingebracht werden (d. h. die Target-Zelle kann in vivo sein) (z. B. ein Säuger, eine Ratte, eine Maus, ein Schwein, ein Primat, ein nichtmenschlicher Primat, ein Mensch usw.). In einigen Fällen kann eine solche Verabreichung zum Zweck des Behandelns und/oder des Verhinderns einer Erkrankung erfolgen, z. B. durch Editieren des Genoms von Target-Zellen.
  • Pflanzenzellen umfassen Zellen eines Monokotyledons und Zellen eines Dikotyledons. Die Zellen können Wurzelzellen, Blattzellen, Zellen des Xylems, Zellen des Phloems, Zellen des Kambiums, apikale Meristemzellen, Parenchymzellen, Collenchymzellen, Sklerchymzellen und dergleichen sein. Pflanzenzellen umfassen Zellen landwirtschaftlicher Kulturpflanzen wie etwa Weizen, Mais, Reis, Sorghum, Hirse, Sojabohnen usw. sein. Pflanzenzellen beinhalten Zellen landwirtschaftlicher Obst- und Nusspflanzen, z. B. Pflanzen, die Aprikosen, Orangen, Zitronen, Äpfel, Pflaumen, Birnen, Mandeln usw. produzieren.
  • Zusätzliche Beispiele für Target-Zellen sind vorstehend im Abschnitt „Modifizierte Zellen“ aufgeführt. Nicht einschränkende Beispiele für Zellen (Target-Zellen) beinhalten: eine prokaryotische Zelle, eine eukaryotische Zelle, eine Bakterienzelle, eine Archaeenzelle, eine Zelle eines einzelligen eukaryotischen Organismus, eine Protozoenzelle, eine Zelle aus einer Pflanze (z. B. Zellen aus Kulturpflanzen, Obst, Gemüse, Getreide, Sojabohnen, Mais, Weizen, Samen, Tomaten, Reis, Maniok, Zuckerrohr, Kürbis, Heu, Kartoffeln, Baumwolle, Cannabis, Tabak, Blütenpflanzen, Nadelbäume, Gymnospermen, Angiospermen, Farne, Bärlappgewächse, Hornmoose, Leberblümchen, Moose, Dikotyledonen, Monokotyledonen usw.), eine Algenzelle (z. B. Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh und dergleichen), Seegräser (z. B. Seetang), eine Pilzzelle (z. B. eine Hefezelle, eine Zelle aus einem Pilz), eine Tierzelle, eine Zelle aus einem wirbellosen Tier (z. B. Fruchtfliege, Nesseltier, Stachelhäuter, Nematode usw.), eine Zelle aus ein Wirbeltier (z. B. Fisch, Amphibie, Reptil, Vogel, Säuger), eine Zelle eines Säugers (z. B. ein Huftier (z. B. ein Schwein, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf); ein Nagetier (z. B. eine Ratte, eine Maus); ein nichtmenschlicher Primat; ein Mensch; Katzenartige (z. B. eine Katze); Hundeartige (z. B. ein Hund); usw.) und dergleichen. In einigen Fällen ist die Zelle eine Zelle, die nicht von einem natürlichen Organismus stammt (z. B. kann die Zelle eine synthetisch hergestellte Zelle sein; auch als künstliche Zelle bezeichnet).
  • Eine Zelle kann eine In-vitro-Zelle sein (z. B. eine etablierte kultivierte Zelllinie). Eine Zelle kann eine Ex-vivo-Zelle sein (kultivierte Zelle aus einem Individuum). Eine Zelle kann eine In-vivo-Zelle sein (z. B. eine Zelle in einem Individuum). Eine Zelle kann eine isolierte Zelle sein. Eine Zelle kann eine Zelle innerhalb eines Organismus sein. Eine Zelle kann ein Organismus sein. Eine Zelle kann eine Zelle in einer Zellkultur sein (z. B. In-vitro-Zellkultur). Eine Zelle kann Teil einer Sammlung von Zellen sein. Eine Zelle kann eine prokaryotische Zelle sein oder von einer prokaryotischen Zelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Bakterienzelle sein oder von einer Bakterienzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Archaeenzelle sein oder von einer Archaeenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine eukaryotische Zelle sein oder von einer eukaryotischen Zelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Pflanzenzelle sein oder von einer Pflanzenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Tierzelle sein oder von einer Tierzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Wirbellosenzelle sein oder von einer Wirbellosenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Wirbeltierzelle sein oder von einer Wirbeltierzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Säugerzelle sein oder von einer Säugerzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Nagetierzelle sein oder von einer Nagetierzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine menschliche Zelle sein oder von einer menschlichen Zelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Mikrobenzelle sein oder von einer Mikrobenzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Pilzzelle sein oder von einer Pilzzelle abgeleitet sein. Eine Zelle kann eine Insektenzelle sein. Eine Zelle kann ein Anthropodenzelle sein. Eine Zelle kann eine Protozoenzelle sein. Eine Zelle kann eine Helminthenzelle sein.
  • Geeignete Zellen beinhalten eine Stammzelle (z. B. eine embryonale Stammzelle (ES), eine induzierte pluripotente Stammzelle (iPS); eine Keimzelle (z. B. eine Eizelle, ein Spermium, eine Oogonie, eine Spermatogonie usw.); eine somatische Zelle, z. B. ein Fibroblast, ein Oligodendrozyt, eine Gliazelle, eine hämatopoetische Zelle, ein Neuron, eine Muskelzelle, eine Knochenzelle, ein Hepatozyt, eine Pankreaszelle usw.
  • Geeignete Zellen beinhalten humane embryonale Stammzellen, fetale Kardiomyozyten, Myofibroblasten, mesenchymale Stammzellen, Kardiomyozyten, Adipozyten, totipotente Zellen, pluripotente Zellen, Blutstammzellen, Myoblasten, adulte Stammzellen, Knochenmarkzellen, mesenchymale Zellen, embryonale Stammzellen, Parenchymzellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Mesothelzellen, Fibroblasten, Osteoblasten, Chondrozyten, exogene Zellen, endogene Zellen, Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, Vorläuferzellen aus dem Knochenmark, Myokardzellen, Skelettzellen, Fötuszellen, undifferenzierte Zellen, multipotente Vorläuferzellen, unipotente Vorläuferzellen, Monozyten, Herzmyoblasten, Skelettmyoblasten, Makrophagen, Kapillarendothelzellen, xenogene Zellen, allogene Zellen und postnatale Stammzellen.
  • In einigen Fällen ist die Zelle eine Immunzelle, ein Neuron, eine Epithelzelle, eine Endothelzelle oder eine Stammzelle. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine T-Zelle, eine B-Zelle, ein Monozyt, eine natürliche Killerzelle, eine dendritische Zelle oder ein Makrophage. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine zytotoxische T-Zelle. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine Helfer-T-Zelle. In einigen Fällen ist die Immunzelle eine regulatorische -T-Zelle (Treg).
  • In einigen Fällen ist die Zelle eine Stammzelle. Stammzellen schließen adulte Stammzellen ein. Adulte Stammzellen werden auch als somatische Stammzellen bezeichnet.
  • Adulte Stammzellen befinden sich in differenziertem Gewebe, behalten jedoch die Eigenschaften der Selbsterneuerung und die Fähigkeit, mehrere Zelltypen hervorzubringen, üblicherweise Zelltypen, die für das Gewebe typisch sind, in dem sich die Stammzellen befinden. Dem Fachmann sind zahlreiche Beispiele für somatische Stammzellen bekannt, einschließlich Muskelstammzellen; hämatopoetische Stammzellen; epitheliale Stammzellen; neurale Stammzellen; mesenchymale Stammzellen; Bruststammzellen; Darmstammzellen; mesodermale Stammzellen; endotheliale Stammzellen; olfaktorische Stammzellen; Stammzellen des Nervenkamms und dergleichen.
  • Stammzellen von Interesse umfassen Säugerstammzellen, wobei sich der Ausdruck „Säuger“ auf jedes Tier bezieht, das als Säuger klassifiziert ist, einschließlich Menschen; nichtmenschliche Primaten; Haus- und Nutztiere; und Zoo-, Labor-, Sport- oder Heimtiere wie etwa Hunde, Pferde, Katzen, Kühe, Mäuse, Ratten, Kaninchen usw. In einigen Fällen ist die Stammzelle eine menschliche Stammzelle. In einigen Fällen ist die Stammzelle eine Nagetierstammzelle (z. B. einer Maus; einer Ratte). In einigen Fällen ist die Stammzelle eine Stammzelle eines nichtmenschlichen Primaten.
  • Stammzellen können einen oder mehrere Stammzellmarker exprimieren, z. B. SOX9, KRT19, KRT7, LGR5, CA9, FXYD2, CDH6, CLDN18, TSPAN8, BPIFB1, OLFM4, CDH17 und PPARGC1A.
  • In einigen Fällen ist die Stammzelle eine hämatopoetische Stammzelle (HSC). HSC sind von Mesoderm abgeleitete Zellen, die aus Knochenmark, Blut, Nabelschnurblut, fötaler Leber und Dottersack isoliert werden können. HSC sind als CD34+ und CD3- charakterisiert. HSC können in vivo die Erythroid-, Neutrophilen-Makrophagen-, Megakaryozyten- und lymphoiden hämatopoetischen Zelllinien neu bevölkern. In vitro können HSC dazu gebracht werden, mindestens einige sich selbst erneuernde Zellteilungen zu durchlaufen, und sie können dazu gebracht werden, sich zu denselben Linien zu differenzieren, wie dies in vivo zu sehen ist. Somit können HSC induziert werden, um in eine oder mehrere von Erythroidzellen, Megakaryozyten, Neutrophilen, Makrophagen und lymphoiden Zellen zu differenzieren.
  • In anderen Ausführungsformen ist die Stammzelle eine neurale Stammzelle (NSC). Neurale Stammzellen (NSC) können in Neuronen und Glia (einschließlich Oligodendrozyten und Astrozyten) differenzieren. Eine neurale Stammzelle ist eine multipotente Stammzelle, die sich mehrfach teilen kann und unter bestimmten Bedingungen Tochterzellen produzieren kann, die neurale Stammzellen sind, oder neurale Vorläuferzellen, die Neuroblasten oder Glioblasten sein können, z. B. Zellen, die darauf festgelegt sind, zu einer oder mehreren Arten von Neuronen bzw. Gliazellen zu werden. Verfahren zum Erhalten von NSC sind im Stand der Technik bekannt.
  • In anderen Ausführungsformen ist die Stammzelle eine mesenchymale Stammzelle (MSC). MSC, die ursprünglich aus dem embryonalen Mesoderm stammen und aus adulten Knochenmark isoliert wurden, können differenzieren, um Muskeln, Knochen, Knorpel, Fett, Markstroma und Sehnen zu bilden. Verfahren zum Isolieren von MSC sind im Stand der Technik bekannt; und es kann ein beliebiges bekanntes Verfahren verwendet werden, um MSC zu erhalten. Siehe z. B. US-Pat. Nr. 5,736,396 , das die Isolierung von menschlichem MSC beschreibt.
  • Eine Zelle ist in einigen Fällen eine Pflanzenzelle. Eine Pflanzenzelle kann eine Zelle eines Monokotyledons sein. Eine Pflanzenzelle kann eine Zelle eines Dikotyledons sein.
  • In einigen Fällen ist die Zelle eine Pflanzenzelle. Zum Beispiel kann die Zelle eine Zelle einer großen landwirtschaftlichen Pflanze sein, z. B. Gerste, Bohnen (trocken essbar), Raps, Mais, Baumwolle (Pima), Baumwolle (Upland), Leinsamen, Heu (Alfalfa), Heu (Nicht-Alfalfa), Hafer, Erdnüsse, Reis, Sorghum, Sojabohnen, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Sonnenblumen (Öl), Sonnenblumen (Nichtöl), Süßkartoffeln, Tabak (Burley), Tabak (heißluftgetrocknet), Tomaten, Weizen (Hartweizen), Weizen (Frühling), Weizen (Winter) und dergleichen. Als ein weiteres Beispiel ist die Zelle eine Zelle einer Gemüsekultur, zu der unter anderem Alfalfasprossen, Aloe-Blätter, Pfeilwurz, Pfeilkraut, Artischocken, Spargel, Bambussprossen, Bananenblüten, Bohnensprossen, Bohnen, Rübenblätter, Rüben, Bittermelone, Bok Choy, Brokkoli, Wildbrokkoli (Rappini), Rosenkohl, Kohl, Kohlsprossen, Kaktusblatt (Nopales), Calabaza, Kardone, Karotten, Blumenkohl, Sellerie, Chayote, chinesische Artischocke (Crosnes), Chinakohl, chinesischer Sellerie, chinesischer Schnittlauch, Choy Sum, Chrysanthemenblätter (Tung Ho), Blattkohl, Maisstängel, Zuckermais, Gurken, Daikon, Löwenzahngrün, Taro, Dau Mue (Erbsenspitzen), Donqua (Wintermelone), Auberginen, Endivien, Eskariol, Straußenfarne, Feldkresse, Frisee, Gai Choy (chinesischer Senf), Gailon, Galanga (Siam, thailändischer Ingwer), Knoblauch, Ingwerwurzel, Gobo, Grüngemüse, Winterrapsgrün, Huauzontle, Jerusalem-Artischocken, Jicama, Grünkohl, Kohlrabi, Weißer Gänsefuß (Quilete), Salat (Bibb), Salat (Boston), Salat (Boston Red), Salat (Grünsalat), Salat (Eisberg), Salat (Lolla Rossa), Salat (Eichblatt - grün), Salat (Eichblatt - rot), Salat (verarbeitet), Salat (Rotblatt), Salat (Römer), Salat (Römer rubin), Salat (russischer roter Senf), Linkok, Lo Bok, Spargelbohnen, Lotuswurzel, Feldsalat, Maguey-Blätter (Agave), Goldnarbe, Mesclun-Mix, Mizuna, Moap (Schwammgurke), Moo, Moqua (Fuzzy-Kürbis), Pilze, Senf, Nagaimo, Okra, Ong Choy, Zwiebelgrün, Opo (Flaschenkürbis), Ziermais, Zierkürbisse, Petersilie, Pastinaken, Erbsen, Paprika (Glockentyp), Paprika, Kürbisse, Radicchio, Radieschensprossen, Radieschen, Rapsgrün, Rapsgrün, Rhabarber, Römersalat (Babyrot), Rutabagas, Salicornia (Meerbohne), Sinqua (Flügelgurke), Spinat, Speisekürbis, Strohballen, Zuckerrohr, Süßkartoffel, Mangold, Tamarindo, Taro, Taro-Blatt, Taro-Triebe, Tatsoi, Tepeguaje (Guaje), Tindora, Tomatillos, Tomaten, Tomaten (Kirschtomate), Tomaten (Strauchtomate), Tomaten (Eiertomate), Kurkuma, Rübengrün, Rüben, Wasserkastanien, Yampi, Yamswurzeln, Yu Choy, Yuca (Maniok) und dergleichen gehören.
  • Eine Zelle ist in einigen Fällen eine Arthropodenzelle. Beispielsweise kann die Zelle eine Zelle einer Unterordnung, einer Familie, einer Unterfamilie, einer Gruppe, einer Untergruppe oder einer Art von z. B. Chelicerata, Myriapodia, Hexipodia, Arachnida, Insecta, Archaeognatha, Thysanura, Palaeoptera, Ephemeroptera, Odonata, Anisoptera, Zygoptera, Neoptera, Exopterygota, Plecoptera , Embioptera , Orthoptera, Zoraptera , Dermaptera, Dictyoptera, Notoptera, Grylloblattidae, Mantophasmatidae, Phasmatodea , Blattaria, Isoptera, Mantodea, Parapneuroptera, Psocoptera, Thysanoptera, Phthiraptera, Hemiptera, Endopterygota oder Holometabola , Hymenoptera, Coleoptera, Strepsiptera, Raphidioptera, Megaloptera, Neuroptera , Mecoptera , Siphonaptera, Diptera, Trichoptera oder Lepidoptera sein.
  • Eine Zelle ist in einigen Fällen eine Insektenzelle. In einigen Fällen ist die Zelle beispielsweise eine Zelle einer Mücke, einer Heuschrecke, einer Wanze, einer Fliege, eines Flohs, einer Biene, einer Wespe, einer Ameise, einer Laus, einer Motte oder eines Käfers.
  • Einbringung von Komponenten in eine Target-Zelle
  • Eine Cas12J-Guide-RNA (oder eine Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die dieselbe codiert) und/oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid (oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die dieselbe codiert) und/oder ein Donor-Polynukleotid kann durch eine beliebige aus einer Vielzahl bekannter Verfahren in eine Wirtszelle eingebracht werden.
  • Verfahren zum Einbringen einer Nukleinsäure in eine Zelle sind im Stand der Technik bekannt und es kann ein beliebiges geeignetes Verfahren verwendet werden, um eine Nukleinsäure (z. B. ein Expressionskonstrukt) in eine Target-Zelle (z. B. eukaryotische Zelle, menschliche Zelle, Stammzelle, Vorläuferzelle und dergleichen) einzubringen. Geeignete Verfahren sind an anderer Stelle hierin detaillierter beschrieben und enthalten z. B. Virus- oder Bakterieninfektion, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Lipofektion, Elektroporation, Calciumphosphatfällung, Polyethylenimin (PEI)-vermittelte Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Liposomen-vermittelte Transfektion, Partikelkanonen-Technologie, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion, Nanopartikel-vermittelte Nukleinsäureabgabe (siehe z. B. Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 13. September 2012, pii: S0169-409X(12)00283-9. Doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) und dergleichen. Einige oder alle der Komponenten können als eine Zusammensetzung (z. B. einschließlich einer beliebigen geeigneten Kombination von: einem Cas12J-Polypeptid, einer Cas12J-Guide-RNA, einem Donor-Polynukleotid usw.) unter Verwendung bekannter Verfahren, z. B. wie etwa Nukleofektion, in eine Zelle eingebracht werden.
  • Donor-Polynukleotid (Donorvorlage)
  • Geleitet von einer Cas12J-Gulde-RNA, erzeugt ein Cas12J-Protein in einigen Fällen stellenspezifische Doppelstrangbrüche (DSB) oder Einzelstrangbrüche (SSB) (z. B. wenn das Cas12J-Protein eine Nickase-Variante ist) innerhalb doppelsträngiger DNA (dsDNA)-Target-Nukleinsäuren, die entweder durch nicht homologe Endverknüpfung (non-homologous end joining - NHEJ) oder durch homologiegesteuerte Rekombination (homology-directed recombination - HDR) repariert werden.
  • In einigen Fällen erfolgt das Kontaktieren einer Target-DNA (mit einem Cas12J-Protein und einer Cas12J-Guide-RNA) unter Bedingungen, die eine nicht homologe Endverknüpfung oder eine homologiegesteuerte Reparatur zulassen. Somit beinhaltet in einigen Fällen ein Subjektverfahren das Kontaktieren der Target-DNA mit einem Donor-Polynukleotid (z. B. durch Einbringen des Donor-Polynukleotids in eine Zelle), wobei das Donor-Polynukleotid, ein Abschnitt des Donor-Polynukleotids, eine Kopie des Donor-Polynukleotids oder ein Abschnitt einer Kopie des Donor-Polynukleotids in die Target-DNA integriert. In einigen Fällen umfasst das Verfahren nicht das Kontaktieren einer Zelle mit einem Donor-Polynukleotid, und die Target-DNA wird so modifiziert, dass Nukleotide innerhalb der Target-DNA deletiert werden.
  • In einigen Fällen werden Cas12J-Guide-RNA (oder DNA, die dieselbe codiert) und ein Cas12J-Protein (oder eine Nukleinsäure, die dasselbe codiert, wie etwa eine RNA oder eine DNA, z. B. ein oder mehrere Expressionsvektoren) mit einer Donor-Polynukleotidsequenz, die mindestens ein Segment mit Homologie zur Target-DNA-Sequenz enthält, gemeinsam verabreicht (z. B. mit einer Target-Nukleinsäure in Kontakt bringen, an Zellen verabreicht usw.), wobei die zugrundeliegenden Verfahren dazu verwendet werden können, einer Target-DNA-Sequenz Nukleinsäurematerial hinzuzufügen, d. h. einzufügen oder zu ersetzen (z. B. um eine Nukleinsäure „einzuschalten“, z. B. eine, die ein Protein, eine siRNA, eine miRNA usw. codiert), ein Tag hinzuzufügen (z. B. 6xHis, ein fluoreszierendes Protein (z. B. ein grün fluoreszierendes Protein; ein gelb fluoreszierendes Protein usw.), Hämagglutinin (HA), FLAG usw.), einem Gen eine regulatorische Sequenz hinzuzufügen (z. B. Promotor, Polyadenylierungssignal, interne Ribosomeneintrittssequenz (IRES), 2A-Peptid, Startcodon, Stoppcodon, Spleißsignal, Lokalisierungssignal usw.), eine Nukleinsäuresequenz zu modifizieren (z. B. eine Mutation einzuführen, eine erkrankungsverursachende Mutation zu entfernen, indem eine korrekte Sequenz eingebracht wird) und dergleichen. Somit ist ein Komplex, der eine Cas12J-Guide-RNA und ein Cas12J-Protein umfasst, in einer beliebigen In-vitro- oder In-vivo-Anwendung nützlich, in der es wünschenswert ist, DNA auf eine stellenspezifische, d. h. „gezielte“ Weise zu modifizieren, beispielsweise Gen-Knock-Out, Gen-Knock-In, Gen-Editing, Gen-Tagging usw., wie sie beispielsweise in der Gentherapie verwendet werden, z. B. zur Behandlung einer Erkrankung oder als ein antivirales, antipathogenes oder Antikrebstherapeutikum, die Produktion genetisch modifizierter Organismen in der Landwirtschaft, die Produktion von Proteinen in großem Maßstab durch Zellen für therapeutische, diagnostische oder Forschungszwecke, die Induktion von iPS-Zellen, die biologische Forschung, das Targeting von Genen von Pathogenen zur Deletion oder zum Ersatz usw.
  • Bei Anwendungen, bei denen es wünschenswert ist, eine Polynukleotidsequenz in das Genom, in dem eine Target-Sequenz gespalten wird, einzufügen, kann der Zelle auch ein Donor-Polynukleotid (eine Nukleinsäure, die eine Donor-Sequenz umfasst) bereitgestellt werden. Eine „Donor-Sequenz“ oder ein „Donor-Polynukleotid“ oder eine „Donorvorlage“ ist eine Nukleinsäuresequenz, die an der durch das Cas12J-Protein gespaltenen Stelle eingefügt werden soll (z. B. nach der dsDNA-Spaltung, nach dem Nicken einer Target-DNA nach dem doppelten Nicken einer Target-DNA und dergleichen). Das Donor-Polynukleotid kann eine ausreichende Homologie zu einer genomischen Sequenz an der Target-Stelle enthalten, z. B. 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 100 % Homologie mit den Nukleotidsequenzen, die die Target-Stelle flankieren, z. B. innerhalb von etwa 50 Basen oder weniger von der Target-Stelle, z. B. innerhalb von etwa 30 Basen, innerhalb von etwa 15 Basen, innerhalb von etwa 10 Basen, innerhalb von etwa 5 Basen oder unmittelbar flankierend zu der Target-Stelle, um die homologiegesteuerte Reparatur zwischen ihr und der Genomsequenz, zu der sie Homologie aufweist, zu unterstützen. Etwa 25, 50, 100 oder 200 Nukleotide oder mehr als 200 Nukleotide der Sequenzhomologie zwischen einem Donor und einer genomischen Sequenz (oder ein ganzzahliger Wert zwischen 10 und 200 Nukleotiden oder mehr) können eine homologiegesteuerte Reparatur unterstützen. Donor-Polynukleotide können beliebig lang sein, z.B. 10 Nukleotide oder mehr, 50 Nukleotide oder mehr, 100 Nukleotide oder mehr, 250 Nukleotide oder mehr, 500 Nukleotide oder mehr, 1000 Nukleotide oder mehr, 5000 Nukleotide oder mehr usw.
  • Die Donor-Sequenz ist typischerweise nicht identisch mit der Genomsequenz, die sie ersetzt. Vielmehr kann die Donor-Sequenz mindestens eine oder mehrere einzelne Basenänderungen, Insertionen, Deletionen, Inversionen oder Umlagerungen in Bezug auf die Genomsequenz enthalten, solange eine ausreichende Homologie vorhanden ist, um eine homologiegesteuerte Reparatur zu unterstützen (z. B. zur Genkorrektur, z. B. um ein erkrankungsverursachendes Basenpaar in ein nicht erkrankungsverursachendes Basenpaar umzuwandeln). In einigen Ausführungsformen umfasst die Donor-Sequenz eine nicht homologe Sequenz, die von zwei Regionen der Homologie flankiert wird, so dass eine homologiegesteuerte Reparatur zwischen der Target-DNA-Region und den zwei flankierenden Sequenzen zur Insertion der nicht homologen Sequenz in die Target-Region führt. Donor-Sequenzen können auch ein Vektorrückgrat umfassen, das Sequenzen enthält, die nicht homolog zu der interessierenden DNA-Region sind und die nicht zur Insertion in die interessierende DNA-Region bestimmt sind. Im Allgemeinen weisen die homologen Regionen einer Donor-Sequenz eine Sequenzidentität von mindestens 50 % zu einer genomischen Sequenz auf, mit der eine Rekombination erwünscht ist. In bestimmten Ausführungsformen sind 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % oder 99,9 % Sequenzidentität vorhanden. Ein beliebiger Wert zwischen 1 % und 100 % Sequenzidentität kann abhängig von der Länge des Donor-Polynukleotids vorhanden sein.
  • Die Donor-Sequenz kann bestimmte Sequenzunterschiede im Vergleich zur genomischen Sequenz umfassen, z. B. Restriktionsstellen, Nukleotidpolymorphismen, selektierbare Marker (z. B. Arzneimittelresistenzgene, fluoreszierende Proteine, Enzyme usw.) usw., die zur Beurteilung der erfolgreichen Insertion der Donor-Sequenz an der Spaltungsstelle verwendet werden können oder in einigen Fällen für andere Zwecke verwendet werden können (z. B. um die Expression am Target-Genomlocus zu kennzeichnen). In einigen Fällen ändern solche Nukleotidsequenzunterschiede, wenn sie sich in einer codierenden Region befinden, nicht die Aminosäuresequenz oder führen zu stillen Aminosäureänderungen (d. h. Änderungen, die die Struktur oder Funktion des Proteins nicht beeinflussen). Alternativ können diese Sequenzunterschiede flankierende Rekombinationssequenzen wie etwa FLP, loxP-Sequenzen oder dergleichen einschließen, die zu einem späteren Zeitpunkt zum Entfernen der Markersequenz aktiviert werden können.
  • In einigen Fällen wird die Donor-Sequenz der Zelle als einzelsträngige DNA bereitgestellt. In einigen Fällen wird die Donor-Sequenz der Zelle als doppelsträngige DNA bereitgestellt. Es kann in linearer oder kreisförmiger Form in eine Zelle eingebracht werden. Wenn sie in linearer Form eingebracht werden, können die Enden der Donor-Sequenz durch ein beliebiges geeignetes Verfahren geschützt werden (z. B. vor exonukleolytischem Abbau) und solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können ein oder mehrere Didesoxynukleotidreste an den 3'-Terminus eines linearen Moleküls angefügt werden und/oder selbstkomplementäre Oligonukleotide können an ein oder beide Enden ligiert werden. Siehe zum Beispiel Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Zusätzliche Verfahren zum Schutz exogener Polynukleotide vor Abbau beinhalten unter anderem die Zugabe von terminalen Aminogruppen und die Verwendung von modifizierten Internukleotidbindungen wie beispielsweise Phosphorothioaten, Phosphoramidaten und O-Methylribose- oder Desoxyriboseresten. Als Alternative zum Schutz der Termini einer linearen Donor-Sequenz können zusätzliche Sequenzlängen außerhalb der Homologieregionen enthalten sein, die abgebaut werden können, ohne die Rekombination zu beeinflussen. Eine Donor-Sequenz kann als Teil eines Vektormoleküls mit zusätzlichen Sequenzen wie beispielsweise Replikationsursprüngen, Promotoren und Genen, die für Antibiotikaresistenz codieren, in eine Zelle eingebracht werden. Darüber hinaus können Donor-Sequenzen als nackte Nukleinsäure, als mit einem Mittel wie etwa einem Liposom oder Poloxamer komplexierte Nukleinsäure eingebracht werden oder durch Viren (z. B. Adenovirus, AAV) bereitgestellt werden, wie an anderer Stelle hierin für Nukleinsäuren beschrieben, die eine Cas12J-Guide-RNA und/oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid und/oder ein Donor-Polynukleotid codieren.
  • Nachweisverfahren
  • Ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung kann nicht zielgerichtete einzelsträngige DNA (ssDNA) promiskuitiv spalten, sobald sie durch Nachweis einer Target-DNA (doppel- oder einzelsträngig) aktiviert wurde. Sobald ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung durch eine Guide-RNA aktiviert wird, was auftritt, wenn die Guide-RNA mit einer Target-Sequenz einer Target-DNA hybridisiert (d. h. die Probe enthält die Target-DNA), wird das Cas12J-Polypeptid zu einer Nuklease, die ssDNA promiskuitiv spaltet (d h. die Nuklease spaltet Nicht-Target-ssDNA, d. h. ssDNA, an die die Guide-Sequenz der Guide-RNA nicht hybridisiert). Somit, wenn die Target-DNA in der Probe vorhanden ist (z. B. in einigen Fällen oberhalb einer Schwellenmenge), ist das Ergebnis die Spaltung von ssDNA in der Probe, die unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Nachweisverfahrens (z. B. unter Verwendung einer markierten einzelsträngigen Nachweis-DNA) nachgewiesen werden können. Die Spaltung von Nicht-Target-Nukleinsäuren wird als „trans-Spaltung“ bezeichnet. In einigen Fällen vermittelt ein Cas12J-Effektorpolypeptid der vorliegenden Offenbarung die trans-Spaltung von ssDNA, jedoch nicht von ssRNA.
  • Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis einer Target-DNA (doppelsträngig oder einzelsträngig) in einer Probe bereitgestellt. In einigen Fällen wird eine Nachweis-DNA verwendet, die einzelsträngig (ssDNA) ist und nicht mit der Guide-Sequenz der Guide-RNA hybridisiert (d. h. die Nachweis-ssDNA ist eine Nicht-Target-ssDNA). Solche Verfahren können Folgendes umfassen: (a) Kontaktieren der Probe mit: (i) einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; (ii) einer Guide-RNA, umfassend: eine Region, die an das Cas12J-Polypeptid bindet, und eine Guide-Sequenz, die mit der Target-DNA hybridisiert; und (iii) einer Nachweis-DNA, die einzelsträngig ist und nicht mit der Guide-Sequenz der Guide-RNA hybridisiert; und (b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch Spaltung der einzelsträngigen Nachweis-DNA durch das Cas12J-Polypeptid erzeugt wird, wodurch die Target-DNA nachgewiesen wird. Wie vorstehend dargelegt, wird, sobald ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung durch eine Guide-RNA aktiviert wird, was auftritt, wenn die Probe eine Target-DNA enthält, mit der die Guide-RNA hybridisiert (d. h. die Probe enthält die Target-DNA), das Cas12J-Polypeptid aktiviert und fungiert als Endoribonuklease, die in der Probe vorhandene ssDNA (einschließlich Nicht-Target-ssDNA) unspezifisch spaltet. Somit, wenn die abgezielte Target-DNA in der Probe vorhanden ist (z. B. in einigen Fällen oberhalb einer Schwellenmenge), ist das Ergebnis die Spaltung von ssDNA (einschließlich Nicht-Target-ssDNA) in der Probe, die unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Nachweisverfahrens (z. B. unter Verwendung einer markierten Nachweis-ssDNA) nachgewiesen werden können.
  • Ebenfalls bereitgestellt werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Spalten von einzelsträngigen DNA (ssDNA) (z. B. Nicht-Target-ssDNA). Solche Verfahren können das Kontaktieren einer Population von Nukleinsäuren mit Folgendem beinhalten, wobei die Population eine Target-DNA und eine Vielzahl von Nicht-Target-ssDNA umfasst: (i) einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung; und (ii) einer Guide-RNA, umfassend: eine Region, die an das Cas12J-Polypeptid bindet, und eine Guide-Sequenz, die mit der Target-DNA hybridisiert, wobei das Cas12J-Polypeptid Nicht-Target-ssDNA der Vielzahl spaltet. Ein solches Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um fremde ssDNA (z. B. virale DNA) in einer Zelle zu spalten.
  • Der Schritt des Kontaktierens eines zugrundeliegenden Verfahrens kann in einer Zusammensetzung durchgeführt werden, die zweiwertige Metallionen umfasst. Der Schritt des Kontaktierens kann in einer azellulären Umgebung durchgeführt werden, z. B. außerhalb einer Zelle. Der Schritt des Kontaktierens kann innerhalb einer Zelle durchgeführt werden. Der Schritt des Kontaktierens kann in einer Zelle in vitro durchgeführt werden. Der Schritt des Kontaktierens kann in einer Zelle ex vivo durchgeführt werden. Der Schritt des Kontaktierens kann in einer Zelle in vivo durchgeführt werden.
  • Die Guide-RNA kann als RNA oder als eine Nukleinsäure, die die Guide-RNA codiert (z. B. eine DNA wie etwa ein rekombinanter Expressionsvektor), bereitgestellt werden. Das Cas12J-Polypeptidkann als ein Protein oder als eine Nukleinsäure, die das Protein codiert (z. B. eine mRNA, eine DNA wie etwa ein rekombinanter Expressionsvektor), bereitgestellt werden. In einigen Fällen können zwei oder mehr (z. B. 3 oder mehr, 4 oder mehr, 5 oder mehr oder 6 oder mehr) Guide-RNA bereitgestellt werden (z. B. unter Verwendung eines Vorläufer-Guide-RNA-Arrays, das von dem Cas12J Effektorprotein in einzelne („reife“) Guide-RNA gespalten werden kann).
  • In einigen Fällen (z. B. beim Kontaktieren mit einer Guide-RNA und einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung) wird die Probe 2 Stunden oder weniger vor dem Messschritt in Kontakt gebracht (z. B. 1,5 Stunden oder weniger, 1 Stunde oder weniger, 40 Minuten oder weniger, 30 Minuten oder weniger, 20 Minuten oder weniger, 10 Minuten oder weniger oder 5 Minuten oder weniger oder 1 Minute oder weniger). In einigen Fällen wird die Probe beispielsweise vor dem Messschritt 40 Minuten oder weniger in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt 20 Minuten oder weniger in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt 10 Minuten oder weniger in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt 5 Minuten oder weniger in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe vor dem Messschritt 1 Minute oder weniger in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe von 50 Sekunden bis 60 Sekunden vor dem Messschritt in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe von 40 Sekunden bis 50 Sekunden vor dem Messschritt in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe von 30 Sekunden bis 40 Sekunden vor dem Messschritt in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe von 20 Sekunden bis 30 Sekunden vor dem Messschritt in Kontakt gebracht. In einigen Fällen wird die Probe von 10 Sekunden bis 20 Sekunden vor dem Messschritt in Kontakt gebracht.
  • Ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Nachweisen einer Target-DNA (einzelsträngig oder doppelsträngig) in einer Probe kann eine Target-DNA mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit nachweisen. In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung dazu verwendet werden, eine Target-DNA nachzuweisen, die in einer Probe vorhanden ist, die eine Vielzahl von DNA (einschließlich der Target-DNA und einer Vielzahl von Nicht-Target-DNA) umfasst, wobei die Target-DNA an einer oder mehreren Kopien pro 107 Nicht-Target-DNA (z. B. einer oder mehreren Kopien pro 106 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 105 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 104 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 103 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 102 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 50 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 20 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 10 Nicht-Target-DNA oder einer oder mehreren Kopien pro 5 Nicht-Target-DNA) vorhanden ist. In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung dazu verwendet werden, eine Target-DNA nachzuweisen, die in einer Probe vorhanden ist, die eine Vielzahl von DNA (einschließlich der Target-DNA und einer Vielzahl von Nicht-Target-DNA) umfasst, wobei die Target-DNA an einer oder mehreren Kopien pro 1018 Nicht-Target-DNA (z. B. einer oder mehreren Kopien pro 1015 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 1012 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 109 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 106 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 105 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 104 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 103 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 102 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 50 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 20 Nicht-Target-DNA, einer oder mehreren Kopien pro 10 Nicht-Target-DNA oder einer oder mehreren Kopien pro 5 Nicht-Target-DNA vorhanden ist.
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine in einer Probe vorhandene Target-DNA nachweisen, wobei die Target-DNA von einer Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu einer Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA (z. B. von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA oder von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA) vorhanden ist.
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine in einer Probe vorhandene Target-DNA nachweisen, wobei die Target-DNA von einer Kopie pro 1018 Nicht-Target-DNA bis zu einer Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA (z. B. von 1 Kopie pro 1018 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 1015 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 1012 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 109 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA oder von 1 Kopie 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target DNA) vorhanden ist.
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine in einer Probe vorhandene Target-DNA nachweisen, wobei die Target-DNA von einer Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu einer Kopie pro 100 Nicht-Target-DNA (z. B. von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 100 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 100 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 102 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA oder von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA) vorhanden ist.
  • In einigen Fällen beträgt die Nachweisschwelle für ein zugrundeliegendes Verfahren zum Nachweisen einer Target-DNA in einer Probe 10 nM oder weniger. Der Ausdruck „Nachweisschwelle“ wird hierin verwendet, um die minimale Menge an Target-DNA zu beschreiben, die in einer Probe vorhanden sein muss, damit der Nachweis erfolgt. Wenn als veranschaulichendes Beispiel somit eine Nachweisschwelle 10 nM beträgt, kann ein Signal erfasst werden, wenn eine Target-DNA in einer Konzentration von 10 nM oder mehr in der Probe vorhanden ist. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 5 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 1 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,5 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,1 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,05 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,01 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,005 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,001 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,0005 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,0001 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,00005 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 0,00001 nM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 10 pM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 1 pM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 500 fM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 250 fM: oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 100 fM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 50 fM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 500 aM (attomolar) oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 250 aM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 100 aM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 50 aM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 10 aM oder weniger auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle von 1 aM oder weniger auf.
  • In einigen Fällen liegt die Nachweisschwelle (zum Nachweisen der Target-DNA in einem zugrundeliegenden Verfahren) in einem Bereich von 500 fM bis 1 nM (z. B. von 500 fM bis 500 pM, von 500 fM bis 200 pM, von 500 fM bis 100 pM, von 500 fM bis 10 pM, von 500 fM bis 1 pM, von 800 fM bis 1 nM, von 800 fM: bis 500 pM, von 800 fM bis 200 pM, von 800 fM bis 100 pM, von 800 fM bis 10 pM, von 800 fM bis 1 pM, von 1 pM bis 1 nM, von 1 pM bis 500 pM, von 1 pM bis 200 pM, von 1 pM bis 100 pM oder von 1 pM bis 10 pM) (wobei sich die Konzentration auf die Schwellenkonzentration der Target-DNA, bei der die Target-DNA nachgewiesen werden kann, bezieht). In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle in einem Bereich von 800 fM bis 100 pM auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle in einem Bereich von 1 pM bis 10 pM auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle in einem Bereich von 10 fM bis 500 fM auf, z. B. von 10 fM bis 50 fM, von 50 fM bis 100 fM, von 100 fM bis 250 fM oder von 250 fM bis 500 fM.
  • In einigen Fällen liegt die Mindestkonzentration, bei der eine Target-DNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 500 fM bis 1 nM (z. B. von 500 fM bis 500 pM, von 500 fM bis 200 pM, von 500 fM bis 100 pM, von 500 fM bis 10 pM, von 500 fM bis 1 pM, von 800 fM bis 1 nM, von 800 fM: bis 500 pM, von 800 fM bis 200 pM, von 800 fM bis 100 pM, von 800 fM bis 10 pM, von 800 fM bis 1 pM, von 1 pM bis 1 nM, von 1 pM bis 500 pM, von 1 pM bis 200 pM, von 1 pM bis 100 pM oder von 1 pM bis 10 pM). In einigen Fällen liegt die Mindestkonzentration, bei der eine Target-DNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 800 fM bis 100 pM. In einigen Fällen liegt die Mindestkonzentration, bei der eine Target-DNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 1 pM bis 10 pM.
  • In einigen Fällen liegt die Nachweisschwelle (zum Nachweisen der Target-DNA in einem zugrundeliegenden Verfahren) in einem Bereich von 1 aM bis 1 nM (z. B. von 1 aM bis 500 pM, von 1 aM bis 200 pM, von 1 aM bis 100 pM, von 1 aM bis 10 pM, von 1 aM bis 1 pM, von 100 aM bis 1 nM, von 100 aM bis 500 pM, von 100 aM bis 200 pM, von 100 aM bis 100 pM, von 100 aM bis 10 pM, von 100 aM bis 1 pM, von 250 aM bis 1 nM, von 250 aM bis 500 pM, von 250 aM bis 200 pM, von 250 aM bis 100 pM, von 250 aM bis 10 pM, von 250 aM bis 1 pM, von 500 aM bis 1 nM, von 500 aM bis 500 pM, von 500 aM bis 200 pM, von 500 aM bis 100 pM, von 500 aM bis 10 pM, von 500 aM bis 1 pM, von 750 aM bis 1 nM, von 750 aM bis 500 pM, von 750 aM bis 200 pM, von 750 aM bis 100 pM, von 750 aM bis 10 pM, von 750 aM bis 1 pM, von 1 fM bis 1 nM, von 1 fM bis 500 pM, von 1 fM bis 200 pM, von 1 fM bis 100 pM, von 1 fM bis 10 pM, von 1 fM bis 1 pM, von 500 fM bis 500 pM, von 500 fM bis 200 pM, von 500 fM bis 100 pM, von 500 fM: bis 10 pM, von 500 fM bis 1 pM, von 800 fM bis 1 nM, von 800 fM bis 500 pM, von 800 fM bis 200 pM, von 800 fM bis 100 pM, von 800 fM bis 10 pM, von 800 fM bis 1 pM, von 1 pM bis 1 nM, von 1 pM bis 500 pM, von 1 pM bis 200 pM, von 1 pM bis 100 pM oder von 1 pM bis 10 pM) (wobei sich die Konzentration auf die Schwellenkonzentration der Target-DNA bezieht, bei der die Target-DNA nachgewiesen werden kann). In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle in einem Bereich von 1 aM bis 800 aM auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle in einem Bereich von 50 aM bis 1 pM auf. In einigen Fällen weist ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung eine Nachweisschwelle in einem Bereich von 50 aM bis 500 fM auf.
  • In einigen Fällen liegt die Mindestkonzentration, bei der eine Target-DNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 1 aM bis 1 nM (z. B. von 1 aM bis 500 pM, von 1 aM bis 200 pM, von 1 aM bis 100 pM, von 1 aM bis 10 pM, von 1 aM bis 1 pM, von 100 aM bis 1 nM, von 100 aM bis 500 pM, von 100 aM bis 200 pM, von 100 aM bis 100 pM, von 100 aM bis 10 pM, von 100 aM bis 1 pM, von 250 aM bis 1 nM, von 250 aM bis 500 pM, von 250 aM bis 200 pM, von 250 aM bis 100 pM, von 250 aM bis 10 pM, von 250 aM bis 1 pM, von 500 aM bis 1 nM, von 500 aM bis 500 pM, von 500 aM bis 200 pM, von 500 aM bis 100 pM, von 500 aM bis 10 pM, von 500 aM bis 1 pM, von 750 aM bis 1 nM, von 750 aM bis 500 pM, von 750 aM bis 200 pM, von 750 aM bis 100 pM, von 750 aM bis 10 pM, von 750 aM bis 1 pM, von 1 fM bis 1 nM, von 1 fM bis 500 pM, von 1 fM bis 200 pM, von 1 fM bis 100 pM, von 1 fM bis 10 pM, von 1 fM bis 1 pM, von 500 fM bis 500 pM, von 500 fM bis 200 pM, von 500 fM bis 100 pM, von 500 fM: bis 10 pM, von 500 fM bis 1 pM, von 800 fM bis 1 nM, von 800 fM bis 500 pM, von 800 fM bis 200 pM, von 800 fM bis 100 pM, von 800 fM bis 10 pM, von 800 fM bis 1 pM, von 1 pM bis 1 nM, von 1 pM bis 500 pM, von 1 pM bis 200 pM, von 1 pM bis 100 pM oder von 1 pM bis 10 pM). In einigen Fällen liegt die Mindestkonzentration, bei der eine Target-DNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 1 aM bis 500 pM. In einigen Fällen liegt die Mindestkonzentration, bei der eine Target-DNA in einer Probe nachgewiesen werden kann, in einem Bereich von 100 aM bis 500 pM.
  • In einigen Fällen zeigt eine zugrundeliegende Zusammensetzung oder ein zugrundeliegendes Verfahren eine attomolare (aM) Nachweisempfindlichkeit. In einigen Fällen zeigt eine zugrundeliegende Zusammensetzung oder ein zugrundeliegendes Verfahren eine femtomolare (fM) Nachweisempfindlichkeit. In einigen Fällen zeigt eine zugrundeliegende Zusammensetzung oder ein zugrundeliegendes Verfahren eine pikomolare (pM) Nachweisempfindlichkeit. In einigen Fällen zeigt eine zugrundeliegende Zusammensetzung oder ein zugrundeliegendes Verfahren eine nanomolare (nM) Nachweisempfindlichkeit.
  • Target-DNA
  • Eine Target-DNA kann einzelsträngig (ssDNA) oder doppelsträngig (dsDNA) sein. Wenn die Target-DNA einzelsträngig ist, gibt es keine Präferenz oder Anforderung für eine PAM-Sequenz in der Target-DNA. Wenn die Target-DNA jedoch dsDNA ist, ist gewöhnlich ein PAM neben der Target-Sequenz der Target-DNA vorhanden (siehe z. B. Erörterung des PAM an anderer Stelle hierin). Die Quelle der Target-DNA kann dieselbe sein wie die Quelle der Probe, z. B. wie nachfolgend beschrieben.
  • Die Quelle der Target-DNA kann eine beliebige Quelle sein. In einigen Fällen ist die Target-DNA eine virale DNA (z. B. eine genomische DNA eines DNA-Virus). Somit kann das zugrundeliegende Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins einer viralen DNA in einer Population von Nukleinsäuren (z. B. in einer Probe) dienen. Ein zugrundeliegendes Verfahren kann auch zur Spaltung von Nicht-Target-ssDNA bei Vorhandensein einer Target-DNA verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Verfahren in einer Zelle stattfindet, kann ein zugrundeliegendes Verfahren dazu verwendet werden, Nicht-Target-ssDNA in der Zelle (ssDNA, die nicht mit der Guide-Sequenz der Guide-RNA hybridisieren) promiskuitiv zu spalten, wenn eine bestimmte Target-DNA in der Zelle vorhanden ist (z. B. wenn die Zelle mit einem Virus infiziert ist und virale Target-DNA nachgewiesen wird).
  • Beispiele für mögliche Target-DNA beinhalten unter anderem virale DNA wie etwa: ein Papovavirus (z. B. humanes Papillomavirus (HPV), Polyomavirus); ein Hepadnavirus (z. B. Hepatitis B-Virus (HBV)); ein Herpesvirus (z. B. Herpes-simplex-Virus (HSV), Varicella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), Herpes-Lymphotrop-Virus, Pityriasis Rosea, Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus); ein Adenovirus (z. B. Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichthadenovirus, Mastadenovirus, Siadenovirus); ein Pockenvirus (z. B. Pocken, Vaccinia-Virus, Kuhpocken-Virus, Affenpocken-Virus, Orf-Virus, Pseudokuhpocken, Stomatitis-papulosa-Virus bei Rindern (bovine papular stomatitis virus); Tanapox-Virus, Yaba-Affentumor-Virus; Molluscum contagiosum-Virus (MCV)); ein Parvovirus (z. B. Adeno-assoziiertes Virus (AAV), Parvovirus B19, humanes Bocavirus, Bufavirus, humanes Parv4 G1); Geminiviridae; Nanoviridae; Phycodnaviridae; und dergleichen. In einigen Fällen ist die Target-DNA Parasiten-DNA. In einigen Fällen ist die Target-DNA bakterielle DNA, z. B. DNA eines pathogenen Bakteriums.
  • Proben
  • Eine zugrundeliegende Probe enthält Nukleinsäure (z. B. mehrere Nukleinsäuren). Der Ausdruck „Vielzahl“ wird hierin verwendet, um zwei oder mehr zu bedeuten. Somit beinhaltet in einigen Fällen eine Probe zwei oder mehr (z. B. 3 oder mehr, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 20 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, 500 oder mehr, 1.000 oder mehr oder 5.000 oder mehr) Nukleinsäuren (z. B. DNA). Ein zugrundeliegendes Verfahren kann als sehr empfindliche Methode verwendet werden, um eine in einer Probe vorhandenen Target-DNA nachzuweisen (z. B. in einer komplexen Mischung von Nukleinsäuren wie etwa DNA). In einigen Fällen beinhaltet die Probe 5 oder mehr DNA (z. B. 10 oder mehr, 20 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, 500 oder mehr, 1.000 oder mehr oder 5.000 oder mehr DNA), die sich in ihrer Sequenz voneinander unterscheiden. In einigen Fällen beinhaltet die Probe 10 oder mehr, 20 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr, 500 oder mehr, 103 oder mehr, 5 × 103 oder mehr, 104 oder mehr, 5 × 104 oder mehr 105 oder mehr, 5 × 105 oder mehr, 106 oder mehr 5 × 106 oder mehr oder 107 oder mehr DNA. In einigen Fällen umfasst die Probe von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 500, von 500 bis 103, von 103 bis 5 × 103, von 5 × 103 bis 104, von 104 bis 5 × 104, von 5 × 104 bis 105, von 105 bis 5 × 105, von 5 × 105 bis 106, von 106 bis 5 × 106 oder von 5 × 106 bis 107 oder mehr als 107 DNA. In einigen Fällen umfasst die Probe von 5 bis 107 DNA (z. B. die sich in ihrer Sequenz voneinander unterscheiden) (z. B. von 5 bis 106, von 5 bis 105, von 5 bis 50.000, von 5 bis 30.000, von 10 bis 106, von 10 bis 105, von 10 bis 50.000, von 10 bis 30.000, von 20 bis 106, von 20 bis 105, von 20 bis 50.000 oder von 20 bis 30,000 DNA). In einigen Fällen enthält die Probe 20 oder mehr DNA, die sich in ihrer Sequenz voneinander unterscheiden. In einigen Fällen enthält die Probe DNA aus einem Zelllysat (z. B. einem eukaryotischen Zelllysat, einem Säugerzelllysat, einem menschlichen Zelllysat, einem prokaryotischen Zelllysat, einem Pflanzenzelllysat und dergleichen). Beispielsweise enthält die Probe in einigen Fällen DNA aus einer Zelle wie etwa einer eukaryotischen Zelle, z. B. einer Säugerzelle, wie etwa einer menschlichen Zelle.
  • Der Ausdruck „Probe“ wird hierin verwendet, um jede Probe zu bezeichnen, die DNA enthält (z. B. um zu bestimmen, ob eine Target-DNA in einer Population von DNA vorhanden ist). Die Probe kann aus einer beliebigen Quelle stammen, z. B. kann die Probe eine synthetische Kombination gereinigter DNA sein; die Probe kann ein Zelllysat, ein DNA-angereichertes Zelllysat oder aus einem Zelllysat isolierte und/oder gereinigte DNA sein. Die Probe kann von einem Patienten stammen (z. B. zum Zwecke der Diagnose). Die Probe kann aus permeabilisierten Zellen stammen. Die Probe kann aus vernetzten Zellen stammen. Die Probe kann sich in Gewebeschnitten befinden. Die Probe kann aus Geweben stammen, die durch Vernetzung hergestellt wurden, gefolgt von Delipidierung und Anpassung, um einen gleichmäßigen Brechungsindex herzustellen. Beispiele für die Gewebepräparation durch Vernetzung, gefolgt von Delipidierung und Anpassung, um einen einheitlichen Brechungsindex herzustellen, wurden beispielsweise in Shah et al., Development (2016) 143, 2862-2867 doi:l 0.1242/dev. 138560 beschrieben.
  • Eine „Probe“ kann eine Target-DNA und mehrere Nicht-Target-DNA enthalten. In einigen Fällen ist die Target-DNA in der Probe mit einer Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 20 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 25 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 50 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 100 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 500 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 5 x 103 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 5 x 104 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 5 x 105 Nicht-Target-DNA, einer Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA oder weniger als einer Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA vorhanden. In einigen Fällen ist die Target-DNA in der Probe mit von einer Kopie pro 10 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 20 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 20 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 50 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 50 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 100 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 100 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 500 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 500 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 103 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 5 × 103 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 5 × 103 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 104 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA, von 1 Kopie pro 105 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA oder von 1 Kopie pro 106 Nicht-Target-DNA bis zu 1 Kopie pro 107 Nicht-Target-DNA vorhanden.
  • Geeignete Proben beinhalten unter anderem Speichel-, Blut-, Serum-, Plasma-, Urin-, Aspirat- und Biopsieproben. Somit umfasst der Ausdruck „Probe“ in Bezug auf einen Patienten Blut und andere flüssige Proben biologischen Ursprungs, feste Gewebeproben wie etwa eine Biopsieprobe oder Gewebekulturen oder davon abgeleitete Zellen und deren Nachkommen. Die Definition umfasst auch Proben, die nach ihrer Beschaffung auf irgendeine Weise manipuliert wurden, wie etwa durch Behandlung mit Reagenzien; gewaschen; oder Anreicherung für bestimmte Zellpopulationen, wie etwa Krebszellen. Die Definition beinhaltet auch Proben, die für bestimmte Arten von Molekülen angereichert wurden, z. B. DNA. Der Ausdruck „Probe“ schließt biologische Proben wie etwa eine klinische Probe wie etwa Blut, Plasma, Serum, Aspirat, cerebrale Wirbelsäulenflüssigkeit (CSF) ein und beinhaltet auch durch chirurgische Resektion gewonnenes Gewebe, durch Biopsie gewonnenes Gewebe, Zellen in Kultur, Zellüberstände, Zelllysate, Gewebeproben, Organe, Knochenmark und dergleichen. Eine „biologische Probe“ umfasst davon abgeleitete biologische Flüssigkeiten (z. B. Krebszellen, infizierte Zellen usw.), z. B. eine Probe, die DNA umfasst, die aus solchen Zellen erhalten wird (z. B. ein Zelllysat oder ein anderer Zellextrakt, der DNA umfasst).
  • Eine Probe kann eine Vielzahl von Zellen, Geweben, Organen oder azellulären Flüssigkeiten umfassen oder daraus erhalten werden. Geeignete Probenquellen umfassen eukaryotische Zellen, Bakterienzellen und Archaeenzellen. Geeignete Probenquellen umfassen einzellige Organismen und mehrzellige Organismen. Geeignete Probenquellen beinhalten einzellige eukaryotische Organismen; eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle, eine Algenzelle, z. B. Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens, C. agardh und dergleichen; eine Pilzzelle (z. B. eine Hefezelle); eine tierische Zelle, ein tierisches Gewebe oder ein tierisches Organ; eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ eines wirbellosen Tieres (z. B. Fruchtfliege, Nesseltier, Stachelhäuter, Nematode, ein Insekt, ein Spinnentier usw.); eine Zelle, ein Gewebe, eine Flüssigkeit oder ein Organ eines Wirbeltiers (z. B. Fisch, Amphibie, Reptil, Vogel, Säuger); eine Zelle, ein Gewebe, eine Flüssigkeit oder ein Organ eines Säugers (z. B. ein Mensch, ein nichtmenschlicher Primat, ein Huftier, eine Katze, ein Rind, ein Schaf, eine Ziege usw.). Geeignete Probenquellen beinhalten Nematoden, Protozoen und dergleichen. Geeignete Probenquellen beinhalten Parasiten wie etwa Helminthen, Malariaparasiten usw.
  • Geeignete Probenquellen beinhalten eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus eines beliebigen der sechs Reiche, z. B. Bakterien (z. B. Eubakterien); Archaebakterien; Protista; Pilze; Plantae; und Animalia. Geeignete Probenquellen beinhalten pflanzenähnliche Mitglieder des Reichs der Protista, einschließlich unter anderem Algen (z. B. Grünalgen, Rotalgen, Glaukophyten, Cyanobakterien); pilzartige Mitglieder von Protista, z. B. Schleimpilze, Eipilze usw.; tierähnliche Mitglieder von Protista, z. B. Flagellaten (z. B. Euglena), Amöboide (z. B. Amöben), Sporozoen (z. B. Apicomplexa, Myxozoa, Microsporidia) und Ciliaten (z. B. Paramecium). Geeignete Probenquellen beinhalten Mitglieder des Reichs der Pilze, einschließlich unter anderem Mitglieder eines beliebigen der Phyla: Basidiomycota (Ständerpilze; z. B. Mitglieder von Agaricus, Amanita, Boletus, Cantherellus usw.); Ascomycota (Schlauchpilze, einschließlich z. B. Saccharomyces); Mycophycophyta (Flechten); Zygomycota (Jochpilze); und Deuteromycota. Geeignete Probenquellen beinhalten Mitglieder des Reichs der Pflanzen, einschließlich unter anderem Mitglieder einer beliebigen der folgenden Abteilungen: Bryophyta (z. B. Moose), Anthocerotophyta (z. B. Hornmoose), Hepaticophyta (z. B. Lebermoose), Lycophyta (z. B. Leberblümchen), Lycophyta (z. B. Bärlapppflanzen), Sphenophyta (z. B. Schachtelhalme), Psilophyta (z. B. Nacktfarne), Ophioglossophyta, Pterophyta (z. B. Farne), Cycadophyta, Gingkophyta, Pinophyta, Gnetophyta und Magnoliophyta (z. B. Blütenpflanzen). Geeignete Probenquellen beinhalten Mitglieder des Reichs der Tiere, einschließlich unter anderem Mitglieder eines der folgenden Phyla: Porifera (Schwämme); Placozoa; Orthonectida (Parasiten mariner Wirbelloser); Rhombozoa; Cnidaria (Korallen, Anemonen, Quallen, Seefedern, Renilla reniformis, Seewespen); Ctenophora (Kammquallen); Platyhelminthes (Plattwürmer); Nemertina (Bandwürmer); Gnathostomulida (Kiefermündchen); Gastrotricha; Rotifera; Priapulida; Kinorhyncha; Loricifera; Acanthocephala; Entoprocta; Nemotoda; Nematomorpha; Cycliophora; Mollusca (Mollusken); Sipuncula (Spritzwürmer); Annelida (Ringelwürmer); Tardigrada (Bärtierchen); Onychophora (Stummelfüßer); Arthropoda (einschließlich der Subphyla: Chelicerata, Myriapoda, Hexapoda und Crustacea, wobei die Chelicerata z. B. Spinnentiere, Merostomata und Pycnogonida beinhalten, wobei die Myriapoda z. B. Chilopoda (Hundertfüßer), Diplopoda (Tausendfüßer), Paropoda und Symphyla beinhalten, wobei die Hexapoda Insekten beinhalten und wobei die Crustacea Garnelen, Krill, Seepocken usw. beinhalten; Phoronida, Ectoprocta (Moostierchen), Brachiopoda, Echinodermata (z. B. Seesterne, Seegänseblümchen, Haarsterne, Seeigel, Seegurken, Schlangensterne, Euryalida usw.), Chaetognatha (Pfeilwürmer), Hemichordata (Eichelwürmer) und Chordata. Geeignete Mitglieder von Chordata beinhalten ein beliebiges Mitglied der folgenden Subphyla: Urochordata (Seescheiden; einschließlich Ascidiacea, Thaliacea und Larvacea); Cephalochordata (Lanzetttierchen); Myxini (Schleimaale); und Vertebrata, wobei Mitglieder von Vertebrata z. B. Mitglieder von Petromyzontida (Neunaugen), Chondrichthyes (Knorpelfische), Actinopterygii (Strahlenflosser), Actinista (Quastenflosser), Dipnoi (Lungenfische), Reptilia (Reptilien, z. B. Schlangen, Alligatoren, Krokodile, Eidechsen usw.), Aves (Vögel); und Mammalian (Säuger) beinhalten. Geeignete Pflanzen beinhalten ein beliebiges Monokotyledon und ein beliebiges Dikotyledon.
  • Geeignete Quellen einer Probe beinhalten Zellen, Flüssigkeiten, Gewebe oder Organe, die einem Organismus entnommen wurden; aus einer bestimmten Zelle oder Gruppe von Zellen, die aus einem Organismus isoliert wurden; usw. Wenn der Organismus beispielsweise eine Pflanze ist, beinhalten geeignete Quellen Xylem, das Phloem, die Kambiumschicht, Blätter, Wurzeln usw. Wenn der Organismus ein Tier ist, beinhalten geeignete Quellen bestimmte Gewebe (z. B. Lunge, Leber, Herz, Niere, Gehirn, Milz, Haut, fötales Gewebe usw.) oder einen bestimmten Zelltyp (z. B. neuronale Zellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Astrozyten, Makrophagen, Gliazellen, Inselzellen, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten usw.).
  • In einigen Fällen ist die Quelle der Probe eine erkrankte Zelle, eine erkrankte Flüssigkeit, ein erkranktes Gewebe oder ein erkranktes Organ (oder es wird vermutet, dass es sich darum handelt). In einigen Fällen ist die Quelle der Probe eine normale (nicht erkrankte) Zelle, eine normale (nicht erkrankte) Flüssigkeit, ein normales (nicht erkranktes) Gewebe oder ein normales (nicht erkranktes) Organ. In einigen Fällen ist die Quelle der Probe eine pathogen-infizierte Zelle, ein pathogen-infiziertes Gewebe oder ein pathogen-infiziertes Organ (oder es wird vermutet, dass es sich darum handelt). Beispielsweise kann die Quelle einer Probe ein Individuum sein, das möglicherweise infiziert ist oder nicht, und die Probe kann eine beliebige biologische Probe sein (z. B. Blut, Speichel, Biopsie, Plasma, Serum, bronchoalveoläre Lavage, Sputum, eine Stuhlprobe, Liquor cerebrospinalis, ein Feinnadelaspirat, eine Abstrichprobe (z. B. ein bukkaler Abstrich, ein Zervixabstrich, ein Nasenabstrich), interstitielle Flüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Nasenausfluss, Tränen, Leukozytenfilm, eine Schleimhautprobe, eine Epithelzellprobe (z. B. Abschaben von Epithelzellen) usw.), die von dem Individuum gesammelt wurden. In einigen Fällen ist die Probe eine zellfreie flüssige Probe. In einigen Fällen ist die Probe eine flüssige Probe, die Zellen umfassen kann. Pathogene umfassen Viren, Pilze, Helminthen, Protozoen, Malariaparasiten, Plasmodium-Parasiten, Toxoplasma-Parasiten, Schistosoma-Parasiten und dergleichen. „Helminthen“ beinhalten Spulwürmer, Herzwürmer und phytophage Nematoden (Nematoda), Egel (Tematoda), Acanthocephala und Bandwürmer (Cestoda). Protozoeninfektionen beinhalten Infektionen durch Giardia spp., Trichomonas spp., Afrikanische Trypanosomiasis, Amöbenruhr, Babesiose, Balantidialruhr, Morbus Chaga, Kokzidiose, Malaria und Toxoplasmose. Beispiele für Krankheitserreger wie etwa Parasiten-/Protozoenpathogene beinhalten unter anderem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Trypanosoma cruzi und Toxoplasma gondii. Pilzpathogene beinhalten unter anderem Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis und Candida albicans. Pathogene Viren beinhalten z. B. humanes Immundefizienzvirus (z. B. HIV); Influenza-Virus; Dengue-Fieber; West-Nil-Virus; Herpesvirus; Gelbfiebervirus; Hepatitis-C-Virus; Hepatitis-A-Virus; Hepatitis B Virus; Papillomavirus und dergleichen. Pathogene Viren können DNA-Viren beinhalten, wie etwa: ein Papovavirus (z. B. humanes Papillomavirus (HPV), Polyomavirus); ein Hepadnavirus (z. B. Hepatitis B-Virus (HBV)); ein Herpesvirus (z. B. Herpes-simplex-Virus (HSV), Varicella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), Herpes-Lymphotrop-Virus, Pityriasis Rosea, Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus); ein Adenovirus (z. B. Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichthadenovirus, Mastadenovirus, Siadenovirus); ein Pockenvirus (z. B. Pocken, Vaccinia-Virus, Kuhpocken-Virus, Affenpocken-Virus, Orf-Virus, Pseudokuhpocken, Stomatitis-papulosa-Virus bei Rindern (bovine papular stomatitis virus); Tanapox-Virus, Yaba-Affentumor-Virus; Molluscum contagiosum-Virus (MCV)); ein Parvovirus (z. B. Adeno-assoziiertes Virus (AAV), Parvovirus B19, humanes Bocavirus, Bufavirus, humanes Parv4 G1); Geminiviridae; Nanoviridae; Phycodnaviridae und dergleichen. Pathogene können z. B. DNA-Viren (z. B. ein Papovavirus (z. B. humanes Papillomavirus (HPV), Polyomavirus); ein Hepadnavirus (z. B. Hepatitis B-Virus (HBV)); ein Herpesvirus (z. B. Herpes-simplex-Virus (HSV), Varicella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), Herpes-Lymphotrop-Virus, Pityriasis Rosea, Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus); ein Adenovirus (z. B. Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichthadenovirus, Mastadenovirus, Siadenovirus); ein Pockenvirus (z. B. Pocken, Vaccinia-Virus, Kuhpocken-Virus, Affenpocken-Virus, Orf-Virus, Pseudokuhpocken, Stomatitis-papulosa-Virus bei Rindern (bovine papular stomatitis virus); Tanapox-Virus, Yaba-Affentumor-Virus; Molluscum contagiosum-Virus (MCV)); ein Parvovirus (z. B. Adeno-assoziiertes Virus (AAV), Parvovirus B19, humanes Bocavirus, Bufavirus, humanes Parv4 G1); Geminiviridae; Nanoviridae; Phycodnaviridae und dergleichen], Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus agalactiae, methicillinresistant Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pneumococcus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Hemophilus influenzae B, Treponema pallidum, Spirochäten der Lyme-Borreliose, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, Tollwutvirus, Influenzavirus, Cytomegalovirus, Herpes-Simplex-Virus I, Herpes-Simplex-Virus II, Parvo-ähnliches Humanserumvirus, respiratorisches Syncytialvirus, Varicella-Zoster-Virus, Hepatitis B-Virus, Hepatitis C-Virus, Masernvirus, Adenovirus, humane T-Zell-Leukämie-Viren, Epstein-Barr-Virus, murines Leukämievirus, Mumpsvirus, vesikuläres Stomatitis-Virus, Sindbis-Virus, lymphozytisches Choriomeningitis-Virus, Warzenvirus, Blauzungenvirus, Sendai-Virus, Katzenleukämievirus, Reovirus, Poliovirus, Simian-Virus 40, Mäusemammatumorvirus, Dengue-Virus, Rötelnvirus, West-Nil-Virus, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma brucei, Sch Istosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Babesia bovis, Eimeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Mycobacterium tuberculosis, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus orale, M. arginini, Acholeplasma laylawii, M. salivarium und M. pneumoniae beinhalten.
  • Messen eines nachweisbaren Signals
  • In einigen Fällen umfasst ein zugrundeliegendes Verfahren einen Schritt des Messens (z. B. Messen eines nachweisbaren Signals, das durch Cas12J-vermittelte ssDNA-Spaltung erzeugt wird). Da ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung nach Aktivierung nicht zielgerichtete ssDNA spaltet, was auftritt, wenn eine Guide-RNA in Gegenwart eines Cas12J-Effektorproteins mit einer Target-DNA hybridisiert, kann ein nachweisbares Signal ein beliebiges Signal sein, das erzeugt wird, wenn ssDNA gespalten wird. In einigen Fällen kann der Schritt des Messens beispielsweise eines oder mehrere der Folgenden beinhalten: Nachweis auf der Grundlage von Goldnanopartikeln (siehe z. B. Xu et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2007; 46(19):3468-70; und Xia et al., Proc Natl Acad Sci, USA. 15. Jun 2010; 107(24):10837-41), Fluoreszenzpolarisation, Kolloidphasentransition/-dispersion (z. B. Baksh et al., Nature. 8. Jan 2004; 427(6970):139-41), elektrochemischer Nachweis, halbleiterbasierte Abtastung (z.B. Rothberg et al., Nature. 20. Jul 2011; 475(7356):348-52; z.B. könnte man eine Phosphatase verwenden, um eine pH-Änderung nach ssDNA-Spaltungsreaktionen zu erzeugen, indem man 2'-3'-cyclische Phosphate öffnet und anorganisches Phosphat in Lösung freisetzt) und Nachweis einer markierten Nachweis-ssDNA (siehe an anderer Stelle hierin für weitere Details). Das Auslesen solcher Nachweisverfahren kann ein beliebiges hinreichendes Auslesen sein. Beispiele für mögliche Auslesungen beinhalten unter anderem: eine gemessene Menge an nachweisbarem Fluoreszenzsignal; eine visuelle Analyse von Banden auf einem Gel (z. B. Banden, die ein gespaltenes Produkt gegenüber einem ungespaltenen Substrat darstellen), ein visueller oder sensorgestützter Nachweis des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer Farbe (d. h. Farbnachweisverfahren) und des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von (oder eine bestimmte Menge von) einem elektrischen Signal.
  • Das Messen kann in einigen Fällen quantitativ sein, z. B. in dem Sinne, dass die Menge von nachgewiesenem Signal verwendet werden kann, um die in der Probe vorhandene Menge an Target-DNA zu bestimmen. Das Messen kann in einigen Fällen qualitativ sein, z. B. in dem Sinne, dass das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines nachweisbaren Signals das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Target-DNA (z. B. Virus, SNP usw.) anzeigen kann. In einigen Fällen ist kein nachweisbares Signal vorhanden (z. B. oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts), es sei denn, die Target-DNA (z. B. Virus, SNP usw.) liegt oberhalb einer bestimmten Schwellenkonzentration vor. In einigen Fällen kann die Nachweisschwelle durch Modifizieren der Menge an Cas12J-Effektor, Guide-RNA, Probenvolumen und/oder Nachweis-ssDNA (falls verwendet) titriert werden. Somit kann beispielsweise, wie es ein Durchschnittsfachmann verstehen würde, eine Anzahl von Kontrollen verwendet werden, wenn dies gewünscht wird, um eine oder mehrere Reaktionen einzurichten, die jeweils so eingerichtet sind, dass sie einen anderen Schwellenwert der Target-DNA nachweisen, und somit könnte eine solche Reihe von Reaktionen verwendet werden, um die Menge an Target-DNA zu bestimmen, die in einer Probe vorhanden ist (z. B. könnte man eine solche Reihe von Reaktionen verwenden, um zu bestimmen, dass eine Target-DNA in der Probe „in einer Konzentration von mindestens X vorhanden ist“).
  • Beispiele für Verwendungen eines Nachweisverfahrens der vorliegenden Offenbarung beinhalten z. B. den Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymorphism - SNP), das Krebs-Screening, den Nachweis einer bakteriellen Infektion, den Nachweis einer Antibiotikaresistenz, den Nachweis einer Virusinfektion und dergleichen. Die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Offenbarung können dazu verwendet werden, ein beliebiges DNA-Target nachzuweisen. Beispielsweise kann ein beliebiges Virus, das Nukleinsäurematerial in das Genom integriert, nachgewiesen werden, da eine Subjektprobe zelluläre genomische DNA enthalten kann, und die Guide-RNA kann zum Nachweis der integrierten Nukleotidsequenz entworfen werden.
  • In einigen Fällen kann ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung dazu verwendet werden, die Menge einer Target-DNA in einer Probe zu bestimmen (z. B. eine Probe, die die Target-DNA und mehrere Nicht-Target-DNA umfasst). Das Bestimmen der Menge einer Target-DNA in einer Probe kann ein Vergleichen der Menge des von einer Testprobe erzeugten nachweisbaren Signals mit der Menge des von einer Referenzprobe erzeugten nachweisbaren Signals umfassen. Das Bestimmen der Menge einer Target-DNA in einer Probe kann Folgendes umfassen: Messen des nachweisbaren Signals, um eine Testmessung zu erzeugen; Messen eines nachweisbaren Signals, das von einer Referenzprobe erzeugt wird, um eine Referenzmessung zu erzeugen; und Vergleichen der Testmessung mit der Referenzmessung, um eine Menge an Target-DNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
  • Beispielsweise umfasst in einigen Fällen ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Bestimmen der Menge einer Target-DNA in einer Probe Folgendes: a) Kontaktieren der Probe (z. B. einer Probe, die die Target-DNA und mehrere Nicht-Target-DNA umfasst) mit: (i) einer Guide-RNA, die mit der Target-DNA hybridisiert, (ii) einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, das in der Probe vorhandene RNA spaltet, und (iii) einer Nachweis-ssDNA; b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch Cas12J-vermittelte ssDNA-Spaltung erzeugt wird (z. B. Spaltung der Nachweis-ssDNA), Erzeugen einer Testmessung; c) Messen eines nachweisbaren Signals, das von einer Referenzprobe erzeugt wird, um eine Referenzmessung zu erzeugen; und d) Vergleichen der Testmessung mit der Referenzmessung, um eine Menge an Target-DNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
  • Als ein weiteres Beispiel umfasst in einigen Fällen ein Verfahren der vorliegenden Offenbarung zum Bestimmen der Menge einer Target-DNA in einer Probe Folgendes: a) Kontaktieren der Probe (z. B. einer Probe, die die Target-DNA und mehrere Nicht-Target-DNA umfasst) mit: (i) einem Vorläufer-Guide-RNA-Array, umfassend zwei oder mehr Guide-RNA, von denden jede eine andere Guide-Sequenz aufweist, (ii) einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, das das Vorläufer-Guide-RNA-Array in einzelne Guide-RNA spaltet und auch RNA der Probe spaltet, und (iii) einer Nachweis-ssDNA; b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch Cas12J-vermittelte ssDNA-Spaltung erzeugt wird (z. B. Spaltung der Nachweis-ssDNA), Erzeugen einer Testmessung; c) Messen eines nachweisbaren Signals, das von jeder der zwei oder mehr Referenzproben erzeugt wird, um zwei oder mehr Referenzmessungen zu erzeugen; und d) Vergleichen der Testmessung mit den Referenzmessungen, um eine Menge an Target-DNA zu bestimmen, die in der Probe vorhanden ist.
  • Amplifikation von Nukleinsäuren in der Probe
  • In einigen Ausführungsformen kann die Empfindlichkeit einer zugrundeliegenden Zusammensetzung und/oder eines zugrundeliegenden Verfahrens (z. B. zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Target-DNA, wie etwa viraler DNA oder eines SNP in zellulärer genomischer DNA) durch Kopplungsnachweis mit Nukleinsäureamplifikation erhöht werden. In einigen Fällen werden die Nukleinsäuren in einer Probe vor dem Kontakt mit einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, das ssDNA gespalten hat, amplifiziert (z. B. kann die Amplifikation der Nukleinsäuren in der Probe vor dem Kontakt mit einem Cas12J-Polypeptidder vorliegenden Offenbarung beginnen). In einigen Fällen werden die Nukleinsäuren in einer Probe gleichzeitig mit dem Kontakt mit einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung amplifiziert. Beispielsweise beinhaltet in einigen Fällen ein zugrundeliegendes Verfahren ein Amplifizieren von Nukleinsäuren einer Probe (z. B. durch Kontaktieren der Probe mit Amplifikationskomponenten) vor dem Kontaktieren der amplifizierten Probe mit einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung. In einigen Fällen beinhaltet ein zugrundeliegendes Verfahren ein Kontaktieren einer Probe mit Amplifikationskomponenten zur gleichen Zeit (gleichzeitig), wenn die Probe mit einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung in Kontakt gebracht wird. Wenn alle Komponenten gleichzeitig hinzugefügt werden (Amplifikationskomponenten und Nachweiskomponenten wie etwa ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, eine Guide-RNA und eine Nachweis-DNA), ist es möglich, dass die trans-Spaltungsaktivität des Cas12J beginnt, die Nukleinsäuren der Probe zur gleichen Zeit abzubauen wie die Nukleinsäuren amplifiziert werden. Selbst wenn dies der Fall ist, kann das gleichzeitige Amplifizieren und Nachweisen die Empfindlichkeit im Vergleich zur Durchführung des Verfahrens ohne Amplifikation erhöhen.
  • In einigen Fällen werden spezifische Sequenzen (z. B. Sequenzen eines Virus, Sequenzen, die ein interessierendes SNP enthalten) aus der Probe amplifiziert, z. B. unter Verwendung von Primern. Somit kann eine Sequenz, an die die Guide-RNA hybridisiert, amplifiziert werden, um die Empfindlichkeit eines zugrundeliegenden Nachweisverfahrens zu erhöhen; dies könnte eine beeinflusste Amplifikation einer gewünschten Sequenz erreichen, um die Anzahl von Kopien der interessierenden Sequenz, die in der die Probe vorhanden sind, relativ zu anderen in der Probe vorhandenen Sequenzen zu erhöhen. Als ein veranschaulichendes Beispiel kann, wenn ein zugrundeliegendes Verfahren verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine gegebene Probe ein bestimmtes Virus (oder ein bestimmtes SNP) enthält, eine gewünschte Region der viralen Sequenz (oder der nicht-viralen Genomsequenz) amplifiziert werden und die amplifizierte Region wird die Sequenz enthalten, die mit der Guide-RNA hybridisieren würde, wenn die virale Sequenz (oder SNP) tatsächlich in der Probe vorhanden wäre.
  • Wie dargelegt, werden in einigen Fällen die Nukleinsäuren (z. B. durch Kontaktieren mit Amplifikationskomponenten) vor dem Kontaktieren der amplifizierten Nukleinsäuren mit einem Cas12J-Polypeptidder vorliegenden Offenbarung amplifiziert. In einigen Fällen erfolgt die Amplifikation für 10 Sekunden oder mehr (z. B. 30 Sekunden oder mehr, 45 Sekunden oder mehr, 1 Minute oder mehr, 2 Minuten oder mehr, 3 Minuten oder mehr, 4 Minuten oder mehr, 5 Minuten oder mehr, 7,5 Minuten oder mehr, 10 Minuten oder mehr usw.) vor dem Kontakt mit einem Cas 12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung. In einigen Fällen erfolgt die Amplifikation für 2 Minuten oder mehr (z. B. 3 Minuten oder mehr, 4 Minuten oder mehr, 5 Minuten oder mehr, 7,5 Minuten oder mehr, 10 Minuten oder mehr usw.) vor dem Kontakt mit einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung. In einigen Fällen erfolgt die Amplifikation über einen Zeitraum in einem Bereich von 10 Sekunden bis 60 Minuten (z. B. 10 Sekunden bis 40 Minuten, 10 Sekunden bis 30 Minuten, 10 Sekunden bis 20 Minuten, 10 Sekunden bis 15 Minuten, 10 Sekunden) bis 10 Minuten, 10 Sekunden bis 5 Minuten, 30 Sekunden bis 40 Minuten, 30 Sekunden bis 30 Minuten, 30 Sekunden bis 20 Minuten, 30 Sekunden bis 15 Minuten, 30 Sekunden bis 10 Minuten, 30 Sekunden bis 5 Minuten, 1 Minute bis 40 Minuten, 1 Minute bis 30 Minuten, 1 Minute bis 20 Minuten, 1 Minute bis 15 Minuten, 1 Minute bis 10 Minuten, 1 Minute bis 5 Minuten, 2 Minuten bis 40 Minuten, 2 Minuten bis 30 Minuten, 2 Minuten bis 20 Minuten, 2 Minuten bis 15 Minuten, 2 Minuten bis 10 Minuten, 2 Minuten bis 5 Minuten, 5 Minuten bis 40 Minuten, 5 Minuten bis 30 Minuten, 5 Minuten bis 20 Minuten, 5 Minuten bis 15 Minuten oder 5 Minuten bis 10 Minuten). In einigen Fällen erfolgt die Amplifikation über einen Zeitraum in einem Bereich von 5 Minuten bis 15 Minuten. In einigen Fällen erfolgt die Amplifikation über einen Zeitraum in einem Bereich von 7 Minuten bis 12 Minuten.
  • In einigen Fällen erfolgt das Kontaktieren einer Probe mit Amplifikationskomponenten mit Amplifikationskomponenten zur gleichen Zeit wie der Kontakt mit einem Cas12J-Polypeptidder vorliegenden Offenbarung. In einigen solchen Fällen ist das Cas12J-Protein zum Zeitpunkt des Kontakts inaktiv und wird aktiviert, sobald die Nukleinsäuren in der Probe amplifiziert wurden.
  • Dem Durchschnittsfachmann sind verschiedene Amplifikationsverfahren und - komponenten bekannt und es kann ein beliebiges geeignete Verfahren verwendet werden (siehe z.B. Zanoli und Spoto, Biosensors (Basel). Mär 2013; 3(1):18-43; Gill und Ghaemi, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2008, 27:224-243; Craw und Balachandrana, Lab Chip, 2012, 12, 2469-2486; die hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen sind). Die Nukleinsäureamplifikation kann Polymerasekettenreaktion (PCR), reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR), quantitative PCR (qPCR), reverse Transkriptions-qPCR (RT-qPCR), nested-PCR, Multiplex-PCR, asymmetrische PCR, Touchdown-PCR, Zufallsprimer-PCR, hemi-nested PCR, Polymerase-Cycling-Assembly (PCA), Kolonie-PCR, Ligase-Kettenreaktion (LCR), digitale PCR, methylierungsspezifische PCR (MSP), Co-Amplifikation bei niedriger Denaturierungstemperatur-PCR (COLD-PCR), allelspezifische PCR, intersequenzspezifische PCR (ISS-PCR), Amplifikation des gesamten Genoms (WGA), inverse PCR und thermisch asymmetrische Interlaced-PCR (TAIL-PCR) umfassen.
  • In einigen Fällen ist die Amplifikation eine isotherme Amplifikation. Der Ausdruck „isotherme Amplifikation“ bezeichnet ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren (z. B. DNA) (z. B. unter Verwendung einer enzymatischen Kettenreaktion), das eine Inkubation bei einer einzigen Temperatur verwenden kann, wodurch die Notwendigkeit eines Thermocyclers entfällt. Die isotherme Amplifikation ist eine Form der Nukleinsäureamplifikation, die nicht auf der thermischen Denaturierung der Target-Nukleinsäure während der Amplifikationsreaktion beruht und daher möglicherweise nicht mehrere schnelle Temperaturänderungen erfordert. Isotherme Nukleinsäureamplifikationsverfahren können daher innerhalb oder außerhalb einer Laborumgebung durchgeführt werden. Durch Kombination mit einem reversen Transkriptionsschritt können diese Amplifikationsverfahren dazu verwendet werden, RNA isotherm zu amplifizieren.
  • Beispiele für isotherme Amplifikationsverfahren beinhalten unter anderem: schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (loop-mediated isothermal amplification - LAMP), Helikase-abhängige Amplifikation (helicase-dependent amplification - HDA), Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA), Strangverdrängungsamplifikation (strand displacement amplification - SDA), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (nucleic acid sequence-based amplification- NASBA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (transcription mediated amplification - TMA), Nicking-Enzym-Amplifikationsreaktion (NEAR), Rolling-Circle-Amplifikation (RCA), Multiple-Displacement-Amplifikation (MDA), Ramifikation (RAM), zirkuläre Helikase-abhängige Amplifikation (circular helicase-dependent amplification - cHDA), isotherme Einzelprimer-Amplifikation (single primer isothermal amplification - SPIA), signalvermittelte Amplifikation der RNA-Technologie (signal mediated amplification of RNA technology - SMART), autarke Sequenzreplikation (self-sustained sequence replication - 3SR), genomexponentielle Amplifikationsreaktion (genome exponential amplification reaction - GEAR) und isotherme Mehrfachverdrängungsamplifikation (isothermal multiple displacement amplification - IMDA).
  • In einigen Fällen handelt es sich bei der Amplifikation um eine Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) (siehe z. B. US-Patente Nr. 8,030,000 , 8,426,134 , 8,945,845 , 9,309,502 und 9,663,820 , welche hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind). Die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) verwendet zwei entgegengesetzte Primer (ähnlich wie PCR) und verwendet drei Enzyme - eine Rekombinase, ein einzelsträngiges DNA-Bindungsprotein (SSB) und eine strangverdrängende Polymerase. Die Rekombinase paart Oligonukleotidprimer mit homologer Sequenz in Duplex-DNA, SSB bindet an verdrängte DNA-Stränge, um zu verhindern, dass die Primer verdrängt werden, und die Strangverdrängungspolymerase beginnt mit der DNA-Synthese, wo der Primer an die Target-DNA gebunden hat. Das Hinzufügen eines reversen Transkriptaseenzyms zu einer RPA-Reaktion kann den Nachweis von RNA sowie DNA ermöglichen, ohne dass ein separater Schritt zur Herstellung von cDNA erforderlich ist. Ein Beispiel für Komponenten für eine RPA-Reaktion ist wie folgt (siehe z.B. US-Patent Nr. 8,030,000 ; 8,426,134 ; 8,945,845 ; 9,309,502 ; 9,663,820 ): 50 mM Tris, pH 8,4, 80 mM Kaliumactetat, 10 mM Magnesiumacetat, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 5 % PEG-Verbindung (Carbowax-20M), 3 mM ATP, 30 mM Phosphokreatin, 100 ng/µl Kreatinkinase, 420 ng/µl gp32, 140 ng/µl UvsX, 35 ng/µl UvsY, 2000 M dNTPs, 300 nM jedes Oligonukleotid, 35 ng/µl Bsu-Polymerase und eine nukleinsäurehaltige Probe).
  • Bei einer transkriptionsvermittelten Amplifikation (TMA) wird eine RNA-Polymerase verwendet, um RNA aus einem in der Primerregion konstruierten Promotor herzustellen, und dann synthetisiert eine reverse Transkriptase cDNA aus dem Primer. Ein drittes Enzym, z. B. Rnase H, kann dann verwendet werden, um das RNA-Target aus cDNA ohne den durch Wärme denaturierten Schritt abzubauen. Diese Amplifikationstechnik ähnelt der autarken Sequenzreplikation (3SR) und der Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikation (NASBA), variiert jedoch in den verwendeten Enzymen. In einem anderen Beispiel verwendet die Helikase-abhängige Amplifikation (HDA) eine thermostabile Helikase (Tte-UvrD) anstelle von Wärme, um dsDNA abzuwickeln und Einzelstränge zu erzeugen, die dann für die Hybridisierung und Verlängerung von Primern durch Polymerase verfügbar sind. Für ein weiteres Beispiel verwendet eine schleifenvermittelte Amplifikation (LAMP) eine thermostabile Polymerase mit Strangverdrängungsfähigkeiten und einen Satz von vier oder mehr spezifisch entworfenen Primern. Jeder Primer ist so konstruiert, dass er Haarnadelenden aufweist, die nach dem Verschieben in eine Haarnadel einrasten, um das Selbstpriming und die weitere Verlängerung der Polymerase zu erleichtern. Bei einer LAMP-Reaktion ist, obwohl die Reaktion unter isothermen Bedingungen abläuft, ein doppelter Wärmedenaturierungsschritt für doppelsträngige Targets erforderlich. Zusätzlich ergibt die Amplifikation ein Leitermuster von Produkten unterschiedlicher Länge. Für ein weiteres Beispiel kombiniert eine Strangverdrängungsamplifikation (SDA) die Fähigkeit einer Restriktionsendonuklease, den unmodifizierten Strang ihrer Target-DNA und eine DNA-Polymerase mit Exonuklease-Mangel zu nicken, um das 3'-Ende am Nick zu verlängern und den stromabwärts gelegenen DNA-Strang zu verdrängen.
  • Nachweis-DNA
  • In einigen Fällen beinhaltet ein zugrundeliegendes Verfahren ein Kontaktieren einer Probe (z. B. einer Probe, die eine Target-DNA und mehrere Nicht-Target-ssDNA umfasst) mit: i) einem Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung, ii) einer Guide-RNA (oder einem Vorläufer-Guide-RNA-Array); und iii) einer Nachweis-DNA, die einzelsträngig ist und nicht mit der Guide-Sequenz der Guide-RNA hybridisiert. In einigen Fällen umfasst ein zugrundeliegendes Verfahren beispielsweise ein Kontaktieren einer Probe mit einer markierten einzelsträngigen Nachweis-DNA (Nachweis-ssDNA), die ein fluoreszenzemittierendes Farbstoffpaar enthält; das Cas12J-Polypeptid spaltet die markierte Nachweis-ssDNA nach ihrer Aktivierung (durch Bindung an die Guide-RNA in dem Kontext, dass die Guide-RNA an eine Target-DNA hybridisiert); und das nachweisbare Signal, das gemessen wird, wird durch das fluoreszenzemittierende Farbstoffpaar erzeugt. In einigen Fällen beinhaltet ein zugrundeliegendes Verfahren beispielsweise ein Kontaktieren einer Probe mit einer markierten Nachweis-ssDNA, die ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Paar oder ein Quencher/Fluor-Paar oder beides umfasst. In einigen Fällen beinhaltet ein zugrundeliegendes Verfahren ein Kontaktieren einer Probe mit einer markierten Nachweis-ssDNA, die ein FRET-Paar umfasst. In einigen Fällen beinhaltet ein zugrundeliegendes Verfahren ein Kontaktieren einer Probe mit einer markierten Nachweis-ssDNA, die ein Fluor/Quencher-Paar umfasst.
  • Fluoreszenzemittierende Farbstoffpaare umfassen ein FRET-Paar oder a Quencher/Fluor-Paar. In beiden Fällen eines FRET-Paares und eines Quencher/Fluor-Paares überlappt das Emissionsspektrum eines der Farbstoffe einen Bereich des Absorptionsspektrums des anderen Farbstoffs in dem Paar. Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck „fluoreszenzemittierendes Farbstoffpaar“ ein Oberbegriff, der verwendet wird, um sowohl ein „Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Paar“ als auch ein „Quencher/Fluor-Paar“ zu umfassen, wobei auf beide Ausdrücke nachfolgend näher eingegangen wird. Der Ausdruck „fluoreszenzemittierendes Farbstoffpaar“ wird austauschbar mit dem Ausdruck „ein FRET-Paar und/oder Quencher/Fluor-Paar“ verwendet.
  • In einigen Fällen (z. B. wenn die Nachweis-ssDNA ein FRET-Paar enthält) erzeugt die markierte Nachweis-ssDNA vor dem Spalten eine Menge an nachweisbarem Signal, und die Menge an nachweisbarem Signal, die gemessen wird, wird reduziert, wenn die markierte Nachweis-ssDNA gespalten wird. In einigen Fällen erzeugt die markierte Nachweis-ssDNA ein erstes nachweisbares Signal vor dem Spalten (z. B. von einem FRET-Paar) und ein zweites nachweisbares Signal, wenn die markierte Nachweis-ssDNA gespalten wird (z. B. von einem Quencher/Fluor-Paar). Somit umfasst die markierte Nachweis-ssDNA in einigen Fällen ein FRET-Paar und ein Quencher/Fluor-Paar.
  • In einigen Fällen umfasst die markierte Nachweis-ssDNA ein FRET-Paar. FRET ist ein Prozess, bei dem eine strahlungslose Energieübertragung von einem Fluorophor im angeregten Zustand zu einem zweiten Chromophor in unmittelbarer Nähe erfolgt. Der Bereich, über den die Energieübertragung stattfinden kann, ist auf ungefähr 10 Nanometer (100 Angström) begrenzt, und die Effizienz der Übertragung ist äußerst empfindlich gegenüber dem Abstand zwischen Fluorophoren. Somit, wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „FRET“ („Fluoreszenzresonanzenergietransfer“, auch bezeichnet als Förster-Resonanzenergietransfer“) auf ein physikalisches Phänomen, das ein Donor-Fluorophor und ein passendes Akzeptor-Fluorophor umfasst, die so ausgewählt sind, dass sich das Emissionsspektrum des Donors mit dem Anregungsspektrum des Akzeptors überlappt, und die ferner so ausgewählt sind, dass, wenn der Donor und der Akzeptor nahe beieinander liegen (normalerweise 10 nm oder weniger), die Anregung des Donors eine Anregung des und eine Emission von dem Akzeptor verursacht, da ein Teil der Energie über einen Quantenkopplungseffekt vom Donor zum Akzeptor gelangt. Somit dient ein FRET-Signal als Näherungsmesser des Donors und des Akzeptors; nur wenn sie nahe beieinander liegen, wird ein Signal erzeugt. Der FRET-Donor-Rest (z. B. Donor-Fluorophor) und der FRET-Akzeptor-Rest (z. B. Akzeptor-Fluorophor) werden hierin gemeinsam als ein „FRET-Paar“ bezeichnet.
  • Das Donor-Akzeptor-Paar (ein FRET-Donor-Rest und ein FRET-Akzeptor-Rest) wird hierin als „FRET-Paar“ oder „Signal-FRET-Paar“ bezeichnet. Somit beinhaltet in einigen Fällen eine zugrundeliegende markierte Nachweis-ssDNA zwei Signalpartner (ein Signalpaar), wenn ein Signalpartner ein FRET-Donor-Rest ist und der andere Signalpartner ein FRET-Akzeptor-Rest ist. Eine zugrundeliegende markierte Nachweis-ssDNA, die ein solches FRET-Paar (einen FRET-Donor-Rest und einen FRET-Akzeptor-Rest) beinhaltet, wird somit ein nachweisbares Signal (ein FRET-Signal) zeigen, wenn sich die Signalpartner in unmittelbarer Nähe befinden (z. B. während sie sich auf demselben RNA-Molekül befinden), aber das Signal wird reduziert sein (oder fehlen), wenn die Partner getrennt sind (z. B. nach Spaltung des RNA-Moleküls durch ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung).
  • FRET-Donor- und -Akzeptor-Reste (FRET-Paare) sind dem Fachmann bekannt und jedes geeignete FRET-Paar (z. B. jedes geeignete Donor- und Akzeptor-Reste-Paar) kann verwendet werden. Beispiele für geeignete FRET-Paare beinhalten unter anderem die in Tabelle 1 dargestellten. Siehe auch: Bajar et al. Sensors (Basel). 14. Sep 2016; 16(9); und Abraham et al. PLoS One. 3. Aug 2015; 10(8):e0134436. Tabelle 1. Beispiele für FRET-Paare (Donor- und Akzeptor-FRET-Reste)
    Donor Akzeptor
    Tryptophan Dansyl
    IAEDANS (1) DDPM (2)
    BFP DsRFP
    Dansyl Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
    Dansyl Octadecylrhodamin
    Cyan fluoreszierendes Protein (CFP) Grün fluoreszierendes Protein (GFP)
    CF (3) Texas Red
    Fluorescein Tetramethylrhodamin
    Cy3 Cy5
    GFP Gelb fluoreszierendes Protein (YFP)
    BODIPY FL (4) BODIPY FL (4)
    Rhodamin 110 Cy3
    Rhodamin 6G Malachitgrün
    FITC Eosin-thiosemicarbazid
    B-Phycoerythrin Cy5
    Cy5 Cy5.5

    (1) 5-(2-Iodacetylaminoethyl)aminonaphthalen-1-sulfonsäure
    (2) N-(4-Dimethylamino-3,5-dinitrophenyl)maleimid
    (3) Carboxyfluoresceinsuccinimidylester
    (4) 4,4-Difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen
  • In einigen Fällen wird ein nachweisbares Signal erzeugt, wenn die markierte Nachweis-ssDNA gespalten wird (z. B. umfasst in einigen Fällen die markierte Nachweis-ssDNA ein Quencher/Fluor-Paar). Ein Signalpartner eines Signal-Quenching-Paares erzeugt ein nachweisbares Signal und der andere Signalpartner ist ein Quencher-Rest, der das nachweisbare Signal des ersten Signalpartners löscht (d. h. der Quencher-Rest quencht das Signal der Signaleinheit, so dass das Signal von dem Signalrest reduziert (gequencht) wird, wenn sich die Signalpartner in der Nähe zueinander befinden, z. B. wenn sich die Signalpartner des Signalpaars in unmittelbarer Nähe befinden).
  • Beispielsweise nimmt in einigen Fällen eine Menge an nachweisbarem Signal zu, wenn die markierte Nachweis-ssDNA gespalten wird. Beispielsweise wird in einigen Fällen das von einem Signalpartner (einem Signalrest) gezeigte Signal von dem anderen Signalpartner (einem Quencher-Signalrestinheit) gequencht, z. B. wenn beide vor der Spaltung durch ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung auf demselben ssDNA-Molekül vorhanden sind). Ein solches Signalpaar wird hierin als ein „Quencher/Fluor-Paar“, „Quenching-Paar“ oder „Signal-Quenching-paar“ bezeichnet. Beispielsweise ist in einigen Fällen ein Signalpartner (z. B. der erste Signalpartner) ein Signalrest, der ein nachweisbares Signal erzeugt, das von dem zweiten Signalpartner (z. B. einem Quencher-Rest) gequencht wird. Die Signalpartner eines solchen Quencher/Fluor-Paares werden somit ein nachweisbares Signal erzeugen, wenn die Partner getrennt sind (z. B. nach Spaltung der Nachweis-ssDNA durch ein Cas12J-Polypeptidder vorliegenden Offenbarung), aber das Signal wird gequencht, wenn sich die Partner in unmittelbarer Nähe befinden (z. B. vor der Spaltung der Nachweis-ssDNA durch ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung).
  • Ein Quencher-Rest kann ein Signal von dem Signalrest (z. B. vor der Spaltung der Nachweis-ssDNA durch ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung) in verschiedenen Graden quenchen. In einigen Fällen löscht ein Quencher-Rest das Signal von dem Signalrest, wobei das bei Vorhandensein des Quencher-Rests nachgewiesene Signal (wenn sich die Signalpartner in der Nähe zueinander befinden) 95 % oder weniger des bei Nichtvorhandensein des Quencher-Rests nachgewiesenen Signals (wenn die Signalpartner getrennt sind) beträgt. Beispielsweise kann in einigen Fällen das bei Vorhandensein des Quencher-Rests nachgewiesene Signal 90 % oder weniger, 80 % oder weniger, 70 % oder weniger, 60 % oder weniger, 50 % oder weniger, 40 % oder weniger, 30 % oder weniger, 20 % oder weniger, 15 % oder weniger, 10 % oder weniger oder 5 % oder weniger des bei Nichtvorhandensein des Quencher-Rests nachgewiesenen Signals betragen. In einigen Fällen wird bei Vorhandensein des Quencher-Rests kein Signal (z. B. über dem Hintergrund) nachgewiesen.
  • In einigen Fällen ist das bei Vorhandensein des Quencher-Rests nachgewiesene Signal (wenn die Signalpartner getrennt sind) mindestens 1,2-fach größer (z.B. mindestens 1,3-fach, mindestens 1,5-fach, mindestens 1,7-fach, mindestens 2-fach mindestens 2,5-fach, mindestens 3-fach, mindestens 3,5-fach, mindestens 4-fach, mindestens 5-fach, mindestens 7-fach, mindestens 10-fach, mindestens 20-fach oder mindestens 50-fach größer) als das bei Nichtvorhandensein des Quencher-Rests nachgewiesene Signal (wenn sich die Signalpartner in der Nähe zueinander befinden).
  • In einigen Fällen ist der Signalrest eine fluoreszierende Markierung. In einigen solchen Fällen quencht der Quencher-Rest das Signal (das Lichtsignal) von der fluoreszierenden Markierung (z. B. durch Absorption von Energie in den Emissionsspektren der Markierung). Wenn sich also der Quencher-Rest nicht in der Nähe des Signalrests befindet, ist die Emission (das Signal) von der fluoreszierenden Markierung nachweisbar, da das Signal nicht von dem Quencher-Rest absorbiert wird. Ein beliebiges geeignetes Donor-Akzeptor-Paar (Signalrest/Quencher-Rest-Paar) kann verwendet werden und viele geeignete Paare sind im Stand der Technik bekannt.
  • In einigen Fällen absorbiert der Quencher-Rest Energie von dem Signalrest (hierin auch als „nachweisbare Markierung“ bezeichnet) und sendet dann ein Signal aus (z. B. Licht mit einer anderen Wellenlänge). Somit ist in einigen Fällen der Quencher-Rest selbst ein Signalrest (z. B. kann ein Signalrest 6-Carboxyfluorescein sein, während der Quencher-Rest 6-Carboxy-Tetramethylrhodamin sein kann), und in einigen solchen Fällen könnte das Paar auch ein FRET-Paar sein. In einigen Fällen ist ein Quencher-Rest ein dunkler Quencher. Ein dunkler Quencher kann Anregungsenergie absorbieren und auf andere Weise abführen (z. B. als Wärme). Somit hat ein dunkler Quencher selbst nur eine minimale bis keine Fluoreszenz (emittiert keine Fluoreszenz). Beispiele für dunkle Quencher sind ferner beschrieben in den US-Patenten Nr. 8,822,673 und 8,586,718 ; den US-Patentveröffentlichungen 20140378330 , 20140349295 und 20140194611 ; und den internationalen Patentanmeldungen: WO200142505 und WO200186001 , welche alle hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
  • Beispiele für fluoreszierende Markierungen beinhalten unter anderem: einen Alexa Fluor®-Farbstoff, einen ATTO-Farbstoff (z. B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTORho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxal2, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), einen DyLight-Farbstoff, einen Cyaninfarbstoff (z. B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), einen FluoProbes-Farbstoff, einen Sulfo Cy-Farbstoff, einen Seta-Farbstoff, einen IRIS-Farbstoff, einen SeTau-Farbstoff, einen SRfluor-Farbstoff, einen quadratischen Farbstoff, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon Green, Pacific Blue, Pacific Green, Pacific Orange, Quantenpunkte und ein angebundenes fluoreszierendes Protein.
  • In einigen Fällen ist eine nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung, ausgewählt aus: einem Alexa Fluore-Farbstoff, einem ATTO-Farbstoff (z. B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thiol2, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxal2, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), einem DyLight-Farbstoff, einem Cyaninfarbstoff (z. B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), einem FluoProbes-Farbstoff, einem Sulfo Cy-Farbstoff, einem Seta-Farbstoff, einem IRIS-Farbstoff, einem SeTau-Farbstoff, einem SRfluor-Farbstoff, einem quadratischen Farbstoff, Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon Green, Pacific Blue, Pacific Green und Pacific Orange.
  • In einigen Fällen ist eine nachweisbare Markierung eine fluoreszierende Markierung, ausgewählt aus: einem Alexa Fluor®-Farbstoff, einem ATTO-Farbstoff (z. B. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thiol2, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxal2, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), einem DyLight-Farbstoff, einem Cyaninfarbstoff (z. B. Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), einem FluoProbes-Farbstoff, einem Sulfo Cy-Farbstoff, einem Seta-Farbstoff, einem IRIS-Farbstoff, einem SeTau-Farbstoff, einem SRfluor-Farbstoff, einem quadratischen Farbstoff, Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamin (TRITC), Texas Red, Oregon Green, Pacific Blue, Pacific Green, Pacific Orange, einem Quantenpunkt und einem angebundenen fluoreszierendes Protein.
  • Beispiele für ATTO-Farbstoffe beinhalten unter anderem: ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thiol2, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxal2, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725 und ATTO 740.
  • Beispiele für AlexaFluor-Farbstoffe beinhalten unter anderem: Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 500, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, Alexa Fluor® 790 und dergleichen.
  • Beispiele für Quencher-Reste beinhalten unter anderem: einen dunklen Quencher, einen Black Hole Quencher® (BHQ®) (z. B. BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), einen Qxl-Quencher, einen ATTO-Quencher (z. B. ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q), Dimethylaminoazobenzolsulfonsäure (Dabsyl), Iowa Black RQ, Iowa Black FQ, IRDye QC-1, einen QSY-Farbstoff (z. B. QSY 7, QSY 9, QSY 21), AbsoluteQuencher, Eclipse und Metallcluster wie etwa Goldnanopartikel und dergleichen.
  • In einigen Fällen ist ein Quencher-Rest ausgewählt aus: einem dunklen Quencher, einem Black Hole Quencher® (BHQ®) (z. B. BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), einem Qxl-Quencher, einem ATTO-Quencher (z. B. ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q), Dimethylaminoazobenzolsulfonsäure (Dabsyl), Iowa Black RQ, Iowa Black FQ, IRDye QC-1, einem QSY-Farbstoff (z. B. QSY 7, QSY 9, QSY 21), AbsoluteQuencher, Eclipse und einem Metallcluster.
  • Beispiele für einen ATTO-Quencher beinhalten unter anderem: ATTO 540Q, ATTO 580Q und ATTO 612Q. Beispiele für einen Black Hole Quencher® (BHQ®) beinhalten unter anderem: BHQ-0 (493 nm), BHQ-1 (534 nm), BHQ-2 (579 nm) und BHQ-3 (672 nm).
  • Für Beispiele für einige nachweisbare Markierungen (z. B. fluoreszierende Farbstoffe) und/oder Quencher-Reste, siehe z. B. Bao et al., Annu Rev Biomed Eng. 2009; 11:25-47; sowie die US-Patente Nr. 8,822,673 und 8,586,718 ; US-Patentveröffentlichungen 20140378330 , 20140349295 , 20140194611 , 20130323851 , 20130224871 , 20110223677 , 20110190486 , 20110172420 , 20060179585 und 20030003486 ; und internationale Patentanmeldungen: WO200142505 und WO200186001 , welche alle hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
  • In einigen Fällen kann die Spaltung einer markierten Nachweis-ssDNA durch Messen einer kolorimetrischen Auslesung nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann die Freisetzung eines Fluorophors (z. B. Freisetzung von einem FRET-Paar, Freisetzung von einem Quencher/Fluor-Paar und dergleichen) zu einer Wellenlängenverschiebung (und damit Farbverschiebung) eines nachweisbaren Signals führen. Somit kann in einigen Fällen die Spaltung einer zugrundeliegenden markierten Nachweis-ssDNA durch eine Farbverschiebung nachgewiesen werden. Eine solche Verschiebung kann ausgedrückt werden als Verlust einer Signalmenge einer Farbe (Wellenlänge), eine Zunahme der Menge einer anderen Farbe, eine Änderung des Verhältnisses einer Farbe zu einer anderen und dergleichen.
  • Transgene, nichtmenschliche Organismen
  • Wie vorstehend beschrieben, wird in einigen Fällen eine Nukleinsäure (z. B. ein rekombinanter Expressionsvektor) der vorliegenden Offenbarung (z. B. eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert usw.) als ein Transgen verwendet, um einen transgenen nichtmenschlichen Organismus zu erzeugen, der ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung produziert. Die vorliegende Offenbarung stellt einen transgenen nichtmenschlichen Organismus bereit, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert.
  • Transgene, nichtmenschliche Tiere
  • Die vorliegende Offenbarung stellt ein transgenes nichtmenschliches Tier bereit, das ein Transgen umfasst, das eine Nukleinsäure umfasst, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptidoder ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert. In einigen Ausführungsformen umfasst das Genom des transgenen nichtmenschlichen Tieres eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert. In einigen Fällen ist das transgene nichtmenschliche Tier homozygot für die genetische Modifikation. In einigen Fällen ist das transgene nichtmenschliche Tier heterozygot für die genetische Modifikation. In einigen Ausführungsformen ist das transgene nichtmenschliche Tier ein Wirbeltier, beispielsweise ein Fisch (z. B. Lachs, Forelle, Zebrafisch, Goldfisch, Kugelfisch, Höhlenfisch usw.), eine Amphibie (Frosch, Molch, Salamander usw.), ein Vogel (z. B. Huhn, Truthahn usw.), ein Reptil (z. B. Schlange, Eidechse usw.), ein nichtmenschliches Säuger (z. B. ein Huftier, z. B. ein Schwein, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf usw.; ein Lagomorph (z. B. ein Kaninchen), ein Nagetier (z. B. eine Ratte, eine Maus), ein nichtmenschlicher Primat usw.) usw. In einigen Fällen ist das transgene nichtmenschliche Tier ist ein Wirbelloser. In einigen Fällen ist das transgene nichtmenschliche Tier ein Insekt (z. B. eine Mücke, ein landwirtschaftlicher Schädling usw.). In einigen Fällen ist das transgene nichtmenschliche Tier ein Spinnentier.
  • Nukleotidsequenzen, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codieren, können unter der Kontrolle eines unbekannten Promotors stehen (d. h. damit wirkverbunden sein) (z. B. wenn sich die Nukleinsäure zufällig in ein Wirtszellgenom integriert) oder können unter der Kontrolle eines bekannten Promotors stehen (d. h. mit diesem wirkverbunden sein). Geeignete bekannte Promotoren können beliebige bekannte Promotoren sein und konstitutiv aktive Promotoren (z. B. CMV-Promotor), induzierbare Promotoren (z. B. Hitzeschock-Promotor, Tetracyclin-regulierter Promotor, Steroid-regulierter Promotor, Metallregulierter Promotor, Östrogenrezeptor-regulierter Promotor usw.), räumlich begrenzte und/oder zeitlich begrenzte Promotoren (z. B. ein gewebespezifischer Promotor, ein zelltypspezifischer Promotor usw.) usw. beinhalten.
  • Transgene Pflanzen
  • Wie vorstehend beschrieben, wird in einigen Fällen eine Nukleinsäure (z. B. ein rekombinanter Expressionsvektor) der vorliegenden Offenbarung (z. B. eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert; eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert usw.) als ein Transgen verwendet, um eine transgene Pflanze zu erzeugen, der ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung produziert. Die vorliegende Offenbarung stellt eine transgene Pflanze bereit, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert. In einigen Ausführungsformen umfasst das Genom der transgenen Pflanze eine zugrundeliegende Nukleinsäure. In einigen Ausführungsformen ist die transgene Pflanze homozygot für die genetische Modifikation. In einigen Ausführungsformen ist die transgene Pflanze heterozygot für die genetische Modifikation.
  • Verfahren zum Einbringen exogener Nukleinsäuren in Pflanzenzellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Solche Pflanzenzellen werden wie vorstehend definiert als „transformiert“ erachtet. Geeignete Verfahren beinhalten Virusinfektion (wie etwa doppelsträngige DNA-Viren), Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Partikelkanonen-Technologie, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion, Siliciumcarbid-Whisker-Technologie, Agrobacterium-vermittelte Transformation und dergleichen. Die Wahl des Verfahrens hängt im Allgemeinen von der Art der zu transformierenden Zelle und den Umständen ab, unter denen die Transformation stattfindet (d. h. in vitro, ex vivo oder in vivo).
  • Transformationsverfahren, die auf dem Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens basieren, sind besonders nützlich, um ein exogenes Nukleinsäuremolekül in eine Gefäßpflanze einzubringen. Die Wildtypform von Agrobacterium enthält ein Ti-Plasmid (Tumor-induzierendes Plasmid), das die Produktion des tumorigenen Crown-Gall-Wachstums auf Wirtspflanzen steuert. Die Übertragung der Tumor-induzierenden T-DNA-Region des Ti-Plasmids auf ein Pflanzengenom erfordert die Ti-Plasmid-codierten Virulenzgene sowie T-DNA-Grenzen, bei denen es sich um eine Reihe direkter DNA-Wiederholungen handelt, die die zu übertragende Region abgrenzen. Ein Agrobacteriumbasierter Vektor ist eine modifizierte Form eines Ti-Plasmids, bei dem die Tumor-induzierenden Funktionen durch die interessierende Nukleinsäuresequenz, die in den Pflanzenwirt eingebracht werden soll, ersetzt werden.
  • Die Agrobacterium-vermittelte Transformation verwendet im Allgemeinen Cointegrate-Vektoren oder binäre Vektorsysteme, bei denen die Komponenten des Ti-Plasmids zwischen einem Helfervektor, der permanent in dem Agrobacterium-Wirt vorhanden ist und die Virulenzgene trägt, und einem Shuttle-Vektor, der das interessierende Gen, das durch T-DNA-Sequenzen begrenzt ist, enthält, aufgeteilt sind. Eine Vielzahl von binären Vektoren ist im Stand der Technik gut bekannt und im Handel erhältlich, beispielsweise von Clontech (Palo Alto, CA). Verfahren zum Kokultivieren von Agrobacterium mit kultivierten Pflanzenzellen oder verwundetem Gewebe wie etwa Blattgewebe, Wurzelexplantaten, Hypokotyledonen, Stammstücken oder Knollen sind im Stand der Technik ebenfalls gut bekannt. Siehe z. B. Glick und Thompson (Hrsg.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton, Fla.: CRC Press (1993).
  • Mikroprojektil-vermittelte Transformation kann auch verwendet werden, um eine zugrundeliegende transgene Pflanze zu produzieren. Dieses zuerst von Klein et al. (Nature 327:70-73 (1987)) beschriebene Verfahren beruht auf Mikroprojektilen wie etwa Gold oder Wolfram, die durch Ausfällen mit Calciumchlorid, Spermidin oder Polyethylenglykol mit dem gewünschten Nukleinsäuremolekül beschichtet sind. Die Mikroprojektilpartikel werden mit einer Vorrichtung wie etwa dem BIOLISTIC PD-1000 (Biorad; Hercules Calif.) mit hoher Geschwindigkeit in ein Angiospermengewebe beschleunigt.
  • Eine Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung (z. B. eine Nukleinsäure (z. B. ein rekombinanter Expressionsvektor), umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codiert) kann auf eine Weise in eine Pflanze derart eingebracht werden, dass die Nukleinsäure in der Lage ist, in eine Pflanzenzelle einzudringen, z. B. über ein In-vivo- oder Ex-vivo-Protokoll. Mit „in vivo“ ist gemeint, dass die Nukleinsäure einem lebenden Körper einer Pflanze verabreicht wird, z. B. Infiltration. Mit „ex vivo“ ist gemeint, dass Zellen oder Explantate außerhalb der Pflanze modifiziert werden und dann solche Zellen oder Organe zu einer Pflanze regeneriert werden. Eine Anzahl von Vektoren, die zur stabilen Transformation von Pflanzenzellen oder zur Etablierung transgener Pflanzen geeignet sind, wurde beschrieben, einschließlich derjenigen, die in Weissbach und Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press und Gelvin et al. (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers beschrieben sind. Spezifische Beispiele beinhalten solche, die von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, sowie solche, die von Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209, Bevan (1984) Nucl AcidRes. 12:8711-8721, Klee (1985) Bio/Technolo 3:637-642 offenbart sind. Alternativ können Nicht-Ti-Vektoren verwendet werden, um die DNA unter Verwendung von Techniken zur freien DNA-Abgabe in Pflanzen und Zellen zu übertragen. Mit diesen Verfahren können transgene Pflanzen wie etwa Weizen, Reis (Christou (1991) Bio/Technology 9:957-9 und 4462) und Mais (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2:603-618) hergestellt werden. Ein unreifer Embryo kann auch ein gutes Target-Gewebe für Monokotylen für direkte DNA-Abgabetechniken unter Verwendung der Partikelkanone sein (Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102:1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technolo 10:667-674; Wan und Lemeaux (1994) Plant Physiol 104:37-48 und für Agrobacterium-vermittelte DNA-Übertragung (Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14:745-750). Beispielhafte Verfahren zur Einbringung von DNA in Chloroplasten sind biolistischer Beschuss, Polyethylenglykoltransformation von Protoplasten und Mikroinjektion (Danieli et al Nat. Biotechnol 16:345-348, 1998; Staub et al Nat. Biotechnol 18:333-338, 2000; O'Neill et al Plant J. 3:729-738, 1993; Knoblauch et al Nat. Biotechnol 17:906-909; US-Pat. Nr. 5,451,513 , 5,545,817 , 5,545,818 und 5,576,198 ; in Intl. Anmeldung Nr. WO 95/16783 ; und in Boynton et al., Methods in Enzymology 217:510-536 (1993), Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917 (1993) und McBride etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305 (1994)). Ein beliebiger Vektor, der für die Verfahren des biolistischen Beschusses, der Polyethylenglykoltransformation von Protoplasten und der Mikroinjektion geeignet ist, ist als Targeting-Vektor für die Chloroplasten-Transformation geeignet. Ein beliebiger doppelsträngiger DNA-Vektor kann als Transformationsvektor verwendet werden, insbesondere wenn das Einbringungsverfahren kein Agrobacterium verwendet.
  • Pflanzen, die gentechnisch modifiziert werden können, umfassen Getreide, Futterpflanzen, Obst, Gemüse, Ölsaaten, Palmen, Forstpflanzen und Weinreben. Konkrete Beispiele für Pflanzen, die modifiziert werden können, sind: Mais, Banane, Erdnuss, Felderbsen, Sonnenblume, Tomate, Raps, Tabak, Weizen, Gerste, Hafer, Kartoffel, Sojabohnen, Baumwolle, Nelken, Sorghum, Lupine und Reis.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt transformierte Pflanzenzellen, Gewebe, Pflanzen und Produkte bereit, die die transformierten Pflanzenzellen enthalten. Ein Merkmal der zugrundeliegenden transformierten Zellen und Gewebe und Produkte, die dasselbe enthalten, ist das Vorhandensein einer zugrundeliegenden Nukleinsäure, die in das Genom integriert ist, und die Produktion eines Cas12J-Polypeptids oder eines Cas12J-Fusionspolypeptids der vorliegenden Offenbarung durch Pflanzenzellen. Rekombinante Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung sind nützlich als Populationen von rekombinanten Zellen oder als Gewebe, Samen, ganze Pflanze, Stamm, Frucht, Blatt, Wurzel, Blume, Stamm, Knolle, Getreide, Tierfutter, ein Pflanzenfeld und dergleichen.
  • Nukleotidsequenzen, die ein Cas12J-Polypeptid oder ein Cas12J-Fusionspolypeptid der vorliegenden Offenbarung codieren, können unter der Kontrolle eines unbekannten Promotors stehen (d. h. damit wirkverbunden sein) (z. B. wenn sich die Nukleinsäure zufällig in ein Wirtszellgenom integriert) oder können unter der Kontrolle eines bekannten Promotors stehen (d. h. mit diesem wirkverbunden sein). Geeignete bekannte Promotoren können beliebige bekannte Promotoren sein und konstitutiv aktive Promotoren, induzierbare Promotoren, räumlich begrenzte und/oder zeitlich begrenzte Promotoren usw. beinhalten.
  • Beispiele für nicht einschränkende Aspekte der Offenbarung
  • Aspekte, einschließlich Ausführungsformen, des vorstehend beschriebenen vorliegenden Gegenstands können allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Aspekten oder Ausführungsformen vorteilhaft sein. Ohne die vorstehende Beschreibung einzuschränken, werden nachfolgend bestimmte nicht einschränkende Aspekte der Offenbarung mit den Nummern 1-149 bereitgestellt. Wie dem Fachmann beim Lesen dieser Offenbarung klar ist, kann jeder der einzeln nummerierten Aspekte mit einem beliebigen der vorhergehenden oder nachfolgenden, individuell nummerierten Aspekte verwendet oder kombiniert werden. Dies soll Unterstützung für alle derartigen Kombinationen von Aspekten bieten und ist nicht auf Kombinationen von Aspekten beschränkt, die nachfolgend ausdrücklich bereitgestellt werden:
    • Aspekt 1. Eine Zusammensetzung, umfassend: a) ein Cas12J-Polypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül, das das Cas12J-Polypeptid codiert; und b) eine Cas12J-Guide-RNA oder ein oder mehrere DNA-Moleküle, die die Cas12J-Guide-RNA codieren.
    • Aspekt 2. Die Zusammensetzung nach Aspekt 1, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 50 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 3. Die Zusammensetzung nach Aspekt 1 oder Aspekt 2, wobei die Cas12J-Guide-RNA eine Nukleotidsequenz mit 80 %, 90 %, 95 %, 98%, 99% oder 100 % Nukleotidsequenzidentität mit einer beliebigen der in 7 dargestellten crRNA-Sequenzen umfasst.
    • Aspekt 4. Die Zusammensetzung nach Aspekt 1 oder Aspekt 2, wobei das Cas12J-Polypeptid an ein Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal - NLS) kondensiert ist.
    • Aspekt 5. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-4, wobei die Zusammensetzung ein Lipid umfasst.
    • Aspekt 6. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-4, wobei a) und b) innerhalb eines Liposoms liegen.
    • Aspekt 7. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-4, wobei a) und b) innerhalb eines Partikels liegen.
    • Aspekt 8. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-7, umfassend eines oder mehrere der Folgenden: einen Puffer, einen Nukleasehemmer und einen Proteasehemmer.
    • Aspekt 9. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-8, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von 85 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 10. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-9, wobei das Cas12J-Polypeptideine Nickase ist, die nur einen Strang eines doppelsträngigen Target-Nukleinsäuremoleküls spalten kann.
    • Aspekt 11. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-9, wobei das Cas12J-Polypeptidein katalytisch inaktives Cas12J-Polypeptid (dCas12J) ist.
    • Aspekt 12. Die Zusammensetzung nach Aspekt 10 oder Aspekt 11, wobei das Cas12J-Polypeptid eine oder mehrere Mutationen an einer Position umfasst, die denen entspricht, die ausgewählt sind aus: D464, E678 und D769 von Cas12J_10037042_3.
    • Aspekt 13. Die Zusammensetzung nach einem der Aspekte 1-12, ferner umfassend eine DNA-Donorvorlage.
    • Aspekt 14. Ein Cas12J-Fusionspolypeptid, umfassend: ein Cas12J-Polypeptid, das an ein heterologes Polypeptid kondensiert ist.
    • Aspekt 15. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 14, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von 50 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 16. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 14, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von 85 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 17. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-16, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Nickase ist, die nur einen Strang eines doppelsträngigen Target-Nukleinsäuremoleküls spalten kann.
    • Aspekt 18. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-17, wobei das Cas12J-Polypeptidein katalytisch inaktives Cas12J-Polypeptid (dCas12J) ist.
    • Aspekt 19. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 17 oder Aspekt 18, wobei das Cas12J-Polypeptid eine oder mehrere Mutationen an einer Position umfasst, die denen entspricht, die ausgewählt sind aus: D464, E678 und D769 von Cas12J_10037042_3.
    • Aspekt 20. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-19, wobei das heterologe Polypeptid an den N-Terminus und/oder den C-Terminus des Cas12J-Polypeptids kondensiert ist.
    • Aspekt 21. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-20, umfassend ein Kernlokalisierungssignal (NLS).
    • Aspekt 22. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid ein Target-Polypeptid ist, das die Bindung an einen Zelloberflächenrest auf einer Target-Zelle oder einem Target-Zelltyp bereitstellt.
    • Aspekt 23. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid eine enzymatische Aktivität zeigt, die die Target-DNA modifiziert.
    • Aspekt 24. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 23, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus: Nukleaseaktivität, Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, DNA-Reparaturaktivität, DNA-Schadensaktivität, Desaminierungsaktivität, Dismutaseaktivität, Alkylierungsaktivität, Depurinierungsaktivität, Oxidationsaktivität, Pyrimidindimer-Bildungsaktivität, Integraseaktivität, Transposaseaktivität, Rekombinaseaktivität, Polymeraseaktivität, Ligaseaktivität, Helikaseaktivität, Photolyaseaktivität und Glycosylaseaktivität.
    • Aspekt 25. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 24, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus: Nukleaseaktivität, Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, Desaminierungsaktivität, Depurinierungsaktivität, Integraseaktivität, Transposaseaktivität und Rekombinaseaktivität.
    • Aspekt 26. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid eine enzymatische Aktivität zeigt, die ein Target-Polypeptid, das mit einer Target-Nukleinsäure assoziiert ist, modifiziert.
    • Aspekt 27. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 26, wobei das heterologe Polypeptid eine Histonmodifikationsaktivität zeigt.
    • Aspekt 28. Das Cas12J-Fusionsprotein nach Aspekt 26 oder Aspekt 27, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus: Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, Acetyltransferaseaktivität, Deacetylaseaktivität, Kinaseaktivität, Phosphataseaktivität, Ubiquitinligaseaktivität, Deubiquitinierungsaktivität, Adenylierungsaktivität, Deadenylierungsaktivität, SUMOylierungsaktivität, DeSUMOylierungsaktivität, Ribosylierungsaktivität, Deribosylierungsaktivität, Myristoylierungsaktivität, Demyristoylierungsaktivität, Glycosylierungsaktivität (z. B. von O-GlcNAc-Transferase) und Desglycosylierungsaktivität.
    • Aspekt 29. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 28, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus: Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, Acetyltransferaseaktivität und Deacetylaseaktivität.
    • Aspekt 30. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid ein endosomales Escape-Polypeptid ist.
    • Aspekt 31. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 30, wobei das endosomales Escape-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus: GLFXALLXLLXSLWXLLLXA (SEQ ID NO: 36) und GLFHALLHLLHSLWHLLLHA (SEQ ID NO: 37), wobei jedes X unabhängig aus Lysin, Histidin und Arginin ausgewählt ist.
    • Aspekt 32. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid ein Chloroplasten-Transitpeptid ist.
    • Aspekt 33. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid eine Proteintransduktionsdomäne umfasst.
    • Aspekt 34. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid ein Protein ist, das Transkription erhöht oder verringert.
    • Aspekt 35. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 34, wobei das heterologe Polypeptid eine Transkriptionsrepressordomäne ist.
    • Aspekt 36. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach Aspekt 34, wobei das heterologe Polypeptid eine Transkriptionsaktivierungsdomäne ist.
    • Aspekt 37. Das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-21, wobei das heterologe Polypeptid eine Proteinbindungsdomäne ist.
    • Aspekt 38. Eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Fusionspolypeptid nach einem der Aspekte 14-37 codiert.
    • Aspekt 39. Die Nukleinsäure nach Aspekt 38, wobei die Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, mit einem Promotor wirkverbunden ist.
    • Aspekt 40. Die Nukleinsäure nach Aspekt 39, wobei der Promotor in einer eukaryotischen Zelle wirkt.
    • Aspekt 41. Die Nukleinsäure nach Aspekt 40, wobei der Promotor in einer oder mehreren der Folgenden wirkt: einer Pflanzenzelle, einer Pilzzelle, einer Tierzelle, einer Zelle eines Wirbellosen, einer Fliegenzelle, einer Zelle eines Wirbeltiers, einer Säugerzelle, einer Primatenzelle, einer Zelle eines nichtmenschlichen Primaten und einer menschlichen Zelle.
    • Aspekt 43. Die Nukleinsäure nach einem der Aspekte 39-41, wobei der Promotor einer oder mehrere der Folgenden ist: ein konstitutiver Promotor, ein induzierbarer Promotor, ein zelltypspezifischer Promotor und ein gewebespezifischer Promotor.
    • Aspekt 43. Die Nukleinsäure nach einem der Aspekte 38-42, wobei die Nukleinsäure ein rekombinanter Expressionsvektor ist.
    • Aspekt 44. Die Nukleinsäure nach Aspekt 43, wobei der rekombinante Expressionsvektor ein rekombinanter adenoassoziierter viraler Vektor, ein rekombinanter retroviraler Vektor oder ein rekombinanter lentiviraler Vektor ist.
    • Aspekt 45. Die Nukleinsäure nach Aspekt 39, wobei der Promotor in einer prokaryotischen Zelle wirkt.
    • Aspekt 46. Die Nukleinsäure nach Aspekt 38, wobei das Nukleinsäuremolekül eine mRNA ist.
    • Aspekt 47. Eine oder mehrere Nukleinsäuren, umfassend: (a) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und (b) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid codiert.
    • Aspekt 48. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach Aspekt 47, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von 50 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 49. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach Aspekt 47, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von 85 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäure aufweist.
    • Aspekt 50. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach einem der Aspekte 47-49, wobei die Cas12J-Guide-RNA eine Nukleotidsequenz mit 80 % oder mehr Nukleotidsequenzidentität mit einer beliebigen der in 7 dargelegten crRNA-Sequenzen umfasst.
    • Aspekt 51. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach einem der Aspekte 47-50, wobei das Cas12J-Polypeptid an ein Kernlokalisierungssignal (NLS) kondensiert ist.
    • Aspekt 52. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach einem der Aspekte 47-51, wobei die Nukleotidsequenz, die die Cas12J-Guide-RNA codiert, mit einem Promotor wirkverbunden ist.
    • Aspekt 53. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach einem der Aspekte 47-52, wobei die Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Polypeptid codiert, mit einem Promotor wirkverbunden ist.
    • Aspekt 54. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach Aspekt 52 oder Aspekt 53, wobei der Promotor, der mit der Nukleotidsequenz, die die Cas12J-Guide-RNA codiert, wirkverbunden ist und/oder der Promotor, der mit der Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Polypeptidcodiert, wirkverbunden ist, in einer eukaryotischen Zelle wirkt.
    • Aspekt 55. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach Aspekt 54, wobei der Promotor in einer oder mehreren der Folgenden wirkt: einer Pflanzenzelle, einer Pilzzelle, einer Tierzelle, einer Zelle eines Wirbellosen, einer Fliegenzelle, einer Zelle eines Wirbeltiers, einer Säugerzelle, einer Primatenzelle, einer Zelle eines nichtmenschlichen Primaten und einer menschlichen Zelle.
    • Aspekt 56. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach einem der Aspekte 53-55, wobei der Promotor einer oder mehrere der Folgenden ist: ein konstitutiver Promotor, ein induzierbarer Promotor, ein zelltypspezifischer Promotor und ein gewebespezifischer Promotor.
    • Aspekt 57. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach einem der Aspekte 47-56, wobei die eine oder die mehreren Nukleinsäuren ein oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren sind.
    • Aspekt 58. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach Aspekt 57, wobei der eine oder die mehreren rekombinanten Expressionsvektoren ausgewählt sind aus: einem oder mehreren adenoassoziierten viralen Vektoren, einem oder mehreren rekombinanten retroviralen Vektoren oder einem oder mehreren rekombinanten lentiviralen Vektoren.
    • Aspekt 59. Die eine oder die mehreren Nukleinsäuren nach Aspekt 53, wobei der Promotor in einer prokaryotischen Zelle wirkt.
    • Aspekt 60. Eine eukaryotische Zelle, umfassend eines oder mehrere der Folgenden: a) ein Cas12J-Polypeptid oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Polypeptid codiert, b) ein Cas12J-Fusionspolypeptid oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, und c) eine Cas12J-Guide-RNA oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die Cas12J-Guide-RNA codiert.
    • Aspekt 61. Die eukaryontische Zelle nach Aspekt 60, umfassend die Nukleinsäure, die das Cas12J-Polypeptid codiert, wobei die Nukleinsäure in die genomische DNA der Zelle integriert ist.
    • Aspekt 62. Die eukaryontische Zelle nach Aspekt 60 oder Aspekt 61, wobei die eukaryotische Zelle eine Pflanzenzelle, eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Spinnentierzelle, eine Pilzzelle, eine Vogelzelle, eine Reptilienzelle, eine Amphibienzelle, eine Wirbellosenzelle, eine Mauszelle, eine Rattenzelle, eine Primatenzelle, eine Zelle eines nichtmenschlichen Primaten oder eine menschliche Zelle ist.
    • Aspekt 63. Eine Zelle, umfassend ein Cas12J-Fusionspolypeptid oder eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Fusionspolypeptid codiert.
    • Aspekt 64. Die Zelle nach Aspekt 63, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
    • Aspekt 65. Die Zelle nach Aspekt 63 oder Aspekt 64, umfassend die Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die das Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, wobei das Nukleinsäuremolekül in die genomische DNA der Zelle integriert ist.
    • Aspekt 66. Ein Verfahren zum Modifizieren einer Target-Nukleinsäure, wobei das Verfahren ein Kontaktieren der Target-Nukleinsäure mit Folgendem umfasst: a) einem Cas12J-Polypeptid; und b) einer Cas12J-Guide-RNA, umfassend eine Guide-Sequenz, die mit einer Target-Sequenz der Target-Nukleinsäure hybridisiert, wobei das Kontaktieren zu einer Modifikation der Target-Nukleinsäure durch das Cas12J-Polypeptidführt.
    • Aspekt 67. Das Verfahren nach Aspekt 66, wobei die Modifikation eine Spaltung der Target-Nukleinsäure ist.
    • Aspekt 68. Das Verfahren nach Aspekt 66 oder Aspekt 67, wobei die Target-Nukleinsäure ausgewählt ist aus: doppelsträngiger DNA, einzelsträngiger DNA, RNA, genomischer DNA und extrachromosomaler DNA.
    • Aspekt 69. Das Verfahren nach einem der Aspekte 66-68, wobei das Kontaktieren in vitro außerhalb einer Zelle erfolgt.
    • Aspekt 70. Das Verfahren nach einem der Aspekte 66-68, wobei das Kontaktieren innerhalb einer Zelle in Kultur erfolgt.
    • Aspekt 71. Das Verfahren nach einem der Aspekte 66-68, wobei das Kontaktieren innerhalb einer Zelle in vivo erfolgt.
    • Aspekt 72. Verfahren nach Aspekt 70 oder Aspekt 71, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
    • Aspekt 73. Das Verfahren nach Aspekt 72, wobei die Zelle aus Folgenden ausgewählt ist: einer Pflanzenzelle, einer Pilzzelle, einer Säugerzelle, einer Reptilienzelle, einer Insektenzelle, einer Vogelzelle, einer Fischzelle, einer Parasitenzelle, einer Arthropodenzelle, einer Wirbellosenzelle, einer Zelle eines Wirbeltiers, einer Nagetierzelle, einer Mauszelle, einer Rattenzelle, einer Primatenzelle, einer Zelle eines nichtmenschlichen Primaten und einer menschlichen Zelle.
    • Aspekt 74. Das Verfahren nach Aspekt 70 oder Aspekt 71, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
    • Aspekt 75. Das Verfahren nach einem der Aspekte 66-74, wobei das Kontaktieren zum Genom-Editing führt.
    • Aspekt 76. Das Verfahren nach einem der Aspekte 66-75, wobei das Kontaktieren Folgendes umfasst: Einbringen von Folgendem in eine Zelle: (a) des Cas12J-Polypeptids oder einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Polypeptid codiert, und (b) der Cas12J-Guide-RNA oder einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die Cas12J-Guide-RNA codiert.
    • Aspekt 77. Das Verfahren nach Aspekt 76, wobei das Kontaktieren ferner Folgendes umfasst: Einbringen einer DNA-Donorvorlage in die Zelle.
    • Aspekt 78. Das Verfahren nach einem der Aspekte 66-77, wobei die Cas12J-Guide-RNA eine Nukleotidsequenz mit 80 % oder mehr Nukleotidsequenzidentität mit einer beliebigen der in 7 dargelegten crRNA-Sequenzen umfasst.
    • Aspekt 79. Das Verfahren nach einem der Aspekte 66-78, wobei das Cas12J-Polypeptid an ein Kernlokalisierungssignal kondensiert ist.
    • Aspekt 80. Ein Verfahren zum Modulieren der Transkription von einer Target-DNA, Modifizieren einer Target-Nukleinsäure oder Modifizieren eines Proteins, das mit der Target-Nukleinsäure assoziiert ist, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Target-Nukleinsäure mit Folgendem umfasst: a) einem Cas12J-Fusionspolypeptid, umfassend ein Cas12J-Polypeptid, das an ein heterologes Polypeptid kondensiert ist; und b) einer Cas12J-Guide-RNA, umfassend eine Guide-Sequenz, die mit einer Target-Sequenz der Target-Nukleinsäure hybridisiert.
    • Aspekt 81. Das Verfahren nach Aspekt 80, wobei die Cas12J-Guide-RNA eine Nukleotidsequenz mit 80 % oder mehr Nukleotidsequenzidentität mit einer beliebigen der in 7 dargelegten crRNA-Sequenzen umfasst.
    • Aspekt 82. Das Verfahren nach Aspekt 80 oder Aspekt 81, wobei das Cas12J-Fusionspolypeptid ein Kernlokalisierungssignal umfasst.
    • Aspekt 83. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-82, wobei die Modifikation keine Spaltung der Target-Nukleinsäure ist.
    • Aspekt 84. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-83, wobei die Target-Nukleinsäure ausgewählt ist aus: doppelsträngiger DNA, einzelsträngiger DNA, RNA, genomischer DNA und extrachromosomaler DNA.
    • Aspekt 85. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-84, wobei das Kontaktieren in vitro außerhalb einer Zelle erfolgt.
    • Aspekt 86. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-84, wobei das Kontaktieren innerhalb einer Zelle in Kultur erfolgt.
    • Aspekt 87. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-84, wobei das Kontaktieren innerhalb einer Zelle in vivo erfolgt.
    • Aspekt 88. Verfahren nach Aspekt 86 oder Aspekt 87, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
    • Aspekt 89. Das Verfahren nach Aspekt 88, wobei die Zelle aus Folgenden ausgewählt ist: einer Pflanzenzelle, einer Pilzzelle, einer Säugerzelle, einer Reptilienzelle, einer Insektenzelle, einer Vogelzelle, einer Fischzelle, einer Parasitenzelle, einer Arthropodenzelle, einer Wirbellosenzelle, einer Zelle eines Wirbeltiers, einer Nagetierzelle, einer Mauszelle, einer Rattenzelle, einer Primatenzelle, einer Zelle eines nichtmenschlichen Primaten und einer menschlichen Zelle.
    • Aspekt 90. Das Verfahren nach Aspekt 86 oder Aspekt 87, wobei die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
    • Aspekt 91. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-90, wobei das Kontaktieren Folgendes umfasst: Einbringen von Folgendem in eine Zelle: (a) des Cas12J-Fusionspolypeptids oder einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die das Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, und (b) der Cas12J-Guide-RNA oder einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, die die Cas12J-Guide-RNA codiert.
    • Aspekt 92. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-91, wobei das Cas12J-Polypeptid ein katalytisch inaktives Cas12J-Polypeptid (dCas12J) ist.
    • Aspekt 93. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-92, wobei das Cas12J-Polypeptid eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen an einer Position umfasst, die denen entspricht, die ausgewählt sind aus: D464, E678 und D769 von Cas12J_10037042_3.
    • Aspekt 94. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-93, wobei das heterologe Polypeptid eine enzymatische Aktivität zeigt, die die Target-DNA modifiziert.
    • Aspekt 95. Das Verfahren nach Aspekt 94, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus: Nukleaseaktivität, Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, DNA-Reparaturaktivität, DNA-Schadensaktivität, Desaminierungsaktivität, Dismutaseaktivität, Alkylierungsaktivität, Depurinierungsaktivität, Oxidationsaktivität, Pyrimidindimer-Bildungsaktivität, Integraseaktivität, Transposaseaktivität, Rekombinaseaktivität, Polymeraseaktivität, Ligaseaktivität, Helikaseaktivität, Photolyaseaktivität und Glycosylaseaktivität.
    • Aspekt 96. Das Verfahren nach Aspekt 95, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus: Nukleaseaktivität, Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, Desaminierungsaktivität, Depurinierungsaktivität, Integraseaktivität, Transposaseaktivität und Rekombinaseaktivität.
    • Aspekt 97. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-93, wobei das heterologe Polypeptid eine enzymatische Aktivität zeigt, die ein Target-Polypeptid, das mit einer Target-Nukleinsäure assoziiert ist, modifiziert.
    • Aspekt 98. Das Verfahren nach Aspekt 97, wobei das heterologe Polypeptid eine Histonmodifikationsaktivität zeigt.
    • Aspekt 99. Das Verfahren nach Aspekt 97 oder Aspekt 98, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus:
      • Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, Acetyltransferaseaktivität, Deacetylaseaktivität, Kinaseaktivität, Phosphataseaktivität, Ubiquitinligaseaktivität, Deubiquitinierungsaktivität, Adenylierungsaktivität, Deadenylierungsaktivität, SUMOylierungsaktivität, DeSUMOylierungsaktivität, Ribosylierungsaktivität, Deribosylierungsaktivität, Myristoylierungsaktivität, Demyristoylierungsaktivität, Glycosylierungsaktivität (z. B. von O-GlcNAc-Transferase) und Desglycosylierungsaktivität.
    • Aspekt 100. Das Verfahren nach Aspekt 99, wobei das heterologe Polypeptid eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten zeigt, ausgewählt aus: Methyltransferaseaktivität, Demethylaseaktivität, Acetyltransferaseaktivität und Deacetylaseaktivität.
    • Aspekt 101. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-93, wobei das heterologe Polypeptid ein Protein ist, das Transkription erhöht oder verringert.
    • Aspekt 102. Das Verfahren nach Aspekt 101, wobei das heterologe Polypeptid eine Transkriptionsrepressordomäne ist.
    • Aspekt 103. Das Verfahren nach Aspekt 101, wobei das heterologe Polypeptid eine Transkriptionsaktivierungsdomäne ist.
    • Aspekt 104. Das Verfahren nach einem der Aspekte 80-93, wobei das heterologe Polypeptid eine Proteinbindungsdomäne ist.
    • Aspekt 105. Ein transgener, mehrzelliger, nichtmenschlicher Organismus, dessen Genom ein Transgen umfasst, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eines oder mehrere der Folgenden codiert: a) ein Cas12J-Polypeptid, b) ein Cas12J-Fusionspolypeptid; und c) eine Cas12J-Guide-RNA
    • Aspekt 106. Der transgene, mehrzellige, nichtmenschliche Organismus nach Aspekt 105, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 50 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargelegten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 107. Der transgene, mehrzellige, nichtmenschliche Organismus nach Aspekt 105, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 85 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargelegten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 108. Der transgene, mehrzellige, nichtmenschliche Organismus nach einem der Aspekte 105-107, wobei der Organismus eine Pflanze, eine Monokotyledonenpflanze, eine Dikotyledonenpflanze, ein wirbelloses Tier, ein Insekt, ein Arthropode, ein Spinnentier, ein Parasit, ein Wurm, ein Nesseltier, ein Wirbeltier, ein Fisch, ein Reptil, eine Amphibie, ein Huftier, ein Vogel, ein Schwein, ein Pferd, ein Schaf, ein Nagetier, eine Maus, eine Ratte oder ein nichtmenschlicher Primat ist.
    • Aspekt 109. System, umfassend eines der Folgenden:
      • a) ein Cas12J-Polypeptid und eine Cas12J-Guide-RNA,
      • b) ein Cas12J-Polypeptid, eine Cas12J-Guide-RNA und eine DNA-Donorvorlage;
      • c) ein Cas12J-Fusionspolypeptid und eine Cas12J-Guide-RNA;
      • d) ein Cas12J-Fusionspolypeptid, eine Cas12J-Guide-RNA und eine DNA-Donorvorlage;
      • e) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid codiert, und eine Cas12J-Guide-RNA;
      • f) eine mRNA, die ein Cas12J-Polypeptid codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine DNA-Donorvorlage;
      • g) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, und eine Cas12J-Guide-RNA;
      • h) eine mRNA, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert, eine Cas12J-Guide-RNA und eine DNA-Donorvorlage;
      • i) eine oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren, umfassend: i) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid codiert; und ii) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNAcodiert;
      • j) eine oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren, umfassend: i) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Polypeptid codiert;ii) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNAcodiert;und iii) eine DNA-Donorvorlage;
      • k) eine oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren, umfassend: i) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert;und ii) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert;und
      • 1) eine oder mehrere rekombinante Expressionsvektoren, umfassend: i) eine Nukleotidsequenz, die ein Cas12J-Fusionspolypeptid codiert; ii) eine Nukleotidsequenz, die eine Cas12J-Guide-RNA codiert; und eine DNA-Donorvorlage;
    • Aspekt 110. Das Cas12J-System nach Aspekt 109, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 50 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 111. Das Cas12J-System nach Aspekt 109, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 85 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 112. Das Cas12J-System nach einem der Aspekte 109-111, wobei die Donorvorlagen-Nukleinsäure eine Länge von 8 Nukleotiden bis 1000 Nukleotiden aufweist.
    • Aspekt 113. Das Cas12J-System nach einem der Aspekte 109-111, wobei die Donorvorlagen-Nukleinsäure eine Länge von 25 Nukleotiden bis 500 Nukleotiden aufweist.
    • Aspekt 114. Ein Kit, umfassend das Cas12J-System nach einem der Aspekte 109-113.
    • Aspekt 115. Das Kit nach Aspekt 114, wobei sich die Komponenten des Kits in demselben Behälter befinden.
    • Aspekt 116. Das Kit nach Aspekt 114, wobei sich die Komponenten des Kits in getrennten Behältern befinden.
    • Aspekt 117. Ein steriler Behälter, umfassend das Cas12J-System nach einem der Aspekte 109-116.
    • Aspekt 118. Der sterile Behälter nach Aspekt 117, wobei der Behälter eine Spritze ist.
    • Aspekt 119. Eine implantierbare Vorrichtung, umfassend das Cas12J-System nach einem der Aspekte 109-116.
    • Aspekt 120. Die implantierbare Vorrichtung nach Aspekt 119, wobei sich das Cas12J-System innerhalb einer Matrix befindet.
    • Aspekt 121. Die implantierbare Vorrichtung nach Aspekt 119, wobei sich das Cas12J-System in einem Reservoir befindet.
    • Aspekt 122. Ein Verfahren zum Nachweisen einer Target-DNA in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren der Probe mit: (i) einem Cas12L-Polypeptid; (ii) einer Guide-RNA, umfassend: eine Region, die an das Cas12L-Polypeptid bindet, und eine Guide-Sequenz, die mit der Target-DNA hybridisiert; und (iii) einer Nachweis-DNA, die einzelsträngig ist und nicht mit der Guide-Sequenz der Guide-RNA hybridisiert; und (b) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch Spaltung der einzelsträngigen Nachweis-DNA durch das Cas12L-Polypeptid erzeugt wird, wodurch die Target-DNA nachgewiesen wird.
    • Aspekt 123. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei die Target-DNA einzelsträngig ist.
    • Aspekt 124. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei die Target-DNA doppelsträngig ist.
    • Aspekt 125. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-124, wobei die Target-DNA bakterielle DNA ist.
    • Aspekt 126. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-124, wobei die Target-DNA virale DNA ist.
    • Aspekt 127. Das Verfahren nach Aspekt 126, wobei die Target-DNA DNA von Papovavirus, humanem Papillomavirus (HPV), Hepadnavirus, Hepatitis-B-Virus (HBV), Herpesvirus, Varicella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Kaposi-Sarkomassoziiertes Herpesvirus, Adenovirus, Pockenvirus oder Parvovirus ist.
    • Aspekt 128. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei die Target-DNA aus einer menschlichen Zelle stammt.
    • Aspekt 129. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei die Target-DNA menschliche fötale oder Krebszell-DNA ist.
    • Aspekt 130. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-129, wobei das Cas12J-Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenzidentität von 50 % oder mehr zu der in einer beliebigen der 6A-6R dargestellten Aminosäuresequenz aufweist.
    • Aspekt 131. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei die Probe DNA aus einem Zelllysat umfasst.
    • Aspekt 132. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei die Probe Zellen umfasst.
    • Aspekt 133. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei die Probe eine Blut-, Serum-, Plasma-, Urin-, Aspirat- oder Biopsieprobe ist.
    • Aspekt 134. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-133, ferner umfassend ein Bestimmen einer Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA.
    • Aspekt 135. Das Verfahren nach Aspekt 122, wobei das Messen eines nachweisbaren Signals eines oder mehrere der Folgenden umfasst: visuell basierter Nachweis, sensorbasierter Nachweis, Farbnachweis, Nachweis auf Grundlage von Goldnanopartikeln, Fluoreszenzpolarisation, Kolloidphasentransition/-dispersion, elektrochemischer Nachweis und halbleiterbasierte Abtastung.
    • Aspekt 136. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-135, wobei die markierte Nachweis-DNA eine modifizierte Nukleobase, einen modifizierten Zuckerrest und/oder eine modifizierte Nukleinsäurebindung umfasst.
    • Aspekt 137. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-135, ferner umfassend ein Nachweisen einer positiven Kontroll-Target-DNA in einer positiven Kontrollprobe, wobei das Nachweisen Folgendes umfasst: (c) Kontaktieren der positiven Kontrollprobe mit: (i) dem Cas12J-Polypeptid; (ii) einer positiven Kontroll-Guide-RNA, umfassend: eine Region, die an das Cas12J-Polypeptid bindet, und eine positive Kontroll-Guide-Sequenz, die mit der positiven Kontroll-Target-DNA hybridisiert; und (iii) einer markierten Nachweis-DNA, die einzelsträngig ist und nicht mit der positiven Kontroll-Guide-Sequenz der positiven Kontroll-Guide-RNA hybridisiert; und (d) Messen eines nachweisbaren Signals, das durch Spaltung der markierten Nachweis-DNA durch das Cas12J-Polypeptid erzeugt wird, wodurch die positive Kontroll-Target-DNA nachgewiesen wird.
    • Aspekt 138. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-136, wobei das nachweisbare Signal in weniger als 45 Minuten nachweisbar ist.
    • Aspekt 139. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-136, wobei das nachweisbare Signal in weniger als 30 Minuten nachweisbar ist.
    • Aspekt 140. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-139, ferner umfassend ein Amplifizieren der Target-DNA in der Probe durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (loop-mediated isothermal amplification - LAMP), Helikase-abhängige Amplifikation (helicase-dependent amplification - HDA), Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA), Strangverdrängungsamplifikation (strand displacement amplification - SDA), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (nucleic acid sequence-based amplification- NASBA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (transcription mediated amplification - TMA), Nicking-Enzym-Amplifikationsreaktion (NEAR), Rolling-Circle-Amplifikation (RCA), Multiple-Displacement-Amplifikation (MDA), Ramifikation (RAM), zirkuläre Helikase-abhängige Amplifikation (circular helicase-dependent amplification - cHDA), isotherme Einzelprimer-Amplifikation (single primer isothermal amplification - SPIA), signalvermittelte Amplifikation der RNA-Technologie (signal mediated amplification of RNA technology - SMART), autarke Sequenzreplikation (self-sustained sequence replication - 3SR), genomexponentielle Amplifikationsreaktion (genome exponential amplification reaction - GEAR) oder isotherme Mehrfachverdrängungsamplifikation (isothermal multiple displacement amplification - IMDA).
    • Aspekt 141. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-140, wobei die Target-DNA in der Probe in einer Konzentration von weniger als 10 aM vorliegt.
    • Aspekt 142. Das Verfahren nach einem der Aspekte 122-141, wobei die einzelsträngige Nachweis-DNA ein fluoreszenzemittierendes Farbstoffpaar umfasst.
    • Aspekt 143. Das Verfahren nach Aspekt 142, wobei das fluoreszenzemittierende Farbstoffpaar eine Menge an nachweisbarem Signal vor der Spaltung der einzelsträngigen Nachweis-DNA erzeugt und die Menge an nachweisbarem Signal nach der Spaltung der einzelsträngigen Nachweis-DNA reduziert ist.
    • Aspekt 144. Das Verfahren nach Aspekt 142, wobei die einzelsträngige Nachweis-DNA ein erstes nachweisbares Signal vor dem Spalten und ein zweites nachweisbares Signal nach der Spaltung der einzelsträngigen Nachweis-DNA erzeugt.
    • Aspekt 145. Das Verfahren nach einem der Aspekte 142-144, wobei das fluoreszenzemittierende Farbstoffpaar ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Paar ist.
    • Aspekt 146. Das Verfahren nach Aspekt 142, wobei eine Menge an nachweisbarem Signal nach der Spaltung der einzelsträngigen Nachweis-DNA zunimmt.
    • Aspekt 147. Das Verfahren nach einem der Aspekte 142-146, wobei das fluoreszenzemittierende Farbstoffpaar ein Quencher/Fluor-Paar ist.
    • Aspekt 148. Das Verfahren nach einem der Aspekte 142-147, wobei die einzelsträngige Nachweis-DNA zwei oder mehr fluoreszenzemittierende Farbstoffpaare umfasst.
    • Aspekt 149. Das Verfahren nach Aspekt 148, wobei die zwei oder mehr fluoreszenzemittierendene Farbstoffpaar ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Paar und ein Quencher/Fluor-Paar enthalten.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sind dargelegt, um dem Durchschnittsfachmann eine komplette Offenbarung und Beschreibung darüber bereitzustellen, wie die vorliegende Erfindung herzustellen und zu verwenden ist, und sie sind nicht dazu bestimmt, den Umfang dessen einzuschränken, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, noch sind die dazu bestimmt, zu repräsentieren, dass die nachstehenden Beispiel alle oder die einzigen durchgeführten Experimente sind. Es wurde versucht, Genauigkeit in Bezug auf verwendete Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur usw.) sicherzustellen, jedoch ist mit einigen Versuchsfehlern und Abweichungen zu rechnen. Sofern nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, ist das Molekulargewicht das gewichtsgemittelte Molekulargewicht, ist die Temperatur in Grad Celsius angegeben und liegt der Druck bei oder nahe dem Atmosphärendruck. Standardabkürzungen können verwendet werden, z. B. bp, Basenpaar(e); kb, Kilobase(n); pl Pikoliter; s oder sek, Sekunde(n); min, Minute(n); h oder Std, Stunde(n); aa, Aminosäure(n); kb, Kilobase(n); bp, Basenpaar(e); nt, Nukleotid(e); i.m., intramuskulär; i.p., intraperitoneal; s.c. subkutan; und dergleichen.
  • Beispiel 1
  • Metagenomische Datensätze aus vielen verschiedenen Ökosystemen wurden generiert und Hunderte von riesigen Phagengenomen mit einer Länge zwischen 200 kbp und 716 kbp wurden rekonstruiert. Vierunddreißig Genome wurden manuell vollständig zusammengestellt, einschließlich der größten Phagengenome, über die bisher berichtet wurde. Das erweiterte genetische Repertoire umfasst verschiedene und neue CRISPR-Cas-Systeme, tRNA, tRNA-Synthetasen, tRNA-Modifikationsenzyme, Initiations- und Elongationsfaktoren sowie ribosomale Proteine. Phagen-CRISPR haben die Fähigkeit, Transkriptionsfaktoren und Translationsgene des Wirts zum Schweigen zu bringen, möglicherweise als Teil eines größeren Interaktionsnetzwerks, das die Translation abfängt, um die Biosynthese auf phagencodierte Funktionen umzuleiten. Einige Phagen verwenden bakterielle Systeme zur Phagenabwehr, um konkurrierende Phagen zu eliminieren. Sieben Hauptkladen riesiger Phagen aus menschlichen und anderen tierischen Mikrobiomen, Ozeanen, Seen, Sedimenten, Böden und der gebauten Umwelt wurden phylogenetisch definiert. Es wird der Schluss gezogen, dass große Geninventare eine konservierte biologische Strategie widerspiegeln, die über einen breiten bakteriellen Wirtsbereich beobachtet wird und zur Verteilung riesiger Phagen in den Ökosystemen der Erde führt.
  • Hunderte von Phagensequenzen >200 kbp in der Länge, die aus Mikrobiom-Datensätzen rekonstruiert wurden, die aus einer Vielzahl von Ökosystemen generiert wurden, wurden vorgestellt. Die drei bislang größten vollständigen Genome für Phagen mit einer Länge von bis zu 642 kbp wurden rekonstruiert. Eine grafische Zusammenfassung bietet einen Überblick über den Ansatz und die wichtigsten Ergebnisse. Die Forschung erweitert das Verständnis der Biodiversität von Phagen und bringt die Vielfalt der Ökosysteme ans Licht, in denen Phagen Genomgrößen aufweisen, die mit denen kleinzelliger Bakterien konkurrieren.
  • Entnahme im Ökosystem
  • Metagenomische Datensätze wurden aus menschlichen Stuhl- und Oralproben, Stuhlproben anderer Tiere, Süßwasserseen und -flüssen, marinen Ökosystemen, Sedimenten, heißen Quellen, Böden, tiefen unterirdischen Lebensräumen und der bebauten Umwelt gewonnen (5). Für eine Untergruppe davon wurden zuvor Analysen von bakteriellen, archaealen und eukaryotischen Organismen veröffentlicht. Genomsequenzen, die eindeutig nicht bakteriell, archaeal, archaeal-viral, eukaryotisch oder eukaryotisch-viral waren, wurden aufgrund ihrer Geninventare entweder als phagen- oder plasmidartig klassifiziert. De-novo assemblierte Fragmente von nahe oder >200 kbp Länge wurden auf Zirkularisierung getestet und eine Teilmenge zur manuellen Überprüfung und Zusammenstellung bis zur Fertigstellung ausgewählt (siehe Verfahren).
  • Genomgrößen und grundlegende Merkmale
  • 358 Phagen-, 3 Plasmid- und 4 Phagen-Plasmid-Sequenzen wurden rekonstruiert (5). Zusätzliche Sequenzen, von denen angenommen wurde, dass sie Plasmide sind, wurden ausgeschlossen (siehe Verfahren), und nur diejenigen, die für CRISPR-Cas-Loci codieren, wurden beibehalten (siehe nachfolgend). In Übereinstimmung mit der Klassifizierung als Phagen wurde eine Vielzahl von phagenrelevanten Genen identifiziert, einschließlich jener, die an der Lyse beteiligt sind und Strukturproteine codieren, und andere erwartete genomische Merkmale von Phagen wurden dokumentiert. Einige Phagen-vorhergesagte Proteine sind groß und bis zu 7694 Aminosäuren lang. Viele davon wurden vorläufig als Strukturproteine annotiert. 180 Phagensequenzen wurden zirkularisiert und 34 manuell vollständig zusammengestellt, in einigen Fällen durch Auflösen komplexer Wiederholungsregionen und ihrer codierten Proteine (siehe Verfahren). Einige Genome zeigen ein klares GC-Versatzsignal für die bidirektionale Replikation, Informationen, die ihren Replikationsursprung einschränken. Die drei größten vollständigen, manuell zusammengestellten und zirkularisierten Phagengenome sind 634, 636 und 643 kbp lang und stellen die größten bisher gemeldeten Phagengenome dar. Zuvor war das größte zirkularisierte Phagengenom 596 kbp lang (Paez-Espino et al. (2016) oben). Dieselbe Studie berichtete über ein zirkularisiertes Genom mit einer Länge von 630 kbp, dies ist jedoch ein Artefakt. Das Problem der verketteten Sequenzen war in IMG-VR so ausgeprägt, dass diese Daten nicht in weitere Analysen einbezogen wurden. Die vollständigen und zirkularisierten Genome aus der Studie, Refseq und veröffentlichte Forschungsergebnissen wurden dazu verwendet, eine aktuelle Ansicht der Verteilung der Phagengenomgrößen (Verfahren) darzustellen. Die mittlere Genomgröße für einen vollständigen Phagen beträgt ~52 kbp (1A), ähnlich der zuvor berichteten durchschnittlichen Größe von ~54 kbp (Paez-Espino et al. (2016) oben). Somit erweitern die hierin berichteten Sequenzen das Inventar von Phagen mit ungewöhnlich großen Genomen erheblich (1B).
  • Interessanterweise wurden zwei verwandte Sequenzen von 712 und >716 kbp Länge identifiziert und manuell zusammengestellt (5). Diese wurden aufgrund ihres Gesamtgenomgehalts und des Vorhandenseins von Terminase-Genen als Phagen klassifiziert. Die Anordnungen sind durch wenige kb lange komplexe Regionen vermengt, die aus kleinen Wiederholungen an beiden Genomenden bestehen. Es wird erwartet, dass diese Genome geschlossen werden könnten, wenn die Wiederholungsregionen rationalisiert werden könnten.
  • Einige Genome haben eine sehr geringe Codierungsdichte (neun <75 %) aufgrund der Verwendung eines genetischen Codes, der sich von dem für die Genvorhersage verwendeten unterscheidet. Ein ähnliches Phänomen wurde für Lak-Phagen berichtet (Devoto et al. (2019), Nat Microbiol und Ivanova et al. (2014), Science 344:909-913). Im Unterschied zu früheren Studien scheinen die Genome den genetischen Code 16 zu verwenden, in dem TAG, normalerweise ein Stoppcodon, für eine Aminosäure codiert.
  • In nur einem Fall wurde eine Sequenz von >200 kbp, die aufgrund des Übergangs in die flankierende bakterielle Genomsequenz als Prophage klassifiziert wurde, identifiziert. Etwa die Hälfte der Genome war jedoch nicht zirkularisiert, so dass ihre Ableitung von Prophagen nicht ausgeschlossen werden kann. Das Vorhandensein von Integrasen in einigen Genomen deutet unter bestimmten Bedingungen auf einen lysogenen Lebensstil hin.
  • Wirte, Vielfalt und Verteilung
  • Eine faszinierende Frage bezieht sich auf die Evolutionsgeschichte von Phagen mit riesigen Genomen. Sind sie das Ergebnis der jüngsten Genomexpansion innerhalb von Gruppen von Phagen normaler Größe oder ist ein großer Bestand an Genen eine etablierte, persistente Strategie? Um dies zu untersuchen, wurden phylogenetische Bäume für die große Terminase-Untereinheit (2) und Hauptkapsidproteine konstruiert, die als Kontextsequenzen in öffentlichen Datenbanken für Phagen aller Größen verwendet wurden (Verfahren). Viele der Sequenzen aus den großen Phagengenomen gruppieren sich, was Kladen definiert. Die Analyse der Genomgrößeninformationen für Datenbanksequenzen zeigt, dass die öffentlichen Sequenzen, die in diese Kladen fallen, von Phagen mit Genomen mit einer Länge von mindestens 120 kbp stammen. Die größte Gruppe, die hier als Maha-Phage bezeichnet wird (Maha ist Sanskrit für riesig), umfasst alle größten Genome der vorliegenden Studie sowie die Lak-Genome aus menschlichen und tierischen Mikrobiomen (Devoto et al. (2019) oben). Sechs weitere klar definierte Cluster großer Phagen wurden identifiziert und mit dem Wort für „riesig“ in verschiedenen Sprachen benannt. Die Existenz dieser Kladen legt fest, dass eine große Genomgröße ein relativ stabiles Merkmal ist. Innerhalb der sieben Klassen wurden Phagen aus einer Vielzahl von Umwelttypen entnommen, was auf eine Diversifizierung dieser großen Phagen und ihrer Wirte über Ökosysteme hinweg hinweist. Die Umweltverteilung von Phagen, die eng genug miteinander verwandt sind, dass ihre Genome weitgehend ausgerichtet werden können, wurde ebenfalls untersucht. In 17 Fällen treten diese Phagen in mindestens zwei Biotoptypen auf.
  • Um zu bestimmen, inwieweit die bakterielle Wirtsphylogenie mit Phagenkladen korreliert, wurden Phagenwirte unter Verwendung von CRISPR-Spacer-Targeting von Bakterien in denselben oder verwandten Proben und von Phylogenie von normalerweise mit dem Wirt assoziierten Genen, die auf Phagen auftreten, identifiziert (siehe nachfolgend). Der prädiktive Wert der bakteriellen Zugehörigkeit der Phagengeninventare wurde ebenfalls getestet (Verfahren) und es wurde festgestellt, dass in jedem Fall das CRISPR-Spacer-Targeting und die phylogenetische Profilierung auf Phylum-Ebene mit den Charakterisierungen des Geninventars übereinstimmten. Folglich wurde dieses Verfahren verwendet, um die Phylum-Level-Zugehörigkeiten von Wirten für viele Phagen vorherzusagen. Die Ergebnisse belegen die Bedeutung von Firmicutes- und proteobakteriellen Wirten und zeigen die höhere Prävalenz von Firmicutes-Phagen im menschlichen und tierischen Darm im Vergleich zu anderen Umgebungen (5). Bemerkenswerterweise sind die vier größten Genome (634-716 kbp lang) alle für Phagen bestimmt, von denen vorhergesagt wird, dass sie sich in Bacteroidetes replizieren, ebenso wie Lak-Phagen mit Genomen von 540-552 kbp (Devoto et al. (2019) oben) und alle Cluster innerhalb von Mahaphage. Insgesamt wird vorausgesagt, dass sich phagenetisch gruppierte Phagen in Bakterien desselben Phylums replizieren.
  • Stoffwechsel, Transkription, Translation
  • Die Phagengenome codieren Proteine, von denen vorhergesagt wird, dass sie sich auf der Bakterienmembran oder der Zelloberfläche befinden. Diese können die Anfälligkeit des Wirts für eine Infektion durch andere Phagen beeinflussen. Fast alle zuvor berichteten Kategorien von Genen, die zur Steigerung des Wirtsstoffwechsels während der Infektion vorgeschlagen wurden, wurden identifiziert. Viele Phagen haben Gene, die an Schritten der De-novo-Biosynthese von Purinen und Pyrimidinen und mehreren Schritte, die Nukleinsäure- und Ribonukleinsäure- und Nukleotidphosphorylierungszustände untereinander umwandeln, beteiligt sind. Diese Gensätze ähneln auf faszinierende Weise denen von Bakterien mit sehr kleinen Zellen und mutmaßlichen symbiotischen Lebensstilen (Castelle und Banfield (2018) Cell 172:1181-1197).
  • Insbesondere haben viele Phagen Gene, deren vorhergesagte Funktionen in der Transkription und Translation liegen. Phagen codieren bis zu 64 tRNA pro Genom, wobei sich die Sequenzen von denen ihrer Wirte unterscheiden. Im Allgemeinen nimmt die Anzahl der tRNA pro Genom mit der Genomlänge zu (1). Sie haben oft bis zu 16 tRNA-Synthetasen pro Genom, die mit denen ihrer Wirte verwandt sind, sich aber von diesen unterscheiden. Phagen können diese Proteine verwenden, um ihre eigenen tRNA-Varianten mit vom Wirt abgeleiteten Aminosäuren aufzuladen. Eine Untergruppe von Genomen enthält Gene zur tRNA-Modifikation und zur Reparatur von tRNA, die als Teil der Wirtsabwehr gegen Phageninfektionen gespalten werden. Ebenfalls identifiziert sind bis zu drei mögliche ribosomale Proteine pro Genom, von denen das häufigste rpS21 ist (ein Phänomen, über das erst kürzlich in Phagen berichtet wurde) (Mizuno et al. (2019) Nat. Commun. 10: 752).; 3). Interessanterweise wird festgestellt, dass die PhagenrpS21 -Sequenzen N-terminale Verlängerungen aufweisen, die reich an Arginin, Lysin und Phenylalanin sind: Reste, die Nukleinsäuren binden. Es wird vorausgesagt, dass diese ribosomalen Phagenproteine Wirtsproteine im Ribosom ersetzen (Mizuno et al. (2019) oben) und dass die Verlängerungen aus der Ribosomenoberfläche nahe der Stelle der Translationsinitiierung herausragen, um die Phagen-mRNA zu lokalisieren.
  • Einige Phagen haben Gene, von denen vorhergesagt wird, dass sie in anderen Proteinsyntheseschritten wirken, einschließlich um eine effiziente Translation sicherzustellen. Einige codieren entweder den Initiationsfaktor 1 oder 3 oder beide, manchmal auch die Elongationsfaktoren G, Tu, Ts und Freisetzungsfaktoren. Ebenfalls identifiziert sind Gene, die Ribosomenrecyclingfaktoren codieren, zusammen mit tmRNA und kleinem Protein B (SmpB), die Ribosomen retten, die auf beschädigten Transkripten blockiert sind, und den Abbau aberranter Proteine auslösen. tmRNA werden auch von Phagen verwendet, um den physiologischen Zustand von Wirtszellen zu erfassen, und können eine Lyse induzieren, wenn die Anzahl der blockierten Ribosomen im Wirt hoch ist.
  • Diese Beobachtungen legen viele Möglichkeiten nahe, wie einige große Phagen die Ribosomenfunktion im Wesentlichen abfangen und umleiten können. Da Phagen-mRNA-Sequenzen mit dem 3'-Ende der 16S-rRNA des Wirts in Eingriff kommen müssen, um die Translation zu initiieren, wurden ihre ribosomalen mRNA-Bindungsstellen vorhergesagt. In den meisten Fällen weisen Phagen-mRNA kanonische Shine Dalgarno (SD)-Sequenzen auf und weitere ∼15% weisen nicht standardmäßige SD-Bindungsstellen auf. Interessanterweise weisen Phagen, deren Genome für ein wahrscheinliches oder mögliches rpS1 codieren, jedoch selten identifizierbare oder kanonische SD-Sequenzen auf. Somit kann phagencodiertes rpS1 selektiv die Translation von Phagen-mRNA initiieren. Insgesamt scheinen Phagengene die Proteinproduktionskapazität des Wirts umzuleiten, um Phagengene zu begünstigen, indem sie die frühesten Schritte der Translation abfangen. Diese Schlussfolgerungen stimmen mit den Ergebnissen einiger eukaryotischer Viren überein, die jede Phase der Proteinsynthese kontrollieren (Jaafar und Kieft (2019) Nat. Rev. Microbiol. 17:110-123). Interessanterweise weisen einige große mutmaßliche Plasmide auch analoge Reihen translationsrelevanter Gene auf.
  • Etwa die Hälfte der Phagengenome weist eine bis fünfzig Sequenzen >25 nt lang auf, die sich zu perfekten Haarnadeln falten. Die Palindrome (Sequenzen mit Dyadensymmetrie) sind fast ausschließlich intergen und jeweils innerhalb eines Genoms einzigartig. Einige, aber nicht alle, werden als Rho-unabhängige Terminatoren vorausgesagt und liefern somit Hinweise auf Gene, die als unabhängig regulierte Einheiten fungieren (Verfahren). Einige Palindrome sind jedoch bis zu 74 bp lang, und 34 Genome weisen Beispiele mit einer Länge von ≥ 40 nt auf, die scheinbar größer als normale Terminatoren sind. Diese treten fast ausschließlich in Mahaphage auf und können alternative oder zusätzliche Funktionen haben, wie etwa die Modulation der Bewegung der mRNA durch das Ribosom.
  • CRISPR-Cas-vermittelte Interaktionen
  • Fast alle Haupttypen von CRISPR-Cas-Systemen auf Phagen, einschließlich Cas9, des kürzlich beschriebenen Typs V-I (Yan et al. (2019) Science 363: 88-91) und neuer Subtypen von Typ-V-F-Systemen wurden identifiziert (Harrington et al. (2018)):839-842.362 Science. Die Klasse-II-Systeme (Typ II und V) werden erstmals in Phagen berichtet. Die meisten Effektornukleasen (zur Interferenz) haben katalytische Reste konserviert, was bedeutet, dass sie möglicherweise funktionell.
  • Im Gegensatz zu dem zuvor gut beschriebenen Fall eines Phagen mit einem CRISPR-System (Seed et al. (2013) Nature 494:489-491) fehlt fast allen Phagen-CRISPR-Systemen eine Spacer-Erfassungsmaschinerie (Cas1, Cas2 und Cas4) und vielen fehlen erkennbare Gene für Interferenzen. Beispielsweise haben zwei verwandte Phagen sowohl ein Typ-I-C-Variantensystem ohne Cas1 und Cas2 als auch ein Helikase-Protein anstelle von Cas3. Sie beherbergen auch ein zweites System, das ein neues Kandidaten-Effektorprotein mit -750 aa vom Typ V enthält, das proximal zu CRISPR-Arrays auftritt. In einigen Fällen haben Phagen, denen Gene für Interferenz und Spacerintegration fehlen, ähnliche CRISPR-Wiederholungen wie ihre Wirte und können daher Cas-Proteine verwenden, die von ihrem Wirt für diese Funktionen synthetisiert wurden. Alternativ können die Systeme, denen eine Effektornuklease fehlt, die Transkription der Target-Sequenzen ohne Spaltung unterdrücken (Luo et al. (2015) Nucleic Acids Res. 43:674-681; Stachler and Marchfelder (2016) J. Biol. Chem. 291:15226-15242).
  • Die phagencodierten CRISPR-Arrays sind häufig kompakt (3-55 Wiederholungen; Median 6 pro Array. Dieser Bereich ist wesentlich kleiner als typischerweise in Bakteriengenomen zu finden (Toms und Barrangou (2017) Biol. Direct 12:20). Einige Phagen-Spacer zielen auf strukturelle und regulatorische Kerngene anderer Phagen ab. Daher verstärken Phagen anscheinend das Immunarsenal ihrer Wirte, um eine Infektion durch konkurrierende Phagen zu verhindern.
  • Es wurden mehrere große Plasmide oder plasmidähnliche Genome identifiziert, die eine Vielzahl von Typen von CRISPR-Cas-Systemen codieren. Einige dieser Systeme haben auch kein Cas1 und Cas2. Am häufigsten zielen die Spacer auf die Mobilisierungs- und Konjugationsgene anderer Plasmide sowie auf Nukleasen und Strukturproteine von Phagen ab.
  • Einige phagencodierte CRISPR-Loci haben Spacer, die auf Bakterien in derselben Probe oder in einer Probe aus derselben Studie abzielen. Es wird angenommen, dass die Target-Bakterien die Wirte für diese Phagen sind, was eine Schlussfolgerung ist, die durch andere Wirtsvorhersageanalysen gestützt wird. Einige Loci mit bakteriellen Chromosomen-Targeting-Spacern codieren Cas-Proteine, die das Wirtschromosom spalten könnten, andere nicht. Das Targeting von Wirtsgenen könnte ihre Regulation deaktivieren oder verändern, was während des Phageninfektionszyklus vorteilhaft sein kann. Einige Phagen-CRISPR-Spacer zielen auf bakterielle intergene Regionen ab und stören möglicherweise die Genomregulation, indem sie Promotoren blockieren oder nichtcodierende RNA zum Schweigen bringen.
  • Zu den interessantesten Beispielen für das CRISPR-Targeting von Bakterienchromosomen gehören Gene, die an der Transkription und Translation beteiligt sind. Zum Beispiel zielt ein Phage auf einen σ70-Transkriptionsfaktor im Genom seines Wirts ab, während er das Gen für σ70 codiert. Es gibt frühere Berichte über σ70-Hijacking durch Phagen mit Anti-Sigma-Faktoren. Dies kann auch bei einigen großen Phagen auftreten, deren Genome für Anti-Sigma-Faktoren codieren. In einem anderen Beispiel zielt ein Phagen-Spacer auf die Glycyl-tRNA-Synthetase des Wirts ab.
  • Interessanterweise wurden keine Hinweise auf ein Targeting eines CRISPRtragenden Phagen durch einen vom Wirt codierten Spacer gefunden, was darauf hindeutet, dass Komponenten in Phagen-Wirt-CRISPR-Wechselwirkungen noch zu entdecken sind. Das Phagen-CRISPR-Targeting anderer Phagen, auf die ebenfalls bakterielles CRISPR (FOG/4) abzielt, deutete jedoch auf Phagen-Wirt-Assoziationen hin, die durch das phagenphylogenetische Profil weitgehend bestätigt wurden.
  • Einige große Pseudomonas-Phagen codieren Anti-CRISPR (Acr) (Bondy-Denomy et al. (2015) Nature 526:136-139; Pawluket al. (2016) Nat Microbiol 1:16085) und Proteine, die ein kernartiges Kompartiment bilden, das ihre replizierenden Genome von der Wirtsabwehr und anderen Bakteriensystemen trennt. Es wurden Proteine identifiziert, die in riesigen Phagengenomen codiert sind, die mit AcrVA5, AcrVA2 und AcrIIA7 clustern und möglicherweise als Acr fungieren. Ebenfalls identifiziert wurden Tubulin-Homologe (PhuZ), die den „Phagenkern“ positionieren, und Proteine, die mit Komponenten der Proteinbarriere verwandt sind. Daher können Phagen-„Kerne“ ein relativ häufiges Merkmal bei großen Phagen sein.
  • Verfahren
  • Identifizierung des Phagen- und Plasmidgenoms
  • In der aktuellen Studie erzeugte Datensätze, die aus früheren Untersuchungen stammen, die Tara Oceans-Mikrobiome (Karsenti et al. (2011) PLoS Biol. 9:e1001177) und das Global Oceans Virome (GOV; (Roux et al. (2016) Nature) 537:689-693) wurden nach Sequenz-Assemblierungen durchsucht, die von Phagen mit Genomen von > 200 kbp Länge stammen könnten. Auslesungs-Assemblierung, Genvorhersage und anfängliche Annotation von Genen folgten den zuvor beschriebenen Standardverfahren (Wrighton et al. (2014) ISME J. 8:1452-1463).
  • Phagenkandidaten wurden anfänglich gefunden, indem Sequenzen abgerufen wurden, die keinem Genom zugeordnet waren und auf Domänenebene kein klares taxonomisches Profil hatten. Taxonomische Profile wurden durch ein Abstimmungsschema ermittelt, bei dem es eine Gewinner-Taxonomie von >50 % Stimmen bei jedem taxonomischen Rang basierend auf den Datenbank-Annotationen von Uniprot und ggKbase (ggkbase.berkeley.edu) geben musste. Die Phagen wurden weiter eingegrenzt, indem Sequenzen mit einer hohen Anzahl hypothetischer Proteinanmerkungen und/oder das Vorhandensein von Phagenstrukturgenen, z. B. Kapsid, Schwanz, Holin, identifiziert wurden. Alle Kandidaten-Phagensequenzen wurden durchgehend überprüft, um mutmaßliche Prophagen von Phagen zu unterscheiden. Prophagen wurden auf der Grundlage eines klaren Übergangs in das Genom mit einem hohen Anteil an zuverlässigen funktionellen Vorhersagen, die häufig mit den wichtigsten Stoffwechselfunktionen verbunden sind, und einer viel höheren Ähnlichkeit mit bakteriellen Genomen identifiziert. Plasmide wurden von Phagen anhand von Übereinstimmungen mit Plasmidmarkergenen (z. B. parA) unterschieden. Drei Sequenzanordnungen konnten nicht eindeutig zwischen Phagen und Plasmid unterschieden werden und wurden als „Phagenplasmid“ zugeordnet.
  • Manuelle Zusammenstellung des Phagen- und Plasmidgenoms
  • Alle Gerüste, die als phagen- oder phagenartig klassifiziert wurden, wurden unter Verwendung eines benutzerdefinierten Skripts auf Endüberlappungen getestet und manuell auf Überlappungen überprüft. Assemblierte Sequenzen, die perfekt zirkularisiert werden konnten, wurden als potenziell „vollständig“ angesehen. Fehlerhafte verkettete Sequenz-Assemblierungen wurden anfänglich durch Suchen nach direkten Wiederholungen >5 kb unter Verwendung von Vmatch gekennzeichnet (Kurtz (2003) Ref Type: Computer Program 412:297). Potenziell verkettete Sequenz-Assemblierungen wurden mithilfe der Dotplot- und RepeatFinder-Funktionen in Geneious v9 manuell auf mehrere große sich wiederholende Sequenzen überprüft. Die Sequenzen wurden korrigiert und aus der weiteren Analyse entfernt, wenn die korrigierte Länge <200 kbp war.
  • Eine Untergruppe der Phagensequenzen wurde für die manuelle Zusammenstellung ausgewählt, mit dem Ziel der Fertigstellung (Ersetzen aller N an Gerüstlücken oder lokalen Fehlanordnungen durch die richtigen Nukleotidsequenzen und Zirkularisierung). Die Zusammenstellung folgte im Allgemeinen den zuvor beschriebenen Verfahren (Devoto et al. (2019) oben). Kurz gesagt, die Auslesungen aus dem entsprechenden Datensatz wurden mit Bowtie2 (Langmead und Salzberg (2012) Nat. Methods 9:357-359) zu den de-novo-assemblierten Sequenzen zugeordnet. Nicht platzierte Partnerpaare von zugeordneten Auslesungen wurden mit Shrinksam beibehalten (github.com/bcthomas/shrinksam). Die Zuordnungen wurden durchgehend manuell überprüft, um lokale Fehlanordnungen mit Geneious v9 zu identifizieren. N-gefüllte Lücken oder Korrekturen von Fehlassemblierungen verwendeten nicht platzierte gepaarte Auslesungen, in einigen Fällen unter Verwendung von Auslesungen, die von Stellen verschoben wurden, an denen sie falsch zugeordnet wurden. In solchen Fällen wurden Fehlzuordnungen basierend auf viel größeren als erwarteten gepaarten Auslesungsabständen, hohen Polymorphismusdichten, Rückwärtszuordnung eines Auslesungspaars oder einer beliebigen Kombination der vorstehend genannten identifiziert.
  • In ähnlicher Weise wurden die Enden unter Verwendung von nicht platzierten oder falsch platzierten gepaarten Auslesungen verlängert, bis eine Zirkularisierung hergestellt werden konnte. In einigen Fällen wurden verlängerte Enden verwendet, um neue Gerüste zu rekrutieren, die dann der Assemblierung hinzugefügt wurden. Die Genauigkeit aller Verlängerungen und lokalen Assemblierungsänderungen wurde in einer nachfolgenden Phase der Auslesungszuordnung überprüft. In vielen Fällen wurden Assemblierungen durch das Vorhandensein wiederholter Sequenzen beendet oder intern korrumpiert. In diesen Fällen wurden Blöcke mit wiederholter Sequenz sowie eine einmalige flankierende Sequenz identifiziert. Die Auslesungen wurden dann manuell verschoben, wobei die Regeln für die Platzierung gepaarter Auslesungen und die einmaligen flankierenden Sequenzen eingehalten wurden. Nach dem Schließen der Lücke, der Zirkularisierung und der Überprüfung der Genauigkeit durchgehend wurde die Endüberlappung beseitigt, die Gene wurden vorhergesagt und durchgehend, und der Start wurde in eine intergene Region verschoben, wobei in einigen Fällen vermutet wird, dass er ursprungsbasiert auf einer Kombination von Abdeckungstrends und GC-Versatz ist (Brown et al. (2016) Nat. Biotechnol. 34:1256-1263). Schließlich wurden die Sequenzen überprüft, um alle wiederholten Sequenzen zu identifizieren, die zu einer falschen Pfadwahl hätten führen können, da die wiederholten Regionen größer waren als die Entfernung, die durch gepaarte Auslesungen überspannt wurde. Dieser Schritt schloss auch artefaktuelle lange Phagensequenzen aus, die durch Ende-zu-Ende-Wiederholungen kleinerer Phagen erzeugt wurden, die in zuvor beschriebenen Datensätzen auftreten.
  • Strukturelle und funktionelle Annotation
  • Nach der Identifizierung und Zusammenstellung von Phagengenomen wurden codierende Sequenzen (CDS) mit Prodigal (-m -c -g 11 -p single) mit genetischem Code 11 vorhergesagt. Die resultierenden CDS wurden wie zuvor beschrieben durch Suchen gegen UniProt, UniRef und KEGG annotiert (Wrighton et al. (2014) oben). Funktionelle Annotationen wurden weiter zugeordnet, indem Proteine gegen Pfam r32 gesucht wurden (Finn et al. (2014) Nucleic Acids Res. 42:D222-30), TIGRFAMS r15 (Haft et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41:D387-95) und Virus Orthologous Groups r90 (vogdb.org). tRNA wurden mittRNAscan-SE 2.0 (Lowe und Eddy, (1997) Nucleic Acids Res. 25 :955-964) unter Verwendung des Bakterienmodells identifiziert. tmRNA wurden unter Verwendung von ARAGORN v1.2.38 (Laslett und Canback, (2004) Nucleic Acids Res. 32):11-16) mit dem bakterien-/pflanzengenetischen Code zugewiesen. Die Clusterbildung der Proteinsequenzen in Familien wurde unter Verwendung einer zweistufigen Prozedur erreicht. Ein erstes Proteinclustering wurde mit der schnellen und empfindlichen Proteinsequenz-Suchsoftware MMseqs (Hauser et al. (2016) Bioinformatics 32:1323-1330) durchgeführt. Eine All-vs-All-Sequenzsuche wurde unter Verwendung des E-Werts: 0,001, der Empfindlichkeit: 7,5 und der Abdeckung: 0,5 durchgeführt. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk wurde basierend auf den paarweisen Ähnlichkeiten aufgebaut und der Greedy-Set-Cover-Algorithmus von MMseq wurde durchgeführt, um Protein-Subcluster zu definieren. Die resultierenden Subcluster wurden als Unterfamilien definiert. Um die entfernte Homologie zu testen, wurden Unterfamilien unter Verwendung eines HMM-HMM-Vergleichs in Proteinfamilien gruppiert. Die Proteine jeder Unterfamilie mit mindestens zwei Proteinmitgliedern wurden unter Verwendung des result2msa-Parameters von mmseqs2 ausgerichtet, und aus den Mehrfachsequenz-Alignments wurden HMM-Profile unter Verwendung der HHpred-Suite erstellt. Die Unterfamilien wurden dann unter Verwendung von HHblits (Remmert et al. (2011) Nat. Methods 9:173-175) aus der HHpred-Suite (mit den Parametern -v 0 -p 50 -z 4 -Z 32000 -B 0 -b 0) miteinander verglichen. Für Unterfamilien mit Wahrscheinlichkeitsbewertungen von ≥ 95 % und einer Abdeckung von ≥ 0,50 wurde eine Ähnlichkeitsbewertung (Wahrscheinlichkeit X Abdeckung) als Gewichtung des Eingabenetzwerks in der endgültigen Clusterbildung unter Verwendung des Markov-Clustering-Algorithmus mit 2,0 als Inflationsparameter verwendet. Diese Cluster wurden als Proteinfamilien definiert. Haarnadeln (Palindrome, basierend auf identischen überlappenden Wiederholungen in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung) wurden unter Verwendung des Geneious Repeat Finder identifiziert und mit Vmatch (Kurtz (2003) oben) datensatzweit lokalisiert. Wiederholungen >25 bp mit 100 % Ähnlichkeit wurden tabellarisch aufgeführt.
  • Referenzgenome für Größenvergleiche
  • RefSeq v92-Genome wurden unter Verwendung des NCBI-Virusportals und Auswahl nur vollständiger dsDNA-Genome mit bakteriellen Wirten gewonnen. Genome von (Paez-Espino et al. (2016) oben) wurden von IMG/VR heruntergeladen und nur Sequenzanordnungen, die mit „kreisförmig“ mit vorhergesagten bakteriellen Wirten markiert waren, wurden beibehalten. Viele der Genome waren das Ergebnis fehlerhafter verketteter Wiederholungsanordnungen. Angesichts des Vorhandenseins von Sequenzen in IMG/VR die auf fehlerhaften Verkettungen beruhen, berücksichtigte die Studie nur Sequenzen aus dieser Quelle, die >200 kb sind; eine Untermenge davon wurde als Artefaktsequenzen entfernt.
  • Wirtsvorhersage
  • Die Phylum-Zugehörigkeiten von bakteriellen Wirten für Phagen wurden unter Berücksichtigung der taxonomischen Uniprot-Profile jedes CDS für jedes Phagengenom vorhergesagt. Die Phylum-Level-Übereinstimmungen für jedes Phagengenom wurden summiert und das Phylum mit den meisten Treffern wurde als potenzielles Wirtsphylum angesehen. Es wurden jedoch nur Fälle zugewiesen, in denen dieses Phylum, das dreimal so viele Zählungen aufwies wie das am zweithäufigsten gezählte Phylum, als vorläufiges Phagenwirtsphylum zugeordnet wurde. Phagenwirte wurden weiter zugewiesen und unter Verwendung von CRISPR-Targeting verifiziert. CRISPR-Arrays wurden auf Sequenz-Assemblierungen >1 kbp aus derselben Umgebung, in der jedes Phagengenom rekonstruiert wurde, vorhergesagt. Spacer wurden extrahiert und gegen die Genome von derselben Stelle unter Verwendung von BLASTN-Short (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410) gesucht. Sequenz-Assemblierungen, die Spacer mit einer Übereinstimmung der Länge > 24 bp und ≤ 1 Fehlpaarung oder mindestens 90 % Sequenzidentität mit einem Genom enthalten, wurden als Targets angesehen. Im Fall von Phagen wurde die Übereinstimmung verwendet, um eine Phagen-Wirt-Beziehung abzuleiten. In allen Fällen stimmte das auf taxonomischen Profilen und CRISPR-Targeting basierende vorhergesagte Wirtsphylum vollständig überein. In ähnlicher Weise wurden die Phyla von Wirten auf der Grundlage einer phylogenetischen Analyse von Phagengenen, die auch in Wirtsgenomen gefunden wurden (z. B. an Translations- und Nukleotidreaktionen beteiligt), vorhergesagt. Schlussfolgerungen, die auf berechneten taxonomischen Profilen und phylogenetischen Bäumen basierten, stimmten ebenfalls vollständig überein.
  • Alternative genetische Codes
  • In Fällen, in denen die Genvorhersage unter Verwendung des Standard-Bakteriencodes (Code 11) zu scheinbar ungewöhnlich niedrigen Codierungsdichten führte, wurden mögliche alternative genetische Codes untersucht. Zusätzlich zur Vorhersage mithilfe von Fast and Accurate genetic Code Inference and Logo (FACIL; (Dutilh et al. (2011) Bioinformatics) 27:1929-1933)) wurden Gene mit genau definierten Funktionen (z. B. Polymerase, Nuklease) identifiziert und die Stopcodons, die Gene terminieren, die kürzer als erwartet waren, wurden bestimmt. Die Gene wurden dann unter Verwendung des Glimmer- und Prodigal-Sets neu vorhergesagt, so dass das Codon nicht als Stopp interpretiert wurde. Andere Kombinationen von umfunktionierten Stoppcodons wurden bewertet und Kandidatencodes (z. B. Code 6 mit nur einem Stoppcodon) wurden aufgrund unwahrscheinlicher Genfusionsvorhersagen ausgeschlossen.
  • Introns wurden in einigen länger als erwarteten Pseudo-tRNA identifiziert, indem die tRNA unter Verwendung eukaryotischer Einstellungen neu vorhergesagt wurden (da der tRNA-Scan keine Introns in tRNA-Genen in Bakterien und Phagen erwartet).
  • Phylogenetische Terminase-Analyse
  • Der phylogenetische Baum mit großer Terminase wurde konstruiert, indem große Terminasen aus der vorstehend erwähnten Annotationspipeline gewonnen wurden. CDS, die mit > 30 Bitscore gegen PFAM, TIGRFAMS und VOG übereinstimmten, wurden beibehalten. Alle CDS, die unabhängig vom Bitscore einen Treffer für eine große Terminase hatten, wurden mit HHblits (Steinegger et al. Bioinformatik 21:951-960) gegen die uniclust30_2018_08-Datenbank durchsucht. Die resultierende Alignierung wurde dann weiter mit der PDB70-Datenbank durchsucht. Verbleibende CDS, die in Proteinfamilien mit einem HMM mit großer Terminase geclustert waren, wurden ebenfalls nach manueller Überprüfung eingeschlossen. Nachgewiesene große Terminasen wurden manuell unter Verwendung von HHPred (Steinegger et al. oben) und jPred (Cole et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36:W197-201) überprüft. Große Terminasen aus den Phagengenomen >200 kb (Paez-Espino et al. (2016) oben) alle vollständigen dsDNA-Phagengenome >200 kb aus RefSeq r92 wurden ebenfalls durch Proteinfamilienclustering mit dem Phagen-CDS aus dieser Studie eingeschlossen. Die resultierenden Terminasen wurden bei 95 % Aminosäureidentität (AAI) geclustert, um die Redundanz unter Verwendung von cd-hit zu verringern (Huang et al. (2010) Bioinformatics 26:680-682). Kleinere Phagengenome wurden eingeschlossen, indem das resultierende CDS-Set anhand der Refseq-Proteindatenbank durchsucht und die 10 besten Treffer beibehalten wurden. Diejenigen Treffer, die keine große Terminase-Übereinstimmung mit PFAM, TIGRFAMS oder VOG hatten, wurden aus der weiteren Betrachtung entfernt und der verbleibende Satz wurde zu 90 % AAI geclustert. Der endgültige Satz von CDS mit großer Terminase wurde MAFFT v7.407 (--localpair --maxiterate 1000) aligniert und schlecht alignierte Sequenzen wurden entfernt und der resultierende Satz wurde neu aligniert. Der phylogenetische Baum wurde unter Verwendung von IQTREE v1.6.9 (Nguyen et al. (2015) Mol. Biol. Evol. 32:268-274) abgeleitet.
  • Phagen-codierte tRNA-Synthetase-Bäume
  • Phylogenetische Bäume wurden für Phagen-codierte tRNA-Synthetase-, Ribosomen- und Initiationsfaktor-Proteinsequenzen unter Verwendung eines Satzes des engsten Referenzsatzes von NCBI- und Bakteriengenomen aus der aktuellen Studie konstruiert.
  • CRISPR-Cas-Locus-Nachweis und Wirtsidentifizierung
  • Phagen-codierte CRISPR-Cas-Loci wurden unter Verwendung der gleichen Verfahren identifiziert, die zur Identifizierung von bakteriellen CRISPR-Cas-Loci verwendet wurden; Spacer, die zwischen Wiederholungen des CRISPR-Locus unter Verwendung von MinCED (github.com/ctSkennerton/minced) und CRISPRDetect (Biswas et al., 2016) extrahiert wurden, wurden mit Sequenzen verglichen, die an derselben Stelle rekonstruiert wurden, und mit Targets, die als Bakterien, Phagen oder andere klassifiziert wurden.
  • Da viele Phagenwirte nicht durch CRISPR-Targeting identifiziert werden können (möglicherweise weil sich Phagen in Proben mit empfindlichen Wirten vermehrt hatten oder die Targets ausreichend mutiert sind, um einen Spacer-Nachweis zu vermeiden), wurden zusätzliche Beweislinien verwendet, um Wirtsidentitäten vorzuschlagen. Aufgrund der Unsicherheit bei diesen Verfahren wurden mögliche Phagenvorhersagen nur auf Phylum-Ebene vorgenommen. In dieser Analyse wurde die Fraktion der Gene berechnet, die auf einem Genom mit der besten vorhergesagten Proteinübereinstimmung mit jedem Stamm codiert sind. Nur in Fällen, in denen das am häufigsten vertretene Phylum in der Häufigkeit das nächsthäufigste Phylum um ≥ 3X überschritten hat, wurde ein vorläufiger bakterieller Wirt vorgeschlagen. Dieser Schwellenwert wurde als konservativ verifiziert, basierend auf bestätigten Informationen zum Wirtsstamm aus CRISPR-Targeting oder phylogenetischer Analyse.
  • Datenverfügbarkeit
  • Das ergänzende Dokument „Genbank“ enthält die Dateien im Genbank-Format für die in dieser Studie berichteten Genomsequenzen. Alle Auslesungen werden in dem kurzen Auslesungsarchiv (falls nicht bereits dort abgelegt) und in den Genomsequenzen in NCBI hinterlegt.
  • Beispiel 2
  • Cas12J ist das kleinste bekannte Einzeleffektor-Cas-Protein mit doppelsträngiger DNA (dsDNA)-Targeting-Fähigkeit. Cas12J ist in der Lage, dsDNA zu spalten, ohne dass eine akzessorische RNA (z. B. eine tracrRNA) funktionieren muss. Darüber hinaus unterscheidet sich die RuvC-Domäne, die eine hochkonservierte Domäne in Cas12 und Cas9 ist, in Cas12J stark von bekannten Cas-Proteinen, und die Domänenarchitektur unterscheidet sich zwischen Mitgliedern der Cas12-Protein-Superfamilie.
  • Ergebnisse
  • Um die Funktionalität und DNA-Targeting-Fähigkeit des Cas12J-Effektors in einem heterologen Kontext zu untersuchen, wurde ein Plasmidinterferenzassay mit Effizienz der Transformation (EOT) eingerichtet (11A). Escherichia coli BL21 (DE3), das cas12J exprimiert, und ein crRNA-Guide, das auf den Antisense-Strang des bla-Gens abzielt, oder eine Non-Targeting-Guide wurden mit pUC19 transformiert (11B). Der Assay ergab, dass die pUC19-Transformationseffizienz in Stämmen, die Cas12J und den pUC19-Targeting-Guide produzieren, im Vergleich zu Stämmen, die Cas12J und den Non-Targeting-Guide produzieren, um 2-3 Größenordnungen verringert ist (11C). Dieses Ergebnis weist auf eine robuste und Guide-abhängige doppelsträngige DNA-Interferenzaktivität von Cas12J hin. Um die unverfälschte relative Transformationseffizienz der DNA-Interferenz jedes Stammes zu bewerten, wurde das Plasmid pYTK001 als Kontrolle transformiert (11B). Die Transformationseffizienz zeigte, dass die Stämme für die Transformation eines nicht zielgerichteten Plasmids gleichermaßen kompetent sind (11C).
  • Verfahren
  • Klonierung der Expressionsplasmide
  • Die Gensequenz von cas12J aus contig PO_An_GD2017L_S7_coassembly_k141_3339380 wurde als ein G-Block von IDT bestellt und unter Verwendung der Golden-Gate-Anordnung in pRSFDuet-1 (Novagen) in MCSI kloniert. In der gleichen Reaktion wurde ein T7-Promotor, die jeweilige Konsensus-Wiederholungssequenz aus dem CRISPR-Array, lokalisiert auf contig P0_An_GD2017L_S7_coassembly _k141_3339380, zusammen mit einem 35-bp-Spacer, der für den durch die Golden-Gate-Anordnung vermittelten Spacer-Austausch zugänglich ist, stromabwärts des cas12J-ORF anstelle von MCSII eingebracht. In der gleichen Reaktion wurde ein Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym (HDVrz) stromabwärts des Spacers eingebracht, um die homogene Prozessierung des unreifen crRNA-Transkripts an seinem 3'-Terminus zu ermöglichen. Um den pUC19-Targeting-Cas12J-Vektor zu erzeugen, wurde der Non-Targeting-Spacer durch Golden-Gate-Anordnung gegen eine Sequenz ausgetauscht, die mit den Basenpaaren 11-45 des pUC19-bla-Gens stromabwärts der AGTATTC-Sequenz übereinstimmt, um die Produktion eines Antisense-Strangkomplementären crRNA-Guides zu ermöglichen.
  • Plasmidinterferenzassay
  • Die erzeugten Cas12J-Vektoren (Non-Targeting und pUC19-Targeting) wurden in chemisch kompetentes E. coli BL21 (DE3) (NEB) transformiert. Drei einzelne Kolonien für jeden Stamm (A-, B- und C-Stämme) wurden ausgewählt, um drei Starterkulturen von 5 ml (LB, Kanamycin 50 µg/ml) zu inokulieren, um elektrokompetente Zellen am folgenden Tag herzustellen. Hauptkulturen von 50 ml (LB, Kanamycin 50 µg/ml) wurden 1:100 inokuliert und unter kräftigem Schütteln bei 37 °C bis zu einem OD600 von 0,3 wachsen gelassen. Anschließend wurden die Kulturen auf Raumtemperatur abgekühlt und die cas12J-Expression wurde mit 0,2 mM IPTG induziert. Die Kulturen wurden für 1 h bei 25 °C bis zu einem OD600 von 0,6-0,7 wachsen gelassen, bevor elektrokompetente Zellen durch wiederholtes Waschen mit eiskaltem ddH2O und 10 %-igem Glycerin hergestellt wurden. Die Zellen wurden in 250 µl 10 %-iges Glycerin resuspendiert. Aliquote von 90 µl wurden in flüssigem Stickstoff blitzgefroren und bei -80 °C gelagert. Am nächsten Tag wurden 80 µl kompetente Zellen mit 3,2 µl Plasmid (20 ng/µl pUC19-Target-Plasmid oder 20 ng/µl pYTK001-Kontrollplasmid) kombiniert, für 30 min auf Eis inkubiert und in drei einzelne Transformationsreaktionen von 25 µl aufgeteilt. Nach der Elektroporation in 0,1-mm-Elektroporationsküvetten (Bio-Rad) auf einem Micropulser-Elektroporator (Bio-Rad) wurden die Zellen in 1 ml Wiederherstellungsmedium (Lucigen), ergänzt mit 0,2 mM IPTG, gewonnen und für eine Stunde bei 37 °C geschüttelt. Anschließend wurden 10-fache Verdünnungsreihen hergestellt und 5 µl der jeweiligen Verdünnungsschritte wurden auf LB-Agar, der die geeigneten Antibiotika enthielt, punktiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert und die Kolonien wurden am folgenden Tag gezählt, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Zur Beurteilung der Transformationseffizienz wurden der Mittelwert und die Standardabweichung aus den zellbildenden Einheiten pro ng transformierten Plasmiden für die Elektroporations-Triplikate berechnet.
  • 11A-1 1C zeigen die Effizienz des Transformationsplasmidinterferenzassays. 11A oberes Feld: Versuchsschema. E. coli, die Cas12J produzieren, werden mit einem Target-Plasmid (pUC19) transformiert. Unteres Feld: Vektorkarte des Effektor-Expressionsplasmids. 11B, Reihenverdünnungen von E. coli, die Cas12J und entweder pUC19-Targeting- oder Non-Targeting-Guides produzieren, transformiert mit pUC19 (links) oder pYTK001 (rechts). 11C, berechnete Transformationseffizienzen in zellbildenden Einheiten (cell forming units - CFU) pro ng transformiertem Plasmid. Mittelwert und +/- SD-Werte (Fehlerbalken) wurden aus Triplikaten abgeleitet.
  • Beispiel 3
  • Ergebnisse
  • Um zu zeigen, dass Cas12J dsDNA schneidet, wurden In-vitro-Experimente außerhalb von Zellen (d. h. in einem nichtzellulären Kontext) durchgeführt. Lineare dsDNA wurde bei Vorhandensein von Cas12J und einer Guide-RNA, die zur Hybridisierung mit einer Target-Sequenz neben einem PAM-Motiv entwickelt wurde, gespalten. Der Cas12J-Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex wurde entweder innerhalb von Zellen (in diesem Fall E. coli durch die Einbringung von Plasmid-DNA, die das Protein und die Guide-RNA codiert) assembliert oder in vitro außerhalb von Zellen aus Apo-Protein und synthetischen RNA-Oligonukleotiden assembliert. Das Experiment ergab, dass RNP mit Cas12J-1947455 („Ortholog #1“), Cas12J-2071242 („Ortholog #2“) oder Cas12J-3339380 („Ortholog #3“), die entweder innerhalb oder außerhalb von Zellen assembliert wurden, lineare dsDNA-Fragmente spalteten, die von der crRNA-Spacer-Sequenz der Guide-RNA geleitet werden (12A und 12B). Das lineare DNA-Substrat von 1,9 kb wurde in Fragmente von 1,2 kb und 0,7 kb gespalten, was auf ein endonukleolytisches DNA-Doppelstrangspaltungsereignis nahe der Stelle der Guide-Komplementarität hinweist. Bei Nichtvorhandensein einer komplementären Guide-Stelle auf der DNA wurde keine dsDNA-Spaltung beobachtet. Dieses Experiment zeigte, dass Cas12J (z. B. Cas12J-1947455, Cas12J-2071242 und Cas12J-3339380) eine crRNA-geleitete DNA-Endonuklease ist, die Doppelstrangbrüche in die DNA einbringen kann. Darüber hinaus zeigte das Experiment, dass funktionelle Cas12J-RNP innerhalb und/oder außerhalb von Zellen assembliert werden können.
  • 12A-12B zeigen, dass Cas12J (z. B. Cas12J-1947455, Cas12J-2071242 und Cas12J-3339380) lineare dsDNA-Fragmente, die von einer crRNA-Spacersequenz geleitet werden, spalten. 12A, zeitabhängige dsDNA-Spaltungsassays für die RNP, die innerhalb von Zellen assembliert wurden. Oben: Cas12J-1947455 (Cas12J-1), Mitte: Cas12J-2071242 (Cas12J-2) und unten: Cas12J-3339380 (Cas12J-3). Die Spuren ganz rechts sind nicht komplementäre DNA-Kontrollen, die vom jeweiligen crRNA-Guide nicht identifiziert werden konnten. 12B, zeitabhängige dsDNA-Spaltungsassays für die RNP, die in vitro außerhalb von Zellen assembliert wurden. Oben: Cas12J-1947455 (Cas12J-1), Mitte: Cas12J-2071242 (Cas12J-2) und unten: Cas12J-3339380 (Cas12J-3). Die Spuren ganz rechts sind nicht komplementäre DNA-Kontrollen, die vom jeweiligen crRNA-Guide nicht identifiziert werden konnten.
  • PAM-Depletion-Assays wurden in Escherichia coli durchgeführt. In dem Assay zielt Cas12J auf eine DNA-Sequenz ab, die an eine randomisierte Sequenz in einer Plasmidbibliothek angrenzt. Die NGS-Sequenzierung ergab, dass Cas12J und crRNA in Bakterien ausreichend waren, um Plasmide mit komplementären Target-DNA-Stellen des crRNA-Guides abzubauen, wenn eine T-reiche PAM-Sequenz neben dem Protospacer lag (13). Das Experiment zeigte auch, dass keine tracrRNA für die Bildung von funktionellen Effektoren erforderlich war. Bemerkenswerterweise weist Ortholog #2 eine minimale 5'-TBN-3'-PAM-Sequenz auf.
  • 13. PAM-Sequenzen, die durch die drei verschiedenen Orthologen abgereichert sind, zeigen, dass PAM für jedes gewünschte Cas12J-Protein leicht zu identifizieren sind.
  • Verfahren
  • Klonierung der Expressionskonstrukte
  • Die Gensequenzen von Cas12J-1947455, Cas12J-2071242 und Cas12J-3339380 wurden als G-Blöcke von IDT bestellt und in pRSFDuet-1 (Novagen) in MCSI C, das unter Verwendung der Golden Gate-Assemblierung an Hexa-Histidin-Tags terminal kondensiert war, kloniert. Zur Coexpression von cas12J mit crRNA-Guides wurden CRISPR-Arrays (36 bp Wiederholung, gefolgt von einem 35-bp-Spacer, sechs Einheiten davon) unter der Kontrolle eines T7-Promotors in Vektoren mit hoher Kopie (ColE1-Ursprung), die bla-Gene zur Selektion enthielten, kloniert.
  • Herstellung des Cas12J-RNP in vivo und Reinigung
  • Die erzeugten cas12J-Überexpressionsvektoren und CRISPR-Array-Expressionsvektoren wurden in E. coli BLR (DE3) (Novagen) co-transformiert und über Nacht bei 37 °C auf LB-Kan-Carb-Agarplatten (50 µg/ml Kanamycin, 50 µg/ml Carbenicillin) inkubiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt, um 80 ml (LB, Carbenicillin 50 µg/ml und Kanamycin 50 µg/ml) Starterkulturen, die bei 37 °C inkubiert wurden und über Nacht kräftig geschüttelt wurden, zu inokulieren. Am nächsten Tag wurden 1,5 1 TB-Kan-Carb-Medium (Carbenicillin 50 µg/ml und Kanamycin 50 µg/ml) mit der jeweiligen 40-ml-Starterkultur inokuliert und bei 37 °C auf ein OD600 von 0,6 wachsen gelassen, 15 min auf Eis abgekühlt und anschließend wurde die Genexpression mit 0,5 mMIPTG induziert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 16 °C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in Waschpuffer (50 mM HEPES-Na (pH 7,5), 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 5 %-igem Glycerin und 0,5 mM TCEP) resuspendiert, anschließend durch Ultraschallbehandlung lysiert, gefolgt von Lysatklärung durch Zentrifugation. Die lösliche Fraktion wurde auf eine 5-ml-Ni-NTA-Superflow-Kartusche (Qiagen) geladen, die in Waschpuffer voräquilibriert war. Gebundene Proteine wurden mit 20 Säulenvolumina (CV) Waschpuffer gewaschen und anschließend in 3 CV Elutionspuffer (50 mM HEPES-Na (pH 7,5), 500 mMNaCl, 500 mM Imidazol, 5 %-igem Glycerin und 0,5 mM TCEP) eluiert. Eluierte Proteine wurden über Nacht bei 4 °C in slide-a-lyzer-Dialysekassetten mit 10k mwco (Thermo Fisher Scientific) gegen Ionenaustausch (IEX)-Ladepuffer (20 mM Tris, pH 9,0, 4 °C, 125 mM NaCl, 5 %-iges Glycerin und 0,5 mM TCEP) dialysiert. Die Proteine wurden auf 2 × 5 ml HiTrap Q HP-Anionenaustauschchromatographiesäulen geladen. Die Proteine wurden in einem Gradienten von IEX-Elutionspuffer (20 mM Tris, pH 9,0, 4 ° C, 1 M NaCl, 5 %-iges Glycerin und 0,5 mM TCEP) eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden durch SDS-PAGE und Urea-PAGE analysiert und die durch Cas12J und crRNA gebildetes RNP enthaltende Fraktion wurde auf 1 ml konzentriert. Schließlich wurden Proteine in eine HiLoad 16/600 Superdex 200pg-Säule, voräquilibriert in Größenausschlusspuffer (10 mM HEPES-Na (pH 7,5), 150 mM NaCl und 0,5 mM TCEP) injiziert. Die Peak-Fraktionen wurden auf eine Absorption bei 280 nm von 60 AU (NanoDrop 8000 Spectrophotometer, Thermo Scientific) konzentriert, was einer geschätzten Konzentration von 500 µM entspricht.
  • Anschließend wurden Proteine in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und bei -80 °C gelagert.
  • Herstellung und Reinigung von apo-Cas12J
  • Die erzeugten cas12J-Überexpressionsvektoren wurden in chemisch geeignetem E. coli BL21(DE3) (NEB) transformiert und über Nacht bei 37 °C auf LB-Kan-Agarplatten (50 µg/ml Kanamycin) inkubiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt, um 80 ml (LB, Kanamycin 50 µg/ml) Starterkulturen, die bei 37 °C inkubiert wurden und über Nacht kräftig geschüttelt wurden, zu inokulieren. Am nächsten Tag wurden 1,5 1 TB-Kan-Medium (Kanamycin 50 µg/ml) mit der jeweiligen 40-ml-Starterkultur inokuliert und bei 37 °C auf ein OD600 von 0,6 wachsen gelassen, 15 min auf Eis abgekühlt und anschließend wurde die Genexpression mit 0,5 mM IPTG induziert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 16 °C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in Waschpuffer (50 mM HEPES-Na (pH 7,5), 1 M NaCl, 20 mM Imidazol, 5 %-igem Glycerin und 0,5 mM TCEP) resuspendiert, anschließend durch Ultraschallbehandlung lysiert, gefolgt von Lysatklärung durch Zentrifugation. Die lösliche Fraktion wurde auf eine 5-ml-Ni-NTA-Superflow-Kartusche (Qiagen) geladen, die in Waschpuffer voräquilibriert war. Gebundene Proteine wurden mit 20 Säulenvolumina (CV) Waschpuffer gewaschen und anschließend in 5 CV Elutionspuffer (50 mM HEPES-Na (pH 7,5), 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 5 %-igem Glycerin und 0,5 mM TCEP) eluiert. Die eluierten Proteine wurden vor der Injektion in eine HiLoad 16/600 Superdex 200pg-Säule, voräquilibriert in Größenausschlusspuffer (20 mM HEPES-Na (pH 7,5), 500 mM NaCl, 5 %-iges Glycerin und 0,5 mM TCEP) auf 1 ml konzentriert. Die Peak-Fraktionen wurden auf eine Absorption bei 280 nm von 40 AU (NanoDrop 8000 Spectrophotometer, Thermo Scientific) konzentriert, was einer geschätzten Konzentration von 500 µM entspricht. Anschließend wurden Proteine in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und bei -80 °C gelagert.
  • Cas 12J-crRNA-RNP-Rekonstitution
  • Cas12J-crRNA-RNP-Komplexe wurden in einer Konzentration von 1,25 µM durch Mischen von Protein und synthetischer crRNA (IDT) in einem Molverhältnis von 1:1 in Rekonstitutionspuffer (10 mM Hepes-K, pH 7,5, 150 mM KCI, 5 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP) assembliert und Inkubation erfolgte bei 20 °C für 30 Minuten. Die synthetische crRNA wurde vor der Assemblierungsreaktion 3 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und dann zur ordnungsgemäßen Faltung auf RT abgekühlt.
  • DNA-Spaltungsassay
  • DNA-Target-Substrate wurden durch PCR aus Plasmid-Template-DNA erzeugt. Spaltungsreaktionen wurden durch Zugabe von DNA (10 nM) zu vorgeformtem RNP (1 µM) in Reaktionspuffer (10 mM Hepes-K, pH 7,5, 150 mM KCI, 5 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP) initiiert. Die Reaktionen wurden bei 37 °C inkubiert und Aliquote wurden in den angegebenen Intervallen entnommen, mit 50 mM EDTA gequencht und in flüssigem Stickstoff gelagert. Nach Beendigung der Zeitreihen wurden die Proben aufgetaut und 20 Minuten bei 37 °C mit 0,8 Einheiten Proteinase K (NEB) behandelt. Ladefarbstoff wurde zugegeben (Gel Loading Dye Purple 6X, NEB) und die Proben wurden durch Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarosegel analysiert.
  • Verwendete Sequenzen
  • crRNA-Guide:
    • >crRNA-1 (Guide-Sequence/Targeting-Sequence fett)
     CACAGGAGAGAUCUCAAACGAUUGCUCGAUUAGUCGAGACAGCUGGUAAU
 GGGAUACCUU (SEQ ID NO: 99)
    • >crRNA-2 (Guide-Sequence/Targeting-Sequence fett)
     UAAUGUCGGAACGCUCAACGAUUGCCCCUCACGAGGGGACUGCCGCCUCC
 GCGACGCCCA (SEQ ID NO: 100)
    • >crRNA-3 (Guide-Sequence/Targeting-Sequence fett)
     AUUAACCAAAACGACUAUUGAUUGCCCAGUACGCUGGGACUAUGAGCUUA
 UGUACAUCAA (SEQ ID NO: 101)
  • DNA-Targets (PAM-Motive sind unterstrichen. Komplementäre Sequenzen des crRNA-Spacers sind fett):
  • >Linear pTarget1:
    Figure DE212020000516U1_0001
    Figure DE212020000516U1_0002
  • >Linear pTarget2:
    Figure DE212020000516U1_0003
    Figure DE212020000516U1_0004
  • >Linear pTarget3:
    Figure DE212020000516U1_0005
    Figure DE212020000516U1_0006
  • Beispiel 4
  • Ergebnisse
  • Die transkriptomische Kartierung legte nahe, dass crRNA in E. coli-Zellen heterolog exprimiert und so prozessiert wurde, dass sie eine Wiederholung mit 25 Nukleotiden und einen Spacer mit 14 bis 20 Nukleotiden enthält. Die Daten legen auch nahe, dass Cas12J wahrscheinlich seine eigene crRNA prozessiert (siehe 14A-14C).
  • 14A-14C veranschaulichen Ergebnisse aus dem Mapping von RNA-Sequenzen auf den Cas12J-CRISPR-Locus von pBAS::Cas12J-1947455 (14A), pBAS::Cas12J-2071242 (14B) und pBAS::Cas12J-3339380 (14C). Die Einfügung zeigt eine detaillierte Ansicht der Transkriptomzuordnung zur ersten Wiederholungs-Spacer-Wiederholungs-Iteration in jedem Locus. Schwarze Rauten bezeichnen Wiederholungen; farbige Quadrate bezeichnen Spacer; ausgeblasste Wiederholungen und Spacer bezeichnen das degenerierte Ende des Arrays.
  • Verfahren
  • RNA-seq
  • pBAS::Cas12J-1947455-, pBAS::Cas12J-2071242- und pBAS::Cas12J-3339380-Konstrukte wurden in chemisch kompetentes E. coli DH5α (QB3-Macrolab, UC Berkeley) transformiert und über Nacht bei 37 °C auf LB-Cm-Agarplatten (34 µg/ml Chloramphenicol) inkubiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt, um 5 ml (LB, 34 µg/ml Chloramphenicol) Starterkulturen, die bei 37 °C inkubiert wurden und über Nacht kräftig geschüttelt wurden, zu inokulieren. Am nächsten Morgen wurden die Hauptkulturen 1:100 geimpft (LB, 34 µg/ml Chloramphenicol) und Locus-Expression wurden mit 200 nM aTc für 24 h bei 16 °C induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Lysepuffer (20 mM Hepes-Na, pH 7,5, 200 mM NaCl) resuspendiert und unter Verwendung von Glasperlen (0,1-mm-Glasperlen, 4 × 30 s Wirbel bei 4 °C, im Abstand von 30 s Abkühlen auf Eis) lysiert. 200 µl Zelllyseüberstand wurden zur RNA-Extraktion gemäß dem Herstellerprotokoll (Ambion) in Trizol überführt. 10 µg RNA wurden mit 20 Einheiten T4-PNK (NEB) für 6 Stunden bei 37 °C zur Dephosphorylierung behandelt. Anschließend wurde 1 mM ATP zugegeben und die Probe wurde für 1 h bei 37 °C für 5'-Phosphorylierung vor der Wärmeinaktivierung bei 65 °C und anschließender Trizol-Reinigung inkubiert.
  • Als nächstes wurden cDNA-Bibliotheken unter Verwendung des RealSeq-AC miRNA-Bibliothekskit-Illumina-Sequenzierung (Somagenics) hergestellt. cDNA-Bibliotheken wurden einer Illumina MiSeq-Sequenzierung unterzogen, wobei Einzelauslesungen mit einer Länge von 50 Nukleotiden erzeugt wurden. Rohe Sequenzierungsdaten wurden verarbeitet, um Adapter und Sequenzierungsartefakte zu entfernen, und es wurden qualitativ hochwertige Auslesevorgänge beibehalten. Die resultierenden Auslesungen wurden auf ihre jeweiligen Plasmide abgebildet, um die CRISPR-Locus-Expression und die crRNA-Prozessierung zu bestimmen.
  • Beispiel 5
  • Ergebnisse
  • Die in 15 bereitgestellten Daten zeigen, dass Cas12J eine gezielte GFP-Störung induzieren kann, was auf eine erfolgreiche nicht-homologe Endverbindung (Non-Homologous End Joining - NHEJ) und eine gezielte genomische Bearbeitung in menschlichen Zellen hinweist. In einem Fall war eine einzelne Cas12J/Guide-RNA in der Lage, bis zu 33 % der Zellen zu editieren (Cas12J-2 Guide 2), vergleichbar mit Werten, die für CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a und CRISPR-CasX berichtet wurden (Cong et al. (2013) Science 339:819; Jinek et al. (2013) eLife 2:e00471; Mali et al. (2013) Science 339:823; und Liu et al. (2019) Nature 566:7743).
  • Verfahren
  • Klonierung von Cas12J-Effektorplasmiden zur Expression in menschlichen Zellen
  • Die Gensequenzen von cas12J-2 und cas12J-3 wurden als G-Blöcke von Integrated DNA Technologies (IDT) bestellt, die codonoptimierte Gene für die Expression in menschlichen Zellen codieren. G-Blöcke wurden über die Golden Gate-Assemblierung in das Vektorgerüst von pBLO62.5 kloniert, stromabwärts über eine GSG-Linker-Codierungssequenz (16A-16B, die Konstruktkarten bereitstellte; und Tabelle 1 (in 17A-17G), die Nukleotidsequenzen der Konstrukte bereitgestellt) an zwei SV40-NLS kondensiert. Die Guide-Codierungssequenz von pBLO62.5 wurde gegen eine einzelne CRISPR-Wiederholung des jeweiligen Homologen ausgetauscht, gefolgt von einer 20-bp-Stuffer-Spacer-Sequenz, die für den Golden Gate-Austausch unter Verwendung des Restriktionsenzyms SapI zugänglich ist (16A-16B; und Tabelle 1 (bereitgestellt in 17A-17G)). Um EGFP-Targeting-Konstrukte zu erzeugen, wurde der Stuffer über die Golden Gate-Assemblierung ausgetauscht, um den Guide für die ausgewählte Target-Stelle zu codieren (Tabelle 2). Tabelle 2 Guide-Sequenzen
    Guide # Spacer-Sequenz 5'->3'
    NT CGTGATGGTCTCGATTGAGT (SEQ ID NO: 105)
    1 ACCGGGGTGGTGCCCATCCT (SEQ ID NO: 106)
    2 ATCTGCACCACCGGCAAGCT (SEQ ID NO: 107)
    3 GAGGGCGACACCCTGGTGAA (SEQ ID NO: 108)
  • Auf menschliche Zellen ausgerichtete GFP-Störung
  • Die GFP HEK293-Reporterzellen wurden zuvor wie zuvor beschrieben durch lentivirale Integration erzeugt. Antony et al. (2018) Mol. Cell. Pediatrics 5:9. Die Zellen wurden routinemäßig unter Verwendung des MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza) gemäß dem Protokoll des Herstellers auf Mycoplasma getestet. GFP HEK293-Reporterzellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und am nächsten Tag mit Lipofectamin 3000 (Life Technologies) und 200 ng Plasmid-DNA, die für die Cas12J-gRNA- und Cas12J-P2A-Puromycin-Fusion codiert, transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden erfolgreich transfizierte Zellen durch Zugabe von 1,5 µg/ml Puromycin auf das Zellkulturmedium für 72 Stunden ausgewählt. Die Zellen wurden passagiert, um subkonfluente Bedingungen aufrechtzuerhalten, und dann auf einem Attune NxT-Durchflusszytometer mit einem Autosampler analysiert. Die Zellen wurden nach 7 Tagen auf dem Durchflusszytometer analysiert, um die Clearance von GFP aus den Zellen zu ermöglichen.
  • Beispiel 6
  • Ergebnisse
  • Um zu testen, ob Cas12J eine unspezifische trans-Spaltungsaktivität aufweist, wurde ein In-vitro-Spaltungsassay eingerichtet, sobald es durch cis-gerichtete Nukleinsäuren aktiviert wurde. In dem Assay wurden die Cas12J-RNPs und die trans-Spaltungs-ssDNA- oder ssRNA-Substrate in Gegenwart von keinem cis-Aktivator, ssDNA-cis-Aktivator, dsDNA-cis-Aktivator oder ssRNA-cis-Aktivator inkubiert.
  • Wie in 18 gezeigt, spalten die drei getesteten Cas12J-Homologen effizient ssDNA, jedoch nicht ssRNA, wenn eine aktivierende DNA, jedoch keine RNA, in der Reaktion vorhanden ist. Dieser Assay zeigt, dass Cas12J durch Spacer-komplementäre ssDNA oder dsDNA aktiviert werden kann, um auf ssDNA in trans abzuzielen. Darüber hinaus kann diese DNA-aktivierte ssDNA-trans-Spaltungsaktivität zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung eines Fluorophor-Quencher-markierten Reporter-Assays verwendet werden (East-Seletsky et al., Nature 538, 270-273 (2016)).
  • Verfahren
  • ssDNA- und ssRNA-Substrate für trans-Spaltung wurden als nicht-komplementär für den Spacer der Cas12J-Guide-RNA entwickelt. Die Substrate wurden unter Verwendung von T4-PNK (NEB) bei Vorhandensein von 32P-γ-ATP am 5'-Ende markiert. Aktive Cas12J-RNP-Komplexe wurden durch Verdünnen des Cas12J-Proteins und der Guide-crRNA auf 4 µM in komplexem Assemblierungspuffer (20 mM HEPES-Na, pH 7,5 RT, 300 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 %-iges Glycerin, 1 mM TCEP) und Inkubation für 30 min bei RT assembliert. Komplementäre Spacer-Aktivatorsubstrate wurden in Oligonukleotid-Hybridisierungspuffer (10 mM Tris, pH 7,8 RT, 150 mM KC1) auf eine Konzentration von 4 µM verdünnt, für 5 min auf 95 °C erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt, um Duplexbildung für doppelsträngige Aktivatorsubstrate zu ermöglichen. Spaltungsreaktionen wurden durch Kombinieren von 200 nM RNP mit 400 nM Aktivatorsubstrat und Inkubation für 10 min bei RT vor Zugabe von 2 nM ssDNA- oder ssRNA-trans-Spaltungssubstraten aufgebaut. Die Reaktionen wurden in Reaktionspuffer (10 mM HEPES-Na, pH 7,5 RT, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 %-iges Glycerin, 0,5 mM TCEP) durchgeführt und für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von zwei Volumina Formamid-Ladepuffer (96 % Formamid, 100 µg/ml Bromphenolblau, 50 µg/ml Xylolcyanol, 10 mM EDTA, 50 µg/ml Heparin) gestoppt, für 5 min auf 95 °C erhitzt und vor der Trennung auf einer 12,5-%igen denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) auf Eis abgekühlt. Die Gele wurden für 4 h bei 80 °C getrocknet, bevor die Phosphorbildgebung unter Verwendung eines Amersham Typhoon-Scanners (GE Healthcare) sichtbar gemacht wurde.
  • Beispiel 7
  • Materialien und Verfahren
  • Metagenomische Assemblies, Genomkuration und CRISPR-CasΦ (CRISPR-Cas12J)-Nachweis
  • Metagenomische Sequenzierungsdaten wurden unter Verwendung zuvor beschriebener Verfahren (Peng et al. Bioinformatics. 28, 1420-1428 (2012); und Nurk et al. Genome Res. 27, 824-834 (2017) assembliert. Codierungssequenzen (CDS) wurden aus Sequenzanordnungen unter Verwendung von verlorenen Genen mit genetischem Code 11 (-m-g 11 -p single) und (-m-g 11 -p meta) vorhergesagt und vorläufige Annotationen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt, indem gegen UniProt, UniRef100 und KEGG gesucht wurde (Wrighton et al. ISME J. 8, 1452-1463 (2014)). Die Phagengenomkuration wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurde Bowtie2 v2.3.4.1 (Langmead und Salzberg Nat. Methods. 9, 357-359 (2012)) verwendet, um Lesevorgänge auf die de novo assemblierte Sequenzen abzubilden, und nicht platzierte Partnerpaare von abgebildeten Lesevorgängen wurden mit Shrinksam beibehalten (github.com/bcthomas/shrinksam). N-gefüllte Lücken und lokale Fehlanordnungen wurden identifiziert und korrigiert, und nicht platzierte oder falsch platzierte gepaarte Auslesungen ermöglichten die Erweiterung der Contig-Enden. Lokale Baugruppenänderungen und -erweiterungen wurden mit weiterer Auslesungszuordnung überprüft. Eine Datenbank mit CasΦ-Sequenzen wurde mit MAFFT v7.407 (Katoh und Standley Mol. Biol. Evol. 30, 772-780 (2013)) und hmmbuild erstellt. CDS von neuen Assemblies wurden mit hmmsearch mit e-Wert <1 × 10-5 gegen die HMM-Datenbank durchsucht und nach Überprüfung zur Datenbank hinzugefügt.
  • Phylogenetische Analyse von Typ-V-Systemen
  • Cas-Proteinsequenzen wurden wie vorstehend beschrieben gesammelt und Vertreter der TnpB-Superfamilie wurden von Makarova et al. (Nat. Rev. Microbiol., 1-17 (2019)) gesammelt und waren Top-BLAST-Treffern von RefSeq. Der resultierende Satz wurde bei 90 % Aminosäureidentität unter Verwendung von CD-HIT geclustert, um die Redundanz zu verringern (Huang et al. Bioinformatics. 26, 680-682 (2010)). Eine neue Ausrichtung von CasΦ mit dem resultierenden Sequenzsatz wurde unter Verwendung von MAFFT LINSI mit 1000 Iterationen erzeugt und gefiltert, um Spalten, die aus Lücken bestehen, in 95 % der Sequenzen zu entfernen. Schlecht ausgerichtete Sequenzen wurden entfernt und der resultierende Satz wurde neu ausgerichtet. Der phylogenetische Baum wurde unter Verwendung von IQTREE v1.6.6 unter Verwendung der automatischen Modellauswahl (Nguyen et al. Mol. Biol. Evol. 32, 268-274 (2015)) und 1000 Bootstraps abgeleitet.
  • crRNA-Sequenzanalyse
  • CRISPR-RNA (crRNA)-Wiederholungen von Phagen-codierten CRISPR-Loci wurden unter Verwendung von MinCED (github.com/ctSkennerton/minced) und CRISPRDetect identifiziert (Biswas et al. BMC Genomics. 17, 356 (2016)). Die Wiederholungen wurden verglichen, indem paarweise Ähnlichkeitsbewertungen unter Verwendung des Needleman-Wunsch-Algorithmus erzeugt wurden, gefolgt von EMBOSS Needle (McWilliam et al. Nucleic Acids Res. 41, W597-600 (2013)). Eine Heatmap wurde unter Verwendung der Ähnlichkeitsbewertungsmatrix erstellt und durch hierarchisches Clustering wurden Dendrogramme erstellt, die der Heatmap überlagert wurden, um verschiedene Cluster von Wiederholungen abzugrenzen.
  • Erzeugung von Plasmiden
  • CasΦ-Loci, einschließlich eines zusätzlichen E. coli-RBS stromaufwärts von casΦ wurden als G-Blöcke von Integrated DNA Technologies (IDT) bestellt und unter Verwendung der Golden Gate-Anordnung (GG) unter der Kontrolle eines Tetracyclininduzierbaren Promotors für RNA seq und PAM-Depletionsplasmidinterferenzexperimente kloniert. Perfekte Wiederholung-Spacer-Einheiten der durch Metagenomik identifizierten CRISPR-Arrays wurden zu einer einzigen Wiederholung-Spacer-Wiederholung-Einheit reduziert, die durch GG-Assemblierung (Aarl-Restriktionsstellen) einem Stuffer-Spacer-Austausch zugänglich ist. Anschließend wurden CasΦ-Gensequenzen durch GG-Assemblierung in pRSFDuet-1 (Novagen) innerhalb von MCSI ohne Tags für die Effizienz von Transformationsplasmid-Interferenz-Assays subkloniert oder zur Proteinreinigung an ein C-terminales Hexa-Histidin-Tag kondensiert. Für Plasmidinterferenz-Assays wurden Mini-CRISPR-Arrays (Wiederholung-Spacer-Wiederholung oder Wiederholung-Spacer-HDV-Ribozym), die durch GG-Assemblierung (Aarl-Restriktionsstellen) für einen Stuffer-Spacer-Austausch geeignet sind, in MCS II von pRSFDuet kloniert. Für Genomeditierungsexperimente in menschlichen Zellen wurden casΦ-Gene als G-Blöcke aus IDT, die codonoptimierte Gene für die Expression in menschlichen Zellen codieren, bestellt. G-Blöcke wurden über GG-Assemblierung in das Vektorgerüst von pBLO62.5 kloniert und stromabwärts über eine GSG-Linker-Codierungssequenz an zwei SV40-NLS kondensiert. Die Guide-Codierungssequenz von pBLO62.5 wurde gegen eine einzelne CRISPR-Wiederholung des jeweiligen Homologen ausgetauscht, gefolgt von einer 20-bp-Stuffer-Spacer-Sequenz, die für den GG-Assembly-Austausch unter Verwendung des Restriktionsenzyms SapI zugänglich ist. Eine Liste von Plasmiden und eine kurze Beschreibung sind in 34 (unter Angabe von Tabelle 3) gegeben. Plasmidsequenzen und Karten werden auf Addgen zur Verfügung gestellt. Um die Cas<D-Vektoren neu zu programmieren, um auf verschiedene Loci abzuzielen, wurden Stuffer-Spacer über GG-Assemblierung ausgetauscht, um das Guide für die ausgewählte Target-Stelle zu codieren (Guide-Spacer-Sequenzen sind in 35 (Bereitstellung von Tabelle 4) aufgeführt). Mutationen in den casΦ-Genen wurden durch GG-Assemblierung eingebracht, um dcasΦ-Gene zu erzeugen.
  • PAM-Depletion-DNA-Interferenz-Assay
  • PAM-Depletion-Assays wurden sowohl mit CasΦ-Plasmiden durchgeführt, die entweder den gesamten CasΦ-Locus trugen, wie von Metagenomics abgeleitet (pPP049, pPP056 und pPP062), als auch mit Plasmiden, die nur das casΦ-Gen und ein Mini-CRISPR (pPP097, pPP102 und pPP107) enthielten. Die Assays wurden als drei einzelne biologische Replikate durchgeführt. Plasmide, die casΦ- und Mini-CRISPR enthielten, wurden in E. coli BL21 (DE3) (NEB) transformiert, und Konstrukte, die CasΦ-Genome enthielten, wurden in E. coli DH5α (QB3-Macrolab, UC Berkeley) transformiert. Anschließend wurden elektrokompetente Zellen durch eiskaltes H2O und Waschen mit 10 %-igem Glycerin hergestellt. Eine Plasmidbibliothek wurde mit 8 randomisierten Nukleotiden am stromaufwärtigen (5' -) Ende der Target-Sequenz konstruiert. Kompetente Zellen wurden dreifach durch Elektroporation mit 200 ng Bibliotheksplasmiden (0,1 mm Elektroporationsküvetten (Bio-Rad) auf einem Micropulser-Elektroporator (Bio-Rad)) transformiert. Nach einer zweistündigen Erholungsperiode wurden die Zellen auf selektiven Medien ausplattiert und koloniebildende Einheiten bestimmt, um eine angemessene Abdeckung aller möglichen Kombinationen der randomisierten 5'-PAM-Region sicherzustellen. Die Stämme wurden 48 Stunden bei 25 °C auf Medien gezüchtet, die geeignete Antibiotika (entweder 100 µg/ml Carbenicillin und 34 µg/ml Chloramphenicol oder 100 µg/ml Carbenicillin und 50 µg/ml Kanamycin) und 0,05 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) oder 200 nM Anhydrotetracyclin (aTc) abhängig vom Vektor enthielten, um die Vermehrung von Plasmiden und die CasΦ-Effektorproduktion sicherzustellen. Anschließend wurden vermehrte Plasmide unter Verwendung eines QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) isoliert.
  • PAM-Depletionssequenzierungsanalyse
  • Die Amplikonsequenzierung des Target-Plasmids wurde verwendet, um PAM-Motive zu identifizieren, die bevorzugt abgereichert sind. Sequenzierungsablesungen wurden auf die jeweiligen Plasmide abgebildet und PAM-randomisierte Regionen wurden extrahiert. Die Häufigkeit jeder möglichen 8-Nukleotid-Kombination wurde aus den ausgerichteten Ablesungen gezählt und auf die Gesamtablesungen für jede Probe normalisiert. Angereicherte PAM wurden durch Berechnen des logarithmischen Verhältnisses im Vergleich zur Häufigkeit in den Kontrollplasmiden berechnet und zur Herstellung von Sequenzlogos verwendet.
  • RNA-Präparation für RNAseq
  • Plasmide, die CasΦ-Loci enthielten, wurden in chemisch kompetentes E. coli DH5α (QB3-Macrolab, UC Berkeley) transformiert. Präparationen wurden als drei einzelne biologische Replikate durchgeführt. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt, um 5 ml Starterkulturen (LB, 34 µg/ml Chloramphenicol), die bei 37 °C inkubiert wurden und über Nacht kräftig geschüttelt wurden, zu inokulieren. Am nächsten Morgen wurden die Hauptkulturen 1:100 geimpft (LB, 34 µg/ml Chloramphenicol) und Locus-Expression wurden mit 200 nM aTc für 24 h bei 16 °C induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Lysepuffer (20 mM Hepes-Na, pH 7,5 RT, 200 mM NaCl) resuspendiert und unter Verwendung von Glasperlen (0,1-mm-Glasperlen, 4 × 30 s Wirbel bei 4 °C, im Abstand von 30 s Abkühlen auf Eis) lysiert. 200 µl Zelllyseüberstand wurden zur RNA-Extraktion gemäß dem Herstellerprotokoll (Ambion) in Trizol überführt. 10 µg RNA wurden mit 20 Einheiten T4-PNK (NEB) für 6 Stunden bei 37 °C zur 2'-3'-Dephosphorylierung behandelt. Anschließend wurde 1 mM ATP zugegeben und die Probe wurde für 1 h bei 37 °C für 5'-Phosphorylierung vor der Wärmeinaktivierung bei 65 °C für 20 min und anschließender Trizol-Reinigung inkubiert.
  • RNA-Analyse durch RNAseq
  • cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung des RealSeq-AC miRNA-Bibliothekskits Illumina Sequencing (Somagenics) hergestellt. cDNA-Bibliotheken wurden einer Illumina MiSeq-Sequenzierung unterzogen, und rohe Sequenzierungsdaten wurden verarbeitet, um Adapter und Sequenzierungsartefakte zu entfernen, und es wurden qualitativ hochwertige Lesevorgänge beibehalten. Die resultierenden Auslesungen wurden auf ihre jeweiligen Plasmide abgebildet, um die CRISPR-Locus-Expression und die crRNA-Prozessierung zu bestimmen, und die Abdeckung wurde in jeder Region berechnet.
  • Effizienz des Transformationsplasmidinterferenzassays
  • CasΦ-Vektoren wurden in chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) (NEB) transformiert. Einzelne Kolonien für biologische Replikate wurden ausgewählt, um drei Starterkulturen von 5 ml (LB, Kanamycin 50 µg/ml) zu inokulieren, um elektrokompetente Zellen am folgenden Tag herzustellen. Hauptkulturen von 50 ml (LB, Kanamycin 50 µg/ml) wurden 1:100 inokuliert und unter kräftigem Schütteln bei 37 °C bis zu einem OD600 von 0,3 wachsen gelassen. Anschließend wurden die Kulturen auf Raumtemperatur abgekühlt und die casΦ-Expression wurde mit 0,2 mM IPTG induziert. Die Kulturen wurden bei 25 °C bis zu einem OD600 von 0,6-0,7 wachsen gelassen, bevor elektrokompetente Zellen durch wiederholtes Waschen mit eiskaltem H2O und 10 %-igem Glycerin hergestellt wurden. Die Zellen wurden in 250 µl 10 %-iges Glycerin resuspendiert. Aliquote von 90 µl wurden in flüssigem Stickstoff blitzgefroren und bei - 80 °C gelagert. Am nächsten Tag wurden 80 µl kompetente Zellen mit 3,2 µl Plasmid (20 ng/ µl pUC19-Target-Plasmid oder 20 ng/ µl pYTK001-Kontrollplasmid) kombiniert, für 30 min auf Eis inkubiert und in drei einzelne Transformationsreaktionen von 25 µl aufgeteilt. Nach der Elektroporation in 0,1-mm-Elektroporationsküvetten (Bio-Rad) auf einem Micropulser-Elektroporator (Bio-Rad) wurden die Zellen in 1 ml Wiederherstellungsmedium (Lucigen), ergänzt mit 0,2 mM IPTG, gewonnen und für eine Stunde bei 37 °C geschüttelt. Anschließend wurden 10-fache Verdünnungsreihen hergestellt und 5 µl der jeweiligen Verdünnungsschritte wurden auf LB-Agar, der die geeigneten Antibiotika enthielt, punktiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert und die Kolonien wurden am folgenden Tag gezählt, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Zur Beurteilung der Transformationseffizienz wurden der Mittelwert und die Standardabweichung aus den zellbildenden Einheiten pro ng transformierten Plasmiden für die Elektroporations-Triplikate berechnet.
  • Proteinproduktion und -reinigung
  • CasΦ-Überexpressionsvektoren wurden in chemisch geeignetes E. coli BL21(DE3)-Star (QB3-Macrolab, UC Berkeley) transformiert und über Nacht bei 37 °C auf LB-Kan-Agarplatten (50 µg/ml Kanamycin) inkubiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt, um 80 ml (LB, Kanamycin 50 µg/ml) Starterkulturen, die bei 37 °C inkubiert wurden und über Nacht kräftig geschüttelt wurden, zu inokulieren. Am nächsten Tag wurden 1,5 1 TB-Kan-Medium (Kanamycin 50 µg/ml) mit 40 ml Starterkultur inokuliert und bei 37 °C auf ein OD600 von 0,6 wachsen gelassen, 15 min auf Eis abgekühlt und anschließend wurde die Genexpression mit 0,5 mM IPTG induziert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 16 °C. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in Waschpuffer (50 mM HEPES-Na, pH 7,5 RT, 1 M NaCl, 20 mM Imidazol, 5 %-igem Glycerin und 0,5 mM TCEP) resuspendiert, anschließend durch Ultraschallbehandlung lysiert, gefolgt von Lysatklärung durch Zentrifugation. Die lösliche Fraktion wurde auf eine 5-ml-Ni-NTA-Superflow-Kartusche (Qiagen) geladen, die in Waschpuffer voräquilibriert war. Gebundene Proteine wurden mit 20 Säulenvolumina (CV) Waschpuffer gewaschen und anschließend in 5 CV Elutionspuffer (50 mM HEPES-Na, pH 7,5 RT, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 5 %-igem Glycerin und 0,5 mM TCEP) eluiert. Die eluierten Proteine wurden vor der Injektion in eine HiLoad 16/600 Superdex 200pg-Säule (GE Healthcare), voräquilibriert in Größenausschlusschromatographiepuffer (20 mM HEPES-Na, pH 7,5 RT, 500 mM NaCl, 5 %-iges Glycerin und 0,5 mM TCEP) auf 1 ml konzentriert. Die Peakfraktionen wurden auf 1 ml konzentriert und die Konzentrationen wurden unter Verwendung eines NanoDrop 8000-Spektralphotometers (Thermo Scientific) bestimmt. Die Proteine wurden bei einer konstanten Temperatur von 4 °C gereinigt und konzentrierte Proteine wurden auf Eis gehalten, um eine Aggregation zu verhindern, in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und bei -80 °C gelagert. AsCas12a wurde wie zuvor beschrieben gereinigt (Knott et al. (2019) Nat. Struct. Mol. Biol. 26:315).
  • In-vitro-Spaltungsassays - Spacer-Tiling
  • Plasmidziele wurden durch GG-Assemblierung von Spacer 2 kloniert, der im CRISPR-Array von CasΦ-1 stromabwärts eines verwandten 5'-TTA-PAM oder nicht verwandten 5'-CCA-PAM in pYTK095 gefunden wurde (Target-Sequenzen sind in 36 (Bereitstellung von Tabelle 5) gegeben). Supercoiled-Plasmide wurden durch Vermehrung des Plasmids über Nacht bei 37 °C in E. coli Mach1 (QB3-Macrolab, UC Berkeley) in LB und Carbenicillin (100 µg/ml) hergestellt, mit anschließender Herstellung unter Verwendung eines Qiagen Miniprep-Kits (Qiagen). Lineare DNA-Targets wurden durch PCR aus dem Plasmidziel hergestellt. crRNA-Guides wurden als synthetische RNA-Oligos von IDT bestellt (37 (Bereitstellung von Tabelle 6)), in DEPC H2O gelöst und für 3 min bei 95 °C erhitzt, bevor sie bei RT abkühlen konnten. Aktive RNP-Komplexe wurden mit einer Konzentration von 1,25 µM durch Mischen von Protein und crRNA (IDT) in einem Molverhältnis von 1:1 in Spaltungspuffer (10 mM Hepes-K, pH 7,5, RT, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP) und Inkubation bei RT für 30 min assembliert. Spaltungsreaktionen wurden durch Zugabe von DNA (10 nM) zu vorgeformtem RNP (1 µM) in Reaktionspuffer (10 mM Hepes-K, pH 7,5, RT, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP) initiiert. Die Reaktionen wurden bei 37 °C inkubiert, mit 50 mM EDTA gequencht und in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Proben wurden aufgetaut und 20 Minuten bei 37 °C mit 0,8 Einheiten Proteinase K (NEB) behandelt. Ladefarbstoff wurde zugegeben (Gel Loading Dye Purple 6X, NEB) und die Proben wurden durch Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarosegel analysiert und mit SYBR Safe (Thermo Fisher Scientific) gefärbt. Zum Vergleich mit Spaltungsprodukten wurden supergewickelte Plasmide mit PciI (NEB) zur Linearisierung und Nt.BstNBI (NEB) zur Plasmideinkerbung und Bildung offener Kreise aufgeschlossen. Vergleichbare Spaltungsassays unter verschiedenen Bedingungen (n ≥ 3) zeigten konsistente Ergebnisse.
  • In-vitro-Spaltungsassays - radioaktiv markierte Nukleinsäuren
  • Aktive CasΦ-RNP-Komplexe wurden durch Verdünnen des CasΦ-Proteins auf 4 µM und der crRNA (IDT) auf 5 µM in RNP-Assemblierungspuffer (20 mM HEPES-Na, pH 7,5 RT, 300 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 %-iges Glycerin, 1 mM TCEP) und Inkubation für 30 min bei RT in einem Molarverhältnis von 1:1,2 assembliert. Die Substrate wurden unter Verwendung von T4-PNK (NEB) bei Vorhandensein von 32P-γ-ATP am 5'-Ende markiert (Substratsequenzen sind in 36 angegeben (Bereitstellung von Tabelle 5)). Oligo-Duplex-Targets wurden durch Kombinieren von 32P-markierten und unmarkierten komplementären Oligonukleotiden in Molverhältnis von 1:1,5 erzeugt. Oligos wurden durch Erhitzen für 5 Minuten auf 95 °C und langsames Abkühlen auf RT in einem Heizblock auf eine DNA-Duplex-Konzentration von 50 nM in Hybridisierungspuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, RT, 150 mM KC1) hybridisiert. Die Spaltungsreaktionen wurden durch Kombinieren von 200 nM RNP mit 2 nM Substrat in Reaktionspuffer (10 mM HEPES-Na, pH 7,5 RT, 150 mM KCI, 5 mM MgCl2, 10 %-iges Glycerin, 0,5 mM TCEP) initiiert und nachfolgend bei 37 °C inkubiert. Für trans-Spaltungsassays wurden komplementäre Spacer-Aktivatorsubstrate in Oligonukleotid-Hybridisierungspuffer (10 mM Tris, pH 7,8 RT, 150 mM KCl) auf eine Konzentration von 4 µM verdünnt, für 5 min auf 95 °C erhitzt und anschließend auf RT abgekühlt, um Duplexbildung für doppelsträngige Aktivatorsubstrate zu ermöglichen. Spaltungsreaktionen wurden durch Kombinieren von 200 nM RNP mit 100 nM Aktivatorsubstrat und Inkubation für 10 min bei RT vor Zugabe von 2 nM ssDNA- oder ssRNA-trans-Spaltungssubstraten aufgebaut. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von zwei Volumina Formamid-Ladepuffer (96% Formamid, 100 µg/ml Bromphenolblau, 50 µg/ml Xylolcyanol, 10 mM EDTA, 50 µg/ml Heparin) gestoppt, für 5 min auf 95 °C erhitzt und vor der Trennung auf einer 12,5-%igen denaturierenden Harnstoff-PAGE auf Eis abgekühlt. Die Gele wurden für 4 h bei 80 °C getrocknet, bevor die Phosphorbildgebung unter Verwendung eines Amersham Typhoon-Scanners (GE Healthcare) sichtbar gemacht wurde. Technische Replikate (n ≥ 2) und vergleichbare Spaltungsassays unter verschiedenen Bedingungen (n ≥ 3) von biologischen Replikaten (n ≥ 2) zeigten konsistente Ergebnisse. Die Banden wurden unter Verwendung von ImageQuant TL (GE) quantifiziert und das gespaltene Substrat wurde aus der Intensität relativ zur bei t = 0 min beobachteten Intensität berechnet. Die Kurven wurden an ein Einphasen-Zerfallsmodell in Prism 8 (Graphpad) angepasst, um die Spaltungsrate abzuleiten.
  • In-vitro-prä-crRNA-Prozessierungsassays
  • Die prä-crRNA-Substrate wurden unter Verwendung von T4-PNK (NEB) bei Vorhandensein von 32P-γ-ATP am 5'-Ende markiert (Substratsequenzen sind in 36 angegeben (Bereitstellung von Tabelle 5)). Die Prozessierungsreaktionen wurden durch Kombinieren von 50 nM CasΦ mit 1 nM Substrat in prä-crRNA-Prozessierungspuffer (10 mM Tris, pH 8, RT, 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 oder 25 mM EDTA, 10 %-iges Glycerin, 1 mM DTT) initiiert und nachfolgend bei 37 °C inkubiert. Substrathydrolyseleitern wurden unter Verwendung des alkalischen Hydrolysepuffers gemäß dem Protokoll des Herstellers (Ambion) hergestellt. 10 µl der Prozessierungsreaktionsprodukte wurden mit 10 Einheiten T4-PNK (NEB) für 1 h bei 37 °C bei Nichtvorhandensein von ATP für die Analyse der Termini-Chemie behandelt.
  • Die Reaktionen wurden durch Zugabe von zwei Volumina Formamid-Ladepuffer (96 % Formamid, 100 µg/ml Bromphenolblau, 50 µg/ml Xylolcyanol, 10 mM EDTA, 50 µg/ml Heparin) gestoppt, für 3 min auf 95 °C erhitzt und vor der Trennung auf einer 12,5-%igen oder 20-%igen denaturierenden Harnstoff-PAGE auf Eis abgekühlt. Die Gele wurden für 4 h bei 80 °C getrocknet, bevor die Phosphorbildgebung unter Verwendung eines Amersham Typhoon-Scanners (GE Healthcare) sichtbar gemacht wurde. Technische Replikate (n ≥ 3) und vergleichbare Spaltungsassays unter verschiedenen Bedingungen (n ≥ 3) von biologischen Replikaten (n ≥ 2) zeigten konsistente Ergebnisse. Die Banden wurden unter Verwendung von ImageQuant TL (GE) quantifiziert und die prozessierte RNA wurde aus der Intensität bei t = 60 min relativ zu der bei t = 0 min beobachteten Intensität berechnet.
  • Analytische Größenausschlusschromatografie
  • 500 µl Proben (5-10 µM Protein, RNA oder rekonstituierte RNP) wurden auf eine S200 XK10/300 Größenausschlusschromatographie (SEC)-Säule (GE Healthcare) injiziert, voräquilibriert in SEC-Puffer (20 mM HEPES-Cl, pH 7,5, RT, 250 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 %-iges Glycerin und 0,5 mM TCEP). Vor der SEC wurden CasΦ-RNP-Komplexe durch Inkubieren von CasΦ-Protein und prä-crRNA für 1 h in 2X prä-crRNA-Prozessierungspuffer (20 mM Tris, pH 7,8, RT, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 %-iges Glycerin, 2 mM DTT) assembliert.
  • Genomeditierung in menschlichen Zellen
  • Die GFP HEK293-Reporterzellen wurden wie zuvor beschrieben durch lentivirale Integration erzeugt. Richardson et al. (2016) Nat. Biotechnol. 34:339. Die Zellen wurden routinemäßig unter Verwendung des MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza) gemäß dem Protokoll des Herstellers auf Nichtvorhandenseio von Mycoplasma getestet. GFP HEK293-Reporterzellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und gemäß Herstellerprotokoll am nächsten Tag mit Lipofectamin 3000 (Life Technologies) und 200 ng Plasmid-DNA, die für die CasΦ-gRNA- und CasΦ-P2A-Puromycin-Fusion codiert, mit 60-70 % Konfluenz transfiziert. Als Vergleichskontrolle wurden 200 ng Plasmid-DNA, die für die SpyCas9-sgRNA- und SpyCas9-P2A-PAC-Fusion codiert, identisch transfiziert, wobei die Target-Sequenzen auf PAM-Unterschiede eingestellt wurden. 24 Stunden nach der Transfektion wurden erfolgreich transfizierte Zellen durch Zugabe von 1,5 µg/ml Puromycin auf das Zellkulturmedium für 72 Stunden ausgewählt.
  • Die Zellen wurden regelmäßig passagiert, um subkonfluente Bedingungen aufrechtzuerhalten, und dann auf einem Attune NxT-Durchflusszytometer mit einem Autosampler analysiert. Die Zellen wurden nach 10 Tagen auf dem Durchflusszytometer analysiert, um die Clearance von GFP aus den Zellen zu ermöglichen.
  • Ergebnisse
  • Cas12J, oder einfach CasΦ als Hommage an seinen phagenbeschränkten Ursprung, ist eine bisher unbekannte Familie von Cas-Proteinen, die in der Biggiephage-Klade codiert sind. CasΦ enthält eine C-terminale RuvC-Domäne mit entfernter Homologie zu der der TnpB-Nuklease-Superfamilie, aus der sich vermutlich CRISPR-Cas-Proteine vom Typ V entwickelt haben (20). CasΦ teilt jedoch <7 % Aminosäureidentität mit anderen CRISPR-Cas-Proteinen vom Typ V und ist am engsten mit einer TnpB-Gruppe verwandt, die sich von Miniaturproteinen vom Typ V (Cas14) unterscheidet (19A).
  • Die ungewöhnlich kleine Größe von CasΦ von -70-80 kDa, was etwa halb so groß ist wie die RNA-geleiteten DNA-Schneideenzyme Cas9 und Cas12a (19B), und das Fehlen von gleichzeitig vorkommenden Genen warfen die Frage auf, ob CasΦ als Bona-fide-CRISPR-Cas-System fungiert. Drei verschiedene CasΦ-Orthologe aus metagenomischen Anordnungen wurden zur Untersuchung ausgewählt, basierend auf der Divergenz ihrer Protein- und CRISPR-Wiederholungssequenzen (21), auf die in 21 als CasΦ-1, CasΦ-2 und CasΦ-3 Bezug genommen wird. Um die Fähigkeit von Cas<D, DNA in Bakterienzellen zu erkennen und darauf abzuzielen, zu untersuchen, wurde getestet, ob diese Systeme Escherichia coli vor Plasmidtransformation schützen können. Es ist bekannt, dass CRISPR-Cas-Systeme auf DNA-Sequenzen nach oder vor einem 2-5-Nukleotid-Protospacer-Adjacent-Motiv (PAM) zur Selbst-gegen-Nicht-Selbst-Diskriminierung abzielen (Gleditzsch et al. (2019), RNA Biology 16:504). Um zu bestimmen, ob CasΦ ein PAM verwendet, wurde eine Bibliothek von Plasmiden, die randomisierte Regionen neben crRNA-komplementären Target-Stellen enthielten, in E. coli transformiert, wodurch Plasmide einschließlich funktioneller PAM bevorzugt abgereichert wurden. Dies zeigte die crRNA-geleitete Doppelstrang-DNA (dsDNA)-Targeting-Fähigkeit von CasΦ und verschiedenen T-reichen PAM-Sequenzen, einschließlich einer minimalen 5'-TBN-3'-PAM, die für CasΦ-2 beobachtet wurde ( 19C).
  • Das E. coli-Expressionssystem und der Plasmidinterferenzassay wurden dazu verwendet, die Komponenten zu bestimmen, die für die Funktion des CRISPR-CasΦ-Systems erforderlich sind. Eine RNA-Sequenzierungsanalyse ergab eine Transkription des casΦ-Gens und des CRISPR-Arrays, jedoch keinen Hinweis auf andere nichtcodierende RNA wie etwa eine transaktivierende CRISPR-RNA (tracrRNA), die in oder nahe dem Locus codiert ist (19D). Zusätzlich wurde festgestellt, dass die CasΦ-Aktivität leicht gegen andere Plasmidsequenzen gerichtet werden konnte, indem die Guide-RNA verändert wurde, was die Programmierbarkeit dieses Systems demonstrierte (22A-22C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CasΦ in seiner natürlichen Umgebung ein funktionelles Phagenprotein und ein Bona-fide-CRISPR-Cas-Effektor ist, der in der Lage ist, DNA zu spalten, die Komplementarität zu verschiedenen crRNA, wahrscheinlich anderen MGE, trägt, um die Superinfektion aufzuheben (19E). Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass dieses Einzel-RNA-System viel kompakter ist als andere aktive CRISPR-Cas-Systeme (19F).
  • CRISPR-Cas-Effektorkomplexe identifizieren und spalten fremde Nukleinsäuren im Endstadium der CRISPR-Cas-vermittelten Immunität gegen MGE (Hille et al. (2018) Cell 172:1239). Um festzustellen, wie CasΦ ein RNA-geleitetes DNA-Targeting für Biggiephagen erreicht, wurden die Erkennungs- und Spaltungsanforderungen von CasΦ in vitro untersucht. Die RNA-Sequenz ergab, dass die Spacersequenz innerhalb der crRNA, die zu DNA-Targets komplementär ist, zwischen 14 und 20 Nukleotiden (nt) lang ist (19D). Die Inkubation von gereinigtem CasΦ (24A-24D) mit crRNA unterschiedlicher Spacergrößen zusammen mit Supercoiled-Plasmid oder linearer dsDNA zeigte, dass die Target-DNA-Spaltung das Vorhandensein eines verwandten PAM und eines Spacers von ≥ 14 nt erfordert (23A; 25A). Die Analyse der Spaltungsprodukte zeigte, dass CasΦ versetzte 5'-Überhänge von 8-12 nt (23B und 23C; 25B und 25C) erzeugt, ähnlich den versetzten DNA-Schnitten, die für andere CRISPR-Cas-Enzyme vom Typ V, einschließlich Cas12a und CasX, beobachtet wurden (Zetsche et al. (2015) Cell 163:759; Liu et al. (2019) Nature 566:218). Es wurde beobachtet, dass CasΦ-2 und CasΦ-3 in vitro aktiver waren als CasΦ-1, und der Nicht-Target-Strang (NTS) wurde schneller gespalten als der Target-Strang (TS) (23D; 26A; 27A und 27B). Weiterhin wurde festgestellt, dass CasΦ ssDNA, aber nicht ssRNA-Targets, spaltet (26B), was darauf hindeutet, dass CasΦ auch auf ssDNA-MGE oder ssDNA-Zwischenprodukte abzielen kann.
  • Um die Rolle der RuvC-Domäne bei der CasΦ-katalysierten DNA-Spaltung zu bewerten, wurde das aktive Zentrum mutiert (D371A, D394A oder D413A), um eine CasΦ-Variante (dCasΦ) herzustellen, von der festgestellt wurde, dass sie dsDNA, ssDNA oder ssRNA in vitro nicht spaltet (26A und 26B). Bei Expression in E. coli zusammen mit dem CRISPR-Array konnte dCasΦ die Transformation eines crRNA-komplementären Plasmids nicht verhindern, was mit der Forderung nach RuvC-katalysiertem DNA-Schneiden übereinstimmt (22A-22B). Diese Beobachtung legt zusammen mit der verzögerten Spaltung des Target-Strangs nach der Nicht-Target-Strang-Spaltung ( 23D; 27A und 27B) nahe, dass CasΦ jeden Strang nacheinander innerhalb des aktiven Zentrums von RuvC spaltet. Die sequentielle Spaltung des dsDNA-Strangs stimmt mit dem dsDNA-Schneidemechanismus der CRISPR-Cas-Proteine vom Typ V (10) überein, die den engsten evolutionären Ursprung mit CasΦ teilen.
  • Darüber hinaus wurde festgestellt, dass CasΦ, wie andere CRISPR-Cas-Effektoren vom Typ V, ssDNA in trans abbaut, wenn es durch Target-dsDNA- oder ssDNA-Bindung in cis aktiviert wird. trans-einzelsträngige DNAse-Aktivität, aber nicht RNAse-Aktivität, bei Erkennung des DNA-Targets in cis wurde beobachtet (28A-28B). Diese trans-Spaltungsaktivität, verbunden mit einer minimalen PAM-Anforderung, kann für einen breiteren Nachweis von Nukleinsäuren nützlich sein.
  • Um die Genomabwehr zu gewährleisten, müssen CRISPR-CasΦ-Systeme reife crRNA-Transkripte produzieren, um die Fremd-DNA-Spaltung zu führen. Andere CRISPR-Cas-Proteine vom Typ V prozessieren ihre eigenen prä-crRNA unter Verwendung eines internen aktiven Zentrums, das sich von der RuvC-Domäne unterscheidet (Fonfara et al. Nature. 532, 517-521 (2016)), oder durch Rekrutieren von Ribonuclease III, um ein Duplex-RNA-Substrat zu spalten, das durch prä-crRNA-Basenpaarung mit einer tracrRNA gebildet wird (Burstein et al. (2017) Nature 542:237; Harrington et al. (2018) Science 362:839; Yan et al. (2019) Science 363:88; Shmakov et al. (2015) Mol. Cell. 60:385). Das Fehlen einer nachweisbaren tracrRNA, die in genomischen CRISPR-CasΦ-Loci codiert ist, deutete daraufhin, dass CasΦ die crRNA-Reifung selbst katalysieren könnte. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde gereinigtes CasΦ mit Substraten inkubiert, die die prä-crRNA-Struktur nachahmen sollten ( 29A). Reaktionsprodukte, die einer 26-29-Nukleotid-langen Wiederholung und einer 20-Nukleotid-Guide-Sequenz der crRNA entsprechen, wurden nur in Gegenwart von Wildtyp-Cas<D beobachtet, was durch RNA-Sequenzanalyse nativer Loci bestätigt wurde (19D; 29A; 29C; 30A-30C). In Kontrollexperimenten wurde festgestellt, dass die CasΦ-katalysierte prä-crRNA-Prozessierung magnesiumabhängig ist (29B; 30A - 30C), was sich von allen anderen bekannten CRISPR-Cas-RNA-Prozessierungsreaktionen unterscheidet und einen bestimmten chemischen Mechanismus der Spaltung nahe legt. Insbesondere verwendet die RuvC-Domäne selbst einen magnesiumabhängigen Mechanismus zur Spaltung von DNA-Substraten (Nowotny et al. (2009) EMBO Rep. 10:144), und es wurde berichtet, dass einige RuvC-Domänen eine endoribonukleolytische Aktivität aufweisen (Yan et al. (2019) Science 363: 88). Basierend auf diesen Beobachtungen wurde ein CasΦ getestet, das eine RuvC-inaktivierende Mutation enthielt; es wurde festgestellt, dass es nicht in der Lage ist, prä-crRNA zu prozessieren (29B; 30A und 30B). Sowohl Wildtyp- als auch katalytisch inaktivierte CasΦ-Proteine können crRNA binden, und ihre rekonstituierten Komplexe mit prä-crRNA weisen ähnliche Elutionsprofile aus einer Größenausschlusssäule auf, was darauf hindeutet, dass keine prä-crRNA-Bindung oder Proteinstabilitätsdefekt aufgrund der RuvC-Punktmutation vorliegt (31A-31B).
  • Es wurde angenommen, dass, wenn die CasΦ RuvC-Domäne für die prä-crRNA-Spaltung verantwortlich ist, die Produkte 5'-Phosphat- und 2'- und 3'-Hydroxylreste enthalten sollten, wie bei RNA beobachtet, die von den RuvC-verwandten RNase HI-Enzymen erzeugt werden (Nowotny et al. (2009) oben). Im Gegensatz dazu prozessieren andere CRISPR-Cas-Enzyme vom Typ V prä-crRNA durch einen metallunabhängigen Säure-Base-Katalysemechanismus an einem aktiven Zentrum, das sich von der RuvC-Domäne unterscheidet, was 2'-3'-cyclischen Phosphat-crRNA-Termini erzeugt, wie für Cas12a beobachtet (Swarts et al. (2017) Mol. Cell. 66:221). Die PNK-Phosphatase-Behandlung von CasΦ-erzeugter crRNA, gefolgt von einer Denaturierung des Acrylamidgels, zeigte keine Änderung des crRNA-Migrationsverhaltens, die sich von der Änderung der Mobilität unterschieden hat, die in einem ähnlichen Experiment festgestellt wurde, das mit von Cas12a erzeugter crRNA durchgeführt wurde (29C; 30C). Dieses Ergebnis impliziert, dass im Gegensatz zu der RuvC-unabhängigen Säure-Basekatalysierten prä-crRNA-Prozessierungsreaktion durch AsCas12a kein 2'-3'-cyclisches Phosphat während der Reaktion, katalysiert durch CasΦ, gebildet wurde (29C und 29D). Zusammen zeigen diese Daten, dass CasΦ ein einzelnes aktives Zentrum sowohl für die prä-crRNA-Prozessierung als auch für die DNA-Spaltung verwendet, was eine bisher nicht sichtbare Aktivität für ein aktive Zentrum von RuvC oder ein CRISPR-Cas-Enzym ist.
  • Die Vielseitigkeit und Programmierbarkeit von CRISPR-Cas-Systemen hat eine Revolution in der Biotechnologie und der Grundlagenforschung ausgelöst, da sie zur Manipulation von Genomen praktisch aller Organismen eingesetzt wurden. Um zu untersuchen, ob die DNA-Spaltungsaktivität von CasΦ für die programmierte Bearbeitung des menschlichen Genoms genutzt werden kann, wurde ein Gen-Disruption-Assay unter Verwendung von CasΦ, das mit einer geeigneten crRNA in HEK293-Zellen coexprimiert wurde, durchgeführt (Liu et al. (2019) Nature 566:218; Oakes et al. (2016) Nat. Biotechnol. 34:646) (32A). Es wurde festgestellt, dass CasΦ-2 und CasΦ-3, jedoch nicht CasΦ-1, eine gezielte Störung eines genomisch integrierten Gens induzieren können, das für verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) codiert (33A; 32B). In einem Fall konnte CasΦ-2 mit einer individuellen Guide-RNA bis zu 33 % der Zellen bearbeiten (33A), vergleichbar mit den ursprünglich für CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a und CRISPR-CasX angegebenen Werten (Zetsche et al (2015) Cell 163:759; Liu et al. (2019) oben; Mali et al. (2013) Science 339:823). Die geringe Größe von CasΦ in Kombination mit seiner minimalen PAM-Anforderung ist besonders vorteilhaft sowohl für die vektorbasierte Abgabe in Zellen als auch für einen größeren Bereich zielgerichteter Genomsequenzen und bietet eine leistungsstarke Ergänzung der CRISPR-Cas-Toolbox.
  • CasΦ stellt eine neue Familie von CRISPR-Cas-Enzymen dar, die durch ihr einziges aktives Zentrum sowohl für das RNA- als auch für das DNA-Schneiden definiert sind. Drei weitere gut charakterisierte Cas-Enzyme Cas9, Cas12a und CasX verwenden ein (Cas12a und CasX) oder zwei aktive Zentren (Cas9) zum Schneiden von DNA und stützen sich auf ein separates aktives Zentrum (Cas12a) oder zusätzliche Faktoren (CasX und Cas9) für crRNA-Prozessierung (33B). Die Feststellung, dass bei CasΦ ein einzelnes aktives RuvC-Zentrum sowohl zur crRNA-Prozessierung als auch zum DNA-Schneiden fähig ist, legt nahe, dass Größenbeschränkungen von Phagengenomen, möglicherweise in Kombination mit großen Populationsgrößen und höheren Mutationsraten in Phagen im Vergleich zu Prokaryoten (24-26), zu einer Konsolidierung der Chemien innerhalb eines katalytischen Zentrums führten.
  • 19A-19F. CasΦ ist ein Bona-fide-CRISPR-Cas-System aus riesigen Phagen. (A) Phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit der berichteten Effektorproteine vom Typ V und der jeweils vorhergesagten TnpB-Stammnukleasen. Bootstrap- und Approximate-Likelihood-Ratio-Testwerte ≥ 90 sind auf den Zweigen mit schwarzen Kreisen gekennzeichnet. (B) Abbildungen der Genomloci von CRISPR-Cas-Systemen, die zuvor in Genomeditierungsanwendungen verwendet wurden. (C) Grafische Darstellung des PAM-Depletionsassays und der resultierenden PAMs für drei CasΦ-Orthologe. (D) RNA-Sequenzierungsergebnisse (links), die auf die nativen Genomloci von CasΦ-Orthologen und ihre stromaufwärts und stromabwärts gelegenen nichtcodierenden Regionen abgebildet sind, wie sie in ihre jeweiligen Expressionsplasmide kloniert wurden. Vergrößerte Ansicht der RNA, die auf das erste Wiederholung-Spacer-Paar abgebildet ist (rechts). (E) Schema der hypothetischen Funktion von Biggiephage-codiertem CasΦ in einem Fall einer Superinfektion seines Wirts. CasΦ kann von dem riesigen Phagen verwendet werden, um konkurrierende mobile genetische Elemente zu eliminieren. (F) Vorausgesagte Molekulargewichte der Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe kleiner CRISPR-Cas-Effektoren und solcher, die bei der Bearbeitung von Säugerzellen funktionieren.
  • 20. Phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit der Typ-V-Subtypen a-k. Phagen-codierte CasΦ-Proteine sind rot umrandet, Prokaryoten- und Transposon-codierte Proteine blau. Bootstrap- und Approximate-Likelihood-Ratio-Testwerte >90 werden auf den Zweigen (Kreisen) angezeigt.
  • 21. CasΦ-crRNA-Wiederholungen sind sehr unterschiedlich. Eine Ähnlichkeitsmatrix wurde unter Verwendung einer Heatmap und eines hierarchischen Clustering-Dendrogramms erstellt und visualisiert. Wiederholungen von CasΦ-1, CasΦ-2 und CasΦ-3.
  • 22A-22C. CasΦ-3 schützt vor Plasmidtransformation. (A) Schema zur Darstellung des EOT-Assays (Efficiency of Transformation). (B) EOT-Assay, der zeigt, dass CasΦ, programmiert durch einen Beta-Lactamase (bla)-Gen-Targeting-Guide, die Effizienz der pUC19-Transformation verringert (rote Balken). Experimente wurden in drei biologischen Replikaten und technischen Elektroporations-Transformationstriplikaten durchgeführt (Punkte; n = jeweils 3, Mittelwert ± SD). Kompetente Zellen wurden durch Transformation von pYTK095, auf das der getestete bla- und NT (Non-Targeting)-Guide nicht abzielt, auf allgemeine Transformationseffizienz (graue Balken) getestet. (C) EOT in Abhängigkeit von der Variation der Reste des aktiven CasΦ-3-RuvC-Zentrums (RuvCI: D413A; RuvCII: E618A; RuvCIII: D708A). N. = jeweils 3, Mittelwert ± SD. Kompetente Zellen wurden auf allgemeine Transformationseffizienz getestet (graue Balken).
  • 23A-23D. CasΦ spaltet DNA. (A) Supercoiled-Plasmidspaltungsassay in Abhängigkeit von der Guide-Spacer-Länge. (B) Spaltungsassay, der auf dsDNA-Oligo-Duplikate zur Kartierung der Spaltungsstruktur abzielt. (C) Schema zur Veranschaulichung des Spaltungsmusters. (D) NTS- und TS-DNA-Spaltungseffizienz (n = jeweils 3, Mittelwert ± SD). Die Daten sind in 27B gezeigt.
  • 24A-24D. Reinigung von Apo-CasΦ. (A) SDS-PAGE der gereinigten Apo-CasΦ-Orthologen und ihrer dCasΦ-Varianten. (B) Analytische Größenausschlusschromatographie (S200) von CasΦ-1 WT (blaue Spur) und dCasΦ-1 (orange Spur). (C) Analytische Größenausschlusschromatographie (S200) von CasΦ-2 WT (blaue Spur) und dCasΦ-2 (orange Spur). D) Analytische Größenausschlusschromatographie (S200) von CasΦ-3 WT (blaue Spur) und dCasΦ-3 (orange Spur).
  • 25A-25C. CasΦ zielt in vitro auf DNA ab, um versetzte Schnitte zu erzeugen. (A) Linearer PCR-Fragment-Spaltungsassay in Abhängigkeit von der Länge des Guide-Spacers und dem Vorhandensein eines verwandten 5'-TTA-3'-PAM (links) oder eines nicht verwandten 5'-CCA-3'-PAM (rechts). (B) Spaltungsassay, der auf dsDNA-Oligo-Duplikate zur Kartierung der Spaltungsstruktur abzielt. (C) Schema zur Veranschaulichung des Spaltmusters der versetzten Schnitte. Dargestellt sind die vorgeschlagenen R-Schleifen-Strukturen (Replikationsschleifenstrukturen), die von CasΦ bei der Bindung der Target-DNA an den crRNA-Spacer gebildet werden.
  • 26A-26B. CasΦ zielt auf dsDNA und ssDNA ab, nicht jedoch auf RNA in vitro. (A) Spaltungsassay zur Bewertung der Fähigkeit von RNP der CasΦ- und dCasΦ-Variante (D371A, D394A und D413A), den Target-Strang (TS) und den Nicht-Target-Strang (NTS) eines dsDNA-Oligo-Duplex zu spalten. (B) Spaltungsassay, der die Fähigkeit von RNP der CasΦ- und dCasΦ-Variante (D371A, D394A und D413A) testet, einen einzelsträngigen DNA- oder RNA-Target-Strang anzuvisieren und zu spalten.
  • 27A-27B. Spaltungsassay zum Vergleich der TS- und NTS-Spaltungseffizienz durch CasΦ. (A) Spaltungsassay-Kurven für das One-Phase-Decay-Modell unter Verwendung von Prism 8 (GraphPad) (n = jeweils 3, Mittelwert ± SD). Die gespaltenen Fraktionen werden basierend auf den Substratbandintensitäten bei t = (0 min) (Tafel B) relativ zu dem jeweiligen Zeitpunkt berechnet. (B) Harnstoffgele der drei unabhängigen Reaktionsreplikate (Replikate 1, 2 und 3). Diese Tafel bezieht sich auch auf 23D für CasΦ-2.
  • 28A-28B. CasΦ zielt bei Aktivierung in cis auf ssDNA, aber nicht auf RNA, in trans ab. (A) Spaltungsassay zum Vergleich der trans-Spaltungsaktivitäten von CasΦ-1, CasΦ-2 und CasΦ-3 auf ssDNA und ssRNA als Targets in trans in Abhängigkeit von entweder ssDNA, dsDNA oder ssRNA als Aktivatoren in cis. (B) Spaltungsassay zum Vergleich der trans-Spaltungsaktivität von CasΦ-1, CasΦ-2 und CasΦ-3.
  • 29A-29D. CasΦ prozessiert prä-crRNA im aktiven Zentrum von RuvC. (A) prä-crRNA-Substrate und Prozessierungszentren (rote Dreiecke), wie von der OH-Leiter in Tafel C abgeleitet. (B) prä-crRNA-Prozessierungszentren für CasΦ-1 und Cas<D-2 in Abhängigkeit von Mg2+ und Variation der Reste des aktiven Zentrums von RuvC (D371A und D394A) (n = jeweils 3, Mittelwert ± SD; t = 60 min). Die Daten sind in 30B gezeigt. (C) Links und Mitte: Alkalische Hydrolyseleiter (OH) des prä-crRNA-Substrats. Rechts: PNK-Phosphatase-Behandlung der CasΦ- und Cas12a-Spaltungsprodukte. (D) Grafische Darstellung der reifen crRNA-Termini-Chemie der Behandlungsergebnisse von CasΦ und Cas12a sowie der PNK-Phosphorylase.
  • 30A-30C. CasΦ-1 und CasΦ-2, jedoch nicht CasΦ-3, prozessieren prä-crRNA. (A) prä-crRNA-Prozessierungsassay für CasΦ-1, CasΦ-2 und CasΦ-3 in Abhängigkeit von Mg2+ und katalytische Reste des aktiven Zentrums von RuvC (dCasΦ-Varianten). (A) Prozessierungsreaktionsreplikate für CasΦ-1 und CasΦ-2 bei t = 0 min und t = 60 min. Lila Quadrate zeigen quantifizierte Banden an. Diese Tafel bezieht sich auf 29B. (C) prä-crRNA-Prozessierungsassay für CasΦ-1, CasΦ-2 und AsCas12a in Abhängigkeit von Mg2+ und katalytische Reste des aktiven Zentrums von RuvC (dCasΦ-Varianten).
  • 31A-31B. CasΦ-WT- und dCasΦ-Proteine bilden RNP mit prä-crRNA. (A) Analytische Größenausschlusschromatographie (S200) von Wildtyp-Proteinen (blaue Spur), prä-crRNA (gelbe Spur) und ihrem jeweiligen rekonstituierten RNP (grüne Spur). (B) Analytische Größenausschlusschromatographie (S200) von Proteinen der dCasΦ-Variante (blaue Spur), prä-crRNA (gelbe Spur) und ihrem jeweiligen rekonstituierten RNP (grüne Spur).
  • 32A-32C. CasΦ-vermittelte EGFP-Genstörung in HEK293-Zellen. (A) Schema des experimentellen Arbeitsablaufs des GFP-Disruptionsassays (links) und der EGFP-Disruption durch SpyCas9 (rechts) (B) CasΦ-Guides mit GFP-Disruption unter 5% (n = jeweils 3, Mittelwert ± SD). (C) EGFP-Karte mit den Target-Orten und der Ausrichtung der Hilfslinien (Pfeile und Zahlen). Gelbe Dreiecke zeigen die besten Anhaltspunkte für eine Genstörung an (bezieht sich auf 34A). Guide-Sequenzen sind in Tabelle 4 aufgeführt (dargestellt in 35).
  • 33A-33B. CasΦ ist für das Editing des menschlichen Genoms geeignet. (A) GFP-Störung unter Verwendung von CasΦ-2 (links) und CasΦ-3 (rechts) und eines Non-Targeting (NT)-Guides als Negativkontrolle (n = jeweils 3, Mittelwert ± SD). Alle getesteten Guides und Target-Regionen innerhalb des EGFP-Gens sind in 32A-32C gezeigt. (B) Schema zur Veranschaulichung der Unterschiede bei der RNA-Prozessierung und beim DNA-Schneiden für Cas9, Cas12a, CasX und CasΦ.
  • 34 zeigt Tabelle 3.
  • 35 zeigt Tabelle 4.
  • 36 zeigt Tabelle 5.
  • 37 zeigt Tabelle 6.
  • Während die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben wurden ist, versteht der Fachmann, dass verschiedene Änderungen vorgenommen werden können und Äquivalente substituiert werden können, ohne vom wahren Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Außerdem können viele Modifikation vorgenommen werden, um ein/eine/einen konkrete/konkretes/konkreten Situation, Material, Stoffzusammensetzung, Prozess, Prozessschritt oder -schritte an das Ziel, den Geist und den Umfang der vorliegenden Erfindung anzupassen. Alle derartigen Modifikationen sollen in den Geltungsbereich der beigefügten Ansprüche fallen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 62815173 B [0001]
    • US 62855739 B [0001]
    • US 62907422 B [0001]
    • US 62948470 B [0001]
    • US 7029913 B [0038]
    • US 5843780 A [0038]
    • US 6200806 B [0038]
    • WO 9920741 A [0038]
    • WO 0151616 A [0038]
    • WO 03020920 A [0038]
    • US 7153684 B [0039]
    • US 20090047263 A [0040]
    • US 20090068742 A [0040]
    • US 20090191159 A [0040]
    • US 20090227032 A [0040]
    • US 20090246875 A [0040]
    • US 20090304646 A [0040]
    • US 7022896 B [0110]
    • WO 9741228 A [0110]
    • US 2009029861 A [0110]
    • WO 2012068627 A [0115, 0138]
    • WO 2010075303 A [0116, 0138]
    • WO 2004067736 A [0118]
    • WO 2013155555 A [0138]
    • US 8906616 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8895308 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8889418 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8889356 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8871445 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8865406 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8795965 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8771945 B [0138, 0174, 0308]
    • US 8697359 B [0138, 0174, 0308]
    • US 20140068797 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140170753 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140179006 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140179770 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140186843 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140186919 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140186958 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140189896 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140227787 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140234972 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140242664 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140242699 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140242700 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140242702 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140248702 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140256046 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273037 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273226 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273230 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273231 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273232 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273233 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273234 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140273235 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140287938 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140295556 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140295557 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140298547 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140304853 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140309487 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140310828 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140310830 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140315985 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140335063 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140335620 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140342456 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140342457 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140342458 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140349400 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140349405 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140356867 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140356956 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140356958 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140356959 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140357523 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140357530 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140364333 A [0138, 0174, 0308]
    • US 20140377868 A [0138, 0174, 0308]
    • WO 9412649 A [0188]
    • WO 9303769 A [0188]
    • WO 9319191 A [0188]
    • WO 9428938 A [0188]
    • WO 9511984 A [0188]
    • WO 9500655 A [0188]
    • WO 9309239 A [0188]
    • US 6437217 B [0204]
    • US 5641876 A [0204]
    • US 6426446 B [0204]
    • US 6429362 B [0204]
    • US 6232526 B [0204]
    • US 6177611 B [0204]
    • US 5322938 A [0204]
    • US 5352605 A [0204]
    • US 5359142 A [0204]
    • US 5530196 A [0204]
    • US 6433252 B [0204]
    • US 6429357 B [0204]
    • US 5837848 A [0204]
    • US 6294714 B [0204]
    • US 6140078 A [0204]
    • US 6252138 B [0204]
    • US 6175060 B [0204]
    • US 6635806 B [0204]
    • US 09757089 B [0204]
    • US 6051753 A [0204]
    • US 5378619 A [0204]
    • US 5850019 A [0204]
    • US 20030220334 A [0213]
    • US 20030083256 A [0213]
    • US 20030032593 A [0213]
    • US 20030022831 A [0213]
    • US 5550318 A [0215]
    • US 5538880 A [0215]
    • US 6160208 A [0215]
    • US 6399861 B [0215]
    • US 6153812 A [0215]
    • US 5159135 A [0215]
    • US 5824877 A [0215]
    • US 5591616 A [0215]
    • US 6384301 B [0215]
    • US 5750871 A [0215]
    • US 5463174 A [0215]
    • US 5188958 A [0215]
    • US 5489677 A [0238]
    • US 5602240 A [0238]
    • US 5034506 A [0239, 0243]
    • US 5539082 A [0242]
    • US 5714331 A [0242]
    • US 5719262 A [0242]
    • WO 9839352 A [0246]
    • WO 9914226 A [0246]
    • US 20120165514 A [0246]
    • US 20100216983 A [0246]
    • US 20090041809 A [0246]
    • US 20060117410 A [0246]
    • US 20040014959 A [0246]
    • US 20020094555 A [0246]
    • US 20020086998 A [0246]
    • US 3687808 A [0250]
    • US 20110293703 A [0261]
    • WO 2014118272 A [0263]
    • US 20130252281 A [0275]
    • US 20130245107 A [0275]
    • US 20130244279 A [0275]
    • US 5736396 A [0296, 0330]
    • US 8030000 B [0384]
    • US 8426134 B [0384]
    • US 8945845 B [0384]
    • US 9309502 B [0384]
    • US 9663820 B [0384]
    • US 8822673 B [0397, 0406]
    • US 8586718 B [0397, 0406]
    • US 20140378330 A [0397, 0406]
    • US 20140349295 A [0397, 0406]
    • US 20140194611 A [0397, 0406]
    • WO 200142505 [0397, 0406]
    • WO 200186001 A [0397, 0406]
    • US 20130323851 A [0406]
    • US 20130224871 A [0406]
    • US 20110223677 A [0406]
    • US 20110190486 A [0406]
    • US 20110172420 A [0406]
    • US 20060179585 A [0406]
    • US 20030003486 A [0406]
    • US 5451513 A [0416]
    • US 5545817 A [0416]
    • US 5545818 A [0416]
    • US 5576198 A [0416]
    • WO 9516783 A [0416]

    Claims (33)

    1. Zusammensetzung, die Folgendes umfasst: a) eine Nuklease, die eine einzelne RuvC-aktive Stelle umfasst, die sowohl ein DNA-Molekül spalten als auch crRNA binden kann; und b) eine Führungs-RNA.
    2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Nuklease eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 50 % identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 120 ist, und wobei die Aminosäuresequenz der Nuklease eine Asparaginsäure an Aminosäureposition 369, eine Glutaminsäure an Aminosäureposition 567 und eine Asparaginsäure an Aminosäureposition 658 umfasst.
    3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nuklease eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 60 %, zu mindestens 70 %, zu mindestens 80 %, zu mindestens 85 %, zu mindestens 90 %, zu mindestens 95 %, zu mindestens 97 %, zu mindestens 98 %, zu mindestens 99 %, oder zu 100 % identisch mit SEQ ID NO: 120 ist.
    4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Führungs-RNA eine Nukleobasensequenz umfasst, die zu mindestens 80 % mit SEQ ID NO: 15 oder 139 identisch ist.
    5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-4, die mindestens ein Kernlokalisierungssignal (NLS) umfasst, das an die Nuklease kondensiert ist.
    6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das mindestens eine NLS entweder mit dem Aminoterminus (N-Terminus) der Nuklease, dem Carboxylterminus (C-Terminus) der Nuklease oder beiden Termini der Nuklease verknüpft ist.
    7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei ein erstes NLS, das die in SEQ ID NO: 49 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, mit dem N-Terminus der Nuklease verknüpft ist und wobei ein zweites NLS, das die in SEQ ID NO: 50 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, mit dem C-Terminus der Nuklease verknüpft ist.
    8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 und 3-6, wobei die Nuklease eine Nickase oder eine katalytisch inaktive Nuklease ist.
    9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-8, die eine DNA-Donor-Matrize, eine zusätzliche Führungs-RNA oder eine Kombination davon umfasst.
    10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-9, die eines oder mehrere von einem Lipid, einem Liposom, einem Vektor oder einem Partikel umfasst.
    11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-10, die eines oder mehrere von einem Puffer, einem Nuklease-Inhibitor und einem Protease-Inhibitor umfasst.
    12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-11, die ein Reportermolekül umfasst.
    13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-12, die eine nachweisbare Markierung umfasst.
    14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-13, wobei das DNA-Molekül ein dem Protospacer benachbartes Motiv von TNN umfasst, wobei T für Thymin und N für ein beliebiges Nukleotid steht.
    15. Zelle, welche die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-14 umfasst.
    16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-14 zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit.
    17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-14, wobei die Zusammensetzung für die Gentherapie, die Produktion von genetisch modifizierten Organismen, die Produktion von Proteinen im großen Maßstab, die Diagnostik, die Induktion von iPS-Zellen oder die Deletion oder den Ersatz von pathogenen Genen ausgelegt ist.
    18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-14, die eine Tierzelle, eine prokaryotische Zelle, eine Archaeenzelle, eine Zelle eines einzelligen eukaryotischen Organismus, eine Protozoenzelle, eine Pilzzelle, eine eukaryotische Zelle oder eine Pflanzenzelle umfasst.
    19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die tierische Zelle aus einer Krebszelle, einer Stammzelle, einer Nagetierzelle, einer HEK293-Zelle, einer Immunzelle, einer T-Zelle, einer Primatenzelle und einer menschlichen Zelle ausgewählt ist.
    20. Fusionspolypeptid, das Folgendes umfasst: eine Nuklease, die an ein heterologes Polypeptid kondensiert ist, wobei die Nuklease eine einzelne RuvC-aktive Stelle umfasst, die sowohl ein DNA-Molekül spalten als auch crRNA binden kann.
    21. Fusionspolypeptid nach Anspruch 20, wobei die Nuklease eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 50 % identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 120 ist, und wobei die Aminosäuresequenz der Nuklease eine Asparaginsäure an Aminosäureposition 369, eine Glutaminsäure an Aminosäureposition 567 und eine Asparaginsäure an Aminosäureposition 658 umfasst.
    22. Fusionspolypeptid nach Anspruch 20 oder 21, wobei die Nuklease eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 60 %, zu mindestens 70 %, zu mindestens 80 %, zu mindestens 85 %, zu mindestens 90 %, zu mindestens 95 %, zu mindestens 97 %, zu mindestens 98 %, zu mindestens 99 %, oder zu 100 % identisch mit SEQ ID NO: 120 ist.
    23. Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 20-22 zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit.
    24. Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 20-23, wobei das Fusionspolypeptid eine nachweisbare Markierung umfasst.
    25. Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 20-24, wobei das DNA-Molekül ein dem Protospacer benachbartes Motiv von TTN umfasst, wobei T für Thymin und N für ein beliebiges Nukleotid steht.
    26. Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 20-25, das mindestens ein Kernlokalisierungssignal (NLS) umfasst, das mit der Nuklease verknüpft ist.
    27. Fusionspolypeptid nach Anspruch 26, wobei das mindestens eine NLS entweder mit dem Aminoterminus (N-Terminus) der Nuklease, dem Carboxylterminus (C-Terminus) der Nuklease oder beiden Termini der Nuklease verknüpft ist.
    28. Fusionspolypeptid nach Anspruch 27, wobei ein erstes NLS, das die in SEQ ID NO: 49 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, mit dem N-Terminus der Nuklease verknüpft ist und wobei ein zweites NLS, das die in SEQ ID NO: 50 angegebene Aminosäuresequenz umfasst, mit dem C-Terminus der Nuklease verknüpft ist.
    29. Nukleinsäure, die eine Nukleobasensequenz umfasst, die das Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 20-28 kodiert.
    30. Nukleinsäure nach Anspruch 29, wobei die Nukleinsäure ein rekombinanter Adeno-assoziierter viraler Vektor, ein rekombinanter retroviraler Vektor oder ein rekombinanter lentiviraler Vektor ist.
    31. Zelle, die das Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 20-28 umfasst.
    32. Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 20-28, wobei das Fusionspolypeptid für die Gentherapie, die Produktion von genetisch modifizierten Organismen, die Produktion von Proteinen im großen Maßstab, die Diagnostik, die Induktion von iPS-Zellen oder die Deletion oder den Ersatz von pathogenen Genen ausgelegt ist.
    33. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Fusionspolypeptid nach Anspruch 20, wobei die Nuklease eine Länge von mindestens etwa 700 Aminosäuren bis etwa 740 Aminosäuren aufweist.
    DE212020000516.8U 2019-03-07 2020-03-05 CRISPR-CAS-Effektorpolypeptide Active DE212020000516U1 (de)

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    WO (1) WO2020181101A1 (de)

    Families Citing this family (64)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    WO2016057961A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
    EP3444347A1 (de) * 2017-08-18 2019-02-20 Universität Heidelberg Verwendung von anti-crispr-polypeptiden zur spezifische aktivierung von gasnukleasen
    HUE063005T2 (hu) 2018-03-14 2023-12-28 Arbor Biotechnologies Inc Új CRISPR DNS-célzó enzimek és rendszerek
    AU2019236211B2 (en) 2018-03-14 2025-05-15 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel CRISPR DNA and RNA targeting enzymes and systems
    WO2019222555A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr-associated systems and components
    WO2020006423A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Editas Medicine, Inc. Synthetic guide molecules, compositions and methods relating thereto
    EP4442836A3 (de) 2018-08-01 2024-12-18 Mammoth Biosciences, Inc. Programmierbare nukleasezusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
    IL283169B1 (en) * 2018-11-15 2025-06-01 Univ China Agricultural Crispr-cas12j enzyme and system
    CA3130789A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
    JP2022536364A (ja) 2019-06-13 2022-08-15 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 操作されたヒト内在性ウイルス様粒子および細胞への送達のためのその使用方法
    WO2021007563A1 (en) * 2019-07-11 2021-01-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna targeting enzymes and systems
    WO2021216512A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 The Regents Of The University Of California Crispr systems in plants
    JP2023529151A (ja) * 2020-06-03 2023-07-07 マンモス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド プログラム可能なヌクレアーゼ及び使用方法
    AU2021310950A1 (en) 2020-07-24 2023-02-16 President And Fellows Of Harvard College Enhanced virus-like particles and methods of use thereof for delivery to cells
    IL301396A (en) 2020-09-30 2023-05-01 Nobell Foods Inc Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
    US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
    US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
    JP7749315B2 (ja) * 2020-11-27 2025-10-06 キヤノン株式会社 標的核酸の検出方法、及びキット
    WO2022140572A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Mammoth Biosciences, Inc. Compositions and methods of using programmable nucleases for inducing cell death
    WO2022150367A1 (en) * 2021-01-05 2022-07-14 Horizon Discovery Ltd. Guide rna designs and complexes for tracr-less type v cas systems
    US20240102032A1 (en) * 2021-01-25 2024-03-28 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
    CN113373130B (zh) * 2021-05-31 2023-12-22 复旦大学 Cas12蛋白、含有Cas12蛋白的基因编辑系统及应用
    JP2024520528A (ja) 2021-06-01 2024-05-24 アーバー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼを含む遺伝子編集システム及びそれらの使用
    WO2023283622A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Montana State University Crispr-based programmable rna editing
    US11814689B2 (en) 2021-07-21 2023-11-14 Montana State University Nucleic acid detection using type III CRISPR complex
    CN113862394B (zh) * 2021-08-12 2023-10-03 北京农业生物技术研究中心 一种番茄不孕病毒的rpa检测方法
    WO2023028254A2 (en) * 2021-08-25 2023-03-02 Vanderbilt University Nucleotides comprising casphi modified for nuclear targeting
    WO2023039373A2 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and method of use thereof
    CN113717962B (zh) * 2021-09-10 2024-08-06 武汉艾迪晶生物科技有限公司 用于水稻基因编辑的CasΦ-2蛋白及其表达盒子和表达载体
    WO2023064923A2 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Mammoth Biosciences, Inc. Fusion effector proteins and uses thereof
    CN114438055B (zh) * 2021-10-26 2022-08-26 山东舜丰生物科技有限公司 新型的crispr酶和系统以及应用
    WO2023086938A2 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 Arbor Biotechnologies, Inc. Type v nucleases
    CN114480324B (zh) * 2022-01-13 2023-04-11 东北农业大学 一种可提高植物耐盐性的蛋白GsMYST1及其相关生物材料与应用
    KR20240152394A (ko) * 2022-03-01 2024-10-21 에피크리스피알 바이오테크놀로지스, 인크. 조작된 뉴클레아제, 그의 조성물 및 사용 방법
    WO2023173105A2 (en) * 2022-03-10 2023-09-14 Saliogen Therapeutics, Inc. Tetracycline inducer/repressor system and simplified viral particle production
    CN117460822B (zh) * 2022-04-25 2024-08-02 辉大基因治疗(新加坡)私人有限公司 新型CRISPR-Cas12i系统及其用途
    EP4522737A2 (de) * 2022-05-09 2025-03-19 Mammoth Biosciences, Inc. Manipulierte cas-phi-proteine und verwendungen davon
    WO2023250325A1 (en) * 2022-06-21 2023-12-28 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating huntington's disease
    EP4544045A2 (de) * 2022-06-21 2025-04-30 The Regents of the University of California Zusammensetzungen und verfahren zur reduzierung des rna-spiegels
    WO2024041299A1 (zh) * 2022-08-25 2024-02-29 山东舜丰生物科技有限公司 突变的CRISPR-Cas蛋白及其应用
    WO2024047587A1 (en) * 2022-08-31 2024-03-07 Regel Therapeutics, Inc. Cas-phi compositions and methods of use
    WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
    WO2024086845A2 (en) * 2022-10-21 2024-04-25 The General Hospital Corporation Engineered casphi2 nucleases
    EP4622662A1 (de) 2022-11-23 2025-10-01 Amber Bio Inc. Genmodifizierende endonukleasen
    WO2024138033A2 (en) * 2022-12-21 2024-06-27 Nvelop Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acid editors
    TW202440938A (zh) 2023-02-15 2024-10-16 美商喬木生物技術公司 用於抑制微管解聚蛋白2(stmn2)轉錄物中異常剪接的基因編輯方法
    WO2024192291A1 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Renagade Therapeutics Management Inc. Delivery of gene editing systems and methods of use thereof
    WO2024220911A1 (en) * 2023-04-20 2024-10-24 Mammoth Biosciences, Inc. Effector proteins, compositions, systems and methods of use thereof
    US20240382622A1 (en) 2023-05-15 2024-11-21 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
    WO2024254550A1 (en) * 2023-06-07 2024-12-12 Nvelop Therapeutics, Inc. Compositions and methods for promoting payload delivery in cells
    CN118421833A (zh) * 2023-08-18 2024-08-02 福建师范大学 基于CRISPR/Cas12j2的免标记可视化检测猴痘病毒的试剂盒及方法
    WO2025043098A2 (en) * 2023-08-23 2025-02-27 Vedabio, Inc. Rapid detection of known and emerging influenza viruses
    WO2025049959A2 (en) 2023-09-01 2025-03-06 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing systems, compositions, and methods for treatment of vexas syndrome
    WO2025059543A1 (en) * 2023-09-13 2025-03-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Editing systems and components and uses thereof
    CN117512071B (zh) * 2023-09-15 2024-06-04 湖北大学 一种耐高温TnpB蛋白及其在核酸检测中的应用
    CN117384883B (zh) * 2023-09-27 2024-10-01 微光基因(苏州)有限公司 CRISPR-Cas系统及其应用
    WO2025108148A1 (zh) * 2023-11-24 2025-05-30 山东舜丰生物科技有限公司 一种活性改善的cas蛋白及其应用
    WO2025166125A1 (en) * 2024-02-02 2025-08-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Engineered crispr-cas12 systems for genome editing
    WO2025171014A1 (en) * 2024-02-05 2025-08-14 The General Hospital Corporation Use of u6 snrna-derived sequences to enhance activities of guide rnas
    WO2025171041A1 (en) * 2024-02-05 2025-08-14 The General Hospital Corporation Engineered casphi2 (cas12j-2) proteins
    WO2025171210A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for gene editing via homology-mediated end joining
    WO2025174765A1 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
    WO2025179057A1 (en) * 2024-02-21 2025-08-28 The Regents Of The University Of California In vivo modification of cell genomes
    CN118931878B (zh) * 2024-10-14 2025-02-07 内蒙古大学 一种基于CRISPR/dCas9的表观遗传基因编辑系统及其应用

    Citations (122)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
    US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
    US5159135A (en) 1986-12-03 1992-10-27 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
    US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
    WO1993003769A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
    WO1993009239A1 (en) 1991-11-08 1993-05-13 Research Corporation Technologies, Inc. Adeno-associated virus-2 basal vectors
    WO1993019191A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-30 Centre National De La Recherche Scientifique Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines pour traitement antitumoral
    WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
    US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
    US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
    US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
    WO1994028938A1 (en) 1993-06-07 1994-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy sponsorship
    US5378619A (en) 1989-10-31 1995-01-03 Monsanto Company Promoter for transgenic plants
    WO1995000655A1 (en) 1993-06-24 1995-01-05 Mc Master University Adenovirus vectors for gene therapy
    WO1995011984A2 (en) 1993-10-25 1995-05-04 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
    WO1995016783A1 (en) 1993-12-14 1995-06-22 Calgene Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
    US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
    US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
    US5538880A (en) 1990-01-22 1996-07-23 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
    US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
    US5545817A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
    US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
    US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
    US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
    US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
    US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
    WO1997041228A2 (en) 1996-05-01 1997-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of the green fluorescent protein as a screenable marker for plant transformation
    US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
    US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
    US5736396A (en) 1995-01-24 1998-04-07 Case Western Reserve University Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation
    US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
    WO1998039352A1 (fr) 1997-03-07 1998-09-11 Takeshi Imanishi Nouveaux analogues de bicyclonucleoside et d'oligonucleotide
    US5824877A (en) 1988-07-22 1998-10-20 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
    US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
    US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
    US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
    WO1999014226A2 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Exiqon A/S Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues
    WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
    US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
    US6140078A (en) 1996-09-05 2000-10-31 Unilever Patent Holdings Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
    US6153812A (en) 1994-10-26 2000-11-28 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic wheat plants
    US6160208A (en) 1990-01-22 2000-12-12 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic corn plants
    US6175060B1 (en) 1997-02-24 2001-01-16 Performance Plants, Inc. Phosphate-deficiency inducible promoter
    US6177611B1 (en) 1998-02-26 2001-01-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize promoters
    US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
    WO2001042505A2 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
    US6252138B1 (en) 1997-01-20 2001-06-26 Plant Genetic Systems, N.V. Pathogen-induced plant promoters
    WO2001051616A2 (en) 2000-01-11 2001-07-19 Geron Corporation Techniques for growth and differentiation of human pluripotent stem cells
    US6294714B1 (en) 1998-07-16 2001-09-25 Nippon Paper Industries Co., Ltd. Method for introducing a gene into a plant using an adventitious bud redifferentiation gene under the control of a light-inducible promoter as a selectable marker gene, and vector for introducing a gene into a plant using the same
    WO2001086001A1 (en) 2000-05-09 2001-11-15 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
    US6384301B1 (en) 1999-01-14 2002-05-07 Monsanto Technology Llc Soybean agrobacterium transformation method
    US6399861B1 (en) 1990-04-17 2002-06-04 Dekalb Genetics Corp. Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
    US20020086998A1 (en) 2000-10-04 2002-07-04 Troels Koch Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
    US20020094555A1 (en) 1999-04-21 2002-07-18 Belotserkovskii Boris P. Locked nucleic acid hybrids and methods of use
    US6426446B1 (en) 1999-05-14 2002-07-30 Dekalb Genetics Corporation Maize RS324 promoter and methods for use thereof
    US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
    US6429362B1 (en) 1998-02-26 2002-08-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize PR-1 gene promoters
    US6433252B1 (en) 1998-05-18 2002-08-13 Dekalb Genetics Corporation Maize L3 oleosin promoter
    US6437217B1 (en) 1999-05-14 2002-08-20 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
    US20030003486A1 (en) 1999-11-16 2003-01-02 Atto-Tec Gmbh Dye-labeled oligonucleotide for labeling a nucleic acid molecule
    US20030022831A1 (en) 1999-08-24 2003-01-30 Cellgate, Inc., A Delaware Corporation Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
    US20030032593A1 (en) 2001-02-16 2003-02-13 Cellgate, Inc. Transporters comprising spaced arginine moieties
    WO2003020920A1 (en) 2001-09-05 2003-03-13 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
    US20030083256A1 (en) 1999-08-24 2003-05-01 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
    US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
    US20030220334A1 (en) 1999-11-30 2003-11-27 Wender Paul A. Byrostatin analogues, synthetic methods and uses
    US20040014959A1 (en) 2002-05-08 2004-01-22 Sorensen Mads Detlef Synthesis of locked nucleic acid derivatives
    WO2004067736A2 (en) 2003-01-28 2004-08-12 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
    US7022896B1 (en) 1997-04-04 2006-04-04 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
    US20060117410A1 (en) 2001-06-12 2006-06-01 Goff Stephen A Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
    US20060179585A1 (en) 2003-07-02 2006-08-17 Atto-Tec Gmbh Sulfonamide derviatives of polycyclic dyes used for analytical applications
    US7153684B1 (en) 1992-10-08 2006-12-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
    US20090029861A1 (en) 2007-02-26 2009-01-29 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of dmo and uses thereof
    US20090041809A1 (en) 2007-03-07 2009-02-12 Nventa Biopharmaceuticals Corporation Double-stranded locked nucleic acid compositions
    US20090047263A1 (en) 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
    US20090068742A1 (en) 2005-12-13 2009-03-12 Shinya Yamanaka Nuclear Reprogramming Factor
    US20090191159A1 (en) 2007-06-15 2009-07-30 Kazuhiro Sakurada Multipotent/pluripotent cells and methods
    US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
    US20090246875A1 (en) 2007-12-10 2009-10-01 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
    WO2010075303A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Splicing factors with a puf protein rna-binding domain and a splicing effector domain and uses of same
    US20110223677A1 (en) 2002-12-18 2011-09-15 Atto-Tec Gmbh Carboxamide-substituted dyes for analytical applications
    US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
    US20110293703A1 (en) 2008-11-07 2011-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
    WO2012068627A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 The University Of Western Australia Peptides for the specific binding of rna targets
    US20130224871A1 (en) 2010-10-19 2013-08-29 Atto-Tec Gmbh Novel Amine-Substituted Tricyclic Fluorescent Dyes
    US20130245107A1 (en) 2011-12-16 2013-09-19 modeRNA Therapeutics Dlin-mc3-dma lipid nanoparticle delivery of modified polynucleotides
    WO2013155555A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 The University Of Western Australia Peptides for the binding of nucleotide targets
    US8586718B2 (en) 2004-09-14 2013-11-19 Applied Biosystems, Llc Multi-chromophoric quencher constructs for use in high sensitivity energy transfer probes
    US20140068797A1 (en) 2012-05-25 2014-03-06 University Of Vienna Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
    US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
    US20140179006A1 (en) 2012-12-12 2014-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
    US20140179770A1 (en) 2012-12-12 2014-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
    US20140186919A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US20140186958A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
    US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
    US20140194611A1 (en) 2008-04-01 2014-07-10 Biosearch Technologies, Inc. Stabilized nucleic acid dark quencher-fluorophore probes
    WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
    US20140234972A1 (en) 2012-12-12 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR-CAS Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
    US20140242702A1 (en) 2013-02-25 2014-08-28 Sigma Aldrich Co. Llc Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
    US20140242664A1 (en) 2012-12-12 2014-08-28 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
    US8822673B2 (en) 2002-02-27 2014-09-02 Life Technologies Corporation Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
    US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
    US20140273037A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to crispr/cas genomic engineering systems
    US20140273235A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
    US20140287938A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
    US20140295556A1 (en) 2013-03-15 2014-10-02 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to Increase Specificity for RNA-Guided Genome Editing
    US20140298547A1 (en) 2012-12-13 2014-10-02 Dow Agrosciences Llc Dna detection methods for site specific nuclease activity
    US20140304853A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
    US20140310828A1 (en) 2013-04-16 2014-10-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
    US20140315985A1 (en) 2013-03-14 2014-10-23 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
    US20140335063A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
    US20140342456A1 (en) 2012-12-17 2014-11-20 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Human Genome Engineering
    US20140349295A1 (en) 2011-10-31 2014-11-27 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method for detecting target nucleic acid
    US20140349405A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
    US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
    US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
    US20140357530A1 (en) 2012-12-12 2014-12-04 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
    US20140357523A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic dna using cas9
    US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
    US20140377868A1 (en) 2013-03-15 2014-12-25 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
    US20140378330A1 (en) 2009-10-30 2014-12-25 Life Technologies Corporation Multi-primer Assay for Mycoplasma Detection
    US9757089B2 (en) 2013-07-31 2017-09-12 Siemens Aktiengesellschaft Rotating unit with a device for wireless data transmission between two parts movable relative to one another, and method for wireless data transmission between two parts movable relative to one another

    Family Cites Families (28)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
    CA2977152C (en) 2012-12-06 2019-04-09 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr-based genome modification and regulation
    WO2015033343A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for expressing recombinant polypeptides
    EP3597740B1 (de) * 2014-11-06 2022-03-23 DuPont US Holding, LLC Peptidvermittelte freisetzung von rna-geführter endonuklease in zellen
    AU2016308339A1 (en) * 2015-08-18 2018-04-12 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
    EP3352795B1 (de) 2015-09-21 2020-08-12 The Regents of The University of California Zusammensetzungen und verfahren zur zielnukleinsäuremodifikation
    CN108463227A (zh) * 2015-11-04 2018-08-28 宾夕法尼亚大学董事会 在造血干细胞中基因编辑的方法和组合物
    EP3374494A4 (de) * 2015-11-11 2019-05-01 Coda Biotherapeutics, Inc. Crispr-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon zur gentherapie
    AU2016380351B2 (en) * 2015-12-29 2023-04-06 Monsanto Technology Llc Novel CRISPR-associated transposases and uses thereof
    AU2017207281B2 (en) * 2016-01-11 2022-03-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of immunotherapy
    US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
    KR20190072548A (ko) 2016-09-30 2019-06-25 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Rna-가이드된 핵산 변형 효소 및 이의 사용 방법
    WO2018064371A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 The Regents Of The University Of California Rna-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
    SG11201906297QA (en) * 2017-03-24 2019-10-30 Curevac Ag Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
    ES2992912T3 (en) * 2017-04-21 2024-12-19 Massachusetts Gen Hospital Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
    MX2019013514A (es) * 2017-05-12 2020-01-20 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para modificar celulas por ingenieria genetica y usos de los mismos en inmunooncologia.
    US20200115688A1 (en) * 2017-08-15 2020-04-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhancing genome editing
    MX2020004578A (es) 2017-11-01 2020-12-03 Univ California Composiciones de casz y metodos de uso.
    US10253365B1 (en) 2017-11-22 2019-04-09 The Regents Of The University Of California Type V CRISPR/Cas effector proteins for cleaving ssDNAs and detecting target DNAs
    SG11202007382TA (en) 2018-02-15 2020-08-28 Sigma Aldrich Co Llc Engineered cas9 systems for eukaryotic genome modification
    CN112105728B (zh) * 2018-05-07 2023-01-10 中国农业大学 CRISPR/Cas效应蛋白及系统
    WO2019222555A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr-associated systems and components
    IL283169B1 (en) * 2018-11-15 2025-06-01 Univ China Agricultural Crispr-cas12j enzyme and system
    AU2019406778A1 (en) 2018-12-17 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
    CA3130789A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
    US20230078265A1 (en) * 2019-03-19 2023-03-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
    WO2021007563A1 (en) * 2019-07-11 2021-01-14 Arbor Biotechnologies, Inc. Novel crispr dna targeting enzymes and systems
    WO2021081200A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 Inari Agriculture, Inc. Genomic alteration of plant germline

    Patent Citations (169)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
    US5530196A (en) 1983-01-17 1996-06-25 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
    US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
    US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
    US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
    US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
    US5463174A (en) 1986-05-29 1995-10-31 Calgene Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
    US5159135A (en) 1986-12-03 1992-10-27 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
    US5159135B1 (en) 1986-12-03 2000-10-24 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
    US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
    US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
    US5824877A (en) 1988-07-22 1998-10-20 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
    US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
    US5378619A (en) 1989-10-31 1995-01-03 Monsanto Company Promoter for transgenic plants
    US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
    US6160208A (en) 1990-01-22 2000-12-12 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic corn plants
    US5538880A (en) 1990-01-22 1996-07-23 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
    US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
    US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
    US6399861B1 (en) 1990-04-17 2002-06-04 Dekalb Genetics Corp. Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
    US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
    US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
    US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
    US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
    WO1993003769A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
    WO1993009239A1 (en) 1991-11-08 1993-05-13 Research Corporation Technologies, Inc. Adeno-associated virus-2 basal vectors
    WO1993019191A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-30 Centre National De La Recherche Scientifique Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines pour traitement antitumoral
    US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
    US7153684B1 (en) 1992-10-08 2006-12-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
    WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
    US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
    WO1994028938A1 (en) 1993-06-07 1994-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy sponsorship
    WO1995000655A1 (en) 1993-06-24 1995-01-05 Mc Master University Adenovirus vectors for gene therapy
    WO1995011984A2 (en) 1993-10-25 1995-05-04 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
    US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
    US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
    WO1995016783A1 (en) 1993-12-14 1995-06-22 Calgene Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
    US5545817A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
    US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
    US6153812A (en) 1994-10-26 2000-11-28 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic wheat plants
    US7029913B2 (en) 1995-01-20 2006-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
    US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
    US6200806B1 (en) 1995-01-20 2001-03-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
    US5736396A (en) 1995-01-24 1998-04-07 Case Western Reserve University Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation
    WO1997041228A2 (en) 1996-05-01 1997-11-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of the green fluorescent protein as a screenable marker for plant transformation
    US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
    US6140078A (en) 1996-09-05 2000-10-31 Unilever Patent Holdings Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
    US6252138B1 (en) 1997-01-20 2001-06-26 Plant Genetic Systems, N.V. Pathogen-induced plant promoters
    US6175060B1 (en) 1997-02-24 2001-01-16 Performance Plants, Inc. Phosphate-deficiency inducible promoter
    WO1998039352A1 (fr) 1997-03-07 1998-09-11 Takeshi Imanishi Nouveaux analogues de bicyclonucleoside et d'oligonucleotide
    US7022896B1 (en) 1997-04-04 2006-04-04 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
    WO1999014226A2 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Exiqon A/S Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues
    WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
    US6177611B1 (en) 1998-02-26 2001-01-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize promoters
    US6429362B1 (en) 1998-02-26 2002-08-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize PR-1 gene promoters
    US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
    US6433252B1 (en) 1998-05-18 2002-08-13 Dekalb Genetics Corporation Maize L3 oleosin promoter
    US6294714B1 (en) 1998-07-16 2001-09-25 Nippon Paper Industries Co., Ltd. Method for introducing a gene into a plant using an adventitious bud redifferentiation gene under the control of a light-inducible promoter as a selectable marker gene, and vector for introducing a gene into a plant using the same
    US6384301B1 (en) 1999-01-14 2002-05-07 Monsanto Technology Llc Soybean agrobacterium transformation method
    US20020094555A1 (en) 1999-04-21 2002-07-18 Belotserkovskii Boris P. Locked nucleic acid hybrids and methods of use
    US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
    US6426446B1 (en) 1999-05-14 2002-07-30 Dekalb Genetics Corporation Maize RS324 promoter and methods for use thereof
    US6437217B1 (en) 1999-05-14 2002-08-20 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
    US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
    US20030083256A1 (en) 1999-08-24 2003-05-01 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
    US20030022831A1 (en) 1999-08-24 2003-01-30 Cellgate, Inc., A Delaware Corporation Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues
    US20030003486A1 (en) 1999-11-16 2003-01-02 Atto-Tec Gmbh Dye-labeled oligonucleotide for labeling a nucleic acid molecule
    US20030220334A1 (en) 1999-11-30 2003-11-27 Wender Paul A. Byrostatin analogues, synthetic methods and uses
    WO2001042505A2 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Epoch Biosciences, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
    WO2001051616A2 (en) 2000-01-11 2001-07-19 Geron Corporation Techniques for growth and differentiation of human pluripotent stem cells
    WO2001086001A1 (en) 2000-05-09 2001-11-15 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
    US20020086998A1 (en) 2000-10-04 2002-07-04 Troels Koch Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
    US20030032593A1 (en) 2001-02-16 2003-02-13 Cellgate, Inc. Transporters comprising spaced arginine moieties
    US20060117410A1 (en) 2001-06-12 2006-06-01 Goff Stephen A Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
    WO2003020920A1 (en) 2001-09-05 2003-03-13 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
    US9663820B2 (en) 2002-02-21 2017-05-30 Alere San Diego Inc. Recombinase polymerase amplification
    US8426134B2 (en) 2002-02-21 2013-04-23 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
    US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
    US8945845B2 (en) 2002-02-21 2015-02-03 Alere San Diego Inc. Recombinase polymerase amplification
    US9309502B2 (en) 2002-02-21 2016-04-12 Alere San Diego Inc. Recombinase polymerase amplification
    US8822673B2 (en) 2002-02-27 2014-09-02 Life Technologies Corporation Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
    US20100216983A1 (en) 2002-05-08 2010-08-26 SANTARIS PHARMA A/S, a Denmark corporation Synthesis of locked nucleic acid derivatives
    US20040014959A1 (en) 2002-05-08 2004-01-22 Sorensen Mads Detlef Synthesis of locked nucleic acid derivatives
    US20120165514A1 (en) 2002-05-08 2012-06-28 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
    US20110223677A1 (en) 2002-12-18 2011-09-15 Atto-Tec Gmbh Carboxamide-substituted dyes for analytical applications
    US20130323851A1 (en) 2002-12-18 2013-12-05 Atto-Tec Gmbh Carboxamide-substituted dyes for analytical applications
    WO2004067736A2 (en) 2003-01-28 2004-08-12 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
    US20060179585A1 (en) 2003-07-02 2006-08-17 Atto-Tec Gmbh Sulfonamide derviatives of polycyclic dyes used for analytical applications
    US20110172420A1 (en) 2003-07-02 2011-07-14 Atto-Tec Gmbh Sulfonamide derivatives of polycyclic dyes used for analytical applications
    US20110190486A1 (en) 2003-07-02 2011-08-04 Atto-Tec Gmbh Sulfonamide derivatives of polycyclic dyes used for analytical applications
    US8586718B2 (en) 2004-09-14 2013-11-19 Applied Biosystems, Llc Multi-chromophoric quencher constructs for use in high sensitivity energy transfer probes
    US20090068742A1 (en) 2005-12-13 2009-03-12 Shinya Yamanaka Nuclear Reprogramming Factor
    US20090047263A1 (en) 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
    US20090227032A1 (en) 2005-12-13 2009-09-10 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
    US20090029861A1 (en) 2007-02-26 2009-01-29 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of dmo and uses thereof
    US20090041809A1 (en) 2007-03-07 2009-02-12 Nventa Biopharmaceuticals Corporation Double-stranded locked nucleic acid compositions
    US20090304646A1 (en) 2007-06-15 2009-12-10 Kazuhiro Sakurada Multipotent/Pluripotent Cells and Methods
    US20090191159A1 (en) 2007-06-15 2009-07-30 Kazuhiro Sakurada Multipotent/pluripotent cells and methods
    US20090246875A1 (en) 2007-12-10 2009-10-01 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
    US20140194611A1 (en) 2008-04-01 2014-07-10 Biosearch Technologies, Inc. Stabilized nucleic acid dark quencher-fluorophore probes
    US20110293703A1 (en) 2008-11-07 2011-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
    WO2010075303A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Splicing factors with a puf protein rna-binding domain and a splicing effector domain and uses of same
    US20140378330A1 (en) 2009-10-30 2014-12-25 Life Technologies Corporation Multi-primer Assay for Mycoplasma Detection
    US20130224871A1 (en) 2010-10-19 2013-08-29 Atto-Tec Gmbh Novel Amine-Substituted Tricyclic Fluorescent Dyes
    WO2012068627A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 The University Of Western Australia Peptides for the specific binding of rna targets
    US20140349295A1 (en) 2011-10-31 2014-11-27 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method for detecting target nucleic acid
    US20130245107A1 (en) 2011-12-16 2013-09-19 modeRNA Therapeutics Dlin-mc3-dma lipid nanoparticle delivery of modified polynucleotides
    US20130244279A1 (en) 2011-12-16 2013-09-19 modeRNA Therapeutics Formulation and delivery of plga microspheres
    US20130252281A1 (en) 2011-12-16 2013-09-26 modeRNA Therapeutics Formulation and delivery of plga microspheres
    WO2013155555A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 The University Of Western Australia Peptides for the binding of nucleotide targets
    US20140068797A1 (en) 2012-05-25 2014-03-06 University Of Vienna Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
    US8895308B1 (en) 2012-12-12 2014-11-25 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US20140170753A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products
    US20140186843A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Massachusetts Institute Of Technology Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
    US8795965B2 (en) 2012-12-12 2014-08-05 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
    US8889418B2 (en) 2012-12-12 2014-11-18 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US20140227787A1 (en) 2012-12-12 2014-08-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products
    US20140234972A1 (en) 2012-12-12 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR-CAS Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
    US8889356B2 (en) 2012-12-12 2014-11-18 The Broad Institute Inc. CRISPR-Cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
    US20140242699A1 (en) 2012-12-12 2014-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
    US20140242664A1 (en) 2012-12-12 2014-08-28 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
    US20140242700A1 (en) 2012-12-12 2014-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US20140186958A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
    US20140248702A1 (en) 2012-12-12 2014-09-04 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
    US20140256046A1 (en) 2012-12-12 2014-09-11 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
    US8771945B1 (en) 2012-12-12 2014-07-08 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
    US20140273234A1 (en) 2012-12-12 2014-09-18 The Board Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
    US20140273232A1 (en) 2012-12-12 2014-09-18 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
    US20140273231A1 (en) 2012-12-12 2014-09-18 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
    US20140335620A1 (en) 2012-12-12 2014-11-13 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US20140179006A1 (en) 2012-12-12 2014-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
    US20140179770A1 (en) 2012-12-12 2014-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
    US8906616B2 (en) 2012-12-12 2014-12-09 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions for sequence manipulation
    US8871445B2 (en) 2012-12-12 2014-10-28 The Broad Institute Inc. CRISPR-Cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
    US20140357530A1 (en) 2012-12-12 2014-12-04 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
    US8865406B2 (en) 2012-12-12 2014-10-21 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US20140186919A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
    US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
    US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
    US20140298547A1 (en) 2012-12-13 2014-10-02 Dow Agrosciences Llc Dna detection methods for site specific nuclease activity
    US20140342457A1 (en) 2012-12-17 2014-11-20 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Human Genome Engineering
    US20140356958A1 (en) 2012-12-17 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Human Genome Engineering
    US20140342456A1 (en) 2012-12-17 2014-11-20 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Human Genome Engineering
    US20140342458A1 (en) 2012-12-17 2014-11-20 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Human Genome Engineering
    WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
    US20140242702A1 (en) 2013-02-25 2014-08-28 Sigma Aldrich Co. Llc Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
    US20140315985A1 (en) 2013-03-14 2014-10-23 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
    US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
    US20140295556A1 (en) 2013-03-15 2014-10-02 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to Increase Specificity for RNA-Guided Genome Editing
    US20140273037A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to crispr/cas genomic engineering systems
    US20140273235A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
    US20140273233A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
    US20140273226A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 System Biosciences, Llc Crispr/cas systems for genomic modification and gene modulation
    US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
    US20140377868A1 (en) 2013-03-15 2014-12-25 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
    US20140295557A1 (en) 2013-03-15 2014-10-02 The General Hospital Corporation Using Truncated Guide RNAs (tru-gRNAs) to Increase Specificity for RNA-Guided Genome Editing
    US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
    US20140287938A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
    US20140304853A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
    US20140310828A1 (en) 2013-04-16 2014-10-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
    US20140309487A1 (en) 2013-04-16 2014-10-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
    US20140335063A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
    US20140349405A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
    US20140356867A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using cas9
    US20140357523A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic dna using cas9
    US20140356959A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
    US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
    US9757089B2 (en) 2013-07-31 2017-09-12 Siemens Aktiengesellschaft Rotating unit with a device for wireless data transmission between two parts movable relative to one another, and method for wireless data transmission between two parts movable relative to one another

    Also Published As

    Publication number Publication date
    US11685909B2 (en) 2023-06-27
    CA3130789A1 (en) 2020-09-10
    GB2595606A (en) 2021-12-01
    JP7239725B2 (ja) 2023-03-14
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    US12312616B2 (en) 2025-05-27
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