DE2203884A1 - Verfahren zur gewinnung von leberwirksamen glykosiden aus picrorrhiza kurroa und diese verbindungen enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

• " Verfahren zur Gewinnung von leberwirkssmen Glykosiden aus Picrorrhiza kurroa und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel In Indien wird die Pflanze Picrorrhiza kurroa Royle ex Benth (Scrophulariaceae) medizinisch oft verwendet. Wie aus der Literatur hervorgeht, haben Abkochungen oder alkoholische Auszüge Wirksamkeit gegen Erkrankungen des Leber - Galle systems.
• So konnte V. N. Pandey (Dissertation Benares Hindu University, Varanasi 1966) die klinische Wirksamkeit des Extraktes aus den Wurzeln dieser Pflanze bei infektiöser Hepatitis mit Gelbsucht nachweisen. G.N. Charturvedi und R.H. Singh (Curr. Med. Pract., Bd. 9 (8), 1955, 5. 451) berichteten über eine- starke Wirkung von Abkochungen aus den Wurzeln der Pflanze bei gelbsüchtigen Albinoratten.
• Es ist bekannt, dass die Wurzeln und Wurzelstöcke von Picrorrhiza kurroa stark bitterschmeckende Ester-Glykoside in relativ grosser Menge enthalten. So beschrieben R.P.Rastogi et al. in J.Sci.Ind.Res., Sect. B, Bd.8 (1949), S. 173 und Bd. 18 (1959), ". 219 ein Glykosid, das sie Kutkin nannten und folgende Struktur vor K. Basu et al., Experentia, Bd. 26 (1970), S. 818 schlugen folgende Struktur für Kutkin vor Ein weiteres bitterschmeckendes Ester-Glykosid beschrieben J. Yosioka et al., Xetrahedron Letters 969, S. 3837, das sie als Picrosid I bezeichneten und folgende Struktur vorschlugen Picrosid I = Zimtsäureester des Catalpols Es wurde nun gefunden, dass es auf technisch leicht durchflrbare Weise gelingt, therapeutisch wertvolle Ester aus den Wurzeln und Wurzelstöcken von Picrorrhiza kurroa in wesentlich höherer Ausbeute anzureichern und zu isolieren. Dabei wurde ein neues, in grosser Menge vorkommendes Esterglykosid isoliert, das als Picrosid II bezeichnet wird.
• Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Geirjirinung von leberwirksamen GlyPosiden aus Picrorrhiza kurroa, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die getrocknete Droge in zerkleinertem Zustand mit einem wasserhaltigen organischen wassermischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 10 bis loooc extrahiert, den erhaltenen Extrakt 1 vom organischen Lösungsmittel befreit, den wasserhaltigen Rückstand mit einem lipophilen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 10 bis 700C extrahiert, die wässrige Phase mit etwa 15 bis 20 Gewichtsprozent Ammoniumsulfat versetzt und anschliessend mit einem organischen Iiösungsmittel extrahiert, das zwischen etwa 60 und 1100C siedet und in Wasser eine mässige Löslichkeit aufweist, den erhaltenen Extrakt II trocknet, unter vermindertem Druck zur Trockene eindampft, den Rückstand durch Gegenstromverteilung zwischen Wasser (obere Phase) und einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol (3 : 2) (untere Phase) reinigt und gegebenenfalls das in der wässrigen Phase vorliegende, im wesentlichen aus Picrosid I und II bestehende Produkt an Kieselgel oder Polydextrangel Sephadex OR LH 20 in seine Komponenten auftrennt.
• In der Praxis wird das erfindungsgemässe Verfahren so durchgefillirt, dass man die getrocknete Droge in gut zerkleinertem Zustand mit einem wasserhaltigen organischen wassermischbaren Lösungsmittel (Wassergehalt 10 bis 70 Volumprozent, vorzugsweise 30 bis 40 Volumprozent) bei einer Temperatur von 10 bis loooc extrahiert, den erhaltenen Extrakt 1 unter vermindertem oder normalem Druck vom organischen Lösungsmittel befreit und mit einem lipophilen, mit Wasser praktisch nicht mischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 10 bis 700C extrahiert. Vorzugsweise wird als Lösungsmittel für diesen Zweck ein halogenierter niederer aliphatischer Eohlenwasserstoff verwendet, z.B. Nethylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff oder Trichloräthylen. Trichloräthylen ist im Verfahren der Erfindung ein besonders geeignetes Lösungsmittel und wird daher bevorzugt.
• Die wässrige Phase wird nach der Extraktion mit dem lipophilen Lösungsmittel mit 15 bis 20 Gewichtsprozent smmoniumsulfat versetzt und anschliessend mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, das zwischen etwa 60 und 1100C siedet und im Wasser eine gewisse Löslichkeit aufweist. Geeignete Lösungsmittel sind: Butanon, n-Butanol und Isobutanol. Butanon, d.h. Methyläthylketon, eignet sich besonders gut. Der erhaltene Extrakt II wird nach dem Troclmen z.B. über wasserfreiem Natriumsulfat vorzugsweise unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von etwa 30 bis 700C getrocknet. Das so erhaltene rohe Glykosidgemisch, das in einer Ausbeute von 10 bis 15 Prozent auf eingesetztes Pflanzenmaterial anfällt, wird in der diese weiter gereinigt, dass eine Gegenstronwerteilung mit Wasser als Oberphase und Chloroform / Äthanol als Unterphase über 4 Stufen erfolgt. Die vereinigten Wasserphasen enthalten überwiegend Picrosid I und Picrosid II. Durch Filtration über Kieselgel oder Polydex-trangel Sephadex X LK 20 wird ein Produkt erhalten, das aus zwei chromatographie Stoffen besteht, aus dem Picrosid I und II. Die Dünnschicht-/ an DC Kieselgelplatten Fertigplatten Merck F254, Laufmittel Butanon 85, Äthanol 15, Entwickler Vanillin j Phosphorsäure, liefert 2 Flecken (Rf = 0,55 dunkelblau, Picrosid I und Rf 0,79 grüngelb, Picrosid II).
• Dieses Gemisch zeigt im pharmakologischen Test Leberschutzwirkung. Die Leberschutzwirkung mit dem gereinigten Glykosidgemisch wurde an männlichen Ratten, ca. 200 g schwer und 3 bis 6 Monate alt, geprüft. Zu diesem Zweck wurden die Tiere nach der Methode von O.H. Schwietzer und G. Schaetz (Pathologie, Diagnostik und Therapie der Bebererkrankungen, 4. Preiburger Sympos.
• 195G, Springer Verlag 1957) mit Thioacetamid vergiftet. Es wurden 4 Kollektive zu je 12 Ratten benutzt. 3 Gruppen erhielten mit der Nahrung täglich 35 mg Thioacetamid (TAA), die 4.Gruppe nur Futter. Eine der drei Gruppen erhielt zusätzlich zum TAA 100 mg gereinigtes Picrorrhiza-Glykosid-Gemisch und die 2.Gruppe täglich 100 mg Silymarin, von dem eine Leberschutzwirkung bekannt ist (vergl. DT-OS 1 963 318), + TAA.
• Der Versuch wurde über 100 Tage ausgeführt.
• Von der mit TAA vergifteten Gruppe waren nach 95 Tagen alle Tiere gestorben. Von der unbehandelten Gruppe waren 2 Tiere, von der Picrorrhiza + TAA-Gruppe 3 Tiere und von der mit Silymarin behandelten Gruppe 8 Tiere gestorben.
• mit Überlebensrate von/Thioacetamid vergifteten Ratten nach 100 Tagen: nicht vergiftet TAA + TAA + Picrorrhiza Silylmarin vergiftet 83,3 Prozent 75 Prozent 33 Prozent O Prozent Die Trennung der beiden Picroside kann nur chromatographisch erfolgen. Durch Chromatographieren an Kieselgel mit Chloroform / Äthanolgemischen oder an Polydextrangel Sephadex # LH 20 mit Aceton wird Picrosid II als bisher noch nicht in der Literatur beschriebene Substanz isoliert. Das Glykosid ist amorph. Die quantitative Analyse lieferte folgende Werte: C: 53,8 Prozent 5,5 Prozent NOCH: 6,1 Prozent.
• Das Ultrarotabsorptionsspektrum des Picrosids II in KBr ist in Fig. 1 wiedergegeben.
• Aus spektroskopischen Untersuchungen und Abbaureaktionen errechnet sich die Summenformel C2DH28°13 Beim Verseifen von Picrosid II mit wäßriger Bariumoxid-Lösung wird das Glykosid in Vanillinsäure und in das bekannte Catalpol gespalten (H.Schmidt et al. J.org.Chem. 31 (1966), S. 500). Somit ist die neue Substanz ein Vanillinsäureester des Catalpols.
• Weitere physikalische Eigenschaften von Picrosid II: [α]D20 = ~ 1790 + 20 (Methanol; c = 2) Dunnschichtchromatographie: (Adsorbens Si02 GF) Butanon / Äthanol 85 + 15 Rf = 0,39 Chloroform / Methanol 4 + 1 Rf = 0,15 Die Substanz zeichnet sich durch eine gute Leberschutz- und choleretische Wirkung aus.
• Die Leberschutzwirkung wurde an weißen Mäusen geprüft. Dazu wurden 4 Gruppen von jeweils 20 weißen Mäusen benützt. Bei 3 Gruppen wurde durch einmalige orale Verabreichung von 0,02 ml/g Tetrachlorkohlenstoff in Olivenöl eine Leberscnädigung hervorgerufen. Die 4. Gruppe erhielt nur Ölivenöl und diente als Kontroll-Gruppe. Dann wurde den Tieren der ersten vergifteten Gruppe 5-tägig jeweils 0,5 mg von Picrosid II in 0,1 ml Gummiarabicum-Schleim pro 10 g Körpergewicht oral verabreicht. Die Tiere der zweiten vergifteten Gruppe erhielten 2 mg des in der deutschen / Offenlegungsschrift 1 963 318 beschriebenen Na-Salzes des bekannten Silybinbernsteinsäurehalbesters unter den gleichen Bedingungen. Die beiden Leergruppen erhielten 5-tägig 0,1 ml Gummiarabicum-Schleim pro 10 O g Körpergewicht. Danach wurde die Leberschädigung durch die Bromsulphalein-Ausscheidung (BSP) ermittelt.
• BSP Kontrollgruppe 1,8 CCl4 vergiftete Gruppe ohne Behandlung 6,7 CCl4 vergiftete Gruppe + 0,5 mg Picrosid II 2,0 CCl4 vergiftete Gruppe + 2 mg Na-Salz 3,0 des Silybinbernsteinsäurehalbesters Cholereseversuche an Ratten beiderlei Geschlechts nach der im Praktikum der Pharmakologie und Toxikologie von A.Grish, VEB Gustav Fischer-Verlag Jena 1969, S. 310 beschriebenen Methode brachten eine starke Zunahme der Gallenabsonderung der mit Picrosid II behandelten Tiere. 2 mg Picrosid entsprechen der Wirkung von 1 mg Natriumsalz der Dehydrocholsäure.
• Wegen ihrer sehr guten Leberschutz- und gallentreibenden Wirkung eignet sich Picrosid II oder das Gemisch mit Picrosid I allgemein zur Behandlung von Lebererkrankungen, besonders solcher, die mit einer ungenügenden Gallenproduktion einhergehen.
• Die Applikation kann oral oder intravenös erfolgen, wobei die Dosierung je nach Gewicht des Patienten etwa 15 bis 50 mg beträgt.
• Zur oralen Verabreichung kommen insbesondere Tabletten oder Dragees in Betracht, die den Wirkstoff in einer Menge von 10 bis 50 mg pro Verabreichungsdosis neben den HilSs- und Trägerstoffen, wie Talkum, Stärke, Milchzucker usw., enthalten. Zweckmäßig wird diese Form gegen den Angriff der Magensalzsäure mit den üblichen Methoden magensaftresistent gemacht.
• Zyr i.v. Applikation verwendet man vorzugsweise Lösungen der Substanz in Wasser unter Zusatz von Lösungsmitteln wie Äthanol oder Propylenglykol.
• Beispiel 1 18,5 kg gemahlene Picrorrhiza Droge wurden mit 18,5 Liter Wasser befeuchtet und in einen Percolator gefüllt. Nach 3 Stunden wurde mit 150 Liter 70prozentigem Aceton (v/v) percoliert und das Percolat kontinuierlich unter vermindertem Druck bei 300C eingeengt. Nach Beendigung der Percolation wurden 56 kg Extrakt erhalten, der durch Ausschütteln mit 3 mal e 10 Liter Trichloräthylen von lipophilen Stoffen befreit wurde. Die.verbleibende wäßrige Phase wurde mit 15 kg Ammoniumsulfat und 20 Liter -vollständig Butanon versetzt und solange geruhrt, bis das Ammoniumsulfat/ gelöst war. Es bildeten sich zwei Schichten, die getrennt wurden. Die untere wäßrige Phase wurde noch 2 mal mit je 20 Liter Butanon ausgerührt und jedesmal getrennt. Die vereinigten Butanonphasen wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der verbleibende pulverförmige Rückstand wurde bei 30 bis 400C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Es wurden 2,75 kg roher Glykosid-Extrakt erhalten.
• Der Extrakt zeigte im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgelplatten Fertigplatten "MerckB, Laufmittel Butanon / Äthanol (85 : 15), Entwickler Vanillin / Phosphorsäure, 5 Flecke mit 2 Hauptflecken.-bei Rf 0,55 und 0,39.
• B e i s p.i e 1 2 200 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten Extraktes wurden der Gegenstromverteilung zwischen zwei Phasen, obere Phase Wasser, untere Phase Chloroform / Äthanol (3 : 2), unterworfen. Die Verteilung wurde in 4 Schütteltrichtern mit je 750 ml oberer und unterer Phase durchgeführt. Es zeigte sich, daß in den 4 oberen Phasen besonders die Picroside I und II angereichert waren. Deshalb wurden die oberen Phasen vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
• Rückstand 175 g.
• Zweckmäßiger ist es, wenn man die vereinigten oberen Phasen mit 600 g (NE4)2S04 und 1,5 Liter Butanon versetzt und solange rührt, bis sich das Salz aufgelöst hat. Es bilden sich 2 Schichten, die getrennt werden. Die untere wäßrige Phase wird noch 1 mal mit 1 Liter Butanon ausgerührt und getrennt. Die vereinigten Butanonphasen werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der verbleibende, pulverförmige Rückstand wird bei 300 bis 400C im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
• Es werden 170 g rohes Gemisch (Picrosid I und II enthaltend) erhalten.
• DC Kieselgel Fertigplatten "Merok", Laufmittel Butanon/ Äthanol (85 : 15), Entwickler Schwefelsäure, 2 Flecke mit Rf 0,55 und 0,32 neben wenig anderen Substanzen.
• Beispiel 3 100 g Polydextrangel Sephadex # LH 20 wurden mit 500 ml Aceton im Erlenmeyerkolben unter Umschwenken angeschlämmt, 3 Stunden quellen gelassen und daim in eine Säule von 500 mm Höhe und 35 mm Durchmesser gegeben. Nach dem Abtropfen des überstehenden Acetons wurden 20 g des gemäß Beispiel 2 gewonnenen Picrosid-Gemisches in wenig Aceton gelöst und auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgte mit 2 Liter Aceton. Nach dem Abtrennen der ersten 100 ml wurden 1,5 Liter aufgefangen, unter vermindertem Druck eingeengt und im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Der gelbe Schaum wurde gepulvert und wog 12 g. Da s Das Dünnschichtchroniagramm zeigte, wie im Beispiel 2 beschrieben, die beiden Picroside.
• Beispiel 4 500 g Kieselgel, Korngröße 0,05 bis 0,2 mm, wurden mit Aceton in einem Erlenmeyerkolben unter Umschwenken ausgeschlämmt, dann in eine Säule von 700 mm Höhe und 60 mm Durchmesser gegeben und mit 500 ml Aceton gewaschen. 100 g des nach Beispiel 2 gewonnenen Picrosidgemisches wurden unter Erwärmen in 300 ml Aceton gelöst und auf die Säule gegeben. Nach dem Einziehen erfolgte die Elution mit 3 Liter Aceton, ohne zu fraktionieren. Das gesamte Eluat wurde winter vermindertem Druck zur Trockene gebracht und im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Der resultierende gelbe Schaum wurde getrocknet und wog 75 g.
• Das Dünnschichtchromatogramm war mit dem in Beispiel 3 erhaltenen identisch.
• Beispiel 5 20 g der gemäß Beispiel 2 gewonnenen Picrosidglycoside wurden in wenig Methanol in einem Rundkolben gelöst und mit 10 g Kieselgel (Korngröße 0,05 - 0,2 mm)versetzt Die Mischung wurde anschließend im Rotationsverdampfer bei 30 bis 40° getrocknet.
• Der Rückstand wurde auf eine Säule von 300 g Kieselgel (Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) gegeben, die durch Einschlammen des Adsorbens mit Chloroform / Methanol 98 + 2 bereitet worden war.
• Es wurde mit Chloroform / Methanol 9 + 1 eluiert, und am Fraktionssammler wurden Fraktionen von 10 ml aufgefangen. Durch DC -Kontrolle, wie im Beispiel 2 beschrieben, wurde in den Fraktionen 175 bis 211 reines Picrosid II nachgewiesen. Die vereinigten Fraktionen hinterließen nach dem Einengen unter verminderten Druck 4,6 g Picrosid II.
• Beispiel 6 5 g des in Beispiel 7 beschriebenen Glykosidgemisches wurden in wenig Aceton gelöst und auf eine Säule von 350 g Kieselgel (Korngröße 0,05 bis 0,2 mm) gegeben und am Fraktionssammler mit Aceton chromatographiert. Die Aufarbeitung erfolgte wie im Beispiel 5.
• Es wurden 2,3 g reines Picrosid II erhalten.
• Beispiel 7 6 g des im Beispiel 3 beschriebenen Picrosidgemisches wurden in wenig Aceton gelöst und auf eine Säule, die aus 200 g Polydextrangel Sephadex LH ph 20 mit Aceton bereitet worden war, gegeben. Durch Chromatographieren am Fraktionssammler wurden 4 g Picrosid II gewonnen.

Claims (4)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von leberwirksamen Glykosiden aus Picrorrhiza kurroa, da d u r c h g e k- e,n n z e i c h -n e t, daß man die getrocknete Droge in zerkleinertem Zustand mit einem wasserhaltigen organischen wassermischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 10 bis 1000C extrahiert, den erhaltenen Extrakt (I) vom organischen Lösungsmittel befreit, den wasserhaltigen Rückstand mit einem lipophilen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 10 bis 700C extrahiert, die wäßrige Phase mit etwa 15 bis 20 Gewichtsprozent Ammoniumsulfat versetzt und anschließend mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, das zwischen etwa 60 und 1100C siedet und in Wasser eine mäßige Löslichkeit aufweist, den erhaltenen Extrakt (11) trocknet, unter vermindertem Druck zur Trockene eindampft, den Rückstand durch Gegenstromverteilung zwischen Wasser und einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol (3: 2) reinigt, und gegebenenfalls das in der wäßrigen Phase vorliegende, in wesentlichem aus Picrosid I und II bestehende Produkt an Kieselgel oder Polydextrangel Sephadex Zu I.H 20 in seine Komponenten auftrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, daß man die wäßrige, 15 bis 20 Gewichtsprozent Ammoniumsulfat enthaltende Phase mit Butanon, n-Butanol oder Isobutanol extrahiert.

3. Picrosid II, ein Vanillinsäureester des Catalpols der Summenformel C23H28O13,dem optischen Drehwert [α]D20 = - 179° + 2° (CH3OH; c = 2) und dem in Figur 1 wiedergegebenen Ultrarotabsorptionsspektrum.

4. Arzneimittel, enthaltend ein gemäß Anspruch 1 gewonnenes Glykosid bzw. Glykosidgemisch.