DE3486491T2

DE3486491T2 - Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE3486491T2
Application number: DE3486491T
Authority: DE
Inventors: Philip J. Barr; James P. Merryweather; Guy Mullenbach; Mickey S. Urdea
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1983-04-25
Filing date: 1984-04-13
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2004-04-14
Also published as: DK204584D0; EP0561137A1; JP2548105B2; HK65594A; JPS59205997A; EP0123228A2; NO174302C; FI87799C; IL71634A; US6642029B1; FI841524A0; DK204584A; PT78484B; JP2530424B2; HUT34236A; ZA842982B; NZ207842A; ATE220101T1; JPH07143886A; ES8505412A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Es wird vermutet, daß das der Verabreichung von Wachstumshormon in vivo folgende somatische Wachstum durch eine Familie mitogener, insulinähnlicher Peptide, deren Serumkonzentrationen wachstumshormonabhängig sind, vermittelt wird. Zu diesen Polypeptiden zählen Somatomedin-C, Somatomedin-A sowie die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und IGF II). IFG I und II lassen sich aus Humanserum isolieren und besitzen Aminosäuresequenzen, die in einem weiten Bereich homolog zu der von Insulin sind. Gegenwärtig können nur beschränkte Mengen dieser Wachstumsfaktoren durch Abtrennung aus Humanserum gewonnen werden. Es wäre daher von großem wissenschaftlichen und klinischen Interesse, relativ große Mengen der Wachstumsfaktoren über rekombinante DNA-Techniken produzieren zu können.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Die Aminosäuresequenzen für die menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und II) wurden zuerst von Rinderknecht und Humbel (1978) J. Biol. Chem. 253: 2769-2776 bzw. Rinderknecht und Humbel (1978) FEBS Letters 89: 283-286 bestimmt. Die Beschaffenheit der IGF-Rezeptoren wird in Massague und Czech (1982) J. Biol. Chem. 257: 5038-5045 erörtert. In Kurjan und Herskowitz, Cell (1982) 30: 933-934 wird ein mutmaßlicher Vorläufer des α-Faktors, der vier Tandemkopien des reifen α-Faktors enthält, sowie dessen Sequenz beschrieben und ein Prozessierungsmechanismus vorgeschlagen. Von Kurjan und Herskowitz werden in einer Zusammenfassung mit dem Titel "A Putative Alpha- Factor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature Alpha-Factor" (Zusammenfassungen von Veröffentlichungen anläßlich der Tagung mit dem Thema "The Molecular Biology of Yeast" in Cold Spring Harbor, 1981, S. 242) die den α-Faktor codierende Sequenz sowie "Spacer" zwischen zwei solchen Sequenzen beschrieben.
In Science, Bd. 219, S. 620-625 (1983) wird die Produktion von menschlichem Interferon in einer einzelligen Wirtszelle (Hefe), die ein DNA-Konstrukt (2-um-Plasmid) enthält, das ein Interferon codierendes Gen im Leseraster mit Sekretionslelt- und Prozessierungssignalsequenzen aus Hefe sowie einen Hefe-Transkriptionsinitiationsbereich ebenso wie ein bakterielles Replikationssysstem aufweist, beschrieben. Weiterhin wird darin eine mit diesem DNA-Konstrukt transformierte Hefe sowie die Produktion und Isolierung von menschlichem Interferon unter Verwendung dieser transformierten Hefe beschrieben.

ZUSAMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur effizienten Herstellung des reifen menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF) bereitgestellt. Insbesondere ermöglicht die Expression eines "prä"-IFG I in einem Hefewirt die Sekretion der Polypeptide in das Nährmedium. Zur Bildung der DNA- Konstrukte werden DNA-Sequenzen aus verschiedenen Quellen, einschließlich sowohl natürlicher als auch synthetischer Quellen, miteinander verbunden. Die dadurch entstandenen DNA-Konstrukte werden in der Hefe stabil repliziert und sorgen für eine effiziente Produktion auf hohem Niveau von prozessierten "prä"-Polypeptiden, die sich in hoher Ausbeute aus dem Nährmedium isolieren lassen.

BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden DNA-Sequenzen bereitgestellt, die dazu in der Lage sind, den menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktor IGF I zu exprimieren. Diese DNA-Sequenzen lassen sich in Vektoren einbauen, und die dadurch entstandenen Plasmide können zur Transformation geeigneter Wirte verwendet werden. Die Transformation eines geeigneten Wirts mit solchen rekombinanten Plasmiden führt zur Expression des Gens für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor und zur Herstellung des Polypeptidprodukts.
Insbesondere werden neuartige DNA-Konstrukte zur Herstellung des Vorläufer-Polypeptids ("prä"-IGF I) in einem Hefewirt bereitgestellt, der dazu in der Lage ist, das Vorläufer-Polypeptid zu prozessieren und das reife Polypeptidprodukt in das Nährmedium zu sezernieren. Die DNA-Konstrukte umfassen ein Replikationssystem mit der Fähigkeit, sie stabil in einem Hefewirt zu halten, einen effizienten Promotor, ein Strukturgen einschließlich Leit- und Prozessierungssignalen, die sich im Leseraster mit dem Strukturgen befinden, sowie eine stromabwärts von dem Strukturgen gelegene Transkriptionsterminationssequenz. Gegebenenfalls lassen sich weitere Sequenzen für die Transkriptionsregulation, Genamplifikation, exogene Transkriptionsregulation und ähnliches bereitstellen. Unter "prä"-IGF I ist zu verstehen, daß die das reife Polypeptid codierende DNA-Sequenz mit einer Leitsequenz, einschließlich von dem Hefewirt effizient erkannter Prozessierungssignale, im gleichen Leseraster verbunden wird. Somit bezeichnet "prä" den Einschluß von Sekretions- und Prozessierungssignalen, die mit einem Hefewirt assoziiert sind, und nicht von solchen Prozessierungssignalen, die mit dem das gewünschte Polypeptid codierenden Gen assoziiert sind.
Bei der Herstellung des DNA-Konstrukts besteht die Notwendigkeit, die das Replikationssystem, den Promotor, das Strukturgen einschließlich Leit- und Prozessierungssignalen sowie den Terminator repräsentierenden individuellen Sequenzen in einer vorgegebenen Anordnung zusammenzubringen, um sicherzustellen, daß sie in dem entstandenen Plasmid ihre Funktion korrekt ausüben können. Wie im folgenden beschrieben, können Adaptermoleküle eingesetzt werden, um die korrekte Orientierung und Anordnung der Sequenzen zu gewährleisten.
Bei dem verwendeten IGF I-Gen kann es sich um chromosomale DNA, cDNA, synthetische DNA oder deren Kombinationen handeln. Die Leit- und Prozessierungssignale stammen normalerweise von in Hefe natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen, die für die Sekretion eines Polypeptids sorgen, ab. Zu solchen Polypeptiden, die von der Hefe in natürlicher Weises sezerniert werden, gehören der α-Faktor, a-Faktor, saure Phosphatase und dergleichen. Die restlichen Sequenzen, aus denen sich das Konstrukt zusammensetzt, einschließlich des Replikationssystems, Promotors und Terminators, sind allgemein bekannt und in der Literatur beschrieben.
Da die verschiedenen DNA-Sequenzen, die zur Bildung des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts verbunden werden, aus unterschiedlichen Quellen stammen, ist es zweckmäßig, die Sequenzen mittels Verbindungs- oder Adaptermolekülen zu verbinden. Adapter lassen sich insbesondere vorteilhafterweise zur Verbindung des 3'-Endes des codierenden Strangs der Leit- und Prozessierungssignalsequenz mit dem 5'-Ende des IGF codierenden Strangs zusammen mit ihren entsprechenden komplementären DNA-Strängen einsetzen. Die Leit- und Prozessierungssignalsequenz kann in der Nähe ihres 3'-Terminus intern verkürzt sein, so daß ihr eine vorgegebene Anzahl an Basenpaaren des codierenden Bereichs fehlt. In diesem Fall läßt sich ein Adapter so konstruieren, daß bei der Verbindung der Leit- und Prozessierungssequenz mit dem IGF codierenden Strang durch diesen Adapter die fehlenden Basenpaare zur Verfügung gestellt werden und sich der IGF-codierende Strang im korrekten Leseraster gegenüber der Leitsequenz befindet. Der synthetische IGF-codierende Bereich und/oder der Adapter an seinem 3'-Ende stellen Translationsstoppcodons bereit, um sicherzustellen, daß der C-Terminus des Polypeptids mit dem natürlich vorkommenden C-Terminus identisch ist.
Die Adapter weisen etwa 5 bis 40 Basen, üblicherweise etwa 8 bis 35 Basen, in der codierenden Sequenz auf und können entweder überhängende oder glatte Enden aufweisen, wobei überhängende Enden bevorzugt sind. Wünschenswerterweise besitzen die Adaptertermini überhängende Enden, die mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen assoziiert sind, so daß der Adapter selektiv zwei unterschiedliche DNA-Sequenzen mit den entsprechenden komplementären überhängenden Enden verknüpft.
Die vorliegende Erfindung wird anhand von synthetischen, für IGF I codierenden und mit den Leit- und Prozessierungssignalen des α-Faktors aus Hefe verbundenen Fragmenten erläutert. Der Hefe-α-Faktor kann mit HindIII und SalI restriktionsverdaut werden. Hindlil spaltet im Prozessierungssignal des α-Faktor-Vorläufers, und zwar 3' von der zweiten Base im codierenden Strang des Glu-Codons, während die HindIII- Erkennungssequenz das Glu-Codon vervollständigt, für Ala codiert und die erste 5'-Base des aminoterminalen Trp-Codons des reifen α-Faktors bereitstellt. Bezüglich der Transkriptionsrichtung des α-Faktor-Gens befindet sich die SalI-Stelle stromaufwärts vom Transkriptionsterminator.
Die für IGF codierenden synthetischen Gene besitzen Nukleotidsequenzen, die auf den bekannten Aminosäuresequenzen des IGF I-Polypeptids beruhen. In den synthetischen Sequenzen werden bevorzugt Codons eingesetzt, die vorzugsweise von dem Hefewirt verwendet werden, beispielsweise beruhend auf der Häufigkeit, mit der die Codons in den für Glykolyseenzyme der Hefe codierenden Genen vorkommen. Zweckmäßigerweise umfaßt die synthetische Sequenz überhängende Enden anstatt glatter Enden zur Insertion in eine Restriktionsstelle in einem Klonierungsvehikel. Weiterhin werden Restriktionsstellen in die synthetischen Sequenzen unter Verwendung von stillen Mutationen eingebaut, um Fragmente zu erzeugen, die zu Sequenzen, welche IGF I/IGF II-Hybridpeptidmoleküle produzieren können, zusammengefügt werden können.
In den Beispielen werden die synthetischen Fragmente mit überhängenden Enden für EcoRI ausgestattet und die EcoRI-Stelle in pBR328 eingefügt. Üblicherweise umfaßt die synthetische Sequenz zusätzliche Restriktionsstellen in unmittelbarer Nachbarschaft der beiden Enden des Polypeptid-codierenden Bereichs. Solche internen Restriktionsstellen werden ausgewählt, um das präzise Ausschneiden des codierenden Bereichs aus dem Klonierungsvehikel zu ermöglichen und die Verbindungen mit den Adaptern herzustellen, so daß sich das fertige DNA-Konstrukt, einschließlich der Leit- und Prozessierungssignale und dem codierenden Bereich, im korrekten Leseraster befindet und in korrekter Weise neben einem Transkriptionsterminator liegt. Vorzugsweise ist die Erkennungssequenz der Restriktionsstellen von der Schnittstelle versetzt, wobei die Spaltung direkt neben dem codierenden Bereich geführt wird und die Erkennungsstelle verloren geht. Dadurch wird die Spaltung genau an beiden Enden des codierenden Bereichs unabhängig von der Nukleotidsequenz ermöglicht. In den Beispielen werden HgaI-Stellen bereitgestellt.
Bei der Herstellung des synthetischen Gens werden überlappende einzelsträngige DNA-Fragmente (ssDNA- Fragmente) mittels herkömmlicher Techniken hergestellt. Solche ssDNA-Fragmente weisen üblicherweise eine Länge von etwa 10 bis 40 Basen auf. Zwar lassen sich beträchtlich längere Fragmente einsetzen, jedoch nimmt die Syntheseausbeute ab, und es bereitet mehr Schwierigkeiten sicherzustellen, daß die korrekte Sequenz nicht unabsichtlicherweise abgebaut oder verändert wurde. Nachdem die ssDNA-Fragmente synthetisiert worden sind, werden sie unter "Annealing"-Bedingungen verbunden, wobei komplementäre Basenpaarung die korrekte Reihenfolge gewährleistet. Die Fragmentenden werden dann ligiert, und das entstandene synthetische DNA-Fragment wird kloniert und amplifiziert, üblicherweise in einem bakteriellen Wirt wie z. B. E. coli. Wie zuvor angedeutet, kann das synthetische Strukturgen mit überhängenden Enden, die zu einer geeigneten Restriktionsstelle im gewünschten Klonierungsvehikel komplementär sind, sowie internen Erkennungsstellen, die das präzise Ausschneiden des codierenden Bereichs erlauben, versehen sein. Nach Klonierung und Amplifikation der synthetischen Sequenzen können verwendbare Mengen der Sequenzen ausgeschnitten werden, üblicherweise an den internen Restriktionsstellen an beiden Enden des IGF codierenden Bereichs.
Zweckmäßigerweise kann es sich bei dem eingesetzten Promotor um den mit der Leit- und Prozessierungssequenz assoziierten Promotor handeln. Auf diese Weise kann ein 5'-mobiles Element, das sowohl den Promotor als auch die Leitsequenz im korrekten räumlichen Abstand für eine effiziente Transkription enthält, bereitgestellt werden. Durch den zusätzlichen Einschluß eines Transkriptionsterminators wird eine "Kassette", bestehend aus Promotor/Leitsequenz - Restriktionsstelle(n) - Terminator, geschaffen, in die der IGF-codierende Bereich mit Hilfe von Adaptern eingefügt werden kann. Üblicherweise lassen sich solche Kassetten bereitstellen, indem ein DNA-Fragment isoliert wird, das ein intaktes Gen eines Hefewirts sowie die stromaufwärts und stromabwärts befindlichen Transkriptionsregulationssequenzen des Gens umfaßt, wobei das Gen ein von dem Wirt sezerniertes Polypeptid exprimiert.
Alternativ läßt sich der natürlich vorkommende Hefepromotor durch andere Promotoren, die eine Transkriptionsregulation ermöglichen, ersetzen. Dies erfordert die Sequenzierung und/oder Restriktionskartierung des stromaufwärts von der Leitsequenz befindlichen Bereichs, um die Einführung eines unterschiedlichen Promotors zu ermöglichen. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, den natürlich vorkommenden Hefepromotor beizubehalten und einen zweiten Promotor in Tandemanordnung bereitzustellen, entweder stromaufwärts oder stromabwärts von dem natürlich vorkommenden Hefepromotor.
Eine große Vielfalt an Promotoren ist verfügbar oder kann aus Hefegenen erhalten werden. Zu den Promotoren von besonderem Interesse zählen diejenigen Promotoren, die mit Enzymen im Glykolyseweg in Verbindung stehen, wie z. B. Promotoren für Alkohyldehydrogenase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglukoisomerase, Phosphofruktokinase, usw. Durch den Einsatz dieser Promotoren zusammen mit Regulationssequenzen wie z. B. Enhancern, Operatoren, usw. und durch Verwendung eines Wirts mit einem intakten Regulationssystem läßt sich die Expression des prozessierten "prä"-IGF regulieren. Somit lassen sich verschiedene kleine organische Moleküle, z. B. Glukose, zur Regulation der Produktion des gewünschten Polypeptids einsetzen.
Man kann ebenfalls temperatursensitive Regulationsmutanten, die eine Modulation der Transkription durch Temperaturveränderung erlauben, einsetzen. Somit kann man die Zellen durch Wachstum bei der nicht-permissiven Temperatur bis zu einer hohen Zelldichte wachsen lassen, bevor die Temperatur geändert wird, um die Expression der "prä"-Polypeptide für IGF I zu ermöglichen.
Es lassen sich ebenfalls andere Fähigkeiten in das Konstrukt einbauen. So sorgen beispielsweise einige Gene für eine Amplifikation, wobei als Folge einer Streßsituation für den Wirt nicht nur das Gen, das auf diesen Streß antwortet, amplifiziert wird, sondern auch flankierende Bereiche. Durch Plazieren eines solchen Gens stromaufwärts von dem Promotor, dem codierenden Bereich und den anderen Regulationssignalen, die für die Transkriptionskontrolle des "prä"-Polypeptids sorgen, sowie durch Versetzen des Hefewirts in einen Streßzustand lassen sich Plasmide erhalten, die mehrere Wiederholungssequenzen aufweisen, die das "prä"-Polypeptidgen mit seinen Regulationssequenzen umfassen. Zu den hierfür beispielhaften Genen gehören die Gene für Metallothioneine und Dihydrofolat- Reduktase.
Neben dem Leitsequenzfragment kann das Konstrukt weitere, zum Wirtsgenom homologe DNA enthalten. Falls eine Integration des IGF-Gens in das (die) Chromosom(en) gewünscht wird, kann diese Integration dadurch verstärkt werden, daß dem IGF-Genkonstrukt flankierende Sequenzen, die zur chromosomalen DNA des Wirts homolog sind, zur Verfügung gestellt werden.
Das verwendete Replikationssystem wird durch den Hefewirt erkannt. Es ist daher wünschenswert, daß es sich hierbei um ein für den Hefewirt natives Replikationssystem handelt. In Botstein et al., Gene (1979) 8: 17-24 werden eine Reihe von Hefevektoren vorgestellt. Von besonderem Interesse sind die YEp-Plasmide, die das 2-um-Plasmid-Replikationssystem enthalten. Diese Plasmide werden in Multikopienform stabil in der Zelle gehalten. Alternativ oder zusätzlich kann man eine Kombination aus ARS1 und CEN4 zur Aufrechterhaltung der Stabilität verwenden.
Nach jeder Manipulation kann das Kontrukt in geeigneter Weise kloniert werden, so daß das gewünschte Konstrukt in reiner Form und in ausreichender Menge für die weitere Manipulation erhalten wird. Günstigerweise läßt sich ein Shuttle-Vektor (d. h. er enthält sowohl einen Hefe- als auch einen bakteriellen Replikationsursprung) verwenden, so daß eine Klonierung in Prokaryonten, bevorzugt E. coli., durchgeführt werden kann.
Die Plasmide können in den Hefewirt mit allen zweckmäßigen Mitteln eingeführt werden, wobei Hefe- Wirtszellen oder -spheroplasten eingesetzt und zur Transformation Calcium-präzipitierte DNA oder Liposomen oder andere herkömmliche Techniken verwendet werden. Die modifizierten Wirte können entsprechend den genetischen Markern, die gewöhnlich in einem zur Konstrukton des Expressionsplasmids verwendeten Vektor zur Verfügung stehen, selektioniert werden. Man kann auch einen auxotrophen Wirt verwenden, wobei das Plasmid ein Gen aufweist, das den Wirt komplementiert und Prototrophie liefert. Alternativ kann das Plasmid als Marker eine Resistenz gegenüber einem geeigneten Biozid, beispielsweise einem Antibiotikum, Schwermetall, Toxin oder ähnlichem, enthalten. Eine Selektion läßt sich dann dadurch erzielen, daß ein Nährmedium, das zu einem Streßzustand in den Elternzellen führt, verwendet wird, so daß für die Zellen, die das Plasmid enthalten, selektioniert wird. Die plasmidhaltigen Zellen können dann in einem entsprechenden Nährmedium gezüchtet und das gewünschte sezernierte Polypeptid nach herkömmlichen Techniken isoliert werden. Das Polypeptid kann durch Chromatographie, Filtration, Extraktion, usw. gereinigt werden. Da das Polypeptid in reifer Form im Nährmedium vorliegt, kann man das Nährmedium im Kreislauf führen und dabei das gewünschte Polypeptid kontinuierlich abtrennen.
Die nachfolgenden Beispiele werden beispielhaft und nichtlimitierend dargestellt.

EXPERIMENTELLER TEIL

Die Experimente dienen nur zu Vergleichszwecken, soweit sie sich auf IGF II beziehen.
Die bevorzugte Hefe-Codons enthaltenden Nukleotidsequenzen für die menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und II) wurden auf der Grundlage der in Rinderknecht und Humbel (1978) J. Biol. Chem 253: 2769-2776 bzw. Rinderknecht und Humbel (1978) FEBS Letters 89: 283-286 veröffentlichten Aminosäuresequenzen erstellt. Die Sequenzen (wobei die codierenden Stränge in 5'-3'-Richtung gezeigt sind) sind wie folgt: IGF I IGF II
Die Sequenzen sind mit überhängenden EcoRI-Enden an beiden Enden ausgestattet. Die Codierung für IGF I beginnt mit der Base 16 des codierenden Strangs und endet mit der Base 225. HgaI-Restriktionsstellen befinden sich an beiden Enden des IGF I-codierenden Bereichs. Die HgaI-Erkennungsstellen (5'-GACGC-3') liegen außerhalb des IGF I-codierenden Bereichs, d. h. zwischen dem Ende der synthischen Sequenz und der HgaI-Schnittstelle. Die synthetische Sequenz für IGF II ist in ähnlicher Weise konstruiert, wobei der codierende Strang mit der Base 16 beginnt und mit der Base 219 endet.
Ein synthetisches DNA-Fragment für IGF II mit der gerade für IGF I beschriebenen Sequenz wurde hergestellt, indem 20 überlappende ssDNA-Seqgmente unter Verwendung des Phophoramiditverfahrens synthetisiert wurden (siehe die gleichzeitig laufende Anmeldung, Serien-Nr. 457,412, eingereicht am 12. Januar 1983). Die ssDNA-Sequenzen waren wie folgt:
Die ssDNA-Segmente wurden wie folgt zusammengefügt: 50 umol jedes Segments außer A und I-16 wurden mit T4-Polynukleotidkinase 5'-phosphoryliert. Von allen Segmenten wurden dann jeweils 50 umol in einem einzigen Schritt als 18-ul-Pool durch Abkühlen von 95º auf 25º über 1,5 Std. annealt. Die Ligation wurde in einem Reaktionsvolumen von 30 ul mit 1 mM ATP, 10 mM DTT, 100 mM Tris-HCl, pH 7, 8, 10 mM MgCl&sub2;, 1 ug/ml Spermidin und T4-Ligase durchgeführt. Das entsprechende, aus der Reihenfolge und Paarung der in Abb. 1 gezeigten Fragmente entstandene doppelsträngige Fragment wurde auf einem 7%igen nativen Polyacrylamid- Elektrophoresegel gereinigt. Abb. 1 IGF I-ANNEALING- UND LIGATIONSSCHEMA
Eine DNA-Sequenz für IGF II wurde in ähnlicher Weise synthetisiert. Die folgenden zusätzlichen ssDNA-Fragmente wurden hergestellt.
200 umol dieser ssDNA-Fragmente sowie der Fragmente A, D und L wurden in ähnlicher Weise wie oben zusammengefügt, wobei A und II-15 nicht phosphoryliert wurden, was zu der folgenden Segmentreihenfolge und -paarung führte. Abb. 2 IGF II-ANNEALING- UND LIGATIONSSCHEMA
Die synthetischen DNA-Sequenzen wurden in die EcoRI-Stelle von pBR328 eingefügt, woraus sich die Plasmide p328IGF I und p328IGF II ergaben. Nach der Klonierung wurden die IGF codierenden Stränge mit HgaI ausgeschnitten.
Danach wurden synthetische Oliguonukleotidadapter an die HgaI-Restriktionsfragmente ligiert. Im Falle von IGF I wiesen die Adapter die folgenden Sequenzen auf:
Bezüglich der Orientierung zum codierenden Strang ist das 3'-Ende des ersten Adapters, a), zur 5'-HgaI- Schnittstelle in der synthetischen IGF I-Sequenz komplementär, während das 5'-Ende des ersten Adapters ein überhängendes Hindlil-Ende zur Verfügung stellt. Der zweite Adapter, b), ist an seinem 5'-Ende zur HgaI-Schnittstelle am 3'-Ende der IGF I-Sequenz komplementär, während das 3'-Ende des Adapters ein überhängendes SalI-Ende zur Verfügung stellt.
Im Falle von IGF II besitzen die Adapter die folgenden Sequenzen:
Mit der gleichen Orientierung wie oben ist der erste Adapter, c), an seinem 3'-Ende zur 5'-HgaI-Schnittstelle in der synthetischen IGF II-Sequenz komplementär, während das 5'-Ende ein überhängendes HindIII-Ende zur Verfügung stellt. Der zweite Adapter, d), ist an seinem 5'-Ende zur zweiten HgaI-Schnittstelle in der synthetischen IGF II-Sequenz komplementär und stellt an seinem 3'-Ende ein überhängendes SalI-Ende zur Verfügung.
Die synthetischen Fragmente und die daran angefügten Adapter wurden über präparative Gelelektrophorese gereinigt und mit 100 ng pAB113, das zuvor vollständig mit den Endonukleasen HindIII und SalI verdaut worden war, ligiert. pAB113 wurde von pAB112 durch Deletion der drei jeweils 63 bp langen HindIII-Fragmente abgeleitet. pAB112 ist ein Plasmid mit einem 1,8 kb langen EcoRI-Fragment, wobei das α-Faktorgen der Hefe in die EcoRI-Stelle von pBR322, in dem die HindIII- und SalI-Stellen deletiert worden waren, kloniert wurde. pAB112 stammt vom Plasmid pAB101 ab, das das α-Faktorgen der Hefe als ein partielles in die BamHI-Stelle des Plasmids YEp24 kloniertes Sau3A-Fragment enthält. pAB101 wurde durch Screenen einer in YEp24 durch Verwendung einer enzymatisch mit ³²P radioaktiv markierten synthetischen Oligonukleotidsonde, die zum veröffentlichten α-Faktor-codierenden Bereich (Kurjan und Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Sping Harbor meeting on the Molecular Biology of Yeasts, Seite 242) homolog ist, klonierten genomischen Hefebibliothek erhalten.
Die entstandenen Mischungen wurden zur Transformation von E. coli-HB101-Zellen verwendet, und man erhielt die Plasmide pAB113-IGF-I und pAB113-IGF-II für IGF I bzw. IGF II.
Die Plasmide pAB113-IGF-I und pAB113-IGF-II (jeweils 5 ug) mit den IGF I- bzw. IGF II-Strukturgenen wurden mit EcoRI vollständig verdaut und die resultierenden Fragmente mit einem Überschuß an EcoRI-BamHI-Adaptern ligiert und mit BamHI verdaut. Die entstandenen 1,8 kb langen BamHI-Fragmente wurden über präparative Gelelektrophorese isoliert und ungefähr jeweils 100 ng der Fragmente mit 100 ng pC1/1, das zuvor vollständig mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, ligiert.
Bei dem Plasmid pC1/1 handelt es sich um ein Derivat von pJDB219, Beggs, Nature (1978) 275 : 104, in dem der dem bakteriellen Plasmid pMB9 in pJDB219 entsprechende Bereich durch pBR322 in pC1/1 ersetzt wurde. Jede Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. coli-HB101-Zellen verwendet. Die Transformanten wurden über Ampicillinresistenz selektioniert und ihre Plasmide mittels Restriktionsendonukleaseverdau analysiert. Die DNA eines für jedes Strukturgen, IGF I bzw. IGF II, ausgewählten Klons (pYIGF-I-10/1) bzw. (pYIGF-II-10/1) wurde präpariert und zur Transformation von AB103-Hefezellen verwendet. Die Transformanten wurden hinsichtlich ihres Leu&spplus;-Phänotyps selektioniert.
Zwei Kulturen (5 und 9 Liter) des mit dem Plasmid (pYIGF-I-10/1) transformierten Hefestamms AB103 (α, pep 4-3, leu 2-3, leu 2-112, ura 3-52, his 4-580) wurden bei 30ºC in -leu-Medium bis zur Sättigung (optische Dichte bei 650 nm = 5) wachsen und bei 30ºC zusätzliche 12 Stunden lang schütteln gelassen. Die Zellüberstände wurden von jeder Kultur durch Zentrifugation gesammelt, und IGF I wurde durch Absorption an einem Ionenaustauscherharz (Biorex-70, erhältlich von Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Kalifornien) konzentriert. Nach Elution mit 10 mM HCl in 80% Ethanol wurden die IGF I-Fraktionen (0,4 ml bzw. 3 ml) auf die Gesamtproteinkonzentration sowie die IGF I-Konzentration getestet. Bei dem Proteintest handelte es sich um den Coomassie-Blue-Test, der von Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Kalifornien, bezogen werden kann. Bei dem IGF I-Test handelte es sich um einen herkömmlichen kompetitiven, radioaktiv markiertes IGF I verwendenden Radioimmunoassay. Es ergaben sich die folgenden Resultate:
Ein IGF I-Bioassay, der auf der synergistischen Wirkung des Peptids auf die Förderung der Antwort des Taubenkropfsacks gegenüber Prolaktin beruht (Anderson et al. (1983) in Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E. M., Hrsg. Walter deGruter, Berlin), zeigt, daß das IGF I-Produkt dieser präparationen eine dem aus Humanserum isolierten IGF I äquivalente Aktivität aufweist.
Kulturen von AB103 (pYIGF-II-10/1), die in ähnlicher Weise wie oben kultiviert wurden und unter Verwendung eines Radiorezeptorassays mit einem Rezeptor aus menschlicher Plazentamembran (Spencer et al. (1979) Act. Endocrinol. 91: 36-48) auf IGF II getestet wurden, zeigten 3,9 Einheiten/ml, während normales Humanserum einen Wert von 1 Einheit/ml besitzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neuartige Konstrukte bereitgestellt, die in Vektoren zur Expression von menschlichem insulinähnlichem Wachstumsfaktor I zwecks Prozessierung und Sekretion eingefügt werden können. Somit läßt sich ein Polypeptid erhalten, das eine identische Sequenz zum natürlich vorkommenden menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktor I aufweist. Aufgrund der vermittelten Sekretion lassen sich verbesserte Ausbeuten bezogen auf die Zellpopulation erhalten, und die nachfolgenden präparativen Schritte sowie Reinigung werden vereinfacht.
Obwohl die vorstehende Erfindung durch die Zeichnungen und Beispiele zum Zwecke der Verdeutlichung näher beschrieben wurde, ist ersichtlich, daß gewisse Änderungen und Modifikationen im Rahmen der als Anlage beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

für den Vertragsstaat: AT

1. Verfahren zur effizienten Herstellung des menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktors I (IGF-I) in Hefe, wobei das Verfahren:

das Bereitstellen eines funktionellen DNA- Konstrukts mit einem IGF-I codierenden Gen, wobei dieser IGF-I die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

die zusammen mit von Hefe erkannten Sekretionsleit- und Prozessierungssignalsequenzen im korrekten Leseraster zu einem Strukturgen verbunden wird, das in einem mit der Hefe kompatiblen Vektor stromabwärts von einem Transkriptionsinitiationsbereich liegt und unter der Transkriptionsregulationskontrolle dieses Transkriptionsinitiationsbereichs steht;

das Einbringen des Vektors in die Hefe;

das Anzüchten der den Vektor enthaltenden Hefe und die Isolierung des sezernierten menschlichen IGF-I daraus umfaßt.

2. Verfahren zur Expression des menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktors I (IGF-I) in Hefe, wodurch dieser IGF-I, gefördert durch von Hefe erkannte Sekretions- und Prozessierungssignale, sezerniert wird, wobei das Verfahren:

das Herstellen eines ersten DNA-Fragments, das eine erste IGF-I codierende DNA-Sequenz enthält, wobei dieser IGF-I die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

und bei dem sich der 5'-Terminus des codierenden Stranges an der oder stromabwärts von der ersten Base dieser DNA-Sequenz befindet;

das Herstellen eines zweiten DNA-Fragments, das eine zweite, für von Hefe erkannte Sekretions- und Prozessierungssignalsequenzen codierende DNA- Sequenz enthält und bei dem sich der 3'-Terminus des codierenden Stranges an der oder stromaufwärts von der terminalen Base des Prozessierungssignals befindet, wobei sich der Terminus mindestens des ersten oder des zweiten Fragments innerhalb der codierenden Sequenz befindet, wodurch Basenpaare fehlen;

das Verbinden des ersten und zweiten DNA-Fragments mittels eines Adapters, der für die fehlenden Basenpaare des ersten und des zweiten DNA-Fragments codiert, wobei sich das erste und das zweite DNA- Fragment im gleichen Leseraster befinden;

das Bereitstellen eines stromabwärts von dem ersten Fragment liegenden und an dieses angrenzenden Terminationscodons, wodurch ein "prä"-IGF-I-Gen zur Verfügung gestellt wird; und

das Klonieren dieses "prä"-IGF-I-Gens in einem Expressionsvektor in Hefe, wobei das "prä"-IGF--I von der Hefe sezerniert und zu IGF-I prozessiert wird, umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem IGF-I codierenden Gen um ein synthetisches Gen mit von Hefe bevorzugten Codons handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das IGF-I codierende Gen die folgende Nukleotidsequenz aufweist:

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Vektor um ein Derivat des 2-uM-Plasmids handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den Sekretionsleit- und Prozessierungssignalsequenzen um Sekretionsleit- und Prozessierungssignalsequenzen des "yeast mating factor" handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den Sekretionsleit- und Prozessierungssignalsequenzen des "yeast mating factor" um Sekretionsleit- und Prozessierungssignalsequenzen des α-Faktors aus Saccharomyces cerevisiae handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Expressionsvektor ein von Bakterien erkanntes Replikationssystem einschließt.

9. Verfahren zur Herstellung des menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktors I (IGF-I) in Hefe, welches das Kultivieren einer Hefezelle unter Bedingungen umfaßt, bei denen IGF-I exprimiert und sezerniert wird, wobei die Hefezelle ein DNA-Konstrukt enthält, das eine den menschlichen insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) codierende Sequenz enthält, die zusammen mit von Hefe erkannten Sekretionsleit- und Prozessierungssignalsequenzen im korrekten Leseraster zu einem Strukturgen verbunden wird, welches stromabwärts von von Hefe benutzten Regulationssignalen liegt und unter deren Transkriptionskontrolle steht, und das dazu in der Lage ist, für die Expression in Hefe zu sorgen.