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DE4205938A1 - Immunotoxine - Google Patents

Immunotoxine

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Publication number
DE4205938A1
DE4205938A1 DE4205938A DE4205938A DE4205938A1 DE 4205938 A1 DE4205938 A1 DE 4205938A1 DE 4205938 A DE4205938 A DE 4205938A DE 4205938 A DE4205938 A DE 4205938A DE 4205938 A1 DE4205938 A1 DE 4205938A1
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DE
Germany
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toxin
type
ber
esp
immunotoxins
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE4205938A
Other languages
English (en)
Inventor
Brunangelo Prof Dr Med Falini
Firenzo Prof Dr Med Stirpe
Harald Prof Dr Med Stein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Original Assignee
Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH filed Critical Medac Gesellschaft fuer Klinische Spezialpraeparate mbH
Priority to DE4205938A priority Critical patent/DE4205938A1/de
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Immunotoxine, die durch covalente Bindung von Pflanzentoxinen an einen monoklonalen Antikörper vom Typ CD30 erzeugt werden.
Einige Pflanzentoxine hemmen über die Inaktivierung von Ribosomen die Proteinsynthese von euraryontischen Zellen und entfalten auf diese Weise zytotoxische Aktivität. Diese Moleküle werden als "Ribosomen inaktivierende Proteine" klassifiziert und abgekürzt als RIPs bezeichnet. Es lassen sich zwei Typen von RIPs unter­ scheiden. Der eine Typ (bezeichnet als Typ 2) besteht aus Heterodimeren, die aus zwei unterschiedlichen durch Disulfid­ brücken verbundenen Peptidketten zusammengesetzt sind; eine der Peptidketten bindet an die Oberfläche von Zielzellen, während die andere Peptidkette die zytotoxische Aktivität besitzt. Der andere Typ von Toxinen (bezeichnet als RIP Typ 1) besteht aus einer einzelnen Peptidkette. Zur Beseitigung der Zytotoxizität ist eine Konjugation dieser Peptidkette an einen Carrier notwendig, der die Fähigkeit zur Bindung an Zelloberflächenmembranen besitzt.
Derartige Carrier können z. B. Antikörper sein, die für ein bestimmtes Zellantigen spezifisch sind.
Bei der hier beschriebenen Erfindung kommen Typ 1 RIPs zur Anwendung. Diese Proteine wurden in der wissenschaftlichen und Patentliteratur mehrfach beschrieben einschließlich Methoden zu ihrer Gewinnung, Reinigung und Bestimmung der biologischen Aktivität. Zu den verwendeten RIPs Typ 1 zählen Mitglieder der Saporin Familie wie z. B. Saporin 6 (SO6) (F. Stirpe et al., Biochem. J. 216, 433 (1986)) und andere Proteine wie z. B. Bryodin (Stirpe et al., Biochem. J. 240, 659 (1986)), Bryodin-L (europäi­ sche Patentveröffentlichung 03 90 040), Momorchochin (europäische Patentveröffentlichung 03 90 040), Dianthin 30 und 32 (F. Stirpe et al., Biochem J. 195, 399 (1981) und A.I. Falasca, Biochem. J. 1 95 399 (1981)), von Asparagus officinalis extrahierte Toxine (Bolognesi et al., Biochem. Biophys. Acta 1087, 293, 1990 (1983)) und europäische Patentveröffentlichung 03 90 040, PAP-S (Barbie­ ri et al., 203, 55 (1982)), Gelonin (Stirpe et al., J. Biol. Chem. 255, 6947 (1989)) und Trichosanthin (Maraganore et al., J. Biol. Chem. 262, 11628 (1987)).
Jedes Toxin vom RIP Typ 1 kann für die Herstellung von Immunkon­ jugaten verwendet werden. Darüber hinaus ist es möglich, Glykoprotein-Toxine in zuckerfreier oder in einer partiell deglykolisierten Form zur Kopplung einzusetzen.
Die andere Komponente der hier vorgestellten Immunotoxine ist ein monoklonaler CD30 Antikörper und insbesondere der monoklonale Antikörper Ber-H2 mit der "cluster of differentiation"-Nr. CD30. Dieser Antikörper wurde 1987 kurz und ausführlich 1989 von R. Schwarting et al. (Leukocyte Typing III, Blood . . .) be­ schrieben. Der Antikörper Ber-H2 wird durch das gleichnamige Hybridom sezerniert, das bei der European Collection of Animal Cell Culture (ECACC), Public Health Laboratory Service, Porton Down, Salisbury, Wiltshire U.K. entsprechend den Bestimmungen des Budapester Übereinkommens unter der vorläufigen Nummer Ber-H2 92012823 am 28.01.1992 hinterlegt wurde.
Das von dem monoklonalen Antikörper Ber-H2 erkannte CD30-Antigen ist ein Glykoprotein mit einer Molekülmasse von 120 kD, wenn diese durch eine SDS-Elektrophorese bestimmt wird. Das Besondere an dem CD30-Antigen ist, daß es im normalen Organismus nur an sehr wenigen T-Zell- und B-Zell-Blasten und an diesen auch nur in geringer Dichte vorhanden ist, (Stein et al., "International Journal of Councer 1982", Blood 66, 848 (1985) Leukocyte Typing III und IV), während es aber bei einer Reihe von lymph­ proliferativen Prozessen in hoher Konzentration exprimiert wird. Zu den stark CD30-positiven malignen Lymphomen gehören in erster Linie die Hodgkin-Lymphome, das anaplastische großzellige Lymphom wie auch die akute Form der adulten T-Zell-Leukämie. Wegen des äußerst seltenen Vorkommens des CD30-Moleküls im normalen Organismus (bis auf wenige aktivierte B- und T-Zell- Blasten sind sämtliche Körperzellen negativ) und der hohen Expression dieses Moleküls auf den Tumorzellen der oben genannten Lymphome erscheint ein Ber-H2 enthaltendes Immunotoxin für die Eliminierung von CD30-positiven Tumorzellen hervorragend geeignet.
Immunotoxine, die für eine Eliminierung von Hodgkin Lymphomzellen bzw. von CD30-positiven Tumorzellen verwendet werden können, sind in der Literatur bekannt. Solche Immunotoxine sind z. B. in WO91/07437 und WO91/07941 oder bei Engert et al., Cancer Res. 50, 2929 (1990) beschrieben. Diese Immunotoxine enthalten als zytotoxische Komponente die A-Kette des Ricins, welches ein Toxin des RIP Typ 2 darstellt. Die Wirkung von an Antikörper gebundenen Ricin A Ketten wurde in vielen Studien untersucht; die klinische Anwendung ergab bisher nur wenig zufriedenstellende Resultate. Der Grund hierfür liegt in der ungünstigen in vivo Pharmakokine­ tik dieser Immunotoxine (J. Biol. Resp. Modifiers., 7, 559 (1988)).
Es konnte jetzt gezeigt werden, daß Immunotoxine, die durch Konjugation des monoklonalen Antikörpers Ber-H2 mit Toxinen des RIP Typ 1 hergestellt wurden, den Immunotoxinen mit Toxin RIP Typ 2 überlegen sind. Das gilt sowohl für die Entfernung von CD30-positiven Zellen in vitro als auch in vivo. In den durch­ geführten Experimenten zeigten die Konjugate mit Toxinen von RIP Typ 1 eine deutlich höhere zytotoxische Kapazität als Ricin-A- Ketten enthaltende Immunotoxine (Siena et al., Transplantation 43, 421 (1987), Blatt 69, 345 (1987)).
Die Herstellung des hier beschriebenen Immunotoxins erfolgte unter Anwendung konventioneller Methoden wie sie in EP-A-16 911 und in "Monoclonal antibody-toxin conjugates: liming the magic bullet", Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, Seiten 168-190 (1982) beschrieben sind.
Zur Konjugation des Toxins mit dem Antikörper eignen sich heterobifunktionale Reagentien wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)-propionat (SPDP), 2-Tminothiolan (Traut′s Reagenz), S-Acetyl-mercaptobernsteinsäureanhydrid (SAMSA), Carbodiimid, Glutaraldehyd und ähnliche Reagentien. Die Anwen­ dungsweise dieser Reagentien ist in der einschlägigen Literatur beschrieben. Für die Herstellung des hier vorgestellten Immunoto­ xins wird eine Kopplung mit Hilfe von Iminothiolan bevorzugt. Dieses Reagenz erlaubt, das Toxin wie auch den Antikörper getrennt zu derivatisieren.
Die Ber-H2-Toxinkonjugate sollen parenteral (intramuskulär oder intravenös) angewendet werden. Deswegen muß das Immunotoxin in einer entsprechenden pharmazeutischen Präparation vorliegen, z. B. als sterile Lösung oder lösliche Suspension oder gefrierge­ trocknete Substanz, die mit entsprechenden Lösungsmitteln rekonstituiert werden kann. Die Dosis ist von verschiedenen Faktoren abhängig z. B. von der Ausbreitung und der Art der Er­ krankung, von dem Zustand der Patienten sowie von anderen Therapiemaßnahmen. Die Dosis beträgt in den meisten Fällen zwischen 0,01 mg/kg und 5 mg/kg, wobei eine Dosis zwischen 0,01 mg/kg und 0,5 mg/kg bevorzugt ist.
Die therapeutische Anwendung kann eine oder mehrere Applikationen pro Tag über einen Zeitraum von einer bis mehreren Wochen umfassen.
Die derivatisierten Toxine und Antikörpermoleküle werden unter Herstellung einer Disulfidbrücke konjugiert. Die in der vor­ liegenden Erfindung verwendeten Ber-H2 Antikörper vom Typ CD30 und der Toxine werden entsprechend nachfolgend beschriebener konventioneller Methoden gereinigt und charakterisiert.
Nachfolgend werden die Herstellung und die Charakterisierung einiger, für die vorliegende Erfindung repräsentativer Immunoto­ xine im genauer beschrieben:
1. Produktion des anti CD30 monoklonalen Antikörpers
Zur Produktion des monoklonalen Antikörpers Ber-H2 wird die gleichnamige Hybridzellinie herangezogen. Der Ber-H2- Antikörper besitzt den Isotyp IgGI und erkennt ein für das CD30 Molekül spezifisches Epitop. Die Hybridomazellinie wird in der Zellkultur unter Verwendung von Standardkulturbedin­ gungen in mit 10% fetalem Kälberserum supplementiertem RPMI 1640 Medium expandiert.
Um eine größere Menge Antikörper zu erhalten, können außerdem 1-3 × 106 Hybridomzellen intraperitoneal in mit Pristan (2,6,10,14-Tetramethyl-pentadecan, Sigma), behandel­ te nu/nu Mäuse (Swiss background) injiziert werden; unter diesen Bedingungen produzieren Hybridomzellen in der Maus einen intraperitonealen Tumor mit Aszitesbildung. Der Aszites enthält den Antikörper in sehr hoher Konzentration. Die Bindungsaktivität des in die Zellkulturüberstand oder in den Aszites sezernierten Ber-H2 Antikörper wird auf zwei verschiedene Arten geprüft. Einmal wird die Bindung der Antikörper an die CD30-positive Zellinie L540 mit Hilfe der indirekten Fluoreszenztechnik (siehe Figur 1) analysiert.
Bei dem anderen Verfahren wird die selektive Bindung der gewonnenen Ber-H2 Antikörper an CD30-positive Tumorzellen in Gefrierschnitten mit Hilfe der Immunhistologie überprüft.
2. Reinigung des anti-CD30 monoklonalen Antikörpers Ber-E2
Der Antikörper wird aus Kulturüberstand oder Aszites mit Hilfe der Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A-Säulen und Hydroxyapatitsäulen isoliert und gereinigt.
Affinitätschromatographie (Ey P.L. et al., Immunochemistry 15, 420 (1972)). Die steril gewonnene Kulturflüssigkeit oder Aszitesflüssigkeit wird durch Zentrifugation und Filtration über einen Nitrocellulosefilter mit 0,45 µm Porengröße geklärt. Das Filtrat wird 1:2 in Puffer (1,5 M Glycin, 3 M NaCl, pH-Wert 9,8) verdünnt und über eine Sepharose-Pro­ tein A Säule (Pharmacia) gegeben. Der Antikörper (IgG1) wird anschließend durch Applikation eines 0,1 M Natriumcitratpuf­ fers, pH-Wert 6,0 eluiert. Bei andern Subklassen erfolgt die Elution bei einem pH-Wert von 3,5 oder 3,0. Die IgG1 enthaltenden Fraktionen werden mit Hilfe eines ELISA-Testes (enzyme linked immunosorbent assay) identifiziert.
Hydroxyapatitchromatographie (Bio-Rad) (Stalkel et al., J. Immonol. Methods 76, 157, (1985)). Gepoolte Ber-H2-Antikör­ per enthaltende Fraktionen werden gegen einen 50 mM Phos­ phatpuffer vom pH-Wert 6,8 dialysiert und anschließend über die Hydroxyapatitchromatographiesäule gegeben. Der Antikör­ per wird mit einem linearen Kaliumphosphat-Gradienten eines Puffers (50 bis 500 mM, pH-Wert 6,8) eluiert. Die Antikörper enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, dialysiert gegen physiologische Kochsalzlösung, anschließend mit Hilfe der Ultrafiltration konzentriert und über einen Filter mit der Porengröße von 0,2 µm filtriert.
Der so erhaltene gereinigte Antikörper wird jetzt durch Affinitätschromatographie unter sterilen Bedingungen und unter Anwendung einer endotoxinentfernenden Gelsäule (Pierce) endotoxinfrei gemacht.
Die Endotoxinbeimischung, die unter 0,125 EU liegen muß, wird mit dem LAL-Test (Wittaker) bestimmt. Alle Lösungen, die für die Reinigung des Antikörpers verwendet wurden, wurden mit pyrogenfreiem und autoklaviertem sterilen Wasser angesetzt. Das Glasmaterial wurde bei 190°C sterilisiert.
Kunststoffmaterialien wurden von möglichen Pyrogenen durch Behandlung mit Natronlauge oder Detergenzien entsprechend der Instruktion der Hersteller befreit. Die Reinheit des Antikörpers wurde mit Hilfe der Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (Laemmli U.K., Nature 227, 680 (1970)) überprüft; der Reinheitsgrad erwies sich jeweils höher als 98%. An einem Aliquod des gereinigten Antikörpers wurde die Bindungskapazität mit Hilfe der Fluorzytometrie (Figur 1) evaluiert. Der gereinigte Antikörper zeigte eine ähnlich gute Bindung gegenüber der L540-Zellinie oder CD30- positiven Tumorzellen in Gefrierschnitten von Morbus-Hodgkin Gewebe wie der Antikörper aus der Zellkultur oder der Aszitesflüssigkeit.
3. Zytofluormetrische und immunhistologische Analyse des monoklonalen CD30-Antikörpers
Die Bindungsaktivität des monoklonalen Antikörpers Ber-H2 wurde sowohl mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz unter Anwendung eines Zytofluorimeters an CD30-positiven Zel­ linien, z. B. der Hodgkinzellinie L540, der HUT 102 und K562 wie auch mit der Alkalischen-Phosphatase-Antialkalischen- Phosphatasereaktion an acetonfixierten Gefrierschnitten von Morbus Hodgkin Gewebe analysiert. Mit der gleichen Methodik wurde auch der gereinigte Antikörper vor und nach seiner Konjugation mit dem Toxin analysiert. Zum Zwecke dieser Testung wurden 1 × 1 106 CD30-positive Zellen 30 Minuten lang in 100 µl Lösung inkubiert. Nach dreimaligen Waschen in einem isoosmolaren Puffer, der 1% Serumalbumin enthielt, wurden die Proben mit 100 µl eines Fluoroescinisothiocyanat (FITC) konjugierten Antimaus-Immunglobulins konjugiert. Nach drei Waschvorgängen erfolgte die Analyse in einem fluo­ reszenzaktivierten Fluorimeter. Zur Gewebsschnittanalyse wurden Gefrierschnitte von CD30-positiven Lymphomen ca. 10 bis Minuten lang in Aceton-pro-Analysi bei Zimmertemperatur fixiert und anschließend mit ca. 300 µl Ber-H2-Antikörper­ präparation inkubiert. Nach einem kurzen Waschen wurde ein Kaninchen-anti-Maus Ig Antikörper als Brückenantikörper appliziert. Nach erneutem Waschen wurde dann der Apapkomplex bestehend aus alkalischer Phosphatase und Antikörpern gegen alkalische Phosphatase für 30 Minuten aufgetragen. Nach erneutem Waschen erfolgte die Sichtbarmachung der gebundenen alkalischen Phosphatasemoleküle mit Hilfe der Neufuchsinre­ aktion (Stein et al., Lab. Invest. (1985)).
4. Extraktion und Reinigung der Toxine
Wie bereits oben erwähnt, wurden die Toxine aus Pflanzenma­ terialien extrahiert und anschließend nach in der Literatur mitgeteilten Verfahren gereinigt. Z.B. wurde Saporin 6 aus Saporin officinalis Samen (Stirpe et al., Biochem. J. 216, 617 (1983)) extrahiert und nach Barbieri et al (J. Chroma­ togr. 408, 235 (1987)) gereinigt. Die Reinheit des Toxins wurde mit Hilfe der SDS-Elektrophorese analysiert. Sie erwies sich höher als 99%. Momordin wurde aus den Samen der Momordica charantia (L Barbieri et al., Biochem. J. 186, 443 (1980)) extrahiert und nach der von Barbieri et al. be­ schriebenen Methode (J. Chromagr., 408, 235 (1987)) gerei­ nigt. Die Reinheit dieses Toxins wurde ebenfalls mit der SDS-Elektrophorese untersucht. Der Reinheitsgrad erwies sich höher als 99%. PAP-S wurde aus Samen der Phytolacca americana extrahiert (Barbieri et al., Biochem. J. 203, 55 (1982)). Die Reinheit bestimmt mit der SDS-Gelelektrophorese erwies sich höher als 99%.
Die Aktivität der Toxine wurde mittels eines Proteinsyn­ these-Hemmtestes unter Anwendung eines in vitro Trans­ lationssystems mit Kaninchenretikulozyten-Lysaten studiert (F. Stirpe et al., Biochem. J. 240, 659 (1986)). Die IC50 (d. h. die molare Konzentration, die eine 50%-ige Hemmung der Proteinsynthese in dem beschriebenen System verursacht) wurde durch die Einbauhemmung von 14C-Leucin bestimmt. Die IC50 für Saporin, Momordin und PAP-S betrug 3,7 × 10-11 M (F. Stirpe et al., Biochem. J. 216, 617 (1983)) bzw. 6 × 10-11 M (L. Barbieri et al., Biochem. J. 186, 334 (1980)) bzw. 3,7 × 10-11 M (L. Barbieri et al., Biochem. J. 203, 55 (1982)).
5. Konjugation des Ber-H2-Antikörpers an die Toxine
Die Toxinkonjugation wurde durch chemische Reaktion zwischen den Ber-H2-Antikörpern und der RIP Typ 1 Toxine erhalten, wobei beide Reaktionspartner mit 2-Iminothiolan (2-IT) (Dinota et al., Brit. Journal Cancer 60, 315 (1989)) derivatisiert wurden.
Derivatisierung der Toxine
Den Toxinlösungen (9 mg/ml in 50 mM Natriumborat, pH-Wert 9) wurden 125 I-markiertes Toxin (106 c.p.m.) und 2-IT (Endkon­ zentration 1,0 mM) hinzugegeben. Nach 30 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von Glycin in einer Endkonzentration von 200 mM gestoppt. Nach weiteren 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Ellman′s Reagenz in Dimethylformamid in einer Endkonzen­ tration von 2,5 mM hinzugegeben. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation wurde das Gemisch über eine Sephadex-G-25-Säule (Pharmacia) gegeben. Die Elution erfolgte mit phosphatge­ pufferter Saline (PBS). Die Derivatisierung der Toxine wurde an einem Aliquat auf der Basis der optischen Dichte bei 280 nm und bei 412 nm vor und nach der Reaktion mit Dit­ hiothreitol (DTT) in einer Endkonzentration von 55 mM bestimmt.
Derivatisierung des Ber-H2-Antikörpers
Der Antikörperlösung (5 bis 25 mg/ml in 50 mM Natriumborat pH 9) wurde eine Lösung von 2-IT in einer Endkonzentration von 0,6 mM hinzugegeben. Die Derivatisierung und die eingeführten SH-Gruppen wurden in gleicher Weise wie bei den Toxinen bestimmt.
Konjugation
Die derivatisierten Toxine wurden in einem Amicon-Konzen­ trator in Stickstoffatmosphäre konzentriert und reduziert durch Zugabe 1/10 des Volumens von 0,55 mM DTT. Das redu­ zierte Toxin wurde von dem reduzierenden Reagenz durch Passage über eine Sephadex G25 Säule befreit und direkt in einem Amicon-Konzentrator gesammelt, in dem sich auch der derivatisierte Antikörper befand. Das Reaktionsgemisch wurde auf 1/4 des Volumens konzentriert und bei Raumtemperatur für 20 Stunden inkubiert und anschließend über eine hochauflö­ sende Gelfiltrationssäule mit Sephacryl S-200 (Pharmacia) gegeben und mit PBS eluiert. Die in den eluierten Fraktionen erhaltene Radioaktivität wurde mit der optischen Dichte bei 280 nm verglichen. Der erste Peak korrelierte mit einem Konjugat von hohem Molekulargewicht, der zweite Peak mit einem Konjugat von niedrigem Molekulargewicht; dann folgten Trimere, Dimere und Monomere des Toxins. Der freie Antikör­ per wurde mit der letzten Fraktion des niedrig-molekularen Konjugats koeluiert wie aus dem teilweise sich überlappenden Peak der Radioaktivität und der optischen Dichtmessung bei 280 nm hervorgeht (Figur 2).
Die Fraktionen, die das niedrig-molekulare Konjugat enthiel­ ten, wurden gesammelt; das Verhältnis von Toxin zu dem Ber- H2-Antikörper wurde ermittelt, indem die Absorption bei 280 nm und die Radioaktivität der Peaks des niedrig-moleku­ laren Konjugats und des freien Toxins in Bezug gesetzt wurden. Mit der beschriebenen Technik wurden Immunotoxine präpariert; repräsentativ für die Erfindung sind das Immuntoxin Ber-H2-Saporin 6 (Ber-H2/SO-6), Ber-H2/PAP-S und Ber-H2/Momordin. Das molare Verhältnis von Toxin und Antikörper bewegte sich - abhängig von dem Toxin und dem derivatisierenden Reagenz - zwischen 1 und 3. Im einzelnen beträgt dieses Verhältnis im Durchschnitt für das Immunoto­ xin Ber-H2/SO-6 2,25, für das Immunotoxin Ber-H2/PAP-S 1,55 und für das Immuntoxin Ber-H2/Momordin 1,75.
Die Bindungsaktivität wie auch die biologische Aktivität der Konjugate wurde bestimmt mit der unter 3. beschriebenen Technik. Wie in Figur 1 illustriert beeinträchtigt die Konjugation die Bindungscharakteristik des Ber-H2-Antikör­ pers in keiner Weise.
6. Charakterisierung der biologischen Aktivität der Immunokon­ jugate Ber-H2/RIP Typ 1-Toxine a) Hemmung der Proteinsynthese in einem zellfreien System
Die biologische Aktivität wird durch die Hemmung des Einbaus von 14-Leucin in Proteine gemessen, die in einem Retikulozyten-Lysatsystem wie unter 4. beschrieben, produziert werden. Die ermittelten IC50-Werte der hier beschriebenen Immunotoxine charakterisieren die Erfindung (Tabelle 1).
b) Hemmung der Proteinsynthese in einem zellhaltigen System
Das Verfahren wurde nach der Beschreibung von Stirpe et al., Biochem. J. 240, 659 (1986 durchgeführt). 2 × 104 COLE-Zellen, L428-Zellen oder L540-Zellen wurden in 200 µl RPMI 1640 Medium in einer 96-Mikrotiterlochplatte bei 37°C 24 Stunden lang entweder mit dem Antikörper, dem Toxin oder dem entsprechenden Immunotoxin in Konzen­ trationen zwischen 5 × 10-15 (5 × 10-13 für COLE-Zellen) und 5 × 10-8 M inkubiert. Dann wurden H3-Leucin (2 µCi/Loch) hinzugegeben; nach einer Inkubation von 18 Stunden bei 37°C wurden die Zellen mit einem Zellharvester (Titertek- Flow) geerntet. Die inkorporierte Aktivität wurde in einem ß-Counter (LKB) gemessen und die IC50 der verschie­ denen Moleküle mittels einer linearen Regressionsanalyse berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergege­ ben.
Es sei darauf hingewiesen, daß der IC50-Wert des freien Toxins höher ist als 10-8 M, während der Ber-H2-Antikörper überhaupt keine Toxizität entfaltet, sogar nicht in den höchsten Konzentrationen.
Tabelle 1
Hemmung der Proteinsynthese durch Immunotoxine

Claims (10)

1. Immunotoxine, gekennzeichnet durch einen Gehalt an monoklo­ nalen CD30 Antikörpern, kovalent gebunden an RIP Typ 1- Toxine.
2. Immunotoxine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die monoklonalen Antikörper dem Typ Ber-H2 angehören.
3. Immunotoxine nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die RIP Typ 1-Toxine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Saporin, Bryodin, aus Asparagus offici­ nalis gereinigte Toxin, PAP, Momordin, Momorcochin-S, Dinathin, Gelonin und Trichosanthin.
4. Immunotoxin nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das RIP Typ 1-Toxin Saporin, PAP und/oder Momordin ist.
5. Verfahren zum Herstellen der Immunotoxine nach den An­ sprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Toxin über heterobifunktionale Reagenzien an den Antikörper bindet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als heterobifunktionale Reagenzien N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)-propionat, 2-Iminothiolan, S-Acetyl-mercapto­ bernsteinsäureanhydrid, Carbodiimid oder Glutaraldehyd verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als heterobifunktionales Reagenz 2-Iminothiolan verwendet.
8. Pharmazeutische Präparate zur Behandlung von Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff Immunotoxine nach den Ansprüchen 1 bis 4 enthalten.
9. Pharmazeutische Präparate nach Anspruch 8 zur selektiven in vivo oder ex vivo Elimination von CD30-positiven Zellen.
10. Pharmazeutische Präparate nach den Ansprüchen 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Wirkstoff in Lösung oder als Suspension in therapeutisch wirksamer Dosierung enthal­ ten.
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