DE60110438T2

DE60110438T2 - Zusammensetzungen enthaltend stilbenoide mit einer hypoglykämischen wirkung

Info

Publication number: DE60110438T2
Application number: DE60110438T
Authority: DE
Inventors: Craig David HOPP; D. Wayne INMAN
Original assignee: Insmed Inc
Current assignee: Insmed Inc
Priority date: 2000-08-16
Filing date: 2001-08-15
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2021-08-16
Also published as: US20020058707A1; ATE293967T1; DE60110438D1; AU2001283353A1; EP1311257A2; US6410596B1; WO2002013811A2; EP1311257B1; WO2002013811A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Stilbenoiden, welche eine hypoglykämische und/oder antidiabetische Aktivität in Säugern, insbesondere beim Behandeln von Diabetes mellitus und beim Senken der Blutglucose aufweisen.
Zugehöriger Stand der Technik
Verwendungen von Cajanus SPP
Pflanzen von Cajanus spp. (Leguminoseae), insbesondere C. cajan, das auch als Taubenerbse oder Straucherbse bezeichnet wird, sind krautartige Mitglieder der Leguminoseae-Familie, welche verbreitet in Afrika, Asien und Süd- und Mittelamerika wachsen. Cajanus spp. sind in der traditionellen Medizin zum Behandeln von Magenschmerzen für Frauen, die für schwanger gehalten wurden, zum Behandeln von Wunden und Verbrennungen bzw. Verbrühungen, Zahnschmerzen, Gonorrhö, schlechter Sehkraft und Herzkrankheiten verwendet worden (Hedberg, H., et al., J. Ethnopharmacol, 9 (2/3), 237–260 (1983).
Neben ihrer Verwendung durch traditionelle Heiler können diese Pflanzen auch in der normalen Nahrung als eine Nahrungspflanze enthalten sein. Cajanus spp. werden z. B. von Menschen in Indien konsumiert. Zu diesem Zweck haben Studien über die Auswirkung des Konsums von Straucherbsen und Urdbohnen auf die Blutglucosespiegel und die Glucosetoleranz berichtet. (Srinivasan, M., Lancet 1957, 317 (1957)).
Es wurde berichtet, dass Extrakte aus Cajanus cajan eine hypoglykämische Aktivität aufweisen. Dhar berichtete, dass ein 50%iger ethanolischer Extrakt aus Cajanus cajan eine hypoglykämische Aktivität aufweist. Dhar, M. L., et al., Indian J. Exp. Biol., 6, 232 (1968).
Wenngleich Extrakte der Gattung Cajanus medizinisch verwendet worden sind, ist eine solche Verwendung nicht ohne potenzielle Nachteile. Erstens enthalten Pflanzenmaterialien neben einer oder mehreren Verbindungen mit einer "erwünschten" biologischen Aktivität oft auch eine große Zahl von in der Natur vorkommenden organischen Verbindungen, von denen eine oder mehrere eine physiologische oder pharmakologische Reaktion hervorrufen können, welche die Verwendung für die gewünschte Aktivität kontraindiziert. Zweitens kann, wenn in Form eines Pflanzenextrakts verabreicht wird, die tatsächliche Dosierung der unbekannten aktiven Verbindungen) nicht eingestellt werden, was zu einer unwirksamen Menge, d. h. einer zu niedrigen Konzentration, oder zu einer toxischen Menge, einer zu hohen Konzentration der verabreichten aktiven Verbindung führen kann.
Somit besteht ein Bedarf für eine isolierte oder eine gereinigte hypoglykämisch aktive Verbindung, Zusammensetzungen, welche therapeutisch wirksame Mengen einer solchen Verbindung umfassen, und Verfahren für ihre Verwendung.
Aus Cajanus SPP isolierte Verbindungen
Stilbenoide
Der Begriff Stilbenoid bezieht sich auf Stilbene, Bibenzyle und Phenyldihydroisocumarine zusammen mit einer Reihe von stickstofffreien Phenanthrenolen, von denen man annimmt, dass sie Produkte des gleichen Stoffwechselwegs sind, welcher zu Stilbenen führt. Siehe allgemein Gorham, J., Progress in Phytochemistry, Band 6, Reinhold, et al., Hrsg., Pergamon press, New York, 1980, Seiten 203–252. Stilbene (Dihydrostilbene) weisen im Allgemeinen die grundlegenden zwei stereoisomeren Formen, ein trans- und ein cis-Gerüst auf:
Im Allgemeinen sind in der Natur vorkommende Stilbene und Bibenzyle in den 3,3',4,4',5 und 5'-Stellungen hydroxy- und/oder methoxy-substituiert. Zu einigen in der Natur vorkommenden Stilbenen und Bibenzylen gehören Pinosylvin (3,5-Dihydroxystilben), Piceatannol (3,3',4,5'-Tetrahydroxystilben), Piceid (3,4',5-Trihydroxystilben-3-O-β-D-glucopyranosid) und Resveratrol (3,4',5-Trihydroxystilben). Mono-(3-Hydroxy-5-methoxystilben) und Dimethylether (3,5-Dimethoxystilben) von trans-Pinosylvin und ihre jeweiligen Dihydroderivate wurden angeblich aus dem Kernholz von Pinus armandi, P. morrisonicola und P. parviflorai isoliert. Fang, J-M, et al., Phytochemistry 27 (5): 1395–1397 (1988).
Stilbenoide können auch in den ortho-(C-2 oder C-6) oder para-(C-4)-Stellungen prenyliert oder homogeranyliert sein. Longistylin A (3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben), B (3,5-Dihydroxy-2,4-di(3-methyl-2-butenyl)stilben), C (3-Hydroxy-5-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)stilben) und D (3,5-Dihydroxy-2,6-di(3-methyl-2-butenyl)stilben) wurden aus der Rinde und der Wurzel von Lonchocarpus longistylus isoliert. Monache, F. D., et al. (Lloydia 40 (2), 201–208 (1977)). 4-Isopentenylresveratrol (3,4',5-Trihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben) wurde aus Arachis hypogea isoliert (Keen, N. T., et al., Phytochemistry 15, 1794 (1976)). Ein prenylierter Pinosylvindimethylether (3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben) wurde aus Derris rariflora (Braz Filho, R., et al., Phytochemistry 14, 261 (1975a)) und D. floribunda isoliert (Braz Filho, R., et al., Phytochemistry 14, 1454 (1975b)). Ein prenylierter Resveratroltrimethylether (3,4',5-Trimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben) wurde angeblich auch aus D. floribunda isoliert (Braz Filho, R., et al., 1975b). Chlorophorin (4-Homogeranyl-2,3',4,5'-tetrahydroxystilben) wurde aus Chlorophora excelsa isoliert (Grundon, M. F., et al., Nature (Lond.) 163, 154 (1949)). Das Auftreten von mit Isoprenketten substituierten Stilbenen in Pflanzen wurde auch von King und Grundo (J. Chem. Soc. 1950, 3547 (1950)); und Cooksey (Cooksey, C. J., et al., Phytochemistry 21 (12), 2935 (1982)) beschrieben.
Prenylierte Bibenzyle sind aus Radula spp. isoliert worden. Asakawa, Y., et al. berichteten über die Isolierung von 3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-bibenzyl aus R. variabilis (Phytochemistry 17, 2005 (1978a)) sowie über die Synthese von Mono- und Dimethylethern und entsprechenden Tetrahydroderivaten. Asakawa berichtete über die Isolierung von in 4-Stellung prenylierten oder geranylierten Bibenzylen aus Radula complanata (Asakawa, Y. et al., Phytochemistry 17, 2115 (1978b)). Asakawa berichtete auch über die Isolierung von Pienylbibenzylen aus Radula kojana (Asakawa, Y., et al., Phytochemistry 30 (1), 219 (1991)).
Vier isoprenylierte Stilben-2-carbonsäure-phytoalexine (3-Hydroxy-5-methoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure, 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure, 3,5-Dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure und 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure) wurden angeblich aus den Blättern von mit Botrytis cinerea befallenem Cajanus cajan isoliert (Cooksey, CJ, et al., Phytochemistry 21 (12): 2935–2938 (1982)).
Es wurden verschiedene biologische Aktivitäten der Stilbenoide beschrieben. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Stilbenoide antioxidative Aktivitäten [Resveratrol] (A. Fauconneau, B., et al., Life Sci. 61 (21): 2103 (1997)); eine antimykotische Aktivität [3,3',4,5'-Tetrahydroxystilben] (Inamori, Y., et al., Chem. Phar. Bull. 33 (7): 2904–09 (1985)); eine gegen die Plättchenaggregation gerichtete Aktivität [Resveratrol] (Chung, M-I, et al., Planta Med. 1992 58: 274–275; und Kimura, Y., et al., Biochim. Biophys. Acta 1995 185, 275–278); eine koronargefäßerweiternde Aktivität (Inamori, Y., et al., Chem. Pharm. Bull. 35, 887–89 (1987)); eine Antileukämieaktivität (Mannila, E., Phytochemistry, 1003, 33 (813–816) und eine Protein-Tyrosinkinase hemmende Aktivität (Orsini, F., et al., J. Nat. Prods. 60, 1082–1087 (1997)) aufweisen.
Aus Pferocarpus marsupium isoliertes Pterostilben (3,4',5-Trimethoxystilben) senkte angeblich signifikant den Plasmaglucosespiegel und das Körpergewicht von STZ-induzierten diabetischen Ratten (Manickam, M., et al., J. Nat. Prods. 60, 609–610 (1996)). Es wurde berichtet, dass sowohl die wässrigen als auch die alkoholischen Extrakte des Kernholzes von Pterocarpus marsupium eine Verringerung des Blutzuckerspiegels herbeiführen (Shah, D. S., Ind. J. Med. Res. 55 (2), 166–168 (1967)).
Die internationale Patentanmeldung WO 00/69430 von Nag et al., veröffentlicht am 23. November 2000, beschreibt Diphenylethylenverbindungen mit der Formel:
worin R Wasserstoff oder -CO₂Z ist, Z Wasserstoff oder ein Kation ist; R₁, R₂ und R₃ jeweils unabhängig voneinander H, -OH oder OR₄ sind, worin R₄ ein lineares oder verzweigtes Alkyl mit 1–12 Kohlenstoffatomen ist; mit der Maßgabe, dass, wenn R Wasserstoff ist und R₂ = R₃ = OMe, dann R₂ nicht OH ist.
Diese Verbindungen sind angeblich für die Behandlung von Diabetes brauchbar.
WO 00/26167 offenbart Diphenylethane (bibenzenes) und Stilbene und ihre Salze für die Behandlung von Typ-I-Diabetes und zum Verstärken der Sekretion von Insulin. Die Dosierungen können bis zu 3 × 1000 μg/kg/Tag betragen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung mit der Formel (I):
worin A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation;
R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und -COOH;
R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy;
R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl;
R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy;
R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl;
R₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; und
R₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy;
wobei wenigstens eines von R₃ und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl;
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon;
und eines Trägers zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zum Ergänzen der Nahrung eines Säugers, der an erhöhten Blutglucosespiegeln leidet.
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(A) Longistylin C;
(B) Longistylin A;
(C) Longistylin A-6-carbonsäure;
(D) 7,8-Dihydrolongistylin C;
(E) 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C;
(F) 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-6-carbonsäure;
(G) 3-Hydroxy-4-(3-methylbutyl)-5-methoxy-7,8-dihydrostilben-2-carbonsäure;
(H) 4-Isopentenylresveratrol(3,4',5-Trihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben;
(I) 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben;
(J) 3,4',5-Trimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben;
(K) Chlorophorin;
(L) 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;
(M) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;
(N) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure;
(O) 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;
(P) 5-Hydroxy-3-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;
(Q) 3,5-Dihydroxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;
(R) 3-Hydroxy-5-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;
(S) 5-Hydroxy-3-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;
(T) 3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan;
(U) 3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan;
(V) 3,5-Diacetyl-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan;
(W) 3,4',5-Trihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan;
(X) 3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan;
(Y) 3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan;
(Z) 2-Geranyl-3,5-dihydroxydiphenylethan;
(AA) 2-Geranyl-3,5-dimethoxydiphenylethan;
(AB) 2-Geranyl-3-hydroxy-5-methoxydiphenylethan; und
(AC) 3-Methoxy-4'-hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan;

Die vorliegende Erfindung ist ferner gerichtet auf die Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung mit der Formel (I):
worin
A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation;
R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und -COOH;
R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy;
R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl;
R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy;
R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl;
R₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und Methoxy; und
R₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy;
wobei wenigstens eines von R₃ und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl;
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon;
und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers zur Herstellung eines Medikaments zum Senken der Blutglucose bei einem Säuger.
Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf die Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

In speziellen Ausführungsformen ist die Erfindung gerichtet auf die Verwendung der vorstehenden Verbindungen für die Behandlung von Typ-I-Diabetes, Typ-II-Diabetes oder als hypoglykämische Mittel zum Verringern der Blutglucose in Situationen von akutem Stress, wie er bei Tieren oder Patienten mit Hyperthermie, Trauma, Sepsis oder Verbrennungen auftritt, oder für die Behandlung von Hyperglykämie in Verbindung mit einer schweren Kopfverletzung, Gehirnthrombose, Enzephalitis oder Hitzschlag oder für die Behandlung von angeborenen Glycogenspeicherstoffwechselerkrankungen und Hyperglykämie, die als Komplikation bei einer Anästhesie auftritt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Liniendiagramm, das die Plasmaglucosespiegel (mg/dl) von db/db-Mäusen zeigt, die mit Vehikel allein, Metformin oder 1000 mg/kg b. i. d. von angereicherten Extrakten von Cajanus cajan (EE1, EE2, EE3 oder EE4) wie in dieser Anmeldung beschrieben behandelt wurden. Der entsprechende Extrakt oder die Verbindung wurde den Tieren bei 0, 8, 24, 32, 48, 56, 72, 80 und 96 Stunden verabreicht. Die Plasmaglucosespiegel wurden bei 0 (vorher), 3 (Tag 1), 51 (Tag 3) und 99 (Tag 5) Stunden nach der Anfangsdosierung gemessen. Alle Datenpunkte N = 8 *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 (Varianzanalyse, einfaktoriell).
2 ist ein Liniendiagramm, das die Plasmaglucosespiegel (mg/dl) von db/db-Mäusen zeigt, die mit Vehikel allein oder 250 mg/kg q. d. von Verbindung A, Verbindung B (Referenz) oder Verbindung C behandelt wurden. Die entsprechende Verbindung wurde den Tieren bei 0, 8 und 24 h verabreicht und die Plasmaglucosespiegel wurden bei 0, 3, 6, 8, 24 und 30 Stunden gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,0001 (Varianzanalyse (ANOVA); einfaktoriell).
3 ist ein Liniendiagramm, das die Plasmaglucosespiegel (mg/dl) von db/db-Mäusen zeigt, die mit Vehikel allein; 250 mg/kg q. d. von Metformin; und 62,5, 125 und 250 mg/kg q. d. von Longistylin C (Verbindung A) behandelt wurden. Die entsprechende Verbindung wurden den Tieren bei 0, 24 und 48 h verabreicht und die Plasmaglucosespiegel wurden bei 0, 6, 30 und 54 h gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,0001 (Varianzanalyse (ANOVA); einfaktoriell).
4 ist ein Liniendiagramm, das die Plasmaglucosespiegel (mg/dl) von db/db-Mäusen zeigt, die mit Vehikel allein; 250 mg/kg q. d. von Metformin; und 62,5, 125 und 250 mg/kg q. d. von Longistylin A-2-carbonsäure (Verbindung C) behandelt wurden. Die entsprechende Verbindung wurde den Tieren bei 0, 24 und 48 h verabreicht und die Plasmaglucosespiegel wurden bei 0, 6, 30 und 54 h gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,0001 (Varianzanalyse (ANOVA); einfaktoriell).
5 ist ein Liniendiagramm, das die Plasmaglucosespiegel (mg/dl) von db/db-Mäusen zeigt, die mit Vehikel allein; 250 mg/kg q. d. von Metformin; und 125 mg/kg q. d. von 7,8-Dihydrolongistylin C (Verbindung E), 125 mg/kg q. d. von 7,8-Dihydropinosylvin-monomethylether (Verbindung G) (Referenz) und 125 mg/kg q. d. von 7,8-Dihydrolongistylin A-2-carbonsäure (Verbindung H) behandelt wurden. Die entsprechende Verbindung wurde den Tieren bei 0, 24 und 48 h verabreicht und die Plasmaglucosespiegel wurden bei 0, 6, 30 und 54 h gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,0001 (Varianzanalyse (ANOVA); einfaktoriell).
6 ist ein Liniendiagramm, das die Plasmaglucosespiegel (mg/dl) von db/db-Mäusen zeigt, die mit Vehikel allein; und 125 mg/kg q. d. von Longistylin C (Verbindung A), 125 mg/kg q. d. von Longistylin A (Verbindung D), 125 mg/kg q. d. von 7,8-Dihydrolongistylin C (Verbindung E) und 125 mg/kg q. d. von 2'',3'',7,8-Tetrahydrolongistylin C (Verbindung F) behandelt wurden. Die entsprechende Verbindung wurde den Tieren bei 0, 24 und 48 h verabreicht und die Plasmaglucosespiegel wurden bei 0, 6, 30 und 54 h gemessen. Alle Datenpunkte N = 8. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,0001 (Varianzanalyse (ANOVA); einfaktoriell).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen
So wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, wird der Begriff "unabhängig voneinander" oder die Äquivalente davon eingesetzt, um den Fall zu beschreiben, dass zwei oder mehr Gruppen gleich oder voneinander verschieden sein können und das Auftreten von einer Gruppe keine Auswirkung oder keinen Einfluss auf das Auftreten der anderen Gruppe hat.
Der Begriff "Alkyl" bezieht sich auf einen einwertigen von einem Alkan (Kohlenwasserstoff) abgeleiteten Rest, der 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, sofern nichts anderes angegeben ist. Er kann geradkettig oder verzweigt sein. Zu bevorzugten geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen gehören Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, 3-Butyl, t-Butyl, 3-Methylbutyl und 3,7-Dimethyloctyl. Alkyl schließt auch eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe ein, welche einen Cycloalkylenteil enthält oder durch einen Cycloalkylenteil unterbrochen ist.
Der Begriff "Cycloalkyl" bezieht sich auf cyclische einwertige Alkane. Zu bevorzugten Cycloalkylgruppen gehören Cyclopentyl und Cyclohexyl.
Der Begriff "Alkenyl" bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest, der 2 bis 10 Kohlenstoffatome und wenigstens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält. Vorzugsweise ist eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung vorhanden und es können bis zu vier nichtaromatische (nicht mesomeriefähige) Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen vorhanden sein. Zu bevorzugten Alkenylgruppen gehören Ethenyl, Propenyl, Butenyl und Geranyl.
Der Begriff "Alkinyl" bezieht sich auf einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest, der 2 bis 10 Kohlenstoffatome und wenigstens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält. Es können bis zu drei Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen vorhanden sein. Zu bevorzugten Alkinylgruppen gehören Ethinyl, Propinyl und Butinyl.
Der Begriff "Alkoxy" bedeutet eine Alkylgruppe aus den angegebenen Kohlenstoffatomen, die durch eine Sauerstoffbindung gebunden ist.
Bevorzugte Stilbenoidverbindungen der Formel (I) werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Longistylin C (Verb. A);
Longistylin A (Verb. D);
Longistylin A-6-carbonsäure (Verb. C);
7,8-Dihydrolongistylin C (Verb. E);
7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C (Verb. F);
7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-6-carbonsäure (Verb. H);
3-Hydroxy-4-isoprenyl-5-methoxystilben-2-carbonsäure;
3-Hydroxy-4-(3-methylbutyl)-5-methoxy-7,8-dihydrostilben-2-carbonsäure;
4-Isopentenylresveratrol(3,4',5-Trihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; (Verb. AA);
3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben (Verb. AB);
3,4',5-Trimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben 27 (Verb. AC);
Chlorophorin (Verb. AD);
3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AE);
3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AF);
3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure (Verb. AG);
3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AH);
5-Hydroxy-3-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AI);
3,5-Dihydroxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AJ);
3-Hydroxy-5-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AK);
5-Hydroxy-3-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AL);
3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)diphenylethan (Verb. AM);
3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)diphenylethan (Verb. AN);
3,5-Diacetyl-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)diphenylethan (Verb. AO);
3,4',5-Trihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)diphenylethan (Verb. AP);
3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan (Verb. AQ);
3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan (Verb. AR);
2-Geranyl-3,5-dihydroxydiphenylethan (Verb. AS);
2-Geranyl-3,5-dimethoxydiphenylethan (Verb. AT);
2-Geranyl-3-hydroxy-5-methoxydiphenylethan (Verb. AU); und
3-Methoxy-4'-hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan (Verb. AV).
Pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Vehikel, eine hypoglykämisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I) und gegebenenfalls ein weiteres hypoglykämisches, antidiabetisches oder antilipidämisches Mittel, das zum Senken der Blutglucose oder zum Senken von Fettsäuren brauchbar ist.
Spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
Die folgenden Verbindungen veranschaulichen die Struktur und Nomenklatur der Verbindungen von Formel (I) und von anderen hier beschriebenen Verbindungen.
Verbindung A
Verbindung A kann auch als Longistylin C; 3-Hydroxy-5-methoxy-6-isoprenylstilben; 5-Hydroxy-3-methoxy-2-isoprenylstilben; 5-Hydroxy-3-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)stilben und 3-Methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)-5-t-(trans-styryl)phenol bezeichnet werden.
Verbindung B
Verbindung B (Referenz) kann auch als Pinosylvin-monomethylether; 3-Hydroxy-5-methoxystilben; und 3-Methoxy-5-(trans-styryl)phenol bezeichnet werden.
Verbindung C
Verbindung C kann auch als Longistylin A-6-carbonsäure; Longistylin A-2-carbonsäure; 3-Hydroxy-4-isoprenyl-5-methoxystilben-2-carbonsäure; 3-Hydroxy-4-(3-methyl-2- butenyl)-5-methoxystilben-2-carbonsäure; 2-Hydroxy-4-methoxy-3-(3-methyl-2-butenyl)-6-(trans-styryl)benzoesäure bezeichnet werden.
Verbindung D
Verbindung D (Verbindung 3) kann auch als Longistylin A; 3-Hydroxy-4-isoprenyl-5-methoxystilben; 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; 3-Methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)-5-(trans-styryl)phenol bezeichnet werden.
Verbindung E
Verbindung E (Verbindung 7, A) kann auch als 7,8-Dihydrolongistylin C; 5-Hydroxy-2-(3-methyl-2-butenyl)-3-methoxydiphenylethan; 3-Hydroxy-6-isoprenyl-5-methoxydiphenylethan; 5-Hydroxy-2-isoprenyl-3-methoxydiphenylethan bezeichnet werden.
Verbindung F
Verbindung F (Verbindung 6, IA) kann auch als 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C; 5-Hydroxy-3-methoxy-2-(3-methylbutyl)diphenylethan; 5-Hydroxy-3-methoxy-2-isopentenyl-diphenylethan; 3-Hydroxy-6-isopentenyl-5-methoxydiphenylethan; 3-Hydroxy-5-methoxy-6-(3-methylbutyl)diphenylethan; 1-(5-Hydroxy-3-methoxy-2-(3-methylbutyl)benzyl)-4-benzylethan bezeichnet werden.
Verbindung G
Verbindung G (Verbindung 5, IA) (Referenz) kann auch als 7,8-Dihydropinosylvinmonomethylether; 5-Hydroxy-3-methoxydiphenylethan; 3-Hydroxy-5-methoxydiphenylethan bezeichnet werden.
Verbindung H
Verbindung H (Verbindung 8) kann auch als 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-2-carbonsäure; 3-Hydroxy-4-isopentenyl-5-methoxybibenzyl-2-carbonsäure; 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methylbutyl)bibenzyl-2-carbonsäure bezeichnet werden.
Die hypoglykämisch aktiven Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln können direkt aus Cajanus spp., vorzugsweise aus C. cajan isoliert oder chemisch synthetisiert und aus einem Reaktionsgemisch isoliert werden. Die hypoglykämisch aktiven Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln, z. B. die Verbindungen A, B, C, E und H können auch direkt aus anderen Arten, z. B. Lonchocarpus longistylus (Verbindung A); Pinus spp (Verbindung B); Lonchocarpus violaceus (Jack) DC (Lonchocarpus longistylus Pittier) (Verbindung C); Radula kojana (Verbindung E); und Pinus strobus var. chiapensis (Verbindung G) isoliert werden. Die isolierten hypoglykämisch aktiven Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln können in gereinigter Form, vorzugsweise in im Wesentlichen gereinigter Form durch Säulenchromatographie, Umkristallisierung oder andere dem Fachmann bekannte Mittel erhalten werden. In einer weiteren Ausführungsform können die hypoglykämisch aktiven Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln auf eine Weise erhalten werden, welche zu einem angereicherten Extrakt oder Isolat mit dem gewünschten Stilbenoidgehalt in einer zweckmäßigen Dosierungsform führt. Die hypoglykämisch aktiven Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln, z. B. Verbindungen AA–AV, können auch direkt aus anderen Pflanzen isoliert werden, wozu z. B. Lonchocarpus violaceus (Monache 1977); Arachis hypogea (Ingham, J. L., Phytochemistry 15, 1791); Derris rariflora (Braz Filho, R., et al., Phytochemistry 14, 261 (1975a)); D. floribunda (Braz Filho, R., et al., Phytochemistry 14, 1454 (1975b)); Chlorophora excelsa (Grundon, M. F., Nature (Lond.) 163, 564 (1949)); und Radula complanata und R. kojana (Asakawa, Y., et al., 1978(a), 1978(b) und (1991), Keen, N. T., et al., Phytochemistry 15, 1794 (1976)) gehören, wie es in den folgenden Abschnitten ausführlicher beschrieben ist.
Verfahren zum Isolieren von hypoglykämisch aktiven Stilbenoiden
Die Verbindungen A–H können aus Cajanus spp., vorzugsweise C. cajan unter Verwendung der nachstehend beschriebenen veranschaulichenden Verfahren oder anderer Standardextraktions- und Reinigungsmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden.
Die Verbindungen A–H können aus anderen Ausgangsmaterialien durch dem Fachmann bekannte Methoden isoliert werden. Die Verbindung A wurde angeblich bereits aus Lonchocarpus violaceus (Monache et al., 1977) und aus Cajanus cajan (Chung Ts'ao Yao, 1985, 18, 2) isoliert. Die Verbindung B wurde angeblich aus Alnus sieboldiana (Betulaceae) (Asakawa, Y., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn 44, 2671 (1971) (1991)) isoliert. Die Verbindung C wurde angeblich aus Cajanus cajan isoliert (Cooksey, C. J. et al., 1982). Die Verbindung D (Longistylin A) wurde angeblich aus Lonchocarpus violaceus isoliert (Monache, et al., (1977)). Die Verbindung E (Dihydrolongistylin C) wurde angeblich aus Radula kojana isoliert (Asakawa, et al., Phytochemistry 30 (1), 219–234 (1991)); und die Verbindung G wurde angeblich bereits aus Pinus strobus var. chiapensis isoliert (J. Braz. Chem. Soc. 1996, 7, 1996). Die Verbindungen F und H wurden durch Hydrierung der Verbindungen A bzw. C hergestellt. Die Verbindungen AA–AP wurden angeblich von Asakawa 1978a, 1978b, 1991; Keen, N. T., et al., 1976; Braz Filho, R., et al., 1975a; und 1975b; Grundon, et al., 1949, und Monache, 1977, isoliert. Außerdem können die so erhaltenen Verbindungen A–H und AA–AV durch Chromatographie, Umkristallisierung oder andere Reinigungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt werden.
Isolierung und Reinigung von hypoglykämisch aktiven Stilbenoiden
Pflanzenmaterial aus dem natürlichen Ausgangsmaterial, z. B. Cajanus spp., vorzugsweise C. cajan (Leguminoseae) wird zunächst mit einem Lösungsmittel extrahiert, um einen Rohextrakt bereitzustellen, der die identifizierten Stilbenoide enthält. Mit "Pflanzenmaterial" wird ein beliebiger Teil der Pflanze, wie etwa Rinde, Blätter, Blüten, Wurzeln und Stängel, bezeichnet. Das Pflanzenmaterial kann gegebenenfalls vor der Extraktion zerkleinert, gemahlen, mazeriert oder anderweitig behandelt werden. Alternativ kann sich das Pflanzenmaterial bereits in einem pulverisierten, zerkleinerten, gemahlenen, mazerierten oder fein zerkleinerten Zustand befinden, wenn es in dieser Anmeldung verwendet wird. Zu geeigneten Extraktionslösungsmitteln gehören polare Lösungsmittel, unpolare Lösungsmittel oder Gemische davon. Zu brauchbaren polaren Lösungsmitteln gehören Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Aceton, Butanol, Ethylacetat, Wasser und Gemische davon, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Zu brauchbaren unpolaren Lösungsmitteln gehören Pentan, Hexan, Heptan, höhere Alkan- und andere Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Petroleumether.
Vorzugsweise wird das Pflanzenmaterial mit einem polaren Lösungsmittel extrahiert, um die Menge an Stilbenoiden zu maximieren, welche aus dem Pflanzenmaterial extrahiert werden kann. Mehr bevorzugt wird das Pflanzenmaterial mit einem Gemisch aus polarem Lösungsmittel und Wasser gewaschen, wobei das Verhältnis von Wasser zu polarem Lösungsmittel im Bereich von 1 : 99 bis 99 : 1 Volumen/Volumen (Vol./Vol.) liegt. Am meisten bevorzugt ist das polare Lösungsmittel ein organischer Alkohol wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, Butanol und dergleichen. Wenn der organische Alkohol Ethanol ist, beträgt das Verhältnis von Wasser zu organischem Alkohol vorzugsweise 5 : 95 bis 95 : 5 (Vol./Vol.), mehr bevorzugt 10 : 90 bis 30 : 70 (Vol./Vol) und am meisten bevorzugt 20 : 80 (Vol./Vol.).
Das Waschen des Pflanzenmaterials mit einem Lösungsmittel kann bei einer Temperatur von ungefähr Raumtemperatur bis ungefähr der Rückflusstemperatur des gewählten Lösungsmittels oder Lösungsmittelsystems, vorzugsweise bei Raumtemperatur, während 2 Stunden bis 72 Stunden, vorzugsweise während 24 Stunden durchgeführt werden, um die Menge an Stilbenoiden zu maximieren, welche aus dem Pflanzenmaterial isoliert werden kann.
Das Pflanzenmaterial kann auch gerührt, eingeweicht oder anderweitig dem Lösungsmittel ausgesetzt werden, um das Extraktionsverfahren zu erleichtern. Zum Beispiel kann das Pflanzenmaterial mechanisch vermischt, beschallt oder anderweitig in dem Lösungsmittel durch dem Fachmann bekannte Verfahren gerührt werden.
Der resultierende Rohextrakt kann anschließend filtriert werden, um unerwünschte feste Materialien oder Pflanzenabfallmaterialien, z. B. verbrauchte Pflanzenrückstände/materialien daraus zu entfernen und um ein Rohfiltrat zu erhalten, das die Stilbenoide enthält. Zu geeigneten Filterverfahren gehört das Leiten des Rohextrakts durch Diatomeenerde, z. B. Diatomeenerde, die unter der Marke "CELITE^TM" von Fisher Scientific Inc. (Los Angeles, Kalifornien) verkauft wird; oder einen Glasfiltertrichter. Eine Zentrifugation von Lösungen oder verdünnten Lösungen des Rohextrakts kann ebenfalls eingesetzt werden, um unerwünschte Feststoffe daraus zu entfernen.
Das Rohfiltrat wird konzentriert, vorzugsweise im Vakuum, und der resultierende Rückstand wird dadurch weiter gereinigt, dass er zwischen zwei Verteilungslösungsmitteln verteilt wird, um die Ausbeute und insgesamt erhaltene Reinheit der isolierten Stilbenoide zu erhöhen. Es ist wichtig, dass die Verteilungslösungsmittel ineinander unvermischbar sind. Vorzugsweise ist eines der Verteilungslösungsmittel ein nichtwässriges Lösungsmittel wie Toluol, Diethylether, Ethylmethylacetat, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Ethylacetat, Pentan, Hexan, Heptan, höhere Alkan(C < 7)lösungsmittel, Dichlormethan und andere Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Petroleumether, von denen der Fachmann weiß, dass sie in Wasser unvermischbar sind, oder imstande sind, Stilbenoide aufzulösen. Das wässrige Lösungsmittel sollte vorzugsweise imstande sein, in dem Pflanzenmaterial vorkommende Verunreinigungen aufzulösen.
Die organische Phase, welche die Stilbenoide enthält, wird abgetrennt, gegebenenfalls vereinigt und anschließend zur Trockne konzentriert, um ein Rohkonzentrat zu erhalten, welches an Stilbenoiden angereichert ist. Die zuvor beschriebenen Extraktions- und Filterschritte können wiederholt werden, um die Ausbeute und insgesamt erhaltene Reinheit der isolierten Stilbenoide zu erhöhen. Das Rohkonzentrat kann durch dem Fachmann bekannte Standardmethoden weiter gereinigt werden, um letztlich isolierte Stilbenoide zu erhalten. Zu beispielhaften Reinigungsmethoden gehören die Umkristallisation und die Chromatographie. Vorzugsweise wird das Rohkonzentrat unter Verwendung einer Flüssigchromatographie, z. B. Hochleistungsflüssigchromatographie, Vakuumblitzchromatographie und Adsorptionschromatographie gereinigt.
Es können verschiedene Harztypen verwendet werden, um die gewünschte chromatographische Wirkung zu erzielen. Zum Beispiel kann, um polare Verunreinigungen daraus zu entfernen, das Rohkonzentrat durch ein Adsorptionsharz (HP-20-Qualität-Harz, verkauft von Mitsubishi-Kasei, mit Sitz in White Plains, NY; C-18 (Octadecyl)-Harz, verkauft von J. T. Baker in Phillipsburg, NJ, oder Supelco von Bellefonte, PA; oder ein anderes Silicagel) geleitet werden, um die Stilbenoide je nach Polarität selektiv zurückzuhalten oder durchzulassen. Die Größe, das Molekulargewicht oder die Celluloseeigenschaften des gewünschten Harzmaterials können verwendet werden, um die Stilbenoide durch selektive Verwendung von Molekularsieb- oder Cellulose-basierten Harzen zu trennen.
Eine geeignete Gradientenlösung wird verwendet, um die Stilbenoide aus dem Rohkonzentrat auf der mit dem gewünschten Harz gefüllten Säule zu waschen und zu trennen. Ein geeigneter Gradient kann eine anfängliche Waschung mit einem Lösungsmittel, gefolgt von einem Elutionslösungsmittel einschließen. Geeignete Elutionslösungsmittel enthalten einen hohen Prozentsatz von Acetonitril (ACN), Methanol, Aceton, Dichlormethan, Ether/Hexan oder einem beliebigen anderen organischen Lösungsmittel oder von Gemischen davon, welche Stilbenoide von dem Harzmaterial in eine angereicherte Fraktion hinein ablösen können. Die angereicherte Fraktion besteht aus Stilbenoiden oder Gemischen davon. Das Elutionslösungsmittel kann bis zu 50% Wasser enthalten, um seine Polarität einzustellen oder zu optimieren. Die Art des Elutionslösungsmittels kann von der Art des verwendeten Harzes abhängen. Zum Beispiel kann für HP-20-Harz, das in Methanol äquilibriert ist, das Elutionslösungsmittel Dichlormethan sein; für C-18-Harz, das in 70% ACN/30% Wasser (Vol./Vol.) äquilibriert ist, ist ein Gradient mit zunehmender Acetonitrilkonzentration geeignet; oder für Silicagelharz, das in Hexan äquilibriert ist, kann das Elutionslösungsmittel ein Gradient mit zunehmender Konzentration von Ether in einer Ether/Hexan-Lösung sein.
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie (DSC) und magnetische Kernresonanz (NMR)-Analyse können verwendet werden, um festzustellen, welche der eluierenden Fraktionen eine angereicherte Fraktion ist und welche angereicherten Fraktionen die gewünschten Stilbenoide enthalten. Gegebenenfalls können verschiedene eluierende Fraktionen vereinigt und den vorstehend beschriebenen DSC und NMR-Analysen unterzogen werden. Die angereicherten Fraktionen können gegebenenfalls erneut gereinigt werden, wobei entweder das gleiche oder ein anderes Elutionsmittelsystem verwendet wird.
Die resultierenden Fraktionen, welche die Stilbenoide enthalten, werden konzentriert, gegebenenfalls im Vakuum. Die die Stilbenoide enthaltenden Fraktionen aus den vorstehend beschriebenen Chromatographieverfahren können vereinigt und durch aufeinander folgende Wiederholungen des Vorstehenden oder durch Umkristallisation oder andere Arten von Chromatographie weiter gereinigt werden. Gegebenenfalls können aufeinander folgende Reinigungen durch Umkristallisation oder Chromatographie durchgeführt werden, um gereinigte Stilbenoide zu erhalten.
Unter Verwendung der vorstehenden Reinigungsmethoden können die isolierten Stilbenoide gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden. "Im Wesentlichen gereinigt" bedeutet, dass die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln einen Reinheitsgrad von wenigstens 95% aufweisen. "Gereinigt" bedeutet, dass die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln einen Reinheitsgrad von wenigstens 97% aufweisen.
Organische Synthese von hypoglykämisch aktiven Stilbenoiden
Es gibt zwei Hauptverfahren zum Synthetisieren von Stilbenoiden, wobei es sich bei dem frühesten Verfahren um Variationen der Perkin-Kondensation einer Phenylessigsäure mit einem Benzaldehyd zum Bilden einer Stilben-α-carbonsäure, gefolgt von einer Decarboxylierung handelt (Funk, C., et al., Chem. Ber., 38, 939 (1905); Buckles, R. E., et al., J. Am. Chem. Soc. 73, 4972 (1951); und Letcher, R. M., Phytochemistry 12, 2789 (1973)). Außerdem wurde die Wittig-Reaktion zwischen einem Benzyltriphenylphosphoniumchlorid oder einem Diethylbenzylphosphonat und einem Benzaldehyd verwendet, um eine höhere Ausbeute eines überwiegend trans-Stilbens zu erhalten, (Gorham, J., Phytochemistry, 16, 249 (1977)); Wheeler, O. H., et al., J. Org. Chem. 30, 1473 (1965)). Bibenzyle werden auch leicht aus Stilbenen durch katalytische Hydrierung mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Kohlenstoff hergestellt.
Die Verbindungen der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln können auch halbsynthetisch aus anderen isolierten Stilbenoiden hergestellt werden. 3-Hydroxy-5-methoxy-4-isoprenylstilben-2-carbonsäure (Verbindung C) und 3-Hydroxy-5-methoxy-6-isoprenylstilben-2-carbonsäure wurden angeblich aus Cajanus cajan isoliert (Cooksey, C. J., et al., (1982)). Eine Methylierung dieser Verbindungen mit Diazomethan ergab 3,5-Dimethoxy-6-isoprenylstilben-2-carbonsäure bzw. 3,5-Dimethoxy-4-isoprenylstilben-2-carbonsäure, (Cooksey, C. J., et al., (1982)).
Prenylierte Bibenzyle sind halbsynthetisch aus Pinosylvin und Pinosylvin-monomethylether durch Hydrierung, Behandlung mit Natriummethoxid in Methanol und anschließend 2,2-Dimethylallylbromid hergestellt worden, wobei 3-Hydroxy-5-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan, 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan und 3-Hydroxy-2,4-di(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan erhalten werden. Asakawa beschrieb auch das Synthetisieren von 2-Geranyl-3-hydroxy-5-methoxydiphenylethan, 4-Geranyl-3-hydroxy-5-methoxydiphenylethan, 2,4-Digeranyl-3-hydroxy-5-methoxydiphenylethan, 2-Geranyl-3,5-dihydroxydiphenylethan; und 2-Geranyl-3,5-dimethoxydiphenylethan (Asakawa (1991)).
Hypoglykämisch aktive Stilbenoide können auch in vivo durch einen Phenylpropanoid-Polymalonat-Stoffwechselweg synthetisiert werden, (Pryce, R. J., Phytochemistry 10, 2679 (1971)).
Sobald die hypoglykämisch aktiven Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln synthetisiert worden sind, können sie unter Verwendung herkömmlicher Chro matographie, Umkristallisierung oder anderer Reinigungsmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden.
Derivate von hypoglykämisch aktiven Stilbenoiden
Ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen Ether- und Acetatderivate von Stilbenoiden, die zum Senken der Blutglucose brauchbar sind. Zum Beispiel können die Carbonsäuregruppen der Stilbenoid-2-carbonsäuren mit CH₂N₂ und Ether methyliert werden, um den Methylether davon herzustellen. Die Hydroxygruppen der Stilbenoide können auch durch Zugeben von Mel in Gegenwart von K₂CO₃ zu einer Verbindung in Me₂CO methyliert werden, wobei Mono- und Dimethylether erhalten werden (Asakawa, 1991).
Außerdem können die Hydroxylgruppen von diesen Stilbenoiden durch dem Fachmann bekannte Verfahren, z. B. unter Verwendung von Acetylchlorid acetyliert werden (Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 101, (1981)).
Es soll darauf hingewiesen werden, dass beliebige Hydroxylgruppen, die nicht so methyliert oder acetyliert sind, an der Bildung der vorstehend beschriebenen pharmazeutisch annehmbaren Salze von Stilbenoiden beteiligt sein können.
Pharmazeutische Zusammensetzungen von hypoglykämisch aktiven Stilbenoiden
Die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln können vermischt werden, z. B. mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für feste Zusammensetzungen wie Tabletten, Pellets oder Kapseln; Kapseln, die Flüssigkeiten enthalten; Suppositorien; Lösungen, Emulsionen, Suspensionen oder eine beliebige andere zur Verwendung geeignete Form. Zu geeigneten Trägern gehören z. B. steriles Wasser, sterile physiologische Salzlösung, Akaziengummi, Gelatine, Stärkekleister, Talk, Keratin, kolloidales Siliciumdioxid, Harnstoff und dergleichen. Außerdem können Hilfsmittel, Stabilisiermittel, Verdickungsmittel, Schmiermittel und Färbemittel verwendet werden. Die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln sind in den Zusammensetzungen in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um eine gewünschte Wirkung auf Diabetes, Blutglucosespiegel; oder Hyperglykämie auszuüben.
Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können in Form von Tabletten, Trochisken, Pastillen, wässrigen oder öligen Suspensionen, Körnchen oder Pulvern, Emulsionen, Kapseln, Sirupen oder Elixieren vorliegen. Oral verabreichte Zusammensetzungen können ein oder mehrere Mittel wie etwa Süßungsmittel wie Fructose, Aspartam oder Saccharin; Aromastoffe wie Pfefferminz, Wintergrünöl oder Kirsche, Färbemittel und Konservierungsmittel enthalten, um eine pharmazeutisch schmackhafte Zubereitung bereitzustellen. Außerdem können Zusammensetzungen in Tablettenform überzogen sein, um den Zerfall und die Absorption im Gastrointestinaltrakt zu verzögern, wodurch eine anhaltende Wirkung über einen längeren Zeitraum bereitgestellt wird. Selektiv permeable Membranen, welche eine osmotisch aktive treibende Verbindung umgeben, sind ebenfalls geeignete oral verabreichte Zusammensetzungen. In diesen letztgenannten Plattformen wird Flüssigkeit aus der Umgebung der Kapsel durch die treibende Verbindung aufgesaugt, welche quillt, wobei der Wirkstoff oder die Wirkstoffzusammensetzung durch eine Öffnung verdrängt wird. Diese Verabreichungsplattformen können ein Verabreichungsprofil von im Wesentlichen nullter Ordnung bereitstellen, im Gegensatz zu den zackenförmigen Profilen von Formulierungen mit sofortiger Freigabe. Ein Zeitverzögerungsmaterial wie Glycerinmonostearat oder Glycerinstearat kann ebenfalls verwendet werden.
Wässrige Suspensionen, welche die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln enthalten, können auch ein oder mehrere Konservierungsmittel wie z. B. Ethyl- oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat, ein oder mehrere Färbemittel, Aromastoffe oder Süßungsmittel enthalten.
Nahrungsergänzungsmittel, die hypoglykämisch aktive Stilbenoide enthalten
Die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln können in Form eines Nahrungsmittel- bzw. Futteradditivs, Nahrungs- bzw. Futterergänzungsmittels, Nahrungsergänzungsmittels, z. B. in fester, halbfester oder flüssiger Form, verwendet werden, welche wenigstens eines der Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln, vorzugsweise Longistylin C (Verbindung A), Longistylin A-6-carbonsäure (Verbindung D); Longistylin A (Verbindung C); 7,8-Dihydrolongistylin C (Verbindung E); 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C (Verbindung F); und 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A- 6-carbonsäure (Verbindung H), einschließlich ihrer therapeutisch wirksamen Salze, als bioaktive Komponente enthält. Wenn es in Nahrungsmittel eingearbeitet ist, kann das hypoglykämisch aktive Stilbenoid als eine isolierte Verbindung verwendet werden oder in einer angereicherten Fraktion eines Pflanzenextrakts enthalten sein.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen können in Nahrungsmittel allein oder in Kombination mit einer anderen antidiabetischen, antihyperglykämischen (Blutglucose-senkenden) oder antilipidämischen Verbindung in Mischung mit einem Träger oder einem Excipiens, das sich für eine orale Verabreichung eignet, eingearbeitet sein.
Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können in Form von Nahrungsmitteln vorliegen, welche die Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen.
Es kann eine beliebige herkömmliche Nahrungsmittelverarbeitungsmethode verwendet werden, um ein Produkt zu erzielen, das die wirksame Menge der Stilbenoidverbindung der Formel (I) umfasst. Es gibt viel Information über das Fachgebiet und die Technologie der verschiedenen herkömmlichen Nahrungsmittelverarbeitungsmethoden und ihre praktische Durchführung sowohl in der Heimtierfutter- als auch der Nahrungsmittelindustrie, und es wird entsprechend angenommen, dass die allgemeinen Prinzipien dieser Methoden dem Fachmann bekannt sind.
Bei der Zugabe eines Stilbenoids zu einem Trägermaterial ist das Verfahren zur Aufnahme der Stilbenoidverbindung nicht auf ein reines Backen oder Entwässern beschränkt, sondern kann auch Methoden wie eine Extrusionsverarbeitung, Coextrudieren und die Herstellung von Konserven einschließen. Außerdem kann das Verfahren, durch welches Granolariegel und Nahrungsmittelriegel hergestellt werden, zum Herstellen der vorliegenden Nahrungsmittel verwendet werden. So können bei der praktischen Durchführung der Erfindung verschiedene Arten von Nahrungsmittelprodukten zusätzlich zu Pulverinhaltsstoffen für Fertignahrungsmittel hergestellt werden. Zum Beispiel gehören zu Nahrungsmitteln, die bei der praktischen Durchführung der Erfindung hergestellt werden, Heimtiertrockenfutter, das als Vollnahrung für Heimtiere dient, sowie Biskuits und Leckerbissen für Heimtiere. Außerdem können aus den vorliegenden Nahrungsmitteln Getreideflockengerichte, Snacks und Nahrungsriegel für Menschen gebildet werden.
Ungeachtet des Verfahrens, durch welches die vorliegenden Nahrungsmittel oder die Komponenten darin hergestellt werden, ist es bevorzugt, dass die resultierenden Nahrungsmittel eine Stilbenoidkonzentration von wenigstens 0,1 g pro Nahrungs- bzw. Diäteinheit bereitstellen.
Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wird als das Trägermaterial ein trockenes Material mit proteinartigem oder mehlartigem Charakter in Betracht gezogen. Zu Beispielen für geeignete Trägermaterialien gehören: ein getrocknetes Bäckereiprodukt, die Mehle von Weizen, Reis, Hafer, Mais und Soja; die Kleien von Weizen, Reis, Hafer und Mais; Weizenmittelmehl, Weizenvollkornmehl, Maisglutenmehl, Maisvollkornmehl, Sojabohnenmehl, Gerste, Sorghum, Fleisch- und Knochenmehle, Geflügelmehl, Fischmehl, Hundetrockenfutter und die verschiedenen Materialien, welche typisch für herkömmliche handelsübliche und Premium-Heimtierfutterprodukte sind.
Das bei der praktischen Durchführung der Erfindung hergestellte Nahrungsmittel kann jede beliebige Form annehmen, die von Menschen oder Heimtieren verzehrt werden kann, wozu eine vollständige und ausgewogene Heimtiernahrung; ein trockenes oder halbtrockenes Produkt, welches ein Additiv für Heimtiernahrung oder menschliche Nahrung ist; oder granola-artige Riegel, Nahrungsriegel oder andere Snacks für Menschen gehören. Speziell wird, wenn das Nahrungsmittel ein Stilbenoid der Formel (I) umfasst, in Betracht gezogen, dass es als ein Inhaltsstoff eingesetzt wird, der in ein anderes Nahrungsmittel eingearbeitet werden soll. Zu diesem Zweck kann das Stilbenoid in Form eines Pulvers oder feinen Mehls vorliegen, welches dann als ein Inhaltsstoff für andere Nahrungsmittel dienen kann. Zu weiteren Beispielen für Nahrungsmittel, die für den menschlichen Verbrauch in Betracht gezogen werden, welche als Inhaltsstoff Stilbenoide enthalten können, die gemäß der Erfindung verarbeitet sind, gehören Füllungen oder Puddings (ähnlich wie Gelatinen und JELLO-Produkte) sowie funktionale Nahrungsmittel in flüssiger Gelform und Dosensuppen.
Verfahren zur Verwendung der hypoglykämisch aktiven Stilbenoide
Aufgrund der Aktivität der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Stilbenoide sind die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln, einschließlich Longistylin C (Verbindung A); Longistylin A-6-carbonsäure (Verbindung D); Longistylin A (Verbindung C); 7,8-Dihydrolongistylin C (Verbindung E); 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C (Verbindung F); und 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-6-carbonsäure (Verbindung H) oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon vorteilhafterweise brauchbare pharmazeutische Zusammensetzungen und Nahrungsergänzungsmittel. Solche Zusammensetzungen und Nahrungsergänzungsmittel können zum Behandeln von Säugern verwendet werden, die an Hyperglykämie oder Diabetes leiden, oder in der Tier- und Humanmedizin für die therapeutische Behandlung von Komplikationen, welche zu einer Hyperglykämie führen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel zum Senken der Blutglucose bei Säugern mit Typ-I- oder Typ-II-Diabetes verwendet. Außerdem können die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln vorteilhafterweise als hypoglykämische Mittel zum Verringern der Blutglucose in Situationen von akutem Stress verwendet werden, wie er bei Tieren oder Patienten mit Hyperthermie, Trauma, Sepsis, Verbrennungen oder solchen, die in Vollnarkose versetzt werden, auftritt. Eine Hyperglykämie, die manchmal mit einer schweren Kopfverletzung, Gehirnthrombose, Enzephalitis und Hitzschlag einhergeht, kann ebenfalls mit den Stilbenoiden der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln therapeutisch behandelt werden. Außerdem sind die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln als hypoglykämische Wirkstoffe für eine seltene angeborene Glycogenspeicherstoffwechselerkrankung brauchbar, die mit einer Hyperglykämie verbunden ist. Die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln, die in den in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren verwendet werden, eignen sich besonders zum Bekämpfen der Hyperglykämie bei Patienten, deren Blutglucose nicht durch eine Diät allein eingestellt werden kann. Außerdem sind die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln imstande, die Blutglucosespiegel ohne eine damit einhergehende Zunahme der Glucosespiegel im Urin zu senken.
Wenn sie einem Säuger zur tierärztlichen Verwendung oder einem Menschen zur klinischen Verwendung verabreicht werden, werden die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln in isolierter Form verabreicht. "Isoliert" bedeutet, dass die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln von anderen Komponenten aus (a) einem natürlichen Ausgangsmaterial wie einer Pflanze oder Zellkultur oder (b) einem synthetischen organischen chemischen Reaktionsgemisch abgetrennt werden.
Vorzugsweise werden die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln durch herkömmliche Methoden im Wesentlichen gereinigt, vorzugsweise gereinigt.
Wenn sie einem Säuger zur tierärztlichen Verwendung oder einem Menschen zur klinischen Verwendung verabreicht werden, können die Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln allein oder in Kombination mit einem beliebigen physiologisch annehmbaren Träger oder Excipiens verwendet werden, welcher bzw. welches für eine enterale oder parenterale Verabreichung geeignet ist. Wenn er für eine parenterale Verabreichung verwendet wird, muss der physiologisch annehmbare Träger steril und zur in vivo-Verwendung in einem Menschen oder zur Verwendung in einer tierärztlichen klinischen Situation geeignet sein.
Die in dieser Erfindung verwendeten Zusammensetzungen können durch eine Reihe von Verfahren verabreicht werden, unter anderem oral, intramuskulär, intravenös, subkutan, transdermal, rektal oder durch Inhalation. Wenngleich die bevorzugte Art und Weise der Verabreichung die orale Verabreichung ist, bleibt die genaue Art der Verabreichung der Entscheidung des praktischen Arztes überlassen. Sie sind besonders wirksam, wenn sie oral verabreicht werden.
Diese Erfindung umfasst die Verwendung eines Stilbenoids, vorzugsweise in isolierter oder gereinigter Form, das in einer Dosis von 1 bis 1000 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise von 2 bis 500 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, mehr bevorzugt 5 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, noch mehr bevorzugt 50 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag verabreicht wird. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung die Verwendung eines Stilbenoids der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln in einer Dosis von 5 bis 350 mg/kg Körpergewicht/Tag der Verbindung, die in einer Menge verwendet werden soll, welche dazu führt, dass die Zusammensetzungen eine therapeutisch wirksame hypoglykämische, antihyperglykämische oder antidiabetische Aktivität aufweisen. Die Dosierung der vorliegenden Zusammensetzungen zur Behandlung oder Verhütung von Hyperglykämie oder Diabetes oder zum Verringern der Blutglucosespiegel hängt von dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung sowie dem Alter, dem Gewicht und dem physischen Zustand des Patienten ab. Im Allgemeinen liegt die Tagesdosierung im Bereich von 1 bis 1000 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise von 2 bis 500 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, mehr bevorzugt 5 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, noch mehr bevorzugt 50 bis 350 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Die Behandlung kann nach Bedarf wiederholt werden, was von der Dosierung und dem Bedarf abhängt, z. B. kann eine Dosierung von 62,5, 125 oder 250 mg/kg Körpergewicht/Tag des Patienten bzw. Tieres in aufgeteilten Dosen verabreicht werden, um Diabetes oder Hyperglykämie zu verhüten oder zu behandeln oder um die Blutglucose zu senken. Die Behandlung kann z. B. fortgesetzt werden, bis der Blutglucosespiegel auf das gewünschte Niveau verringert ist oder auf einem gewünschten Niveau gehalten werden soll. Die angemessene Dosierung der Zusammensetzungen kann von dem medizinischen Fachmann leicht bestimmt werden.
Für die Behandlung von Diabetes, Hyperglykämie oder das Bewirken einer Senkung der Blutglucose kann eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, welche ein Stilbenoid der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon wie vorstehend beschrieben zusammen mit einem anderen antidiabetischen, antihyperglykämischen oder Blutglucose-senkenden Mittel enthält, wozu Insulin; ein Biguanid wie Metformin oder Buformin; ein Sulfonylharnstoff wie Acetohexamid, Chlorpropamid, Tolazamid, Tolbutamid, Glyburid, Glypizid oder Glyclazid; ein PPARγ-Agonist, wozu die Thiazolidindione (wie Troglitazon) gehören; ein α-Glucosidase-Inhibitor wie Acarbose oder Miglitol; ein β-Adrenoceptoragonist wie PL-316,243, Cholestyramin, Clofibrat, Colestipol, Fluvastatin, Gemfibrozil, Lovastatin, Niacin, Pravastatin, Probucol, hydrophiles Psyllium-Mucilloid, Simvastatin und Natriumdichloracetat gehören. Alternativ können die Zusammensetzungen, die ein hypoglykämisch aktives Stilbenoid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon umfassen, in Kombination mit, vor, gleichzeitig mit oder im Anschluss an die Verabreichung eines anderen antidiabetischen, antihyperglykämischen oder antilipidämischen Mittels wie vorstehend beschrieben verabreicht werden.
Wenngleich die Erfinder der vorliegenden Erfindung nicht auf einen bestimmten Wirkungsmechanismus zum Erklären der hypoglykämischen Aktivität der Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln festgelegt werden möchten, wird ins Auge gefasst, dass sie vorteilhafterweise sowohl für die Behandlung von insulinabhängigem oder Typ-I-Diabetes (früher als juveniler Diabetes oder Insulinmangeldiabetes bezeichnet) als auch von nicht-insulinabhängigem oder Typ-II-Diabetes (früher als Erwachsenendiabetes bezeichnet) brauchbar sein können. Die Stilbenoide der in dieser Anmel dung beschriebenen Formeln können gegebenenfalls in einer wirksamen Menge als pharmazeutisch annehmbare Carboxylat- oder Phenolatsalze unter Verwendung von Gegenionen wie Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, Zink und Eisen verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um das Verständnis der Erfindung zu unterstützen.
Beispiele
Beispiel für die Isolierung und Charakterisierung von Stilbenoidverbindungen
Materialien und Methoden
Eine analytische Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) wurde an einer Hitachi Model D-6500 Chromatography Data Station durchgeführt, die mit einem Interface D-6000, einer Pumpe L-6200A, einem automatischem Probengeber AS-2000, einem Diodenarray-Detektor L-4500A und einem in Reihe geschalteten Lichtstreudetektor Sedex 55 und einer HPLC-Säule Primesphere C18 HC, 4 × 50 mm (5 μm) ausgestattet war. Alle Chromatographieläufe wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Lösungsmittel mit HPLC-Reinheit wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Magnetische Kernresonanz (NMR)-Spektren wurden an einem Varian Unity Plus 400 oder einem Varian Unity 400-Spektrometer aufgezeichnet. Die NMR-Spektren von Verbindungen wurden in deuteriertem Chloroform aufgezeichnet. Ein- und zweidimensionale NMR-Versuche, darunter ¹N-NMR, ¹³C-NMR, Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (HMQC) und Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) ergaben Molekülstrukturinformation. Massenspektren wurden an einem Kratos MS-50 im hochauflösenden Power Electron Impact Scanning-Modus, 70 eV, aufgezeichnet. Die Auflösung wurde auf 2000 eingestellt, mit einer Abtastgeschwindigkeit von 10 s/Zerfall. Die Proben wurden mit einem Temperaturgradienten von 50° bis 300°C laufen gelassen, welcher mit einer Geschwindigkeit von 50°/min anstieg. Infrarotspektren wurden an einem Perkin-Elmer 1600 Series FTIR aufgezeichnet. Ultraviolettspektren wurden direkt von dem Hitachi Diodenarray-UV-Detektor an dem HPLC-System erhalten.
Isolierung von Stilbenverbindungen unter Verwendung einer Lösungsmittelextraktion
Extraktion und Isolierung in kleinem Maßstab
Zermahlenes Blattmaterial von Cajanus cajan (4,2 kg) wurde mit 50 l 80%igem Ethanol (EtOH) (80% Ethanol : 20% Wasser Vol./Vol.) durch mechanisches Rühren bei Raumtemperatur 24 Stunden extrahiert. Die Lösung wurde dann durch CELITE^TM filtriert und das Filtrat wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde anschließend in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet, wobei 521 g erhalten wurden. Dies wurde zwischen DCM (10 l) und H₂O (10 l) verteilt. Die DCM-Schicht wurde durch CELITE^TM geleitet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei 225 g Material erhalten wurden. Von diesem wurden 30,0 g an 37 g Si-Gel adsorbiert und einer offenen Säule zugegeben, die 180 g Si-Gel enthielt. Die Säule wurde mit Hexan und ansteigenden Prozentsätzen von Ethylacetat (EtOAc) eluiert. Es wurden insgesamt sieben Fraktionen gesammelt. Die Verbindung B (0,59 g), Verbindung A (1,05 g) und Verbindung C (1,21 g) von Fraktion vier wurden durch präparative HPLC-Trennung (MeCN/H₂O-Gradient, 60 ml/min) erhalten. Eine präparative HPLC (MeCN/H₂O-Gradient, 60 ml/min) von Fraktion zwei ergab Verbindung D (0,17).
Herstellung von angereicherten Stilbenoidextrakten von Cajanus spp
Zermahlenes Blattmaterial von Cajanus cajan (1245 kg) wurde in 10 l Ethanol/Wasser (80 : 20 Vol./Vol.) 24 Stunden bei Raumtemperatur mit konstantem Mischen gerührt. Die Ethanollösung wurde unter Vakuum durch einen Filtertrichter ("grobe" Porengröße) filtriert, im Vakuum zur Trockne eingedampft und in einem Vakuumofen über Nacht trocknen gelassen, wobei 200 g eines dunkelbraunen Materials (angereicherter Extrakt 1 (EE1)) erhalten wurden.
185 g von EE1 wurden beschallt und in 3 l Dichlormethan (DCM) und 3 l Wasser eingerührt, um sie aufzulösen. Dieses Gemisch wurde in einen Scheidetrichter überführt und über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Jegliche klare untere Schicht wurde entfernt und für eine spätere Vereinigung zurückbehalten. In Gegenwart einer Emulsion inner halb der DCM-Fraktion oder an der DCM/Wasser-Grenzfläche wurde der trübe Emulsionsanteil der unteren Schicht (DCM) entfernt. Der trübe Anteil der unteren Schicht wurde entfernt, zentrifugiert, in den Scheidetrichter zurückgeführt und erneut sich trennen gelassen. Dieses Verfahren wurde wiederholt, um die Trennung zwischen den Wasser- und DCM-Schichten zu vervollständigen.
Die untere Schicht (DCM) wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft, um den vorangereicherten Extrakt 2 (Vor-EE2) zu erhalten. Nach dem Konzentrieren wurde die Wasserschicht gefriergetrocknet, um den angereicherten Extrakt 3 (EE3) zu erhalten.
Der resultierende Vor-EE2 wurde in 2 l von 90% Ethanol/Wasser gelöst und zu 1,5 l Petroleumether (Petrolether) zugegeben. Dieses Gemisch wurde in einen Scheidetrichter überführt und sich in eine obere Schicht (Petrolether) und eine untere Schicht (90% Ethanol) trennen gelassen. Die untere Schicht wurde wiederholt einer 2-Phasen-Trennung unterworfen, bis die Petroletherschicht eine helle Farbe aufwies. In einem Fall wurde die untere Schicht in 800 ml Petrolether und anschließend erneut in 500 ml Petrolether extrahiert. Alle Petroletherfraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft, um eine angereicherte Extraktverbindung zu erhalten. Die zurückbleibende Ethanolfraktion wurde unter Vakuum eingedampft und ergab den am Ende erhaltenen angereicherten Extrakt 2 (EE2).
Ein wasserlöslicher Absud, angereicherter Extrakt 4 (EE4) wurde wie folgt hergestellt:
300 g nicht zermahlene Blätter in einem wasserdurchlässigen Beutel (Teebeutel) wurden in siedendes Wasser eingetaucht und 15 Minuten kochen gelassen. Am Ende der 15 Minuten wurde der Heizer abgeschaltet und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Überstand wurde durch Gaze und anschließend Filterpapier geleitet. Der Beutel wurde ausgequetscht, um Restflüssigkeit zu entfernen, welche zentrifugiert und filtriert wurde. Das Filtrat wurde auf ungefähr 375 ml konzentriert. Das resultierende Filtrat wurde durch Zugeben von 1,6 l Isopropanol zu dem Filtrat und Inkubieren des Gemisches in einem Kühlschrank (4°C) über Nacht ausgefällt. Das Gemisch wurde dann durch einen Filtertrichter ("grob") unter Vakuum filtriert. Der Überstand wurde zur Trockne eingedampft, wieder in Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet, wobei 24,16 g angereicherter Extrakt 4 (EE4) erhalten wurden.
Extraktion und Reinigung in großem Maßstab
Zermahlenes Blattmaterial von Cajanus cajan (11 kg) wurde in 110 l Methanol (MeOH) gerührt. Die MeOH-Lösung wurde durch 1 kg CELITETM filtriert und im Vakuum eingedampft, wobei 1,39 kg eines grünen öligen Materials erhalten wurden. Dieses Material wurde vier Stunden mit 20 l Aceton verrieben. Das Acetongemisch wurde durch 1 kg CELITE^TM vakuumfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei 721 g Feststoffe erhalten wurden. Die Feststoffe (538 g) wurden mit 4 l MeOH extrahiert, zu denen 1 l H₂O langsam unter Vermischen zugegeben wurde. Die resultierende milchige Suspension wurde auf eine 18 × 92 cm-Säule gepumpt, die HP 20 (Mitsubishi)-Sorbens enthielt. Die Säule wurde mit 95 : 5 MeOH/H₂O eluiert. Es wurden vierzehn 10 l-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 7–10 wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei 64 g eines öligen Feststoffs erhalten wurden. Dieses Material wurde in 6,5 l MeOH gelöst, zu dem 3,5 l H₂O zusammen mit 10 ml HOAc zugegeben wurden. Nach 30 Minuten wurde das Gemisch durch Whatman #2-Filterpapier filtriert. Sowohl die Feststoffe von der MeOH-Fällung als auch das Filtrat von der MeOH-Fällung wurden für die weitere Verarbeitung aufgehoben. Die Feststoffe von der MeOH-Fällung wurden über Nacht bei 40°C in einem Vakuumofen getrocknet. Dies ergab 10 g eines weißen amorphen Pulvers, welches zusammen mit 500 ml n-Hexan in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben wurde. Mit gutem Vermischen wurde Aceton zugegeben, bis die Lösung klar wurde. 1 g Entfärbungskohle wurde zu der gerührten Lösung zugegeben, welche anschließend durch ein Bett (2 g) von CELITE^TM vakuumfiltriert wurde. Das Filtrat wurde in einem Abzug über Nacht offen stehen gelassen, was zur Ausfällung von Feststoffen führte. Der Überstand wurde dekantiert und 40 ml Hexan und 5 ml Aceton wurden den Feststoffen wieder zugegeben, welche beim Stehen bei –10°C zwei Schichten bildeten. Dies ergab 10 g eines weißen amorphen Pulvers, welches zusammen mit 500 ml n-Hexan in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben wurde. Mit gutem Mischen wurde Aceton zugegeben, bis die Lösung klar wurde. 1 g Entfärbungskohle wurde zu der gerührten Lösung zugegeben, welche anschließend durch ein Bett (2 g) von CELITE^TM vakuumfiltriert wurde. Das Filtrat wurde über Nacht in einem Abzug offen stehen gelassen, was zur Ausfällung von Feststoffen führte. Der Überstand wurde dekantiert und 40 ml Hexan und 5 ml Aceton wurden den Feststoffen wieder zugegeben, welche beim Stehen bei –10°C während zwei Stunden zwei Schichten bildeten. Die Schichten wurden getrennt und die obere Schicht wurde unbedeckt über Nacht stehen gelassen, wobei farblose kristalline Feststoffe erhalten wurden. Das kristalline Material wurde mit einer minimalen Menge von 10 : 1 Hexan/Aceton verrieben und in einem geschlossenen Behälter bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Der Überstand wurde dekantiert und die Kristalle in einem Vakuumofen getrocknet, wobei 6 g Material erhalten wurden, die anhand der NMR- und HPLC-Diodenarray-Daten als Verbindung C identifiziert wurde. Die Ausbeute aus der Pflanze betrug 0,07%.
Schema 2
Das Filtrat von der MeOH-Fällung (10 l) wurde durch eine kleine Menge von C18 (Bakerbond, 40 mm) geleitet, gepumpt auf eine 100 × 5 cm C18-Chromatographiesäule, welche mit MeOH gewaschen und mit 65 : 35 : 0,1 MeOH/Wasser/HOAc äquilibriert worden war. Weitere 500 ml von 65 : 35 : 0,1 MeOH/Wasser/HOAc wurden durch die Säule gepumpt, um die Beladung zu vervollständigen. Die Säule wurde mit 80 : 20 : 01 MeOH/Wasser/HOAc eluiert. Es wurden zweiunddreißig Fraktionen gesammelt, die jeweils 1 l enthielten. Die Fraktionen 12–18 wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wobei 18 g Feststoffe erhalten wurden. Die Feststoffe (11,1 g) wurden in 700 ml Hexan dispergiert, wobei gerührt wurde. Zu der Dispersion wurde genug DCM (200 ml) zugegeben, um eine klare Lösung zu erzeugen. Zu dieser Lösung wurde 1 g Entfärbungskohle zugegeben. Die Suspension wurde 1 Stunde gerührt, anschließend durch ein Bett von CELITE^TM (39 g) filtriert. Das CELITE^TM-Bett wurde mit weiteren 100 ml von 7 : 2 Hexan/CH₂Cl₂ gewaschen. Die vereinigten Lösungen (1000 ml) wurden langsam (3 Stunden) auf ein Volumen von 300 ml eingedampft, wobei ein Stickstoffstrom verwendet wurde. Die Feststoffe wurden filtriert, in einem Vakuumofen getrocknet und wie folgt umkristallisiert. Das getrocknete Material (8 g) wurde in 10 ml DCM gelöst, zu dem 70 ml Hexan unter Rühren zugegeben wurden. Die Lösung wurde unbedeckt stehen gelassen, bis sich Feststoffe bildeten. Der Behälter wurde dann bedeckt und über Nacht bei –10°C stehen gelassen. Die resultierende erste Ausbeute an Kristallen wurde filtriert und beiseite gestellt. Der Überstand wurde konzentriert, wobei ein Stickstoffstrom verwendet wurde, und es wurde eine zweite Ausbeute an Kristallen gesammelt. Die ersten und zweiten Ausbeuten wurden vereinigt und in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet, wobei 5,4 g Verbindung A als ein gebrochen weißer Feststoff erhalten wurden. Die Identifizierung erfolgte anhand der NMR- und HPLC-Diodenarray-Daten. Die Ausbeute aus den Pflanzenmaterialien betrug 0,1%.
Schema 3
Halbsynthetische Herstellung von Stilbenoidverbindungen
Alle Mittel wurden so verwendet, wie sie erhalten wurden. Alle feuchtigkeitsempfindlichen Reaktionen erfolgten unter einer Stickstoffatmosphäre, wobei trockene Lösungsmittel verwendet wurden; luftempfindliche Reaktionen erfolgten unter einer Stickstoffatmosphäre. Die Verdampfung von Lösungsmitteln erfolgte bei Raumtemperatur, sofern nichts anderes angegeben ist. Eine Säulenchromatographie wurde an einer präparativen C-18-HPLC (Bakerbond) durchgeführt. ¹H-NMR und ¹³C-NMR wurden bei 400 MHz bzw. 100 MHz erhalten. Elementaranalysen wurden von dem Analytical Services De partment an der University of California, Berkeley, durchgeführt. Die Schmelzpunkte sind nicht korrigiert.
Herstellung von Verbindung E und Verbindung F aus Verbindung A
Eine Lösung von Verbindung A (394 mg) in MeOH (10 ml) wurde über 10% Pd-Holzkohle (41 mg) bei Raumtemperatur 3 Stunden lang unter 50 psi H₂ hydriert. Anschließend wurde der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Produkt wurde durch präparative C-18-HPLC (Bakerbond) gereinigt, wobei ein Gradient aus Acetonitril und Wasser als das Lösungsmittelsystem verwendet wurde und 289 mg Verbindung E als ein gebrochen weißer Feststoff erhalten wurde. UV (MeCN/H₂O, 8 : 2) λ_max 284 nm; IR (Dünnfilm) ν 3354, 2929, 1604, 1456, 1304, 1189, 1140, 1086 cm^–1; ¹H-NMR und ¹³C-NMR; EIMS m/z 296, 239, 191, 163, 137; HREIMS m/z 296,1761 (M+, Δ 5,2 ppm von ber.) und 26 mg von Verbindung F; UV (MeCN/H₂O, 8 : 2) λ_max 282 nm; IR (Dünnfilm) ν 3354, 2951, 1604, 1467, 1304, 1195, 1146 cm^–1; ¹H-NMR und ¹³C-NMR; EIMS m/z 298, 241, 193, 151, 137; HREIMS m/z 298,1927 (M+, Δ 2,0 ppm von ber.)
Herstellung von Verbindung G (Referenz) aus Verbindung B (Referenz)
Eine Lösung von Verbindung B (500 mg) in MeOH (15 ml) wurde über 20% Pd-Holzkohle (99 mg) bei Raumtemperatur 3 Stunden lang unter 50 psi H₂ hydriert. Anschließend wurde der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Produkt wurde durch präparative C-18-HPLC gereinigt, wobei ein Gradient aus Acetonitril und Wasser als das Lösungsmittelsystem verwendet wurde und 237 mg von Verbindung G als ein braunes Öl erhalten wurde. UV (MeCN/H₂O, 8 : 2) λ_max 278 nm; IR (Dünnfilm) ν 3365, 2929, 1598, 1456, 1195, 1146, 1059 cm^–1; ¹H-NMR und ¹³C-NMR; EIMS m/z 228, 137, 91; HREIMS m/z 228,1167 (M+, Δ 7,4 ppm von ber.)
Herstellung von Verbindung H aus Verbindung C
Eine Lösung von Verbindung C (212 mg) in MeOH (10 ml) wurde über 20% Pd-Holzkohle (43 mg) bei Raumtemperatur 3 Stunden lang unter 50 psi H₂ hydriert. Anschließend wurde der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Produkt wurde durch präparative C-18-HPLC gereinigt, wobei ein Gradient von Acetonitril und Wasser als das Lösungsmittelsystem verwendet wurde und 175 mg von Verbindung H als ein weißer Feststoff erhalten wurde. UV (MeCN/H₂O, 8 : 2) λ_max 269 nm; IR (Dünnfilm) ν 3398, 2951, 1609, 1456, 1271, 1140 cm^–1; ¹H-NMR und ¹³C-NMR; EIMS m/z 298, 268, 241, 207, 151, 137, 91; HREIMS m/z 342,1834 (M+, Δ 0,9 ppm von ber.)
Strukturaufklärung der Stilbenverbindungen VERBINDUNG A Longistylin C
Verbindung A (Longistylin C) wurde zuvor aus Lonchocarpus violaceus (Lloydia, 1977, 40, 201) und Cajanus cajan (Chung Ts'ao Yao, 1985, 18, 2) isoliert. Die Molekülformel von Verbindung A wurde auf der Grundlage eines Peaks in dem HREIMS bei m/z 294,1634 (M⁺, Δ 4,8 ppm von ber.) als C₂₀H₂₂O₂ bestimmt. Ein IR-Spektrum von Verbindung A wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3337, 2926, 1594, 1455, 1430, 1355 und 1316 auf. Die Struktur von Verbindung A wurde durch sorgfältige Interpretation der spektralen Daten aufgeklärt. Die Zuordnungen beruhten auf ein- und zweidimensionalen NMR-Versuchen, die dem Fachmann auf Gebiet der Strukturaufklärung bekannt sind und zu denen ¹H-NMR, ¹³C-NMR, Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (HMQC) und Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) gehören. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung A in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. In dem HMBC-Spektrum beobachtete Protonen-Kohlenstoff-Fernkorrelationen sind ebenfalls aufgeführt.
NMR-Daten für Verbindung A In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Verbindung B (Referenz)
Verbindung B (Pinosylvin-monomethylether) wurde ursprünglich im Jahr 1939 aus dem Kernholz von Kiefern isoliert (Liebigs Ann. Chem., 1939, 539, 116). Anschließend wurde sie in über 60 verschiedenen Pinus-Arten (Prog. in Phytochemistry, 1980, 6, 203) und Rinderurin (J. Nat. Prod., 1983, 46, 852) gefunden. Diese Verbindung wurde jedoch zuvor nicht aus Cajanus cajan beschrieben. Die Molekülformel für Verbindung B wurde durch das Auftreten eines Peaks im HRFABMS bei m/z 294,1633 (M⁺, Δ 4,5 ppm von ber.) als C₁₅H₁₄O₂ bestimmt. Das IR-Spektrum von Verbindung B wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3435, 1609, 1451, 1422 und 1086 auf. Die Struktur von Verbindung B wurde durch sorgfältige Interpretation der spektralen Daten aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung B in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. In dem HMBC-Spektrum beobachtete Protonen-Kohlenstoff-Fernkorrelationen sind ebenfalls aufgeführt.
NMR-Daten für Verbindung B In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Verbindung C Longistylin A-2-carbonsäure
Die Verbindung C wurde zuvor aus Cajanus cajan beschrieben (Phytochemistry, 1982, 21, 2935). Auf der Grundlage des Vorhandenseins eines Peaks bei m/z 337,1473 (Δ 9,9 ppm von ber.) in dem HRFABMS, der [M – H]^– entspricht, wurde festgestellt, dass Verbindung C die Molekülformel C₂₁H₂₂O₄ hat. Das IR-Spektrum der Verbindung C wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3422, 2968, 1702, 1629, 1451, 1277, 1170 und 1117 auf. Die Struktur von Verbindung C wurde durch sorgfältige Untersuchung der spektralen Daten aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung C in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. In dem HMBC-Spektrum beobachtete Protonen-Kohlenstoff-Fernkorrelationen sind ebenfalls aufgeführt.
NMR-Daten für Verbindung C In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Verbindung D Longistylin A
Verbindung D (Longistylin A) wurde zuvor aus Lonchocarpus violaceus (Lloydia, 1977, 40, 201) und Cajanus cajan (Chung Ts'ao Yao, 1985, 18, 2) isoliert. Die Molekülformel von Verbindung D wurde auf der Grundlage eines Peaks in dem HREIMS bei m/z 226,0981 (M⁺, Δ 5,6 ppm von ber.) als C₂₀H₂₂O₂ bestimmt. Das IR-Spektrum wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3328, 3027, 2940, 2839, 1592, 1497, 1454 und 1347 auf. Die Struktur von Verbindung D wurde durch Vergleich mit der Literatur und sorgfältige Untersuchung der spektralen Daten einschließlich ¹H-NMR, ¹³C-NMR, Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (HMQC) und Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung D in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben. In dem HMBC-Spektrum beobachtete Protonen-Kohlenstoff-Fernkorrelationen sind ebenfalls aufgeführt.
NMR-Daten für Verbindung D In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Verbindung E Dihydrolongistylin C
Verbindung E (7,8-Dihydrolongistylin C) wurde durch Hydrierung von Verbindung A hergestellt. Verbindung E wurde zuvor als ein natürliches Produkt beschrieben, das aus Radula kojana isoliert wurde (Phytochemistry, 1991, 30, 219). Die Molekülformel C₂₀H₂₄O₂ wurde durch einen Peak bei m/z 296,1761 (M⁺, Δ 5,25 ppm von ber.) in dem HREIMS von SP-36306 bestätigt. Das IR-Spektrum von Verbindung E wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3354, 2929, 1604, 1456, 1034, 1190, 1140 und 1086 auf. Die Struktur von Verbindung E wurde durch Vergleich mit der Literatur und sorgfältige Interpretation der spektralen Daten aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung E in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
NMR-Daten für Verbindung E In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Verbindung F Tetrahydrolongistylin C
Verbindung F (7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C) wurde durch Hydrierung von Verbindung A hergestellt und besitzt die Molekülformel C₂₀H₂₆O₂, was durch einen Peak in dem HREIMS von Verbindung F bei m/z 298,1927 (M⁺, Δ 2,05 ppm von ber.) belegt wird. Das IR-Spektrum von Verbindung F wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3354, 2951, 1604, 1467, 1304, 1195 und 1146 auf. Die Struktur von Verbindung F wurde durch sorgfältige Interpretation der spektralen Daten, einschließlich ¹H-NMR und ¹³C-NMR aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung F in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
NMR-Daten für Verbindung F In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Verbindung G (Referenz) 7,8-Dihydropinosylvin-monomethylether
Verbindung G (7,8-Dihydropinosylvin-monomethylether) wurde zuvor als ein natürliches Produkt beschrieben, das aus Pinus strobus var. chiapensis isoliert wurde (J. Braz. Chem. Soc., 1996, 7, 187). Die Verbindung wurde durch Hydrierung von Verbindung B hergestellt. Die Molekülformel für Verbindung G, C₁₅H₁₆O₂, wurde auf der Grundlage eines Peaks bei m/z 228,1167 (M⁺, Δ 7,36 ppm von ber.) in dem HREIMS von SP-36308 bestimmt. Das IR-Spektrum von Verbindung G wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3365, 2929, 1598, 1456, 1195, 1146 und 1059 auf. Die Struktur von Verbindung G wurde durch Vergleich mit der Literatur und sorgfältige Interpretation der spektralen Daten, einschließlich ¹H-NMR und ¹³C-NMR, aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von SP-36308 in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.
NMR-Daten für Verbindung G In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Verbindung H 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-2-carbonsäure
Verbindung H wurde durch Hydrierung von Verbindung C hergestellt. Auf der Grundlage eines Peaks in dem HREIMS bei m/z 342,1834 (M⁺, Δ 0,89 ppm von ber.) wurde festgestellt, dass die Molekülformel von Verbindung H C₂₁H₂₆O₄ ist. Das IR-Spektrum von Verbindung H wies Absorptionen bei ν (cm^–1): 3398, 2951, 1609, 1457, 1271 und 1140 auf. Die Struktur von Verbindung H wurde durch sorgfältige Untersuchung der spektralen Daten aufgeklärt. Werte für die chemischen Verschiebungen von Verbindung H in ¹H-NMR und ¹³C-NMR sind zusammen mit den Protonen-Kohlenstoff-Fernkorrelationen in der nachstehenden Tabelle angegeben.
NMR-Daten für Verbindung H In CDCl₃ erhaltene Spektren ¹³C-NMR @ 100 MHz; δ; ¹H-NMR @ 400 MHz; δ; Integral, Multiplizität, J
Hypoglykämische Aktivität der Stilbenoide
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Wirksamkeit der Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln beim Verringern von Plasmaglucosespiegeln in C57BL/ks-diabetischen (db/db)-Mäusen, d. h. einem im Fachgebiet anerkannten Modell für nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM).
In dem nachstehend beschriebenen in vivo-Mausmodell wurde eine repräsentative Auswahl von Stilbenanaloga getestet.
In vivo-Versuche; allgemeine Arbeitsvorschriften
Die folgenden Versuche werden angegeben, um das Verständnis der Erfindung zu unterstützen.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der Stilbenoide der in dieser Anmeldung beschriebenen Formeln, z. B. Longistylin A (Verbindung A); Pinosylvin-monomethylether (Verbindung B) (Referenz), Longistylin A-2-carbonsäure (Verbindung C); Longistylin A (Verbindung D); 7,8-Dihydrolongistylin C (Verbindung E); 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C (Verbindung F); 7,8-Dihydropinosylvin-monomethylether (Verbindung G) (Referenz) und 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-2-carbonsäure (Verbindung H) beim Verringern der Plasmaglucosespiegel in C57BL/ks diabetischen (db/db)-Mäusen, d. h. einem im Fachgebiet anerkannten Modell für nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM).
Materialien und Methoden
Genetisch veränderte fettleibige diabetische Mäuse (als C57BL/ks diabetisch oder db/db bezeichnet) wurden von dem Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) gekauft und dienten als Versuchstiere. Männliche Tiere im Alter von 8–9 Wochen wurden in den hier beschriebenen Untersuchungen eingesetzt. Die Tiere waren unter Standardlaborbedingungen bei 22°C und 50% relativer Feuchtigkeit untergebracht (4 Mäuse/Käfig) und erhielten eine Diät von Purina Nagetierfutter und Wasser ad libitum. Vor der Behandlung wurde Blut aus der Schwanzvene von jedem Tier entnommen. Mäuse, welche Plasmaglucosespiegel zwischen 350 und 600 mg/dl aufwiesen, wurden verwendet. Jede Behandlungsgruppe bestand aus acht Mäusen, welche so verteilt waren, dass die mittleren Glucosespiegel zu Beginn der Untersuchung in jeder Gruppe äquivalent waren. Db/db-Mäuse erhielten oral durch Sondenernährung: die Versuchsverbindung, die in einer Menge von 62,5, 125 oder 250 mg/kg/Tag verabreicht wurde (sofern nichts anderes angegeben ist), oder Metformin, das in einer Menge von 250 mg mmol/kg 1–3 Tage verabreicht wurde. Testverbindungen wurden in einem flüssigen Vehikel verabreicht, das 0,25% (Gew./Vol.) Carboxymethylcellulose, 1% (Vol./Vol.) Tween 60^® (Polyoxyethylensorbitanmonostearat) und bis zu 10% (Vol./Vol.) Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Volumen von 10 ml/kg enthielt. Blut wurde aus der Schwanzvene 3, 6, 8, 24 und 30 Stunden nach der Verabreichung (der ersten Verabreichung) der jeweiligen Verbindung in nichtnüchternem Zustand entnommen. Bei den Versuchen 3–5 wurde auch 54 Stunden nach der Verabreichung (der ersten Verabreichung) der jeweiligen Verbindung in nichtnüchternem Zustand Blut entnommen. Die Blutproben wurden hinsichtlich der Plasmaglucosespiegel analysiert. Die individuellen Körpergewichte und der mittlere Futterverbrauch (jeder Käfig) wurden ebenfalls täglich gemessen.
Die isolierten Testsubstanzen wurden wie vorstehend beschrieben (siehe oben) hergestellt. Metformin (1,1-Dimethylbiguanid), Carboxymethylcellulose und Tween 60 wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA; Katalog Nrn. D-5035, C-4888 bzw. p-1629) gekauft. Plasmaglucosespiegel wurden colorimetrisch unter Verwendung von Glucoseoxidase (Sigma Chemical Co.; Sigma Katalog Nr. 315) bestimmt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (wobei mit der Verbindung behandelte und mit Vehikel behandelte verglichen wurden) wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse und des Post-Hoc-Fisher-Tests bewertet.
Ergebnisse
Angereicherte Extrakte
Wie in 1 und in Tabelle 1a gezeigt ist, führte die orale Verabreichung von angereichertem Extrakt 2 in einer Dosis von 1000 mg/kg zu statistisch signifikanten Verringerungen der Plasmaglucosespiegel in db/db-Mäusen. Interessanterweise führte EE1 (ein ethanolischer Extrakt) zu hypoglykämischen Wirkungen, welche nach 5 Tagen signifikant waren. Dieser Extrakt war dem im Fachgebiet beschriebenen sehr ähnlich, aber signifikant weniger wirksam als der Lösungsmittel-extrahierte EE2 (Dhar, M. L., et al., Indian J. Exp. Biol., 6, 232 (1968)).
Vehikel, Metformin (250 mg/kg) oder angereicherter Extrakt (1000 mg/kg) wurden db/db-Mäusen 0 (Anfang), 8, 24, 32, 48, 56, 72, 80 und 96 Stunden nach der Anfangsdosis verabreicht.
Die Plasmaglucosespiegel wurden an der Grundlinie, 3 (Tag 1), 51 Stunden (Tag 3) und 99 Stunden (Tag 5) gemessen. Tabelle 1a

Ns: nicht signifikant

Verbindungen A, B und C
Wie in 2 und in den Tabellen 1 und 2 nachstehend gezeigt ist, führte die orale Verabreichung der Verbindungen A und C in einer Dosis von 250 mg/kg an db/db-Mäuse zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Plasmaglucose, bezogen auf das Vehikel (Kontrolle). Die folgenden Testsubstanzen wurden in db/db-Mäusen hinsichtlich der Fähigkeit zum Senken der Blutglucose bewertet: Longistylin C (5-Hydroxy-3-methoxystilben-2-carbonsäure) (Verbindung A); Pinosylvin-monomethylether (5-Hydroxy-3-methoxystilben) (Verbindung B) (Referenz); und Longistylin A-2-carbonsäure (3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben-2-carbonsäure) (Verbindung C). Die Testsubstanzen wurden in einer Reihe von Versuchen bewertet, welche in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 zusammengefasst sind.
Eine Anfangseinzeldosis von Verbindung A und zusätzliche anschließende Dosen von Verbindung C (250 mg/kg), die db/db-Mäusen 8 und 24 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung gegeben wurden, führten zu statistisch signifikanten Verringerungen der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen zu 6, 8, 24 oder 30 Stunden-Zeitpunkten nach der anfänglichen oralen Verabreichung. Sechs Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel für die aktive Versuchsverbindung A und C 130,6 mg/dl (p < 0,0001) bzw. 8,4 mg/dl (p = 0,0295), ausgehend von dem Grundlinienwert. Acht Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel für die aktiven Versuchsverbindungen A [02] und C [04] 129,1 mg/dl (p < 0,0001) bzw. stiegen 4,5 mg/dl (p = 0,0466), ausgehend von den Grundlinienwerten. 24 Stunden nach der Anfangsdosierung, unmittelbar nach der dritten Dosierung sanken die mittleren Glucosespiegel für die aktive Versuchsverbindung C 122,8 mg/dl (p = 0,0049), ausgehend von den Grundlinienwerten.
Einzeldosen von Verbindung A (250 mg/kg) in Vehikel wiesen ebenfalls einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 3 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung auf. Drei Stunden nach der Dosierung sanken die mittleren Glucosespiegel für die aktive Versuchsverbindung C, suspendiert in Vehikel, 80,3 mg/dl (p = 0,0797), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Dosen von Verbindung B (Referenz) (250 mg/kg) in Formulierung IV wiesen ebenfalls einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 30 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung auf. 30 Stunden nach der Dosierung stiegen die mittleren Glucosespiegel für die aktive Versuchsverbindung C, suspendiert in Formel (IV), nur 36,5 mg/dl (p = 0,1088), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Wie in Tabelle 3 nachstehend gezeigt ist, trat die antihyperglykämische Wirkung der Verbindungen A und C bei Dosierungsplänen von 250 mg/kg in Abwesenheit von jeglicher signifikanter ungünstiger Wirkung auf die Futteraufnahme oder das Körpergewicht auf. Die Körpergewichte waren bei den behandelten Tieren während des Testzeitraums (Tabelle 2) nicht beeinflusst. Es wurde festgestellt, dass die Futteraufnahme derjenigen Tiere, denen die Verbindungen A (250 mg/kg) und C (250 mg/kg) verabreicht wurden, geringer war als die des normalen Futteraufnahmebereichs (5–6 g/Tag/Maus)
Die Daten in den Tabellen 1, 2 und 3 deuten darauf hin, dass die vorstehend erwähnten Stilbenoide wirksame hypoglykämische Mittel in einem Nagetiermodell für Insulinresistenz, Fettleibigkeit und NIDDM sind.
Tabelle 1 Wirkungen von Testsubstanzen auf die Glucosesenkung bei diabetischen db/db-Mäusen
Tabelle 2 Wirkungen von Testsubstanzen auf die Glucosesenkung bei diabetischen db/db-Mäusen
Tabelle 3 Wirkungen von Testsubstanzen auf Körpergewichte und Futterverbrauch bei diabetischen db/db-Mäusen
Verbindung A
Wie in 3 und in Tabelle 4 nachstehend gezeigt ist, führte die orale Verabreichung von Verbindung A in Dosen von 62,5, 125 und 250 mg/kg an db/db-Mäuse zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Plasmaglucose, bezogen auf Vehikel (Kontrolle).
Longistylin C (Verbindung A) wurde in db/db-Mäusen hinsichtlich der Fähigkeit zum Senken der Blutglucose bewertet. Die Testsubstanz wurde in einer Reihe von Versuchen bewertet, welche in Tabelle 4 nachstehend zusammengefasst sind.
Einzeldosen von Verbindung A (62,5, 125 und 250 mg/kg) wurden db/db-Mäusen 24 und 48 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung gegeben und führten zu statistisch signifikanten Verringerungen der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 6, 30 oder 54 Stunden oder zu allen Zeitpunkten nach der oralen Verabreichung. Sechs Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 125 mg/kg und 250 mg/kg der aktiven Versuchsverbindung A verabreicht worden waren, 89,9 mg/dl (p = 0,0233) bzw. 79,3 mg/dl (p = 0,0367), ausgehend von dem Grundlinienwert. 30 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der zweiten Dosierung sanken die mittleren Glucosespiegel von Tieren, denen 62,5, 125 und 250 mg/kg der aktiven Versuchsverbindung A verabreicht worden waren, 62,8 mg/dl (p = 0,0153), 44,9 mg/dl (p = 0,0460) bzw. 158,5 mg/dl (p = 0,0001), ausgehend von den Grundlinienwerten. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der dritten Dosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 250 mg/kg der aktiven Versuchsverbindung A verabreicht worden waren, 144,5 mg/dl (p = 0,0001), ausgehend von den Grundlinienwerten.
62,5 und 125 mg/kg-Dosen von Verbindung A, suspendiert in Vehikel, wiesen ebenfalls einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 54 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung auf. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 62,5 und 125 mg/kg-Dosen der aktiven Versuchsverbindung A, suspendiert in Vehikel, verabreicht worden waren, 31,0 mg/dl (p = 0,1234) bzw. 34,3 mg/dl (p = 0,1106), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Zum Vergleich senkte das bekannte hypoglykämische Mittel Metformin, das in einer Menge von 250 mg/kg gegeben wurde, die Plasmaglucosespiegel um ungefähr 180,4 mg/dl (p = 0,0003) 6 Stunden nach der Anfangsdosis; und 112,4 mg/dl (p = 0,0016) 30 Stunden nach der Anfangsdosis, 6 Stunden nach der zweiten Dosis. Metformin, suspendiert in Vehikel wies ebenfalls einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 54 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung auf. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der Dosierung bei 48 Stunden sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen das in Vehikel suspendierte Metformin verabreicht wurde, 41,3 mg/dl (p = 0,0882), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Wie in Tabelle 5 nachstehend gezeigt ist, trat die antihyperglykämische Wirkung von Verbindung A in Dosierungsplänen von 62,5 mg/kg, 125 mg/kg und 250 mg/kg in Abwesenheit von jeglicher signifikanter nachteiliger Wirkung auf die Futteraufnahme oder das Körpergewicht auf. Die Körpergewichte wurden bei Tieren, die während des Testzeitraums behandelt wurden, nicht beeinflusst (Tabelle 5). Es wurde festgestellt, dass die Futteraufnahme der Tiere, denen 250 mg/kg Verbindung A verabreicht wurde, geringer war als die des normalen Futteraufnahmebereichs (5–6 g/Tag/Maus).
Diese Daten deuten darauf hin, dass die vorstehend erwähnten Stilbenoide wirksame hypoglykämische Mittel in einem Nagetiermodell für Insulinresistenz, Fettleibigkeit und NIDDM sind.
Tabelle 4 Wirkungen von Testsubstanzen auf die Glucosesenkung bei diabetischen db/db-Mäusen
Tabelle 5 Wirkungen von Testsubstanzen auf Körpergewichte und Futterverbrauch bei diabetischen db/db-Mäusen
Verbindung C
Wie in 4 und in Tabelle 6 nachstehend gezeigt ist, führte die orale Verabreichung von Verbindung C in Dosen von 62,5, 125 und 250 mg/kg an db/db-Mäuse zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Plasmaglucose, bezogen auf Vehikel (Kontrolle).
Longistylin A-2-carbonsäure (Verbindung C) wurde in db/db-Mäusen hinsichtlich der Fähigkeit zum Senken der Blutglucose bewertet. Die Testsubstanz wurde in einer Reihe von Versuchen bewertet, welche in Tabelle 6 nachstehend zusammengefasst sind.
Einzeldosen von Verbindung C (62,5, 125 und 250 mg/kg) wurden db/db-Mäusen 24 und 48 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung gegeben und führten zu statistisch signifikanten Verringerungen der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 6, 30 oder 54 Stunden oder zu allen Zeitpunkten nach der oralen Verabreichung. Sechs Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 250 mg/kg der aktiven Versuchsverbindung A verabreicht worden waren, 120,8 mg/dl (p = 0,0019), ausgehend von dem Grundlinienwert. 30 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der zweiten Dosierung, sanken die mittleren Glucosespiegel von Tieren, denen 62,5, 125 und 250 mg/kg der aktiven Versuchsverbindung 02 verabreicht worden waren, 40,7 mg/dl (p = 0,0322), 69,7 mg/dl (p = 0,0131) bzw. 221,4 mg/dl (p < 0,0001), ausgehend von den Grundlinienwerten. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der dritten Dosierung, sanken die mittleren Glucosespiegel von Tieren, denen 125 mg/kg und 250 mg/kg der aktiven Versuchsverbindung 04 verabreicht worden waren, 60,4 mg/dl (p = 0,0409) und 122,0 mg/dl (p = 0,0086), ausgehend von den Grundlinienwerten.
125 mg/kg-Dosen von Verbindung C, suspendiert in Vehikel, wiesen ebenfalls einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 6 Stunden nach einer anfänglichen oralen Verabreichung auf. Sechs Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen die aktive Versuchsverbindung C, suspendiert in Vehikel, verabreicht worden war, 34,3 mg/dl (p = 0,1287), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Zum Vergleich senkte das bekannte hypoglykämische Mittel Metformin, das in einer Menge von 250 mg/kg gegeben wurde, die Plasmaglucosespiegel um ungefähr 180,4 mg/dl (p < 0,0001) 6 Stunden nach der Anfangsdosis; und 112,4 mg/dl (p = 0,0009) 30 Stunden nach der Anfangsdosis, 6 Stunden nach der zweiten Dosis.
Metformin, suspendiert in Vehikel, wies auch einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 54 Stunden nach einer anfänglichen oralen Verabreichung auf. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die Glucosespiegel der Tiere, denen in Vehikel suspendiertes Metformin verabreicht wurde, 41,3 mg/dl (p = 0,0696), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Wie in Tabelle 7 nachstehend gezeigt ist, trat die antihyperglykämische Wirkung von Verbindung C in Dosierungsplänen von 62,5 mg/kg, 125 mg/kg und 250 mg/kg in Abwesenheit jeglicher signifikant nachteiliger Wirkung auf die Futteraufnahme oder das Körpergewicht auf. Die Körpergewichte wurden bei Tieren, die während des Testzeitraums behandelt wurden, nicht beeinflusst (Tabelle 7). Es wurde festgestellt, dass die Futteraufnahme derjenigen Tiere, denen 250 mg/kg Verbindung C verabreicht wurden, geringer war als die des normalen Futteraufnahmebereichs (5–6 g/Tag/Maus).
Die Daten in den Tabellen 6 und 7 deuten darauf hin, dass die vorstehend erwähnten Stilbenoide wirksame hypoglykämische Mittel in einem Nagetiermodell für Insulinresistenz, Fettleibigkeit und NIDDM sind.
Tabelle 6 Wirkungen von Testsubstanzen auf die Glucosesenkung bei diabetischen db/db-Mäusen
Tabelle 7 Wirkungen von Testsubstanzen auf Körpergewichte und Futterverbrauch bei diabetischen db/db-Mäusen
Verbindungen E, G (Referenz) und H
Wie in 5 und Tabelle 8 nachstehend gezeigt ist, führte die orale Verabreichung der Verbindungen E (7,8-Dihydrolongistylin C), G (7,8-Dihydropinosylvin-monomethylether) (Referenz) und H (7,8-Dihydrolongistylin A-2-carbonsäure) in Dosen von 125 mg/kg an db/db-Mäuse zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Plasmaglucose, bezogen auf das Vehikel (Kontrolle).
Longistylin C (Verbindung A) wurde in db/db-Mäusen hinsichtlich der Fähigkeit zum Senken der Blutglucose bewertet. Die Testsubstanz wurde in einer Reihe von Versuchen bewertet, welche in Tabelle 8 nachstehend zusammengefasst sind.
Einzeldosen der Verbindungen E (7,8-Dihydrolongistylin C), G (7,8-Dihydropinosylvinmonomethylether) (Referenz) und H (7,8-Dihydrolongistylin A-2-carbonsäure) wurden db/db-Mäusen 24 und 48 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung gegeben und führten zu statistisch signifikanten Verringerungen der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 30 oder 54 Stunden oder zu beiden Zeitpunkten nach der oralen Verabreichung. 30 Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 250 mg/kg der aktiven Versuchsverbindungen E und G verabreicht worden waren, 47,0 mg/dl (p = 0,0136) und 74,6 mg/dl (p = 0,0023), ausgehend von dem Grundlinienwert. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der dritten Dosierung, sanken die mittleren Glucosespiegel von Tieren, denen 125 mg/kg der aktiven Versuchsverbindungen E und H verabreicht worden waren, 54,7 mg/dl (p < 0,0001) bzw. 33,3 mg/dl (p < 0,0001), ausgehend von den Grundlinienwerten. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der dritten Dosierung, stiegen die mittleren Glucosespiegel von Tieren, denen 125 mg/kg der aktiven Versuchsverbindung G verabreicht worden waren, nur 12,0 mg/dl (p = 0,0071), ausgehend von den Grundlinienwerten.
125 mg/kg-Dosen der Verbindung G, suspendiert in Vehikel, wiesen auch einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 30 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung auf. 30 Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen die aktive Versuchsverbindung G, suspendiert in Vehikel, verabreicht worden war, 12,2 mg/dl (p = 0,0926), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Zum Vergleich senkte das bekannte hypoglykämische Mittel Metformin, das in einer Menge von 250 mg/kg gegeben wurde, die Plasmaglucosespiegel um ungefähr 113,6 mg/dl (p < 0,0001) 6 Stunden nach der Anfangsdosis und 25,1 mg/dl (p = 0,0471) 30 Stunden nach der Anfangsdosis, 6 Stunden nach der zweiten Dosis. 54 Stunden nach der Anfangsdosis, 6 Stunden nach der dritten Dosis, stiegen die Glucosespiegel von Tieren, denen Metformin in einer Menge von 250 mg/kg gegeben wurde, nur 6,8 mg/dl (p = 0,0033).
Wie in Tabelle 9 nachstehend gezeigt ist, trat die antihyperglykämische Wirkung der Verbindungen E, G und H in Dosierungsplänen von 125 mg/kg in Abwesenheit jeglicher signifikanter nachteiliger Wirkung auf die Futteraufnahme oder das Körpergewicht auf. Die Körpergewichte wurden bei Tieren, die während des Testzeitraums behandelt wurden, nicht beeinflusst (Tabelle 9).
Die Daten in den Tabellen 8 und 9 deuten darauf hin, dass die vorstehend erwähnten Stilbenoide wirksame hypoglykämische Mittel in einem Nagetiermodell für Insulinresistenz, Fettleibigkeit und NIDDM sind.
Tabelle 8 Wirkungen von Testsubstanzen auf die Glucosesenkung bei diabetischen db/db-Mäusen
Tabelle 9 Wirkungen von Testsubstanzen auf Körpergewichte und Futterverbrauch bei diabetischen db/db-Mäusen
Verbindungen A, D, E und F
Wie in 6 und in Tabelle 10 nachstehend gezeigt ist, führte die orale Verabreichung der Verbindungen A (Longistylin C), D (Longistylin A), E (7,8-Dihydrolongistylin C) und F (7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C) in einer Dosis von 125 mg/kg an db/db-Mäuse zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Plasmaglucose, bezogen auf Vehikel (Kontrolle).
Die folgenden Testsubstanzen wurden in db/db-Mäusen hinsichtlich der Fähigkeit zum Senken der Blutglucose bewertet: Verbindung A (Longistylin C), Verbindung D (Longistylin A), Verbindung E (7,8-Dihydrolongistylin C) und Verbindung F (7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C). Die Testsubstanzen wurden in einer Reihe von Versuchen bewertet, welche in Tabelle 10 nachstehend zusammengefasst sind.
Einzeldosen der Verbindungen A (Longistylin C), D (Longistylin A), E (7,8-Dihydrolongistylin C) und F (7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C) wurden db/db-Mäusen 24 und 48 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung gegeben und führten zu statistisch signifikanten Verringerungen der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 6, 30 oder 54 Stunden oder zu allen Zeitpunkten nach der oralen Verabreichung. Sechs Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 125 mg/kg der aktiven Versuchsverbindungen A, D und F verabreicht worden waren, 78,5 mg/dl (p = 0,0070), 76,4 mg/dl (p = 0,0083), 53,8 mg/dl (p = 0,0409) und 80,3 mg/dl (p = 0,0062), ausgehend von dem Grundlinienwert. 30 Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 125 mg/kg der aktiven Versuchsverbindungen A, D und E verabreicht worden waren, 116,0 mg/dl (p = 0,0008), 130,6 mg/dl (p = 0,0002) und 109,9 mg/dl (p = 0,0020), ausgehend von dem Grundlinienwert. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung, 6 Stunden nach der dritten Dosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen 125 mg/kg der aktiven Versuchsverbindungen A, D und E verabreicht worden waren, 99,2 mg/dl (p = 0,0331) bzw. 99,5 mg/dl (p = 0,0277), ausgehend von den Grundlinienwerten.
125 mg/kg-Dosen der Verbindung E, suspendiert in Vehikel, wiesen ebenfalls einen Trend zum Verringern der Plasmaglucose bezogen auf Vehikelkontrollen 54 Stunden nach der anfänglichen oralen Verabreichung auf. 54 Stunden nach der Anfangsdosierung sanken die mittleren Glucosespiegel der Tiere, denen die aktive Versuchsverbindung E, suspendiert in Vehikel, verabreicht worden war, 86,6 mg/dl (p = 0,0730), ausgehend von dem Grundlinienwert.
Wie in Tabelle 11 nachstehend gezeigt ist, trat die antihyperglykämische Wirkung der Verbindungen A, E, G und H in Dosierungsplänen von 125 mg/kg in Abwesenheit von jeglicher signifikant nachteiliger Wirkung auf die Futteraufnahme oder das Körpergewicht auf. Die Körpergewichte wurden bei Tieren, die während des Testzeitraums behandelt wurden, nicht beeinflusst (Tabelle 11).
Die Daten in Tabelle 11 deuten darauf hin, dass die vorstehend erwähnten Stilbenoide wirksame hypoglykämische Mittel in einem Nagetiermodell für Insulinresistenz, Fettleibigkeit und NIDDM sind.
Tabelle 10 Wirkungen von Testsubstanzen auf die Glucosesenkung bei diabetischen db/db-Mäusen
Tabelle 11 Wirkungen von Testsubstanzen auf Körpergewichte und Futterverbrauch bei diabetischen db/db-Mäusen

Claims

Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung mit der Formel (I):
worin A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation; R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und -COOH; R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl; R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl; R₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; und R₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; wobei wenigstens eines von R₃ und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl; oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon; und eines Trägers zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zum Ergänzen der Nahrung eines Säugers, der an erhöhten Blutglucosespiegeln leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die hypoglykämisch wirksame Menge der Verbindung 1 bis 1000 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die hypoglykämisch wirksame Menge der Verbindung 50 bis 350 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nahrungsergänzungsmittel für eine orale Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus Cajanus cajan isoliert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nahrungsergänzungsmittel in Form eines Nahrungsriegels, eines Getreideflockengerichts, eines Energieriegels, einer Suppe oder eines Tierfutters vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem getrockneten Bäckereiprodukt, Weizenmehl, Reismehl, Hafermehl, Maismehl, Sojamehl, Weizenkleie, Reiskleie, Haferkleie, Maiskleie, Weizenmittelmehl, Weizenvollkornmehl, Maisglutenmehl, Maisvollkornmehl, Sojaboh nenmehl, Gerste, Sorghum, Fleisch- und Knochenmehlen, Geflügelmehl, Fischmehl und Trockentierfutter.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger an Diabetes leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger an Hyperglykämie leidet.
Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (A) Longistylin C; (B) Longistylin A; (C) Longistylin A-6-carbonsäure; (D) 7,8-Dihydrolongistylin C; (E) 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C; (F) 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-6-carbonsäure; (G) 3-Hydroxy-4-(3-methylbutyl)-5-methoxy-7,8-dihydrostilben-2-carbonsäure; (H) 4-Isopentenylresveratrol(3,4',5-Trihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; (I) 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; (J) 3,4',5-Trimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; (K) Chlorophorin; (L) 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (M) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (N) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure; (O) 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (P) 5-Hydroxy-3-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (Q) 3,5-Dihydroxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (R) 3-Hydroxy-5-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (S) 5-Hydroxy-3-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (T) 3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (U) 3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (V) 3,5-Diacetyl-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (W) 3,4',5-Trihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (X) 3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan; (Y) 3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan; (Z) 2-Geranyl-3,5-dihydroxydiphenylethan; (AA) 2-Geranyl-3,5-dimethoxydiphenylethan; (AB) 2-Geranyl-3-hydroxy-5-methoxydiphenylethan; und (AC) 3-Methoxy-4'-hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; und eines Trägers zur Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zum Ergänzen der Nahrung eines Säugers, der an erhöhten Blutglucosespiegeln leidet.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (A) Longistylin C; (B) Longistylin A; und (C) Longistylin A-6-carbonsäure.
Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung mit der Formel (I):
worin A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Einfachbindung und einer Doppelbindung in trans-Konformation; R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H und -COOH; R₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl; R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl; R₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und Methoxy; und R₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH und C_1-2-Alkoxy; wobei wenigstens eines von R₃ und R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Methyl-2-butenyl, 3-Methylbutyl, 3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl und 3,7-Dimethyloctyl; oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon; und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Senken der Blutglucose bei einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die hypoglykämisch wirksame Menge der Verbindung 1 bis 1000 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die hypoglykämisch wirksame Menge der Verbindung 50 bis 350 mg/kg/Tag beträgt.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung für eine orale Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Verbindung aus Cajanus cajan isoliert wird.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das pharmazeutisch annehmbare Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, Zink und Eisen.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Säuger an Diabetes leidet.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Säuger an Hyperglykämie leidet.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung für die Verabreichung in Verbindung mit einem weiteren hypoglykämischen Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Insulin; einem Biguanid; einem Sulfonylharnstoff; einem PPARγ-Agonisten; einem α-Glucosidaseinhibitor; und einem β-Adrenozeptoragonisten, bestimmt ist.
Verwendung einer hypoglykämisch wirksamen Menge einer isolierten Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (A) Longistylin C; (B) Longistylin A; (C) Longistylin A-6-carbonsäure; (D) 7,8-Dihydrolongistylin C; (E) 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin C; (F) 7,8,2'',3''-Tetrahydrolongistylin A-6-carbonsäure; (G) 3-Hydroxy-4-(3-methylbutyl)-5-methoxy-7,8-dihydrostilben-2-carbonsäure; (H) 4-Isopentenylresveratrol(3,4',5-Trihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; (I) 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; (J) 3,4',5-Trimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)stilben; (K) Chlorophorin; (L) 3,5-Dimethoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (M) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (N) 3,5-Dihydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)bibenzyl-2-carbonsäure; (O) 3-Hydroxy-5-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (P) 5-Hydroxy-3-methoxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (Q) 3,5-Dihydroxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (R) 3-Hydroxy-5-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (S) 5-Hydroxy-3-methoxy-2-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; (T) 3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (U) 3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (V) 3,5-Diacetyl-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (W) 3,4',5-Trihydroxy-4-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-diphenylethan; (X) 3,5-Dihydroxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan; (Y) 3,5-Dimethoxy-4-(3,7-dimethyloctyl)diphenylethan; (Z) 2-Geranyl-3,5-dihydroxydiphenylethan; (AA) 2-Geranyl-3,5-dimethoxydiphenylethan; (AB) 2-Geranyl-3-hydroxy-5-methoxydiphenylethan; und (AC) 3-Methoxy-4'-hydroxy-4-(3-methyl-2-butenyl)diphenylethan; und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Senken der Blutglucose bei einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (A) Longistylin C; (B) Longistylin A; und (C) Longistylin A-6-carbonsäure.