DE60120415T2

DE60120415T2 - Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen

Info

Publication number: DE60120415T2
Application number: DE60120415T
Authority: DE
Inventors: A. Frank Cambridge SKRALY; Martha Haverhill SHOLL
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2021-07-21
Also published as: JP2004512825A; WO2002008428A3; JP4860094B2; AU7599601A; AU2001275996B2; ATE329048T1; US20100021919A1; DE60120415D1; EP1305439A2; US8741624B2; EP1305439B1; WO2002008428A2; US20020164729A1; KR20040014389A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft generell das Gebiet der Produktion von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs) durch Genmanipulieren von Bakterien.
Die Synthese von PHA-Polymeren, die das Monomer 4-Hydroxybutyrat (4HB) enthalten, wie Poly(3-hydroxybutyrat-co-4-hydroxybutyrat) (PHB4HB) (Doi, 1995, Macromol. Symp. 98: 585-99), oder von 4-Hydroxyvalerat- und 4-Hydroxyhexanoat-haltigen PHA-Polyestern ist beschrieben worden, zum Beispiel von Valentin et al., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36: 507-14, und Valentin et al., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 710-16. Die Erzeugung von PHB4HB, zum Beispiel, wurde durch das Verfüttern von Glucose und 4HB oder einem Substrat, das in 4-Hydroxybutyrat überführt wird, an Ralstonia eutropha (Kunioka et al., 1988, Polym. Commun. 22: 174, Doi et al., 1990, Int. J. Biol. Macromol. 12: 106, Nakamura et al., 1992, Macromolecules 25: 423), Alkaligenes latus (Hiramitsu et al., 1993, Biotechnol. Lett. 15: 461), Pseudomonas acidovorans (Kimura et al., Biotechnol. Lett. 14: 445) und Comomonas acidovorans (Saito & Doi, 1994, Int. J. Biol. Macromol. 16: 18) erreicht. Zu Substraten, die in 4HB überführt werden, gehören 1,4-Butandiol, 1,6-Hexandiol, 1,8-Octandiol, 1,10-Decandiol, 1,12-Dodecandiol und Gamma-Butyrolacton. Die PHB4HB-Copolymere können mit einer Vielzahl an Monomerzusammensetzungen erzeugt werden, die unterschiedliche Polymereigenschaften bereitstellen. Im einzelnen nimmt, wenn die Menge des 4HB über 15 Gew.-% ansteigt, die Schmelztemperatur (T_m) auf unter 130°C ab, und die Dehnung beim Reißen steigt auf über 400 % an (Saito et al. 1996, Polym. Int. 39: 169).
Es wäre jedoch äußerst vorteilhaft, kosteneffektivere Wege zur Herstellung von 4HB-haltigen PNAs durch biologische Systeme zu entwickeln. Für die ökonomische Produktion von PHA sind verschiedene Faktoren kritisch, zu denen die Kosten für das Substrat, die Fermentationszeit und die Effizienz der Weiterverarbeitung gehören. Eine generelle Eigenschaft der PHA-erzeugenden Wildtyp-Bakterien ist, dass ihre Wachstumsgeschwindigkeit niedrig ist, sie oft schwer aufzubrechen sind und ihre Zugänglichkeit für eine Genmanipulation beschränkt ist. Deshalb wäre es erwünscht, transgene Organismen zu entwickeln, die eine verbesserte Wirtschaftlichkeit der PHA-Produktion bereitstellen.
Die Produktion des Copolymers PHB4HB in rekombinanten E. coli ist beschrieben worden (z.B. PCT WO 00/01118S von Huisman et al., PCT WO 98/39453 von Hein et al.). Eine Anzahl neuartiger, biologisch hergestellter 4HB-Polymere, die in rekombinanten E. coli erzeugt wurden, ist von Skraly und Peoples beschrieben worden (z.B. PCT WO 99/61624). In diesen Studien zeigte nur die Huisman-Literaturstelle die Inkorporation kleiner Mengen des 4HB-Comonomers aus 1,4-Butandiol. Es wäre äußerst vorteilhaft, genmanipulierte Systeme zu entwickeln, die zur Produktion einer Anzahl von 4HB-Copolymeren und von Poly-4HB-Homopolymeren unter Verwendung von 1,4-Butandiol als Quelle für das 4HB-Monomer fähig sind.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, verbesserte rekombinante Systeme und Verfahren zur Produktion von PHAs, wie von PHAs, die das 4HB-Monomer enthalten, unter Einsatz verschiedener einfacher Zucker und Alkohole als Substrate bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden rekombinante Verfahren bereitgestellt, durch die zusätzliche Gene in E. coli, die so genmanipuliert wurden, dass sie PHA bilden, eingeführt werden, so dass die verbesserten Stämme PHA-Homopolymere und -Copolymere direkt aus Diolen bilden.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyalkanoaten bereit, das umfasst das Bereitstellen eines genmanipulierten, nicht-menschlichen Organismus, der die Enzyme Dioloxidoreduktase, Aldehyddehydrogenase, PHA-Synthase und entweder Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase exprimiert, wobei wenigstens ein Gen, das für eines der genannten Enzyme codiert, in den genannten Organismus eingeführt wird, das Bereitstellen von Diolen, die durch vom Organismus exprimierte Enzyme in Hydroxyalkanoatmonomere überführt werden können, und das Kultivieren des Organismus unter Bedingungen, unter denen die Hydroxyalkanoatmonomere unter Bildung von Polyhydroxyalkanoaten polymerisiert werden. Der Organismus kann auch so genmanipuliert werden, dass er die β-Ketothiolase und/oder die Acetoacetyl-CoA-Reduktase exprimiert. Das Verfahren kann ferner den Schritt des Gewinnens des Polyhydroxyalkanoats umfassen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen werden PHAs, die 4-Hydroxybutyrat (4HB)-Monomere enthalten, direkt aus 1,4-Butandiol erzeugt; PHAs, die 5-Hydroxyvalerat (5HV) enthalten, werden aus 1,5-Pentandiol erzeugt; PHAs, die 6-Hydroxyhexanoat (6HH) enthalten, werden aus 1,6-Hexandiol erzeugt, PHAs, die 3-Hydroxypropionat (3HP) enthalten, werden aus 1,3-Propandiol (auch Propylenglycol genannt) erzeugt; PHAs, die 2-Hydroxypropionat (2HP, Lactat) enthalten, werden aus 1,2-Propandiol (Propylenglycol) erzeugt; PHAs, die 2-Hydroxyethanoat (2HE, Glycolat) enthalten, werden aus 1,2-Ethandiol (Ethylenglycol) erzeugt.
Wenigstens eines der Gene, dass für diese Enzymaktivitäten codiert, wird eingeführt, und zusätzlich kann die Expression dieser Gene in PHA-Produzenten vom Wildtyp amplifiziert werden, um die Erzeugung von PHA-Homopolymeren und -Copolymeren direkt aus Diol-Ausgangsmaterialien zu verbessern. Die PHA-Polymere können leicht gewonnen werden, und sie sind industriell als Polymere oder als Ausgangsmaterialien für verschiedene chemische Zwischenprodukte nützlich.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verbesserung eines biologischen Systems zur Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten mit einem nicht-menschlichen Organismus bereit, der so genmanipuliert ist, dass er die Enzyme Dioloxidoreduktase, Aldehyddehydrogenase, PHA-Synthase und Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase exprimiert, wobei wenigstens ein Gen, das für eines der genannten Enzyme codiert, in den genannten Organismus eingeführt wird, und wobei der Organismus Diole in Hydroxyalkanoatmonomere überführen kann, die unter Bildung von Polyhydroxyalkanoaten polymerisiert werden, wobei das Verfahren umfasst das Selektieren von Mutanten mit erhöhten Enzymaktivitäten durch

i) das Einführen von Mutationen in einen spezifischen Wirt, und
ii) das Screenen von Pools der erzeugten Mutanten auf eine erhöhte Fähigkeit zur Synthese von PHA aus einem ausgewählten Diol oder Diolen.

Der Organismus kann auch so genmanipuliert werden, dass er die β-Ketothiolase und/oder die Acetoacetyl-CoA-Reduktase exprimiert. Das Verfahren kann ferner den Schritt des Gewinnens des Polyhydroxyalkanoats umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht den Weg vom 1,4-Butandiol zum 4-Hydroxybutylyl-CoA, der in einer Ausführungsform eingesetzt wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es werden Verfahren bereitgestellt, durch die zusätzliche Gene in Mikroorganismen eingeführt werden, die so genmanipuliert wurden, dass sie PHA bilden, so dass die verbesserten Stämme PHA-Homopolymere und Copolymere direkt aus einfachen Alkohol- und Zuckersubstraten bilden. Diese Prozesse basieren auf rekombinanten Bakterien, z.B. Escherichia coli, als Produktionsorganismen und auf Genen der PHA-Biosynthese aus PHA-erzeugenden Mikroben wie Ralstonia eutropha oder Alcaligenes latus, auch wenn heutzutage viele andere Quellen für PHA-Gene bekannt sind (Madison & Huisman, 1999, Microbiol. & Molecular Biology Reviews 63: 21-53). Rekombinante E. coli haben viele Vorteile gegenüber PHA-erzeugenden Organismen vom Wildtyp, einschließlich der Einfachheit der Genmanipulation, der Verfügbarkeit der vollständigen Genomsequenz, einer hohen Wachstumsgeschwindigkeit, einer Flexibilität bezüglich des Wachstumssubstrats und einer leichten Lysierbarkeit.
Organismus der genmanipuliert werden soll
Bei einer Ausführungsform werden die Gene für den gesamten in der 1 dargestellten Weg in den Produktionsorganismus eingeführt. Es kann ein Organismus, der natürlicherweise keine PHAs bildet, wie E. coli, verwendet werden. Es sind verschiedene Systeme zur Produktion von PHB mit rekombinanten E. coli beschrieben worden (Madison & Huisman, 1999, Microbiology & Molecular Biology Reviews 63:21-53). Die für eine Dioloxidoreduktase und eine Aldehyddehydrogenase codierenden Gene werden in diesen Wirt eingeführt. Im Falle von 1,4-Butandiol überführt die Dioloxidoreduktase das Substrat in 4-Hydroxybutyraldehyd, das dann durch die Aldehyddehydrogenase in 4-Hydroxybutyrat überführt wird. Im Falle von 1,3-Propandiol überführt die Dioloxidoreduktase das Substrat in 3-Hydroxypropionaldehyd, das dann durch die Aldehyddehydrogenase in 3-Hydroxypropionat überführt wird. Andere Diole können auf analoge Weise behandelt werden. In einigen Fällen kann es zu einer Inkorporation einer Hydroxysäure, die um zwei Kohlenstoffe kürzer als das Diol-Ausgangsmaterial ist, in PHA kommen. Das beruht auf dem endogenen Katabolismus, der dem des Beta-Oxidationswegs des Fettsäurekatabolismus ähnelt. Zum Beispiel können 4HB-Einheiten, oder sowohl 4HB- als auch 6HB-Einheiten, im Polymer als Ergebnis des Verfütterns von 1,6-Hexandiol erzeugt werden. Gegebenenfalls kann eine exogene Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase mit eingeschlossen werden, um die Aktivierung der Hydroxysäure mit Coenzym A zu erleichtern. Das aktivierte Monomer kann dann über die Aktivität einer geeigneten, im Produktionswirt vorhandenen PHA-Synthase in PHA inkorporiert werden. Die Enzymaktivitäten stellen im Produktionswirt ein System für die Synthese eines Polymers bereit, das einen oder mehrere Monomertyp(en), in Abhängigkeit von den Diol-Ausgangsmaterialien, enthält.
Es ist oft sehr nützlich, Copolymere zu synthetisieren, die Monomere wie die oben erwähnten und 3HB enthalten. In diesem Falle enthält der Produktionswirt auch das β-Ketothiolase- und das Acetoacetyl-CoA-Reduktase-Gen, deren Produkte Acetyl-CoA in 3HB-CoA überführen. Acetyl-CoA kann vom Diol oder von einer anderen Kohlenstoffquelle, wie einem Zucker, stammen. Sowohl 3HB-CoA als auch Hydroxyacyl-CoAs, wie die oben erwähnten, können von verschiedenen PHA-Synthasen, wie der, die vom rekombinanten Wirt exprimiert wird, akzeptiert werden, und deshalb werden Copolymere von PHB vom rekombinanten Wirt synthetisiert. Das Diol kann, was auch immer die gewünschte PHA-Zusammensetzung ist, den Zellen entweder während des Wachstums oder nach einer separaten Wachstumsphase, entweder allein oder in Kombination mit wenigstens einem anderen Ausgangsmaterial, wie einem Zucker, verfüttert werden, und PHA wird in den Zellen akkumuliert.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann ein rekombinanter Organismus, der natürlicherweise wenigstens einen Teil des in der 1 gezeigten Wegs enthält, eingesetzt werden. Bei dieser Ausführungsform kann eine oder können mehrere der oben diskutierten Aktivitäten (Dioloxidoreduktase, Aldehyddehydrogenase, Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase, β-Ketothiolase, PHA-Synthase und Acetoacetyl-CoA-Reduktase) aus der endogenen Maschinerie des Wirts stammen, auch wenn wenigstens ein Gen, das für eines der Enzyme Dioloxidoreduktase, Aldehyddehydrogenase, PHA-Synthase und entweder Acyl-CoA-Synthetase oder Acyl-CoA-Transferase codiert, in den genannten Wirt eingeführt ist. Zum Beispiel könnten nur die Dioloxidoreduktase und die Aldehyddehydrogenase in R. eutropha, einem natürlicherweise PHA-erzeugenden Organismus, exprimiert werden, um seine Fähigkeit, 1,4-Butandiol in 4HB zu überführen, zu unterstützen, und man könnte sich auf die natürliche Fähigkeit des Wirts zur Durchführung der übrigen erforderlichen Metabolismusschritte verlassen. Viele natürlicherweise PHA-erzeugende Organismen sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt (Braunegg et al., 1998, J. Biotechnology 65: 127-61). Wenn der Wirt nicht zur PHA-Produktion fähig ist, kann eine PHA-Synthase oder der gesamte Weg der PHB-Biosynthese und gegebenenfalls eine exogene Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase zur Ermöglichung der PHA-Produktion in diesen Organismus eingeführt werden. Die dafür erforderlichen Techniken sind in diesem Gebiet gut bekannt (zum Beispiel Dennis et al., 1998, J. Biotechnology 64: 177-86). Auch hier kann das Diol den Zellen entweder während des Wachstums oder nach einer separaten Wachstumsphase, entweder allein oder in Kombination mit wenigstens einem anderen Ausgangsmaterial, wie einem Zucker, verfüttert werden, und das PHA wird in den Zellen akkumuliert.
Die Implementierung der Produktion von PHAs aus Diol-Ausgangsmaterialien ist nicht, wie es in den Beispielen beschrieben wird, auf Bakterien beschränkt. Die gleichen Gene können in nicht-menschliche eukaryotische Zellen, zu denen, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Hefezellen und kultivierte Pflanzenzellen gehören, eingeführt werden.
Gene für die Verwertung von Substraten
Gene und Techniken, die zur Entwicklung rekombinanter PHA-Erzeuger für den Einsatz, wie er hier beschrieben wird, geeignet sind, sind Fachleuten auf diesem Gebiet generell bekannt (Madison & Huisman, 1999, Microbiology und Molecular Biology Reviews 63: 21-53, PCT WO 99/14313). Da alle der für die Implementierung der Produktion von PHAs aus Ausgangsmaterialien wie Diolen und Zuckern erforderlichen Gene kloniert wurden und in einer für eine Genmanipulation geeigneten Form erhältlich sind, kann jede beliebige Kombination plasmidgetragener und integrierter Gene eingesetzt werden, und die Implementierung dieses Wegs ist deshalb nicht auf die hier umrissenen Schemata beschränkt. Viele verschiedene Implementierungen werden Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sein.
Die 1,3-Propandioloxidoreduktase (EC 1.1.1.202) findet sich in verschiedenen Bakterienspecies. Oft wird sie unter anaeroben Bedingungen durch Glycerol induziert (Forage & Foster, 1982, J. Bacteriol. 149: 413-419). Dieses Enzym katalysiert die reversible Bildung von 3-Hydroxypropionaldehyd und anderer Hydroxyaldehyde aus dem entsprechenden Diol. Es wird angenommen, dass das Enzym physiologisch in erster Linie bei der Diolbildung eingesetzt wird, wenn der Aldehyd als ein Elektronenakzeptor auf Kosten von NADH benötigt wird (Johnson & Lin, J. Bacteriol. 169: 2050-54). Organismen, die die 1,3-Propandioloxidoreduktase enthalten, sind typischerweise fähig, Glycerol in 1,3-Propandiol zu überführen, auch wenn ähnliche Aktivitäten in anderen Organismen gefunden werden. Zu Bakterienspecies, die für die Fähigkeit zur Überführung von Glycerol in 1,3-Propandiol bekannt sind, gehören Klebsiella pneumoniae (Streekstra et al., 1987, Arch. Microbiol. 147: 268-75), Klebsiella oxytoca (Homann et al., 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:121-26), Klebsiella planticola (gleiche Literaturstelle) und Citrobacter freundii (Boenigk et al., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 453-57), auch wenn viele andere Beispiele allgemein bekannt sind.
Aldehyddehydrogenasen sind in biologischen Systemen extrem weit verbreitet. Das Überprüfen der Genomdatenbank von E. coli auf Homologien zeigt, dass allein dieser Organismus wenigstens sieben mutmaßliche Enzyme dieses Typs enthält. Sie sind so zahlreich und unterschiedlich, dass sogar Versuche, sie alle zu klassifizieren, kompliziert sind (z.B. Vasiliou et al., 1999, Pharmacogenetics 9:421-34), Eine Diskussion all der Typen und physiologischen Rollen dieser Enzyme würde den Rahmen dieser Diskussion sprengen. Die Wahl einer für den Einsatz im metabolischen Engineering geeigneten Aldehyddehydrogenase sollte nach einer Evaluation der Substratspezifität der verschiedenen Kandidaten erfolgen. Enzymtests wie die, die von Baldomá & Aguilar (1987, J. Biol. Chem. 262: 13991-6) beschrieben wurden, sind für derartige Diagnosen nützlich.
Acyl-CoA-Transferasen (EC 2.8.3.x) und Acyl-CoA-Synthetasen (EC 6.2.1.x) katalysieren beide die Bildung von Thioestern aus organischen Säuren mit Coenzym A. Acyl-CoA-Transferasen, wie OrfZ (auch HbcT genannt) (Söhling und Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178: 871-80), übertragen die CoA-Einheit eines Donors wie Acetyl-CoA auf eine freie organische Säure, wie eine Fettsäure. Acyl-CoA-Synthetasen, wie AlkK (van Beilen et al., 1992, Mol. Microbiol. 6: 3121-36), ligieren eine freie organische Säure und freies Coenzym A, wobei sie die Energie für die Reaktion aus ATP gewinnen und AMP und Pyrophosphat als Nebenprodukte entstehen.
Verbesserungen von Enzymen des Wegs
Es kann vorteilhaft sein, die spezifische Aktivität oder die Substratspezifität der Enzyme in dem hier beschriebenen Weg vom Diol zum PHA zu verbessern. Zum Beispiel kann es sein, dass ein bestimmtes Diol in einem bestimmten Organismus nicht mit annehmbarer Geschwindigkeit in PHA überführt wird. Verbesserungen dieser Art beinhalten im Allgemeinen eine Mutagenese und ein Screenen; die DNA-Sequenz(en), die verbessert werden soll(en), werden einer oder mehreren Mutageneserunde(n) unterzogen, woran sich eine Testung auf erhaltene Verbesserungen anschließt.
Die Mutagenese kann über einen beliebigen der Vielzahl von Wegen, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, erfolgen (z.B. eine fehlerhafte PCR oder eine Kassettenmutagenese, eine Passage durch Mutatorstämme von Bakterien, eine Behandlung mit chemischen Mutagenen), wie sie beschrieben wurden von Cadwell et al., 1992, PCR Methods and Applications 2: 28-33, Erickson et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3858-62, Hermes et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 696-700, Ho et al., 1989, Gene 77: 51-59, Kellog et al., 1981, Science 214: 1133-35, Reidhaar-Olson et al., 1988, Science 241: 53-57, Stemmer, 1994, Nature 370: 389-91 und Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51.
Das Screenen auf einen verbesserten Weg vom Diol zum PHA beinhaltet das Kultivieren einer wie oben beschrieben erzeugten Mutantenpopulation auf eine Weise, dass bezüglich einer Eigenschaft hinsichtlich des Wegs verbesserte Zellen leicht selektiert werden können. Eine Ausführungsform ist die Selektion auf ein verbessertes Wachstum mit dem interessierenden Diol. Ein Organismus, der bezüglich der Aufnahme oder der Verwertung eines bestimmten Diols defizient ist, wird mit dem Diol als einziger Kohlenstoffquelle nicht gut wachsen. Ein flüssiges Medium oder Agarplatten, die das Diol als einzige Kohlenstoffquelle zusammen mit allen anderen Nährstoffen, die für das Wachstum des betreffenden Organismus erforderlich sind, enthält bzw. enthalten, kann bzw. können mit einem Pool von Mutanten angeimpft werden, und Zellen, die imstande sind zu wachsen, können leicht isoliert werden. Eine weitere Ausführungsform ist die Selektion von Zellen, die imstande sind, ein Polymer zu bilden, wenn sie in Gegenwart des Diols kultiviert werden. Wenn ein Organismus nicht imstande ist, das Diol mit signifikanter Geschwindigkeit in einen Monomervorläufer zu überführen, der anschließend polymerisiert werden kann, führt das Ausplattieren des Organismus auf Agar, der das Diol als einzige Kohlenstoffquelle enthält (neben Kohlenstoff, der in möglicherweise vorhandenen, zugegebenen komplexen Zusätzen, wie Hefeextrakt, enthaften ist), zu Zellen mit einem geringen oder keinem Gehalt an PHA. Das Kultivieren eines Pools von Mutanten auf einer derartigen Platte kann Stämme identifizieren, die die Fähigkeit zur Überführung des Diols in polymerisierbare Zwischenprodukte gewonnen haben. Diese Zellen erscheinen stärker opak und weißer als die Zellen, die kein PHA erzeugen. Alternativ kann eine andere Kohlenstoffquelle, wie Glucose, zugegeben werden, wenn die Zellen, die gescreent werden sollen, aus dieser Kohlenstoffquelle kein Polymer synthetisieren können. Platten können auch dazu dienen, Stämme zu eliminieren, die unter den vorliegenden Bedingungen nicht wachsen können. Zum Beispiel wird eine Zelle, die über eine Mutagenese die Fähigkeit zur Bildung von PHA aus Diol gewonnen hat, die aber eine für die Industrie wichtige Eigenschaft wie die Fähigkeit, auf einem minimalen Glucosemedium zu wachsen, verloren hat, nicht auf Platten wachsen, die das Diol und Glucose enthalten, insbesondere wenn sie auf dem Diol als einzige Kohlenstoffquelle nicht wachsen kann. Nur diejenigen Zellen, die PHA aus Diol bilden können und auf minimalem Glucosemedium wachsen können, werden in diesem Fall als opake Kolonien erscheinen. Das PHA kann in Zellen, insbesondere auf Platten, mittels Verfahren sichtbar gemacht werden, die empfindlicher als das visuelle Screenen unbehandelter Kolonien sind, wie durch Färben mit Nilrot (wie z.B. bei Spiekermann et al., 1999, Arch. Microbiol. 171: 73-80). Verfahren wie die obigen können über mehrere Runden wiederholt werden, um den Weg vom Diol zum PHA weiter zu optimieren. Die Screeningverfahren werden durch die obigen Aspekte der Diskussion veranschaulicht, sind aber nicht auf diese beschränkt, und weitere nützliche Screeningverfahren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.
Regulation der Expression
Bei jeder beliebigen der zuvor erwähnten Ausführungsformen ist es möglich, die Zusammensetzung des erzeugten Polymers durch das Steuern der Expression der Dioloxidoreduktase und der Aldehyddehydrogenase oder durch das Steuern der Verfügbarkeit des Diols zu steuern. Je höher die Aktivitäten der Dioloxidoreduktase und der Aldehyddehydrogenase sind, desto mehr aktiviertes Monomer wird als Ergebnis dieser Aktivitäten entstehen, und zwar bis zu einem Punkt, an dem ein weiterer Faktor, wie die Verfügbarkeit des Substrats oder eine Enzymaktivität stromabwärts davon, limitierend wird. Verfahren zur Modulation der Genexpression (und somit der Enzymaktivität) in verschiedenen Organismen sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt. Die Geschwindigkeit der Zugabe des Diols zu den kultivierten Zellen kann über verschiedene Techniken gesteuert werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Fermentation und Zellkultur gut bekannt sind.
Im Falle einiger Mikroorganismen können einige oder alle Gene in das Wirtschromosom integriert werden, und einige oder alle können auf einem Plasmid bereitgestellt werden. In einigen Fällen können kompatible Plasmidsysteme eingesetzt werden, wobei zum Beispiel verschiedene Schritte des Wegs von einem Plasmid codiert werden und die anderen Schritte durch ein zweites Plasmid codiert werden. Es kann auch eine Kombination der beiden Ansätze eingesetzt werden.
Substrate
Wie oben diskutiert wurde gehören zu Substraten, die zur Herstellung von PHAs im Zusammenhang mit den hier beschriebenen Systemen eingesetzt werden können, Alkohole, vorzugsweise Diole. Beispiele für geeignete Diole sind 1,6-Hexandiol, 1,5-Pentandiol, 1,4-Butandiol, 1,3-Propandiol, 1,2-Ethandiol und 1,2-Propandiol.
Diese Diole sind für viele Mikroorganismen nicht toxisch, in vielen Fälle sogar in hohen Konzentrationen. Sie können im Vergleich zu organischen Säuren, die häufig in niedrigen Konzentrationen für viele Mikroorganismen toxisch sind, bessere Ausgangsmaterialien für die Fermentation sein. Viele Diole sind leicht erhältlich und relativ kostengünstig. Zum Beispiel lag die weltweite Nachfrage nach 1,4-Butandiol 1995 bei ungefähr 1 Milliarde Pfund, und es wird sehr häufig bei der Produktion synthetischer Polymere eingesetzt (Morgan, Chemistry & Industry, 3. März 1997, S. 166-8).
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele noch klarer werden.
Beispiel 1: Enzymtest der AldH von Escherichia coli
Auf der Basis seiner Homologie mit anderen Aldehyddehydrogenasen wurde das aldH-Gen mittels PCR aus dem Genom von E. coli kloniert. Das Plasmid pMS33 enthält aldH unter der Kontrolle des trc-Promotors. E. coli DN5α wurde mit pMS33 oder, als Negativkontrolle, pFS14 transformiert. Das Plasmid pFS14 enthält das 4hbD (4HB-Dehydrogenase)-Gen von Clostridium kluyveri, wie es von Söhling und Gottschalk (1996, J. Bacteriol. 178: 871-80) beschrieben wurde.
DH5α/pMS33 und DH5α/pFS14 ließ man bei 37°C unter Schütteln in Luria-Bertani-Bouillon (LB, Difco, Detroit, Michigan) bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 0,5 wachsen, und anschließend wurden sie mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Die Inkubation wurde 3 Stunden fortgesetzt, und anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugieren (2000 g, 10 min) vom Medium abgetrennt, mit 0,1 M Tris (pH 8,0) gewaschen, erneut zentrifugiert und in einem Volumen von 0,1 M Tris (pH 8,0), das ungefähr der Größe des Zellpellets entsprach, resuspendiert. Jede Probe wurde mit einer Mikrospitze in 3-mL-Aliquots auf Eis 2 min sonifiziert (XL-Sonicator, Heat Systems-Ultrasonics Inc., Farmingdale, New York), mit einem Zyklus mit 70 % und einer Pause von einer Sekunde. Das Lysat wurde in einer Mikrozentrifuge bei 14 000 g für 10 min zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt und „Zellrohextrakt" genannt.
Die Enzymtests wurden in einem Gesamtvolumen von 1 mL, das 100 mM Natriumglycin (pH 9,5), 1 mM 3-Hydroxypropionaldehyd (3HPA), 1 mM NAD⁺ oder NADP⁺ und 6 mM Dithiothreitol (DTT) und ein Volumen des Zellrohextrakt mit 20-100 μg Gesamtprotein enthielt, durchgeführt. Vor der Zugabe von 3HPA, die die Reaktion startete, wurde eine Basislinie etabliert. Die mit dem DH5α/pFS14-Extrakt erhaltene Aktivität lag bei 0,00 U/mg, wenn NAD⁺ eingesetzt wurde, und bei 0,03 U/mg, wenn NADP⁺ eingesetzt wurde. Die mit dem DH5α/pMS33-Extrakt erhaltene Aktivität lag bei 1,89 U/mg, wenn NAD⁺ eingesetzt wurde, und bei 0,32 U/mg, wenn NADP⁺ eingesetzt wurde. Somit gewinnen Zellen, die das AldH-Protein von E. coli exprimieren, die Fähigkeit, 3HPA mit entweder NAD⁺ oder NADP⁺ als Cofaktor in 3-Hydroxypropionsäure zu überführen.
Konstruktion von pFS14
Das 4hbD-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung des Plasmids pCK3 (Söhling & Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-80) als Matrize kloniert. Es wurden die folgenden Oligonucleotidprimer eingesetzt:
5'-CTCTGAATTCAAGGAGGAAAAAATATGAAGTTATTAAAATTGGC-3' (SEQ ID NO: 1)
(4hbD 5' EcoRI)
5'-TTTCTCTGAGCTCGGGATATTTAATGATTGTAGG-3' (SEQ ID NO: 2)
(4hbD 3' SacI)
Das resultierende PCR-Produkt wurde mit EcoRI und SacI verdaut und in das mit den gleichen Enzymen verdaute Plasmid pTrcN ligiert. pTrcN ist ein Derivat von pTrc99a (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Die Modifikation, die pTrcN von diesem unterscheidet, ist die Entfernung der NcoI-Restriktionsstelle durch einen Verdau mit NcoI, eine Behandlung mit T4-DNA-Polymerase und eine Selbstligation.
Konstruktion von pMS33
Auf der Basis seiner Homologie mit anderen Aldehyddehydrogenasen wurde das aldH-Gen mittels PCR aus dem Genom von E. coli unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer kloniert:
5'-GGTGGTACCTTAAGAGGAGGTTTTTATGAATTTTCATCACCTGGCTT-3' (SEQ ID NO: 3)
(aldH 5' Acc651)
5'-GGTGCGGCCGCTCAGGCCTCCAGGCTTATCCA-3' (SEQ ID NO: 4)
(aldH 3' NotI)
Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Acc651 und Natl verdaut und in das mit den gleichen Enzymen verdaute pSE380 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) ligiert, wodurch pMS33 erzeugt wurde.
Beispiel 2: Wachstum von E. coli mit 1,4-Butandiol als einzige Kohlenstoffquelle
Der E.-coli-Stamm LS5218 (bezogen vom Yale E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Connecticut, als Stamm CGSC 6966) wurde mit einem von zwei Plasmiden, pFS76 oder pFS77, transformiert. pFS76 enthält das 4HB-Dehydrogenase (gbd)-Gen von Ralstonia eutropha, wie es bei Valentin et al. (1995, Eur. J. Biochem. 222: 43-60) beschrieben ist. Das Plasmid pFS77 enthält das gbd-Gen sowie das Aldehyddehydrogenase (aldH)-Gen von E. coli und das 1,3-Propandioloxidoreduktase (dhaT)-Gen von Klebsiella pneumoniae, wobei die Gene in Form eines einzigen Operons angeordnet sind. Beide Plasmide enthalten den trc-Promotor für die Transkription der Gene.
LS5218/pFS76 und LS5218/pFS77 wurden auf Platten mit Minimalmedium ausgestrichen, die entweder 5 g/L 4HB (4-Hydroxybutyrat, als Natriumsalz) oder 5 g/L 1,4-Butandiol enthielten. Das Medium der Platten enthielt auch pro Liter: 15 g Agar, 1 mmol MgSO₄, 10 mg Thiamin, 25,5 mmol Na₂HPO₄, 33,3 mmol K₂HPO₄, 27,2 mmol KH₂PO₄, 2,78 mg FeSO₄·7H₂O, 1,98 mg MnCl₂·4H₂O, 2,81 mg CoSO₄·7H₂O, 0,17 mg CuCl₂·2H₂O, 1,67 mg CaCl₂·2H₂O, 0,29 mg ZnSO₄·7H₂O, 100 μg Ampicillin und 0,1 mmol IPTG. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Beide Stämme wuchsen auf der Platte mit 4HB, aber nur LS5218/pFS77 wuchs auf der Platte mit 1,4-Butandiol. Somit wurde gezeigt, dass der aus dem gbd-, dem aldH- und dem dhaT-Gen bestehende Weg für das Wachstum von E. coli LS5218 mit 1,4-Butandiol als einzige Kohlenstoffquelle ausreicht.
Konstruktion von pFS76
Das gbd-Gen wurde mittels PCR aus dem Genom von R. eutropha H16 (bezogen von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, als Stamm ATCC 17699) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert:
5'-CCTGAATTCAGGAGGTTTTTATGGCGTTTATCTACTATCTGACCCAC-3' (SEQ ID NO: 5)
(gbd 5' EcoRI)
5'-CCTGAGCTCCTACCTGCAAGTGCTCGCCGCTC-3' (SEQ ID NO: 6)
(gbd 3' SacI)
Das resultierende PCR-Produkt wurde mit EcoRI und SacI verdaut und in das mit den gleichen Enzymen verdaute pSE380 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) ligiert, wodurch pFS76 erhalten wurde.
Konstruktion von pFS77
Die aldH-dhaT-Region wurde aus pMS59 durch einen Verdau mit NheI und HindIII entfernt. Das Plasmid pFS76 wurde mit SpeI und HindIII verdaut. NheI und SpeI bilden kompatible klebrige Enden. Das aldH-dhaT-Fragment von pMS59 und das große Fragment von pFS76 wurden zusammenligiert, wodurch pFS77 erhalten wurde, das das gbd-, das aldH- und das dhaT-Gen, alle unter der Kontrolle des trc-Promotors, enthielt.
Beispiel 3: Erzeugung von Poly(4HB) aus 1,4-Butandiol
Der Escherichia-coli-Stamm LS5218 (CGSC 6966) wurde mit einem der beiden Plasmide pFS30 und pMS60 transformiert. pFS30 enthält das PHA-Synthase (phaC)-Gen von Ralstonia eutropha und das 4HB-CoA-Transferase (hbcT)-Gen von Clostridium kluyveri, beide unter der Kontrolle des trc-Promotors. pMS60 enthält das aldH- und das dhaT-Gen zusammen mit den beiden Genen von pFS30, alle unter der Kontrolle des trc-Promotors. Das Ziel des Experiments war es zu bestimmen, ob die Zufügung des aldH- und des dhaT-Gens günstig für die Umwandlung von 1,4-Butandiol in 4HB im PHA-Polymer sein würde.
Man ließ jeden Stamm in mit 100 μg/mL Ampicillin supplementiertem LB-Bouillon über Nacht bei 37°C unter Schütteln mit 250 Upm wachsen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren (2000 g, 10 min) vom Medium abgetrennt und in 100 mL eines Mediums resuspendiert, das pro Liter enthielt: 2,5 g LB-Pulver, 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7,0, 2 g Glucose, 5 g 1,4-Butandiol, 100 μg Ampicillin und 0,1 mmol IPTG. Diese Inkubationen wurden bei 30°C unter Schütteln mit 250 Upm 25 Stunden durchgeführt. Die Zellen von einem Viertel des Kolbenvolumens wurden wie oben zentrifugiert, mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert. Ungefähr 20 mg lyophilisierte Zellmasse aus jedem Kolben wurde 3 Stunden bei 110°C einer gleichzeitigen Extraktion und Butanolyse in 2 mL einer Mischung, die (in Volumeneinheiten) 90 % 1-Butanol und 10 % konzentrierte Salzsäure enthielt, mit 2 mg/mL als internem Standard zugesetzter Benzoesäure, unterzogen. Die wasserlöslichen Komponenten der resultierenden Mischung wurden durch Extraktion mit 3 mL Wasser entfernt. Die organische Phase (1 μL in einem Splitverhältnis von 1:50 bei einer Gesamtflussgeschwindigkeit von 2 mL/min) wurde auf einer SPB-1-GC-Kapillarsäule aus verschmolzenem Siliciumdioxid (30 m, 0,32 mm ID, 0,25 um Film; Supelco, Bellefonte, Pennsylvania) mit dem folgenden Temperaturprofil analysiert: 2 min bei 80°C, mit 10°C pro min auf 250°C, 2 min bei 250°C. Der für die Testung bezüglich des Vorliegens von 4-Hydroxybutyrateinheiten im Polymer eingesetzte Standard war Gamma-Butyrolacton (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin).
Der Stamm LS5218/pFS30 erreichte eine optische Dichte (600 nm) von 3,9 und hatte Poly-4HB in einem Anteil von 3,3 % des Trockengewichts der Zellen akkumuliert, während der Stamm LS5218/pMS60 eine optische Dichte (600 nm) von 6,5 erreichte und Poly-4HB in einem Anteil von 12,3 % des Trockengewichts der Zellen akkumuliert hatte. Somit reicht die Expression des aldH- und des dhaT-Gens aus, die Fähigkeit von E. coli LS5218 zur Synthese von Poly-4HB aus 1,4-Butandiol zu erhöhen.
Konstruktion von pFS16
Das Plasmid pFS16 wurde durch das Ligieren des PCR-Produkts von orfZ (auch hbcT genannt) von Clostridium kluyveri an pTrcN konstruiert. Das orfZ-Gen wurde mittels PCR vom Plasmid pCK3 (Söhling und Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178: 871-80) unter Verwendung der folgenden Oligonucleotidprimer amplifiziert:
5'-TCCCCTAGGATTCAGGAGGTTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAG-3'
(SEQ ID NO: 7)
(orfZ 5' AvrII)
5'-CCTTAAGTCGACAAATTCTAAAATCTCTTTTTAAATTC-3' (SEQ ID NO: 8)
(orfZ 3' SalI)
Das resultierende PCR-Produkt wurde mit AvrII und SalI verdaut und in das mit XbaI (das mit AvrII kompatibel ist) und SalI verdaute pTrcN ligiert, wodurch pFS16 erzeugt wurde.
Konstruktion von pFS30
Das Plasmid pFS3 wurde von pFS16 durch das Zufügen des PHA-Synthase (phaC)-Gens von Ralstonia eutropha abgeleitet. Das Plasmid pAeT414 wurde mit XmaI und StuI verdaut, so dass der Promotor von R. eutropha und das phaC-Strukturgen auf einem Fragment vorlagen. pFS16 wurde mit BamHI geschnitten, zur Erzeugung stumpfer Enden mit T4-DNA-Polymerase behandelt und dann mit XmaI verdaut. Die beiden so erhaltenen DNA-Fragmente wurden zusammenligiert, wodurch pFS30 erzeugt wurde.
Konstruktion von pMS59
Das aldH-Gen wurde aus pMS33 durch einen Verdau mit SpeI und BglII entfernt. Das Plasmid pTC42 (Skraly et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 98-105), das das dhaT-Gen von Klebsiella pneumoniae unter der Kontrolle des trc-Promotor enthält, wurde mit NheI und BglII verdaut. SpeI und NheI bilden kompatible klebrige Enden. Das aldH-haltige Fragment von pMS33 und das große Fragment von pTC42 wurden zusammenligiert, wodurch pMS59 erzeugt wurde.
Konstruktion von pMS60
Die aldH-dhaT-Region wurde aus pMS59 durch einen Verdau mit SpeI, gefolgt von einer Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und einem sich anschließenden Verdau mit MfeI isoliert. Dieses Fragment hatte ein stumpfes Ende und ein klebriges Ende, das mit von EcoRI erzeugten klebrigen Enden kompatibel war. pFS30 wurde mit XmaI verdaut, gefolgt von einer Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und einem sich anschließenden Verdau mit EcoRI. Das große Fragment von pFS30 und das aldH-dhaT-haltige Fragment von pMS59 wurden zusammenligiert, wodurch pMS60 erzeugt wurde.
Beispiel 4: Synthese von Poly(3HB-co-4HB) aus Glucose und 1,4-Butandiol
Der E.-coli-Stamm MBX1493 ist ein Poly(3HB-co-4HB) erzeugender Stamm mit dem in das Chromosom integrierten orfZ-Gen (auch hbcT genannt) von C. kluyveri (Söhling & Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178: 871-80). Er stammte vom Stamm MBX1335 ab, einem PHB-erzeugenden Stamm mit den in sein Chromosom integrierten Genen phaA, phaB und phaC. MBX1335 wurde selbst durch eine Transduktion des phaA-, phaB- und phaC-Gens mit dem Bakteriophagen P1 in den Stamm LS5218 von MBX820 abgeleitet (siehe PCT WO 00/011188 von Metabolix).
Der Stamm MBX1493 wurde in separaten Schritten mit vier Plasmiden transformiert: pTrcN, pTC42, pMS33 und pMS59. Diese Plasmide enthaften, unter der Kontrolle des trc-Promotors, die folgenden Gene: keines, nur dhaT, nur aldH bzw. sowohl aldH als auch dhaT. Alle diese Stämme ließ man in 3 mL mit 100 μg/mL Ampicillin supplementiertem LB bei 37°C unter Schütteln über Nacht wachsen. Ein Volumen von 1 mL von jeder dieser Kulturen wurde zum Animpfen von 50 mL eines Mediums eingesetzt, das pro Liter enthielt: 1 mmol MgSO₄, 10 mg Thiamin, 25,5 mmol Na₂HPO₄, 33,3 mmol K₂HPO₄, 27,2 mmol KH₂PO₄, 2,78 mg FeSO₄·7H₂O, 1,98 mg MnCl₂·4H₂O, 2,81 mg CoSO₄·7H₂O, 0,17 mg CuCl₂·2H₂O, 1,67 mg CaCl₂·2H₂O, 0,29 mg ZnSO₄·7H₂O, 10 g Glucose, 5 g 4-Hydroxybutyrat oder 10 g 1,4-Butandiol, 100 μg Ampicillin, 25 μg Chloramphenicol und 0,01 mmol IPTG. Diese Kulturen wurden bei 30°C unter Schütteln mit 250 Upm 88 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (2000 g, 10 min) von diesem Medium abgetrennt, und sie wurden lyophilisiert und mittels GC bezüglich des PHA-Gehalts und der PHA-Zusammensetzung analysiert. Die Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzung der von diesen Stämmen erzeugten Polymere und die letztendlichen optischen Dichten (600 nm) der Kulturen.
Wie in der Tabelle 1 gezeigt ist, bilden alle Stämme bei einer Fütterung mit 4HB ein Copolymer mit einem signifikanten prozentualen 4HB-Anteil. Wenn jedoch 1,4-Butandiol verfüttert wird, erzielten nur die pMS59-haltigen Zellen, das heißt die Zellen, die sowohl aldH als auch dhaT exprimieren, eine signifikante Inkorporation von 4HB in das Polymer. Somit wurde gezeigt, dass der aldH-dhaT-Weg die Umwandlung von 1,4-Butandiol in 4HB ermöglicht und nicht signifikant mit der Gesundheit der Zellen oder der nachfolgenden Inkorporation von 4HB in ein PHA interferiert. Tabelle 1: Überführung von 1,4-Butandiol in 4HB

^a Prozent des gesamten Trockengewichts der Zellen
^b Prozent des gesamten Polymergewichts

Beispiel 5: Erzeugung von Poly(3HP) aus 1,3-Propandiol
Der Escherichia-coli-Stamm LS5218 (CGSC 6966) wurde mit einem der beiden Plasmide pFS30 und pMS60 transformiert. Das Ziel des Experiments war es zu bestimmen, ob die Zufügung des aldH- und des dhaT-Gens günstig für die Umwandlung von 1,3-Propandiol in 3HP sein würde.
Man ließ jeden Stamm in mit 100 μg/mL Ampicillin supplementiertem LB-Bouillon über Nacht bei 37°C unter Schütteln mit 250 Upm wachsen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren (2000 g, 10 min) vom Medium abgetrennt und in 50 mL eines Mediums resuspendiert, das pro Liter enthielt: 2,5 g LB-Pulver, 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7,0, 5 g Glucose, 0 oder 10 g 1,3-Propandiol, 100 μg Ampicillin und 0,1 mmol IPTG. Diese Inkubationen wurden bei 30°C unter Schütteln mit 250 Upm 25 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden wie oben beschrieben durch Zentrifugieren vom Medium abgetrennt, mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert, lyophilisiert und mittels GC bezüglich des PHA-Gehalts und der PHA-Zusammensetzung analysiert. Der zur Testung des Vorliegens von 3-Hydroxypropionateinheiten im Polymer eingesetzte Standard war Beta-Propiolacton (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin).
In den Kolben ohne zugesetztes 1,3-Propandiol wurde keine PHP-Bildung gefunden; die Stämme LS5218/pFS30 und LS5218/pMS60 erreichten optische Dichten (600 nm) von 4,6 bzw. 8,2. In den Kolben mit zugesetztem 1,3-Propandiol erreichte der Stamm LS5218/pFS30 eine optische Dichte (600 nm) von 5,2, und er akkumulierte kein Poly-3HP in nachweisbaren Mengen, während der Stamm LS5218/pMS60 eine optische Dichte (600 nm) von 6,6 erreichte und Poly-3HP in einer Menge von 5,0 % des Trockengewichts der Zellen akkumuliert hatte. Somit reicht die Expression des aldH- und des dhaT-Gens aus, die Fähigkeit von E. coli LS5218 zur Synthese von Poly-3HP aus 1,3-Propandiol zu steigern.
Beispiel 6: Synthese von Poly(3HB-co-3HP) aus Glucose und 1,3-Propandiol
Der Stamm MBX1493 wurde in separaten Schritten mit vier Plasmiden transformiert: pTrcN, pTC42, pMS33 und pMS59. Alle diese Stämme ließ man in 100 mL mit 100 μg/mL Ampicillin supplementiertem LB bei 37°C unter Schütteln über Nacht wachsen. Die Zellen wurden aus den Kolben gegossen, und die verbleibende Flüssigkeit wurde aufgehoben. Zu jedem Kolben wurden dann 80 mL eines Mediums gegeben, das pro Liter enthielt: 6,25 g LB-Pulver, 1 mmol MgSO₄, 10 mg Thiamin, 25,5 mmol Na₂HPO₄, 33,3 mmol K₂HPO₄, 27,2 mmol KH₂PO₄, 2,78 mg FeSO₄·7H₂O, 1,98 mg MnCl₂·4H₂O, 2,81 mg CoSO₄·7H₂O, 0,17 mg CuCl₂·2H₂O, 1,67 mg CaCl₂·2H₂O, 0,29 mg ZnSO₄·7H₂O, 10 g Glucose, 100 μg Ampicillin, 25 μg Chloramphenicol und 0,01 mmol IPTG. Diese Kulturen wurden bei 37°C unter Schütteln mit 250 Upm 7 Stunden inkubiert. Zu jedem Kolben wurden dann 20 mL des oben angegebenen Mediums gegeben, außer dass in diesem Medium der LB-Anteil auf 12,5 g/L erhöht war, die Glucose auf 100 g/L erhöht war, das IPTG auf 0,25 mM erhöht war und 1,3-Propandiol in einer Konzentration von 50 g/L zugefügt war. Somit lagen die letztendlich bei dieser Stufe vorliegenden Konzentrationen bei 2,5 g/L LB, 20 g/L Glucose, 10 g/L 1,3-Propandiol und 0,05 mM IPTG. Diese Kolben wurden unter Schütteln mit 250 Upm bei 30°C 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren (2000 g, 10 min) von diesem Medium abgetrennt, und sie wurden lyophilisiert und mittels GC bezüglich des PHA-Gehalts und der PHA-Zusammensetzung analysiert. Die Tabelle 2 zeigt die Zusammensetzung der von diesen Stämmen erzeugten Polymere und die letztendlichen optischen Dichten (600 nm) der Kulturen.
In Abwesenheit von 1,3-Propandiol synthetisierten alle Stämme lediglich PHB. Wenn 1,3-Propandiol gefüttert wurde, erreichten nur die pMS59-haltigen Zellen, das heißt die Zellen, die sowohl aldH als auch dhaT exprimierten, ein signifikantes Ausmaß der Inkorporation von 3HP in das Polymer. Die Zellen, die pMS33 enthalten, oder aldH allein, erzielten auch eine Inkorporation von 3HP, aber nur in geringem Ausmaß. Somit wurde für den aldH-dhaT-Weg gezeigt, dass er die Überführung von 1,3-Propandiol in 3HP ermöglicht. Die Zellen, die das dhaT-Gen enthalten (pTC42 und pMS59), erzeugten weniger Gesamtpolymer, wenn 1,3-Propandiol vorhanden war, und das liegt höchstwahrscheinlich an der Toxizität von 3-Hydroxypropionaldehyd. Die Erhöhung des Verhältnisses der aldH- zur dhaT-Expression und/oder das Verringern der Konzentration des 1,3-Propandiols sollte dieses Phänomen unterdrücken. Tabelle 3: Inkorporation von 3HP in PHA durch MBX1493 mit verschiedenen Plasmiden

Beispiel 7: Einsatz der Acyl-CoA-Synthetase für die Synthese von Poly(4HB) aus 1,4-Butandiol
Der Stamm MBX1668, der die Gene aldH und dhaT in sein Chromosom integriert enthält, und zwar in Form eines Operons mit dem Tetracyclinresistenzmarker von Tn10, wurde mit einem der beiden Plasmide pFS73 und pMS92 transformiert. Das Plasmid pFS73 ist das gleiche wie das in vorherigen Beispielen beschriebene pFS30, außer dass der Ampicillinresistenzmarker durch den Kanamycinresistenzmarker von pACYC177 (GenBank Accession No. X06402) ersetzt ist. Das Plasmid pMS92 leitet sich von pFS73 ab, wobei das ortZ-Gen durch das alkK-Gen von Pseudomonas oleovorans ersetzt ist (van Beilen et al., 1992, Mol. Microbiol. 6: 3121-36). Man ließ jeden dieser Stämme in 3 mL LB, das mit 50 μg/mL Kanamycin und 10 μg/mL Tetracyclin supplementiert war, unter Schütteln bei 37°C über Nacht wachsen. Ein Milliliter von jeder Kultur wurde als Inokulum zu einer rechteckigen Flasche von 200 mL gegeben. Jede Flasche enthielt 50 mL eines Medium, das pro Liter enthielt: 0,1 g Casaminosäuren, 5 mmol MgSO₄, 10 mg Thiamin, 25,5 mmol Na₂HPO₄, 33,3 mmol K₂HPO₄, 27,2 mmol KH₂PO₄, 2,78 mg FeSO₄·7H₂O, 1,98 mg MnCl₂·4H₂O, 2,81 mg CoSO₄·7H₂O, 0,17 mg CuCl₂·2H₂O, 1,67 mg CaCl₂·2H₂O, 0,29 mg ZnSO₄·7H₂O, 10 g Glucose, 10 g 1,4-Butandiol, 50 μg Kanamycin und 10 μg Tetracyclin. Diese Kulturen wurden bei 30°C unter Schütteln mit 250 Upm 48 Stunden inkubierf. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren (2000 g, 10 min) von diesem Medium abgetrennt, und sie wurden lyophilisiert und mittels GC bezüglich des PHA-Gehalts und der PHA-Zusammensetzung analysiert. Der Stamm MBX1668, der pFS73 beherbergte, enthielt 5,8 % des Trockengewichts an Poly(4HB), während MBX1668, der pMS92 beherbergte, 27,7 % des Trockengewichts an Poly(4HB) enthielt. Somit ist das alkK-Gen bei der Synthese von PHAs aus Diolen ein annehmbarer, und in diesem Falle besserer, Ersatz für das orfZ-Gen.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten, das umfasst das Bereitstellen eines genetisch manipulierten, nicht-menschlichen Organismus, der die Enzyme Dioloxidoreduktase, Aldehyddehydrogenase, PHA-Synthase und entweder Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase exprimiert, wobei wenigstens ein Gen, das für eines der genannten Enzyme codiert, in den genannten Organismus eingeführt wird, das Bereitstellen von Diolen, die durch vom Organismus exprimierte Enzyme in Hydroxyalkanoatmonomere überführt werden können, und das Kultivieren des Organismus unter Bedingungen, unter denen die Hydroxyalkanoatmonomere unter Bildung von Polyhydroxyalkanoaten polymerisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Diol 1,6-Hexandiol ist und das Hydroxyalkanoatmonomer 6-Hydroxyhexanoat ist, das Diol 1,5-Pentandiol ist und das Hydroxyalkanoatmonomer 5-Hydroxyvalerat ist, das Diol 1,4-Butandiol ist und das Hydroxyalkanoatmonomer 4-Hydroxybutyrat ist, das Diol 1,3-Propandiol ist und das Hydroxyalkanoatmonomer 3-Hydroxypropionat ist, das Diol 1,2-Ethandiol ist und das Hydroxyalkanoatmonomer 2-Hydroxyethanoat ist oder das Diol 1,2-Propandiol ist und das Hydroxyalkanoatmonomer 2-Hydroxypropionat ist.
Verfahren zur Verbesserung eines biologischen Systems zur Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten, das umfasst den Schritt des Bereitstellens eines nicht-menschlichen Organismus, der genetisch so manipuliert ist, dass er die Enzyme Dioloxidoreduktase, Aldehyddehydrogenase, PHA-Synthase und Acyl-CoA-Transferase oder Acyl-CoA-Synthetase exprimiert, wobei wenigstens ein Gen, das für eines der genannten Enzyme codiert, in den genannten Organismus eingeführt wird, und wobei der Organismus Diole in Hydroxyalkanoatmonomere überführen kann, die unter Bildung von Polyhydroxyalkanoaten polymerisiert werden, wobei das Verfahren außerdem umfasst das Selektieren von Mutanten mit erhöhten Enzymaktivitäten durch i) Einführen von Mutationen in einen spezifischen Wirt, und ii) Screenen von Pools der erzeugten Mutanten auf eine erhöhte Fähigkeit zur Synthese von PHA aus einem ausgewählten Diol oder Diolen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, wobei der Organismus auch genetisch so manipuliert ist, dass er β-Ketothiolase und/oder Acetoacetyl-CoA-Reduktase exprimiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 3, das außerdem den Schritt des Gewinnens des Polyhydroxyalkanoats umfasst.