DE60128451T2

DE60128451T2 - Beschichtung welche ein anhaften von endothelzellen stimuliert

Info

Publication number: DE60128451T2
Application number: DE60128451T
Authority: DE
Inventors: Michael John Toronto KUTRYK; Robert John Fort Lauderdale COTTONE; Stephen Maxwell Miami ROWLAND
Original assignee: OrbusNeich Medical Inc Fort Lauderdale; Orbus Medical Technologies Inc
Current assignee: OrbusNeich Medical Inc Fort Lauderdale; Orbus Medical Technologies Inc
Priority date: 2000-03-15
Filing date: 2001-03-15
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2021-03-16
Also published as: EP1263484A1; EP1263484B1; US20050043787A1; WO2001068158A1; US7037332B2; ATE362382T1; US20150352263A1; JP5859179B2; US20130035755A1; JP2013046771A; CA2400319A1; AU2001245734A1; JP5675744B2; JP2015128598A; CA2400319C; US20020049495A1; US7803183B2; KR20030001378A; DE60128451D1; IL151501A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von medizinischen Vorrichtungen, die in Gefäße im Körper implantiert sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Stents oder synthetische Transplantate, die in Blutgefäße implantiert sind und eine Matrix enthalten, die das Haften von Endothelzellen am Stent oder am synthetischen Implantat fördert.
Allgemeiner Stand der Technik
Atheriosklerose ist weltweit eine der wichtigsten Ursachen für Tod und Arbeitsunfähigkeit. Atheriosklerose beinhaltet die Ablagerung von Fettplaques auf der Lumenoberfläche von Arterien. Die Ablagerung von Fettplaques auf der Lumenoberfläche der Arterie für zu einer Verringerung der Querschnittsfläche der Arterie. Diese Ablagerung blockiert schließlich den Blutfluß vom von der Körpermitte entfernt gelegenen Punkt zur Läsion, wodurch es zu einer ischämischen Beschädigung der von der Arterie belieferten Gewebe kommt.
Kranzarterien versorgen das Herz mit Blut. Die Atheriosklerose von Kranzarterien (CAD) stellt in den Vereinigten Staaten die häufigste, ernsthafte, chronische, lebensbedrohliche Erkrankung dar, die mehr als 11 Millionen Personen betrifft. Die sozialen und ökonomischen Kosten der koronären Atheriosklerose übersteigen die der meisten anderen Krankheiten weit. Eine Verengung des Kranzarterienlumens führt zu einer Schädigung des Herzmuskels, was zuerst zu Angina, gefolgt vom myokardialen Infarkt und schließlich zum Tod führt. In den Vereinigten Staaten gibt es jedes Jahr mehr als 1,5 Millionen myokardiale Infarkte. 600000 (oder 40%) dieser Patienten leiden an akutem myokardialem Infarkt, und mehr als 300000 dieser Patienten sterben vor dem Erreichen des Krankenhauses (Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., 1998).
Die CAD kann unter Anwendung der perkutanen transluminalen koronaren Gefäßplastik mit einem Ballon (PTCA) behandelt werden. Mehr als 400000 PTCA-Verfahren werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten durchgeführt. Bei der PTCA wird in eine periphere Arterie ein Ballonkatheder eingeführt und durch das Arteriensystem in die verstopfte Kranzarterie geleitet. Dann wird der Ballon aufgeblasen, die Arterie gedehnt, und der störende Fettplaque abgeflacht, wodurch es zu einer Verstärkung der Querschnittsströmung des Bluts durch die betroffene Arterie kommt. Diese Therapie führt jedoch gewöhnlich nicht zu einer dauerhaften Öffnung der betroffenen Kranzarterie. 50% der mit der PTCA behandelten Patienten benötigen innerhalb von sechs Monaten ein Wiederholungsverfahren, um eine erneute Verengung der Kranzarterie zu korrigieren. Medizinisch wird diese erneute Verengung der Arterie nach der Behandlung durch die PTCA als Restenose bezeichnet. Akut beinhaltet die Restenose eine Rückfederung und Schrumpfung des Gefäßes. Dem Rückfedern und Schrumpfen des Gefäßes folgt anschließend eine Wucherung der Zellen des medialen glatten Muskels als Reaktion auf die Verletzung der Arterie durch die PTCA. Die Wucherung der Zellen des glatten Muskels wird teilweise durch die Freisetzung verschiedener Entzündungsfaktoren aus dem verletzten Bereich vermittelt, dazu gehören Thromboxan A₂, der von Thrombocyten stammende Wachstumsfaktor (PDGF) und der Fibroplasten-Wachstumfaktor (FGF). Um das Problem der Restenose zu lösen, ist eine Anzahl unterschiedlicher Verfahren angewendet worden, dazu gehört die Behandlung der Patienten mit unterschiedlichen pharmakologischen Mitteln oder das mechanische Offenhalten der Arterie mit einem Stent (Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., 1998).
Von den verschiedenen angewendeten Verfahren zur Beseitigung der Restenose haben sich Stents als am wirksamsten erwiesen. Stents sind Metallgerüste, die im erkrankten Gefäßsegment angeordnet werden, um ein normales Gefäßlumen zu schaffen. Die Anordnung des Stents im betreffenden Arteriensegment verhindert die Rückfederung und den anschließenden Verschluß der Arterie. Stents können auch die lokale Sektion der Arterie entlang der medialen Schicht der Arterie verhindern. Durch den Erhalt eines größeren Volumens als das, das unter Anwendung der PTCA allein geschafften wird, verringern Stents die Restenose um 30%. Trotz ihrer Erfolge haben Stents die Restenose nicht vollkommen eliminiert (Suryapranata et al. 1998. Randomized comparison of coronary stenting with balloon angioplasty in selected patients with acute myocardial infarction. Circulation 97: 2502–2502).
Eine Verengung der Arterien kann in anderen Gefäßen als Kranzarterien auftreten, dazu gehören die Aorta iliacae, die infrainguinale, die distale tiefliegende femorale, die distale popliteale, die tibiale, die subklavikulare und die mesenteriale Arterie. Die Häufigkeit der Atheriosklerose der peripheren Arterien (PAD) hängt von der bestimmten betroffenen anatomischen Stelle sowie auch den für die Diagnose des Verschlusses angewendeten Kriterien ab. Herkömmlich haben die Ärzte den Test der Claudicatio intermittens angewendet, um zu bestimmen, ob eine PAD vorliegt. Diese Methode kann jedoch eine deutliche Unterschätzung des tatsächlichen Auftretens der Erkrankung in der Population darstellen. Die Raten der PAD ändern sich anscheinend mit dem Alter, wobei bei älteren Personen die PAD häufiger auftritt. Daten vom National Hospital Discharge Survey schätzen, daß jedes Jahr 55000 Männer und 44000 Frauen eine zum ersten Mal erfaßte Diagnose einer chronischen PAD und 60000 Männer und 50000 Frauen eine zum ersten Mal erfaßte Diagnose einer akuten PAD aufwiesen. 91% der PAD-Fälle beinhalteten die äußeren Extremitäten. Die Häufigkeit von comorbider CAD bei Patienten mit PAD kann 50 übersteigen. Außerdem nimmt bei Patienten mit PAD die Häufigkeit einer zerebrovaskulären Erkrankung zu.
Die PAD kann unter Anwendung der perkutanen, transluminalen Gefäßplastik mit einem Ballon (PTA) behandelt werden. Die Verwendung von Stents in Verbindung mit der PTA verringert das Auftreten von Restenose. Die postoperativen Ergebnisse, die mit medizinischen Vorrichtungen, wie Stents, erhalten worden sind, stimmen jedoch nicht mit den Ergebnissen überein, die unter Anwendung üblicher operativer Revaskularisationsverfahren, d.h. jenen unter Verwendung eines venösen oder prothetischen Bypassmaterials, erhalten worden sind (Principles of Surgery, Schwartz et al. Herausg., Kapitel 20, Arterial Disease, 7. Aufl., McGraw-Hill Health Professions Division, New York 1999).
Die PAD wird vorzugsweise unter Anwendung von Bypassverfahren behandelt, wobei der blockierte Abschnitt der Arterie mit einem Transplantat umgangen wird (Principles of Surgery, Schwartz et al. Herausg., Kapitel 20, Arterial Disease, 7. Aufl., McGraw-Hill Health Professions Division, New York 1999). Das Transplantat kann aus einem autologen Venensegment, wie der Schenkelvene, oder einem synthetischen Transplantat, wie einem aus Polyester, Polytetrafluorethylen (PTFE) oder gedehntem Polytetrafluorethylen (ePTFE), bestehen. Die Raten für das postoperative Offenbleiben hängen von einer Anzahl unterschiedlicher Faktoren ab, dazu gehören die Lumenabmessungen des Bypasstransplantats, die Art des für das Transplantat verwendeten synthetischen Materials und die Abflußstelle. Die Restenose und die Thrombose sind jedoch selbst bei der Verwendung von Bypasstransplantaten weiterhin signifikante Probleme. Das Offenbleiben bei infrainguinalen Bypassverfahren in drei Jahren bei Verwendung eines Bypasstransplantats aus ePTFE beträgt z.B. bei einem femoralen-poplitealen Bypass 54% und nur 12% bei einem femoralen-tibialen Bypass.
Folglich besteht signifikanter Bedarf nach einer Verbesserung der Leistung von sowohl Stents als auch synthetischen Bypasstransplantaten, um die Morbidität und die Mortaliät der CAD und PAD weiter zu verringern.
Bei Stents bestand ein Versuch darin, die Stents mit verschiedenen antithrombotischen oder antirestenotischen Mitteln zu überziehen, um die Thrombose und Restenose zu vermindern. Das Imprägnieren von Stents mit einem radioaktiven Material hemmt z.B. anscheinend die Restenose, indem die Migration und Proliferation von Myofibroblasten gehemmt wird (US-Patente Nr. 5,059,166, 5,199,939 und 5,302,168). Die Bestrahlung des behandelten Gefäßes kann Sicherheitsprobleme für den Arzt und den Patienten beinhalten. Außerdem ermöglicht die Bestrahlung keine gleichmäßige Behandlung des betroffenen Gefäßes.
Stents wurden auch alternativ mit chemischen Mitteln, wie Heparin oder Phosphorylcholin, beschichtet, die beide anscheinend die Thrombose und Restenose vermindern. Obwohl Heparin und Phosphorylcholin anscheinend die Restenose bei Tiermodellen in kurzer Zeit deutlich verringern, hat die Behandlung mit diesen Mitteln bei der Verhinderung der Restenose anscheinend keine Langzeitwirkung. Außerdem kann Heparin eine Thrombocytenverminderung hervorrufen, was zu ernsthaften thromboembolischen Komplikationen, wie einem Schlaganfall, führt. Trotzdem ist es nicht denkbar, Stents mit ausreichenden therapeutisch wirksamen Mengen von entweder Heparin oder Phosphorylcholin zu beladen, damit die Behandlung von Restenose auf die Weise praktisch wird.
Synthetische Transplantate wurden auf unterschiedliche Weise behandelt, um die postoperative Restenose und Thrombose zu verringern. (Bos. et al. 1998. Small-Diameter Vascular Graft Prostheses: Current Status Archives Physio. Biochem. 106: 100–115). Es ist z.B. berichtet worden, daß Verbundstoffe von Polyurethan, wie gitterartiges Polycarbonat-urethan, die Restenose im Vergleich mit ePTFE-Transplantaten verringern. Die Oberfläche des Transplantats ist auch unter Anwendung einer Hochfrequenz-Glühentladung modifiziert worden, um dem cPTFE-Transplantat Polyterephthalat zuzusetzen. Synthetische Transplantate sind auch mit Biomolekülen, wie Collagen, imprägniert worden. Keiner dieser Versuche hat jedoch die Häufigkeit von Thrombose oder Restenose über lange Zeit verringert.
Da Endothelzellen bestimmte intrinsische Eigenschaften wie Zellregulationsmoleküle besitzen, die die Häufigkeit von Thrombose oder Restenose verringern, kann eine Stimulation der Ausbildung einer Monoschicht aus Endothelzellen auf der Oberfläche von Stents oder synthetischen Transplantaten sowohl die Restenose als auch die Thrombose verhindern. (Belle et al. 1997. Stent Endothelialization. Circulation 95: 438–448; Bos. et al. 1998. Small-Diameter Vascular Graft Prostheses: Current Status Archives Physio. Biochem. 106: 100–115).
Endothelzellen wurden nach der Implantation des Stents durch die lokale Zufuhr des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), eines Endothelzellmitogens, auf der Oberfläche von Stents aufgebracht (Belle et al. 1997. Stent Endothelialization. Circulation 95: 438–448). Da die Anwendung eines VEGF sowohl systemische als auch lokale Effekte haben kann, kann diese Behandlungsform unzuverlässig sein.
Synthetische Transplantate sind auch mit Endothelzellen geimpft worden, die klinischen Ergebnisse bei einer endothelialen Impfung waren jedoch im allgemeinen schlecht, d.h. niedrige Raten für das postoperative Offenbleiben (Lio et al. 1998. New concepts and Materials in Microvascule Grafting: Prosthetic Graft Endothelial Cell Seeding and Gene Therapy. Microsurgery 18: 263–256). Dekker et al., Thrombosis and Haemostasis 66(6) 715–724 (1991) offenbaren eine bessere Adhäsion und Proliferation von Human-Endothelzellen an Polyethylen, das vorher mit gegen Endothelzellmembran-Antigene gerichteten monoklonalen Antikörpern und extrazellulären Matrixproteinen beschichtet worden ist.
Folglich besteht Bedarf, neue Verfahren und Zusammensetzungen zum Beschichten von medizinischen Vorrichtungen, einschließlich Stents und synthetischen Transplantaten, mit Endothelzellen zu entwickeln. Diese Beschichtungsart wird nicht nur die Restenose sondern auch thromboembolische Komplikationen verhindern, die sich durch die Implantation von Stents ergeben. Verfahren und Zusammensetzungen, die eine solche Verbesserung bieten, beseitigen die Nachteile der früheren Technologie und haben einen signifikanten positiven Einfluß auf die Morbidität und Mortalität, die mit der CAD und der PAD verbunden sind. Es ist die Aufgabe dieser Erfindung, Stents und synthetische Transplantate herzustellen, die so beschichtet sind, daß das Haften von Endothelzellen an einer medizinischen Vorrichtung, wie einem Stent oder einem synthetischen Transplantat, stimuliert wird.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung ist in den Ansprüchen angegeben.
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Beschichten von medizinischen Vorrichtungen mit einer Matrix bereit, die das Haften von Endothelzellen an einer medizinischen Vorrichtung fördern. Die Matrix enthält Antikörper, die das Haften von Endothelzellen an der Oberfläche der medizinischen Vorrichtung stimulieren.
"Medizinische Vorrichtung" steht hier für eine Vorrichtung, die für die Prophylaxe oder Therapie eines medizinischen Zustands zeitweilig oder dauerhaft in einen Säuger eingeführt wird. Zu diesen Vorrichtungen gehören irgendwelche, die subkutan, perkutan oder chirurgisch eingeführt werden, so daß sie in einem Organ, Gewebe oder Lumen sitzen. Zu medizinischen Vorrichtungen können Stents, beschichtete Stents, wie die mit Polytetrafluorethylen (PTFE) oder gedehntem Polytetrafluorethylen (ePTFE) beschichteten, synthetische Transplantate, künstliche Herzklappen, künstliche Herzen und Befestigungen, um das künstliche Organ mit dem Blutkreislauf zu verbinden, Venenklappen, Transplantate für ein Aneurisma der abdominalen Aorta (AAA), Filter der Vena cava inferior, Dauerkatheder für die Infusion von Medikamenten, Embolusspiralen, bei der vaskulären Embolisation verwendete Embolusmaterialien (z.B. PVA-Schaumstoffe) und Gefäßnähte.
Das Beschichten der medizinischen Vorrichtung mit den Zusammensetzungen und nach Verfahren dieser Erfindung kann die Entwicklung einer Endothelzellschicht auf der Oberfläche der medizinischen Vorrichtung stimulieren, wodurch die Restenose sowie auch andere thromboembolische Komplikationen verhindert werden, die sich durch die Implantation der medizinischen Vorrichtung ergeben.
Synthetische Transplantate und Stents können für die Behandlung der CAD oder der PAD verwendet werden. Ein Stent oder ein synthetisches Transplantat kann mit einer Matrix beschichtet werden, die Antikörper enthält, die das Haften von zirkulierenden Vorläufern von Endothelzellen an der medizinischen Vorrichtung stimulieren. Die Antikörper können monoklonale Antikörper umfassen, die gegenüber Oberflächenantigenen von Endothelzellen, wie CD34, einem auf der Oberfläche eines Vorläufers von Endothelzellen ausgeprägten Antigen, reaktiv sind. Es können Fab-Fragmente des monoklonalen Antikörpers verwendet werden. Nach einer anderen Ausführungsform können auch monoklonale Antikörper verwendet werden, die gegen andere endotheliale Oberflächenantigene, wie KDR oder Tie-2, gerichtet sind. Nach einer Ausführungsform kann eine einzige Art eines Antikörpers verwendet werden, die mit einem Antigen reagiert. Nach einer anderen Ausführungsform kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Antikörpern, die gegen unterschiedliche Oberflächenantigene von Endothelzellen gerichtet sind, miteinander gemischt und der Matrix zugesetzt werden.
Die Matrixbeschichtung der medizinischen Vorrichtung kann aus einem synthetischen Material, wie Polyurethan, Poly-L-milchsäure, Celluloseester oder Polyethylenglycol, bestehen. Nach einer anderen Ausführungsform besteht die Matrix aus natürlich vorkommenden Materialien, wie Collagen, Fibrin, Elastin oder amorphem Kohlenstoff. Die Matrix kann verschiedene Schichten umfassen, wobei eine erste Schicht aus synthetischen oder natürlich vorkommenden Materialien und eine zweite Schicht aus Antikörpern besteht. Die Schichten können sequenziell geordnet sein, wobei die erste Schicht direkt mit der Oberfläche des Stents oder des synthetischen Transplantats in Kontakt steht und die zweite Schicht eine Oberfläche, die mit der ersten Schicht in Kontakt steht, und eine gegenüberliegende Oberfläche aufweist, die mit dem Gefäßlumen in Kontakt steht.
Nach einer dritten Ausführungsform kann die Matrix Fullerene umfassen, wobei die Fullerene im Bereich von etwa C₆₀ bis C₁₀₀ liegen. Die Fullerene können auch als Nanoröhrchen angeordnet sein, die Moleküle oder Proteine enthalten. Die Fullerenmatrix kann auch mit PTFE oder ePTFE oder Antikörpern gemischt sein. Nach einer anderen Ausführungsform kann das PTFE oder ePTFE zuerst als Schicht auf der medizinischen Vorrichtung angeordnet werden, der eine zweite Schicht von Fullerenen folgt.
Die Matrix kann nicht-kovalent oder kovalent an die medizinische Vorrichtung gebunden sein. Antikörper können kovalent an die Matrix gebunden sein, wobei hetero- oder homobifunktionelle Vernetzungsmittel verwendet werden.
Es werden auch Verfahren zu Behandlung von Atheriosklerose beschrieben. Die Arterie kann entweder eine Kranzarterie oder eine periphere Arterie, wie eine femorale Arterie sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt einen Antikörper, der durch ein vernetzendes Molekül kovalent an die Matrix gebunden ist;
2 zeigt ein Diagramm des die Matrix verankernden C60O-Moleküls.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Überblick
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die das Beschichten einer medizinischen Vorrichtung, wie eines Stents oder eines synthetischen Transplantats, mit einer Matrix beinhalten, die dann dazu dient, die medizinische Vorrichtung zu beschichten. Nach einer Ausführungsform enthält die Matrix eine therapeutisch wirksame Menge von zumindest einer Art eines Antikörpers, der das Haften von Endothelzellen an der medizinischen Vorrichtung fördert. Nach dem Haften kommt es zum Differenzieren und zur Proliferation der Endothelzellen auf der Oberfläche der Matrix. Das Vorhandensein von Endothelzellen auf der medizinischen Vorrichtung vermindert das Auftreten von Restenose und Thrombose nach der Implantation der medizinischen Vorrichtung in das Gefäß.
"Antikörper" steht hier für eine Art eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers, wobei sich der monoklonale oder polyklonale Antikörper an ein Antigen oder ein funktionelles Äquivalent dieses Antigens bindet. Der Begriff Antikörper umfaßt irgendein Fragment eines Antikörpers, wie Fab-, F(ab')₂- oder FC-Fragmente. (Ein Antikörper umfaßt eine Vielzahl von einzelnen Antikörpermolekülen = 6,022 × 1023 Moleküle pro Mol des Antikörpers.)
"Therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers" steht hier für die Menge eines Antikörpers, die das Haften von Endothelzellen an der medizinischen Vorrichtung fördert. Die Antikörpermenge, die erforderlich ist, um die hier beanspruchte Erfindung durchzuführen, ändert sich mit der Art des verwendeten Antikörpers. Die verwendete Antikörpermenge hängt z.B. von der Bindungskonstante zwischen dem Antikörper und dem Antigen, gegen das er reagiert, ab. Dem Fachmann ist allgemein bekannt, wie man therapeutisch wirksame Mengen eines Antikörpers für die Verwendung mit einem bestimmten Antigen bestimmt.
"Medizinische Vorrichtung" steht hier für eine Vorrichtung, die für die Prophylaxe oder Therapie eines medizinischen Zustands einem Säuger zeitweilig oder dauerhaft eingeführt wird. Zu diesen Vorrichtungen gehören irgendwelche, die subkutan, perkutan oder chirurgisch eingeführt werden, so daß sie in einem Organ, Gewebe oder Lumen sitzen. Zu medizinischen Vorrichtungen gehören Stents, beschichtete Stents, wie die mit PTFE oder ePTFE beschichteten, synthetische Transplantate, künstliche Herzklappen, künstliche Herze und Befestigungen, um das künstliche Organ mit dem Blutkreislauf zu verbinden, Venenklappen, Transplantate für ein Aneurisma der abdominalen Aorta (AAA), Filter der Vena cava inferior, Dauerkatheder für die Infusion von Medikamenten, Embolusspiralen, bei der vaskulären Embolisation verwendete Embolusmaterialien (z.B. PVA-Schaumstoffe) und Gefäßnähte.
"Restenose" steht hier für die Ansammlung einer Schicht von Zellen des glatten Muskels und Matrixprotein in der Gefäßinnenhaut einer Arterienwand. Die Gefäße können aufgrund der Restenose verschlossen werden. Nach einer PTCA oder PTA kommt es dazu, daß Zellen des glatten Muskels von der Media und Adventitia, die normalerweise nicht in der Gefäßinnenhaut vorhanden sind, wuchern und zur Gefäßinnenhaut wandern und Proteine ausscheiden, womit es zu einer Ansammlung von Zellen des glatten Muskels und Matrixprotein innerhalb der Gefäßinnenhaut kommt. Diese Ansammlung führt zu einer Verengung des Lumens der Arterie, womit der Blutfluß vom von der Körpermitte entfernt gelegenen Punkt zur Verengung vermindert wird. "Hemmung der Restenose" steht hier für die Hemmung der Migration und Proliferation von Zellen des glatten Muskels, die von einer Verhinderung der Proteinausscheidung begleitet wird, so daß die Restenose und sich daraus ergebende Komplikationen verhindert werden.
Patienten, die mit der Vorrichtung und den Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt werden können, können ein Säuger oder insbesondere der Mensch, ein Hund, eine Katze, ein Schwein, ein Nagetier oder ein Affe sein.
Die vorliegende Erfindung kann in vivo oder in vitro angewendet werden.
Der Begriff "Endothelzelle" steht für Endothelzellen in irgendeiner Entwicklungsstufe, von einem Vorläufer bis zur Reife. Vollständig differenzierte Endothelzellen können aus einer Arterie oder Vene, wie der Human-Nabelvene, abgetrennt werden, wohingegen Vorläufer von Endothelzellen aus peripherem Blut oder Knochenmark isoliert werden. Die Endothelzellen werden an die medizinischen Vorrichtungen gebunden, indem die Endothelzellen mit einer medizinischen Vorrichtung inkubiert werden, die mit der Matrix beschichtet ist, die ei nen Antikörper oder ein anderes Mittel enthält, der bzw. das an Endothelzellen haftet.
Diese Erfindung kann auf irgendeiner Arterie oder Vene verwendet werden. Im Umfang dieser Erfindung ist Atheriosklerose irgendeiner Arterie eingeschlossen, wozu Kranzarterien, infrainguinale Arterien, Aorta iliacae, subklavikulare, die mesenteriale und renale Arterien gehören. Andere Arten von Gefäßverschlüssen, wie jene, die sich durch eine Sektion eines Aneurismas ergeben, werden ebenfalls von dieser Erfindung erfaßt.
Die medizinische Vorrichtung kann nach der Einführung in ein Gefäß mit Endothelzellen beschichtet werden. Nach einer anderen Ausführungsform wird die medizinische Vorrichtung vor dem Einführen der medizinischen Vorrichtung mit den Endothelzellen beschichtet. In jedem Fall wird durch das Vorhandensein von Endothelzellen auf der luminalen Oberfläche der medizinischen Vorrichtung die Restenose oder Thrombose gehemmt oder verhindert.
Endothelzellen
Endothelzellen von der Human-Nabelvene (HUVEC) werden nach dem Verfahren von Jaffe et al., J. Clin. Invest., 52: 2745: 2757, 1973 aus Nabelschnüren gewonnen. Kurz zusammengefaßt werden die Zellen durch Behandlung mit Collagenase von den Wänden der Blutgefäße abgestreift und in mit Gelatine beschichteten Gewebekulturkolben im Medium M199 gezüchtet, das 10% fötales Kälberserum mit wenig Endotoxin, 90 μg/ml konservierungsmittelfreies Heparin vom Schwein, 20 μg/ml Zusatzmittel für das Endothelzellenwachstum (ECGS), Glutamin und Antikörper enthält.
Vorläufer von Endothelzellen werden nach den Verfahren von Asahara et al. aus peripherem Humanblut abgetrennt (Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964–967, 1997). Magnetische Kügelchen, die mit einem Antikörper für CD34 beschichtet sind, werden mit peripherem Humanblut inkubiert. Nach der Inkubation werden die gebundenen Zellen eluiert und können im Medium M-199 gezüchtet werden, das 20% fötales Rinderserum und Rinderhirnextrakt enthält (Clonetics, San Diego, CA). Die Zellen werden durch fluoreszierende Antikörper für CD45, CD34, CD31, Flk-1, Tie-2 und E-Selectin gekennzeichnet.
Endothelzellen werden mit irgendwelchen Expressionsvektoren von Säugern transfektiert, die irgendwelche geklonte Gene codierende Proteine enthalten, wie dem von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), dem Fibroplasten-Wachstumsfaktor (FGF) oder Stickoxid-Synthase (NOS), wobei herkömmliche Verfahren angewendet werden (siehe z.B. die Mammalia-Expressionsvektoren und Transfektionskits, die von Stratagene, San Diego, CA kommerziell erhältlich sind). Gereinigte Vorläufer von Endothelzellen vom Schwein werden z.B. nach den Verfahren von Rosengart et al. mit dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) transfektiert, wobei ein adenoviraler Expressionsvektor verwendet wird, der die VEGF cDNA ausprägt (Six-month assessment of a phase I trial of angiogenic gene therapy for the treatment of coronary artery disease using direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing the VEGF121 cDNA. Ann. Surg. 230(4): 466–470 (1999), hier als Bezug erwähnt).
Antikörper
Monoklonale Antikörper, die im erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, können nach den Standardverfahren von Kohler und Milstein produziert werden (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Nature 265: 495–497, 1975). Endothelzellen können als Immunogen verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu produzieren, die gegen Oberflächenantigene von Endothelzellen gerichtet sind.
Gegen Endothelzellen gerichtete, monoklonale Antikörper werden hergestellt, indem einer Maus oder Ratte HUVEC oder gereinigte Vorläufer von Endothelzellen injiziert werden. Nach einer ausreichenden Zeit wird die Maus getötet, und es werden die Zellen der Milz erhalten. Die Zellen der Milz werden immortalisiert, indem sie im allgemeinen in Gegenwart eines nichtionischen Detergens, z.B. Polyethylenglycol, mit Myelomzellen oder mit Lymphomzellen fusionieren. Die resultierenden Zellen, die die fusionierten Hybridome enthalten, können in einem selektiven Medium, wie dem HAT-Medium, wachsen und die überlebenden Zellen werden in einem solchen Medium gezüchtet, wobei die Bedingungen einer begrenzten Verdünnung angewendet werden. Die Zellen wachsen in einem geeigneten Behälter, z.B. Mikrotitervertiefungen, und der Überstand wird auf monoklonale Antikörper mit der gewünschten Spezifität, d.h. Reaktivität gegenüber Antigenen von Endothelzellen, überprüft.
Für die Verbesserung der Ausbeuten von monoklonalen Antikörpern gibt es verschiedene Verfahren, wie das Injizieren von Hybridomzellen in den Peritonealraum eines Mammaliawirts, der die Zellen akzeptiert, und das anschließende Gewinnen des Bauchwassers. Wenn sich eine unzureichende Menge des monoklonalen Antikörpers im Bauchwasser sammelt, wird der Antikörper aus dem Blut des Wirts gewonnen. Für die Abtrennung und Reinigung von monoklonalen Antikörpern gibt es verschiedene herkömmliche Methoden, damit die monoklonalen Antikörper von anderen Proteinen und anderen Verunreinigungen befreit werden.
Im Umfang dieser Erfindung liegen auch nützliche Bindungsfragmente von monoklonalen Antikörpern für Endothelzellen, wie die Fab-, F(ab')2- oder Fc-Fragmente dieser monoklonalen Antikörper. Die An tikörperfragmente werden nach herkömmlichen Verfahren erhalten. Nützliche Bindungsfragmente können z.B. durch Peptidaseaufschluß des Antikörpers unter Verwendung von Papain oder Pepsin hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper betreffen einen Antikörper aus der IgG-Klasse aus einer Quelle in Form einer Maus; das ist jedoch nicht als Einschränkung gedacht. Der vorstehend genannte Antikörper und jene Antikörper mit einer Funktionsäquivalenz zum vorstehend genannten Antikörper, entweder aus einer Quelle in Form einer Maus, einer Mammaliaquelle, einschließlich dem Menschen, oder anderen Quellen, oder Kombinationen davon liegen im Umfang dieser Erfindung, sowie auch andere Klassen, wie IgM, IgA, IgE und dergleichen, einschließlich Isotypen innerhalb dieser Klassen. Im Falle von Antikörpern bedeutet der Begriff "Funktionsäquivalenz", daß sich zwei unterschiedliche Antikörper jeweils an den gleichen antigenen Ort auf einem Antigen binden, mit anderen Worten konkurrieren die Antikörper um die Bindung an das gleiche Antigen. Das Antigen kann sich auf dem gleichen oder einem anderen Molekül befinden.
Nach einer Ausführungsform werden monoklonale Antikörper verwendet, die mit dem Oberflächenantigen CD34 von Endothelzellen reagieren. Es hat sich gezeigt, daß monoklonale Antikörper für CD34, die an einen festen Träger gebunden sind, Vorläufer von Endothelzellen aus peripherem Humanblut einfangen. Nach dem Einfangen sind diese Vorläuferzellen zu einer Differenzierung in Endothelzellen in der Lage (Asahara et al. 1997. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964–967). Hybridome, die monoklonale Antikörper produzieren, die gegen CD34 gerichtet sind, können von der American Type Tissue Collection (Rockville, MD) erhalten werden. Nach einer anderen Ausführungsform werden monoklonale Antikörper verwendet, die gegenüber den Oberflächenantigenen Flk-1 oder Tie-2 von Endothelzellen reaktiv sind.
Es können auch polyklonale Antikörper verwendet werden, die gegenüber Endothelzellen reaktiv sind, die aus der gleichen Spezies wie die abgetrennt wurden, die das Implantat in Form der medizinischen Vorrichtung empfängt.
Stent
Der Begriff "Stent" steht hier für irgendeine medizinische Vorrichtung, die, wenn sie in das Lumen eines Gefäßes eingesetzt ist, das Querschnittslumen des Gefäßes vergrößert. Der Begriff "Stent" schließt beschichtete Stents, wie die mit PTFE oder ePTFE beschichteten, ein. Nach einer Ausführungsform schließt dies Stents ein, die perkutan zugeführt werden, um Verschlüsse von Kranzarterien zu behandeln oder Sektionen oder Aneurisma von Gefäßen der Milz, des Knorpels, des Darmbeins und der Kniekehle zu verschließen. Nach einer anderen Ausführungsform wird der Stent in ein Venengefäß eingebracht. Der Stent kann aus polymeren oder metallischen Bauelementen bestehen, auf die die Matrix aufgebracht ist, oder der Stent kann ein Verbundstoff der Matrix sein, die mit einem Polymer vermischt ist. Es kann z.B. ein verformbarer Stent aus Metalldraht verwendet werden, wie er in US-Patent Nr. 4,886,062 von Wiktor offenbart ist. Es kann auch ein selbstexpandierender Stent aus einem elastischen Polymermaterial verwendet werden, wie der in der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung WO 91/12779 "Intraluminal Drug Eluting Prosthesis" offenbarte. Stents können auch unter Verwendung von rostfreiem Stahl, Polymeren, Nickel-Titan, Tantal, Gold, Platin-Iridium oder Elgiloy und MP35N und anderen eisenhaltigen Materialien hergestellt werden. Stents werden auf einem Katheder durch das Körperlumen zur Behandlungsstelle geführt, wo der Stent vom Katheder gelöst wird, wobei sich der Stent in einen direkten Kontakt mit der Lumenwand des Gefäßes ausdehnen kann. Dem Fachmann ist klar, daß andere Gestaltungen von selbstexpandierenden Stents (wie Stentgestaltungen aus elastischem Metall) mit den Antikörpern und Matrices dieser Erfindung verwendet werden können.
Synthetisches Transplantat
"Synthetisches Transplantat" steht für irgendeine künstliche Prothese mit biokompatiblen Eigenschaften. Nach einer Ausführungsform schließt dies synthetische Transplantate aus Dacron (Polyethylenterephthalat, PET) oder Teflon (ePTFE) ein. Nach einer anderen Ausführungsform bestehen synthetische Transplantate aus Polyurethan. Nach einer dritten Ausführungsform besteht das synthetische Transplantat aus einer inneren Schicht aus gitterartigem Polycarbonat-urethan und einer äußeren Schicht aus gitterartigem Dacron. Dem Fachmann ist klar, daß irgendein biokomplatibles synthetisches Transplantat mit den Antikörpern und Matrices dieser Erfindung verwendet werden kann (Bos. et al. 1998. Small-Diameter Vascular Prostheses: Current Status. Archives Physio. Biochem. 106: 100–115). Synthetische Transplantate können für die Anastomose von Gefäßenden miteinander oder für die Umgehung eines erkrankten Gefäßsegmentes verwendet werden.
Matrix
(A) Synthetische Materialien
Die Matrix, die zum Beschichten des Stents oder eines synthetischen Transplantats verwendet wird, kann aus synthetischen Materialien, wie Polyurethan, segmentiertem Polyurethan-Harnstoff/Heparin, Poly-L-milchsäure, Celluloseester oder Polyethylenglycol, ausgewählt werden.
(B) Natürlich vorkommendes Material
Die Matrix kann aus natürlich vorkommenden Substanzen, wie Collagen, Laminin, Heparin, Fibrin, Cellulose oder Kohlenstoff ausgewählt werden. Eine primäre Anforderung an die Matrix besteht darin, daß sie ausreichend elastisch und flexibel ist, so daß sie an den freiliegenden Oberflächen des Stents oder der synthetischen Matrix ohne Risse bleibt.
(C) Fullerene
Die Matrix kann auch ein Fulleren umfassen (der Begriff "Fulleren" schließt eine Vielzahl von Fullerenmolekülen ein). Fullerene sind Kohlenstoffkäfigmoleküle. Die Anzahl der Kohlenstoffmoleküle (C) in einer Fullerenspezies schwankt von etwa C₆₀ bis etwa C₁₀₀. Fullerene werden durch Reaktionen von elementarem Kohlenstoff oder kohlenstoffhaltigen Spezies bei hoher Temperatur nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren erzeugt; z.B. durch Verdampfen von Kohlenstoff mittels Laser, Erwärmen von Kohlenstoff in einem Lichtbogen oder Verbrennen von Kohlenwasserstoffen in rußenden Flammen (US-Patent Nr. 5,292,813 von Patel et al., US-Patent Nr. 5,558,903 von Bhushan et al.). In jedem Fall wird eine kohlenstoffhaltige Ablagerung oder kohlenstoffhaltiger Ruß erzeugt. Aus diesem Ruß werden durch Extraktion mit geeigneten Lösungsmitteln, wie Toluol, verschiedene Fullerene erhalten. Die Fullerene werden nach bekannten Verfahren, insbesondere durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), getrennt. Fullerene können synthetisiert oder von Dynamic Enterprises, Ltd. Berkshire, England oder Southern Chemical Group, LLC, Tucker, Georgia kommerziell erhalten werden.
Fullerene können durch eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden auf Oberflächen aufgebracht werden, dazu gehören das Sublimieren, das Verdampfen mittels Laser, das Zerstäuben, Ionenstrahlen, Sprühbeschichten, Tauchbeschichten, Beschichten durch Aufwalzen oder Streichen, wie es in US-Patent Nr. 5,558,903 offenbart ist.
Ein wichtiges Merkmal von Fullerenen ist ihre Fähigkeit, "aktivierten Kohlenstoff" zu bilden. Die Elektronenstruktur des Fullerens ist ein System aus überlappenden n-Orbitalen, so daß entlang der Oberfläche des Moleküls eine Vielzahl von bindenden Elektronen zusammenwir kend vorliegt (Chemical and Engineering News, 8. April 1991, S. 59). Als Formen von aktiviertem Kohlenstoff zeigen Fullerene im wesentlichen van-der-Waals-Kräfte für schwache Wechselwirkungen. Durch die adsorbierende Natur der Fullerenoberfläche können sie selbst zusätzlich modifiziert werden, um bestimmte Wechselwirkungen der Zellmembran auszurichten. Bestimmte Moleküle, die chemische Eigenschaften besitzen, durch die sie sich selektiv an Zellmembranen bestimmter Zellarten oder an bestimmte Komponenten von Zellmembranen binden, z.B. Lektine oder Antikörper, können an der Fullerenoberfläche adsorbiert werden. Die Fullerenoberfläche kann auch chemisch modifiziert werden, so daß sie bestimmte reaktive Gruppen für die Zellmembran, z.B. Oxidations- oder Reduktionsmittel, zeigt. Das Binden verschiedener Moleküle an die Fullerenoberfläche kann beeinflußt werden, so das Oberflächen geschaffen werden, die verschiedene Zellarten, z.B. Epithelzellen, Fibroplasten, primäre Explantate oder Subpopulationen von T-Zellen, selektiv binden, US-Patent Nr. 5,310,669 von Richmond et al.; Stephen R. Wilson, Biological Aspects of Fullerenes, Fullerenes: Chemistry, Physics and Technology, Kadish et al. Herausg. John Wiley & Sons, NY 2000.
Fullerene können auch Nanoröhrchen bilden, die andere Atome oder Moleküle enthalten (Liu et al. Science 280: 1253–1256 (1998). Die Synthese und Herstellung von Nanoröhrchen aus Kohlenstoff ist auf diesem Fachgebiet allgemein bekannt (US-Patent Nr. 5,753,088 von Olk et al. und US-Patent Nr. 5,641,466 von Ebbsen et al., die beide hier als Bezug erwähnt werden). Moleküle, wie Proteine, können ebenfalls innerhalb der Nanoröhrchen aus Kohlenstoff enthalten sein. Nanoröhrchen können z.B. mit den Enzymen, z.B. Zn₂Cd₂-Metallothionein, Cyctochromen C und C3 und β-Lactamase, gefüllt werden, nachdem die Enden des Nanoröhrchens abgeschnitten worden sind (Davis et al. Inorganica Chim. Acta 272: 261 (1998); Cook et al. Full Sci. Tech. 5(4): 695 (1997).
Es können auch dreidimensionale Fullerenstrukturen verwendet werden. US-Patent Nr. 5,338,571 von Mirkin et al. offenbart dreidimensionale mehrschichtige Fullerenstrukturen, die auf einer Substratoberfläche gebildet werden, indem (i) Fullerene chemisch modifiziert werden, wodurch eine eine Bindung bildende Spezies bereitgestellt wird; (ü) die Oberfläche des Substrats chemisch behandelt wird, wodurch eine eine Bindung bildende Spezies bereitgestellt wird, die für eine kovalente Bindung mit der eine Bindung bildenden Spezies des Fullerens in einer Lösung effektiv ist; und (iii) eine Lösung der modifzierten Fullerene mit der behandelten Substratoberfläche in Kontakt gebracht wird, wodurch eine Fullerenschicht erzeugt wird, die kovalent an die behandelte Substratoberfläche gebunden ist.
(D) Aufbringen der Matrix auf die medizinische Vorrichtung
Die Matrix sollte fest an der Oberfläche des Stents oder des synthetischen Transplantats haften. Das wird vorzugsweise erreicht, indem die Matrix in direkt aufeinanderfolgenden dünnen Schichten aufgebracht wird. Jede Schicht der Matrix kann die Antikörper enthalten. Nach einer anderen Ausführungsform können die Antikörper nur bei der Schicht verwendet werden, die sich in direktem Kontakt mit dem Lumen des Gefäßes befindet. Unterschiedliche Arten von Matrices können nacheinander in direkt aufeinanderfolgenden Schichten aufgebracht werden. Die Antikörper können nach dem Aufbringen der Matrix auf dem Stent kovalent oder nicht-kovalent auf die Matrix aufgebracht werden.
Um eine medizinische Vorrichtung, wie einen Stent, zu beschichten, wird dieser Stent in eine Lösung der Matrix in einer Flüssigkeit mit maßvoller Viskosität getaucht oder damit besprüht. Nach dem Aufbringen jeder Schicht wird der Stent vor dem Aufbringen der nächsten Schicht getrocknet. Nach einer Ausführungsform übersteigt eine dünne, anstrichartige Matrixbeschichtung eine Gesamtdicke von 100 μm nicht.
Eine geeignete Beschichtungslösung für eine Matrix wird z.B. hergestellt, indem 480 Milligramm (mg) eines Arzneimittelträgers, wie Poly-D,L-milchsäure (als R203 von Boehringer Inc, Ingelheim, Deutschland erhältlich) unter aseptischen Bedingungen in 3 Milliliter (ml) Chloroform gelöst werden. Im Prinzip kann jedoch irgendeine biologisch abbaubare (oder nicht biologisch abbaubare) Matrix, die blut- und gewebeverträglich (biokompatibel) ist und gelöst, dispergiert oder emulgiert werden kann, als Matrix verwendet werden, wenn sie nach dem Aufbringen relativ schnell zu einer selbstklebenden lack- oder anstrichähnlichen Beschichtung auf der medizinischen Vorrichtung trocknet.
Das Beschichten eines Stents mit Fibrin ist dem Fachmann z.B. allgemein bekannt. In US-Patent Nr. 4,548,736, das auf Muller et al. veröffentlicht worden ist, läßt man Fibrin durch den Kontakt von Fibrinogen mit Thrombin gerinnen. Das Fibrin im erfindungsgemäßen fibrinhaltigen Stent hat den Faktor XIII, und während der Gerinnung ist Calcium vorhanden, wie es in US-Patent Nr. 3,523,807, das auf Gerendas veröffentlicht worden ist, oder in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0366564 beschrieben ist, um die mechanischen Eigenschaften und die Biostabilität der implantierten Vorrichtung zu verbessern. Das Fibrinogen und das Thrombin, die in der vorliegenden Erfindung für die Erzeugung von Fibrin verwendet werden, stammen vorzugsweise von der gleichen Tier- oder Humanspezies wie die, in die der Stent implantiert wird, um irgendwelche Immunreaktionen zwischen den Spezies, z.B. Human gegen Rind, zu vermeiden. Das Fibrinprodukt kann in Form eines feinen Fibrinfilms vorliegen, der durch Gießen von kombiniertem Fibrinogen und Thrombin in einem Film und anschließendes osmotisches Entfernen der Feuchtigkeit aus dem Film durch eine semipermeable Membran erzeugt wird.
In der Europäischen Patentanmeldung 0366564 wird ein Substrat (das vorzugsweise eine hohe Porosität oder hohe Affinität für entweder Thrombin oder Fibrinogen aufweist) mit einer Fibrinogenlösung und mit einer Thrombinlösung in Kontakt gebracht. Das Ergebnis ist eine Fibrinschicht, die durch Polymerisieren von Fibrinogen auf der Oberfläche der medizinischen Vorrichtung erzeugt worden ist. Mehrere Fibrinschichten, die nach diesem Verfahren aufgebracht wurden, können für eine Fibrinschicht mit irgendeiner gewünschten Dicke sorgen. Nach einer anderen Ausführungsform läßt man das Fibrin zuerst gerinnen und dann wird es zu einem Pulver gemahlen, das mit Wasser gemischt und in einer erhitzten Form in die gewünschte Form gepreßt wird (US-Patent Nr. 3,523,807). Im geformten Fibrin kann auch eine bessere Stabilität erreicht werden, wenn das Fibrin mit einem Fixiermittel, wie Glutaraldehyd oder Formaldehyd, in Kontakt gebracht wird. In der vorliegenden Erfindung können diese und andere Verfahren angewendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, um Fibrin herzustellen und zu formen.
Wenn ein synthetisches Transplantat mit Collagen beschichtet wird, sind die Verfahren zur Herstellung von Collagen und zu dessen Formgebung zu einem synthetischen Transplantat allgemein bekannt, wie es in US-Patent Nr. 5,851,230 von Weadock et al. aufgeführt ist. Dieses Patent beschreibt Verfahren zum Beschichten eines synthetischen Transplantats mit Collagen. Verfahren zum Anbringen von Collagen an ein Substrat in Form eines porösen Transplantats schließen typischerweise das Aufbringen einer Collagendispersion auf das Substrat, das Trocknenlassen und das Wiederholen dieses Verfahrens ein. Collagendispersionen werden typischerweise hergestellt, indem unlösliches Collagen (etwa 1 bis 2 Gew.-%) bei einem sauren pH-Wert (pH-Wert im Bereich von 2 bis 4) in einer Dispersion gemischt wird. Die Dispersion wird typischerweise mit einer Spritze in den Hohlraum des Transplantats injiziert und manuell einmassiert, um die gesamte innere Oberfläche mit der Collagensuspension zu bedecken. Die über schüssige Collagensuspension wird durch eines der offenen Enden des Transplantats entfernt. Die Schritte zum Beschichten und Trocknen werden einige Male wiederholt, so daß für eine ausreichende Behandlung gesorgt wird.
Nach einer weiteren Ausführungsform wird der Stent oder das synthetische Transplantat mit amorphem Kohlenstoff überzogen. In US-Patent Nr. 5,198,263 ist ein Verfahren zur Herstellung von amorphen Kohlenstoffilmen durch Auftragen mit hoher Rate bei niedriger Temperatur in Gegenwart eines fluorierten Gases oder anderen Halogengases beschrieben. Das Aufbringen gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren kann bei weniger als 100°C, einschließlich Umgebungstemperatur des Raums, nach einem plasmagestützten chemischen Bedampfungsverfahren mit Hochfrequenz durchgeführt werden. Der unter Anwendung dieser erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte amorphe Kohlenstoffilm haftet an vielen Substratarten gut, dazu gehören z.B. Glasmaterialien, Metalle, Halbleiter und Kunststoffe.
Das Anfügen einer Fullereneinheit an reaktive Plätzen in Form einer Aminogruppe bei einem aminhaltigen Polymer, wodurch die mit Fulleren gepropften aminhaltigen Polymere erzeugt werden, kann wie in US-Patent Nr. 5,292,813 beschrieben erfolgen. Eine auf diese Weise durchgeführte chemische Modifizierung sorgt für die direkte Einführung der Fullerene in den Stent. Nach einer weiteren Ausführungsform können die Fullerene auf der Oberfläche des Stents oder synthetischer Transplantate aufgebracht werden, wie es vorstehend beschrieben ist (siehe WO 99/32184 von Leone et al.). Fullerene können auch über eine Aldehydbindung gebunden werden (Yamago et al. Chemical Derivatization of Organofullerenes through Oxidation, Reduction and C-O and C-C Bond Forming Reactions, J. Org. Chem. 58 4796–4798 (1998). C60O kann auch über eine Epoxidgruppe am Fulleren direkt an einen Stent gebunden werden. Diese Bindung erfolgt über eine kovalente Bindung an Sauerstoff. Diese Verbindung und die Protokolle für das Koppeln sind von BuckyUSA (BuckyUSA, Houston, Texas) kommerziell erhältlich.
(E) Zugabe von Antikörpern zur Matrix
Antikörper, die das Haften eines Vorläufers von Endothelzellen fördern, können entweder kovalent oder nicht-kovalent in die Matrix eingebracht werden. Antikörper können in jede Schicht der Matrix eingeführt werden, indem die Antikörper mit der Matrixbeschichtungslösung gemischt werden. Nach einer anderen Ausführungsform können die Antikörper kovalent auf die letzte Schicht der Matrix aufgebracht werden, die auf die medizinische Vorrichtung aufgebracht wurde.
Nach einer Ausführungsform werden die Antikörper einer Lösung zugesetzt, die die Matrix enthält. Z.B. werden Fab-Fragmente auf dem monoklonalen Antikörper für CD34 mit einer Lösung inkubiert, die Human-Fibrinogen in einer Konzentration von 500 bis 800 mg/dl enthält. Es wird eingeschätzt, daß die Konzentration des Fab-Fragmentes gegen CD34 veränderlich ist und daß der Fachmann die optimale Konzentration ohne übermäßige Versuche bestimmen kann. Der Stent wird dem Fab/Fibrin-Gemisch zugesetzt, und das Fibrin wird durch Zugabe von konzentriertem Thrombin (mit einer Konzentration von mindestens 1000 E/ml) aktiviert. Das entstehende polymerisierte Fibringemisch, das die Fab-Fragmente enthält, die direkt in die Matrix eingeführt worden sind, wird zu einer dünnen Schicht (weniger als 0,12 cm) auf der Oberfläche des Stents oder des synthetischen Transplantats gepreßt. Praktisch kann auf diese Weise jede Art eines Antikörpers oder Antikörperfragments in eine Matrixlösung eingeführt werden, bevor ein Stent oder ein synthetisches Transplantat beschichtet wird.
Nach einer weiteren Ausführungsform werden Antikörper kovalent an die Matrix gebunden. Nach einer Ausführungsform werden die Antikörper durch Verwendung von hetero- oder homobifunktionellen Lin kermolekülen kovalent an die Matrix gebunden. Der Begriff "gebunden" steht hier für das kovalente Koppeln des Antikörpers über ein Linkermolekül mit der Matrix. Die Verwendung von Linkermolekülen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beinhaltet typischerweise das kovalente Koppeln der Linkermoleküle mit der Matrix, nachdem sie am Stent haftet. Nach dem kovalenten Koppeln an die Matrix versehen die Linkermoleküle die Matrix mit einer Anzahl von aktiven funktionellen Gruppen, die verwendet werden können, um eine Art oder mehrere Arten von Antikörpern kovalent zu koppeln. 1 zeigt eine Darstellung des Koppelns über ein vernetzendes Molekül. Eine Endothelzelle 1.01 bindet sich über das Oberflächenantigen der Zelle 1.02 an einen Antikörper 1.03. Der Antikörper wird durch ein vernetzendes Molekül 1.04 an die Matrix 1.05–1.06 gebunden. Die Matrix 1.05-1.06 haftet am Stent 1.07. Die Linkermoleküle können direkt (d.h. durch Carboxylgruppen) oder nach der allgemein bekannten Kopplungschemie, wie Veresterung, Amidieren und Acylieren, an die Matrix gekoppelt werden. Das Linkermolekül kann eine Di- oder Triamin-funktionelle Verbindung sein, die durch die direkte Bildung von Amidbindungen an die Matrix gekoppelt wird und für Amin-funktionelle Gruppen sorgt, die für die Reaktion mit den Antikörpern zur Verfügung stehen. Das Linkermolekül kann z.B. ein Polyamin-funktionelles Polymer, wie Polyethylenimin (PEI), Polyallylamin (PALLA) oder Polyethylenglycol (PEG), sein. Eine Vielzahl von PEG-Derivaten, z.B. mPEG-Succinimidylpropionat oder mPEG-N-Hydroxysuccinimid, ist zusammen mit den Protokollen für das kovalente Koppeln von Shearwater Corporation, Birmingham, Alabama kommerziell erhältlich (siehe auch Weiner et al. Influence of a poly-ethyleneglycol spacer on anitgen capture by immobilized antibodies. J. Biochem. Biophys. Methods 45: 211–219 (2000), das hier als Bezug erwähnt wird). Es wird eingeschätzt, daß die Auswahl des bestimmten Kopplungsmittels von der Art des verwendeten Antikörpers abhängen kann und daß eine solche Auswahl ohne übermäßige Versuche vorgenommen werden kann. Es können auch Gemische dieser Polymere verwendet werden. Diese Moleküle enthalten eine Vielzahl von gebundenen Amin-funktionellen Gruppen, die verwendet werden können, um einen oder mehrere Antikörper an der Oberfläche zu immobilisieren.
Antikörper können an die C60O-Fullerenschichten gebunden werden, die direkt auf der Oberfläche des Stents aufgebracht worden sind. Vernetzungsmittel können kovalent an die Fullerene gebunden werden. Die Antikörper werden dann an das Vernetzungsmittel gebunden, das wiederum an den Stent gebunden wird. 2 ist eine Erläuterung des Koppelns durch C60O. Die Endothelzellen 2.01 wird über ein Oberflächenantigen der Zelle 2.02 an einen Antikörper 2.03 gebunden, der wiederum kovalent oder nicht-kovalent an die Matrix 2.04 gebunden wird. Die Matrix 2.04 wird über C60O 2.05 kovalent an den Stent 2.06 gebunden.
Versuchsbeispiele
Diese Erfindung wird im folgenden Abschnitt der Versuchsdetails erläutert. Diese nachfolgend aufgeführten Abschnitte dienen dem Verstehen dieser Erfindung, sollen jedoch die Erfindung, sowie sie in den danach folgenden Ansprüchen aufgeführt ist, in keiner Weise einschränken und sollen nicht so gedeutet werden.
Beispiel 1
Anbringen von Human-Endothelzellen an mit CD34 Fab beschichteten Stents Materialien und Verfahren
1. Zellen
HUVEC werden aus Human-Nabelschnüren nach dem Verfahren von Jaffe (Jaffe, E. A. in "Biology of Endothelial Cells" E. A. Jaffe, Herausg. Martinus-Nijhoff, The Hague (1984), das hier als Bezug erwähnt wird) präpariert und im Medium 199 gezüchtet, das mit 20% fötalem Kälberserum (FCS), L-Glutamin, Antibiotika, 130 μg/ml Heparin und 1,2 mg/ml Zusatzmittel für das Wachstum von Endothelzellen (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) ergänzt worden ist.
Vorläufer von Endothelzellen werden nach dem Verfahren von Asahara et al. aus peripherem Humanblut abgetrennt (Isolation of Putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964–967). Monoklonale Antikörper für CD34 werden mit magnetischen Kügelchen gekoppelt und mit der Leukocytenfraktion von Human-Gesamtblut inkubiert. Nach der Inkubation werden die gebundenen Zellen eluiert und in M-199 gezüchtet, das 20% fötales Rinderserum und Rinderhirnextrakt enthält (Clonetics, San Diego, CA). Die Zellen werden durch fluoreszierende Antikörper für CD45, CD34, CD31, Flk-1, Tie-2 und E-Selectin gekennzeichnet.
2. Beschichten von Stents

A. R-Stents, die von Orbus International B.V. (Leusdon, Niederlande) hergestellt werden, werden mit 500 bis 800 mg/ml Human-Fibrinogen (Sigma, St. Louis, MO) zusammen mit Fab-Fragmenten des monoklo nalen Antikörpers für CD34 inkubiert, und das Fibrinogen wird durch die Zugabe von 1000 Einheiten/ml Thrombin polymerisiert. Nach dem Inkubieren des Stents mit dem polymerisierten Fibringemisch, das die monoklonalen Fab-Fragmente für CD34 enthält, wird das Fibrin zu einer dünnen Schicht (weniger als 0,012 cm) am R-Stent gepreßt. Der R-Stent mit der dünnen Fibrinschicht, die die Fab-Fragmente enthält, wird dreimal mit mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Raumtemperatur gewaschen, die 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) enthält.
B. Alternativ werden R-Stents mit mPEG-Succinimidylpropionat (Shearwater Corporation, Birmingham, Alabama) beschichtet. Die Succinimidylgruppe wird nach den Instruktionen des Herstellers mit den monoklonalen Fab-Fragmenten für CD34 (mit Fab-PEG beschichtete R-Stents) umgesetzt, wodurch zwischen dem PEG-Derivat und dem Fab-Fragment eine stabile Amidbindung gebildet wird.

3. Bindungsassay der Endothelzellen
Die mit Fibrin-anti-CD34 Fab beschichteten R-Stents oder die mit Fab-PEG beschichteten R-Stents werden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ mit isolierten HUVEC oder isolierten Vorläufern von Endothelzellen in Zellkonzentrationen von 100000 bis 1000000 Zellen/ml in M199 inkubiert, das 0,5% BSA enthält. Vor dem Inkubieren mit dem Stent werden die HUVEC oder die Vorläufer der Endothelzellen 24 Stunden mit [³H]-Thymidin markiert. Nachdem die markierten Endothelzellen 4 bis 72 Stunden mit den Stents inkubiert worden sind, die mit Fibrin und Fab-anti-CD34 beschichtet worden waren, werden die Stents aus der Lösung genommen und fünfmal mit M199 gewaschen, das 0,5% BSA enthält. Die gebundenen Endothelzellen werden durch Trypsinbehandlung entfernt, und das Binden der markierten Endothelzellen an die Stents wird durch Scintillationszählung des [³H]-Thymidins festgestellt. Als negative Kontrolle wer den allein mit Fibrin beschichtete oder unbeschichtete Stents mit mit [³H]-Thymidin markierten Endothelzellen inkubiert. Die Ergebnisse werden unter Anwendung des t-Tests statistisch ausgewertet, um den Bindungsunterschied festzustellen. Mit Fibrin beschichtete Stents, die monoklonale Fab-Fragmente für CD34 enthalten, zeigen eine deutlich stärkere Bindung von Endothelzellen im Vergleich mit unbeschichteten Stents.
Beispiel 2
Proliferation von Human-Endothelzellen auf mit CD34-Fab beschichteten Stents
Assay der Endothelzellproliferation
R-Stents, die mit Fibrin beschichtet sind, das Fab-Fragmente für CD34 enthält, werden 4 bis 72 Stunden in M199, das 0,5% BSA enthält, mit den HUVEC oder Vorläufern von Endothelzellen inkubiert. Nach dem Inkubieren der Stents mit den HUVEC oder den Vorläufern von Endothelzellen werden die Stents fünfmal mit M199 gewaschen, das 0,5% BSA enthält, und dann mit [³H]-Thymidin inkubiert. Die Einführung von [³H]-Thymidin wird bei den gewaschenen und gewonnenen HUVEC oder den Vorläufern der Endothelzellen festgestellt (die Zellen werden mit Trypsin gewonnen). Die Proliferation der HUVEC oder der Vorläufer der Endothelzellen auf mit Fibrin beschichteten Stents wird mit der Endothelzellenproliferation in üblichen Mikrotiterschalen verglichen. Die Proliferation von HUVEC oder der Vorläufer von Endothelzellen auf mit Fibrin beschichteten Stents ist gleich oder größer als die Proliferation von Endothelzellen in Mikrotiterschalen.
Beispiel 3
Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die gegenüber HUVEC und Vorläufern von Endothelzellen reaktiv sind
BALB/c-Mäuse werden intraperitoneal drei- bis viermal in zwei- bis vierwöchigen Abständen mit 1,5 × 10⁶ HUVEC in PBS oder 1,5 × 10⁶ Vorläufern von Endothelzellen immunisiert und 3 Tage vor der Entnahme von Milzzellen mit 1,5 × 10⁶ HUVEC oder 1,5 × 10⁶ Vorläufern von Endothelzellen angeregt. Es wird eine Milzzellensuspension hergestellt, mit dem Myelom NS1/1 AG4.1 fusioniert, und Hypridome werden gezüchtet und geklont. Um die Wirksamkeit beim Hybridomwachstum und beim Klonen zu verbessern, können im Kulturmedium 10% eines mit Endothelzellen konditionierten Mediums (HUVEC) enthalten sein. Zuerst werden die Überstände der Hybridomkultur durch Immunofluoreszenz-Durchflußcyctometrie (FACS) auf die Reaktivität gegenüber den HUVEC oder Vorläufern von Endothelzellen getestet. Kurz zusammengefaßt werden die HUVEC (1,5 × 10⁴) oder Vorläufer von Endothelzellen (1,5 × 10⁴) mit unverdünntem Hybridomüberstand inkubiert (30 min, 4°C), gewaschen und mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Schaf-F(ab')2-anti-Maus-Ig (100 μg/ml) inkubiert. Nach der letzten Wäsche werden die Endothelzellen durch FACS-Analyse auf die Bindung von monoklonalen Antikörpern geprüft. Positive Hybridomüberstände werden auf die Human-Melanomzellinie MM-170 geprüft, um nicht-endothelspezifische mAb zu eliminieren. Die Endothelspezifität wird ferner durch die Prüfung von monoklonalen Antikörpern bei einer Gruppe von Human-Tumorzellinien sowie auch Human-Lymphocyten, Monocyten, Neutrophilen, Erytrocyten und Thrombocyten bestätigt.
Beispiel 4
Untersuchungen der Verletzungen durch einen Ballon beim Schwein
Die Implantation von mit Antikörpern beschichteten Stents wird bei jungen Yorkshire-Schweinen mit einem Gewicht von 25 bis 30 kg vorgenommen. Die Tierbetreuung entspricht dem "Guide for the Care an Use of Laboratory Animals" (NIH-Veröffentlichung Nr. 80-23, 1985 durchgesehen). Nachdem sie über Nacht ohne Nahrung geblieben waren, wurden die Tiere mit Ketaminhydrochlorid (20 mg/kg) beruhigt. Nach der Einleitung der Anästhesie mit Thiopental (12 mg/kg) wurden die Tiere intubiert und mit einem Beatmungsapparat verbunden, der ein Gemisch aus Sauerstoff und Stickoxid (1:2 (Vol./Vol.)) verabreicht. Die Anästhesie wird mit 0,5 bis 2,5 Vol.-% Isofluran aufrechterhalten. Für die antibiotische Prophylaxe wird durch eine intramuskuläre Injektion von 1000 mg eines Gemischs von Procain-Penicillin-G und Benzathin-Penicillin-G (Streptomycin) gesorgt.
Unter sterilen Bedingungen wird eine Arteriotomie der linken Halsschlagarterie durchgeführt, und in der linken Halsschlagarterie wird eine 9F-Einführungshülse plaziert. Alle Tiere erhielten intravenös 7500 IE Heparin-Natrium und 100 mg Acetylsalicylsäure. Große Pillen mit weiteren 2500 IE Heparin werden durch das Verfahren periodisch verabreicht, um eine aktivierte Gerinnungszeit von mehr als 300 s aufrechtzuerhalten. Ein 8F-Führungskatheder wird durch die Halsschlaghülse eingeführt und zum Ursprung der Darmbeinarterie geführt. Die Angiographie wird nach der Verabreichung von 1 mg Isosorbiddinitrat vorgenommen, und die Bilder werden unter Verwendung eines quantitativen Systems für die koronäre Angiographie analysiert. Ein 3F-Embolektomiekatheder wird in die gemeinsame Oberschenkelarterie eingeführt und distal zum für die Stentimplantation ausgewählten Segment geführt. Der Embolektomieballon wird auf eine Größe aufgeblasen, die 0,5 mm größer als das Arteriensegment ist, und zweimal zurückgezogen, um das Gefäß bloßzulegen. Unmittelbar nach der Bloßlegung wird durch den Führungskatheder ein mit Fibrin beschichteter Stent eingeführt, der ein Fab-Fragment eines monoklonalen Antikörpers enthält, und im bloßgelegten Segment der Oberschenkelarterie entfaltet. Tiere wurden sowohl am dritten Tag als auch acht Wochen nach der Implantation des Stents getötet. Die Tiere wurden zuerst beruhigt und anästhesiert, wie es vorstehend beschrieben ist. Die mit einem Stent versehenen Oberschenkelsegmente werden entnommen und dann 48 Stunden bei 4°C in 4% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphatbuffer pH = 7,2 gegeben. Ein rechteckiger Schnitt der Gefäßwand wird zur Weiterebehandlung für die Elektronenmikroskopieauswertung der Bedeckung der Oberfläche der Endothelzellen entnommen. Dieser Teil des mit einem Stent versehenen Gefäßes wird in 0,15 Kakodylatpuffer gegeben und ferner mit 2,5% Glutaraldehyd in 0,15 m Kakodylat fixiert. Dann wird das Gewebe mit 0,1 m Kakodylatpuffer nachfixiert, der 1% OsO₄ und 50 mM Ferricyanid (K₃[Fe(CN₆]) enthält und weiterbehandelt (Reduction in thrombotic events with heparin-coated Palmaz-Schatz stents in normal procine coronary arteries, Circulation 93: 423–430).
Die restlichen Schnitte der mit einem Stent versehenen Arteriensegmente werden mit drei Änderungen von Methylmethacrylat imprägniert, wie es bei van Beusekom et al. (Cardiovasc Pathol 5: 69–76 (1996)) beschrieben ist. Die eingebetteten Arteriensegmente mit dem Stent an Ort und Stelle werden auf einem motorgetriebenen rotierenden Mikrotom (HM-350, Microm GmbH, München, Deutschland) in 3 bis 5 μm dicke Schnitte zerteilt, wobei Wegwerfklingen aus rostfreiem Stahl verwendet werden. Auf mit Chrom-Aluminium beschichteten Objektträgern werden die Schnitte auf einer Heizplatte bei 40°C gedehnt, wobei ein Gemisch aus 60% 2-Butoxyethanol und 10 Ethanol in Wasser verwendet wird. Die Schnitte werden mit einer Kunststoffolie bedeckt, das überschüssige Butoxyethanol-Ethanolgemisch wird entfernt, und die Objektträger können über Nacht in einem Ofen mit 40°C trocknen. Dann werden die Schnitte 30 bis 60 Minuten in einer Lösung von gleichen Volumina von Xylol-Chloroform deplastifiziert. Danach werden bei den präparierten Schnitten übliche Färbungsverfahren für die Lichtmikroskopie vorgenommen. Statistik: Die Daten werden als Durchschnittswert ± Standardabweichung vom Durchschnittswert (SD) der unabhängigen Versuche angegeben. Die statische Signifikanz wird durch eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA) und den Fisher-PLSD-Tests (StatView 4.01, Brain Power, Inc., Calabasas, Calif.) bestimmt. Für die Daten der behandelten und unbehandelten Segmente der Oberschenkelarterien wird ein paarweiser t-Test angewendet (StatView 4.01). Ein p-Wert von < 0,05 wird als statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Durchschnittswerten angesehen. Tiere, die mit einem Stent behandelt worden waren, der ein monoklonales Fab-Fragment gegen Endothelzellen vom Schwein enthielt, zeigt eine stärkere Endothelzellenbedeckung und eine deutlich geringere Restenose im Vergleich mit Kontrollen, denen ein unbeschichteter Stent implantiert worden war.
Beispiel 5
Transfektion von Vorläufern von Endothelzellen vom Schwein
Vorläufer von Endothelzellen vom Schwein werden nach dem Verfahren von Asahara et al. aus dem peripheren Blut vom Schwein abgetrennt (Isolation of Putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964–967). Monoklonale Antikörper für CD34 werden mit magnetischen Kügelchen gekoppelt und mit der Leukocytenfraktion vom Gesamtblut vom Schwein inkubiert. Nach der Inkubation werden die gebundenen Zellen eluiert und in M-199 gezüchtet, das 20% fötales Rinderserum und Rinderhirnextrakt enthält (Clonetics, San Diego, CA). Die Zellen werden durch fluoreszierende Antikörper für CD45, CD34, CD31, Flk-1, Tie-2 und E-Selectin gekennzeichnet.
Gereinigte Vorläufer von Endothelzellen vom Schwein werden z.B. nach den Verfahren von Rosengart et al. mit einem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) transfektiert, wobei ein Adenovirusvektor verwendet wird, der die VEGF cDNA ausprägt (Six-month assessment of a phase I trial of angiogenic gene therapy for the treatment of coronary artery disease using direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing the VEGF121 cDNA (Ann. Surg. 230(4): 466–470 (1999)).
Die transfektierten gereinigten Vorläuferzellen vom Schwein, die den VEGF ausprägen, werden nach der Ballonverletzung und der Implantation eines Stents wie in Beispiel 4 beschrieben in das Oberschenkelarterienmodell beim Schwein infundiert, wobei ein Doppelballonkammer-Infusionskatheder (Cordis Corp.) verwendet wird, der den mit einem Stent versehenen Bereich der Oberschenkelarterie isoliert. Die Restenose wird bei mit der Ballonangioplastie in Form eines Stents behandelten Schweinen, die eine Infusion von mit dem VEGF transfektierten Vorläuferzellen vom Schwein erhalten hatten, und bei Schweinen verglichen, die eine Infusion mit nichttransfektierten Vorläufern von Endothelzellen vom Schwein erhalten hatten. Die Expression des VEGF in den erneut infundierten Vorläufern von Endothelzellen vom Schwein führt zu einer geringeren Häufigkeit und Schwere der Restenose bei mit anti-CD34 beschichteten Stents.
Beispiel 6
Herstellung von mit Aminosilan-PEG gebundenen Antikörpern
Stentherstellung – Stents werden aus rostfreiem Stahl 316L hergestellt und gereinigt und passiviert, indem sie zuerst in einer Ultraschallreinigungsvorrichtung in einem anionischen Detergens gewaschen und dann unter Rühren in heiße Salpetersäure eingeweicht werden, darauf folgt das abschließende Spülen mit deionisiertem Wasser.
Der Derivatbildung unterzogene Stents werden wie folgt hergestellt – Stents werden drei Minuten in ein 2%iges Gemisch von N-(2-Aminoethyl-3-aminopropyl)trimethoxysilan in 95% Ethanol getaucht, entnommen, bei Raumtemperatur luftgetrocknet und dann 10 Minuten bei 110°C gehärtet.
Spacerkopplung mit Polyethylengycol (PEG) – Der Derviatbildung unterzogene Stents werden in 100 ml 0,1 m MES-Puffer gegeben, dem 10 mM Dicarboxymethyl-PEG und 500 mg EDC zugesetzt worden waren, und zwei Stunden unter ständigem Rühren bei 25°C inkubiert.
Gebundener Antikörper – Antikörper für Endothelzellen werden in einer einstufigen Carbodiimid-Kopplungsreaktion an den mit PEG funktionalisierten Stents immobilisiert, indem die Stents in 150 ml 0,1 m MES-Puffer (pH = 4,5) getaucht werden, in dem 1,0 mg CD34-IgG₁-Antikörper vom Schwein gelöst ist, und zwei Stunden bei 25°C inkubiert. Die Stents werden aus der Lösung genommen und fünfmal mit 50 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (pH = 7,2) mit 0,02% Tween 20 gespült.
Die Reagenzien schließen die folgenden ein: N-(2-Aminoethyl-3-aminopropyl)trimethoxysilan (Degussa-Huls); MES-Puffer – Morpholin-Ethansulfonsäure-Puffer (Sigma, St. Louis, MO); EDC – 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (Sigma, St. Lous, MO); Dicarboxymethyl-PEG – Dicarboxymethyl-poly(ethylenglycol) (MW 3400) (Shearwater, Huntsville, AL).
Obwohl verschiedene Ausführungsformen der Erfindung beschrieben worden sind, ist es nicht beabsichtigt, die Erfindung auf diese Ausführungsformen zu beschränken.

Claims

Medizinische Vorrichtung, die sich nach dem Einsetzen in ein Gefäß für das Beschichten mit Endothelzellen eignet, die eine Beschichtung umfaßt, wobei die Beschichtung eine therapeutisch wirksame Menge von zumindest einer Art eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments, die mit einem Oberflächenantigen von Endothelzellen reagiert, und zumindest eine Schicht aus einer Matrix, die an der Oberfläche der medizinischen Vorrichtung haftet, umfaßt, wobei die Matrix ein synthetisches oder natürlich vorkommendes, biokompatibles Material umfaßt und wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment in der Matrix eingelagert worden oder kovalent an die Matrix gebunden ist.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Matrixmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fulleren im Bereich von etwa C₆₀ bis etwa C₁₀₀, Polyurethan, segmentiertem Polyurethan-Harnstoff/Heparin, Poly-L-milchsäure, Poly-D,L-milchsäure, Celluloseester, Polyethylenglycol, Collagen, Laminin, Heparin, Fibrin, Elastin, Cellulose und Kohlenstoff besteht.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper über ein Linkermolekül kovalent an die letzte Schicht der Matrix gebunden ist, die die medizinische Vorrichtung überzieht.
Medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Matrix ein Fulleren im Bereich von etwa C₆₀ bis etwa C₁₀₀ umfaßt.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die erste Schicht der Matrix nicht-kovalent an die medizinische Vorrichtung gebunden ist.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die erste Schicht der Matrix kovalent an die medizinische Vorrichtung gebunden ist.
Medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das Fulleren C60O ist.
Medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Fulleren als Nanoröhrchen angeordnet ist.
Medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die medizinische Vorrichtung ein Stent ist.
Medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die medizinische Vorrichtung ein synthetisches Transplantat ist.
Medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Oberflächenantigen der Endothelzellen auf einer Humanzelle vorliegt.
Medizinische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei der monoklonale Antikörper mit dem Oberflächenantigen CD34 von Endothelzellen reagiert.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, wobei der monoklonale Antikörper Fab- oder F(ab')2-Fragmente umfaßt.
Medizinische Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Matrix auch Polytetrafluorethylen oder gedehntes Polytetrafluorethylen umfaßt.
Zusammensetzung zum Beschichten einer medizinischen Vorrichtung, damit sich die Vorrichtung nach dem Einführen in ein Gefäß für das Beschichten mit Endothelzellen eignet, die eine Matrix und eine therapeutisch wirksame Menge von zumindest einer Art eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments umfaßt, das mit einem Oberflächenantigen von Endothelzellen reagiert, wobei die Matrix ein synthetisches oder natürlich vorkommendes, biokompatibles Material umfaßt und der Antikörper oder das Antikörperfragment in der Matrix eingelagert worden oder kovalent an die Matrix gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Matrixmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fulleren im Bereich von etwa C₆₀ bis etwa C₁₀₀ Polyurethan, segmentiertem Polyurethan-Harnstoff/Heparin, Poly-L-milchsäure, Poly-D,L-milchsäure, Celluloseester, Polyethylenglycol, Collagen, Laminin, Heparin, Fibrin, Elastin, Cellulose und Kohlenstoff besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Oberflächenantigen der Endothelzellen auf einer Humanzelle vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der monoklonale Antikörper mit dem Oberflächenantigen CD34 von Endothelzellen reagiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, wobei der monoklonale Antikörper Fab- oder F(ab')2-Fragmente umfaßt.
Verfahren zum Beschichten einer medizinischen Vorrichtung, damit sich die Vorrichtung nach dem Einführen in ein Gefäß für das Beschichten mit Endothelzellen eignet, das folgendes umfaßt: (a) auf die Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung wird zumindest eine Schicht einer Matrix aufgebracht, die ein synthetisches oder natürlich vorkommendes, biokompatibles Material umfaßt, wobei die Matrix an der Oberfläche haftet, und (b) auf die Matrix, die die medizinische Vorrichtung überzieht, wird eine therapeutisch wirksame Menge von zumindest einer Art eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments aufgebracht, die mit einem Oberflächenantigen von Endothelzellen reagiert, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment in der Matrix eingelagert oder kovalent an die Matrix gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Matrixmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fulleren im Bereich von etwa C₆₀ bis etwa C₁₀₀, Polyurethan, segmentiertem Polyurethan-Harnstoff/Heparin, Poly-L-milchsäure, Poly-D,L-milchsäure, Celluloseester, Polyethylenglycol, Collagen, Laminin, Heparin, Fibrin, Elastin, Cellulose und Kohlenstoff besteht.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Antikörper nicht-kovalent auf die letzte Schicht der Matrix aufgebracht wird, die die medizinische Vorrichtung überzieht.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei der Antikörper über ein Linkermolekül kovalent an die letzte Schicht der Matrix gebunden ist, die die medizinische Vorrichtung überzieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das Fulleren C60O ist.
Stent, der mit der Zusammensetzung nach Anspruch 16 überzogen ist, wobei die Matrix aus einem Fulleren besteht, das als Nanoröhrchen angeordnet ist.