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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Oberflächen fester
Träger
und im Besonderen auf ein Verfahren zum Immobilisieren von Zielmolekülen an die
Oberflächen
fester Träger.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Es
wird eine Vielzahl analytischer Verfahren verwendet, um Interaktionen
zwischen Molekülen
zu charakterisieren, insbesondere im Zusammenhang von Untersuchungen,
die auf die Detektion und Interaktion von Biomolekülen gerichtet
sind. Zum Beispiel sind Antikörper-Antigen-Interaktionen
in vielen Gebieten, einschließlich
Biologie, Immunologie und Pharmakologie, von grundlegender Bedeutung.
In diesem Zusammenhang umfassen viele analytische Verfahren das
Binden eines Liganden, wie z. B. eines Antikörpers, an einen festen Träger, gefolgt
vom In-Kontakt-Bringen des Liganden mit einem Analyten, wie z. B.
einem Antigen. Nach dem In-Kontakt-Bringen des Liganden und des
Analyten werden einige Eigenschaften gemessen, die die Interaktion
anzeigen, wie z. B. die Fähigkeit
des Liganden, den Analyten zu binden. Oft wird gewünscht, dass
es nach der Messung der Interaktion möglich sein sollte, das Ligand-Analyt-Paar
zu dissoziieren, um einen freien Liganden zu regenerieren, und dadurch
ein Wiederverwenden der Oberfläche
des Liganden für
eine weitere analytische Messung zu ermöglichen.
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Die
Bindung, oder Immobilisierung, des Liganden an den Träger kann
entweder direkt oder indirekt erfolgen. Bei der direkten Immobilisierung
wird der Ligand direkt an die Oberfläche gekoppelt, typischerweise
kovalent, wohingegen bei der indirekten Immobilisierung der Ligand
von einem Molekül,
das typischerweise kovalent direkt an die Oberfläche gekoppelt ist, eingefangen
wird (üblicherweise
durch nicht-kovalente Bindung). Obwohl die indirekte Immobilisierung
an Liganden, die eine geeignete Bindungsstelle oder Tag für das oberflächengekoppelte
Molekül
aufweisen, beschränkt
ist, hat sie mehrere Vorteile. Zum Beispiel ist eine nicht-kovalente
Immobilisierung des Liganden einfacher zu bewirken als eine kovalente
Kopplung und der Ligand muss nicht rein zu sein, sondern kann von
einer unverarbeiteten Probe eingefangen werden. Ferner werden alle
Liganden in einer bekannten und konsistenten Ausrichtung an der
Oberfläche
immobilisiert. Normalerweise ist es auch möglich, die Oberfläche des
Liganden durch allgemeine Regenerierungsbedingungen zu regenerieren,
so dass ein wiederholtes Einfangen an der Oberfläche ausgeführt werden kann. Beispielhafte
Einfangmoleküle
umfassen das Protein A und das Protein G, die beide an den Fc-Teil
der Immunoglobuline (Antikörper)
binden, NTA-Metallchelate, die an Histidin-Tags binden, und Oligonukleotide,
die an ein komplementäres
Oligonukleotid-Tag hybridisieren.
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Die
Verwendung von Oligonukleotiden als Einfangmoleküle, die ausführlich in
z. B.
US-A-5,648,213 offenbart
sind, hat den zusätzlichen
Vorteil, dass durch Variieren der Oligonukleotidsequenzen sehr spezifische
Oligonukleotidpaare einfach gebildet werden können. Die Spezifität der Einfangoligonukleotide,
die an die einzelnen Oberflächenbereiche
oder Stellen fester Träger
gebunden sind, kann dann verwendet werden, um verschiedene Liganden
an unterschiedliche Stellen zu steuern. Ein anderer Vorteil liegt
darin, dass im Vergleich zu zum Beispiel einer Proteinoberfläche, die
für Denaturierung
empfänglich
ist, ziemlich raue Bedingungen verwendet werden können, um
die Oligonukleotideinfangoberfläche
zu regenerieren. Ein Problem beim Immobilisieren von Oligonukleotiden
an einen festen Träger
ist jedoch ihre relativ große
negative Ladung, die es erschwert, sie an negativ geladene Oberflächen zu
immobilisieren. Herkömmliche
Herangehensweisen zur Überwindung
dieses Problems, umfassend die Verwendung hoher Salzkonzentrationen
zum Abschirmen der Ladungen oder niedrige pH-Bedingungen schlugen
fehl oder führten
zu geringen Immobilisierungsgraden, wie in den nachstehenden Vergleichsbeispielen
dargestellt wird.
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Im
Bereich der Gentechnik ist bisher die Verwendung von Polykationen
als nonvirale Mittel zum Liefern von DNA an die Zellen bekannt.
Die Polykationen binden effektiv an negativ geladene DNA, was in
einer wesentlichen DNA-Verdichtung resultiert. Wenn der gebildete
Polyelektrolytkomplex eine positive Gesamtladung aufweist, erhöht er ebenfalls
die Interaktion mit einer negativ geladenen Zellmembran. Der gebildete
DNA/Polyelektrolytkomplex interagiert mit der Zelloberfläche und
die DNA wird dann von der Zelle aufgenommen, wahrscheinlich durch
Lysosome oder Endosome.
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Positiv
geladene, neutrale und negativ geladene Liposome sowie positiv geladene
Mizellen wurden auch für
die Lieferung von Nukleinsäuren
an Zellen verwendet, wobei im Falle der Mizelle auf die positive
Ladung der Mizellen vertraut wird, um eine „Kreuzbewegung" zwischen den polyanionen
Nukleinsäuren
und den polyanionen Oberflächen
der Zellen bereitzustellen. Zum Beispiel offenbart
US-A-6,210,717 die Verwendung einer
gemischten polymeren Mizelle, die ein amphiphatisches Polyester-Polykation-Copolymer
und ein amphiphatisches Polyester-Zucker-Copolymer enthält, um eine ausgewählte Nukleinsäure in eine
Wirtszelle zu liefern.
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WO 02/082078 offenbart
die Detektion oder Quantifizierung von Analyten, die an immobilisierte
Einfangmoleküle
gebunden sind durch Affinitätsliposome,
die eingekapselte Enzymaktivatoren und an der Oberfläche angebrachte
Affinitätskomponenten
enthalten, die fähig
sind, spezifisch an Einfanganalyte zu binden. Die Enzymaktivatoren
werden durch Temperatur- oder Detergens-vermittelte Mechanismen
von den Liposomen freigegeben, um Festphasen-immobilisierte inaktive
Enzymmoleküle
zu kontaktieren und zu aktivieren. Bei Vorhandensein von zugefügtem Substrat
erzeugen die aktivierten Enzyme elektrochemisch oder optisch detektierbare
Reportermoleküle,
die gemessen werden.
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WO 02/072873 offenbart
die Herstellung einer Substratoberfläche, die eine Lipiddoppelschichtmembran
trägt,
durch In-Kontakt-Bringen einer Substratoberfläche mit einer wässrigen
Flüssigkeit,
die gemischte Detergens/Lipid-Mizellen enthält, um gemischte Detergens/Lipid-Mizellen
anzuhängen.
Die Substratoberfläche
wird dann mit einer wässrigen
Flüssigkeit
in Kontakt gebracht, die im Wesentlichen frei von Detergens ist, um
die Detergensmoleküle
aus den angehängten
gemischten Mizellen herauszulösen
und die übrigen
Lipidmoleküle
dazu zu bringen, sich in einer Lipiddoppelschichtmembran an der
Substratoberfläche
anzusammeln. Ein Biomolekül,
wie z. B. ein Membranprotein, kann in die Doppelschichtmembran eingeschlossen
werden, indem das Biomolekül
in die gemischte Mizellenherstellung eingeschlossen oder das Biomolekül vor dem
Ablagern der gemischten Mizellenherstellung an der Substratoberfläche angebracht
wird.
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, das Problem des Immobilisierens
von Oligonukleotiden an eine negativ geladene Oberfläche zu überwinden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorstehenden und anderen Ziele und Vorteile werden durch ein neuartiges
Verfahren zum Immobilisieren eines Zielmoleküls an die Oberfläche eines
festen Trägers
bereitgestellt, bei dem das Zielmolekül zuerst mit einer vesikularen
Struktur in Form eines Liposoms oder einer Mizelle komplexiert wird,
woraufhin der Komplex mit dem festen Träger in Kontakt gebracht wird,
um zuzulassen, dass das Zielmolekül an die Oberfläche bindet.
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Die
vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Immobilisieren
eines Zielmoleküls
an die Oberfläche
eines festen Trägers
bereit, die fähig
ist, Zielmoleküle
zu binden, wobei das Zielmolekül
und die Oberfläche
des festen Trägers
elektrische Ladungen derselben Art tragen und das Verfahren die
folgenden Schritte umfasst:
Komplexieren des Zielmoleküls mit einem
Liposom oder einer Mizelle, die fähig sind, einen dissoziierbaren Komplex
mit dem Zielmolekül
zu bilden und eine elektrische Ladung einer Art zu tragen, die der
des Zielmoleküls
entgegengesetzt ist,
In-Kontakt-Bringen des gebildeten Komplexes
mit der Oberfläche
des festen Trägers,
um dadurch das Zielmolekül
an die Oberfläche
zu binden und den Komplex zu dissoziieren, und
Entfernen des
Liposoms oder der Mizelle von der Oberfläche des festen Trägers, um
das Zielmolekül
auf der Oberfläche
immobilisiert zu hinterlassen.
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Ist
der Komplex nicht dissoziiert, wenn das Binden an die Oberfläche des
festen Trägers
erfolgt, kann eine Nachbehandlung oder ein Waschen erforderlich
sein.
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Die
vorstehenden und anderen Aspekte der Erfindung werden mit Bezug
auf die beiliegende Zeichnung und die nachstehende ausführliche
Beschreibung deutlich.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
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1 ist
eine schematische Darstellung eines Mizelle/Oligonukleotid-Komplexes.
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DEFINITIONEN
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In
der Beschreibung und den Ansprüchen
der vorliegenden Erfindung wird die nachstehende Terminologie gemäß den nachstehend
dargestellten Definitionen verwendet.
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„Fester
Träger" bezieht sich auf
ein beliebiges festes (biegsames oder steifes) Substrat, an das
ein oder mehrere Zielverbindungen immobilisiert werden sollen. Das
Substrat kann biologisch, nicht-biologisch, organisch, anorganisch
oder eine Kombination davon sein, und kann in Form von Teilchen,
Strängen,
Ausfällungen,
Gelen, Platten, Rohren, Kugeln, Behältern, Kapillaren, Pads, Scheiben,
Folien, Platten, Gleitstücken
etc. mit einer beliebigen herkömmlichen
Form, einschließlich
Scheibe, Kugel, Kreis etc. vorliegen.
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„Komplex" bezieht sich auf
eine chemische Verbindung von zwei (oder mehr) Arten, die normalerweise durch
schwache elektrostatische Kräfte
verbunden sind. Ein Komplex ist dissoziierbar, wenn er in die zwei
den Komplex bildenden Arten dissoziiert werden kann.
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„Vesikulare
Struktur" bezieht
sich auf eine organisierte Struktur aus amphiphatischen (oberflächenaktiven)
Molekülen
mit sowohl hydrophoben als auch hydrophilen Bereichen und beinhaltet
zum Beispiel Liposome, Mizellen oder inverse Mizellen. Liposome
sind kugelförmige
Vesikel, die von einer Doppelschicht aus Lipiden, üblicherweise
Phospholipiden gebildet sind, die ein wässriges Volumen einschließen, wohingegen
Mizellen und inverse Mizellen kolloidale Anhäufungen aus amphiphatischen
Molekülen
sind, die an (und über) einer
gut-definierten Konzentration auftreten, die als die kritische Mizellenkonzentration
(CMC) bekannt ist. Die typische Anzahl angehäufter Moleküle in einer Mizelle liegt bei
ungefähr
50 bis 100.
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„Funktionale
Gruppe” bezieht
sich auf einen reaktiven chemischen Stoff. Wenn an der Oberfläche eines
festen Trägers
vorhanden, dient die funktionale Gruppe dazu, ein Bindemittel, wie
z. B. ein Einfangmittel oder ein Ligand, an die Oberfläche zu binden.
Normalerweise müssen
funktionale Gruppen aktiviert werden, um ein Bindemittel zu immobilisieren.
Die funktionalen Gruppen können
inhärent
in dem Material vorhanden sein, das als fester Träger verwendet
wird, oder sie können
bereitgestellt werden, indem der Träger mit einem geeigneten die
funktionale Gruppe enthaltenden Material behandelt oder beschichtet
wird. Eine funktionale Gruppe kann auch eingeführt werden, indem die Oberfläche des
festen Trägers
mit einem entsprechenden chemischen Mittel reagiert.
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„Aktivierung" bezieht sich auf
eine Modifikation einer funktionalen Gruppe zu einer reaktiven Gruppe, die
ein Verbinden eines Bindemittels daran ermöglicht oder verbessert.
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„Ligand" bezieht sich auf
ein Molekül,
das eine bekannte oder unbekannte Affinität für einen gegebenen Analyten
aufweist. Der Ligand kann ein natürlich auftretendes Molekül sein oder
eins, das künstlich
hergestellt wurde. Der Ligand kann an sich oder in Anhäufungen
mit anderen Arten verwendet werden. Optional kann der Ligand auch
eine Zelle sein.
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„Analyt" bezieht sich auf
ein Molekül,
das ein Makromolekül,
wie z. B. ein Polypetid oder ein Polynukleotid, oder sogar ein kleines
Molekül
sein kann, dessen Vorhandensein, Menge und/oder Identität zu bestimmen
sind, oder das in anderer Hinsicht, wie z. B. seinen Bindeigenschaften,
zu charakterisieren ist. Der Analyt wird durch einen besonderen
Liganden erkannt, der ein Analyt/Ligand-Paar bildet. Optional kann
der Ligand auch eine Zelle sein. Wie hierin verwendet, beinhaltet
der Begriff Analyt auch Nachbildungen.
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„Einfangmittel" bezieht sich auf
ein Bindemittel, das an die Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert
werden und andere Arten wie z. B. einen Liganden oder ein zweites
Einfangmittel binden kann.
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„Spezifisches
Bindepaar" (abgekürzt „sbp") bezieht sich auf
ein Paar aus Molekülen (jedes
ist ein Element eines spezifischen Bindepaares), die natürlich abgeleitet
oder künstlich
hergestellt sind. Eins der Molekülpaare
weist eine Struktur (wie z. B. eine Fläche oder einen Hohlraum) an
seiner Oberfläche
auf, die spezifisch an (und ist daher definiert als komplementär zu) eine(r)
besondere(n) Struktur (wie z. B. eine räumliche und polare Organisation)
des anderen Moleküls
bindet, so dass das Paar die Eigenschaft aufweist, spezifisch aneinander
zu binden. Beispiele für
Arten spezifischer Bindepaare sind Protein-Protein, Antigen-Antikörper, Antikörper-Hapten,
Biotin-Avidin, Ligand-Rezeptor (z. B. Hormon-Rezeptor, Peptid-Rezeptor,
Enzym-Rezeptor),
Carbohydrat-Protein, Carbohydrat-Lipid, Lektin-Carbohydrat, Nukleinsäure-Nukleinsäure (einschließlich z.
B. PNA-PNA; PNA = Peptidnukleinsäure),
Histidinrest(e)-Metallchelat.
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„Antikörper" bezieht sich auf
ein Immunoglobulin, das natürlich
oder teilweise oder vollständig
künstlich
hergestellt sein kann und ebenfalls aktive Fragmente umfasst, einschließlich Fab-Antigen-bindende
Fragmente, univalente Fragmente und bivalente Fragmente. Der Begriff
deckt ebenfalls alle Proteine ab, die einen Bindebereich aufweisen,
der homolog zu einem Immunoglobulinbereich ist. Solche Proteine
können
von natürlichen
Quellen abgleitet oder teilweise oder vollständig künstlich hergestellt sein. Beispielhafte
Antikörper sind
die Immunoglobulinisotypen und die Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv,
dAb, und Fd Fragmente.
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„Nukleinsäure" bezieht sich auf
ein Deoxyribonukleotidpolymer (DNA) oder Ribonukleotidpolymer (RNA)
in entweder Einzel- oder Doppelstrangform, und umfasst ebenfalls
künstlich
hergestellte Nachbildungen, die in ähnlicher Weise wie die natürlich vorkommenden
Nukleotidsäuren
wirken. Während
natürliche
Nukleinsäuren
eine Phosphathauptkette aufweisen, können künstliche Nukleinsäuren andere
Arten von Hauptketten, Nukleotiden oder Basen enthalten. Diese beinhalten
zum Beispiel Peptidnukleinsäuren
(PNAs) wie z. B. in
US-A-5,948,902 und
den darin zitierten Referenzen beschrieben; Pyranosylnukleinsäuren (p-NAs)
wie z. B. in
WO 99/15540 (p-RNAs),
WO 99/15539 (p-RNAs), und
WO 00/11011 (p-DNAs) beschrieben;
gesperrte Nukleinsäuren
(LNAs) wie z. B. in
US-A-6,316,198 beschrieben;
und Phosphothionate und andere Varianten der Phosphathauptkette
natürlicher
Nukleinsäuren.
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„Oligonukleotid” bezieht
sich auf Einzelstrangnukleotidmultimere von etwa 5 bis ungefähr 100 Nukleotiden
(einschließlich
künstlich
hergestellter Nachbildungen, wie vorstehend bei „Nukleinsäure" beschrieben).
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„Polynukleotid" bezieht sich auf
Einzelstrangnukleotidmultimere von ungefähr 100 Nukleotiden (einschließlich künstlich
hergestellter Nachbildungen, wie vorstehend bei „Nukleinsäure" beschrieben).
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„Organische
Verbindung eines niedrigen Molekulargewichts" bezieht sich auf eine organische Verbindung
eines niedrigen Molekulargewichts in dem Bereich von ungefähr 100 bis
ungefähr
1000, normalerweise von ungefähr
250 bis ungefähr
800. Verbindungen eines niedrigen Molekulargewichts werden manchmal
auch als kleine Moleküle
bezeichnet.
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„Feld" bezieht sich im
Allgemeinen auf ein lineares oder zweidimensionales Feld aus separaten
Bereichen, wobei jeder einen endlichen Bereich aufweist, der an
einer kontinuierlichen Oberfläche
eines festen Trägers
gebildet ist und einen oder mehrere Bindemittel, wie z. B. Einfangmittel
oder Liganden, unterstützt.
Geordnete Felder aus Nukleinsäuren,
Proteinen, kleinen Molekülen,
Zellen oder anderen Substanzen an einem festen Träger ermöglichen
die parallele Analyse komplexer biochemischer Proben. In einem Mikrofeld
beträgt die
Dichte der einzelnen Bereiche oder Stellen typischerweise mindestens
100/cm2 und die separaten Bereiche weisen
einen Durchmesser im Bereich von ungefähr 10–1000 μm, normalerweise ungefähr 10–500 μm auf und
sind von anderen Bereichen in dem Feld um ungefähr denselben Abstand getrennt.
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„Biosensor" bezieht sich normalerweise
auf ein Gerät,
das eine Komponente für
die Molekularerkennung (zum Beispiel eine Schicht mit immobilisierten
Antikörpern)
in Verbindung mit einem physiochemischen Festwandler verwendet.
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In
der Beschreibung und den angefügten
Ansprüchen
schließen
die Einzahlformen „ein", „eine" und „der" die Pluralformen
mit ein, es sei denn, es ist was anderes angegeben. Wenn nicht anders
angegeben, haben die hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen
Begriffe dieselbe Bedeutung, wie einem Fachmann aus dem mit der
Erfindung verwandten Gebiet allgemein bekannt.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Wie
vorstehend erwähnt,
bezieht sich die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf die Immobilisierung
eines Zielmoleküls
an die Oberfläche
eines festen Trägers.
Feste Träger
mit immobilisierten Zielmolekülen
werden in verschiedenen Gebieten verwendet, einschließlich Analyse-
und Trennverfahren. Die Immobilisierung eines Zielmoleküls an einen
festen Träger
umfasst oft das Binden, wie z. B. kovalentes Binden, des Moleküls an die
Oberfläche
des festen Trägers.
Normalerweise weist der feste Träger
eine reaktive chemische Gruppe auf, die mit dem Zielmolekül reagieren
kann. Manchmal trägt
das Zielmolekül
eine elektrische Ladung und wenn die Oberfläche des festen Trägers eine
entgegengesetzte Ladung trägt,
wird das Zielmolekül
an die Oberfläche
des festen Trägers
angezogen, was die molekulare Interaktion mit der Oberfläche erleichtert.
Andererseits wird, wenn die Oberfläche des festen Trägers dieselbe
Art Ladung trägt
wie das Zielmolekül,
deutlich, dass die Immobilisierung verringert oder sogar wesentlich
verhindert werden kann. Ein Beispiel für den letzteren Fall ist die
Immobilisierung von Oligonukleotiden (die im Allgemeinen eine negative
Ladung tragen) an negativ geladene Oberflächen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurde jetzt herausgefunden, dass ein geladenes Zielmolekül, insbesondere
ein Makromolekül,
wie z. B. ein Oligonukleotid, effizient an die Oberfläche eines
festen Trägers
immobilisiert werden kann, selbst dann, wenn die Oberfläche dieselbe
Ladung trägt
wie das Zielmolekül,
wenn das Zielmolekül
zuerst mit einer vesikularen Struktur komplexiert wird, die eine
Ladung trägt,
die der des Zielmoleküls
entgegengesetzt ist, und der Komplex wird anschließend mit
der Oberfläche
des festen Trägers
in Kontakt gebracht.
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Ohne
auf eine spezielle Theorie begrenzt zu sein, wird angenommen, dass
die verbesserte Immobilisierungseffizienz auf dem Zielmolekül/vesikulare
Struktur-Komplex
beruht, welcher dem Zielmolekül
erlaubt, nah genug an die Oberfläche
zu gelangen, um mit ihr zu interagieren. Das wiederum beruht vermutlich
einerseits auf z. B. der positiv geladenen vesikularen Struktur,
die die entgegengesetzte z. B. negative Ladung des Zielmoleküls mindestens
teilweise neutralisiert, und andererseits z. B. im Falle eines Makromoleküls wie einem Oligonukleotid,
auf dem Kompaktieren des Makromoleküls durch die vesikulare Struktur.
Das Kompaktieren kann auch in einer schnelleren Diffusion des Moleküls an die
Oberfläche
resultieren, im Vergleich zu der Diffusion des freien Moleküls. Im Hinblick
auf die angenommene bevorzugte Kompaktierung eines Zielmoleküls kann
die Bildung des Zielmolekül/vesikulare
Struktur-Komplexes auch die Immobilisierung davon an die neutrale
Oberfläche
eines festen Trägers
verbessern. Das Verringern von Repulsionskräften zwischen den zu immobilisierenden
Molekülen
kann auch zu höheren
Immobilisierungsdichten führen.
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Das
vorliegende Erfindungskonzept ist allgemein auf ein beliebiges Zielmolekül anwendbar,
das einen dissoziierbaren Komplex mit einer geladenen oder ungeladenen
vesikularen Struktur bilden kann. Das Zielmolekül ist jedoch vorzugsweise ein
Biomolekül
(einschließlich
künstlich
hergestellter Biomoleküle
und Nachbildungen davon), wie z. B. Nukleinsäuren (einschließlich z.
B. Plasmide), Proteine, Polypetide, Lipide und Carbohydrate. Weitere
spezifische Beispiele für
Biomoleküle
sind Oligonukleotide, Polynukleotide, Antikörper und Enzyme. Das Zielmolekül kann auch
eine organische Verbindung eines niedrigen Molekulargewichts sein.
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Die
vesikulare Struktur ist ein Liposom oder eine Mizelle, speziell
eine Mizelle. Liposome oder Mizellen können gemischte Liposome oder
gemischte Mizellen sein, d. h. zwei (oder mehr) Liposome- bzw. Mizellen-bildende
Komponenten enthalten. [0038] In einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird eine Nukleinsäure,
insbesondere ein Nukleotid, unter Verwendung einer positiv geladenen
Mizelle oder eines Liposoms an eine negativ geladene Oberfläche eines
festen Trägers
immobilisiert. Eine schematische Darstellung eines Komplexes zwischen
einem Oligonukleotid (20-mer) und einer positiv geladenen Mizelle
(CTAB) ist in 1 dargestellt.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird ein Protein, insbesondere ein Antikörper, der eine
negative Ladung trägt,
unter Verwendung einer positiv geladenen Mizelle oder eines Liposoms
an eine negativ geladene Oberfläche
eines festen Trägers
immobilisiert.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird eine organische Verbindung eines niedrigen Molekulargewichts,
wie z. B. Adenosintriphosphat (ATP) oder Nitrilotriaceticsäure (NTA),
die eine negative Ladung trägt,
mitilfe einer positiv geladenen Mizelle oder eines positiv geladenen
Liposoms an eine negativ geladene Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
wird ein positiv geladenes Zielmolekül unter Verwendung einer negativ
geladenen Mizelle oder eines negativ geladenen Liposoms an eine
positiv geladene Oberfläche eines
festen Trägers
immobilisiert. [0042] Die relativen Mengen der Zielmoleküle und zu
verwendenden Mizellen oder Liposome hängt unter anderem von dem speziellen
Zielmolekül
und den Mizellen bzw. Liposomen ab, aber geeignete Verhältnisse
können
von einem Fachmann leicht ermittelt werden. Im Allgemeinen können Verhältnisse
von Zielmolekül
zu Mizelle bzw. Liposom (Anzahl der Zielmoleküle zu Anzahl der Mizellen)
von ungefähr
1:3 bis ungefähr
3:1, vorzugsweise von ungefähr
1:2 bis ungefähr
2:1, speziell ungefähr
1:1 verwendet werden.
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Die
Herstellung der Mizellen und Liposome ist Fachleuten gut bekannt
und muss hier nicht ausführlich beschrieben
werden. Für
allgemeine Beschreibungen der Verfahren dafür kann zum Beispiel Bezug genommen
werden auf Szoka, F., Jr., und Papahadjopoulos, D., Annu. Rev. Biophys.
Bioeng. 9, 457 (1980); und Schwendener, R. A., Ansanger, M., und
Weder, H. G., Biochem. Biophys. Res. Commun., 100, 1055 (1981).
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Beispiele
für amphiphatische
Moleküle
oder oberflächenaktive
Stoffe, aus denen positiv geladene Mizellen hergestellt werden können, umfassen
Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB), Cetyltrimethylammoniumbromid
(CTAB) (anderer Name: Hexadecyltrimethylammoniumbromid), Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid,
Dimethyldioctadecylammoniumbromid, Dodecylethyldimethylammoniumbromid,
Ethylhexadecyldimethylammoniumbromid, Trimethyl(tetradecyl)ammoniumbromid
und Thonzoniumbromid.
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Negativ
geladene Mizellen können
zum Beispiel aus Natriumdodecylsulfat (SDS) hergestellt werden.
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Beispiele
für Moleküle, aus
denen positiv oder negativ geladene Liposome hergestellt werden
können, beinhalten
Hexadecyldimethylammoniumpropan-1-sulfonat.
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Normalerweise
wird bevorzugt, dass lediglich ein Teil der elektrischen Ladung
der Mizelle oder des Liposoms durch das Zielmolekül neutralisiert
wird, so dass nach der Bildung des Komplexes eine Restladung übrig bleibt,
um dem Komplex zu erlauben, mit einer entgegengesetzt geladenen
Oberfläche
eines festen Trägers
elektrostatisch zu interagieren.
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Der
Komplex zwischen dem Zielmolekül
und der vesikularen Struktur wird normalerweise spontan gebildet.
Wenn der Komplex anschließend
mit dem festen Träger
in Kontakt gebracht wird, interagiert das Zielmolekül mit der
reaktiven funktionalen Gruppe oder einer anderen Bindungshälfte an
der Oberfläche,
so dass das Zielmolekül
daran immobilisiert wird. Das kann eine gleichzeitige Dissoziierung
des Komplexes bewirken. Normalerweise wird jedoch eine Behandlung
oder eine Waschung mit einer geeigneten Lösung erforderlich sein, um
den Komplex zu dissoziieren und die vesikulare Struktur oder die
Reste davon von der Oberfläche
zu entfernen. Die dafür
notwendigen Lösungen/Bedingungen
sind Fachleuten entweder gut bekannt oder können von ihnen leicht ermittelt
werden.
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Der
feste Träger
ist vorzugsweise eine steife Struktur und kann ein Substrat mit
einer Oberflächenschicht
aus einem anderen Material umfassen. Während der feste Träger ein
Teilchen sein kann, ist es normalerweise eine Oberfläche einer
größeren Einheit,
wie z. B. eine Innenfläche
eines Brunnens oder Behälters oder
einer Platte oder eines Gleitstücks.
Beispielhaft für
die letztere Art sind feste Träger,
die für
Protein- oder DNA/RNA-Chips verwendet werden, sowie Messoberflächen in
Sensorgeräten,
wie z. B. Biosensoren.
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Die
Oberfläche
des festen Trägers
kann aus einer Vielzahl Materialien bestehen, zum Beispiel Polymeren,
Kunststoffen, Harzen, Polysacchariden, Silika oder silikatischen
Materialien, Karbon, Metallen, anorganischen Gläsern, Membranen etc. Eine geeignete
Oberfläche
ist ein Metallfilm, z. B. Gold, Silber oder Aluminium, vorzugsweise
Gold.
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Um
die Immobilisierung von Zielmolekülen zu erlauben, umfasst die
Oberfläche
des festen Trägers Gruppen
oder Moleküle,
die fähig
sind, mit dem Zielmolekül
zu interagieren. Solche Gruppen können funktionale Gruppen sein,
z. B. Hydroxy, Carboxy, Amino, Formyl, Hydrazid, Carbonyl, Expoxy
oder Vinyl, die eine kovalente Bindung mit einer funktionalen Gruppe
an dem Zielmolekül
bilden können.
Normalerweise wird (werden) die funktionale(n) Gruppe(n) vor der
Reaktion mit dem Zielmolekül
an der Oberfläche
oder an dem Zielmolekül
zu einer reaktiveren Gruppe(n) aktiviert. Zum Beispiel kann ein
Aminonukleotid an eine oberflächengebundene
Carboxygruppe gekoppelt werden, die zu einer N-Hydroxysuccinimidestergruppe aktiviert
ist. Es ist zu beachten, dass eine Oberfläche mit einer aktivierten funktionalen
Gruppe, die z. B. vor der Aktivierung negativ, aber nach der Aktivierung
neutral geladen ist, während
des Immobilisierungsvorgangs aufgrund der Ausführung einer Hydrolyse der aktivierten
Gruppe eine negative Ladung entwickeln kann.
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Alternativ
trägt die
Oberfläche
des festen Trägers
ein Element eines spezifischen Bindepaares (sbp) und das andere
Element des spezifischen Bindepaares befindet sich an dem Zielmolekül. Ein allgemein
verwendetes sbp zum Immobilisieren von Oligonukleotiden ist Biotin-Avidin
(oder Streptavidin).
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Besonders
im Zusammenhang mit Biosensoren kann die Oberfläche des festen Trägers ein
Teil einer Fließzelle
sein, und erlauben, dass die Verfahren der Erfindung vor Ort in
der Fließzelle
durchgeführt
werden. Beispiele für
Fließzellen,
die auf dem Gebiet der Biosensoren verwendet werden, sind z. B.
in
US-A-5,492,840 ,
5,513,264 und
WO 99/36766 beschrieben.
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Wie
vorstehend erwähnt,
kann das Zielmolekül
zum Beispiel ein Analyt-bindender Ligand sein oder ein Einfangmittel,
das fähig
ist, einen Liganden zu binden. Alternativ kann das Einfangmittel
ein Bindemittel binden, das wiederum einen Liganden binden kann.
Ein einzelnes Einfangmittel kann verwendet werden, um einen einzelnen
Liganden an die Oberfläche
zu binden, oder verschiedene Liganden an unterschiedliche einzelne
Bereiche der Oberfläche
zu binden, um ein Ligandenfeld bereitzustellen. Alternativ kann
ein Ligandenfeld gebildet werden, indem unterschiedliche Liganden
selektiv an spezifische Einfangelemente gebunden werden, die an
den entsprechenden einzelnen Oberflächenbereichen bereitgestellt
sind. Das Binden eines Liganden an die Oberfläche eines festen Trägers, wie
z. B. eine Sensoroberfläche,
wird oft als „Sensibilisieren" der Oberfläche bezeichnet.
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Beispiele
für Liganden
umfassen, ohne Begrenzung darauf, Agonisten und Antiagonisten für Zellmembranen,
Toxine und Venome, virale Epitope, Antigendeterminaten, Hormone
und Hormonrezeptoren, Steroide, Peptide, Enzyme, Substrate, Kofaktoren,
Arzneistoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Oligosaccharide,
Proteine, Glykoproteine, Zellen, Zellmembranen, Organellen, Zellrezeptoren,
Vitamine, virale Epitope und Immunoglobuline, z. B. monoklonale
und polyklonale Antikörper.
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Beispielhafte
Einfangmittel beinhalten Nukleinsäuren und Antikörper, speziell
Oligonukleotide. Eine Oberfläche
mit einem Einfangmittel in Form eines Oligonukleotids kann zum Beispiel
verwendet werden, um einen Liganden zu binden, der mit einem komplementären Oligonukleotid-Tag
gepaart ist. Auf diese Weise können
verschiedene Liganden leicht an verschiedene einzelne Bereiche der
Oberfläche
immobilisiert werden. Wie vorstehend erwähnt, ist es ebenfalls möglich, verschiedene
Oligonukleotide an unterschiedliche einzelne Bereiche zu immobilisieren,
um z. B. verschiedenartig Oligonukleotid-getaggte Liganden daran
einzufangen. Das wird verschiedenen Ligandenpaaren erlauben, unterschiedliche
Bereiche anzusteuern, aber die Einfangoberfläche kann weiterhin durch allgemeine
Regenerierungsbedingungen regeneriert werden.
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Normalerweise
weisen die Oligonukleotide eine Länge von mindestens sechs Basen
auf. Es wird ferner bevorzugt, dass die Oligonukleotidpaare über mindestens
einen Abschnitt ihrer jeweiligen Sequenzen vollständig komplementär sind.
Vollständig
komplementäre
Sequenzen werden jedoch bevorzugt.
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Hierfür sind bifunktionale
Mittel, die verwendet werden können,
um Ligand/Oligonukleotid-Paare herzustellen, wie z. B. Antikörper/Oligonukleotid-Paare,
Fachleuten gut bekannt und können
von ihnen leicht ausgewählt
werden. Für
Beispiele solcher heterobifunktionalen Mittel kann zum Beispiel
auf das vorstehend erwähnte
US-A-5,648,213 Bezug
genommen werden.
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Beispiele
für Analyte,
die als Probe genommen werden können,
umfassen, ohne Begrenzung darauf, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren,
Toxine und Venome, virale Epitope, Hormone (z. B. Opiate, Steroide
etc.), Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, Kofaktoren,
Arzneistoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Oligosaccharide,
Proteine und monoklonale Antikörper.
Die Untersuchung eines Analyten ist nicht auf die qualitative oder
quantitative Bestimmung des Analyten begrenzt, sondern beinhaltet zum
Beispiel auch das Untersuchen seiner Interaktion mit einem Liganden
für die
weitere Charakterisierung des Analyten, wie dem Bestimmen der Bindeeigenschaften,
z. B. die Affinität
und kinetische Konstanten.
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Verfahren
zum Detektieren des Vorhandenseins von gebundenem(n) Analyt(en)
an der Oberfläche können aus
einer großen
Vielzahl von Detektionsverfahren ausgewählt werden, einschließlich sowohl
photometrischer und nicht-photometrischer
Detektionsverfahren, zum Beispiel Markierungs-basierter Verfahren,
bei denen der (die) Analyt(e) oder ein analytspezifisches Reagens,
z. B. mit einem Radiolabel, einem Chromophor, einem Fluorphor, einer
Chemilumineszenzhälfte
oder einem Übergangsmetall
markiert ist (sind), sowie labelfreien Verfahren.
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Bei
vielen Anwendungen werden die Untersuchungen mit einem Biosensor
durchgeführt.
Biosensoren können
auf einer Vielzahl von Detektionsverfahren basieren. Typischerweise
beinhalten solche Verfahren, sind aber nicht begrenzt auf, Massendetektionsverfahren,
wie z. B. piezoelektrische, optische, thermooptische und Oberflächenwellengerät(SAW)-Verfahren
und elektrochemische Verfahren, wie z. B. potentiometrische, konduktometrische,
amperometrische und kapazitive Verfahren. Im Hinblick auf optische
Detektionsverfahren beinhalten repräsentative Verfahren jene, welche
die Oberflächenmassenkonzentration
detektieren, wie z. B. Reflexionsoptikverfahren, einschließlich sowohl
Innen- als auch Außenreflexionsverfahren,
die winkel-, wellenlängen-
oder phasenaufgelöst
sind, zum Beispiel Ellipsometrie und Evaneszenzwellenspektroskopie
(EWS), wobei die letztere Oberflächenplasmonresonanz
(SPR) Spektroskopie, Brewsterwinkelrefraktometrie, Grenzwinkelrefraktometrie,
verhinderte Totalreflexion (FTR), Evaneszenzwellenellipsometrie,
gestreute Totalinnenreflexion (STIR), optische Wellenleitersensoren,
evaneszenzwellenbasierte Bildgebung beinhaltet, wie z. B. grenzwinkelaufgelöste Bildgebung,
brewsterwinkelaufgelöste
Bildgebung, SPR-winkelaufgelöste Bildgebung
und Ähnliches
umfasst. Ferner können
photometrische Verfahren, die zum Beispiel auf Evaneszenzfluoreszenz
(TIRF) und Phosphoreszenz basieren, ebenfalls verwendet werden sowie
Wellenleiterinterfometer. Auch Atomkraftmikroskopie(AFR)-basierte
Detektionsverfahren sind zu erwähnen.
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In
den nachstehenden Beispielen wurde ein Biosensorinstrument verwendet,
das auf Oberflächenplasmonresonanz(SPR)-Detektion
an einer Goldoberfläche
basiert, und durch Massenmessen an der Oberfläche eine Echtzeitbindeinteraktionsanalyse
zwischen einem oberflächengebundenen
Liganden und einem interessierenden Analyten ermöglicht. Eine ausführliche
Erläuterung
der technischen Aspekte dieser Art Biosensor sowie des Phänomens der
SPR ist in dem vorstehend erwähnten
US-A-5,313,264 zu finden. Ausführlichere
Informationen über
Feldbeschichtungen für
Biosensoroberflächen
sind zum Beispiel in
US-A-5,242,828 und
US-A-5,436,161 zu
finden. Darüber
hinaus ist eine ausführliche
Erläuterung
der technischen Aspekte der in dem Biosensorinstrument verwendeten
Biosensorchips, in dem vorstehend erwähnten
US-A-5,492,840 zu finden.
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In
den nachstehenden Beispielen werden verschiedene Aspekte der vorliegenden
Erfindung speziell zum Zweck der Darstellung und nicht zur Begrenzung
dargestellt.
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BEISPIELE
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Es
wurde ein BIACORE® 3000-Instrument (Biacore
AB, Uppsala, Schweden) verwendet. Bei diesem Instrument übermittelt
ein Mikrofluidsystem Proben und Laufpuffer mit sehr hoher Präzision und
geringem erforderlichen Probenvolumen durch vier einzeln detektierte
Fließzellen
(eine nach der anderen oder reihenweise). Als Sensorchip wurde der
Sensorchip CM5 (Biacore AB, Uppsala, Schweden) verwendet, der eine
Goldoberfläche
mit einem kovalent verbundenen Carboxymethyl-modifizierten Dextranpolymerhydrogel
aufweist. Der Laufpuffer war HBS-N (10 mM HEPES pH 7,4 und 150 mM
NaCl) (Biacore AB, Uppsala, Schweden). Aufgrund der Carboxylgruppen
hat das Hydrogel einen anionischen Charakter. Die Ausgabe aus dem
Instrument ist ein Sensorgramm, das eine Abbildung der Detektorantwort
(gemessen in Resonanzeinheit RU) als eine Funktion der Zeit darstellt.
Ein Anstieg von 1000 RU entspricht einem Anstieg der Masse an der
Sensoroberfläche
von ungefähr
1 ng/mm2.
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Die
folgenden zwei (komplementären)
Oligonukleotide wurden verwendet (an dem 5'-Ende
mit einer Aminogruppe chemisch modifiziert):
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Die
Nukleotidsequenz BC1 ist in Persson, B., et al. (1997) Anal. Biochem.
246,34,44 offenbart.
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Vergleichsbeispiel 1
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Immobilisierung von aminomodifiziertem
Oligonukleotid BC1 bei hohen Salzkonzentrationen
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Der
Sensorchip CM5 wurde aktiviert durch 0,2M N-Ethyl-N-Dimethylamino-Propylcarbodiimid
(EDC) und 50 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) für 7 oder 20 Minuten bei einem
Fluss von 5 μl/min
(EDC und NHS waren von Biacore AB, Uppsala, Schweden), und konvertierte
einen Teil der Carboxylgruppen an dem Dextran zu reaktiven N-Hydroxysuccinimidestergruppen.
Anschließend
wurden 100 μM
aminmodifiziertes Oligonukleotid BC1 (SGS DNA, Köping, Schweden oder DNA-Technologie,
Alborg, Dänemark)
in Borat 8,5 Immobilisierungspuffer (Biacore AB, Uppsala, Schweden)
für 13
Minuten in 5 μl/min
injiziert, um es an die Oberfläche
zu immobilisieren. Unreagierte N-Hydroxysuccinimidestergruppen wurden
deaktiviert, indem Ethanolamin für
3 Minuten bei 5 μl/min
injiziert wurde (Ersetzen der aktivierten Gruppe durch Hydroxyethylamid).
Der Immobilisierungsvorgang wurde bei hohen NaCl-Konzentrationen
durchgeführt,
die von 1 bis 3 variierten, um die negative Ladung des Oligonukleotids
abzuschirmen, und bei ziemlich hohen pH-Werten zwischen 7,0 und
8,5, um ein schnelles Binden an die Oberfläche zu erhalten.
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Im
Anschluss an jede Immobilisierung wurde die Oberfläche mit
drei Impulsen von 50 mM NaOH, 1 NaCl für 1 min (Fluss 5 μl/min) gewaschen,
um das locker gebundene Oligonukleotid zu entfernen. Das komplementäre aminomodifizierte Oligonukleotid
BC2 sowie ein nicht-komplementäres
Oligonukleotid (BC1) durften dann für 3 Minuten bei einem Fluss
von 5 μl/min
mit HBS-EP-Puffer (Biacore AB, Uppsala, Schweden) an das immobilisierte
Aminonukleotid BC1 hybridisieren. Die Oligonukleotidkonzentrationen
varierten zwischen 1 und 10 μM.
Die Regeneration der Oberfläche
zwischen den Hybridisierungen wurde mit 50 mM NaOH, 1M NaCl für 1 Minute
durchgeführt.
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Die
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
| pH | NaCl-Konz.
(M) | NHS/EDC-Aktivierungszeit (min) | Immobilisierung (RU) | Hybridisierung von
komplementärem
Oligo (RU) | Hybridisierung von
nicht-komplementärem Oligo
(RU) |
| 7,0 | 1 | 7 | –26 | 9,7 | 4,8 |
| 7,0 | 3 | 7 | –5,4 | 1,9 | 7,5 |
| 8,5 | 1 | 7 | 16,5 | 8,6 | 6,9 |
| 8,5 | 3 | 7 | 40,8 | 10,1 | 6,8 |
| 7,0 | 1 | 20 | 74,2 | 11,6 | 10,1 |
| 7,0 | 3 | 20 | –28,9 | 3,2 | 8,4 |
| 8,5 | 1 | 20 | –7,8 | 3,7 | 7,3 |
| 8,5 | 3 | 20 | 15,0 | 4,4 | - |
-
Wie
aus der Tabelle ersichtlich wird, war die hohe Salzkonzentration
nicht effektiv, um die Immobilisierung von dem Aminooligonukleotid
an die Oberfläche
zu erhöhen.
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Die
Immobilisierung wurde auch nicht durch Verändern des pH-Wertes oder Erhöhen der NHS/EDC-Aktivierungszeit
beeinflusst.
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Vergleichsbeispiel 2
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Immobilisierung von aminomodifiziertem
Oligonukleotid BC1 bei Vorhandensein von Tetramethylammoniumchlorid
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Demselben
Immobilisierungsprotokoll wie in Beispiel 1 folgend, wurde das Oligonukleotid
BC1 an die Oberfläche
eines CM5 Chips immobilisiert, mit der Ausnahme, dass HBS-EP (Biacore
AB, Uppsala, Schweden) als Immobilisierungspuffer verwendet wurde,
und 1M, 0,75M, 0,5M oder 0,25M Tetramethylammoniumchlorid (TMA-Cl)
anstelle von NaCl verwendet wurde, um die negativen Ladungen des
Oligonukleotids abzuschirmen. Nach dem Waschen mit 50 mM NaOH, 1M
NaCl wurden Hybridisierungen mit komplementären und nicht-komplementären Oligonukleotiden
wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
| TMA-Cl-Konz.
(M) | Immobilisierung
(RU) | Hybridisierung
von komplementärem
Oligo (RU) | Hybridisierung
von nicht-komplementärem
Oligo (RU) |
| 0,25 | –0,9 | 6,7 | 4,5 |
| 0,50 | –4,1 | 3,8 | 4,9 |
| 0,75 | –1,7 | 3,5 | 4,8 |
| 1,00 | 3,5 | 3,3 | 4,3 |
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Wie
aus der Tabelle ersichtlich wird, hatte TMA-Cl keine Auswirkung
auf die Immobilisierung des Oligonukleotids an die Oberfläche.
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Beispiel 3
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Immobilisierung von aminomodifiziertem
Oligonukleotid BC1 durch Komplexieren mit Cetyltrimethylammoniumbromidmizellen
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Der
Sensorchip CM5 wurde aktiviert, wie oben im Beispiel 1 beschrieben.
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Anschließend wurden
10–50 μM aminmodifiziertes
Oligonukleotid BC1 (SGS DNA, Köping,
Schweden oder DNA-Technologie, Alborg, Dänemark) in 10 mM Hepes pH 7,4
(Biacore AB, Uppsala, Schweden) bei variierenden Konzentrationen
an Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) für 10 min bei 5 μl/min injiziert,
um es an die Oberfläche
zu immobilisieren. Unreagierte N-Hydroxysuccinimidestergruppen wurden
deaktiviert, indem Ethanolamin für
3 Minuten bei 5 μl/min
injiziert wurde. Nach dem Waschen mit 50 mM NaOH, 1M NaCl wurden
Hybridisierungen mit komplementären
und nicht-komplementären
Oligonukleotiden durchgeführt,
wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind nachstehend in
Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
| CTAB-Konz. (mM) | Amino-Oligo-Konz. (μM) | Immobilisierung
(RU) | Verlust
beim Waschen (RU) | Hybridisierung von
komplementärem
Oligo (RU) | Hybridisierung von
nicht-komplementärem Oligo |
| 0,40 | 10 | 3170 | –690 | 2181 | –0,6 |
| 0,60 | 10 | 3440 | –649 | 2701 | 2,0 |
| 0,80 | 10 | 3322 | –612 | 2390 | 1,8 |
| 1,00 | 10 | 2763 | –527 | 1877 | 0,8 |
| 0,75 | 25 | 3075 | –423 | 1569 | –1,3 |
| 1,50 | 25 | 3175 | –474 | 2375 | 2,1 |
| 2,25 | 25 | 3170 | –500 | 2317 | 2,3 |
| 3,00 | 25 | 3046 | –511 | 2258 | 2,2 |
| 2,25 | 50 | 3121 | –511 | 2388 | –1,5 |
| 3,00 | 50 | 3147 | –471 | 2349 | 1,4 |
| 3,75 | 50 | 3103 | –442 | 2312 | 2,5 |
| 4,50 | 50 | 2863 | –446 | 2242 | 2,8 |
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Wie
aus der Tabelle ersichtlich wird, wurden hohe Immobilisierungs-
und Hybridisierungsniveaus erreicht. Die am besten geeignete CTAB-Konzentration
weicht deutlich von der Konzentration des Oligonukleotids BC1 ab.
Die kritische Mizellenkonzentration (CMC) für CTAB in dem verwendeten Immobilisierungspuffer liegt
wahrscheinlich bei ungefähr
0,29 mM. Da eine Durchschnittsmizelle von CTAB 61 Moleküle enthält, zeigt die
Tabelle ein optimales Mizellen:Oligo-Verhältnis von ungefähr 1:1 an
(0,60 mM CTAB/10 μM
BC1; 1,50 mM CTAB/25 μM
BC1; bzw. 3,00 mM CTAB/50 μM
BC1).
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Beispiel 4
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Immobilisierung von aminomodifiziertem
Oligonukleotid BC1 durch Komplexieren mit Dodecyltrimethylammoniumbromidmizellen
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Es
wurde dem in Beispiel 3 beschriebenen Vorgang gefolgt, mit der Ausnahme,
dass Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) durch Dodecyltrimethylammoniumbromid
(DTAB) ersetzt wurde. Es wurde keine Hybridisierung mit nicht-komplementärem Oligonukleotid
durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
| DTAB-Konz.
(mM) | Amino-Oligo-Konz. (μM) | Immobilisierung
(RU) | Verlust
beim Waschen (RU) | Hybridisierung
von komplementärem
Oligo (RU) |
| 0 | 10 | 10,5 | –116,6 | 15 |
| 5 | 10 | 3054,5 | –625,8 | 1970,7 |
| 10 | 10 | 3372,7 | –680,4 | 2054,1 |
| 15 | 10 | 3519,7 | –625,4 | 2276,5 |