DE602004013350T2

DE602004013350T2 - Elastinpeptid-fingerabdrücke und analyseverfahren für mit copd in verbindung stehendes mmp12

Info

Publication number: DE602004013350T2
Application number: DE602004013350T
Authority: DE
Inventors: Per Broberg; Thomas Fehniger; György MARKO-VARGA; Stephan Max Planck Inst. of Biochemi UEBEL
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2003-09-25
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2024-09-25
Also published as: ATE393395T1; WO2005029090A1; EP1668372A1; US8012692B2; EP1668372B1; ES2303954T3; US20060292631A1; DE602004013350D1; SE0302559D0

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Protein- oder Peptidfingerabdrücken sowie Protein- oder Peptidbiomarker. Diese Verfahren und Biomarker können bei der Identifizierung, Bewertung, Untersuchung oder Beobachtung von Leiden oder Krankheiten, beispielsweise als Hilfe bei der Entdeckung, Entwicklung oder Verwendung von Arzneistoffen zur Behandlung solcher Leiden oder Krankheiten verwendet werden.
STAND DER TECHNIK
Verschiedene biologische Marker, auch als Biomarker bekannt, wurden bereits über die Anwendung von Biochemie und Molekularbiologie auf medizinische und toxikologische Gegebenheiten identifiziert und untersucht. Ein Biomarker wurde als „eine Charakteristik, die objektiv als ein Indikator für normale biologische Vorgänge, krankhafte Vorgänge oder pharmakologische Reaktionen auf einen therapeutischen Eingriff gemessen und bewertet wird," beschrieben. Bei einem Biomarker handelt es sich um einen beliebigen identifizierbaren und meßbaren Indikator, der mit einem bestimmten Leiden bzw. einer bestimmten Krankheit verbunden ist, wobei eine Korrelation zwischen dem Vorhandensein oder der Konzentration des Biomarkers und einem bestimmten Aspekt des Leidens bzw. der Krankheit (einschließlich des Vorliegens, des Grads oder Änderungsgrads, der Art, des Stadiums des Leidens bzw. der Krankheit, der Anfälligkeit dafür oder der Ansprechbarkeit auf einen für die Behandlung des Leidens bzw. der Krankheit verwendeten Arzneistoffs) gibt. Die Korrelation kann dabei qualitativer, quantitativer oder sowohl qualitativer als auch quantitativer Natur sein. Typischerweise handelt es sich bei einem Biomarker um eine Verbindung, ein Verbindungsfragment oder eine Gruppe von Verbindungen. Derartige Verbindungen können beliebige in einem Organismus anzutreffende oder von diesem produzierte Verbindungen sein, einschließlich Proteine (und Peptide), Nukleinsäuren und andere Verbindungen.
Biomarker besitzen ein Vorhersagepotential und können zur Vorhersage oder zum Nachweis des Vorliegens, Grads, der Art oder des Stadiums bestimmter Leiden oder Krankheiten (einschließlich des Vorliegens oder Spiegels bestimmter Mikroorganismen oder Toxine), der Anfälligkeit (einschließlich genetischer Anfälligkeit) für bestimmte Leiden oder Krankheiten oder die Reaktion auf bestimmte Behandlungen (einschließlich Arzneistoffbehandlungen) verwendet werden. Man nimmt an, daß Biomarker bei der zukünftigen Entdeckung und Entwicklung von Arzneistoffen eine zunehmend wichtige Rolle spielen werden, und zwar durch Verbesserung der Effizienz von Forschungs- und Entwicklungsprogrammen. Biomarker lassen sich als Diagnostika, Agenzien zur Beobachtung des Fortschreitens einer Krankheit, Agenzien zur Beobachtung der Behandlung und als Agenzien für das Vorhersagen des klinischen Ergebnisses verwenden. So wird beispielsweise in verschiedenen Biomarkerforschungsprojekten versucht, Marker für spezifische Krebserkrankungen und spezifische cardiovaskuläre und immunologische Krankheiten zu identifizieren.
Zur Analyse von Proteinen (einschließlich Peptiden) wurden die Techniken der Proteomik (einschließlich Peptidomik) entwickelt. Diese Techniken werden in einem Modus mit hohem Durchsatz angewandt, wobei eine enorme Menge an Daten erzeugt wird, die mit Computersystemen analysiert werden. Dabei werden Proteine aus einer biologischen Probe isoliert und mit hoher Auflösung, beispielsweise mittels chromatographischer Trennungen, getrennt. Der Satz von Proteinen wird dann unter Verwendung qualitativer und quantitativer Techniken, wie beispielsweise Massenspektrometrie charakterisiert. Als Ergebnis erhält man einen Protein-(oder Peptid-)Fingerabdruck (einen konstanten, reproduzierbaren Satz von Proteinen bzw. Peptiden). Ausgewählte Proteine/Peptide oder Gruppen von Proteinen/Peptiden können weiter unter Erzeugung von Protein-/Peptidprofilen analysiert werden. Proteomik wird heutzutage als Analyse im Großmaßstab der Funktion von Genen angesehen und entwickelt sich zu einem zentralen Gebiet in der funktionellen Genomik.
Proteine werden im allgemeinen unter Verwendung von Techniken auf Gelbasis getrennt. Zurzeit ist die 2D-PAGE(Polyacrylamid-Gelelektrophorese) das Hauptanalyseverfahren zur Untersuchung der zellulären Expression von Proteinen. Geräteplattformen gestatten den fast vollständig automatischen Betrieb von 2D-Gelanalysen. Die 2D-Gelverfahren weisen eine gute Empfindlichkeit und Auflösung für eine große Fraktion exprimierter Proteine, typischerweise solche in einem Massenbereich von 10–120 kDa, auf. Allerdings weisen die Verfahren beträchtliche Einschränkungen bei der Identifizierung von Proteinen geringer Häufigkeit/niedrigen Molekulargewichts auf, von denen einige in Konzentrationen von nicht mehr als einigen wenigen Molekülen pro Zelle vorliegen. Probleme von Probenverlust und/oder unzureichender Wiedergewinnung haben die Isolierung von Proteinen geringer Häufigkeit/niedrigen Molekulargewichts mittels 2D-PAGE bislang verhindert. Darüber hinaus kann das Vorliegen dieser Proteine durch die Spots von Proteinen mit höherer Häufigkeit maskiert sein. Zu weiteren Klassen von Proteinen, die für die 2D-PAGE problematisch sind, zählen saure, basische, hydrophobe Proteine sowie Proteine mit hohem Molekulargewicht.
Als eine gute Alternative für die Trennung von Proteinen oder Peptiden, die sich nicht für die 2D-PAGE eignen, wurde die mehrdimensionale HPLC (High Performance Liquid Chromatography [Hochleistungsflüssigkeitschromatographie]) verwendet. Dabei wird das Protein- oder Peptidgemisch durch eine Abfolge chromatographischer stationärer Phasen oder Dimensionen geleitet, was zu einer höheren Auflösungsstärke führt. Ebenso ist die HPLC flexibler als die 2D-Gel-Trennverfahren, da sich die stationären und mobilen Phasen hinsichtlich ihrer Eignung bei der Auflösung spezifischer interessierender Protein- oder Peptidklassen sowie hinsichtlich der Kompatibilität miteinander sowie mit nachgeschalteten massenspektrometrischen Nachweis- und Identifizierungsverfahren auswählen lassen. On-line-Konfigurationen dieser Arten von Trennplattformen mit mehreren Mechanismen sind bekannt.
Die Massenspektrometrie (MS) ist ebenso ein wesentliches Element auf dem Gebiet der Proteomik. In der Tat handelt es sich bei MS um das Hauptwerkzeug, das zur Untersuchung und Charakterisierung aufgereinigter Proteine auf diesem Gebiet eingesetzt wird. Die Schnittstellenverknüpfung in der Proteomik und MS, wobei Hunderte oder Tausende von Proteinen dargestellt werden, wird mittels Geltechnologie hergestellt, wobei sich eine hohe Auflösung auf einem einzigen Gel erzielen läßt. Von Forschern wird die Leistungsstärke der MS erfolgreich genutzt, um die zweidimensionalen Gele, die ursprünglich die treibende Kraft der Proteomik waren, abzulösen.
Die Anwendung und Entwicklung von der Massenspektrometrie (MS) zur Identifizierung von Proteinen oder Peptiden, die über Flüssigphasentrenntechniken und/oder Trenntechniken auf Gelbasis getrennt wurden, führte zu bedeutenden technologischen Fortschritten bei der Protein- und Peptidexpressionsanalyse. Es gibt zwei Hauptverfahren für die massenspektrometrische Charakterisierung von Proteinen und Peptiden: MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization [Matrixunterstützte Laserdesorption/-ionisierung]) und ESI(Elektrospray-Ionisierung). Unter Verwendung verschiedener Ansätze lassen sich MALDI- und ESI-Ionenquellen mit TOF(Time-Of-Flight) oder anderen Arten massenspektrometrischer Analysegeräte kombinieren, um die Massen oder die Sequenzen von Peptiden zu bestimmen.
Bei der MALDI-Technik werden Peptide mit der Matrix cokristallisiert und Laserimpulsen ausgesetzt. Durch diese Behandlung werden die Peptide verdampft und ionisiert. Anschließend werden die Molekulargewichte (Massen) der geladenen Peptide in einem TOF-Analysegerät bestimmt. In dieser Vorrichtung beschleunigt ein elektrisches Feld die geladenen Moleküle in Richtung auf einen Detektor, wobei die Unterschiede in der Zeitdauer, die die ionisierten Peptide bis zum Erreichen des Detektors benötigen (ihrer Time-Of-Flight), die Molekulargewichte der Peptide ergeben; dabei erreichen kleinere Peptide den Detektor schneller. Durch dieses Verfahren werden Massenprofile der Peptidgemische erzeugt – das heißt, Profile der Molekulargewichte von und Mengen an Peptiden im Gemisch. Diese Profile lassen sich dann zur Identifizierung bekannter Proteine aus Proteinsequenzdatenbanken verwenden.
Bei der ESI-Technik sowie einer unter dem Namen LC (Liquid Chromatography [Flüssigkeitschromatographie])/MS/MS bekannten Technik wird eine Spannung an eine sehr feine Nadel, die ein Peptidgemisch enthält, angelegt. Daraufhin werden von der Nadel Tröpfchen in ein massenspektrometrisches Analysegerät gesprüht, und in dem Gerät verdampft, wobei Peptidionen freigesetzt werden. Bei der LC/MS/MS werden von Forschern LC-Mikrokapillarvorrichtungen zur ersten Trennung der Peptide verwendet.
Bei der Massenspektrometrie (MS) handelt es sich um eine wertvolle Analysetechnik, da damit eine intrinsische Eigenschaft eines Biomoleküls, nämlich seine Masse, mit sehr hoher Empfindlichkeit gemessen wird. MS läßt sich daher zur Messung eines breiten Spektrums von Molekülarten (Proteine, Peptid oder beliebige andere Biomoleküle) sowie eines breiten Spektrums von Probenarten/biologischen Materialien verwenden. Dabei ist bekannt, daß eine korrekte Probenvorbereitung für die Erzeugung des MS-Signals und die Auflösung und Empfindlichkeit der Spektren entscheidend ist. Die Probenvorbereitung stellt daher einen entscheidenden Bereich für die Gesamtdurchführbarkeit und -empfindlichkeit der Analyse dar.
Proteine kommen natürlicherweise in Zellen, als Bestandteile von Zellstrukturen sowie als Bestandteile natürlicher biologischer Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Lymphe und Schweiß, vor. Die Proteomik stellt ein essentielles Werkzeug für die Untersuchung biologischer Systeme und Vorgänge dar, da Proteine eine reiche Quelle für wertvolle Informationen liefern. So gestatten diese Informationen beispielsweise den Vergleich von Biomarkern, die qualitativ und/oder quantitativ zwischen gesunden und erkrankten Bevölkerungsgruppen unterschiedlich sind. Proteomiktechniken gestatten die Identifizierung individueller Proteinspezies in komplexen Proteingemischen.
Die Proteomik wird bei der Entdeckung und Entwicklung von Arzneistoffen, beispielsweise zum Nachweis von in Patienten mit bestimmten Leiden oder Krankheiten in signifikanterweise veränderten Proteinen, verwendet. Einige dieser krankheitsassoziierten Proteine können dabei als neue Arzneistoffziele identifiziert werden, wobei andere sich als Biomarker für den Krankheitsverlauf eignen können. Solche Biomarker können zur Verbesserung der klinischen Entwicklung eines neuen Arzneistoffs oder zur Entwicklung neuer Diagnostika für die jeweilige Krankheit verwendet werden.
Der Nachweis krankheitsassoziierter Proteine kann über das folgende Verfahren erzielt werden. Man entnimmt sowohl aus erkrankten Individuen als auch gesunden Individuen Proteinproben. Bei diesen Proben kann es sich um Zellen, Gewebe oder biologische Flüssigkeiten handeln, die zur Extraktion und Anreicherung von Protein- und/oder Peptidbestandteilen verarbeitet werden. Dieser Vorgang beinhaltet typischerweise das Verteilen in der Lösungsphase, kann jedoch auch die Erzeugung von an feste Matrizes gebundenen Protein- und/oder Peptidbestandteilen umfassen. Nach Trennung und Analyse mit hohem Durchsatz (Proteomik) werden Proteinexpressionsfingerabdrücke sowohl für die erkrankten als auch die gesunden Individuen mittels qualitativer und quantitativer Messung produziert. Diese Fingerabdrücke können als einzigartige Identifizierungsmerkmale zur Unterscheidung von Individuen und/oder zum Nachweisen und/oder Verfolgen bestimmter natürlicher Prozesse oder Krankheitsprozesse verwendet werden. Diese Prototypfingerabdrücke werden für jede Einzelprobe/Einzelperson ermittelt und als Zahlenwerte in einer Computerdatenbank aufgezeichnet. Die Fingerabdrücke werden anschließend unter Verwendung von Bioinformatikwerkzeugen analysiert, um die Proteine oder Peptide, die in den Prototypformen vorliegen und deren Expression in den aus den gesunden bzw. erkrankten Untersuchungsproben stammenden Proben unterschiedlich vorliegen kann oder nicht, zu identifizieren und selektionieren. Diese Proteine/Peptide werden dann weiter charakterisiert, wobei ausführliche Profile erstellt werden, mit denen die charakteristischen Massen und physikalischen Eigenschaften der Proteine oder Peptide identifiziert werden. Dabei kann sich herausstellen, daß entweder ein einziges Protein/Peptid oder Gruppen von Proteinen/Peptiden in signifikanter Weise mit bestimmten natürlichen Prozessen oder Krankheitsprozessen assoziiert sind.
Es sind verschiedene krankheitsassoziierte Proteine bekannt, wobei es sich bei einigen von diesen um Enzyme handelt, deren Aktivität an einem bestimmten Punkt in der Entwicklung eines bestimmten Leidens oder einer bestimmten Krankheit ansteigt oder abnimmt. Solche Enzyme können geeignete Arzneistoffziele darstellen, was zu einer Suche nach pharmazeutisch wirksamen Verbindungen (Arzneistoffen) führt, die zur Hemmung oder Stimulierung des Enzyms und somit zur Vorbeugung oder Behandlung des Leidens bzw. der Krankheit verwendet werden könnten. Bei anderen krankheitsassoziierten Proteinen kann es sich um Abbauprodukte bestimmter Enzyme oder um Proteine handeln, die bei Vorliegen der Krankheit zahlreicher produziert werden.
Zu krankheitsassoziierten Proteinen gehören beispielsweise die Metalloproteinasen, eine Superfamilie von Proteinasen (Enzymen), von denen man annimmt, daß sie bei zahlreichen physiologischen Krankheitsprozessen wichtig sind. Die Modulation der Aktivität einer oder mehrerer Metalloproteinasen kann sich bei diesen Krankheiten oder Leiden durchaus günstig auswirken. Es sind eine Reihe von Metalloproteinase-Inhibitoren bekannt (siehe beispielsweise die Übersichtsartikel über MMP-Inhibitoren von Beckett R. P. und Whittaker M., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8(3): 259–282 und von Whittaker M. et al., 1999, Chemical Reviews 99(9): 2735–2776). Aufgrund von Struktur- und Funktionsbetrachtungen wurden Metalloproteinase-Enzyme in Familien und Unterfamilien eingeteilt, wie bei N. M. Hooper (1994) FEBS Letters 354: 1–6 beschrieben. Zu den Metalloproteinasen gehören beispielsweise die Matrixmetalloproteinasen (MMPs), wie z. B. die Collagenasen (MMP1, MMP8, MMP13); die Gelatinasen (MMP2, MMP9), die Stromelysine (MW3, MMP10, MMP11), Matrilysin (MMP7), Metalloelastase (MMP12), Enamelysin (MMP19) and die MT-MMPs (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17).
Zu den krankheitsassoziierten Proteinen gehören beispielsweise diejenigen Enzyme, die mit dem Ausbruch und/oder dem Fortschreiten der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) in Verbindung gebracht wurden, wie nachfolgend diskutiert.
COPD, die hauptsächlich durch das Rauchen von Zigaretten verursacht wird, wird nach den Erwartungen im Jahr 2020 weltweit die dritthäufigste Todesursache sein. COPD ist durch einen reduzierten maximalen Ausatmungsstrom sowie ein langsames erzwungenes Entleeren der Lungen gekennzeichnet. Diese Beschränkungen des Luftstroms sind hauptsächlich auf chronische Bronchitis unter Beteiligung einer Hypertrophie der Schleimdrüsen und durch die Zerstörung der Alveolarwände hervorgerufenes Emphysem zurückzuführen. Letzteres führt zur Vergrößerung der distal zur terminalen Bronchiole liegenden Lufträume mit anschließendem Kollabieren der kleinen Luftwege, Beschränkungen des Luftstroms, Zerstörung von Teilen des Kapillarbetts und Verlust des elastischen Zusammenziehens der Lunge. Dieser Verlust des elastischen Zusammenziehens sowie die Vergrößerung der Lufträume in den Lungen von COPD-Patienten führt zu verringerten FEV(Forced Expiratory Volume)-Werten und erhöhten FVC(Forced Vital Capacity)-Werten. Die Schwere der Krankheit wird als Grad der Lungenfunktionsbeeinträchtigung bestimmt, die mit einem Spirometer gemessen wird. Das Vorliegen eines Postbronchodilator-FEV₁-Werts von < 80% des vorhergesagten Werts in Kombination mit einem FEV₁/FVC-Verhältnis von < 70% bestätigt das Vorliegen einer Luftstrombeschränkung, die nicht vollständig reversibel ist. Das chronische Inkontaktkommen mit Zigarettenrauch verursacht eine Entzündungsreaktion in der Lunge, was zu Veränderungen der Luftwegsepitheloberfläche sowie zur Aktivierung und einer erhöhten Anzahl von mehreren Entzündungszellen führt.
Es wurde seit langem vorgeschlagen, daß Entzündung sowie ein Protease-Antiprotease-Ungleichgewicht als nachgeschaltete Effektoren der Lungenzerstörung nach chronischem Zigarettenrauchen wirken. Durch histologische Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß in den Luftwegen von Rauchern erhöhte Anzahlen von Makrophagen und T-Lymphozyten vorliegen und daß ebenso Neutrophile in den Luftwegen von Rauchern und COPD-Patienten erhöht sind, was mit der Schwere der Luftstromblockierung in Verbindung stand. Bei den Alveolarmakrophagen handelt es sich um langlebige Phagozyten und um die am häufigsten vorkommenden Abwehrzellen in der Lunge, und zwar sowohl unter Normalbedingungen als auch während einer chronischen Entzündung. Durch das Aussenden chemotaktischer Faktoren rekrutieren sie dann Neutrophile und Lymphozyten durch Aktivieren der Adhäsionsmolekülexpression auf mikrovaskulären Lungenendothelzellen an der Infektionsstelle. Die Entzündungszellen, die in die Lunge des Rauchers eindringen, produzieren lokal Vermittlermoleküle, wie beispielsweise Zytokine, Serin- und Metalloproteinasen sowie Oxidantien. Diese Vermittlermoleküle, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von COPD spielen, können so wirken, daß sie die Entzündungsreaktion weiter aktivieren und ebenso die Bestandteile der extrazellulären Matrix abbauen.
Normalerweise hindern Plasmaproteinaseinhibitoren, vor allem α₁-Antitrypsin (α₁-AT), proteolytische Enzyme daran, Strukturproteine der Lunge zu verdauen. Nach der Proteinase-Antiproteinase-Hypothese entstehen Emphyseme durch eine Erhöhung der Proteinasefreisetzung in den Lungen, eine Verringerung der Antiproteinaseabwehr oder einer Kombination davon. Elastin ist der Hauptbestandteil elastischer Fasern, die einen Hauptteil der extrazellulären Matrix der Lunge bilden. Untersuchungen zeigen, daß Individuen, die für α₁-AT-Mangel homozygot sind, eine erhöhte Anfälligkeit für die Entwicklung von Lungenemphysemen aufweisen, vor allem wenn sie auch noch rauchen.
Ein Beispiel für ein mit COPD verbundenes krankheitsassoziiertes Enzym ist die Matrix-Metalloproteinase MMP12, auch unter dem Namen Makrophagenelastase oder Metalloelastase bekannt. Eines der natürlichen Substrate von MMP12 ist Elastin, das unlösliche, elastische Protein mit hoher Zugfestigkeit, das sich in den Zwischenzellräumen der Bindegewebe großer Arterien, Tracheen, Bronchien und Ligamente findet. MMP12 wurde ursprünglich in der Maus von Shapiro et al [1992, Journal of Biological Chemistry 267: 4664] und danach von der gleichen Gruppe im Menschen kloniert (Shapiro et al, "Cloning and characterization of a unique elastolytic metalloproteinase produced by human alveolar macrophages", 1993, Journal of Biological Chemistry 268(32): 23824–23829). Die Proteinsequenz eines menschlichen MMP12 ist in der SwissProt-Datenbank, zugänglich unter http://us.expasy.org/sprot/ (swissprot: locus MM12_HUMAN, accession P39900), gespeichert. MMP12 wird vorzugsweise in aktivierten Makrophagen exprimiert, wobei gezeigt wurde, daß es von Alveolarmakrophagen aus Rauchern sezerniert wird [Shapiro et al, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824–23829] und ebenso in Schaumzellen in aterosklerotischen Läsionen vorliegt [Matsumoto et al., 1998, Am J Pathol 153: 109]. Ein Mausmodell der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) basiert auf einem sechsmonatigen Challenge von Mäusen mit Zigarettenrauch, und zwar zwei Zigaretten täglich sechs Tage pro Woche. Nach dieser Behandlung entwickelten Wildtyp-Mäuse Lungenemphyseme. Wurden MMP12-Knock-Out-Mäuse in diesem Modell getestet, so entwickelten diese keine signifikanten Emphyseme, was stark darauf hinweist, daß MMP12 ein Schlüsselenzym bei der COPD-Pathogenese darstellt. Man glaubt, daß MMP12 Lungengewebe über den Abbau des Elastins im Gewebe abbaut. Die Rolle der MMPs, wie beispielsweise MMP12, bei COPD (Emphyseme und Bronchitis) wird bei Anderson und Shinagawa, 1999, Current Opinion in Antiinflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29–38 besprochen. Kürzlich wurde entdeckt, daß Rauchen die Makrophageninfiltration und makrophagenproduzierte MMP12-Expression in menschlichen Halsschlagaderplaques Kangavari erhöht [Matetzky S, Fishbein MC et al., Circulation 102: (18), 36–39 Suppl. S, 31. Okt. 2000].
Der gegenwärtige Einsatz der Proteomik oder Peptidomik bei der Entdeckung und Entwicklung von Arzneistoffen (insbesondere für die Krankheit COPD) wird durch verschiedene Faktoren eingeschränkt, einschließlich beispielsweise:

a) dem Fehlen von Profilen krankheitsassoziierter Peptide, die sich mit spezifischen Arzneistoffzielen verknüpfen lassen (da gegenwärtige Fingerabdruckverfahren Gesamtproteinunterschiede analysieren und sich nicht auf ein bestimmtes Protein/Arzneistoffziel konzentrieren);
b) dem Fehlen von Biomarkern zur Identifizierung von an COPD erkrankten Individuen in einem frühen Stadium der Krankheit;
c) dem Fehlen von Biomarkern zur Bewertung potentieller Arzneistoffe, bei denen es sich um MMP12-Inhibitorverbindungen handelt, insbesondere in klinischen Studien (d. h. zur Validierung, daß das MMP12-Ziel von dem Inhibitor getroffen wird).

Aus der WO 91/18290 ist die Verwendung von Antikörpern gegen Peptidmarker zum Nachweis des Vorliegens von Lungenschäden bei asymtomatischen Patienten bekannt.
Die WO 89/01625 betrifft die immunologische Identifizierung carboxyterminaler Sequenzen von Elastin in menschlichem Plasma unter Verwendung monospezifischer Antikörper.
Von Joos et al. (Human Molecular Genetics, 2002, Bd. 11, Nr. 5) und Wallace et al. (Am. J. Pharmacogenetics 2002: 2(3): 167–175) wird die Rolle häufiger Polymorphismen in mehreren MMP-Genpromotoren bei einer durch Rauchen induzierten Lungenverletzung untersucht.
Vorliegend wurde nun eine neue Methodik zur Herstellung und Verwendung von Protein-/Peptid-Fingerabdrücken entwickelt, die die Identifizierung und Untersuchung krankheitsassoziierter Proteine/Peptide gestattet, die sich mit spezifischen Arzneistoffzielen (wie etwa MMP12) oder mit spezifischen Arzneistoffzielkombinationen verknüpfen lassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN UND FIGUREN
In Tabelle 1 sind die MS-Atommasseneinheitsidentitäten von 97 Peptiden als Ergebnis der Verdauung von Elastin mit MMP12 und Trennung mittels Säulenchromatographie dargestellt.
In Tabelle 2 sind die MS-Atommasseneinheitsidentitäten von 185 Peptiden als Ergebnis der Verdauung von Elastin mit MMP12 und Trennung mittels Säulenchromatographie dargestellt.
In 1 ist das aus einer gegebenen Flüssigphasentrennfraktion erzeugte Massenspektrum dargestellt, wobei 1A den Peptid-Fingerabdruck in einer Harnfraktion von einem an COPD leidenden Menschen zeigt, 1B den Peptid-Fingerabdruck bei einem gesunden Individuum zeigt und 1C den Peptid-Fingerabdruck in einem Gemisch von MMP-12+Elastin nach 2,5 h Inkubation zeigt.
2 zeigt als weiteres Beispiel das aus einer gegebenen Flüssigphasentrennfraktion erzeugte Massenspektrum, wobei 2A den Peptid-Fingerabdruck in einer Harnfraktion von einem an COPD leidenden Menschen zeigt, 2B den Peptid-Fingerabdruck bei einem gesunden Individuum zeigt und 2C den Peptid-Fingerabdruck in einem Gemisch von MMP-12+Elastin nach 2,5 h Inkubation zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vorliegend wird ein Peptid-Fingerabdruck bereitgestellt, umfassend aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte, wobei der Peptid-Fingerabdruck wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt. Ferner wird ein Peptid-Fingerabdruck bereitgestellt, umfassend aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte, wobei der Peptid-Fingerabdruck wenigstens neunzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt. Ebenso wird ein Peptid-Fingerabdruck bereitgestellt, umfassend aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte, wobei der Peptid-Fingerabdruck wenigstens einhundertfünfzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt. Ein bevorzugter Peptid-Fingerabdruck umfaßt alle in Tabelle 1 identifizierten Peptide. Ein weiterer bevorzugter Peptid-Fingerabdruck umfaßt alle in Tabelle 2 identifizierten Peptide.
Jede Kombination bzw. alle Kombinationen der über Masse in Tabelle 2 oder Tabelle 1 identifizierten Peptide kann bzw. können bei Anwendungen eingesetzt werden, bei denen das Vorhandensein und/oder die Abwesenheit des Proteins Elastin in einem beliebigen diagnostischen Rahmen eines klinischen Leidens gemessen oder beobachtet wird. Zu derartigen klinischen Leiden gehören systemische Entzündung, Gefäßentzündung, Lungenentzündung, Leberentzündung, Herzentzündung oder andere Krankheiten, die mit dem Langzeitkonsum von Zigaretten oder dem Inkontaktkommen mit Zigarettenrauch verknüpft werden können. Insbesondere zählt zu derartigen klinischen Leiden COPD. Jede Kombination bzw. alle Kombinationen der über Masse in Tabelle 2 oder Tabelle 1 identifizierten Peptide kann bzw. können in einer beliebigen modifizierten Form, einschließlich chemischer Modifikationen enthaltener Gruppierungen, Quervernetzung zu Gruppierungen, Markierung mit Gruppierungen, einschließlich Radionukliden, Fluoreszenzfarbstoffen oder ähnlichen Reagentien, verwendet werden. Jede Kombination bzw. alle Kombinationen der über Masse in Tabelle 2 oder Tabelle 1 identifizierten Peptide kann bzw. können in diagnostischen Testkits, mit denen das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Proteins Elastin gemessen oder beobachtet wird, verwendet werden.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Verfahren zur Bestimmung oder Bestätigung davon, ob das Enzym MMP12 mit der Krankheit Y assoziiert ist, wobei man in dem Verfahren

(a) eine gewonnene gesunde Probe zur Herstellung eines gesunden Peptid-Fingerabdrucks analysiert,
(b) eine gewonnene kranke Bioflüssigkeitsprobe oder eine kranke Gewebeprobe, wobei die kranke Probe Anzeichen des Ausbruchs oder des Fortschreitens der Krankheit Y zeigt, zur Herstellung eines kranken Peptid-Fingerabdrucks analysiert,
(c) den gesunden Peptid-Fingerabdruck mit dem kranken Peptid-Fingerabdruck vergleicht und den im kranken Peptid-Fingerabdruck gefundenen Satz von Peptiden identifiziert,
(d) den in Schritt (c) identifizierten kranken Satz von Peptiden mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Peptid-Fingerabdruck, wobei der Peptid-Fingerabdruck ein oder mehrere der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt, vergleicht und ermittelt, ob statistisch signifikante Ähnlichkeiten oder Unterschiede zwischen ihnen bestehen, und zwar auf der Grundlage eines qualitativen und quantitativen Vergleichs unter Verwendung statistischer Formulierungen zum Testen von Zufallsereignissen,
(e) falls signifikante Assoziationen zwischen den quantitativen und qualitativen Meßgrößen in Schritt (d) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 mit der Krankheit Y in der analysierten Probe assoziiert ist,
(f) falls keine signifikanten Assoziationen zwischen den quantitativen und qualitativen Meßgrößen in Schritt (d) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 nicht mit der Krankheit Y in der analysierten Probe assoziiert ist.

Vorzugsweise handelt es sich bei der Krankheit Y um COPD. Der aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassende Peptid-Fingerabdruck umfaßt vorzugsweise wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide oder wenigstens neunzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide oder wenigstens einhundertfünfzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide. Am stärksten bevorzugt umfaßt der Peptid-Fingerabdruck alle in Tabelle 1 identifizierten Peptide oder alle in Tabelle 2 identifizierten Peptide.
Ein Verfahren gemäß des dritten erfindungsgemäßen Aspekts kann zur Bestimmung des Vorliegens von COPD verwendet werden, wobei man in dem Verfahren

(a) eine gewonnene Bioflüssigkeits- oder Gewebeprobe analysiert, um ihren Peptid-Fingerabdruck zu erhalten,
(b) den in Schritt (a) identifizierten Peptid-Fingerabdruck der Probe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Peptid-Fingerabdruck, wobei der Peptid-Fingerabdruck ein oder mehrere der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt, vergleicht und ermittelt, ob statistisch signifikante Ähnlichkeiten zwischen ihnen bestehen,
(c) falls statistisch signifikante Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß COPD vorliegt,
(d) falls keine statistisch signifikanten Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß COPD nicht vorliegt oder erfolgreich behandelt wird.

Der aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassende Peptid-Fingerabdruck umfaßt vorzugsweise wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide oder wenigstens neunzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide oder wenigstens einhundertfünfzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide. Am stärksten bevorzugt umfaßt der Peptid-Fingerabdruck alle in Tabelle 1 identifizierten Peptide oder alle in Tabelle 2 identifizierten Peptide.
In einem vierten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein diagnostischer Testkit zur Bestimmung des Vorliegens von COPD bereitgestellt, der Mittel zum Vergleichen des Peptid-Fingerabdrucks einer Bioflüssigkeitsprobe oder des Peptid-Fingerabdrucks einer Gewebeprobe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Substrat-Fingerabdruck umfaßt, wobei der Substrat-Fingerabdruck wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt.
Ein weiteres Verfahren stellt ein Verfahren zur Analyse der Wirkung eines Arzneistoffs Z auf das Enzym MMP12 dar, wobei man in dem Verfahren

(a) eine aus einem an COPD leidenden Menschen oder nichtmenschlichen Tier gewonnene Bioflüssigkeitsprobe oder eine Gewebeprobe analysiert, um ihren Peptid-Fingerabdruck zu erhalten, wobei der Mensch bzw. das nichtmenschliche Tier jeweils bereits mit dem Arzneistoff Z vorbehandelt wurden,
(b) den in Schritt (a) identifizierten Peptid-Fingerabdruck der Probe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Peptid-Fingerabdruck, wobei der Peptid-Fingerabdruck ein oder mehrere der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt, vergleicht und ermittelt, ob statistisch signifikante Ähnlichkeiten zwischen ihnen bestehen,
(c) falls statistisch signifikante Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 durch den Arzneistoff Z nicht gehemmt wird,
(d) falls keine statistisch signifikanten Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 durch den Arzneistoff Z gehemmt wird.

In einem sechsten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein diagnostischer Testkit zur Analyse der Wirkung eines Arzneistoffs Z auf das Enzym X bereitgestellt, wobei der Kit Mittel zum Vergleichen des Peptid-Fingerabdrucks einer Bioflüssigkeitsprobe oder des Peptid-Fingerabdrucks einer Gewebeprobe mit dem Peptid-Fingerabdruck der Abbauprodukte in einem Gemisch von Enzym X mit seinem natürlichen Substrat umfaßt, wobei die Probe aus einem Menschen oder nichtmenschlichen Tier, der bzw. das mit dem Arzneistoff Z behandelt wurde oder wird, gewonnen wurde.
In bevorzugten diagnostischen Testkits gemäß dem sechsten erfindungsgemäßen Aspekt handelt es sich bei dem Enzym X um MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, MMP12 oder MMP14, bei dem natürlichen Substrat um Elastin und bei der Krankheit Y um COPD. In einem besonders bevorzugten diagnostischen Test gemäß dem sechsten erfindungsgemäßen Aspekt handelt es sich bei dem Enzym X um MMP12 (am stärksten bevorzugt menschliches MMP12), bei dem natürlichen Substrat um Elastin (am stärksten bevorzugt menschliches Elastin) und bei der Krankheit Y um COPD, wobei der Peptid-Fingerabdruck der Abbauprodukte eines oder mehrere der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt. Insbesondere umfaßt der Peptid-Fingerabdruck der Abbauprodukte wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide. Ganz besonders umfaßt der Peptid-Fingerabdruck der Abbauprodukte wenigstens neunzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide. Vor allem umfaßt der Peptid-Fingerabdruck der Abbauprodukte wenigstens einhundertfünfzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide. Ein bevorzugter Peptid-Fingerabdruck der Abbauprodukte umfaßt alle in Tabelle 1 identifizierten Peptide. Ein weiterer bevorzugter Peptid-Fingerabdruck der Abbauprodukte umfaßt alle in Tabelle 2 identifizierten Peptide.
Ein bevorzugter diagnostischer Testkit zur Analyse der Wirkung eines Arzneistoffs Z auf das Enzym MMP12 umfaßt Mittel zum Vergleichen des Peptid-Fingerabdrucks einer Bioflüssigkeitsprobe oder des Peptid-Fingerabdrucks einer Gewebeprobe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Substrat-Fingerabdruck, wobei der Substrat-Fingerabdruck wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt und wobei die Probe aus einem Menschen oder nichtmenschlichen Tier, der bzw. das mit dem Arzneistoff Z behandelt wurde oder wird, gewonnen wurde. Insbesondere umfaßt der Substrat-Fingerabdruck wenigstens neunzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide. Vor allem umfaßt der Substrat-Fingerabdruck wenigstens einhundertfünfzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide. Ein bevorzugter Substrat-Fingerabdruck umfaßt alle in Tabelle 1 identifizierten Peptide. Ein weiterer bevorzugter Substrat-Fingerabdruck umfaßt alle in Tabelle 2 identifizierten Peptide.
Ausgehend von den erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich ein Krankheitsmodell (ein Vorhersageindikator für die Krankheitsentwicklung) erzeugen, das das Vorliegen/Fehlen, die relative Häufigkeit sowie die qualitativen/quantitativen Eigenschaften von Einzelpeptiden/Proteinen oder Gruppen von Peptiden/Proteinen innerhalb eines jeden Fingerabdrucks umfaßt. Durch die Analyse von Bioflüssigkeits- oder Gewebeproben über einen dynamischen Zeitraum in bezug auf spezifische Protein-/Peptid-Fingerabdrücke läßt sich eine Assoziationskorrelation zwischen spezifischen Rahmen der klinischen Krankheit und bestimmten spezifischen Peptid-Fingerabdrücken ermitteln.
In den erfindungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung der folgenden Methodik zur Erzeugung der Protein-/Peptid-Fingerabdrücke bevorzugt. Diese Methodik liefert und führt zu Messungen mit optimaler Auflösung und Empfindlichkeit.
Bei der bevorzugten Methodik handelt es sich um eine automatisierte mehrdimensionale Flüssigphasentrennplattformtechnologie. Dabei wird die gesamte Plattform automatisch in einem geschlossenen Betriebssystem betrieben, worin die mehrdimensionalen Trennmechanismen in flüssigen Trennphasen auf Chromatographiesäulen ausgeführt werden. Das Zusammenschalten dieser Trennschritte erfolgt on-line mit Transferschritten zwischen den Säulen in der Arbeitsplatzstation. Die Schnittstelle zwischen den Trennmechanismen wird über chromatographische Bedingungen bereitgestellt, die das Überführen der Analyten von einer Dimension zur nächsten ohne Verluste gestattet. Dies wird durch den Flüssigkeits-Flüssigkeits-Transfer zwischen den Dimensionen erreicht. Eine Beschreibung zur Durchführung der Methodik ist nachfolgend angegeben.
Bioflüssigkeitsproben werden in die Flüssigphasen-Peptidprofilerstellungsplattform eingeführt und bei 4°C temperiert, um die Stabilität der Proben über den Zeitraum sicherzustellen. Die Probe wird dann in die erste Trenndimension vom Autoinjektor (Säule 1) injiziert. Der Mechanismus in diesem Schritt beruht auf Größentrennung (das Trennpackungsmaterial aus Polymer oder Kieselgel besitzt hochdefinierte Poren). In der ersten Dimension werden größere Proteine und Biopolymere vom Eintreten in die Poren der Kügelchen des Trennmaterials ausgeschlossen. Die interessierenden Analyten, wie beispielsweise Peptidanalyten, diffundieren in die Poren und binden an die Funktionalität innerhalb der Poren. Bei dieser Funktionalität kann es sich um elektrostatisch geladene Oberflächen oder hydrophobe Oberflächen handeln, auf denen die Peptide gebunden werden. Auf diese Weise erfolgt eine selektive Anreicherung der Peptide, wobei gleichzeitig die größeren Proteine und Biopolymere ausgeschlossen und nach Elution verworfen werden. Das Säulenmaterial wird dann einige Male mit verschiedenen Elutionsmitteln gewaschen, um störende Bestandteile aus der Probe, die an die äußere Oberfläche ebenso wie an Filter und offen liegende Oberflächen des chromatographischen Systems gebunden hat, zu entfernen. Auf diese Weise wird die angereicherte Peptidfraktion in den Poren des Säulenmaterials mit hoher Reinheit isoliert.
Nach den Waschschritten wird ein starkes Elutionsmittel in die nächste Dimension, Säule 2, eingeführt. In der zweiten Dimension wird die Elution von Säule 1 in Säule 2 on-line überführt und oben auf dem Träger der Säule 2 absorbiert. Bei der Säule 2 handelt es sich um ein Kügelchen mit geladener Funktionalität, bei der die Trennung über elektrostatische Mechanismen erfolgt. Es wird dabei eine Gradientenelution verwendet, und die entsprechenden Peptide werden in eluierten Fraktionen getrennt. Diese Fraktionen werden als nächstes in der dritten Dimension über Hydrophobizität getrennt, wodurch das Salz aus den Peptidfraktionen entfernt wird und eine Aufkonzentrierung unter Verwendung eines Waschschritts mit wäßrigem Medium erfolgt, gefolgt von der Elution auf eine Zielplattenoberfläche, von wo die Peptidmassensequenzen bestimmt werden.
In der vierten Dimension des Systems kommt die Massenspektrometrie zum Einsatz, bei der die Masse, Intensität (Quantitität) jeder einzelnen Peptidkomponente aller Fraktionen der Probe analysiert wird.
Die vom Massenspektrometer produzierten Daten bestehen aus mehreren Faktoren und repräsentieren genaue einzelne Probennamen zu spezifischen Rahmenzeitpunkten der Verfahrensschritte. Die charakteristischen physikalischen Eigenschaften der Peptide und Proteine, zu denen Größe, Masse, Ladung und Hydrophobizität gehören, führen zu individuellen Signaturprofilen für jedes Peptid oder Protein. Diese Eigenschaften werden vom Massenspektrophotometer nachgewiesen und als Dateien mit drei Überschriften, Fraktion, Masse/z und Intensität, aufgezeichnet.
Die Massenwerte werden typischerweise bis zur 4. Dezimalstelle aufgezeichnet, doch werden sie für Darstellungszwecke auf den nächsten Zahlenwert gerundet. Das Verfahren zur Bestimmung der statistischen Signifikanz für die Assoziationen von Peptiden mit gegebenen Fingerabdrücken oder zwischen einzelnen Fingerabdrücken oder Gruppen von Fingerabdrücken beruht auf Konstanten einer Datenmatrix, die aus den Werten für Fraktion, Masse/z und Intensität für jedes Peptid konstruiert wird. Die Datenmatrix wird über die Kombinationen von Fraktionen und Massen, die in jeder Untersuchungsprobe vorliegen, erstellt, wobei die Intensitäten für eine jede solche Kombination aus Masse und Fraktion aufsummiert werden. Es entsteht dann die folgende Datenmatrix:

Versuchsobjekt 1 Versuchsobjekt 2

Fraktion 1 × Masse 1 I_1,1 I_1,2

Fraktion 2 × Masse 2 .... ....

worin I_1,1 usw. die aufsummierten Intensitäten bedeuten. Versuchsobjekte werden normiert, indem die Gesamtsumme der Intensitäten pro Versuchsobjekt abgeglichen wird.
Ein Java-Code berechnet eine regularisierte t-Statistik, wodurch die falsch-positiv- und falsch-negativ-Raten minimiert werden, und zwar nach der Theorie in Broberg (2003, Genome Biology, 4(6): R41). In der Praxis beginnt man mit einer Größe oben auf der Liste oder einer Reihe praktischer Größen oben auf der Liste, wobei die Aufgabe darin besteht, eine optimale Größe im gegebenen Bereich zu finden und besagte Liste mit so vielen echt-Positiven wie möglich zu füllen. Die verwendete Teststatistik weist die von Tusher et al (2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 5116–5121) entwickelte Form
auf, wobei diff eine Effektabschätzung, z. B. eine mittlere Gruppendifferenz, S einen Standardfehler und S₀ eine Regularisierungskonstante bedeuten. Im Zwei-Proben-Fall ergibt S₀ = 0 den t-Test gleicher Varianz. Unter Verwendung von Abschätzungen der falsch-positiv und falsch-negativ-Raten wird über ein Optimierungsverfahren das Kriterium C = √(FP² + FN²) über einem Gitter möglicher Werte von S₀ (gegeben durch Perzentile in der Verteilung von S) und der Länge der oberen Liste minimiert.
Die Ausgabe enthält Gruppenmittelwerte, p-Werte für den Vergleich, die falsch-positiv-Rate und falsch-negativ-Rate, die sich unter Einschluß der vorliegenden Fraktion × Masse sowie allen mit kleineren p-Werten ergäbe. Die Ausschußgrenze (Cut-Off) wird so gewählt, daß die falsch-positiv- und falsch-negativ-Raten minimiert werden.
Die sich ergebenden Massenspektrendaten, Peptidmasse, Peptidfraktion und Peptididentität werden durch statistische Vergleiche zwischen beispielsweise Individuen mit COPD und gesunden Individuen erzeugt. Die digitale Masseneinheit wird in Töpfe +/–0,5 Masseneinheiten zu jeder Seite der nachgewiesenen Masse gruppiert und mit einer gegebenen Peptidfraktion kombiniert. Als nächstes werden die Topfintensitäten aufsummiert, so daß sich für jedes einzelne Fragment eine extrapolierte Identität ergibt. Die in der statistischen Analyse verwendete Gesamttopfanzahl lag typischerweise zwischen 10 000–20 000. Die Massenfragmente werden dann mittels Gruppierungen von Individuen, wie beispielsweise Individuen mit COPD oder gesunden Individuen, verglichen. Die statistische Analyse beruht auf von jedem Individuum gesammelten 40–50 Fraktionen. Die Zeit pro Zyklus zur Erzeugung der 40–50 Peptidfraktionen beträgt weniger als 5 Stunden.
Die Massenfragmente der nachfolgend in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Peptide konnten in keinem der unter Verwendung dieser Methodik getesteten 20 gesunden Prototypindividuen identifiziert werden.
Integrierte Verfahrensschritte für die Biomarkeridentifizierung sind essentiell und enthalten die folgenden vier verfahrensdefinierenden Eckpfeiler: 1/biomedizinisches klinisches Material hoher Qualität, 2/Technologieplattform zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Peptiden, 3/in-vitro-Test mit qualitativer und quantitativer Analyse von beispielsweise aus der Reaktion mit MMP-12-Enzym, mit menschlichem Elastin als Substrat, hervorgehenden Peptiden/Peptidprodukten, 4/statistisches Verfahren zur Verknüpfung mehrerer Sätze von Spitzenidentitäten mit Prototyp-Fingerabdrücken und mit differentieller Expression dieser Peptide und Peptid-Fingerabdrücke innerhalb der und zwischen den bezeichneten Untersuchungsgruppen. Hierbei handelt es sich um einen bevorzugten Weg zur Analyse der Daten, der die Analyse der Biomarkerpeptide, die wahrscheinlich mit dem Urin von COPD-Patienten assoziiert sind, gestattet (Schema D).
Die vier Verfahrenseckpfeiler sind jeweils abhängig voneinander und erforderlich, um Biomarkerpeptide über differentielle Quantifizierung zwischen gesunden Individuen und Individuen mit COPD zu bestimmen, wobei diese Quantifizierung beispielsweise in Verbindung mit den durch die Funktion/Aktivität des MMP-12-Enzyms entstandenen Peptiden von Elastin in Verbindung gebracht wird. Das bevorzugte Verfahren kann auch zur Bestimmung und zum Nachweis der natürlichen Elastinabbauprodukte, die sich aus der Spaltung von Elastin mit natürlich oder konstruierten elastolytischen spezifischen Enzymen, einschließlich MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 und MMP14 ergeben, verwendet werden. Schema D: Gegenseitige Abhängigkeit der Verfahrenseckpfeiler
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne auf diese beschränkt zu sein.
BEISPIELE
Die Peptidfragmente von Elastin, die das Ergebnis der enzymatischen Verdauung von menschlichem Elastin mit menschlichem MMP12 sind, wurden zuerst unter Laborbedingungen unter Verwendung eines in-vitro-Modellsystems zur Erzeugung von Peptiden einheitlicher Länge und Peptid-Fingerabdrücken der Proteolyse von Elastin durch dieses MMP12-Enzym identifiziert. Diese Peptide wurden dann gesammelt und über eine Reihe von Chromatographiesäulen aufgetrennt, um die Peptide zur Identifizierung zu isolieren. Die Peptide wurden dann als Atommasseneinheiten unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometriespektren identifiziert. Dabei wurde für jede Fraktion der säulengetrennten Peptide die Masse einer jeden Einheit sowie die Massenintensität einer jeden Einheit aufgezeichnet und in Datenbanken gespeichert. Zur Analyse des Profils von Atommasseneinheitsidentitäten aus allen mittels MS analysierten Fraktionen wurde ein statistisches Softwareprogramm verwendet. Eine Konsensus-Atommassenidentität wurde einem Satz von als Erkennungszeichen dienenden Elastinpeptiden, die mit dem enzymatischen Abbau durch MMP12 assoziiert sind, zugeordnet. Ein erster nicht inklusiver Satz aus 97 aus Elastin stammenden Peptiden, auch als Peptid-Fingerabdruck bekannt, ist in Tabelle 1 aufgeführt. Ein zweiter nicht inklusiver Satz aus 185 aus Elastin stammenden Peptiden, auch als Peptid-Fingerabdruck bekannt, ist in Tabelle 2 aufgeführt. Der in Tabelle 2 dargestellte Satz aus 185 Peptiden umfaßt den in Tabelle 1 dargestellten Satz aus 97 Peptiden.
In den Tabellen 1 und 2 sind die Identitäten von als Erkennungszeichen dienenden Peptiden aufgeführt, die sich als Referenzpunkte zur Entdeckung und/oder Identifizierung von Peptiden mit ähnlichen oder fast ähnlichen physikochemischen Eigenschaften in anderen komplexen Proteingemischen verwenden lassen. In den Tabellen sind die Identitäten von als Erkennungszeichen dienenden Peptiden aufgeführt, die sich als Referenzpunkte für die Entdeckung und/oder Identifizierung von Peptiden ähnlicher Charakteristik, die in menschlichen klinischen Proben vorliegen, verwenden lassen. Damit werden ferner die Identitäten von als Erkennungszeichen dienenden Peptiden bereitgestellt, die sich als Referenzpunkte für die Entdeckung und/oder Identifizierung der genauen Aminosäuresequenzidentität dieser selben Peptideinheiten verwenden lassen. Damit werden die Identitäten von als Erkennungszeichen dienenden Peptiden bereitgestellt, die sich als Referenzpunkte für die Entdeckung und/oder Identifizierung des Vorliegens, Fehlens und der relativen Häufigkeit einzelner Peptide oder beliebiger Gruppierungen dieser Peptide in klinischen Proben von gesunden Individuen oder Individuen mit klinischen Leiden, die mit dem Abbau von menschlichem Elastin assoziiert sind, und den nachfolgenden Gruppierungen von Individuen auf der Grundlage dieser Fingerabdrücke oder einer beliebigen Kombination der in diesen Proben vorliegenden Peptide verwenden lassen.
Experimentelle Vorgehensweise
Es wurde das folgende Verfahren verwendet. Ein in-vitro-MMP-12-Test wurde entwickelt, um Peptidanmerkungen anzufertigen, die direkt der MMP-12-Aktivität zugeordnet werden. Diese Anmerkungen repräsentieren Peptidmassen, die für den Abbau von menschlichem Elastin durch proteolytische Aktivität von menschlichem MMP-12 spezifisch sind und zur Erstellung von Signaturen von Peptid-Fingerabdrücken verwendet werden, die sich messen lassen und Signaturpeptidprofilen, die in sowohl gesunden Individuen als auch Individuen mit klinischen Leiden, wie etwa COPD, entnommenen Bioflüssigkeitsproben vorliegen, gegenübergestellt werden können. Andere elastinspezifische proteolytische Enzyme, wie etwa MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 und MMP14, produzieren separate und eigenständige Peptidprodukte von dem Elastinsubstrat. Der Test wird wie folgt durchgeführt; Elastin aus der menschlichen Lunge wird als Substrat im in-vitro-Testansatz mit menschlichem MMP-12 verwendet. Das unlösliche menschliche Elastin wird unter Verwendung eines 100 mM TRIS-HCL-Puffers, pH 7,5, mit 0,1 M NaCl und 10 mM CaCl2 gewaschen und dann zwischen wiederholten Waschschritten zentrifugiert. Anschließend werden 1,2 mg Elastin im Testpuffer 100 mM TRIS-HCL-Puffer, pH 7,5, mit 0,1 M NaCl und 10 mM CaCl2 und 60 μg menschlichem MMP-12 resuspendiert. Die Inkubation wurde 7 Stunden bei 37°C durchgeführt, wobei das Elastin durch das Enzym MMP12 abgebaut wurde. Der Proteolysevorgang wurde durch die Zugabe von Iodacetamid gestoppt.
Nach dem Verdau werden die Proben direkt analysiert oder bei –80°C im Gefrierschrank aufbewahrt. Die Proben wurden durch Auftauen von Proben bei Raumtemperatur analysiert, wobei ein Probenvorbereitungsschritt unter Verwendung eines Umkehrphasenpräparationsschritts durchgeführt wurde. Die Probe wurde dann aus der Präparation über einen Acetonitrilelutionsschritt auf die MALDI-TOF-Zielplatte eluiert. Nach Zugabe von Cyano-4-hydroxyzimtsäure (ACHA) als Matrix für die Kristallbildung wurde der Lauf am MALDI-TOF-Massenspektrometer durchgeführt, bei dem ein Peptid-Fingerabdruck der MMP12-Elastin-Abbauprodukte identifiziert und mit Anmerkungen versehen wurde.
Die spezifischen experimentellen Bedingungen, die zur Erzeugung von differentiell präsentierten Peptiden in menschlichen Urinproben von gesunden Individuen und COPD-Patienten verwendet wurden, wurden wie folgt erzeugt.
Die Urinbioflüssigkeit wurde von Individuen über normales Urinieren gewonnen und gesammelt und anschließend portionsweise bei –80°C eingefroren. Der gefrorene Urin wurde bei Raumtemperatur aufgetaut, der pH-Wert auf 2,5 mit Orthophosphorsäure eingestellt und der Urin für die HPLC-Trennungen aufgearbeitet. Die Urinproben wurden in ein zweidimensionales Chromatographiesystem eingeführt, bei dem der erste verwendete Trennmechanismus in einer Größenausschlußchromatographie bestand. Die Ausschußgrenze des Säulenmaterials wurde mit 15 kDa festgelegt. Die aus 1) dem Größenausschlußsäulentrennschritt erhaltenen Auftrennungen wurden on-line auf einen 2) Kationenaustauschsäulenschritt übertragen, bei dem die Peptide/Proteine aufgrund ihrer Ladung getrennt wurden. Diese Fraktionen wurden dann auf einen 3) Umkehrphasen-Säulentrennschritt übertragen, bei dem alle in der Probe vorliegenden störenden Matrixbestandteile ausgeschlossen wurden. Die Fraktionen der dritten Dimension wurden auf eine MALDI-Zielplatte mit einem Auftrageroboter punktförmig aufgetragen, womit die MALDI-Matrix zu den Peptid/Protein-Probenpunkten gegeben wurde. Als nächstes wurde die MALDI-Probenplatte in das MALDI-TOF-Massenspektrometergerät eingesetzt und bestrahlt, so daß Peptidfragmente entstanden, die dann gemäß der genauen Masse, Quantität und Isotopenauflösung eines jeden einzelnen MALDI-TOF-Peptidspektrums analysiert wurden.
Der durch MMP12-Verdauung unter Laborbedingungen erzeugte Elastinpeptid-Fingerabdruck, wie oben beschrieben, wird als Referenzerkennungszeichen zur Auffindung identischer oder fast identischer homologer Peptide in klinischen Bioflüssigkeiten verwendet.
Elastinpeptidfragmente bzw. der Elastinpeptid-Fingerabdruck werden bzw. wird im Urin eines Patienten mit chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) identifiziert. Bei diesem Patienten war zuvor im klinischen Rahmen COPD nachgewiesen worden. In diesem Beispiel zeigte der Patient anomale Atemfunktionstests, wie sich anhand einer niedrigen FEV1-Wertung („Score") zeigte. Ferner zeigte dieser Patient bei Verwendung der CT-Abbildungstechnik Hinweise auf eine pulmonale alveoläre Überblähung und Emphysem. Ferner zeigte dieser Patient bei der histologischen Untersuchung der Lunge und bei Verwendung eines Verfahrens zur Identifizierung von Elastinprotein im Lungengewebe durch Immunhistochemie mit einem gegen menschliches Elastin spezifischen und für ein Hexamerepitop von menschlichem Elastin und Tropoelastin spezifischen Antikörper Hinweise auf die Zerstörung von Elastinprotein im Parenchym der Lunge. Ferner zeigte dieser Patient histologische Hinweise auf Alveolitis und alveoläre Makrophagenanreicherungen in Bereichen der Lunge in unmittelbarer Nachbarschaft zu Elastinexpression und Elastinabbau. Ferner zeigte dieser Patient aufgrund von Immunhistochemie von Lungengewebeschnitten mit einem für einen Aktivierungsmarker, CD-68, spezifischen Antikörper histologische Hinweise darauf, daß die gleichen alveolär lokalisierten Makrophagen zur Expression von CD-68 im Gewebe aktiviert wurden. Ferner zeigte dieser Patient aufgrund von Immunhistochemie von Lungengewebeschnitten mit einem für menschliches MMP-12 spezifischen Antikörper histologische Hinweise darauf, daß die gleichen alveolär lokalisierten Makrophagen zur Expression von menschlichem MMP-12 im Gewebe aktiviert wurden. Bei diesem Patienten handelte es sich um ein Mitglied einer Gruppe von 20 untersuchten Patienten. Die oben beschriebenen erhaltenen Ergebnisse traten nicht allein nur bei diesem einen COPD-Patienten auf. Die oben beschriebenen erhaltenen Ergebnisse fanden sich häufig unter den 20 untersuchten COPD-Patienten.
Es wurde das folgende Verfahren verwendet:

1) Eine Bioflüssigkeitsprobe wurde einem gesunden Menschen entnommen; in diesem Beispiel wird als gesunder Mensch ein lebender Erwachsener im Alter von 20–80 ohne Krankheitssymptome, ohne ein gegenwärtiges klinisches Leiden, ohne Behandlung für ein klinisches Leiden mit Medikamenten oder verschriebenen Arzneistoffen, ohne Risikoverhalten für die Entwicklung einer Krankheit, wie z. B. Rauchen, Drogenmißbrauch, Alkoholismus, Übergewicht, oder ohne eine diagnostizierte genetische Veranlagung für eine Krankheit, die beispielsweise später im Leben eintritt, definiert. Bioflüssigkeit wird vorliegend als eine beliebige Probe von menschlichem klinischen Material in Lösungsform definiert. Diese kann beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Speichel, Spülungen, Tränenflüssigkeit, Urin, Samenflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, wäßrigen Humor, Waschungen von Höhlungen oder Nebenhöhlen, die lösliche Form von Gewebepräparationen, die lösliche Form von Organpräparationen oder Schweiß beinhalten. Die Proben können jeweils aus einem einzigen Individuum stammen oder Sammlungen von Einzelproben von mehreren Individuen darstellen. Im vorliegenden Beispiel handelt es sich bei der gesunden Bioflüssigkeit um Urin.
2) Die gesunde Urinprobe wurde analysiert, so daß ein gesunder Peptid-Fingerabdruck erhalten wurde; dabei wird analysiert beispielsweise als beliebige Kombination der Schritte Probenauswahl, -vorbereitung, -trennung, -identifizierung, Versehen mit Anmerkungen, Wiederauffinden gespeicherter Daten und Vergleiche von Daten aus dem Hauptteil der vorliegenden Anmeldung, den in der vorliegenden Anmeldung bereitgestellten Beispielen, den Ansprüchen der vorliegenden Anmeldung, definiert. Im vorliegenden Beispiel wird Fingerabdruck als ein identifizierbarer einmaliger Peptidbestandteil eines nativen Proteins und/oder als einer, der mit einem anderen identifizierbaren einmaligen Peptidbestandteil eines nativen Proteins kombiniert werden kann oder nicht, und/oder als die Gesamtsumme aller identifizierbaren einmaligen Peptide, die zusammen gruppiert werden können und zwar so, daß die Gruppierung selbst eine Einheit bildet, definiert. Identifizierbar wird hier als die Fraktion, Masse und Intensität einzelner Peptideinheiten definiert. Ferner wird die Masse als die einzigartige MS-Massenzuordnung eines identifizierbaren Einzelpeptids, die abgeleitete Masse gesammelter identifizierbarer Einzelpeptideinheiten und/oder die abgeleitete Masse gesammelter identifizierbarer Einzelpeptideinheiten in Kombination definiert.
3) Eine Bioflüssigkeitsprobe eines erkrankten Menschen wurde einem erkrankten Individuum entnommen. Erkrankt ist im vorliegenden Beispiel als eine erwachsene Person im Alter von 20–80 Jahren, mit oder ohne klinische Symptome oder Krankheitspräsentation und/oder mit einem klinischen Risikoverhalten für die Entwicklung einer Krankheit, wie beispielsweise Rauchen, Drogenmißbrauch, Alkoholismus, Übergewicht, mit oder ohne eine diagnostizierte genetische Veranlagung für eine Krankheit zu einem späteren Zeitpunkt im Leben definiert. Zum Beispiel Patienten mit einer klinischen Diagnose von COPD oder Patienten in Gefahr der Entwicklung von (COPD); Risiko für eine Krankheit wird hier beispielsweise als jemand definiert, der zur Zeit Tabak oder ein anderes medizinisches Kraut raucht, oder als eine Person, die irgendwann einmal geraucht hat, oder als eine Person, die geraucht hat und das Rauchen aufgegeben hat, unabhängig vom Zeitrahmen in Verbindung mit der Probennahme von diesem genannten Patienten für die Untersuchung. Weiter wird als in Gefahr für eine Krankheit eine beliebige Person definiert, die Mängel bei der Expression oder der Regulation der Expression von Alpha-1-Antitrypsin oder verwandten natürlich vorkommenden biochemischen Molekülen oder einer beliebigen oder beliebigen biologischen Einheit in Verbindung mit der Expression oder Funktion von Alpha-1-Antitrypsin oder verwandten natürlich vorkommenden biochemischen Molekülen zeigt. Bei dem erkrankten Individuum im vorliegenden Beispiel handelt es sich um eine Person, die Zeichen des Ausbruchs oder Fortschreitens von chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) zeigte. Ferner können vorliegend COPD-Patienten als Individuen charakterisiert werden, die unter Verwendung einer histologischen Analyse oder einer immunhistochemischen Analyse von Lungengewebeproben Elastinabbau zeigen. COPD-Patienten können hier ferner als Individuen charakterisiert werden, die unter Verwendung von Röntgenabbildung (HRCT, CT), histologischer Analyse oder immunhistochemischer Analyse von Lungengewebeproben Alveolitis, Luftwegsüberblähung oder Emphysem zeigen. Ferner können COPD-Patienten hier als Individuen charakterisiert werden, die unter Verwendung von Histologie und Immunhistochemie mit für den Nachweis von Produkten von durch aktivierte Makrophagen exprimierten Genen spezifischen Antikörpern Hinweise auf aktivierte Makrophagen in Lungengewebeproben zeigen. Im vorliegenden Beispiel zeigte der Patient entsprechende histologische Hinweise auf eine Vergrößerung des Lungenluftraums, Emphysem und Zerstörung pulmonaler Elastinintegrität. Ferner zeigte das Beispiel Hinweise auf aktivierte alveoläre Makrophagen in der Nähe von Stellen pulmonaler Elastinzerstörung. Kranke Bioflüssigkeit wird hier vorliegend als eine beliebige Probe menschlichen klinischen Materials in Lösungsform, die Patienten entnommen wurde, die die Kriterien der Krankheitsdefinition wie oben vollständig oder teilweise erfüllen, definiert. Dieses Material kann beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Speichel, Spülungen, Tränenflüssigkeit, Urin, Samenflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, wäßrigen Humor, Waschungen von Höhlungen oder Nebenhöhlen, die lösliche Form von Gewebepräparationen, die lösliche Form von Organpräparationen oder Schweiß beinhalten. Die Proben können aus Einzelpatienten stammen, oder es kann sich dabei um Sammlungen von Einzelproben aus mehreren Patienten handeln. Im vorliegenden Beispiel handelt es sich bei der Bioflüssigkeit um Urin.
4) Die kranke Probe wurde unter Erhalt eines kranken Peptid-Fingerabdrucks analysiert; im vorliegenden Beispiel wird Fingerabdruck als ein identifizierbarer einmaliger Peptidbestandteil eines nativen Proteins und/oder als einer, der mit einem anderen identifizierbaren einmaligen Peptidbestandteil eines nativen Proteins kombiniert werden kann oder nicht, und/oder als die Gesamtsumme aller identifizierbaren einmaligen Peptide, die zusammen gruppiert werden können und zwar so, daß die Gruppierung selbst eine Einheit bildet, definiert. Identifizierbar wird hier als die Fraktion, Masse und Intensität einzelner Peptideinheiten definiert. Ferner wird die Masse als die einzigartige MS-Massenzuordnung eines identifizierbaren Einzelpeptids, die abgeleitete Masse gesammelter identifizierbarer Einzelpeptideinheiten und/oder die abgeleitete Masse gesammelter identifizierbarer Einzelpeptideinheiten in Kombination definiert.

Zusammenfassung der experimentellen Vorgehensweise

1) Eine Bioflüssigkeitsprobe wurde einem gesunden Menschen entnommen;
2) die gesunde Urinprobe wurde unter Erhalt eines gesunden Peptid-Fingerabdrucks analysiert;
3) eine Bioflüssigkeitsprobe eines erkrankten Menschen wurde einem erkrankten Individuum entnommen;
4) die kranke Probe wurde unter Erhalt eines kranken Peptid-Fingerabdrucks analysiert;
5) der gesunde Peptid-Fingerabdruck wurde mit dem kranken Peptid-Fingerabdruck verglichen, um den Satz von Peptiden zu identifizieren, der sich nur im kranken Peptid-Fingerabdruck findet;
6) der in Schritt 5) identifizierte kranke Satz von Peptiden wurde mit dem Peptid-Fingerabdruck der in Schritt 8) produzierten Abbauprodukte verglichen.

Beschreibung der experimentellen Vorgehensweise
Die zur Erzeugung differentiell präsentierter Peptide in menschlichen Urinproben von gesunden Individuen und COPD-Patienten verwendeten spezifischen experimentellen Bedingungen wurden wie folgt erstellt:
Die Bioflüssigkeit wurde als Patientenprobe entnommen und anschließend portionsweise bei –80°C eingefroren. Der gefrorene Urin wurde bei Raumtemperatur aufgetaut, der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,5 eingestellt und der Urin für HPLC-Trennungen aufbereitet. Die Urinproben wurden in ein dreidimensionales Chromatographiesystem eingeführt, bei dem der erste verwendete Trennmechanismus in einer Größenausschlußchromatographie bestand. Die Ausschußgrenze des Säulenmaterials lag bei ungefähr 15 kDa. Die aus dem Größenausschlußsäulentrennschritt erhaltenen Auftrennungen werden im nächsten Schritt on-line auf einen Kationenaustauschsäulenchromatographieschritt übertragen, bei dem Peptide/Proteine aufgrund von Ladung getrennt wurden. Diese Fraktionen wurden dann auf einen Umkehrphasentrennschritt übertragen, bei dem alle in der Probe vorliegenden störenden Matrixbestandteile ausgeschlossen werden, wobei es sich hier um die dritte Trenndimension handelt. Die Fraktionen der dritten Dimension wurden auf eine MALDI-Zielplatte punktförmig mit einem Auftrageroboter aufgetragen, womit die MALDI-Matrix zu den Peptid/Protein-Probenpunkten gegeben wurde. Als nächstes wurde die MALDI-Probenplatte in das MALDI-TOF-Massenspektrometergerät eingesetzt und bestrahlt, so daß sich Peptidfragmente ergaben, die dann gemäß der genauen Masse, Quantität und Isotopenauflösung eines jeden einzelnen MALDI-TOF-Peptidspektrums analysiert wurden.
Tabellen
Tabelle 1 zeigt die MS-Atommasseneinheitsindentitäten von 97 aus MMP12-Verdauung und Trennung mittels Säulenchromatographie erhaltenen Elastinpeptiden. Tabelle 2 zeigt die MS-Atommasseneinheitsindentitäten von 185 aus MMP12-Verdauung und Trennung mittels Säulenchromatographie erhaltenen Elastinpeptiden. Zur Erzeugung der Peptidsätze wurden jeweils Fraktionen von Säuleneluaten, die die getrennten Peptide enthielten, auf MS aufgetragen, identifiziert, mit Anmerkungen versehen und anschließend zur statistischen Analyse in einer Datenbank abgelegt.
Figuren
In 1 und 2 sind zwei Beispiele dargestellt, bei denen die qualitativen und quantitativen Unterschiede zwischen den Peptid-Fingerabdrücken gesunder Individuen und von COPD-Patienten bestimmt wurden. Dargestellt sind jeweils Daten mutmaßlicher, in den Urinproben nachgewiesener Elastinpeptide. In 1A und 2A sind Beispiele für die in der Urinbioflüssigkeit von COPD-Patienten aufgrund aktiven MMP-12-Abbaus angetroffenen Peptide dargestellt, während 1B und 2B äquivalente Fraktionen von gesunden Individuen repräsentieren, die diese Peptide nicht aufweisen. Die Abwesenheitswerte für diese Peptide in den gesunden Individuen wurden auf die niedrigste Quantifizierungsstufe bezogen, die das MALDI-Instrument bietet.
In 1 ist das aus einer gegebenen Flüssigphasentrennfraktion erzeugte Massenspektrum dargestellt, wobei 1A den Peptid-Fingerabdruck in einer Harnfraktion von einem an COPD leidenden Menschen zeigt, 1B den Peptid-Fingerabdruck bei einem gesunden Individuum zeigt und 1C den Peptid-Fingerabdruck in einem Gemisch von MMP-12+Elastin nach 2,5 h Inkubation zeigt.
2 zeigt als weiteres Beispiel das aus einer gegebenen Flüssigphasentrennfraktion erzeugte Massenspektrum, wobei 2A den Peptid-Fingerabdruck in einer Harnfraktion von einem an COPD leidenden Menschen zeigt, 2B den Peptid-Fingerabdruck bei einem gesunden Individuum zeigt und 2C den Peptid-Fingerabdruck in einem Gemisch von MMP-12+Elastin nach 2,5 h Inkubation zeigt.
Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen das von einer gegebenen Flüssigphasentrennfraktion mit Peptiden mit einem eine spezifische gegebene chemisch-physikalische Eigenschaft aufweisenden Peptid erzeugte Massenspektrum. In 1A zeigt das erhaltene Massenspektrum das Vorliegen des Massenspitzenwerts von 1094,60 bei COPD-Patienten, das einem enzymatischen MMP-12-Produkt mit Elastin als Substrat entspricht. 1B veranschaulicht das erhaltene Massenspektrum von gesunden Freiwilligen, bei dem die Masse des Peptidspitzenwerts von 1094,60 nicht qualitativ von den Hintergrundsignalen zu unterscheiden ist. Diese Daten sind statistisch signifikant, wenn sie innerhalb der kranken und gesunden Patientengruppen verglichen werden.

2A zeigt, daß der einer Masse von 1285,7 entsprechende Peptidspitzenwert in einer menschlichen Urinfraktion von einem an COPD leidenden Patienten vorliegt. 2B zeigt, daß dieser Peptidspitzenwert im Massenspektrum des gesunden Individuums fehlt. Diese Daten sind statistisch signifikant, wenn sie innerhalb der kranken und gesunden Patientengruppen verglichen werden. TABELLE 1

Peptidnummer	Peptidmasse	Peptidnummer	Peptidmasse	Peptidnummer	Peptidmasse	Peptidnummer	Peptidmasse
1	772,4	28	1185,7	55	1379,6	82	1758,9
2	798,4	29	1193,6	56	1402,8	83	1762,9
3	802,4	30	1199,6	57	1424,8	84	1763,9
4	817,5	31	1216,6	58	1440,7	85	1770,0
5	823,4	32	1232,6	59	1455,8	86	1832,9
6	824,4	33	1237,6	60	1469,8	87	1840,0
7	865,4	34	1242,7	61	1477,8	88	1851,0
8	874,5	35	1254,7	62	1484,8	89	1885,0
9	878,5	36	1255,9	63	1505,8	90	1920,0
10	904,4	37	1262,6	64	1508,9	91	1929,8
11	937,5	38	1265,7	65	1519,8	92	1942,0
12	944,5	39	1285,7	66	1520,8	93	1998,1
13	951,5	40	1287,7	67	1524,8	94	2168,1
14	977,5	41	1291,7	68	1536,8	95	2367,2
15	1027,5	42	1296,7	69	1542,8	96	2620,3
16	1072,6	43	1298,7	70	1570,7	97	2823,5
17	1073,6	44	1299,7	71	1596,8
18	1089,5	45	1314,7	72	1599,8
19	1094,6	46	1320,8	73	1613,9
20	1107,6	47	1322,7	74	1644,8
21	1114,6	48	1331,7	75	1666,9
22	1137,6	49	1347,7	76	1670,9
23	1141,6	50	1352,7	77	1687,9
24	1142,6	51	1363,7	78	1696,9
25	1145,6	52	1368,8	79	1702,2
26	1155,6	53	1369,0	80	1706,8
27	1171,6	54	1370,7	81	1718,9

Schlüssel zu den Figuren:
Alle Figuren

y-Achse:
intensity – Intensität
x-Achse
mass – Masse

Claims

Peptid-Fingerabdruck, umfassend aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte, wobei der Peptid-Fingerabdruck wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt.
Peptid-Fingerabdruck nach Anspruch 1, der wenigstens neunzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt.
Peptid-Fingerabdruck nach Anspruch 1, der wenigstens einhundertfünfzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt.
Peptid-Fingerabdruck nach Anspruch 1, der alle in Tabelle 1 identifizierten Peptide umfaßt.
Peptid-Fingerabdruck nach Anspruch 1, der alle in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt.
Verfahren zur Bestimmung davon, ob das Enzym MMP12 mit der Krankheit Y assoziiert ist, bei dem man (a) eine gewonnene gesunde Bioflüssigkeits- oder Gewebeprobe zur Herstellung eines gesunden Peptid-Fingerabdrucks analysiert, (b) eine gewonnene kranke Bioflüssigkeitsprobe oder eine kranke Gewebeprobe, wobei die kranke Probe Anzeichen des Ausbruchs oder des Fortschreitens der Krankheit Y zeigt, zur Herstellung eines kranken Peptid-Fingerabdrucks analysiert, (c) den gesunden Peptid-Fingerabdruck mit dem kranken Peptid-Fingerabdruck vergleicht und den im kranken Peptid-Fingerabdruck gefundenen Satz von Peptiden identifiziert, (d) den in Schritt (c) identifizierten kranken Satz von Peptiden mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Peptid-Fingerabdruck, wobei der Peptid-Fingerabdruck ein oder mehrere der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt, vergleicht und ermittelt, ob statistisch signifikante Ähnlichkeiten oder Unterschiede zwischen ihnen bestehen, und zwar auf der Grundlage eines qualitativen und quantitativen Vergleichs unter Verwendung statistischer Formulierungen zum Testen von Zufallsereignissen, (e) falls signifikante Assoziationen zwischen den quantitativen und qualitativen Messgrößen in Schritt (d) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 mit der Krankheit Y in der analysierten Probe assoziiert ist, (f) falls keine signifikanten Assoziationen zwischen den quantitativen und qualitativen Messgrößen in Schritt (d) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 nicht mit der Krankheit Y in der analysierten Probe assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Krankheit Y um die chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) handelt.
Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), bei dem man (a) eine gewonnene Bioflüssigkeits- oder Gewebeprobe analysiert, um ihren Peptid-Fingerabdruck zu erhalten, (b) den in Schritt (a) identifizierten Peptid-Fingerabdruck der Probe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Peptid-Fingerabdruck, wobei der Peptid-Fingerabdruck ein oder mehrere der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt, vergleicht und ermittelt, ob statistisch signifikante Ähnlichkeiten zwischen ihnen bestehen, (c) falls statistisch signifikante Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß COPD vorliegt, (d) falls keine statistisch signifikanten Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß COPD nicht vorliegt oder erfolgreich behandelt wird.
Diagnostischer Testkit zur Bestimmung des Vorliegens von chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), der Mittel zum Vergleichen des Peptid-Fingerabdrucks einer Bioflüssigkeitsprobe oder des Peptid-Fingerabdrucks einer Gewebeprobe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Substrat-Fingerabdruck umfaßt, wobei der Kit einen wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfassenden Substrat-Fingerabdruck umfaßt.
Verfahren zur Analyse der Wirkung eines Arzneistoffs Z auf das Enzym MMP12, wobei man in dem Verfahren (a) eine aus einem an chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) leidenden Menschen oder nichtmenschlichen Tier gewonnene Bioflüssigkeitsprobe oder eine Gewebeprobe analysiert, um ihren Peptid-Fingerabdruck zu erhalten, wobei der Mensch bzw. das nichtmenschliche Tier jeweils bereits mit dem Arzneistoff Z vorbehandelt wurden, (b) den in Schritt (a) identifizierten Peptid-Fingerabdruck der Probe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Peptid-Fingerabdruck, wobei der Peptid- Fingerabdruck ein oder mehrere der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfaßt, vergleicht und ermittelt, ob statistisch signifikante Ähnlichkeiten zwischen ihnen bestehen, (c) falls statistisch signifikante Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 durch den Arzneistoff Z nicht gehemmt wird, (d) falls keine statistisch signifikanten Ähnlichkeiten in Schritt (b) ermittelt werden, den Schluß zieht, daß das Enzym MMP12 durch den Arzneistoff Z gehemmt wird.
Diagnostischer Testkit zur Analyse der Wirkung eines Arzneistoffs Z auf das Enzym MMP12, wobei der Kit Mittel zum Vergleichen des Peptid-Fingerabdrucks einer Bioflüssigkeitsprobe oder des Peptid-Fingerabdrucks einer Gewebeprobe mit einem aus dem Abbau von Elastin durch das Enzym MMP12 hervorgegangene Peptidprodukte umfassenden Substrat-Fingerabdruck umfaßt, wobei der Kit einen wenigstens zwanzig der in Tabelle 2 identifizierten Peptide umfassenden Substrat-Fingerabdruck umfaßt und wobei die Probe aus einem Menschen oder nichtmenschlichen Tier, der bzw. das mit dem Arzneistoff Z behandelt wurde oder wird, gewonnen wurde.