DE60212177T2

DE60212177T2 - Nukleinsäure-extraktion

Info

Publication number: DE60212177T2
Application number: DE60212177T
Authority: DE
Inventors: Matthew Maidstone BAKER; Matthew Sittingbourne TAYLOR; Shilpa Canterbury UPPAL
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2022-11-21
Also published as: EP1448774A1; DE60212177D1; US20050053941A1; GB0127809D0; WO2003046177A1; AU2002343040A1; ATE329021T1; EP1448774B1; JP2005510238A

Description

Anwendungsbereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Reinigung von Nucleinsäure und speziell auf ein Verfahren zur Gewinnung einer Probe von Target-Nucleinsäure aus Bakterienzellen, die die Target-Nucleinsäure und genomische DNA oder RNA enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Aktuelle Methoden zur Reinigung nichtgenomischer Nucleinsäuren, wie z.B. von Vektor-DNA oder RNA, beruhen auf umfassender/-m Cytolyse oder Zellwandabbau, um die in den Zellen vorhandene Nucleinsäure durch zelllysierende Enzyme, wie z.B. Lysozym, chaotrope Substanzen oder extreme(n) pH- und Hitze freizusetzen (siehe z.B. die von Maniatis beschriebenen Verfahren (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Book 1, Sections 1.21–1.23, Cold Spring Harbor Press (1989)). Bei diesem Ansatz wird zwar die nichtgenomische Nucleinsäure aus den Zellen freigesetzt, diese wird jedoch von der Mehrheit der anderen in der Zelle enthaltenen wirtsgenomischen Nucleinsäuren sowie anderen Verunreinigungen, wie z.B. zellulären Endotoxinen, begleitet. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit einer Reihe von schwierigen und zeitaufwändigen Reinigungsschritten, um Target-Nucleinsäuremoleküle von diesen Verunreinigungen zu reinigen. Diese Schritte sind notwendig, da die Freisetzung von RNA oder wirtschromosomaler DNA dann die nachfolgende Analyse oder die Funktionalität der Target-Nucleinsäure stören kann, sofern diese in der Target-Nucleinsäure-Probe vorhanden sind. Weitere, umfassende Cytolyse führt oft zur Bildung einer viskosen Masse aus Zellmaterial, was eine weitere Reinigung schwierig macht.
Calvin und Hanawalt (J. Bacteriol 170(6), 2796–2801 (1988)) beschreiben die Anwendung von Umkehr-Elektroporation zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus E. coli. Obwohl nach diesem Verfahren Plasmide gewonnen wurden, führten die meisten der getesteten Bedingungen auch zur Extraktion von zellulärer DNA und RNA. Um die Plasmide zu gewinnen, waren elektrische Felder mit einer Stärke von 13.000 bis 15.000 V/cm erforderlich.
WO 00/29563 (Cambridge Molecular Technologies Limited) beschreibt ein Verfahren zur Trennung von Plasmiden und genomischer DNA unter Verwendung eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, eines Chaotrops und von Erhitzen auf zumindest 65°C. Dies führte zur Extraktion der Plasmid-DNA in die organische Phase.
EP-A-0.657.530 (Gen-Probe Inc) offenbart ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäure aus Bakterienzellen mit einem permeabilisierenden Reagens, das ein nichtionisches Detergens und einen Metallchelatbildner, wie z.B. EDTA, enthält, in Kombination mit Erhitzen auf 80 bis 100°C.
Ein weiteres Problem ist, dass die Verfahren zur Reinigung einer Target-Nucleinsäure-Probe von den Verunreinigungen typischerweise verschiedene Zentrifugationsschritte erfordern und dass sich während der Reinigungsvorgänge das Volumen der Proben beträchtlich ändert. Diese Faktoren bedeuten, dass existierende Reinigungsprotokolle von technischem Personal durchgeführt werden müssen und nicht leicht zu automatisieren sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt allgemein ein Verfahren zum Erhalt einer Target-Nucleinsäure-Probe aus Bakterienzellen bereit, welche die Target-Nucleinsäure und genomische DNA oder RNA enthalten. Im Gegensatz zu Vorschriften nach dem Stand der Technik ist es bei diesem Verfahren nicht notwendig, die die Target-Nucleinsäure enthaltenden Zellen zu lysieren; stattdessen beruht es auf der Beobachtung, dass die Zellen nach Abtrennung von Kulturlösung oder -medium in einem wässrigen Medium resuspendiert werden können und dass die Target-Nucleinsäure durch die Zellwände in das wässrige Medium freigesetzt werden kann, ohne dass eine Cytolyse erforderlich ist. Mit der vorliegenden Erfindung kann in bevorzugten Ausführungsformen auf das Erhitzen, wie es in vielen Verfahren zur Nucleinsäureextraktion nach dem Stand der Technik eingesetzt wurde, verzichtet werden. Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders gut für die Trennung nichtgenomischer Nucleinsäure, wie z.B. zellulärer Vektor-DNA oder RNA, selbstreplizierender Satellitennucleinsäuren oder Plasmid-DNA, von genomischen Nucleinsäuren, wie z.B. Chromosomen und ribosomaler DNA der Wirtszellen.
Dementsprechend bietet die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Gewinnung einer Target-Nucleinsäure-Probe aus Bakterienzellen, welche die Target-Nucleinsäure und genomische Nucleinsäure enthalten, wobei Verfahren folgende Schritte umfasst:
Trennen der Zellen vom Kulturmedium;
Suspendieren der Zellen in einem wässrigen Medium, was dazu führt, dass die Target-Nucleinsäure aus den Zellen in das wässrige Medium austritt, worin das wässrige Medium Wasser, ein Puffer mit niedrigem Salzgehalt, eine Salzlösung, eine Lösung eines Salzes eines zweiwertigen oder dreiwertigen Metalls oder eine Zuckerlösung ist; sowie
Gewinnen der Nucleinsäure-Probe aus dem wässrigen Medium;
worin die Zellen während der oben genannten Schritte im Wesentlichen nicht lysiert werden und die genomische Nucleinsäure innerhalb der Zellen im Wesentlichen zurückhalten und worin das Verfahren bei einer Temperatur von weniger als 60°C und in Abwesenheit eines elektrischen Felds, das Zellporation verursachen kann, durchgeführt wird.
Das Verfahren verursacht vorzugsweise keine nennenswerte Freisetzung zellulärer Endotoxine und ermöglicht so die Trennung der Target-Nucleinsäure von den zellulären Endotoxinen, zusätzlich zu genomischer Nucleinsäure oder RNA.
Obwohl sich die Erfinder nicht auf eine bestimmte Theorie festlegen möchten, sind sie davon überzeugt, dass die Änderung der Umgebung der Zellen von den Bedingungen in der Kulturlösung zu den Bedingungen im wässrigen Medium, das typischerweise niedrigere Ionenstärke aufweist, die Zellwände für die Target-Nucleinsäure, speziell für Nucleinsäure wie etwa Vektoren, „durchlässig" oder leicht porös macht. Dies ermöglicht der Target-Nucleinsäure, in das wässrige Medium zu diffundieren, ohne die Zellen, z.B. durch Kontakt der Zellen mit Lysozym, Chaotropen oder extremem pH-Wert oder Erhitzen, lysieren zu müssen, mit dem Ergebnis, dass die Zellen Verunreinigungen wie etwa genomische DNA und Zellproteine zurückhalten und somit keine Notwendigkeit für komplizierte Verfahren besteht, um dieses Material aus einer Probe zu entfernen, die diese Verunreinigungen sowie die Target- Nucleinsäure enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Target-Nucleinsäuren 100 kb oder weniger, noch bevorzugter 50 kb oder weniger, noch bevorzugter 20 kb oder weniger, oder sogar noch bevorzugter 10 kb oder weniger, lang sein. Die Länge der Nucleinsäuren kann vom Fachmann beispielsweise mit Hilfe von Gelelektrophorese unter Verwendung eines Polyacrylamid- oder Agarosegels festgestellt werden, siehe z.B. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, (1992).
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „nicht nennenswert lysiert", dass vorzugsweise weniger als 20 %, noch bevorzugter weniger als 10 %, noch bevorzugter weniger als 5 %, noch bevorzugter weniger als 2 %, insbesondere weniger als 1 %, der Zellen der nach dem Verfahren behandelten Population lysiert werden. Das Ausmaß an Cytolyse ist leicht festzustellen, beispielsweise durch Zählen von in einer Probe enthaltenen lysierten und nichtlysierten Zellen unter einem Mikroskop.
Bei diesem Verfahren ist die Target-Nucleinsäure nichtgenomische Nucleinsäure, die von genomischer Nucleinsäure, die in den Zellen zurückgehalten wird, getrennt wird. Zu nichtgenomischer Nucleinsäure zählen Vektoren, Plasmide, selbstreplizierende Satellitennucleinsäure oder Cosmid-DNA oder Vektor-RNA. Andere Formen von Target-Nucleinsäuren können Bakteriophagen wie etwa Lambda und M13 sowie virale Nucleinsäuren umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der nichtgenomischen Nucleinsäure-Probe um Plasmid-DNA.
Das Verfahren ist auf viele verschiedene Arten von Bakterienwirtszellen allgemein anwendbar. Beispiele sind unter anderem gramnegative und grampositive Bakterien sowie Fadenbakterien. Die Verwendung von gramnegativen Bakterien wie etwa E. Coli-Stämmen, wird bevorzugt, z.B. die Stämme JM109 oder HB101.
Typischerweise werden die Zellen bei Umgebungstemperaturen zwischen 0 und 40°C behandelt. Im Gegensatz zu vielen Verfahren nach dem Stand der Technik werden in der vorliegenden Erfindung Temperaturen von weniger als etwa 60°C, noch bevorzugter von weniger als etwa 40°C, eingesetzt. Bevorzugte Temperaturbe reiche, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, liegen zwischen 0 und 60°C, zwischen 0 und 40°C, und insbesondere zwischen 15 und 40°C.
In der vorliegenden Erfindung kommen viele verschiedenen Bedingungen zum Herbeiführen der Freisetzung von Target-Nucleinsäure aus den Zellen in das umgebende wässrige Medium zur Anwendung. Beispiele für bevorzugte wässrige Medien sind unter anderem Wasser, Salze wie z.B. NaCl, unter hypotonischen oder hypertonischen Bedingungen. Zu den Beispielen für salzarme Puffer zählen Tris-HCl, z.B. bei einem pH-Wert von 6–9, gegebenenfalls zusammen mit EDTA, Kaliumsalze, wie z.B. Kaliumacetat, gegebenenfalls zusammen mit KCl, oder Salze zweiwertiger oder dreiwertiger Metalle, wie z.B. CaCl₂, vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 10 und 250 mM, noch bevorzugter zwischen 50 und 150 mM.
Alternativ oder zusätzlich kann auch eine Zuckerlösung verwendet werden, vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,05 und 1,0 M, noch bevorzugter zwischen 0,1 und 0,5 M. Eine bevorzugte Zuckerlösung ist dabei Saccharoselösung.
Gegebenenfalls können die wässrigen Medien zusätzlich eine Proteinase, wie z.B. Proteinase K, enthalten um die Ausbeute der Target-Nucleinsäure zu steigern. Speziell haben die Erfinder herausgefunden, dass die Aufnahme einer Proteinase zusammen mit dem Salz eines zweiwertigen oder dreiwertigen Metallions den Austritt der Target-Nucleinsäure aus den Zellen stark steigert. Die Verwendung von Proteinase K und CaCl₂ wird besonders bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das wässrige Medium ein salzarmer Puffer. Der salzarme Puffer enthält vorzugsweise Tris-HCl, gegebenenfalls in Kombination mit EDTA. In diesem Fall enthält der salzarme Puffer vorzugsweise 5 mM bis 50 mM Tris-HCl, insbesondere etwa 10 mM Tris-HCl. Falls EDTA enthalten ist, ist sie vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 0,1 mM und 100 mM, noch bevorzugter in einer Konzentration zwischen 0,1 und 50 mM, insbesondere in einer Konzentration von etwa 1 mM, enthalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der salzarme Puffer ein Kaliumsalz in einer Konzentration zwischen 10 mM und 30 mM, insbesondere in einer Konzentration von etwa 16 mM. Ein bevorzugter pH-Wert von Kaliumsalzlösungen liegt bei etwa pH 4.
Das wässrige Medium hat vorzugsweise einen pH-Wert zwischen pH 3 und 11, noch bevorzugter zwischen pH 6 und 9, insbesondere einen pH-Wert von etwa 8,5.
Etwas höhere Salzkonzentrationen können ebenso eingesetzt werden, beispielsweise bei Verwendung von wässrigen Medien, die Natriumchlorid enthalten, z.B. in einer Konzentration, die vorzugsweise zwischen etwa 50 mM und 250 mM, noch bevorzugter bei 150 mM, liegt: Ein bevorzugter pH-Wert von Natriumchloridlösungen liegt bei etwa pH 7. Die Salzlösungen oder wässrigen Medien können mit Standard-Laborpuffern wie etwa biologischen Puffern, z.B. MES, MOPS, HEPES, Acetatpuffern oder sogar Phosphatpuffern wie z.B. PBS gepuffert werden.
Das wässrige Medium kann ein Detergens, entweder allein oder in Kombination mit einer oder mehrerer der anderen, hier beschriebenen Komponenten umfassen. Beim Detergens handelt es sich vorzugsweise um ein nichtionisches Detergens, wie z.B. Tween 20, das die nachfolgende Verwendung der Target-Nucleinsäure, z.B. in Analyseverfahren, nicht hemmt. Das wässrige Medium kann weiters eine RNA-Nuclease oder eine DNA-Nuclease umfassen, um unerwünschte RNA- oder DNA-Targets aus einem Gemisch, das in das umgebende Medium freigesetzt wurde, selektiv abzubauen. Zusätzlich kann eine Protease verwendet werden um freigesetzte Proteine abzubauen.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, die rauen Bedingungen vieler Verfahren nach dem Stand der Technik zur Reinigung von Nucleinsäure zu umgehen. Wenn die Bedingungen verschärft werden, wird die Zellwand umfassend abgebaut und eine beträchtliche Menge an unerwünschten Nucleinsäuren wird freigesetzt. Beispiele für verschärfte Bedingungen sind unter anderem, jedoch nicht ausschließlich 0,1 M NaOH oder 0,1 M NaOH mit 1 % SDS. In einigen Fällen umfassen verschärfte Bedingungen die Verwendung von Temperaturen von 65°C oder höher und/oder die Verwendung von nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln und/oder den Einsatz von Elektroporation. Das Verfahren dieser Erfindung wird daher in Abwesenheit eines elektrischen Felds, durch welches Poration ausgelöst werden kann, z.B. bei einer Feldstärke über 10.000 V/cm, durchgeführt.
In manchen Ausführungsformen kann das Verfahren einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Schritte umfassen:

(a) Isolieren der Target-Nucleinsäure; oder
(b) Analysieren der Target-Nucleinsäure; oder
(c) Amplifizieren der Target-Nucleinsäure; oder
(d) Sequenzieren der Target-Nucleinsäure

Diese Schritte werden nachstehend detaillierter beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Target-Nucleinsäure, z.B. ein Plasmid, gemäß vorliegender Erfindung von den Zellen getrennt werden, und das resultierende wässrige Medium, d.h. der Überstand, kann ohne die Notwendigkeit weiterer Reinigungsschritte direkt eingesetzt werden, z.B. für PCR- oder andere Analyseverfahren.
Dem Fachmann stehen eine Reihe von Verfahren zur Reinigung von Nucleinsäure, die aus Zellen ausgetreten ist und im wässrigen Medium vorliegt, zur Verfügung. Zu den Beispielen für Reinigungsverfahren zählen unter anderem Ionenaustausch, Elektrophorese, Siliciumoxid-Festphasenextraktion mit chaotropem Salz, Fällung, Ausflockung, Filtration, Gelfiltration, Zentrifugation, Alkoholfällung und/oder die Verwendung eines Ladungsänderungs- ("charge switch"-, CS-) Materials, das in anhängigen Anmeldungen der Erfinder, d.h. in der Europäischen Patentanm. Nr. 98957019.7, in der US-Patentanmeldung Nr. 09/736.632 und in der WO 02148164 beschrieben werden, sowie andere nach dem Stand der Technik bekannte Reinigungs- oder Trennverfahren. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Target-Nucleinsäure mit einem Ladungsänderungsmaterial gereinigt, das beispielsweise auf einer Festphase, einer Pipettenspitze, Perlen (besonders Magnetperlen), einer porösen Membran, einer Fritte, einem Sintermaterial, einer Sonde oder einem Tauchstab, einem Röhrchen (PCR-Röhrchen, Eppendorfröhrchen) oder einem Mikroarray vorliegt. Ladungsänderungsmaterialien können feste Phasen oder löslich sein. Sie umfassen ionisierbare Gruppen, damit sie fähig sind, Nucleinsäure bei einem ersten pH-Wert (typischerweise zwischen pH 5,0 und 9,0) zu binden und dann bei einem zweiten, höheren pH-Wert (typischerweise unter 10,5) freizusetzen. Beispiele für Festphasen-Ladungsänderungsmaterialien sind jene, bei denen (1) die ionisierbaren Gruppen getrennt durch kovalente oder Ionenbindung oder durch Adsorption an einem festen Trägermaterial immobilisiert sind, (2) die ionisierbaren Gruppen getrennt an ein Polymer gebunden sind, das durch kovalente oder Ionenbindung oder durch Adsorption an einem Trägermaterial immobilisiert ist, (3) die ionisierbaren Gruppen, gegebenenfalls mittels Vernetzer, polymerisiert sind und das Polymer durch kovalente oder Ionenbindung oder durch Adsorption auf einem festen Trägermaterial immobilisiert ist. Die geladenen Gruppen im CS-Material können beispielsweise von einem biologischen Puffer bereitgestellt werden (zum Beispiel Tris, Bis-Tris, PolyTris oder PolyBis-Tris), von einm polyhydroxylierten Amin, ein Detergens oder Tensid, einem Kohlenhydrat, einer Nucleinsäurebase, einer stickstoffhältigen heterozyklischen Verbindung, einem Monoamin, einem biologischen Färbemittel oder von einer negativ ionisierbaren Gruppe, deren pKa etwa zwischen 3,0 und 7,0 liegt, und einem Metalloxid, das bei dem ersten pH-Wert sowie gegebenenfalls auch bei dem zweitem pH-Wert positiv geladen ist.
Die Target-Nucleinsäure kann ebenso Gegenstand von Amplifikation sein, wobei einfach Polymerasekettenreaktion genutzt wird. PCR-Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure werden im US-Patent Nr. 4.683.195 beschrieben. Im Allgemeinen erfordern solche Verfahren, dass Sequenzinformationen von den Enden der Target-Sequenz bekannt sind, um geeignete Vorwärts- und Rückwärts-Oligonucleotid-Primer zu erzeugen, die identisch mit oder ähnlich der Polynucleotidsequenz sind, die das Ziel der Amplifikation ist. PCR umfasst die Schritte der Denaturierung der Matrizen-Nucleinsäure (wenn diese doppelsträngig ist), des Anellierens von Primer und Target und der Polymerisation. Die mit Sonden untersuchte oder als Matrize in der Amplifi kationsreaktion verwendete Nucleinsäure kann genomische DNA, cDNA oder RNA sein. PCR kann verwendet werden, um spezifische Sequenzen genomischer DNA, spezifische RNA-Sequenzen sowie aus mRNA transkribierte cDNA, aber auch Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen zu amplifizieren. Literaturverweise bezüglich des allgemeinen Einsatzes von PCR-Verfahren sind unter anderem Mullis et al., Symp. Quant. Biol. 51, 263, Cold Spring Harbor (1987); Ehrlich (Hrsg.), PCR Technology, Stockton Press, NY, (1989); Ehrlich et al., Science 252, 1643–1650 (1991), Innis et al. (Hrsg.), „PCR protocols; A guide to Methods and Applications", Academic Press, New York (1990).
In manchen Ausführungsformen kann das Verfahren einen oder mehrere anfängliche Schritte umfassen, wie z.B.:
Züchten der Zellen in der Kulturlösung oder Kultivieren auf Selektivmedium auf Platten. Die Zellen/Kolonien werden getrennt und dann im wässrigen Medium angeordnet. Die Trennung kann durch Zentrifugieren, Filtration, Magnetperlen-Trennung oder unter Verwendung von Sonden oder Tauchstäben erfolgen.
In einer bestimmten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Züchten der Zellen in einer Kulturlösung oder einem Kulturmedium, das Trennen und Resuspendieren der Zellen im wässrigen Medium, um Durchlässigkeit der Zellen und damit das Freisetzen der Target-Nucleinsäure herbeizuführen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun – zur Veranschaulichung, nicht als Einschränkung – unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen genauer beschrieben.
Kurzbeschreibung der Figuren
Die 1 bis 5 zeigen die gemäß vorliegender Erfindung gereinigten Plasmid-DNA-Proben, die auf mit Ethidiumbromid eingefärbten Agarosegelen laufen gelassen wurden. Die Figuren wurden mit den Bedingungen beschriftet (Reagenzien und Konzentrationen), die für jede Reinigung eingesetzt wurden. Die Nucleinsäurebanden stam men alle von Plasmid-DNA, in superspiralisierter, geknickter oder linearer Form. Für genomische DNA wurden keine Banden festgestellt, was die Selektivität des Verfahrens der Erfindung zeigt.
Beispiel 1:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von JM109, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA mit pH 8,5 resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, was einen klaren Überstand, der das Plasmid enthielt, ergab. Eine Probe wurde zur PCR-Analyse entnommen, und das verbleibende Plasmid wurde gereinigt, indem der pH-Wert mit 166 μl eines 1,6 M Kaliumacetatpuffers auf 4 eingestellt wurde und danach 1 mg von mit positiv geladenen Gruppen derivatisierten Magnetperlen hinzugefügt wurde. Die Magnetperlen wurden 1 Minute lang inkubiert, um das Plasmid zu binden, auf einem Magneten abgetrennt, zweimal mit Wasser gewaschen und die DNA dann durch Elution mit 100 μl 10 mM Tris-HCl mit pH 8,5 gewonnen. Die Plasmidreinheit wurde durch Gelelektrophorese bestätigt und die Identität durch PCR und Sequenzierung bestätigt.
Beispiel 2:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von XL-1-Blue, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA mit pH 8,5 resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, was einen klaren Überstand, der das Plasmid enthielt, ergab. Eine Probe wurde zur PCR-Analyse entnommen, und das verbleibende Plasmid wurde gereinigt, indem der pH-Wert mit 166 μl eines 1,6 M Kaliumacetatpuffers auf 4 eingestellt wurde und danach 1 mg von mit positiv geladenen Gruppen derivatisierten Magnetperlen hinzugefügt wurde. Die Magnetperlen wurden 1 Minute lang inkubiert, um das Plasmid zu binden, auf einem Magneten abgetrennt, zweimal mit Wasser gewaschen und die DNA dann durch Elution mit 100 μl 10 mM Tris-HCl mit pH 8,5 gewonnen. Die Plasmidreinheit wurde durch Gelelektrophorese bestätigt und die Identität durch PCR und Sequenzierung bestätigt.
Beispiel 3:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von XL-1-Blue, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl Wasser resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, was einen klaren Überstand, der das Plasmid enthielt, ergab. Die Plasmidreinheit wurde durch Gelelektrophorese bestätigt und die Identität durch PCR bestätigt.
Beispiel 4:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von XL-1-Blue, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl 0,15 M NaCl resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, was einen klaren Überstand, der das Plasmid enthielt, ergab. Die Plasmidreinheit wurde durch Gelelektrophorese bestätigt und die Identität durch PCR bestätigt.
Beispiel 5:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von XL-1-Blue, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl 10 mM Kaliumacetat, 10 mM Kaliumchlorid mit einem pH-Wert von 4 resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, was einen klaren Überstand, der das Plasmid enthielt, ergab. Die Plasmidreinheit wurde durch Gelelektrophorese bestätigt und die Identität durch PCR bestätigt.
Beispiel 6:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von XL-1-Blue, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl 10 mM Tris-HCl, 1 % Tween 20, resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, was einen klaren Überstand, der das Plasmid enthielt, ergab. Die Plasmidreinheit wurde durch Gelelektrophorese bestätigt und die Identität durch PCR bestätigt.
Beispiel 7:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von XL-1-Blue, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl 10 mM Tris-HCl, 1 % Tween 20, resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen und der Überstand, der das Plasmid enthielt, zur direkten Analyse einer PCR-Reaktion zugeführt.
Beispiel 8:
Eine 5-ml-Übernachtkultur von JM109, der pUC19-Plasmid enthielt, wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, die dann in 500 μl 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH-Wert 8,5 plus 20 μg/ml RNase A, resuspendiert wurden. Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen zentrifugiert, was einen klaren Überstand, der das Plasmid enthielt, ergab. Eine Probe wurde zur PCR-Analyse entnommen, und das übrige Plasmid wurde gereinigt, indem der pH-Wert mit 166 μl eines 1,6 M Kaliumacetatpuffers auf 4 eingestellt wurde und danach 1 mg von mit positiv geladenen Gruppen derivatisierten Magnetperlen hinzugefügt wurde. Die Magnetperlen wurden 1 Minute lang inkubiert, um das Plasmid zu binden, auf einem Magneten abgetrennt, zweimal mit Wasser gewaschen und die DNA dann durch Elution mit 100 μl 10 mM Tris-HCl mit pH 8,5 gewonnen. Die Plasmidreinheit wurde durch Gelelektrophorese bestätigt.
Beispiel 9:
Eine Lösung von 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH-Wert 8,5, wurde mit Wasser auf die folgenden prozentuellen Konzentrationen (%) verdünnt: 100, 20, 15, 10 und 5. Dann wurden 5 × 1,5 ml Kulturlösung einer 200-ml-pUC19/XL1-Blue-Übernachtkultur zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde entfernt. Etwa 500 μl der Pufferkonzentrationsreihe wurden zusammen mit 5 μl Proteinase K (20 mg/ml) und 5 μl RNase A (5 mg/ml) zu den 5 Röhrchen hinzugefügt. Die 5 Proben wurden vollständig resuspendiert und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die Proben erneut zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen übergeführt, und das Pellet wurde verworfen. In jedes Röhrchen wurden 500 μl eines 1,5 M Kaliumacetatpuffers, pH 4 (KP), zusammen mit 40 μl CS-Magnetperlen hinzugefügt, und die Röhrchen wurden vollständig resuspendiert, 1 Minute lang inkubiert, auf einem Magnetgestell abgetrennt, zweimal gewaschen und in 50 μl Elutionspuffer (EP) eluiert. Wie in 1 gezeigt wird, wurden 10 μl jeder Probe auf einem 1 % Agarosegel, das mit Ethidiumbromid eingefärbt wurde, laufen gelassen.
Beispiel 10:
Saccharose wurde in den folgenden Konzentrationen (M) zubereitet: 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 und 0,1. 5 × 1,5 ml Kulturlösung einer 200-ml-pUC19/XL1-Blue-Übernachtkultur wurden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde entfernt. 500 μl des Saccharosekonzentrationen (M) wurden den 5 Röhrchen hinzugefügt. 5 μl Proteinase K und 5 μl RNase A wurden wie zuvor jedem Röhrchen hinzugefügt. Die 5 Proben wurden vollständig resuspendiert und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die Proben erneut zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen übergeführt, und das Pellet wurde verworfen. Es wurden 500 μl PB und 40 μl CST-Magnetperlen hinzugefügt, und die Röhrchen wurden vollständig resuspendiert, 1 Minute lang inkubiert, auf einem Magnetgestell abgetrennt, zweimal gewaschen und in 50 μl Elutionspuffer (EP) eluiert. 10 μl jeder Probe wurden auf einem 1 % Agarosegel, das mit Ethidiumbromid eingefärbt wurde, laufen gelassen, wie in 2 dargestellt.
Beispiel 11:
CaCl₂ in den folgenden Konzentrationen (mM) zubereitet: 200, 175, 150, 125 und 100. 5 × 1,5 ml Kulturlösung einer 200-μl-pUC19/XL1-Blue-Übernachtkultur wurden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde entfernt. Etwa 500 μl der CaCl₂-Konzentrationsreihe wurden den 5 Röhrchen zugesetzt. 5 μl Proteinase K und 5 μl RNase A wurden wie zuvor jedem Röhrchen hinzugefügt. Die 5 Proben wurden vollständig resuspendiert und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die Proben erneut zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen übergeführt, und das Pellet wurde verworfen. 500 μl PB und 40 μl CS-Magnetperlen wurden hinzugefügt, und die Röhrchen wurden vollständig resuspendiert, 1 Minute lang inkubiert, auf einem Magnetgestell abgetrennt, zweimal gewaschen und in 50 μl Elutionspuffer (EP) eluiert. 10 μl jeder Probe wurden auf einem 1 % Agarosegel, das mit Ethidiumbromid eingefärbt wurde, laufen gelassen, wie in 3 dargestellt.
Beispiel 12:
Um zu bestätigen, dass es sich bei der ausgetretenen DNA um pUC19-Vektorplasmid handelt, wurden 4 PCR-Reaktionen unter Verwendung von pUC19-Vektorprimern angesetzt, um ein 700-bp-PCR-Fragment zu amplifizieren. Zwei davon wurden unter Verwendung von aus Zellen ausgetretener, durch Extraktion erhaltener DNA angesetzt, und 2 wurden unter Verwendung einer pUC19-Probe aus Laborbeständen des Vektors angesetzt. 10 μl jedes Produkts wurden auf einem 1 % Agarosegel, das mit Ethidiumbromid eingefärbt wurde, mit einer 1-kb-Extensionsleiter laufen gelassen, wie in 4 dargestellt.
Beispiel 13:
Neun × 1,5 ml Kulturlösung einer 200-μl-pUC19/XL1-Blue-Übernachtkultur wurden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde entfernt. Die folgende 100-mM-CaCl₂-Volumsreihe (μl) wurde zu den 9 Proben hinzugefügt: 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 und 700. 5 μl Proteinase K und 5 μl RNase A wurden wie zuvor jedem Röhrchen hinzugefügt. Die 9 Proben wurden vollständig resuspendiert und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubiert. Nach 15 Minuten wurden die Proben erneut zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen übergeführt, und das Pellet wurde verworfen. 500 μl Fällungspuffer und 40 μl CST-Magnetperlen wurden hinzugefügt, und die Röhrchen wurden vollständig resuspendiert, für 1 Minute inkubiert, auf einem Magnetgestell abgetrennt, zweimal gewaschen und in 50 μl Elutionspuffer (EP) eluiert. 10 μl jeder Probe wurden auf einem 1 % Agarosegel, das mit Ethidiumbromid eingefärbt wurde, laufen gelassen, wie in 5 dargestellt.

Claims

Verfahren zur Gewinnung einer Target-Nucleinsäure-Probe aus Bakterienzellen, die die Target-Nucleinsäure und genomische Nucleinsäure enthalten, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Trennen der Zellen vom Kulturmedium; Suspendieren der Zellen in einem wässrigen Medium, was dazu führt, dass die Target-Nucleinsäure aus den Zellen in das wässrige Medium austritt, worin das wässrige Medium Wasser, ein Puffer mit niedrigem Salzgehalt, eine Salzlösung, eine Lösung eines Salzes eines zweiwertigen oder dreiwertigen Metalls oder eine Zuckerlösung ist; und Gewinnen der Nucleinsäureprobe aus dem wässrigen Medium; worin die Zellen während der oben genannten Schritte im Wesentlichen nicht lysiert werden und die genomische Nucleinsäure innerhalb der Zellen im Wesentlichen zurückhalten und worin das Verfahren bei einer Temperatur von weniger als 60°C und in Abwesenheit eines elektrischen Feldes, das Zellporation verursachen kann, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren bei einer Temperatur von unter 40°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin Zellproteine innerhalb der Zellen im Wesentlichen zurückgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die genomische Nucleinsäure chromosomale DNA oder ribosomale RNA der Wirtszellen ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Target-Nucleinsäure-Probe ein Vektor, ein Plasmid, Satelliten- oder Cosmid-DNA oder Vektor-RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Target-Nucleinsäure-Probe Plasmid-DNA ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zellen ein gramnegativer Mikroorganismus sind.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Zellen E. coli sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das wässrige Medium einen pH-Wert zwischen pH 6 und 9 aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Puffer mit niedrigem Salzgehalt Tris-HCl umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der Tris-HCl-Puffer eine Konzentration zwischen 5 mM und 50 mM aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin der Tris-HCl-Puffer weiters EDTA umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, worin der Tris-HCl-Puffer einen pH von etwa 8,5 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Puffer mit niedrigem Salzgehalt Kaliumacetat/KCl umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Kaliumacetat/KCl eine Konzentration zwischen 10 mM und 30 mM aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, worin das Kaliumacetat/KCl einen pH von etwa 4 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Salzlösung eine Natriumchloridlösung ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Natriumchloridlösung eine Konzentration zwischen etwa 50 mM und 250 mM und/oder einen pH von etwa pH 7 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Lösung zweiwertiger Metallionen eine CaCl₂-Lösung ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die CaCl₂-Lösung in einer Konzentration zwischen 10 und 250 mM vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Zuckerlösung eine Saccharoselösung ist und eine Konzentration zwischen 0,05 und 1,0 M aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das wässrige Medium weiters eine Proteinase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die Proteinase Proteinase K ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das wässrige Medium weiters ein Detergens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Detergens ein nichtionisches Detergens ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das wässrige Medium weiters eine RNA-Nuclease und/oder eine DNA-Nuclease und/oder eine Protease umfasst.
Verfahren, umfassend die Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1 bis 26 und einen weiteren Schritt der Reinigung der in der Target-Nucleinsäure-Probe enthaltenen Target-Nucleinsäure.
Verfahren, umfassend die Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1 bis 26 und einen weiteren Schritt des Isolierens der Target-Nucleinsäure-Probe.
Verfahren, umfassend die Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1 bis 26 und einen weiteren Schritt des Analysierens der Target-Nucleinsäure-Probe.
Verfahren, umfassend die Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1 bis 26 und einen weiteren Schritt des Amplifizierens der Target-Nucleinsäure-Probe.
Verfahren, umfassend die Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1 bis 26 und einen weiteren Schritt des Sequenzierens der Target-Nucleinsäure-Probe.
Verfahren nach Anspruch 28, worin das Isolieren der Target-Nucleinsäure mittels Ionenaustausch, Elektrophorese, Siliciumdioxid-Festphasenextraktion, Fällung, Ausflockung, Filtration, Gelfiltration, Zentrifugation, Alkoholfällung und/oder unter Verwendung eines Ladungswechselmaterials erfolgt.