DE60213432T2

DE60213432T2 - Verfahren und anlyse zur züchtung von organischen gewebekulturen

Info

Publication number: DE60213432T2
Application number: DE60213432T
Authority: DE
Inventors: University of Oxford J. T. TRIFFITT; University of Oxford Zhidao XIA; D.E.S. University of Oxford Hua YE; D.E.S. University of Oxford Zhanfeng CUI
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2001-09-11
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: GB0121986D0; ATE334189T1; DE60213432D1; US20040203147A1; EP1425379A2; WO2003022985A3; EP1425379B1; WO2003022985A2; JP2005502351A; AU2002324169A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Struktur zum Züchten von lebendem organischem Gewebe, wobei insbesondere ein Gerüst bereitgestellt wird, auf welchem Zellen des Gewebes eingeimpft werden können, und es wird eine Nährflüssigkeit bereitgestellt, um das Gewebe wachsen zu lassen.
Konstruiertes Gewebe involviert das Einimpfen von geeigneten Zellen in ein Gerüst (auch bekannt als Matrix), um ein Bio-Konstrukt zu bilden. Das Bio-Konstrukt wird dann unter definierten Bedingungen für einen bestimmten Zeitraum kultiviert. Insbesondere ist es bekannt kleine Abschnitte von Hautgewebe auf dieser Weise zu züchten.
Das Gewebe wird in einer allgemein planaren Form gezüchtet und in Nährflüssigkeit eingetaucht, so dass Nährstoffe und Sauerstoff zu allen Zellen des Gewebes diffundieren können.
Verschiedene Gerüst- oder Matrixtypen sind allgemein bekannt und schließen Collagengele ein. Um als Gerüst oder Matrix effektiv zu funktionieren, ist es essentiell, dass das Gerüst oder die Matrix die richtige Porosität und Oberfläche für das Anheften von Zellen hat. Wenn das Gerüst fibröser Natur ist, ist es wichtig, dass die Fasern einen relativ kleinen Durchmesser haben, so dass sie eine große Oberfläche bereitstellen, während sie ein relativ kleines Volumen einnehmen. Die Fasern werden dann mit einer Dichte/Porosität angeordnet, um das Anheften und Wachstum der Zellen zwischen den Fasern zu erlauben.
Es ist ebenfalls bekannt ein Gerüst bereitzustellen, in welchem die Fasern des Gerüsts selbst hohl sind, wobei sie die Diffusion von Nährflüssigkeit entlang des Inneren der Fasern zwischen den Zellen erlauben. Obwohl dies einige Vorteile gegenüber Gerüsten bietet, die feste Fasern benutzen, ist der Transport von Flüssigkeiten trotzdem relativ limitiert, so dass das Gewebe dennoch nur als eine allgemein laminare Blattlage gezüchtet wird.
Um ein Wachstum von Gewebe zu erlauben, das eine mehr dreidimensional-ähnliche Struktur hat, schlagen Dokumente, wie das US 4 661 458 und GB 2 178 447 A , vor, die zweidimensionalen Lagenstrukturen eine über der anderen anzuordnen. Werden jedoch Gerüstlagen auf dieser Weise erfordert, so ist die Konstruktion relativ kompliziert, und es bestehen beträchtliche Limitierungen in Bezug auf die gesamte Form und Gestalt des dreidimensionalen Gewebewachstums.
Das EP-A-1 152 053, das unter dem Artikel 54(3) EPC relevant ist, beschreibt ein Verfahren zur Produktion eines dreidimensionalen bio-künstlichen Gewebes, das lebensfähige Zellen in oder auf einer Matrix hat, und wodurch Zellen und Matrix in einem Gewebe oder einem Vorläufer eines Gewebes, einem vaskularisierten Gewebe aus biologischen Materialien, erhalten durch das Verfahren, kultiviert werden können, und einen experimentellen Reaktor für wissenschaftliche Zwecke und zur Produktion von klinisch verwendbaren Geweben und Organen. Ein Gefäß wird in das künstliche biologische Gewebe am Anfang dieser Produktion eingeführt. Es kann in die Matrix eingeführt werden bevor es mit den für das künstliche biologische Gewebe gewünschten Zellen geimpft wird. Ein Gefäß natürlichen Ursprungs von einem Menschen oder Tier kann als Gefäß verwendet werden. Es ist ebenfalls möglich, ein künstliches Gefäß zu verwenden, besonders eins von einem biologisch kompatiblen Polymeren.
Arnaout W.S. et al.: „Development of Bioartificial Liver: Bilirubin Conjugation in Gunn Rats" Journal of Surgical Research, Academic Press Inc., San Diego, CA, US, Band 48, Nr. 4, April 1990 (1990-04), Seiten 379-382, XP002954972 ISSN: 0022-4804 beschreibt eine bio-künstliche Leber unter Verwendung von Mikroträger-angehefteten Hepatozyten und eines Bioreaktors. Der Bioreaktor besteht aus einer intrakapillären Kammer aus porösen hohlen Cellulose-Acetat-Fasern, die in einem Polycarbonat-Modul eingeschlossen sind, das eine extrakapilläre Kammer bildet. Diese Kammer, die um die hohlen Fasern oder Kapillaren gebildet ist, ist mit Mikroträger-angehefteten Hepatozyten gefüllt.
Angesichts des Obengenannten ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Bereitstellung von konstruierten Gewebestrukturen zu ermöglichen, die andere gewünschte Gestalten und Größen haben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Züchten von lebendem organischem Gewebe bereitgestellt, das Folgendes beinhaltet:
freies Definieren eines Volumens mit der gewünschten Gestalt und Größe;
Vorsehen einer Vielzahl an Membrankapillaren entlang frei wählbarer Bahnen, mit denen das Volumen durchsetzt ist, wobei jede Membrankapillare eine jeweilige Membranwand einschließt, welche gegenüber Nährstoffen und Sauerstoff durchlässig ist, und welche einen inneren Durchgang für den Transport einer Nährflüssigkeit definiert, wobei die Membrankapillaren biologisch abbaubar oder biologisch resorbierbar sind;
Bilden eines Gerüsts in dem Volumen um die Vielzahl an Membrankapillaren herum, wobei das Gerüst für das Einimpfen von Gewebezellen und das Gewebewachstum geeignet ist;
Einimpfen von Zellen des Gewebes in das Gerüst; und
Vorsehen eines Nährflüssigkeitsstroms durch die Vielzahl an Membrankapillaren hindurch.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch eine Struktur zum Züchten von lebendem organischem Gewebe bereitgestellt, die Folgendes beinhaltet:
ein Gerüst, auf welchem Zellen des Gewebes eingeimpft werden können und auf welchem das Gewebe gezüchtet werden kann; und
eine Vielzahl an von dem Gerüst getrennten Membrankapillaren, wobei jede Membrankapillare eine jeweilige Membranwand beinhaltet, die einen inneren Durchgang zum Transport einer Nährflüssigkeit bzw. eines Nährstofffluids definiert, wobei die Mem branwände für Nährstoffe und Sauerstoff durchlässig sind und das Gerüst mit der Vielzahl an Membrankapillaren entlang frei gewählter Bahnen durchsetzt ist, sodass die Gestalt des Gerüsts frei gewählt sein kann, wobei das Gerüst mit der Vielzahl an Membrankapillaren durchsetzt ist, um so das Gewebe in die Lage zu versetzen, überall im Gerüst gezüchtet zu werden, wobei die Membrankapillaren biologisch abbaubar oder biologisch resorbierbar sind.
In dieser Hinsicht kann ferner eine Gewebestruktur bereitgestellt werden, die Folgendes beinhaltet:
lebendes organisches Gewebe; und
eine Vielzahl an künstlichen Membrankapillaren, wobei jede Membrankapillare eine jeweilige Membranwand beinhaltet, die einen inneren Durchgang zum Transport einer Nährflüssigkeit definiert, wobei die Membranwände für Nährstoffe und Sauerstoff durchlässig sind und das Gewebe mit der Vielzahl an Membrankapillaren entlang frei gewählter Bahnen durchsetzt ist, sodass die Gestalt des Gewebes frei gewählt sein kann, wobei das Gewebe mit der Vielzahl an Membrankapillaren durchsetzt ist, um so das Leben des Gewebes zu unterstützen, wobei die Membrankapillaren biologisch abbaubar oder biologisch resorbierbar sind.
In dieser Hinsicht kann das Gewebe auf einem Gerüst von jeder gewünschten Gestalt und Größe gezüchtet werden. Während die vorher bekannten dünnen Abschnitte von Hautgewebe im Wesentlichen als 2-dimensional betrachtet werden könnten, gemäß der vorliegenden Erfindung können im Gegensatz 3-dimensionale Gerüste und Gewebestrukturen bereitgestellt werden. Aufgrund der Membrankapillaren ist die Nährstoffversorgung der Zellen tief im Gewebekonstrukt nicht länger auf Diffusion durch das Gerüst von der äußeren Oberfläche limitiert. Das Blutzirkulations-Netzwerk, von dem natürliches Gewebe abhängt, ist normalerweise in konstruierten Geweben nicht vorhanden. Vorher war die Nährstoffversorgungsdiffusion zu Zellen innerhalb des Gewebes ein limitierender Faktor. Durch das Einbetten jedoch eines Membrankapillaren-Netzwerks in das Gerüst, so dass Zellen innerhalb des Gewebes mit Nährstoffen versorgt werden, können Gerüste und Gewebe mit jeder gewünschten Gestalt und Größe bereitgestellt werden. Ist das Gewebe einmal gezüchtet worden, so kann es in ein Tier oder einen Menschen, wie erforderlich, implantiert werden. Abhängig von den Anforderungen und der Applikation des Gewebes kann es so angeordnet werden, dass die Membrankapillaren sich abbauen oder absorbiert werden während ihres künstlichen Wachstums oder nachdem sie implantiert wurden.
Es ist ersichtlich, dass der Terminus Gewebe alle Formen von lebendem organischem Material zu decken beabsichtigt, wie Knorpel, Knochen, Blutgefäße, Mark, Muskeln, Nerven und Organe.
Vorzugsweise wird das Gerüst aus einer Vielzahl an Fasern oder Partikeln von relativ kleinem Durchmesser im Vergleich zu den Membrankapillaren gebildet.
In dieser Hinsicht stellt das Gerüst eine große Oberfläche und Struktur bereit, innerhalb welcher die Zellen eingeimpft und gezüchtet werden können, wobei die Membrankapillaren relativ große Kanäle für die Nährstoffe und für Sauerstoff bereitstellen. Als Resultat können Nährstoffe und Sauerstoff tief in das Gerüst getragen werden, so dass das Züchten von Gewebe erlaubt wird, das relativ dick ist.
In dieser Hinsicht können das Gerüst und/oder das Gewebe eine relativ große Ausdehnung in drei jeweils zueinander orthogonalen Richtungen haben.
Natürlich können die Membrankapillaren relativ langen Durchmessers von Membrankapillaren kleineren Durchmessers begleitet sein, die sich der Größe der physiologischen Kapillaren nähern, welche mit ihnen verbunden sind.
Vorzugsweise sind die Membrankapillaren nicht gezwungen, Bahnen innerhalb laminarer Blattlagen zu folgen. In dieser Hinsicht deckt der Verweis auf laminare Blattlagen beides, planare und gekrümmte Lagen.
Gemäß bekannter Techniken hängt die Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff von der Diffusion durch einer relativ dünnen Gerüstlage oder entlang der Fasern relativ kleinen Durchmessers, die das Gerüst ausmachen, ab. Es ist nur möglich, eine Struktur zu bilden, die als dreidimensional betrachtet werden könnte, indem diese Lagen gerollt werden oder die Lagen eine über der anderen bereitgestellt werden.
Dort wo gemäß der Erfindung die Membrankapillaren entlang frei gewählter Bahnen liegen und sie nicht gezwungen sind, Bahnen innerhalb laminarer Blattlagen zu folgen, kann das Gerüst und das Gewebe in jeder gewünschten Gestalt gebildet werden.
Vorzugsweise wird mindestens eine Membrankapillare vorgesehen, einer Bahn zu folgen, die weder in noch parallel zu der laminaren Blattlage ist, in welcher die Bahn einer anderen der Membrankapillaren liegt.
Mit anderen Worten haben die Membrankapillaren nicht der bekannten Lagenstruktur zu folgen. Dort wo eine Kapillare in einer bestimmten Richtung ist, die in einer laminaren Blattlage liegend angesehen werden kann, kann eine andere Membrankapillare einer Bahn in einer nicht in Zusammenhang stehenden Richtung folgen, zum Beispiel schräg zur ersten Kapillare. Folglich ist große Flexibilität in den Bahnen der Kapillaren vorhanden, und folglich in der Gestalt des Gerüsts und Gewebes, die von den Membrankapillaren bedient werden können.
Vorzugsweise wird mindestens eine Membrankapillare entlang einer gewundenen Bahn bereitgestellt, die nicht innerhalb einer laminaren Blattlage gezwungen ist.
Mit anderen Worten kann jede Membrankapillare jeder gewünschten Bahn durch das Gerüst und Gewebe folgen und braucht nicht einer Lagenstruktur zu folgen, wie es vorher der Fall war.
Vorzugsweise wird die Mehrzahl der Membrankapillaren mit omnidirektionalen Bahnen bereitgestellt.
Somit kann jede der Kapillaren eine Bahn haben, die ausschließlich von den Bedürfnissen des Gewebes, das sie zu unterstützen haben, bestimmt wird.
Membrankapillaren mit verschiedenen Durchmessern können in derselben Struktur verwendet werden.
Vorzugsweise wird im Verfahren des Züchtens des lebenden organischen Gewebes das Volumen durch Wählen einer gewünschten Gestalt und Größe für eine Form definiert.
Folglich wird für jede Gestalt und Größe von Gewebe, die erforderlich ist, eine geeignete Form gebildet.
Vorzugsweise schließt das Verfahren den Schritt der Bereitstellung der Vielzahl an Membrankapillaren in der Form ein.
Somit, wenn die Gestalt und Größe von erforderlichem Gewebe bestimmt worden ist und eine geeignete Form bereitgestellt worden ist, können die Membrankapillaren innerhalb der Form entlang von Bahnen positioniert werden, die geeignet sind, um das Wachstum des Gewebes in seinem ganzen Volumen zu unterstützen.
Vorzugsweise wird das Gerüstmaterial in die Form um die Vielzahl an Membrankapillaren herum eingeführt.
Das Gerüst wird somit in der gewünschten Gestalt der Form gebildet, wobei die Membrankapillaren dieses mit dem gewünschten Abstand und Muster durchsetzen. Es ist möglich, Zellen mit dem Gerüstmaterial zu mischen, bevor es in die Form eingeführt wird. Auf dieser Weise durchsetzen die Zellen leicht und vollständig das ganze Gerüst, bevor Wachstum begonnen hat.
Vorzugsweise sind wenigstens einige der Membrankapillaren an gegenüberliegenden Enden offen, sodass jede davon einen Durchgang für einen Nährflüssigkeitsstrom durch das Gewebe hindurch vorsieht, sodass Nährflüssigkeit das Gewebe mit Nährstoffen versorgt.
Auf dieser Weise tragen Membrankapillaren Nährflüssigkeit durch das Gewebe. Frische Flüssigkeit tritt an einem Ende rein, während Flüssigkeit, aus der Nährstoffe zu den Zellen diffundiert sind, am anderen Ende austritt.
Wenigstens einige der Membrankapillaren können an einem Ende blockiert werden, sodass Nährflüssigkeit dem offenen Ende zugeführt werden kann, um so das Gewebe mit Nährstoffen zu versorgen.
Auf dieser Weise fließt Nährflüssigkeit nicht durch die Membrankapillaren, wird aber in den Membrankapillaren bereitgestellt, fließt innerhalb der Kapillaren in das Gewebe und wird dann durch die Kapillarwände in die Gewebezellen verteilt.
Wenigstens einige der Membrankapillaren können an beiden Enden blockiert sein.
Auf dieser Weise stellt die Flüssigkeit innerhalb der Kapillaren eine Diffusionsbahn von kleinerem Widerstand bereit.
Wenigstens einige der Vielzahl an Membrankapillaren können Membranen haben, die gegenüber metabolischen Abfallprodukten durchlässig sind und für das Abtransportieren von Flüssigkeit, die metabolische Abfallprodukte enthält, aus dem Gewebe geeignet sein können.
Auf dieser Weise können, dort wo Nährflüssigkeit von einem Ende einer Membrankapillare zum gegenüberliegenden Ende fließt, Nährstoffe diffundieren und aus der Flüssigkeit sich in umliegenden Zellen des Gewebes verteilen, während metabolische Abfallprodukte in der Flüssigkeit absorbiert werden können, und folglich aus der Membrankapillare extrahiert und beseitigt werden können.
Eine zusätzliche Vielzahl an Membrankapillaren kann bereitgestellt werden, die Membranen haben, die gegenüber metabolischen Abfallprodukten durchlässig sind, und welche das Gerüst durchsetzen, so dass sie metabolische Abfallflüssigkeit aus dem Gewebe abtransportieren.
Folglich können Membrankapillaren vorgesehen sein, metabolische Abfallprodukte auf derselben Weise zu entfernen, in der Membrankapillaren positioniert sind, um Nährstoffe zu liefern.
Wenigstens einige der zusätzlichen Vielzahl an Membrankapillaren können an einem der gegenüberliegenden Enden blockiert sein, sodass metabolische Abfallflüssigkeit aus dem Gewebe über die offenen Enden abgeführt werden kann.
Dies ist besonders anwendbar dort wo Membrankapillaren mit blockierten Enden bereitgestellt werden, um Nährstoffe zu liefern. Insbesondere stellt ein Set von Membrankapillaren Nährstoffe den Zellen bereit, und ein anderes Set von Membrankapillaren extrahiert metabolische Abfallprodukte aus den Zellen.
Die Struktur zum Züchten des organischen Gewebes kann mit einem Abfallprodukt-Extraktor zum Abführen von metabolischer Abfallflüssigkeit aus der zusätzlichen Vielzahl an Membrankapillaren bereitgestellt werden.
In entsprechender Weise kann die Struktur eine Nährflüssigkeitsversorgung zur Bereitstellung von Nährflüssigkeit zu den Membrankapillaren einschließen.
Die Membrankapillaren können aus jedem geeigneten Material aufgebaut sein, zum Beispiel wie Polymilchsäure (PLA), Polyglykolsäure (PGA), Polymilchsäure-co-glykolsäure (PLGA) oder Polycaprolacton.
Vorzugsweise sind die Membrankapillaren aus porösen Wänden mit Poren, zum Beispiel sind sie aus einem Material mit Poren aufgebaut, die mit dem fortschreitenden Abbau der Membrankapillaren an Größe zunehmen, um so für eine erhöhte Zufuhr von Nährflüssigkeit zu dem Gewebe zu sorgen.
Auf dieser Weise, während die Kultur fortschreitet und sich die Zelldichte innerhalb des Gewebes erhöht, wird die größere Porengröße einen höheren Transport von Nährstoffen zum Gewebe erlauben, und damit helfen, den erhöhten Bedarf an Nährstoffen zu decken.
Vorzugsweise können Endothelzellen mit gewünschter biochemischer Signalgebung in die Membrankapillaren eingeführt werden, um das Wachstum von Blutgefäßen an Stelle der Membrankapillaren zu stimulieren.
Normalerweise, aber nicht ausschließlich, können diese Endothelzellen zu einem späteren Stadium eingeführt werden.
Die Endothelzellen haften innerhalb der Membrankapillaren und wachsen selbst anfänglich, um eine Einzellage zu bilden. Somit werden die Membrankapillaren mit fortschreitendem Abbau vom Wachstum von Blutgefäßen ersetzt.
Natürlich wird das Wachstum von Gewebe in die Volumina, die von den Membrankapillaren eingenommen werden, wenn sie einmal abgebaut/absorbiert worden sind, relativ langsam sein, und folglich werden die resultierenden Kanäle den Fluss von Nährflüssigkeit erlauben. Somit ist es auch möglich, die Gewebestruktur zu implantieren und Blutgefäßen zu erlauben, sich nach der Implantation natürlich zu entwickeln.
Vorzugsweise sind die Membrankapillaren im Wesentlichen zwischen 10 μm und 2 mm im Durchmesser, noch bevorzugter 0,1 mm und 1 mm.
Auf dieser Weise sind die Kapillaren von ausreichender Querschnittsfläche, um einen guten Fluss von Flüssigkeit zu tragen, und nehmen dennoch keine übermäßige Menge an Volumen in der Gewebestruktur ein. Für Organwachstum können Durchmesser von bis zu 5 mm nötig sein, aber für anderes Gewebewachstum können Durchmesser von bis zu 2 mm ausreichend sein.
Vorzugsweise werden die Membrankapillaren im Wesentlichen nicht mehr als 5 mm Abstand voneinander haben.
Es ist ersichtlich, dass Nährstoffe und metabolische Abfallprodukte zwischen den Zellen und den Membrankapillaren diffundieren müssen. Folglich, wenn die Zellen zu weit von einer Membrankapillare entfernt sind, wird ein nicht-ausreichendes Empfangen von Nährstoffen und Entfernen von Abfallprodukten vorhanden sein.
Vorzugsweise werden die Membrankapillaren mit angrenzenden jeweiligen Wänden nicht näher als 0,5 mm voneinander sein.
Vorzugsweise verlaufen wenigstens einige der Membrankapillaren durch das Gerüst hindurch parallel zueinander.
Somit können die Kapillaren in einer geordneten Reihe durch das Gewebe angeordnet werden, zum Beispiel zwischen zwei entgegengesetzten Seiten des Gewebes verlaufend.
Alternativ dazu können wenigstens einige der Membrankapillaren auf Umwegen über jeweilige Bahnen durch das Gerüst verlaufen.
Auf dieser Weise können die Membranen Gestalten des Gewebes folgen, und an beliebigen Punkten starten und enden, was das Gewebe betrifft. Die Umwege der Bahnen können Teil einer organisierten Gesamtform sein, oder können zufällig innerhalb des Volumens des Gewebes sein. Unberücksichtigt, um dem Gewebe geeignete Lebensunterstützung bereitzustellen, sollte kein Teil des Gewebes um mehr als eine vorbestimmte Entfernung von einer Membrankapillare entfernt sein. Dies könnte erreicht werden durch Anordnen der Membrankapillaren in einer vorbestimmten organisierten Art und Weise, oder durch die Bereitstellung ausreichender Anzahl/Längen von Membrankapillaren, so dass die Mindestentfernung erreicht wird.
Die Erfindung wird klarer verstanden werden durch die folgende Beschreibung, die in beispielhafter Weise gegeben wird, mit Hinweis auf die begleitenden Zeichnungen, in welchen:
die 1 eine Form für eine Struktur, gemäß der vorliegenden Erfindung, schematisch darstellt;
die 2 einen Querschnitt durch die zusammengesetzte Form aus der 1 darstellt;
die 3 ein Bio-Konstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung, darstellt, das aus der Form der 1 produziert wurde;
die 4 die Struktur eines Typus von Gerüst darstellt;
die 5 eine Membrankapillare zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung darstellt;
die 6 eine Anordnung von Membrankapillaren in einer Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
die 7 eine Anordnung von Membrankapillaren in einer Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
die 8 eine Anordnung von Membrankapillaren in einer Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
die 9 eine Anordnung von Membrankapillaren in einer Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
die 10 eine Anordnung von Membrankapillaren darstellt, die in einer Struktur an beiden Enden blockiert sind, gemäß der vorliegenden Erfindung;
die 11 zwischenverbundene Membrankapillaren in einer Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
die 12 ein Gesamtsystem zum Züchten lebender organischer Gewebe darstellt; und
die 13 einen Bioreaktor schematisch darstellt;
die 14 einen Bioreaktor darstellt, der für Experimente verwendet wurde;
die 15 ein Bioreaktor-Perfusionssystem darstellt;
die 16 Alamar-blue-Assay-Ergebnisse darstellt;
die 17 Lactat-Produktionsergebnisse darstellt;
die 18 pH-Wert-Ergebnisse darstellt;
die 19(a) und 19(b) CO₂- und O₂-Partialdruck-Ergebnisse darstellen;
die 20(a) bis 20(d) Konzentrationsergebnisse von K+, Na+, Ca++ und Cl– darstellen;
die 21 Färbungsergebnisse von lebenden/toten Zellen darstellt; die 22(a) bis 22(d) H & E-Färbung von geernteten Zellen und Gewebe darstellt; und
die 23 SEM-Bilder darstellt.
Es ist bereits bekannt Gerüste bereitzustellen, in welchen Zellen eingeimpft werden können, um so ein Bio-Konstrukt zu bilden, das unter vordefinierten Bedingungen kultiviert werden kann. Solche Gerüste werden zum Beispiel in R. C. Thompson et al., Polymer, Scaffold Processing; Principle of Tissue Engineering 2te Ausgabe, herausgegeben von R.L. Lanza, R. Langer und J. Vacanti (2000) beschrieben.
Mit einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein geeignetes Polymermaterial, vorzugsweise biologisch abbaubar oder biologisch resorbierbar und mit einer Abbau-/Adsorptionsrate gemäß der Anforderungen des Benutzers gewählt, in einer Lösung bereitgestellt, die in eine Form gegossen werden kann. Die Lösung fährt fort ein Gel zu bilden, indem ein poröses zwischenverbundenes Netzwerk gebildet wird, innerhalb dessen Gewebe gezüchtet werden kann.
Wie in der 1 schematisch dargestellt, können während des Formungsungsstadiums Membrankapillaren 2 durch die Form bereitgestellt werden, in diesem Fall bereitgestellt durch die zwei Abschnitte 4 und 6.
Die 2 ist ein Querschnitt durch die zusammengesetzte Form aus der 1, entlang einer der Membrankapillaren 2. Wie durch den Pfeil dargestellt, kann das Material für das Gerüst durch die Formöffnung 8 bereitgestellt werden.
Als Resultat kann ein Gerüst 10, wie in der 3 dargestellt, bereitgestellt werden, das eine Anzahl von Membrankapillaren 2 hat, die es durchqueren. Die Kapillaren 2, die unten weiter beschrieben werden, sind durchlässig für Nährstoffe und Sauerstoff. Folglich können durch das Bereitstellen, zum Beispiel durch Pumpen, von Nährflüssigkeit durch die Kapillaren 2 von einem Ende zum anderen, Nährstoffe ins innere Volumen des Gerüsts 10 bereitgestellt werden. Wie dargestellt, ist das Gerüst 10 von der Form 4, 6 entfernt worden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass es nicht notwendig ist, das Gerüst von der Form zu entfernen. Die Form könnte selbst einen Teil des „Bioreaktors" bilden, um das Gel zu halten und weiter das Gewebewachstum zu unterstützen.
Wie oben beschrieben, bildet das Gerüst 10 eine Struktur aus einem porösen zwischenverbundenem Netzwerk. Dieses ist schematisch in der 4 dargestellt. Die Stränge 12, welche die zwischenverbundene Struktur bilden, haben relativ kleine Durchmesser und lassen Abstände frei, in welchen Zellen 14 eingeimpft werden können. Insbesondere bieten die Stränge 12 Unterstützung für die eingeimpften Zellen 14, und die Zellen 14 sind dann in der Lage, sich zu teilen und zu wachsen, unterstützt durch die Struktur des Gerüsts.
Gemäß vorheriger Techniken ist die Versorgung der Zellen 14 mit Nährstoffen auf den Fluss von Nährstoffen durch die Struktur oder, sofern hohle Gerüstfasern verwendet werden, den relativ schmalen Bahnen, die von den Gerüstfasern bereitgestellt werden, angewiesen. Es wird jedoch natürlich für größere Volumen von Gewebe, in denen die Zellen die Struktur füllen, für ausreichende Nährstoffe unmöglich, ihren Weg zu den Zellen zu finden und entlang der erforderlichen Entfernungen zu diffundieren. Die Membrankapillaren 2 stellen Kanäle für Flüssigkeiten in zentralen Regionen des Gerüsts und Gewebes bereit.
Die Membrankapillaren selbst sind durchlässig für Nährstoffe, so dass die Nährstoffe sich vom Inneren der Kapillare zu den Zellen des Gewebes und von einem Ort zu einem anderen bewegen können.
Die 5 stellt eine Kapillare schematisch dar, die porös ist. Nährflüssigkeit kann in die Kapillare 2 hinein bereitgestellt werden, wie durch den Pfeil dargestellt, so dass Nährstoffe durch Poren 16 der Kapillarenwand 18 diffundieren (oder sogar gepumpt werden) können. Die Membrankapillaren 2 können selbst einen Teil des Gerüsts für das Gewebe bilden, so dass Zellen des Gewebes auf der äußeren Oberfläche der Kapillaren 2 wachsen. In dieser Hinsicht können natürlich Nährstoffe aus den Poren 16 fließen, aber die Gewebezellen können nicht in der Kapillare 2 durch die Poren 16 wachsen, aufgrund der relativen Größe der Zellen und der Poren. Vorzugsweise starten wenigstens die Poren mit Querschnitten von weniger als 1 μm, oder tatsächlich 0,1 μm.
In einigen Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, dass die Zellen sich nicht selbst auf den Membrankapillaren 2 einimpfen oder wachsen. Dies macht es einfacher die Kapillaren wenn nötig zu entfernen.
Für Laborarbeit, wobei die Membrankapillaren im Gewebe eingebettet bleiben können, ist es möglich, nicht-biologisch-abbaubare und biologisch verträgliche Materialien für die Kapillaren 2 zu verwenden. Geeignete Materialien für die Kapillaren schließen Polysulfone und Polyethersulfone ein. Sofern das Gewebe in einem tierischen oder humanen Körper implantiert werden soll, wird es natürlich bevorzugt, wenn nicht benötigt, dass die Membrankapillaren 2 vom Gewebe entfernt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dies durch Konstruieren der Membrankapillaren aus biologisch abbaubaren Materialien erreicht. Beispiele für solche Materialien schließen Polymilchsäure (PLA), Polyglykolsäure (PGA) und Polycaprolacton ein. Tatsächlich sind hohle PLA-Fasern bekannt aus dem Chinese J Reparative and Reconstructive Surgery, 2000 Band 14(2), Seite 40, Materials Fabrication of Tissue Engineered Peripheral Nerve in Vitro/WANG Guang-lin, YANG Zhi-ming, XIE Hui-qi et al.
Die Produktion der Kapillaren mit geeigneter Durchlässigkeit aufgrund der Porengrößen, kann unter Anwendung bekannter Techniken und Anpassen der Größen der Kapillaren und der Poren entsprechend der Anforderungen des Gewebewachstums erreicht werden.
Die Materialeigenschaften der Kapillarmembranen 2 können ebenfalls angepasst werden, um im Grad des biologischen Abbaus zu variieren. In dieser Hinsicht ist es ersichtlich, dass das Wachstum größerer Gewebestrukturen längere Entwicklungsperioden erfordern wird. In diesem Fall wird es erforderlich sein, dass die Membrankapillaren über längere Perioden intakt bleiben werden. In entsprechender Weise kann in einigen Applikationen ein Anwender fordern, dass die Membrankapillaren 2 bis nach der Implantation der Gewebestruktur in den tierischen oder humanen Wirtskörper intakt bleiben. Erneut werden in diesem Fall die Membrankapillaren solche Materialeigenschaften benötigen, die es ihnen ermöglichen länger intakt zu bleiben.
Um die Abbaurate zu variieren, ist es möglich, die Materialeigenschaften, einschließlich der Zusammensetzung, der Membrankapillaren 2 zu ändern. Alternativ dazu oder zusätzlich kann die Dicke der Wände 18 der Membrankapillaren 2 variiert werden. Insbesondere werden natürlich Membrankapillaren 2 mit dickeren Wänden 18 über längere Zeitperioden intakt bleiben.
Für bestimmte Gründe im Hinblick auf die Gewebestruktur, die gezüchtet wird, ist es möglich, innerhalb des selben Gerüsts und der selben Gewebestruktur, Membrankapillaren 2 mit verschiedenen jeweiligen Raten von Abbau bereitzustellen. Dies kann besonders Anwendung finden, wenn, wie unten zu beschreiben ist, natürliche Blutgefäße im Gewebe entwickelt werden.
Sofern eine Membrankapillare 2 biologisch abbaubar ist, kann es arrangiert werden, dass während sie abgebaut wird, sich die Poren 16 vergrößern. Durch Arrangieren der Membrankapillaren 2 auf dieser Weise, stellen sie progressiv einen erhöhten Fluss von Nährstoffen zum umliegenden Gewebe bereit. Dies ist höchst vorteilhaft, da natürlich mit der Zeit das Gewebe wachsen wird, und folglich seine Bedürfnisse für Nährstoffe wachsen werden. Es ist voraussehbar, dass normale Gewebe-Remodellierung optimale Gewebeernährung nach in-vivo-Implantation geben wird.
Es ist ersichtlich, dass das Grundgerüst, wie das Gerüst 10 in der 3, in jeder Gestalt oder Größe geformt werden kann, abhängig von der Anwendung. Es bestehen dann verschiedene Weisen, auf denen die Membrankapillaren 2 in diesem Gerüst angeordnet werden können. Diese Anordnungen können in verschiedenen Gruppen breit gefächert berücksichtigt werden.
Wie in der 6 dargestellt, ist jede Membrankapillare 2 an beiden Enden offen, und verläuft durch das Gewebe und Gerüst 10. Sauerstoffreiche Nährflüssigkeit fließt durch jede Membrankapillare 2, wie dargestellt. Auf ihrem Weg durch das Gewebe und Gerüst 10 dispergieren Nährstoffe und Sauerstoff aus der Membrankapillare 2 zum umliegenden Gewebe.
An diesem Punkt ist es Wert anzumerken, dass natürlich die lebenden Zellen des Gewebes metabolische Abfallprodukte produzieren, einschließlich Lactat und Kohlendioxid. Somit sollte in der bevorzugten Ausführungsform dieses Abfallprodukt vom Gewebe entfernt werden. Durch Festlegen der Materialeigenschaften von wenigstens einigen der Membrankapillaren 2, so dass sie durchlässig für metabolische Abfallprodukte sind, ist es möglich diese Membrankapillaren 2 zu verwenden, um die metabolischen Abfallprodukte vom Gewebe zu entfernen. In der Praxis werden in den meisten Fällen die Membrankapillaren 2, wenn sie für Nährstoffe durchlässig sind, für die Abfallprodukte durchlässig sein.
Somit, erneut hinweisend auf die 6, während die Flüssigkeit durch die Membrankapillaren 2 fließt, passieren Nährstoffe und Sauerstoff aus der Flüssigkeit zu den umliegenden Zellen, während metabolische Abfallprodukte in der Flüssigkeit absorbiert/aufgelöst/diffundiert werden oder, und folglich aus der Struktur entfernt werden.
Alternativ dazu können einige der Membrankapillaren 2 verwendet werden, um Nährflüssigkeit zu transportieren, während andere der Membrankapillaren 2 eine neutrale Flüssigkeit transportieren können, die zum Aufnehmen und Entfernen der metabolischen Abfallprodukte bestimmt ist.
Die 7 stellt eine alternative Anordnung dar, in welcher die Membrankapillaren 2 an einem Ende blockiert und an dem anderen Ende offen sind. Mit dieser Anordnung kann Nährflüssigkeit an den offenen Enden einiger der Membrankapillaren 2a bereitgestellt werden, um so die Zellen des Gewebes zu ernähren. Auf der anderen Seite kann Flüssigkeit von dem Gewebe und Gerüst in anderen der Membrankapillaren 2b extrahiert und aus der Struktur entfernt werden.
Es ist ersichtlich natürlich, dass die Anordnungen der 6 und 7 kombiniert werden können, unter Verwendung offen-endender und geschlossen-endender Membrankapillaren 2, entsprechend der besonderen Bedürfnisse eines bestimmten Gewebewachstums.
Im Hinblick auf die Anordnungen der 6 und 7 sollte auch angemerkt werden, dass die Membrankapillaren 2 nicht nur mit Nährflüssigkeit von einer Seite gefüttert und metabolische Abfallprodukte von der anderen Seite entfernt werden müssen. Es ist möglich, die Eingänge und Ausgänge auf derselben Seite zu lokalisieren, oder tatsächlich auf jeder geeigneten Position, entsprechend der besonderen Bedürfnisse des Gewebes, das gezüchtet wird. Tatsächlich können Kapillaren in jedem geeigneten Muster angeordnet werden, zum Beispiel einem Gitter, wie es in der 8 dargestellt ist.
Die 6, 7 und 8 stellen bestimmte Anordnungen dar, wobei die Membrankapillaren 2 im Gerüst in vorbestimmten organisierten Mustern gebildet sind. Insbesondere sind die Membrankapillaren parallel zueinander mit einem gleichmäßigen Abstand angeordnet. Offensichtlich hat dies einige Vorteile darin, dass eine gleichmäßige Verteilung des Flusses von Nährstoffen und metabolischen Abfallprodukten erreicht werden kann.
Es ist ersichtlich, dass die Membrankapillaren 2 nicht nur geraden Bahnen folgen müssen. Insbesondere können sie jedem gewünschten Umweg einer Bahn durch das Gewebe und Gerüst folgen. Dies ist schematisch in der 9 dargestellt.
Anordnungen wie diese haben den Vorteil, dass Eingänge und Ausgänge zu Membrankapillaren 2 zusammengruppiert werden können, und dass weniger Membrankapillaren 2 bereitgestellt werden müssen, um Nährstoffe zu liefern und metabolische Abfallprodukte von einem gegebenen Volumen von Gewebe zu entfernen. Bestimmte Umwege von Bahnen können jedoch bereitgestellt werden, entsprechend der besonderen Bedürfnisse eines bestimmten Typus von Gewebewachstum. Offen-endende und geschlossen-endende Membrankapillaren 2 können verwendet und kombiniert werden, wie mit Hinweis auf die 6, 7 und 8 beschrieben, tatsächlich können gerade- und gewunden-geformte Membrankapillaren 2 entsprechend der Bedürfnisse zwischengemischt werden.
Es sollte ebenfalls angemerkt werden, dass, vorausgesetzt Zellen sind nahe genug an Membrankapillaren 2, um Nährstoffe aufzunehmen und metabolische Abfallprodukte zu entsorgen, das Muster der Membrankapillaren 2 unwichtig sein kann. Folglich ist es möglich, durch das Bereitstellen einer ausreichenden Anzahl und/oder Länge an Membrankapillaren 2 in einem gegebenen Volumen von Gerüst und Gewebe, festzulegen, dass alle Zellen des Gewebes nahe genug an geeigneten Membrankapillaren 2 sein werden, um zu leben und zu wachsen.
Folglich können Membrankapillaren, zum Beispiel durch Gießen, in einer zufälligen Anordnung im Gerüst 10 eingebettet werden. In diesem Fall ist es dennoch möglich für die Membrankapillaren, offen-endend, geschlossen-endend oder eine Mixtur der beiden zu sein. In entsprechender Weise können natürlich zufällige und vorbestimmte Muster von Membrankapillaren 2 ebenfalls gemischt sein.
Es ist auch möglich, Kapillaren zu verwenden, die an beiden Enden blockiert sind. Dies ist in der 10 dargestellt.
Die Flüssigkeit innerhalb der Kapillaren stellt eine Diffusionsbahn von reduziertem Widerstand im Vergleich zu der wachsenden Gewebestruktur bereit. Folglich verbessern die Kapillaren den Transfer von Abfallprodukten und Nährstoffen durch die Struktur. Sie reservieren auch Raum für das Einwachsen von Blutgefäßen.
Diese Kapillaren, die an beiden Enden blockiert sind, könnten vorzugsweise in Verbindung mit den Kapillaren verwendet werden, die oben diskutiert wurden, und können gerade oder Umwegbahnen in einem organisierten oder zufälligen Muster haben. Es wäre jedoch ebenfalls möglich, nur blockierte Kapillaren zu verwenden. In diesem Fall werden Nährstoffe und Abfallprodukte zwischen der Oberfläche der Struktur und den Abschnitten der Kapillaren in der Region der Oberfläche diffundieren.
Ein Weg, um ein Gerüst zu machen, ist ein Polymernetz zu verwenden, das aus verschlungenen Polymerfasern besteht. Zum Beispiel könnte das Gerüst aus künstlichem Knorpel, ein PLA-Fasernetz als Gerüst verwenden.
Die hohlen Membrankapillaren können verwendet werden, um die Gerüstmaterialien zu ergänzen. Die Kapillaren (sagen wir von ungefähr 0,1-0,3 mm Durchmesser) können angeordnet oder zufällig gepackt werden. Während der Bearbeitung des Gerüsts kann das Ende der Kapillaren blockiert sein. Nährstoffe können in und aus der Membrankapillare diffundieren, abhängig von Konzentrationsgradienten. Nährstoff kann innerhalb der Kapillare fließen, wenn ein oder beide Enden offen sind und ein Druckgradient existiert, oder nur durch die Flüssigkeit innerhalb der Kapillare diffundieren, wenn beide Enden blockiert sind. Die Diffusionsrate innerhalb der Kapillaren würde viel schneller sein als durch das bildende Gewebe (mindestens um einen Faktor von 2, da keine Zellen und ECM innerhalb der Kapillare vorhanden sind). Der Mechanismus wird helfen, eine gleichmäßige Verteilung von Nährstoffen und Beseitigung von Abfallprodukten innerhalb des 3-d-Gewebes zu erhalten.
Die 11 stellt eine weitere Variation zu den Anordnungen der 6 bis 10 dar.
Die Kapillaren können zwischenverbunden sein, um ein Netzwerk zu bilden. Wie dargestellt, nimmt dieses die Form einer Baumstruktur von zwischenverbundenen Kapillaren verschiedener Durchmesser an. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Hauptkapillare langen Durchmessers 200a mit weiteren Kapillaren mit kleinerem Durchmesser 200b verbunden, die selbst mit Nebenkapillaren 200c verbunden sind.
Wie vorher, kann diese Anordnung mit denen gemischt werden, die oben diskutiert wurden, und kann vorbestimmte, zufällig gerade, Umweg-, offen-endende oder gechlossen-endende Formen annehmen.
Der Mindestabstand zwischen Membrankapillaren 2, um das Leben der Zellen im Gewebe zu unterstützen, wird offensichtlich entsprechend der Natur des Gewebes variieren. In normalen Fällen für organisches Gewebe, wie tierisches oder humanes Gewebe, sollten jedoch die Membrankapillaren 2 nicht weiter als 5 mm auseinander und vorzugsweise ungefähr 0,5-1 mm auseinander sein. Vorzugsweise werden die Membrankapillaren mit nicht weniger als 0,5 mm zwischen angrenzenden jeweiligen Wänden positioniert.
Der Diffusionsabstand wird vom Gerüst und von der Zelldichte abhängen. Wenn nur ein Set von Kapillaren Nährstoffe bereitstellen und Abfallprodukte entfernen soll, wird der Abstand ungefähr 1-3 mm sein. Wenn verschiedene Kapillaren für Nährstoff und Abfallprodukt verwendet werden, sollte der Abstand ungefähr 1-5 mm sein. Zwei Kapillaren, die Nährstoff liefern, sollten (grob) 2 mm (oder mehr, da die dritte Kapillare ebenfalls Platz einnimmt) auseinander sein, mit einer Abfallprodukt-Entfernungskapillare zwischen ihnen. Diese Zahlen sind nur Indikativ. Sie sind der Abstand zwischen den zwei Außenoberflächen der Kapillaren, da der Kapillarendurchmesser gut im Bereich von mm oder mehr sein kann, wie früher beschrieben.
Die Wahl der Kapillarengröße hängt auch von der Natur des Gewebes, das gezüchtet wird, und der Gestalt und Größe des Gewebes, das gezüchtet wird, ab. Kapillaren größeren Durchmessers stellen einen größeren Fluss von Flüssigkeiten und größeren Oberflächenbereich pro Kapillare bereit, durch welchen die Flüssigkeit dispergiert oder absorbiert werden kann. Auf der anderen Seite nehmen Kapillaren größeren Durchmessers offensichtlich mehr Platz im Gewebe ein, und folglich ist die Anzahl der Kapillaren limitiert.
Für die meisten Anwendungen sollten daher die Membrankapillaren zwischen 10 μm und 2 mm im Durchmesser sein, vorzugsweise 0,1 mm bis 1 mm.
Wie oben erwähnt, besteht eine Möglichkeit, Endothelzellen in oder auf den Kapillaren 2 einzuführen.
Es ist ersichtlich, dass wenn eine Gewebestruktur gezüchtet wurde und die Membrankapillaren 2 abgebaut wurden, die Gewebestruktur mit offenen Kanälen geblieben ist. Diese Kanäle transportieren selbst Nährstoff und Abfallprodukte für einige Zeit. Während das Gewebe jedoch weiterhin wächst, werden die Kanäle kleiner werden, bis ein nicht-ausreichender Transfer von Nährstoffen und Abfallprodukten vorkommen wird.
Wenn die Gewebestruktur in das geeignete Tier oder in den geeigneten Menschen zu einem frühen Stadium implantiert wird, ist es der Gewebeprobe möglich, Blutgefäße zu entwickeln, die vom Wirtskörper erzeugt wurden. Als eine Alternative dazu ist es jedoch möglich, Endothelzellen in oder auf die Membrankapillaren einzuführen. Diese Zellen könnten sich zu Blutgefäßen entwickeln, während die Membrankapillaren abgebaut werden.
Die 12 stellt ein Gesamtsystem zum Züchten des Gewebes dar. Dieses schließt eine Behausung 50 für die oben diskutierte Struktur, wobei die Temperatur und andere Umweltbedingungen ebenfalls kontrolliert werden können, eine Nährstoff-Versorgungsvorrichtung 52 und eine Abfallprodukt-Entsorgungsvorrichtung 54 ein. Ein Controller 56 kontrolliert dann die Versorgungsvorrichtung 52, um das Gerüst und die Gewebestruktur in der Behausung 50 mit Nährflüssigkeit zu versorgen, kontrolliert die Umweltbedingungen der Behausung 50 und kontrolliert die Abfallprodukt-Entsorgungsvorrichtung 54, um die metabolischen Abfallprodukte zu extrahieren.
Experimentelle Ergebnisse
Verfahren
Zellkultur
Fibroblasten aus Ratten-Knochenmark wurden geerntet unter Verwendung von Oberschenkelknochenmark aus 3 Monate alten weiblichen LOU/CN-Ratten und durch Zentrifugation bei 1000rpm 5 Minuten lang pelletiert. Das Zell-Pellet wurde in 10 ml α-MEM (Minimum-Essential-Medium) resuspendiert und durch ein Zellsieb passiert. Zellsuspensionsproben wurden mit 2%iger Essigsäure in PBS (Phosphat-gepufferte Saline) verdünnt, und die Anzahl und Lebensfähigkeit von nukleierten Zellen wurden bestimmt. Zellen wurden zu 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ in 25 cm²-Flaschen plattiert und in gepuffertem 20 mM-MEM (ergänzt mit 10% (v/v) FBS, 1 % Antibiotika und 1 % Fungizon) kultiviert.
Nachdem sie einen subkonfluenten Zustand erreicht hatten, wurden die Zellen mittels Trypsin-EDTA (0,05% w/v) wiederhergestellt und am Tag vor der Inokulation mit Cytodex 1-Mikroträgern kultiviert.
Mikroträger-Kügelchen-Kultur
Da die Fibroblastenzellen aus Ratten-Knochenmark anheftungsabhängige Zellen sind, wurden Cytodex 1-Mikroträger-Kügelchen als Substrat für die Zellen, um sich anzuheften, verwendet.
Cytodex 1-Mikroträger basieren auf einer kreuz-verknüpften Dextran-Matrix, die mit positiv geladenen N,N-Diethylaminoethyl- (DEAE) Gruppen substituiert ist. Zellkulturen auf Cytodex 1 wurden unter Befolgung des Protokolls durchgeführt, das vom Hersteller bereitgestellt wurde.
Herstellung von Collagen-Gel mit Zellen

– Trypsinisieren Sie die erforderliche Anzahl von Zellenflaschen, schleudern Sie sie herunter (d.h. zentrifugieren Sie) und führen Sie Zellzählung durch. Berechnen Sie die Anzahl von Zellen, die erforderlich sein wird, und die nötige Verdünnung.
– Während die Zellen in der Zentrifuge sind, tun Sie das Eis in die Haube und stellen Sie die Gefäße mit den folgenden Lösungen auf das Eis: 10 × α-MEM, Collagen und 0,4 M-Natriumhydroxid.
– Resuspendieren Sie die Zellen und stellen Sie die Tube auf Eis.
– Um die Collagen-Polymerisierungslösung herzustellen, dispensieren Sie die folgenden Bestandteile in der angegebenen Reihenfolge. Mischen Sie sanft mittels Wirbelns, nach Zugabe von jeder Komponente. 2 ml destilliertes Wasser 1 ml 10 × α-MEM 5 ml Collagen
– Fügen Sie unter Verwendung einer Pasteur-Pipette 0,4 M-NaOH tropfenweise hinzu, bis die Lösung nach Zugabe und Wirbeln orange wird.
– Fügen Sie 2 ml der Zellsuspension hinzu und wirbeln Sie sanft, um gründlich zu mischen.

Hohlfaser-Bioreaktor
Die 13 ist eine schematische Repräsentation des Hohlfaser-Bioreaktors, und die 14 stellt die eigentliche Anordnung dar, die für diese Experimente verwendet wurde.
Zwei Gruppen von Membrankapillaren wurden in die Gerüste des Gewebes eingebettet. Die Kapillaren oder Hohlfaserkapillaren hatten einen Durchmesser von 0,3 mm bis 1 mm. Die Wände dieser Kapillaren waren porös und halbdurchlässig. Die erste Gruppe von Kapillaren stellte die Funktion von Arterien bereit. Das Kulturmedium, das auch sauerstoffreich war, floss innerhalb dieser Gruppe von Kapillaren. Die Nährstoffe und der Sauerstoff, die innerhalb dieser Fasern flossen, kamen durch die Membranporen raus und waren innerhalb des Gewebes fast gleichmäßig verteilt.
Die Nährstoffe, die aus der ersten Gruppe von Kapillaren flossen, gingen in die Zellen, und die Zellen konsumierten Nährstoffe und produzierten Metaboliten, die entfernt werden mussten.
Die zweite Gruppe der Kapillaren, die als Venolen fungierten, wurden ebenfalls in das Gewebe eingebettet und mit der ersten Gruppe von Kapillaren verstrickt. Die verbrauchten Medien und metabolischen Abfallprodukte durchdrangen diese zweite Gruppe von Kapillaren und flossen aus dem Gewebe. Deshalb wurde ein dem Kapillarensystem ähnliches Nährstoff-Zirkulationssystem im nativen Gewebe erschaffen.
Die Membranporengröße war nicht groß genug für die Zellen, um durch die Membranwand zu gehen. Zwischen den zwei Sets von Kapillaren können die Gerüstmaterialien, wie natürliche Biopolymere und synthetische Polymere, verwendet werden, um das Gerüst zum Anheften von Zellen bereitzustellen. Einige Zellen können sich auch an die Membran anheften.
Im anfänglichen Stadium der Zell- und Gewebekultur werden die Membranporen die Zellen davor stoppen, durch die Membran zu gehen. Die Membranen könnten aus biologisch abbaubaren Polymeren gemacht worden sein und könnten mit fortschreitender Zeit abgebaut werden. Deshalb könnte sich die Nominalgröße der Poren dieser Membranen mit der Zeit erhöhen. Dies dient zwei Funktionen:

1 Mit fortschreitender Kultur wird sich die Zelldichte innerhalb des Gewebes sehr erhöhen und folglich ist ein hoher Transport von Nährstoffen erforderlich. Eine größere Porengröße würde helfen, diesen erhöhten Bedarf an Nährstoffen zu decken.
2 In den späteren Stadien der Kultur können Endothelzellen in die Kapillarsysteme in beide, die erste Gruppe, welche die Arteriengruppe ist, oder die zweite Gruppe, die Venengruppe, eingeführt werden. Dies ist so, weil der Fluss leicht umgekehrt werden kann, so dass die zweite Gruppe die Nährstoffe bereitstellt und die erste Gruppe die metabolischen Abfallprodukte sammelt. Die eingeführten Endothelzellen könnten sich an die Oberfläche dieser Kapillaren anheften und eventuell Kapillaren-Blutgefäße bilden. Dies stimmt besonders, wenn die ursprünglich eingeführten Membranen abgebaut werden. Es wird erwartet, dass massiges Gewebe mit einem eingebetteten Kapillarensystem mittels solcher Verfahren produziert werden kann.

Herstellung von einem Hohlfaser-Bioreaktor

1 Die Patrone (13mmID × 22mmOD × 40mmL-Dimension) und die Seitenanschlüsse wurden in der Werkstatt bearbeitet. Die Patronen und Schraubkappen an beiden Enden waren aus Polycarbonat gemacht. Die Anschlüsse für das Medium (302) waren klinische männliche Luer-Verbindungen und die Seitenanschlüsse für die Inokulation von Zellen (303) waren klinische weibliche Luer-Verbindungen, die auf dem Rumpf der Patrone geklebt waren.
2 Hohlfasermembranen aus Cellulose-Acetat wurden aus normalen Haemodialysatoren rausgeschnitten und mit Silikongummi an den beiden Enden der Patrone fixiert.

Perfusionssystem
Das Perfusionssystem bestand aus vier Hauptkomponenten: einem Hohlfaser-Bioreaktor, einer Pumpstation, einem Kulturmedium-Reservoir und einem Gaszylinder (15). Zellen wurden in das ECS des Hohlfaser-Bioreaktors eingeimpft. Kulturmedium wurde aus dem Mediumreservoir mittels der peristaltischen Pumpe entnommen, trat in den intrakapillären Raum ein und kehrte dann zum Reservoir zurück. Routinemäßig wurde eine Medium-Flussrate von 14 ml/h verwendet.
Kontrolle
Ein Hohlfaser-Bioreaktor ohne Mediumfluss diente als Kontrolle. Das Medium wurde im Kontrollsystem auf täglicher Basis gewechselt.
Erhaltung der Bioreaktoren
150 ml Kulturmedium wurde für jeden Bioreaktor verwendet und am 4. Tag gewechselt. Für das Kontrollsystem wurde das Medium täglich gewechselt.
Der pH-Wert, der Partialdruck von CO₂ und O₂ und die Konzentration von HCO₃ ^–, Ca²⁺, K⁺, Na⁺ und Cl^– des Kulturmediums wurden täglich auf einem Blutgas-Analysator ge messen. Die Lactat-Produktion der Zellen in den Bioreaktoren wurde mittels Lactat-Reagenz von Sigma gemessen.
Zellvermehrung
Die Zellvermehrung wurde unter Anwendung des Alamar-Blau-Assays gemessen. Die Alamar-Blaufarbe wurde aufgrund der metabolischen Aktivität der kultivierten Zellen von einer nicht-fluoreszierenden Form auf ein fluoreszierendes Produkt reduziert.
An Tag 1, 4 und 7 wurde die Zirkulation des Mediums gestoppt. Nach der Entfernung des im Bioreaktor übrig gebliebenen Mediums, wurde frisches Medium mit 5%-Alamar-Blau in den Bioreaktor injiziert. Nach 2 Stunden in einem 37°C-Inkubator, wurden 200 μl Medium von jedem Bioreaktor in 96-Well-Platten gegeben. Die relative Fluoreszenseinheit wurde mittels eines Fluoreszens-Mikroplatten-Lesers bei Wellenlängen von 530 nm (Anregung) und 590 nm (Emission) gemessen. Kontrollen, die nur Medium und Alamar-Blau-Reagenz enthielten und auch 2 Stunden lang inkubiert worden waren, wurden ebenfalls gemessen.
Zellenlebensfähigkeit
Die Zellenlebensfähigkeit wurde mittels eines lebend/tot-Lebensfähigkeitsassay-Kits bestimmt. Nachdem der Bioreaktor geerntet war, wurden die Proben in PBS gespült und in einer 24-Well-Platte zugefügt. 0,5 ml Arbeitslösung (2 μM-Calcein und 4 μM-EthD-1 in PBS) wurden jedem Well hinzugefügt und bei 37°C 45 Minuten lang inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden mehrere Tropfen von PBS auf einem sauberen Mikroskopier-Objektträger zugefügt. Die Proben wurden von der 24-Well-Platte auf die Mikroskopier-Objektträger transferiert und unter dem Fluoreszensmikroskop angeschaut (Anregung/Emission: Calcein 494/517 nm; EthD-1 528/617 nm). Von jeder Probe wurden Bilder gemacht.
H-E-Färbung
Nachdem die Bioreaktoren geerntet worden waren, wurden die Proben in PBS gespült und in 10%-Formaldehyd 15 Minuten lang fixiert. Die Proben wurden in 2%-Agarose und dann in Parafin eingebettet, und 4 μm-Schnitte erhalten.
Entwachsen Sie die Schnitte in Xylen 15 Minuten lang und spülen Sie in 100%-, 70%- und 40%-Alkohol der Reihe nach aus. Spülen Sie unter laufendem Wasser 5 Minuten lang. Färben Sie mit Mayers Haematoxylin 20 Minuten lang, und waschen und färben Sie blau unter laufendem Wasser 5 Minuten lang. Färben Sie mit Eosin 5 Minuten lang und waschen Sie unter laufendem Wasser 1 Minute lang. Entwässern Sie in 40%-, 70%- und 100%-Alkohol, und klären Sie in Xylen. Betten Sie in DPX-Einbettmedium ein.
SEM
Die Proben wurden für die SEM unter Verwendung von 3%-Glutaraldehyd und 1 %-Osmiumsäure fixiert und unter Verwendung von Aceton in verschiedenen Konzentrationen (von 20% bis 100%) dehydratisiert. Die Proben wurden einer kritischer-Punkt-Trocknung unter Verwendung von Isoamylacetat unterzogen und dann mit Gold beschichtet. Die Proben wurden dann mittels eines Rasterelektronenmikroskops bei 15 kV-Beschleunigungsspannung betrachtet und es wurden Bilder gemacht.
Ergebnisse
Zellvermehrung
Das Alamar-Blau-Assay zur Zellvermehrung wird in der 16 gezeigt. Es war kein Unterschied zwischen der Kontrolle und der Perfusionierten an Tag 1 vorhanden. Die RFU von Alamar-Blau in der Kontrollgruppe nahm an Tag 4 und Tag 7 ab, verglichen mit ungefähr 5fachen Zunahmen in der perfusionierten Gruppe, was statistisch signifikant ist (p < 0,05).
Lactat-Konzentration des Mediums
Die Ergebnisse der Lactat-Produktion im Kulturmedium in zwei Gruppen werden in der 17 gezeigt. Das von Zellen produzierte Lactat in der Kontrollgruppe war stabil zu allen Zeitpunkten (zwischen 0,00097 (0,00058 und 0,0044 (0,0004 mmol). Im perfusionierten Bioreaktor jedoch, war das Lactat im Kulturmedium höher als in der Kontrollgruppe (zwischen 0,032 (0,0091 und 0,065 (0,0129), und zwar signifikant am Tag 4 und Tag 6 (p < 0,05).
Gas- und Elektrolytanalyse des Mediums
Die pH-Werte des Mediums in zwei Gruppen werden in der 18 gezeigt. Die pH-Werte in der perfusionierten Gruppe waren stabil zwischen 7,3 und 7,4, hatten aber eine leichte Zunahme auf 7,48 (0,053. Im Vergleich zur perfusionierten Gruppe jedoch, nahm der pH-Wert in der Kontrollgruppe an Tag 6 und Tag 7 auf 7,44 (0,008 bzw. 7,6 (0,03 (p < 0,05 und p < 0,01) zu.
Die Partialdrucke von O₂ und CO₂ in den zwei Gruppen werden in der 19 gezeigt. Die Ergebnisse in der perfusionierten Gruppe waren relativ stabil, aber die Kontrollgruppe zeigte einen Trend von leichter Zunahme im Partialdruck von O2 und Abnahme im Partialdruck von CO2 zwischen Tag 1 und Tag 7.
Die Konzentrationen von K+, Na+, Ca++, Cl– im Medium der zwei Gruppen waren unterschiedlich, waren aber alle innerhalb physiologischer Bereiche (20).
Zell-Lebensfähigkeit
Die lebend/tot-Zellfärbung wird in der 21 gezeigt. Die hohlen Fasern, Collagengel und Zellträger werden mittels Lichtmikroskopie in der 21A gezeigt. Nach lebend/tot-Färbung waren mittels Fluoreszensmikroskopie die lebenden Zellen grün und tote Zellen waren rot. In der perfusionierten Gruppe waren die Zellen gleichmäßig über der Collagen-Gelmatrix und Mikroträgern in hoher Dichte verteilt. Es waren Gewebe-ähnliche Strukturen gebildet. Es waren viel mehr lebende Zellen in der perfusionierten Gruppe vorhanden als in der Kontrolle. In der Kontrollgruppe war die Zelldichte niedriger und es waren mehr tote Zellen vorhanden als in der perfusionierten Gruppe (21B).
H&E-Färbung
Die 22 zeigt H&E-Färbung von geernteten Zellen und Gewebe in Hohlfaser-Bioreaktoren. Die Kontrollgruppe wird in den 22a und b gezeigt. Die Zellen waren abgelöst von der Oberfläche des Zellträgers. Wenige Zellen überlebten in der Collagenmatrix. Die perfusionierte Gruppe wird in den 22c und d gezeigt. Die Mikroträger waren mit Zellen bedeckt. Die Zellen verteilten sich gleichmäßig in der Collagenmatrix und einige dreidimensionale Gewebe-ähnliche Strukturen waren gebildet.
SEM-Beobachtung
In beiden Gruppen waren die Mikroträger teilweise in der Collagen-Gelmatrix eingebettet, welche die hohlen Fasern bedeckte, und bildeten eine Verbundstruktur (23a). Die Oberflächen der hohlen Fasern waren glatt, weder mit Zellen noch Collagenmatrix angeheftet. Einige Zellen wuchsen auf den Mikroträgern, sie breiteten sich aber nicht.
In der perfusionierten Gruppe bildeten die Zellen eine einzige Schicht auf der ganzen äußeren Oberfläche der Collagenmatrix und Multischichten in einigen Bereichen. Die Zellen waren sehr aktiv, mit ausgedehnten Zellprozessen, welche sich in die Collagenmatrix integrierten und Zellverbindungen zwischen Zellen bildeten (22b). Einige Zellen bildeten neue Collagenmatrix (23c). Es waren keine Hinweise vorhanden, die zwischen hohlen Fasern und Collagenmatrix wachsende Zellen zeigten (23d).
In der Kontrollgruppe war die Collagenmatrix nicht mit Zellen bedeckt. Einige Zellen konnten detektiert werden, sie waren aber in schwachen Zuständen, sie breiteten sich nicht aus wie die Zellen in der perfusionierten Gruppe. Tote Zellen und Zelltrümmer verblieben in der Collagenmatrix und in den Mikroträgern (23e). Verglichen mit den organisierten feinen Collagenfasern, die in Richtung von Zellprozessen orientiert waren (22c), waren die Collagenfasern in der Kontrollgruppe rauh und unorganisiert, ohne jede Beziehung zu Zellen und ohne Anzeichen einer Zelleinmischung (23f).

Claims

Struktur zum Züchten von lebendem organischem Gewebe, die Folgendes beinhaltet: ein Gerüst (12), auf welchem Zellen (14) des Gewebes eingeimpft werden können und auf welchem das Gewebe gezüchtet werden kann; und eine Vielzahl an von dem Gerüst (12) getrennten Membrankapillaren (2), wobei jede Membrankapillare (2) eine jeweilige Membranwand beinhaltet, die einen inneren Durchgang zum Transport einer Nährflüssigkeit bzw. eines Nährstofffluids definiert, wobei die Membranwände für Nährstoffe und Sauerstoff durchlässig sind und das Gerüst (12) mit der Vielzahl an Membrankapillaren entlang frei gewählter Bahnen durchsetzt ist, sodass die Gestalt des Gerüsts (12) frei gewählt sein kann, wobei das Gerüst (12) mit der Vielzahl an Membrankapillaren (2) durchsetzt ist, um so das Gewebe in die Lage zu versetzen, überall im Gerüst (12) gezüchtet zu werden, wobei die Membrankapillaren (2) biologisch abbaubar oder biologisch resorbierbar sind.
Struktur nach Anspruch 1, wobei das Gerüst (12) eine Vielzahl an Fasern von relativ geringen kleinen Durchmesser im Vergleich mit der Vielzahl an Membrankapillaren umfasst.
Struktur nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Membrankapillaren (2) nicht nur innerhalb laminarer Blattlagen enthaltenen Bahnen folgen.
Struktur nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei mindestens eine der Membrankapillaren (2) einer Bahn folgt, die sich weder in der laminaren Blattlage befindet noch parallel zu dieser verläuft, in welcher die Bahn einer weiteren der Membrankapillaren (2) liegt.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens eine der Membrankapillaren (2) einer nicht innerhalb einer laminaren Blattlage enthaltenen gewundenen Bahn folgt.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membrankapillaren (2) omnidirektional sind.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gerüst (12) sich in drei jeweils zueinander orthogonalen Richtungen erstreckt.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens einige der Membrankapillaren (2) an gegenüberliegenden Enden offen sind, sodass jede davon einen Durchgang für einen Nährflüssigkeitsstrom durch das Gewebe hindurch vorsieht, sodass Nährflüssigkeit das Gewebe mit Nährstoffen versorgt.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens einige der Membrankapillaren (2) an einem Ende blockiert sind, sodass Nährflüssigkeit dem offenen Ende zugeführt werden kann, um so das Gewebe mit Nährstoffen zu versorgen.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens einige der Membrankapillaren (2) an beiden Enden blockiert sind.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens einige der Vielzahl an Membrankapillaren (2) Membranwände besitzen, die gegenüber metabolischen Abfallprodukten durchlässig sind und für das Abtransportieren von metabolische Abfallprodukte enthaltender Flüssigkeit aus dem Gewebe geeignet sind.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine zusätzliche Vielzahl an von dem Gerüst (12) getrennten Membrankapillaren (2) und mit Membranwänden, die gegenüber metabolischen Abfallprodukten durchlässig sind, und mit denen das Gerüst (12) entlang frei gewählter Bahnen durchsetzt ist, um so metabolische Abfallflüssigkeit aus dem Gewebe abzutransportieren.
Struktur nach Anspruch 12, wobei wenigstens einige der zusätzlichen Vielzahl an Membrankapillaren (2) an einem von gegenüberliegenden Enden blockiert sind, sodass metabolische Abfallflüssigkeit aus dem Gewebe über die offenen Enden abgeführt werden kann.
Struktur nach Anspruch 12 oder 13, weiterhin einschließend einen Abfallprodukt-Extraktor zum Abführen von metabolischer Abfallflüssigkeit aus der zusätzlichen Vielzahl an Membrankapillaren.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membrankapillaren (2) aus einem von Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polymilchsäure-co-glykolsäure und Polycaprolacton aufgebaut sind.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membrankapillaren (2) aus einem Material mit Poren aufgebaut sind, die mit dem fortschreitenden Abbau der Membrankapillaren (2) an Größe zunehmen, um so für eine erhöhte Zufuhr von Nährflüssigkeit in das Gewebe zu sorgen.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membrankapillaren (2) zwischen 10 μm und 2 mm Durchmesser haben.
Struktur nach Anspruch 17, wobei die Membrankapillaren (2) zwischen 0,1 mm und 1 mm Durchmesser haben.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Abstand zwischen den Membrankapillaren (2) nicht weniger als 0,5 mm beträgt.
Struktur nach Anspruch 19, wobei der Abstand zwischen den Membrankapillaren (2) ungefähr 1 mm beträgt.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens einige der Membrankapillaren (2) durch das Gerüst hindurch parallel zueinander verlaufen.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens einige der Membrankapillaren (2) auf Umwegen über jeweilige Bahnen durch das Gerüst verlaufen.
Struktur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin einschließend eine Nährflüssigkeitszufuhr, um die Vielzahl an Membrankapillaren (2) mit Nährflüssigkeit zu versorgen.
Gewebestruktur, die Folgendes beinhaltet: Lebendes organisches Gewebe gemäß der Struktur der Ansprüche 1 bis 23; und eine Vielzahl an künstlichen Membrankapillaren (2), wobei jede Membrankapillare (2) eine jeweilige Membranwand beinhaltet, die einen inneren Durchgang zum Transport einer Nährflüssigkeit definiert, wobei die Membranwände für Nährstoffe und Sauerstoff durchlässig sind und das Gewebe mit der Vielzahl an Membrankapillaren entlang frei gewählter Bahnen durchsetzt ist, sodass die Gestalt des Gewebes frei gewählt sein kann, wobei das Gewebe mit der Vielzahl an Membrankapillaren (2) durchsetzt ist, um so das Leben des Gewebes zu unterstützen, wobei die Membrankapillaren (2) biologisch abbaubar oder biologisch resorbierbar sind.
Verfahren zum Züchten von lebendem organischem Gewebe, das Folgendes beinhaltet: Freies Definieren eines Volumens mit der gewünschten Gestalt und Größe; Vorsehen einer Vielzahl an Membrankapillaren (2) entlang frei wählbarer Bahnen, mit denen das Volumen durchsetzt ist, wobei jede Membrankapillare (2) eine jeweilige Membranwand einschließt, welche gegenüber Nährstoffen und Sauerstoff durchlässig ist, und welche einen inneren Durchgang für den Transport einer Nährflüssigkeit definiert, wobei die Membrankapillaren (2) biologisch abbaubar oder biologisch resorbierbar sind; Bilden eines Gerüsts (12) in dem Volumen um die Vielzahl an Membrankapillaren (2) herum, wobei das Gerüst (12) für das Einimpfen von Gewebezellen und das Gewebewachstum geeignet ist; Einimpfen von Zellen des Gewebes in das Gerüst (12); und Vorsehen eines Nährflüssigkeitsstroms durch die Vielzahl an Membrankapillaren (2) hindurch.
Verfahren nach Anspruch 25, weiterhin einschließend: Bilden des Gerüsts (12) mit einer Vielzahl an Fasern von kleinem Durchmesser im Vergleich mit den Membrankapillaren (2).
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Membrankapillaren (2) nicht zwangsweise Bahnen innerhalb laminarer Blattlagen folgen.
Verfahren nach Anspruch 25, 26 oder 27, weiterhin einschließend: Vorsehen von mindestens einer der Membrankapillaren (2) entlang einer Bahn, die sich weder in der laminaren Blattlage befindet noch parallel zu dieser verläuft, in welcher die Bahn einer weiteren der Membrankapillare (2) liegt.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 25 bis 28, weiterhin einschließend: Vorsehen mindestens einer der Membrankapillaren (2) entlang einer nicht innerhalb einer laminaren Blattlage liegenden gewundenen Bahn.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 25 bis 29, einschließend: Vorsehen der Vielzahl an Membrankapillaren (2) entlang omnidirektionaler Bahnen.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 25 bis 30, wobei das Volumen durch Wählen einer gewünschten Gestalt und Größe für eine Form definiert ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 25 bis 30, weiterhin einschließend: Vorsehen der Vielzahl an Membrankapillaren (2) in der besagten Form.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 25 bis 32, weiterhin einschließend: Einführen von Gerüstmaterial in die Form um die Vielzahl an Membrankapillaren (2) herum.
Verfahren nach Anspruch 33, weiterhin einschließend das Mischen von Zellen mit dem Gerüstmaterial vor dem Einführen des Gerüstmaterials in die Form.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 25 bis 34, weiterhin einschließend: Einführen von Endothelzellen in die Membrankapillaren (2) und Stimulieren des Wachstums von Blutgefäßen an Stelle der Membrankapillaren (2).