DE60217326T2

DE60217326T2 - Von neurofilamentproteinen abgeleitete peptide und deren medizinische verwendung

Info

Publication number: DE60217326T2
Application number: DE60217326T
Authority: DE
Inventors: A. Paul Beaconsfield AVERBACK
Original assignee: Nymox Corp Canada; Nymox Corp
Current assignee: Nymox Corp Canada; Nymox Corp
Priority date: 2001-05-25
Filing date: 2002-05-24
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2022-05-25
Also published as: NZ529911A; CY1111120T1; NO20035231D0; DK1390403T3; KR100945383B1; CN1582301A; DE60217326D1; BR0209990A; CA2448348A1; US20030096350A1; ES2278916T3; WO2002097030A2; AU2002256587B2; WO2002097030A3; NO20035231L; KR20040038913A; JP4584573B2; ATE350396T1; CA2448348C; EP1390403B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Peptide, die sich aus Aminosäuresequenzen zusammensetzen, die einem Teil der Aminosäuresequenz von Neurofilamentproteinen entsprechen. Diese Verbindungen können intramuskulär, oral, intravenös, intrathekal, intratumoral, intranasal, topisch, transdermal etc. verabreicht werden, entweder aleine oder zu einem Träger konjugiert.
Beschreibung der verwandten Technik
Viele medizinische Behandlungen und Verfahren umfassen die Entfernung oder Zerstörung schädlichen oder unerwünschten Gewebes. Beispiele für solche wichtige Behandlungen umfassen die kirurgische Entferung von Krebsgewächsen, die Zerstörung von metastatischen Tumoren mit Hilfe von Chemotherapie sowie die Reduktion von drüsiger (z.B. prostatischer) Hyperplasie. Andere Beispiele umfassen die Entfernung von unerwünschtem Gesichtshaar, die Entfernung von Warzen und die Entfernung von unerwünschtem Fettgewebe. Viele dieser Behandlungen sind entweder invasiv durch komplizierte und gefährliche Chirurgie oder zerstören durch nicht-invasive Verfahren ansonsten gesundes Gewebe, das nicht Ziel der Behandlungen sind.
Es gibt einen Bedarf an einem effizienten Mittel, das schädliche oder unerwünschte Zellen und Gewebe zerstört und entweder: (i) ohne Chirurgie die Entfernung von schädlichen oder unerwünschten Zellen und Geweben erleichtert; oder (ii) das weitere Wachstum von schädlichen oder unerwünschten Zellen und Geweben hemmt, welches Mittel aber hauptsächlich lokale Wirkungen und minimale oder keine systemische Toxizität haben wird.
Krebs ist eine Abnormalität der internen regulatorischen Mechanismen einer Zelle, welche Abnormalität ein unkontrolliertes Wachstum und eine unkontrollierte Reproduktion der Zelle mit sich bringt. Normale Zellen stellen Gewebe her, und wenn diese Zellen ihre Fähigkeit verlieren, sich als eine spezifische, kontrollierte und koordinierte Einheit zu verhalten, (Dedifferenzierung) führt der Defekt zu Unordnung unter der Zellenpopulation. Wenn dies der Fall ist, wird ein Tumor gebildet.
Gutartiges übermäßiges Gewebewachstum sind Abnormalitäten, wo es erwünschenswert ist, Zellen aus einem Organismus zu entfernen. Gutartige Tumoren sind zelluläre Proliferationen, die nicht durch den Körper metastasieren, die aber dennoch Krankheitssymptome verursachen. Solche Tumoren können tödlich sein, wenn sie sich in nichtzugänglichen Bereichen in Organen, wie z.B. dem Gehirn, befinden. Gutartige Tumoren kommen in vielen anderen Organen, hierunter Lunge, Haut, Hypophyse, Schilddrüse, Nebennierenrinde und Knochenmark, Ovarium, Gebärmutter, Hoden, Bindegewebe, Muskel, Eingeweide, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Leber, Gallenblase, Pankreas, Prostata, Herz und anderen Organen.
Chirurgie ist oft die erste Stufe in der Behandlung von Krebs. Der Zweck einer Chirurgie ist verschieden. Manchmal wird Chirurgie zur Entfernung möglichst viel des erwiesenen Tumors verwendet, oder zumindest wird ein Teil des Tumors (der/die wesentliche(n) Hauptteil(e) des Tumors wird/werden entfernt so dass es einen geringeren Teil gibt, der mit anderen Mitteln behandelt werden muss). Abhängig vom Krebstyp und -ort kann Chirurgie auch dem Patienten gewissermaßen symptomatisch helfen. Wenn z.B. ein Chirurge einen großen Teil eines sich vergrößernden Gehirntumors entfernen kann, reduziert sich der Druck innerhalb des Schädels, welches zu einer Verbesserung der Symptome des Patientens führt.
Nicht alle Tumoren können operiert werden. Einige können in Teilen des Körpers lokalisiert sein, welches es unmöglich macht, sie völlig zu entfernen. Beispiele von diesen Tumoren wären Tumoren im Gehirnstamm (einem Teil des Gehirns, der den Atem steuert), oder ein Tumor, der in der Hauptblutader oder um sie herum gewachsen ist. In diesen Fällen ist die Rolle der Chirurgie wegen des hohen Risikos, das mit der Entfernung von Tumoren verbunden ist, begrenzt.
In einigen Fällen wird Chirurgie nicht dafür verwendet, einen Teil von Tumoren zu entfernen, weil es einfach nicht notwendig ist. Zum Beispiel ist Hodgkin's Lymphom ein Krebstyp der Lymphknoten, der sehr gut auf Kombinationen von Chemotherapie und Strahlentherapie reagiert. In Hodgkin's Lymphom ist Chirurgie selten erforderlich, um eine Heilung herbeizuführen, aber Chirurgie wird fast immer zur Feststellung einer Diagnose verwendet.
Chemotherapie ist eine andere gewöhnliche Form von Krebsbehandlung. Chemotherapie umfasst im wesentlichen die Verwendung von Medikationen (gewöhnlich oral oder durch Injektion verabreicht), die schnell trennende Zellen (z.B. diejenige, die in einem Tumor gefunden werden) im Körper spezifisch angreifen. Dies macht Chemotherapie zur Behandlung von Krebstypen, die schon metastasiert haben, und Tumoren, die sich durch das Blut und die Lympsysteme schnell ausbreiten können, die aber neben dem primären Tumor nicht deutlich sind, geeignet. Chemotherapie kann auch zur Erhöhung der Reaktion lokalisierter Tumoren auf Chirurgie und Strahlungstherapie verwendet werden. Dies ist z.B. für einige Krebstypen im Kopf und Genick der Fall.
Unglücklicherweise können andere Zellen im menschlichen Körper, die sich normalerweise schnell trennen (wie z.B. die Magenauskleidung und Haar), auch von Chemotherapie beeinflusst werden. Deswegen induzieren einige (obwohl nicht alle) Chemotherapiemittel Übelkeit oder Haarausfall. Diese Nebenwirkungen sind vorübergehend, und Ärzte können Medikationen bereitstellen, um dazu beizutragen, viele dieser Nebenwirkungen zu verrringern. Im allgemeinen werden Chemotherapiebehandlungen somit von Patienten gut toleriert. Da unser Wissen ständig wächst, haben Forscher neuere Chemotherapiemittel entwickelt, die Krebszellen nicht nur besser zerstören können, sondern auch weniger Nebenwirkungen für den Patienten haben.
Chemotherapie wird auf viele verschiedene Weisen den Patienten verabreicht. Einige sind Tabletten, die täglich oder ein mal pro Woche oder nach einem anderen Plan eingenommen werden, und einige werden durch eine intravenöse Injektion verabreicht. Um die Behandlung in Form einer einspritzbaren Chemotherapie zu erhalten, geht der Patient zum Arzt oder ins Krankenhaus. Andere chemotherapeutische Mittel erfordern ständige Infusion in die Blutbahn 24 Stunden pro Tag. Für diese Typen von Chemotherapie wird ein kleines chirurgisches Verfahren ausgeführt, um eine kleine Pumpe, die vom Patienten getragen wird, zu implantieren. Die Pumpe verabreicht dann langsam die Medikation. In vielen Fällen wird ein bleibender Anschluss in der Ader des Patienten angebracht, um den Bedarf an wiederholten Nadelstechen zu beseitigen.
Strahlungstherapie ist ein anderes gewöhnlich eingesetztes Mittel zur Bekämpfung von Krebs. Strahlung zerstört Krebs durch Beschädigung der DNA innerhalb der Tumorzellen. Die Strahlung wird in zwei möglichen Weisen "appliziert". Die erste und gewöhnlichste Weise sieht vor, dass ein Strahl von Strahlung sehr genau mit Fokus auf den Tumor auf den Patienten gerichtet wird. Dabei liegt der Patient auf einem Tisch, und der Strahl bewegt sich um ihn/sie herum. Dies dauert nur einige Minuten, wird aber fünf Tage pro Woche 3-6 Wochen lang (abhängig vom Tumortyp) vorgenommen, um eine bestimmte vorgeschriebene "Gesamtdosis" zu erreichen.
Manchmal wird ein anderes Strahlungsverfahren mit der Bezeichnung Brachytherapie verwendet, das vorsieht, dass radioaktive Pellets ("Samen") oder Drähte am Tumorbereich des Körpers implantiert werden. Die Implantate können vorübergehend oder bleibend sein. In Bezug auf bleibende Implantate "zerfällt" oder klingt die Strahlung in den Samen innerhalb eines Zeitraums von Tagen oder Wochen ab, so dass der Patient nicht radioaktiv ist. Was vorübergehende Implantate angeht, wird die Gesamtdosis von Strahlung normalerweise innerhalb von etwa zwei Tagen abgegeben, und der Patient muss während dieses Zeitraums im Krankenhaus bleiben. Für beide Typen von Brachytherapie wird Strahlung generell einem sehr zielgerichteten Bereich verabreicht, um eine lokale Kontrolle über einen Krebstyp (im Gegensatz zur Behandlung des ganzen Körpers wie bei Chemotherapie) zu erzielen.
Einige besonders ausgewählte Patienten können für Knochenmarktransplantate überwiesen sein. Dieses Verfahren wird normalerweise ausgeführt, weil entweder ein Patient an einem besonders aggressiven Krebs leidet, oder weil er an einem Krebs leidet, der nach Behandlung mit herkömmlicher Therapie rückfällig wird. Knochenmarktransplantation ist ein kompliziertes Verfahren. Es gibt viele Typen, und ihr Potential, Nebenwirkungen und Heilung zu verursachen, variiert. Die meisten Transplantate werden in Spezialzentren ausgeführt, und in vielen Fällen wird die Anwendung hiervon als Erforschung betrachtet.
Es kommen weitere Therapien vor, obwohl die meisten immer noch in klinischen Studien erforscht werden und noch nicht Standardpflege geworden sind. Beispiele umfassen die Anwendung von Immuntherapie, monoklonalen Antikörpern, Anti-angiogenesefaktoren und Gentherapie.
Immuntherapie: Verschiedene Verfahren sind entwickelt worden, um dazu beizutragen, dass das eigene Immunsystem des Patienten Krebs bekämpfen kann, von Strahlung oder Chemotherapie völlig getrennt. Um das Ziel zu erreichen, injizieren die Forscher dem Patienten oft mit einem besonders abgeleiteten Impfstoff. In diesem Bereich ist meist der Forschung hinsichtlich Melanoma vorgenommen worden, obwohl andere Krebstypen jetzt auch abgezielt werden.
Monoklonale Antikörper: Dies sind kleine Proteine, die insbesondere gestaltet sind, um an Krebszellen (und nicht an normale Zellen) zu binden, indem von Unterschieden zwischen Krebszellen und Nicht-Krebszellen in deren Membranen profitiert wird. Bevor die Antikörper dem Patienten verabreicht werden, werden sie oft an verschiedenen zytotoxischen Verbindungen angehängt ("tagged") gebunden oder werden radioaktiv gemacht, so dass der Antikörper vorzugsweise die Krebszellen abzielt, wobei das toxische Mittel den gewünschten Zellen verabreicht wird.
Anti-angiogenesefaktoren: Da Krebszellen sich schnell trennen und Tumoren wachsen, können sie bald ihrer Blutzufuhr entwachsen. Um hierfür zu kompensieren, scheiden einige Tumoren eine Verbindung aus, bei der es sich gezeigt hat, dass sie dazu beiträgt, das Wachstum von Blutadern in ihrer Umgebung zu induzieren, wobei eine ständige Zufuhr von Nährstoffen den Krebszellen gewährleistet wird. Neulich haben Forscher untersucht, wie man diesen Prozess abschalten kann, indem man das Wachstum der Blutadern abbricht und/oder verhindert, dass zusätzliches Blut an die Krebszellen gelangt.
Gentherapie: Krebs ist das Ergebnis einer Reihe von Mutationen, die letztendlich zur Produktion einer Krebszelle und ihrer überhöhten Proliferation davon führen. Krebstypen können behandelt werden, indem Gene in die Krebszellen eingeführt werden, die entweder zur Eindämmung oder zum Abbrechen der Proliferation des Krebses, zum Einschalten der programmierten Zellenmechanismen der Zelle, um die Zelle zu zerstören, zur Verbesserung der Immunerkennung der Zelle oder zur Ausdrückung eines Pro-Arzneimittels, das sich zu einem toxischen Metaboliten oder einem Zytokin, die Tumorwachstum hemmen, umwandelt, agieren.
Gutartige Tumoren und Missbildungen können auch durch eine Reihe von Verfahren, hierunter Chirurgie, Röntgentherapie, medikamentöse Therapie, thermische oder elektrische Abtragung, Kryotherapie etc. behandelt werden. Obwohl gutartige Tumoren nicht metastisieren, können sie groß wachsen und wieder auftreten. Chirurgische Extirpation von gutartigen Tumoren ist mit all den für Chirurgie gewöhnlichen Problemen und Nebenwirkungen verbunden und muss für einige gutartige Tumoren, wie z.B. hypophysäre Adenomen, Meningenomen des Gehirns, prostatische Hyperplasie etc., oft wiederholt durchgeführt werden.
Andere Zustände, die unerwünschte zelluläre Elemente umfassen, und wo selektives zelluläres Entfernen erwünscht ist, umfassen z.B. Herzkrankheit und Schlaganfälle. Diese Zustände werden typisch durch Atherosklerose verursacht, eine proliferative Läsion von fibrösfettigen und modifizierten Glattmuskelelementen, die die Blutaderwand deformieren, das Lumen einengen, die Blutströmung einschränkt, zu fokalen Blutgerinnseln prädisponieren und letztendlich zur Blockierung und Herzinfarkt führen. Behandlungen für Atherosklerose umfassen Bypasstransplantate, künstliche Transplantate, Angioplastie mit Rekanalisierung, Kürretage, Strahlung, Laser oder andere Entfernungsformen, Pharmacotherapie, um Atherosklerose durch Lipidreduktion zu hemmen, Anti-Gerinnsel-Therapien und generelle Maßnahmen von Diät, Motion und Lebensstil. Es gibt einen Bedarf an ein Verfahren zum Entfernen atherosklerotischer Läsionen ohne das Risiko und Nebenwirkungen chirurgischer Verfahren.
Andere Beispiele für unerwünschte zelluläre Elemente, wo selektives zelluläres Entfernen erwünscht ist, umfassen viralinduziertes Wachstum, wie z.B. Warzen. Ein anderes Beispiel sind hypertrophische entzündliche Massen, die bei Entzündungszuständen gefunden werden, und hypertrophische Narben oder Keloide. Zusätzliche Beispiele werden in kosmetischen Kontexten gefunden, wie z.B. das Entfernen von Haar, z.B. Gesichtshaar, oder zur Verminderung unerwünschter Gewebeflächen für kosmetische Zwecke, wie z.B. in der Gesichtshaut und in den Bindegeweben oder in der Haut und in den Bindegeweben der Extremitäten.
Noch weitere Beispiele werden dem Fachmann offenkundig sein. In allen oder in den meisten Beispielen gibt es einen Bedarf an Behandlungen, die ohne die Risiken und Nebenwirkungen der herkömmlichen Therapien die unerwünschten zellulären Elemente entfernen oder zerstören können. Es gibt auch einen Bedarf, die unerwünschten zellulären Elemente mit mehr Präzision zu entfernen.
Neurofilamentproteine (NTP) sind eine Familie neulich charakterisierter Gehirnproteine. Ein Mitglied dieser Familie, AD7C-NTP, ist ein ~41 kD membranverbundenes Phosphorprotein mit Funktionen, die mit Nervensprossung verbunden sind (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); de la Monte et al., Alz.. Rep., 2: 327-332 (1999); de la Monte SM and Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3: 345-353 (2001)). Das Gen, das für AD7C-NTP kodiert, und der vorhergesagten Proteinsequenz für AD7C-NTP sind identifiziert und beschrieben worden (de la Monte et al.,). Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997)). Außer der ~41 kD Spezien sind andere Spezien von Neurofilamentprotein (~26 kD, ~21 kD, (~17 kD und ~15 kD) identifiziert und mit neuroectodermischen Tumoren, Astrozytomen und Glioblastomen und mit Beschädigung infolge von Hypoxie, Schema oder zerebralem Infarkt verbunden worden (Xu et al., Cancer Research, 53: 3823-3829 (1993); de la Monte et al.,). Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurot. Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurot. Sci., 135(2): 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); und de la Monte et al., Alz.. Rep., 2: 327-332 (1999)).
Spezien von Neurofilamentprotein sind in US-Patent Nr. 5948634; 5948888 und 5830670, alle betreffend "Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease" und in US-Patent Nr. 6071705 für "Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction" beschrieben und beansprucht worden. Wie darin beschrieben wird NTP während Absterbens von Zellen aufreguliert und produziert. Abgestorbene und sterbende Nervenzellen werden somit als überproduzierende NTP beschrieben, und dementsprechend indiziert ihr Vorkommen das Absterben von Nervenzellen und den Beginn von Alzheimerkrankheit (AD) an.
Andere Spezien von Neurofilamentprotein sind als andere Produkte des AD7C-NTP-Gens (z.B. ein Protein mit 112 Aminosäuren, in NCBI Entrez-Protein database Accession #XP_032307 PID g15928971 beschrieben) oder als ähnlich mit Neurofilamentproteinen (z.B. ein Protein mit 106 Aminosäuren, in NCBI Entrez-Protein database Accession #AAH14951 PID g15928971 beschrieben, ein anderes Protein mit 106 Aminosäuren, in NCBI Entrez-Protein database Accession #XP_039102 PID g18599339 beschrieben, und ein Protein mit 61 Aminosäuren, in NCBI Entrez-Protein database Accession #AAH02534 PID g12803421 beschrieben) identifiziert worden.
Neurofilamentprotein ist mit AD verbunden, und NTP wird in Verbindung mit Absterben von Zellen in AD aufreguliert. Im Vergleich mit Kontrollen wird AD7C-NTP mRNA in AD-Gehirn aufreguliert; AD7C-NTP-Proteinpegel in Gehirn und in CSF sind in AD höher als Kontrollen; und AD7C-NTP-Immunreaktivität wird in senilen Plaques, in neurofibrillären Verfilzungen (NFT), in degenerierenden Neuronen, Neuropil-Faden und dystrophischen neurotischen Sprossen in AD- und Downs Syndrom-Gehirnen gefunden (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 419-423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3): 1004-13 (1990); de la Monte et al., J. Neurot. Sci., 113(2): 152-64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6): 733-42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurot., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurot. Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); und de la Monte et al., Alz.. Rep., 2: 327-332 (1999)). NTP wird innerhalb Zellen, in feinen Prozessen im Neuropil, lokalisiert, oder ist extrazellulär in sowohl AD- als auch Downs Syndrom-Gehirnen, siehe de la Monte et al., Ann. Neurot., 32(6): 733-42 (1992).
Erhöhte Pegel von AD7C-NTP-Protein sind in sowohl CSF als auch im Urin von AD-Patienten gefunden worden (de la Monte und Wands, Front Biosci 7: 989-96 (2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3: 345-353 (2001); Munzar et al, Alzheimer's Reports 4: 61-65 (2001); Kahle et al, Neurology 54: 1498-1504 (2000) und Averback Neurology 55: 1068 (2000); Munzar et al, Alzheimer Reports 3: 155-159 (2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2: 327-332 (1999); Ghanbari et al, J Clin Lab Anal 12: 285-288 (1998); Ghanbari et al, J Clin Lab Anal 12: 223-226 (1998); Ghanbari et al, Journal of Contemporary Neurology 1998; 4A: 2-6 (1998); und de la Monte et al, J Clin Invest 100: 3093-3104 (1997).
Überexpression von NTP ist auch zum Prozess des Absterbens von Zellen bei Alzheimerkrankheit geknüpft worden (de la Monte und Wands, J. Neuropatho. and Exp. Neuro., 60: 195-207 (2001); de la Monte und Wands, Cell Mol Life Sci 58: 844-49 (2001). AD7C-NTP ist auch in Downs Syndrom-Gehirngewebe (Wands et al., Internationale Patentpublikation Nr. WO 90/06993; de la Monte et al, J Neurot Sci 135: 118-25 (1996); de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)) identifiziert worden. Einige Hinweise deuten an, dass Überexpression von NTP auch mit normalem Normaverspannungsglaukom verbunden sein kann (Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21: 867-76 (2000)).
WO 00/63230 beschreibt ein 47-mer-Polypeptid, das SEQ ID No: 35 der vorliegenden Erfindung umfasst, welches Polypeptid für eine Reihe von Krankheiten (Krebs, neurologische Krankheiten etc.) geeignet sein kann. WO 00/58495 beschreibt ein 47-mer-Polypeptid, das SEQ ID No: 11 und 12 der vorliegenden Erfindung umfasst, welches Polypeptid für eine Reihe von Krankheiten (Krebs, neurologische Krankheiten etc.) geeignet sein kann. Sijts, A.J.A.M. et al (J. Immun., Band 152, 1994, 106-116) beschreibt das Peptid SSWDYITV, das bei Peptidimpfungsstrategien gegen Tumoren geeignet sein kann. WO 99/19347 beschreibt das Peptid ISGPCPK zur Behandlung von Krebs.
Es hat sich gezeigt, dass NTP ein effizientes Mittel dafür ist, Absterben von Zellen sowohl in vitro in Gliom- und Neuroblastomzellkulturen als auch in vivo in normalem Nagermuskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis sowie in einer Reihe von verschiedenen Tumoren humanen und nicht-humanen Ursprungs, hierunter Brustkarzinomen, Hautkarzinomen und Papillomen, Dickdarmkarzinomen, Gehirngliomen und anderen in Nagermodellen zu verursachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Innerhalb der Technik gibt es immer noch einen Bedarf an neuen, weniger toxischen Behandlungen zur Behandlung unerwünschter zellulärer Elemente. Diese Erfindung betrifft die überraschende Entdeckung, dass Peptide, die Aminosäuresequenzen enthalten, die einem Teil der Aminosäuresequenz von Neurofilamentproteinen entsprechen, auch solche Mittel sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung solcher Peptide zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, der aus der Gruppe bestehend aus: einem gutartigen oder bösartigen Tumor; einer Hyperplasie, Hypertrophie, oder übermäßigem Wachstum; einem viral, bakteriell oder parasitartig veränderten Gewebe; einer Missbildung eines Gewebes; Hypertrophie der Mandeln; prostatischer Hyperplasie; einer kosmetischen Modifizierung des Gewebes; einer Gefäßerkrankung; Hämorrhoiden; Krampfadern; Atherosklerose oder Atheriosklerose; einer Entzündungserkrankung; autoimmuner Erkrankung; Stoffwechselerkrankung; vererblicher/genetischer Erkrankung; traumatischer Erkrankung; ernährungsbedingter Mangelerkrankung; Infektionserkrankung; Amyloidablagerung; Fibroseerkrankung; kongenitaler Missbildung; Enzymdefizienzerkrankung; Strahlungserkrankung, endokriner Erkrankung und degenerativer Erkrankung ausgewählt ist. Eine solche Anwendung umfasst, dass einem bedürftigem Säugetier eine therapeutisch effektive Menge eines Peptids verabreicht wird, das aus Aminosäuresequenzen besteht, die einem Teil der Aminosäuresequenz von Neurofilamentprotein (NTP) entsprechen.
Ein solches Peptid ("NTP-Peptid") kann alleine oder zu einem Träger kojugiert verabreicht werden. Das NTP-Peptid kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal), intracerebroventrikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokular, intraarteriell, topisch, transdermal, durch ein Aerosol, eine Infusion, eine Bolusinjektion, eine Implantationseinrichtung, ein "Sustained release"-System etc., entweder alleine oder zu einem Träger konjugiert verabreicht werden.
Darüber hinaus kann das NTP-Peptid zusammen mit anderen Therapien zur Behandlung von gutartigen oder bösartigen Tumoren und anderem unerwünschtem oder schädlichem zellulärem Wachstum verwendet werden.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Zeigt die vollständige Aminosäuresequenz und Nukleinsäuresequenz des AD7C-NTP-Gens und des AD7C-NTP-Proteinprodukts dieses Gens (Sequenz 120 und 121 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888; de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); NCBI Entrez-Protein Accession #AAC08737; PID g3002527) [SEQ ID NO. 1].
2: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neurofilamentproteins mit 122 Aminosäuren (Sequenz 40 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NO. 2].
3: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neurofilamentproteins mit 112 Aminosäuren (NCBI Entrez-Protein Accession #XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NO. 3].
4: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen eines neurofilamentproteinähnlichen Proteins mit 106 Aminosäuren (NCBI Entrez-Protein Accession #AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NO. 4].
5: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen eines neurofilamentproteinähnlichen Proteins mit 106 Aminosäuren (NCBI Entrez-Protein Accession #XP_039102 PID g18599339) [SEQ ID NO. 5].
6: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neurofilamentproteins mit 98 Aminosäuren (Sequenz 30 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NO. 6].
7: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neurofilamentproteins mit 75 Aminosäuren (Sequenz 48 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NO. 7].
8: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neurofilamentproteins mit 68 Aminosäuren (Sequenz 36 aus dem US-Patent Nr. 5830670,5948634 und 5948888; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NO. 8].
9: Zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des neurofilamentproteinähnlichen Proteins mit 61 Aminosäuren (NCBI Entrez-Protein Accession #AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NO. 9].
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Der Ausdruck "AD7C-NTP" bezeichnet das ~41 kD Protein und das Gen und die Nukleinsäuresequenzen, die dafür kodieren, und die in de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093-104 (1997), in Sequenz 120 und 121 im US-Patent Nr. 5948634, 5948888 und 5830670 und in GenBank #AF010144 beschrieben sind, die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von welchen in 1 dargestellt sind. Der Ausdruck "AD7C-NTP" umfasst auch biologisch aktive Fragmente, Varianten, Derivate, Homologe und Nachahmungen von AD7C-NTP.
Der Ausdruck "NTP" oder "Neurofilamentprotein" bezeichnet Neurofilamentproteine und verwandte Moleküle (hierunter Bauchspeicheldrüse-Filamentprotein) und die Nukleinsäuresequenzen, die für diese Proteine kodieren, und umfasst (begrenzen sich aber nicht auf) folgende Proteine und Nukleinsäuresequenzen, die für die Aminosäuresequenzen dieser Proteine kodieren:

(a) AD7C-NTP;
(b) die ~42, (~)26, (~)21, (~)17, (~)14 und ~8 kD Arten von Neurofilamentprotein, wie in US-Patent Nr. 5948634, 5948888, 5830670 und 6071705 und in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurot., 55(10): 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurot. Sci., 138(1-2): 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clan. Invest., 100: 3093-3104 (1997) und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999) beschrieben.
(c) Proteine, die spezifisch vom monoklonalen Antikörper #2, hinterlegt beim American Type Culture Collection, Manassas, Va. unter der Hinterlegungsnummer H6-12546, oder vom monoklonalen Antikörper #5, hinterlegt beim American Type Culture Collection, Manassas, Va. unter der Hinterlegungsnummer H6-12545, erkannt werden;
(d) Proteiene, die vom AD7C-NTP-Gen kodiert werden;
(e) das Neurofilamentprotein mit 122 Aminosäuren, beschrieben in Sequenz 40 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888 und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25447, PID g10048540 aufgelistet, wofür die Aminosäuresequenzen in 2 dargestellt sind;
(f) das Neurofilamentprotein mit 112 Aminosäuren, in NCBI Entrez-Protein Accession #XP_032307, PID g14725132 aufgelistet, wofür die Aminosäuresequenzen in 3 dargestellt sind;
(g) ein neurofilamentproteinähnliches Protein mit 106 Aminosäuren, in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH14951 PID g15928971 aufgelistet, wofür die Aminosäuresequenzen in 4 dargestellt sind;
(h) ein neurofilamentproteinähnliches Protein mit 106 Aminosäuren, in NCBI Entrez-Protein Accession #XP_039102, PID g18599339 aufgelistet, wofür die Aminosäuresequenz in 5 dargestellt ist;
(i) das Neurofilamentprotein mit 98 Aminosäuren, beschrieben in Sequenz 30 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888 und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25445, PID g10048538 aufgelistet, wofür die Aminosäuresequenzen in 6 dargestellt sind;
(j) das Neurofilamentprotein mit 75 Aminosäuren, beschrieben in Sequenz 48 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888 und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25448, PID g10048541 aufgelistet, wofür die Aminosäuresequenzen in 7 dargestellt sind;
(k) das Neurofilamentprotein mit 68 Aminosäuren, beschrieben in Sequenz 36 aus dem US-Patent Nr. 5830670, 5948634 und 5948888 und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25446, PID g10048539 aufgelistet, wofür die Aminosäuresequenzen in 8 dargestellt sind;
(l) das neurofilamentproteinähnliche Protein mit 61 Aminosäuren, aufgelistet in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH02534, PID g12803421, wofür die Aminosäuresequenzen in 9 dargestellt sind;
(m) Bauchspeicheldrüse-Filamentprotein;
(n) neurales Bauchspeicheldrüse-Filamentprotein (nPTP), beschrieben in US-Patent Nr. 6071705; und
(o) Proteine, die spezifisch von den Antikörpern erkannt werden, die von einem Hybridom aus der Gruppe bestehend aus HB 9934, HB 9935 und HB 9936, hinterlegt beim American Type Culture Collection, produziert werden. Aminosäuren und Aminosäurereste, die hierin beschrieben sind, können in

Tabelle 1
Der Ausdruck "NTP-Peptid" bezeichnet die folgenden Peptide, die aus der Aminosäuresequenz für AD7C-NTP abgeleitet sind, wie von den unten stehenden 5 Aminosäuresequenzen beschrieben:

NTP-Peptid #1 [SEQ ID NO. 10], AD7C-NTP p1-15 MEFSLLLPRLECNGA Met-Glu-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-Pro-Arg-Leu-Glu-Cys-Asn- Gly-Ala

NTP-Peptid #2 [SEQ ID NO. 11], AD7C-NTP p14-28 GAISAHRNLRLPGSS Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro-Gly-Ser-Ser

NTP-Peptid #3 [SEQ ID NO. 12], AD7C-NTP p29-45 DSPASASPVAGITGMCT Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met-Cys-Thr

NTP-Peptid #4 [SEQ ID NO. 13], AD7C-NTP p43-58 MCTHARLILYFFLVEM Met-Cys-Thr-His-Ala-Arg-Leu-Ile-Leu-Tyr-Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met

NTP-Peptid #5 [SEQ ID NO. 14], AD7C-NTP p52-62 YFFLVEMEFLH Tyr-Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Glu-Phe-Leu-His

NTP-Peptid #6 [SEQ ID NO. 15], AD7C-NTP p63-73 VGQAGLELPTS Val-Gly-Gln-Ala-Gly-Leu-Glu-Leu-Pro-Thr-Ser

NTP-Peptid #7 [SEQ ID NO. 16], AD7C-NTP p74-90 DDPSVSASQSARYRTGH Asp-Asp-Pro-Ser-Val-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Arg-Tyr-Arg-Thr-Gly-His

NTP-Peptid #8 [SEQ ID NO. 17], AD7C-NTP p68-101 TGHHARLCLANFCG Thr-Gly-His-His-Ala-Arg-Leu-Cys-Leu-Ala-Asn-Phe-Cys-Gly

NTP-Peptid #9 [SEQ ID NO. 18], AD7C-NTP p97-113 ANFCGRNRVSLMCPSWS Ala-Asn-Phe-Cys-Gly-Arg-Asn-Arg-Val-Ser-Leu-Met-Cys-Pro-Ser-Trp-Ser

NTP-Peptid #10 [SEQ ID NO. 19], AD7C-NTP p114-132 PELKQSTCLSLPKCWDYRR Pro-Glu-Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #11 [SEQ ID NO. 20], AD7C-NTP p116-132 LKQSTCLSLPKCWDYRR Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #12 [SEQ ID NO. 21], AD7C-NTP p119-132 STCLSLPKCWDYRR Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #13 [SEQ ID NO. 22], AD7C-NTP p122-132 LSLPKCWDYRR Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #14 [SEQ ID NO. 23], AD7C-NTP p126-138 KCWDYRRAAVPGL Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu

NTP-Peptid #15 [SEQ ID NO. 24], AD7C-NTP p126-144 KCWDYRRAAVPGLFILFFL Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu

NTP-Peptid #16 [SEQ ID NO. 25], AD7C-NTP p126-149 KCWDYRRAAVPGLFILFFLRHRCP Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro

NTP-Peptid #17 [SEQ ID NO. 26], AD7C-NTP p126-163 KCWDYRRAAVPGLFILFFLRHRCPTLTQDEVQWCDHSS Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser

NTP-Peptid #18 [SEQ ID NO. 27], AD7C-NTP p128-132, P241-245 WDYRR Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #19 [SEQ ID NO. 28], AD7C-NTP p139-151 FILFFLRHRCPTL Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu

NTP-Peptid #20 [SEQ ID NO. 29], AD7C-NTP p139-163 FILFFLRHRCPTLTQDEVQWCDHSS Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Clu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser

NTP-Peptid #21 [SEQ ID NO. 30], AD7C-NTP p146-174 HRCPTLTQDEVQWCDHSSLQPSTPEIKHP His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser-Leu-Gln-Pro-Ser-Thr-Pro-Glu-Ile-Lys-His-Pro

NTP-Peptid #22 [SEQ ID NO. 31], AD7C-NTP p175-188 PASASQVAGTKDMH Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met-His

NTP-Peptid #23 [SEQ ID NO. 31], AD7C-NTP p186-203 DMHHYTWLIFIFIFNFLR Asp-Met-His-His-Tyr-Thr-Trp-Leu-Ile-Phe-Ile-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu-Arg

NTP-Peptid #24 [SEQ ID NO. 33], AD7C-NTP p189-207 QSLN His-Tyr-Thr-Trp-Leu-Ile-Phe-Ile-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu-Arg-Gln-Ser-Leu-Asn

NTP-Peptid #25 [SEQ ID NO. 34], AD7C-NTP p208-252 SVTQAGVQWRNLGSLQPLPPGFKLFSCPSLLSSWDYRRPPRLANF Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp-Arg-Asn-Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Gly-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe

NTP-Peptid #26 [SEQ ID NO. 35], AD7C-NTP p227-245 PGFKLFSCPSLLSSWDYRR Pro-Gly-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #27 [SEQ ID NO. 36], AD7C-NTP p229-252 FKLFSCPSLLSSWDYRRPPRLANF Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe

NTP-Peptid #28 [SEQ ID NO. 37], AD7C-NTP p232-245 FSCPSLLSSWDYRR Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #29 [SEQ ID NO. 38], AD7C-NTP p236-245 SLLSSWDYRR Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #30 [SEQ ID NO. 39], AD7C-NTP p239-243, p339-343 SSWDY Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr

NTP-Peptid #31 [SEQ ID NO. 40], AD7C-NTP p239-245 SSWDYRR Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

NTP-Peptid #32 [SEQ ID NO. 41], AD7C-NTP p239-263 SSWDYRRPPRLANFFVFLVEMGFTM Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Phe-Val-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Gly-Phe-Thr-Met

NTP-Peptid #33 [SEQ ID NO. 42], AD7C-NTP p253-263 FVFLVEMGFTM Phe-Val-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Gly-Phe-Thr-Met

NTP-Peptid #34 [SEQ ID NO. 43], AD7C-NTP p259-281 MGFTMFARLILISGPCDLPASAS Met-Gly-Phe-Thr-Met-Phe-Ala-Arg-Leu-Ile-Leu-Ile-Ser-Gly-Pro-Cys-Asp-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser

NTP-Peptid #35 [SEQ ID NO. 44], AD7C-NTP p270-274 ISGPC Ile-Ser-Gly-Pro-Cys

NTP-Peptid #36 [SEQ ID NO. 45], AD7C-NTP p275-291 DLPASASQSAGITGVSH Asp-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val-Ser-His

NTP-Peptid #37 [SEQ ID NO. 46], AD7C-NTP p288-304 GVSHHARLIFNFCLFEM Gly-Val-Ser-His-His-Arg-Leu-Ile-Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe-Glu-Met

NTP-Peptid #38 [SEQ ID NO. 47], AD7C-NTP p298-307 NFCLFEMFSH Asn-Phe-Cys-Leu-Phe-Glu-Met-Glu-Ser-His

NTP-Peptid #39 [SEQ ID NO. 48], AD7C-NTP p308-353 SVTQAGVQWPNLGSLQPLPPGLKRFSCLSLPSSWDYGHLPPHPANF Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp-Pro-Asn-Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His-Leu-Pro-Pro-His-Pro-Ala-Asn-Phe

NTP-Peptid #40 [SEQ ID NO. 49], AD7C-NTP p326-344 PPGLKRFSCLSLPSSWDYG Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly

NTP-Peptid #41 [SEQ ID NO. 50], AD7C-NTP p332-345 FSCLSLPSSWDYGH Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His

NTP-Peptid #42 [SEQ ID NO. 51], AD7C-NTP p335-343 LSLPSSWDY Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly

NTP-Peptid #43 [SEQ ID NO. 52], AD7C-NTP p339-375 SSWDYGHLPPHPANFCIFIRGGVSPYLSGWSQTPDLR Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His-Leu-Pro-Pro-His-Pro-Ala-Asn-Phe-Cys-Ile-Phe-Ile-Arg-Gly-Gly-Val-Ser-Pro-Tyr-Leu-Ser-Gly-Trp-Ser-Gln-Thr-Pro-Asp-Leu-Arg

NTP-Peptide, die von dieser Erfindung umfasst sind, können unter Anwendung von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie z.B. rekombinante DNA-Technologie, Proteinsynthese und Isolation von natürlich vorkommenden NTP-Peptiden.
Ein NTP-Peptid kann unter Anwendung von wohlbekannten rekombinanten DNA-Technologieverfahren hergestellt werden, wie z.B. denjenigen Verfahren, die in Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) und/oder Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. und Wiley and Sons, N.Y. [1994] beschrieben sind.
Ein Gen oder eine cDNA, das/die für ein NTP-Peptid kodiert, kann z.B. durch Screenen einer genomischen Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden. Proben oder Primer, die zum Screenen der Bibliothek geeignet sind, können auf der Basis von Sequenzinformation für andere bekannte Gene oder Genfragmente aus der gleichen oder einer ähnlichen Genfamilie, wie z.B. konservierte Motive, die in anderen NTP-Proteinen gefunden werden, generiert werden. In den Fällen, wo ein Gen, das für ein NTP-Peptid kodiert, aus einer Spezies identifiziert worden ist, kann das gesamte Gen oder ein Teil des Gens ausserdem als eine Probe zum Identifizieren homologer Gene aus anderen Spezien verwendet werden. Die Proben oder Primer können zum Screenen von cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Gewebequellen, die voraussichtlich ein NTP-Gen ausdrücken, verwendet werden. Typisch werden Bedingungen von hoher Stringenz zum Screenen verwendet, um die Anzahl falscher Positive, die aus dem Screen erhalten werden, zu minimieren.
Ein anderer Weg zur Herstellung eines Gens, das für ein NTP-Peptid kodiert, besteht darin, chemische Synthese unter Anwendung von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, wie z.B. denjenigen, die von Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 [1989]) beschrieben sind, zu verwenden. Diese Verfahren umfassen unter anderem das Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonatverfahren zur Nukleinsäuresynthese. Ein bevorzugtes Verfahren für eine solche chemische Synthese ist polymerunterstützte Synthese unter Anwendung von standardmäßiger Phosphoramiditchemie. Die DNA, die für ein NTP-Peptid kodiert, hat typisch eine Länge von mehreren hunderten Nukleotiden. Nukleinsäuren größer als ca. 100 Nukleotiden können unter Anwendung dieser Verfahren als mehrere Fragmente synthetisiert werden. Die Fragmente können dann zur Bildung des NTP-Peptids in voller Länge zusammenligiert werden. Das DNA-Fragment, das für das aminoterminale Ende des Proteins kodiert, hat einen ATG, der für ein Methioninrest kodiert. Dieses Methionin kann eventuell in der reifen Form des NTP-Peptids vorkommen, abhängig davon, ob das Protein, das in der Wirtszelle produziert wird, dafür konstruiert ist, aus dieser Zelle ausgeschieden zu werden.
Das Gen, die cDNA oder ein Fragment davon, das/die für das NTP-Peptid kodiert, kann unter Anwendung standardmäßiger Ligierungsverfahren in einen angemessenen Expressions- oder Amplifikationsvektor eingesetzt werden. Der Vektor wird typisch dafür ausgewählt, in der bestimmten verwendeten Wirtszelle (d.h. der Vektor ist mit dem Wirtszellenmechanismus kompatibel, so dass die Amplifikation des Gens und/oder die Expression des Gens vorkommen können/kann), funktionell zu sein. Das Gen, die cDNA oder ein Fragment davon, das/die für das NTP-Peptid kodiert, kann in Prokaryot-, Hefe-, Insekt-(Baculovirussysteme) und/oder eukaryoten Wirtzellen amplifiziert/ausgedrückt werden. Die Auswahl der Wirtszelle hängt teilweise davon ab, ob das NTP-Peptid zu glycosylieren und/oder zu phosphorylieren ist. Hefe-, Insekt- oder Saugetier-Wirtszellen werden gegebenenfalls bevorzugt.
Typisch enthalten die Vektoren, die in irgendeiner der Wirtszellen verwendet werden, zumindest eine 5'-flankierende Sequenz (auch als einen "Promotor" bezeichnet) und andere regulierende Elemente sowie (einen) Verstärker, ein Replikationsoriginelement, ein Transkriptionsabschlusselement, eine vollständige Intronsequenz mit einer Spender- und Akzeptor-Spleißstelle, eine Signalpeptidsequenz, ein Ribosom-Bindungsstelle-Element, eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinkeregion zum Einsetzen der Nukleinsäure, die für das auszudrückende Polypeptid kodiert, und ein wählbares Markerelement. Jedes dieser Elemente wird unten behandelt. Der Vektor kann eventuell eine "tag"-Sequenz, d.h. ein Oligonukleotidmolekül, das sich an dem 5'- oder 3'-Ende der NTP-proteinkodierenden Sequenz befindet, enthalten; das Oligonukleotidmolekül kodiert für polyHis (wie z.B. hexaHis) oder andere "Tags", wie z.B. FLAG, HA (Hemaglutinin-Influenza-Virus) oder myc, wofür kommerziell zugängliche Antikörper erhältlich sind. Typisch wird der Tag nach Expression des Polypeptids zum Polypeptid fusioniert und kann als ein Mittel zur Affinitätsaufreinigung des NTP-Peptids aus der Wirtszelle dienen. Affinitätsaufreinigung kann z.B. durch Säulenchromatographie unter Anwendung von Antikörpern gegen den Tag als eine Affinitätsmatrix erreicht werden. Danach kann der Tag durch verschiedene Wege, z.B. unter Anwendung von bestimmten Peptidasen, eventuell aus dem aufgereinigten NTP-Protein oder NTP-Peptid entfernt werden.
Das Scharnier und die Fc-Region des humanen Immunglobulins könnten sowohl am N-terminalen als auch am C-terminalen Ende des NTP-Peptids von einem Fachmann fusioniert werden. Das nachfolgende Fc-Fusionsprotein könnte mit Hilfe einer Protein A-Affinitätssäule aufgereinigt werden. Es ist bekannt, dass Fc eine lange pharmakokinetische Halbwertzeit in vivo ausweist, und es wurde gefunden, dass Proteine, die zu Fc fusioniert worden sind, eine wesentlich größere Halbwertzeit in vivo als das nicht-fusionierte Gegenstück ausdrücken. Fusion zur Fc-Region ermöglicht somit auch Dimerisierung/Multimerisierung des Moleküls, welches für Bioaktivität einiger Moleküle geeignet sein kann.
Die 5'-flankierende Sequenz kann homolog (d.h. aus der gleichen Spezies und/oder dem gleichen Stamm als der Wirtszelle), heterolog (d.h. aus einer anderen Art als der Wirtszellenart oder -stamm), hybrid (d.h. eine Kombination der 5'-flankierenden Sequenzen aus mehr als einer Quelle), synthetisch sein, oder sie kann die 5'-flankierende Sequenz des nativen NTP-Proteins- oder -peptidgens sein. Als solche kann die Quelle der 5'-flankierenden Sequenz irgendeiner der einzelligen prokaryoten oder eukaryoten Organismen, irgendeiner Wirbeltier oder Invertebrator oder irgendeine Pflanze sein, vorausgesetzt, dass die 5'-flankierende Sequenz im Wirtszellenmechanismus funktionell ist und hiervon aktiviert werden kann.
Die 5'-flankierenden Sequenzen, die in den Vektoren geeignet sind, können durch irgendeins von vielen Verfahren, die innerhalb der Technik bekannt sind, erhalten werden. Typisch sind andere hierin geeignete 5'-flankierende Sequenzen als die NTP-genflankierende Sequenz vorher durch Mapping und/oder Restriktionsendonukleasespaltung identifiziert worden und können somit unter Anwendung von angemessenen Restriktionsendonukleasen aus der dazugehörenden Gewebequelle isoliert werden. In einigen Fällen kann die ganze Nukleotidsequenz der 5'-flankierenden Sequenz bekannt sein. Die 5'-flankierende Sequenz kann unter Anwendung von Verfahren, die für Nukleinsäuresynthese oder Clonen oben beschrieben sind, synthetisiert werden.
Wenn die ganze 5'-flankierende Sequenz oder ein Teil davon bekannt ist, kann sie unter Anwendung von PCR und/oder durch Screenen einer genomischen Bibliothek mit geeigneten oligonukleotid- und/oder 5'-flankierenden Fragmenten aus der gleichen oder aus einer anderen Art erhalten werden.
Wenn die 5'-flankierende Sequenz nicht bekannt ist, kann ein Fragment von DNA, enthaltend eine 5'-flankierende Sequenz, aus einem größeren Stück DNA isoliert werden, die z.B. eine kodierende Sequenz oder sogar ein anderes Gen oder andere Gene enthalten kann. Isolation kann durch Restriktionsendonuklease-Spaltung unter Anwendung von einem oder mehreren sorgfältig ausgewählten Enzymen durchgeführt werden, um das richtige DNA-Fragment zu isolieren. Nach der Spaltung kann das erwünschte Fragment durch Agarosegelaufreinigung, Qiagen^®-Säule oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden. Die Auswahl geeigneter Enzyme, diesem Zweck gerecht zu werden, wird einem Fachmann offenkundig sein.
Der Ursprung des Replikationselements ist typisch ein Teil von kommerziell erworbenen prokaryoten Expressionsvektoren und hilft zur Amplifikation des Vektors in einer Wirtszelle. Die Amplifikation des Vektors bis zu einer gewissen Anzahl von Kopien kann in einigen Fällen für eine optimale Expression des NTP-Peptids von Bedeutung sein. Wenn der gewählte Vektor keine Replikationsoriginstelle enthält, kann eine solche auf der Basis einer bekannten Sequenz chemisch synthetisiert und in den Vektor ligiert werden. Typisch befindet sich das Transkriptionsabschlusselement 3' des Endes der NTP-peptidkodierenden Sequenz und dient zum Abschluss der Transkription des NTP-Proteins oder -Peptids. Gewöhnlich ist das Transkriptionsabschlusselement in prokaryoten Zellen ein G-C-reiches Fragment gefolgt von einer Poly T-Sequenz. Obwohl das Element aus einer Bibliothek leicht geklont oder sogar als Teil eines Vektors kommerziell erworben werden kann, kann es unter Anwendung von Verfahren zur Nukleinsäuresynthese, wie z.B. denjenigen, die oben beschrieben sind, leicht synthetisiert werden.
Ein wählbares Markergenelement kodiert für ein Protein, das für das Überleben und Wachstum einer Wirtszelle, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet wird, notwendig ist. Typische Selektionsmarkergene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika und andere Toxine, z.B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin für prokaryote Wirtszellen, bewirken; (b) auxotrophische Mängel der Zelle komplementieren; oder (c) kritische Nährstoffe, die von den komplexen Medien nicht zugänglich sind, zuführen. Bevorzugte wählbare Marker sind das Kanamycinresistenzgen, das Ampicillinresistenzgen und das Tetracyclinresistenzgen.
Das Ribosombindungselement, gewöhnlich als die Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryote) oder der Kozak-Sequenz (Eukaryote) bezeichnet, ist normalerweise zur Translationsinitiierung von mRNA notwendig. Das Element befindet sich typisch 3' zum Promotor und 5' zur kodierenden Sequenz des NTP-Proteins oder NTP-Peptids, das synthetisiert werden muss. Die Shine-Dalgarno-Sequenz variiert, aber ist typisch ein Polypurin (d.h. mit einem hohen A-G-Gehalt). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen sind identifiziert worden, von denen jede unter Anwendung von oben beschriebenen und in einem prokaryoten Vektor verwendeten Verfahren leicht synthetisiert werden kann.
In den Fällen, wo es wünschenswert ist, dass das Peptid aus der Wirtszelle ausgeschieden wird, kann eine Signalsequenz zum Leiten des NTP-Proteins aus der Wirtszelle heraus, in der es synthetisiert wird, verwendet werden, und der carboxyterminale Teil des Proteins kann zur Vermeidung von Membranverankern entfernt werden. Die Signalsequenz ist typisch in der kodierenden Region des NTP-Gens oder der cDNA, oder direkt am 5'-Ende der NTP-genkodierenden Region, angebracht. Viele Signalsequenzen sind identifiziert worden, und irgendeine dieser Sequenzen, die in der ausgewählten Wirtszelle funktionell sind, kann zusammen mit dem NTP-Gen oder der cDNA verwendet werden. Deswegen kann die Signalsequenz zum NTP-Gen oder zur cDNA homolog oder heterolog und zum NTP-Gen oder zur cDNA homolog oder heterolog sein. Darüber hinaus kann die Signalsequenz unter Anwendung von oben beschriebenen Verfahren chemisch synthetisiert werden. In den meisten Fällen führt das Ausscheiden des Polypeptids aus der Wirtszelle durch das Vorkommen eines Signalpeptids zum Entfernen des aminoterminalen Methionins aus dem Polypeptid.
In vielen Fällen kann die Transkription des NTP-Gens oder der cDNA durch das Vorkommen eines oder mehrerer Introne im Vektor erhöht werden; dies ist insbesondere der Fall, wenn das NTP-Peptid in eukaryoten Wirtszellen, insbesondere Säugetierwirtszellen, produziert wird. Die verwendeten Introne können im NTP-Gen natürlich vorkommen, insbesondere wenn das verwendete Gen eine genomische Sequenz in voller Länge oder ein Fragment hiervon ist. Wenn das Intron im Gen nicht natürlich vorkommt (sowie in den meisten cDNA's), kann das/die Intron(e) aus einer anderen Quelle erhalten werden. Die Position des Introns in Bezug auf die flankierende Sequenz und das NTP-Gen ist relativ wichtig, weil das Intron transkribiert werden muss, um wirksam zu sein. Wenn das NTP-Gen, das in den Expressionsvektor eingesetzt worden ist, so ein cDNA-Molekül ist, ist die bevorzugte Position des Introns 3' zur Transkriptionsanfangsstelle und 5' zur Poly A-Transkriptionsabschlusssequenz. Für NTP cDNA befindet/befinden sich das Intron oder die Introne vorzugsweise an der einen oder anderen Seite (d.h. 5' oder 3') der cDNA, so dass sie diese kodierende Sequenz nicht unterbricht. Irgendein Intron aus irgendeiner Quelle, hierunter irgendeinem viralen, prokaryoten und eukaryoten (Pflanzen- oder Tier-) Organismus, kann zur Ausführung der Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass es mit der/den Wirtszelle(n) kompatibel ist, in die es eingesetzt wird. Synthetische Introne sind auch hierin einbezogen. Im Vektor kann eventuell mehr als ein Intron verwendet werden.
Wenn ein oder mehrere der oben beschriebenen Elemente nicht schon im zu verwendenden Vektor vorkommen, können sie individuell erhalten und in den Vektor ligiert werden. Verfahren, die zum Erhalt jedes der Elemente verwendet werden, sind dem Fachmann wohlbekannt und können mit den oben beschriebenen Verfahren (d.h. Synthese der DNA, Bibliothekscreenen und desgleichen) verwendet werden.
Die endgültigen Vektoren, die zur Ausführung der Erfindung verwendet werden, können aus Ausgangsvektoren, wie z.B. einem kommerziell erhältlichen Vektor, konstruiert werden. Solche Vektoren enthalten eventuell einige der Elemente, die in den fertiggestellten Vektor einbezogen werden müssen. Wenn keine der erwünschten Elemente im Ausgangsvektor vorkommen, kann jedes Element in den Vektor individuell ligiert werden durch Schneiden des Vektors mit der/den angemessenen Restriktionsendonuklease(n), so dass die Enden des Elements, das in den Vektor ligiert werden muss, sowie die Enden des Vektors für die Ligierung kompatibel sind. In einigen Fällen kann es notwendig sein, die Enden, die zusammenligiert werden müssen, "abzustumpfen", um eine zufriedenstellende Ligierung zu erhalten. Abstumpfung wird so erreicht, dass man zuerst unter Anwendung von Klenow DNA-Polymerase oder T4 DNA-Polymerase in Anwesenheit sämtlicher vier Nukleotide die "klebrigen Enden" auffüllt. Dieses Verfahren ist innerhalb der Technik wohlbekannt und z.B. in Sambrook et al., oben, beschrieben. Alternativ können zwei oder mehrere der Elemente, die in den Vektor eingesetzt werden müssen, zuerst zusammenligiert (wenn sie nebeneinander angebracht werden müssen) und danach in den Vektor ligiert werden.
Ein anderes Verfahren zur Konstruktion des Vektors zum gleichzeitgen Ausführen aller Ligierungen der verschiedenen Elemente in einer Reaktionsmischung. Hier werden viele unsinnige oder nicht-funktionelle Vektoren aufgrund nicht angemessenen Ligierens oder Einsetzens von Elementen generiert, der funktionelle Vektor kann jedoch durch Restriktionsendonukleasespaltung identifiziert und ausgewählt werden.
Bevorzugte Vektoren zur Ausführung der Erfindung sind solche, die mit Bakterien-, Insekten- und Säugetier-Wirtszellen kompatibel sind. Solche Vektoren umfassen unter anderem pCRII, pCR3 und pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen) und pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).
Nachdem der Vektor konstruiert worden und ein Nukleinsäuremolekül, das für das NTP-Peptid kodiert, in die richtige Stelle des Vektors eingesetzt worden sind, kann der vollständige Vektor zur Amplifikation und/oder Polypeptidexpression in eine geeignete Wirtszelle eingesetzt werden. Wirtszellen können prokaryote Wirtszellen (wie z.B. E. coli) oder eukaryote Wirtszellen (wie z.B. eine Hefezelle, eine Insektzelle oder eine Wirbeltierzelle) sein. Bei Züchten unter angemessenen Bedingungen kann die Wirtszelle NTP-Peptid synthetisieren, das nachher aus dem Kulturmedium eingesammelt oder direkt von der Wirtszelle, die es produziert (wenn es nicht ausgeschieden wird), werden können.
Nach der Einsammlung kann das NTP-Peptid unter Anwendung von Verfahren, wie z.B. Molekularsiebchromatographie, Affinitätschromatographie und desgleichen, aufgereinigt werden. Die Auswahl der Wirtszelle zur Herstellung von NTP-Peptid hängt teilweise davon ab, ob das NTP-Peptid glycosyliert oder phosphoryliert werden soll (wobei eukaryote Wirtszellen bevorzugt sind), und die Weise, bei der die Wirtszelle imstande ist, das Protein in dessen nativen tertiären Struktur zu "falten" (z.B. korrekte Orientierung von Disulfidbrücken etc.), so dass das biologisch aktive Protein vom NTP-Protein oder -Peptid mit biologischer Aktivität hergestellt wird, wobei das NTP NTP-Peptid nach der Synthese unter Anwendung von angemessenen chemischen Bedingungen, wie unten beschrieben, "gefaltet" werden kann. Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugetierzellen, wie z.B. Ovariumzellen aus chinesischen Hamstern (CHO), humane embryonale Nieren(HEK)-293 oder -293T-Zellen oder 3T3-Zellen. Die Auswahl geeigneter Saugetier-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, zum Züchten, zur Amplifikation, zum Screenen und zur Produktherstellung und -aufreinigung sind innerhalb der Technik bekannt. Andere geeignete Säugetier-Zelllinien sind die COS-1- und COS-7-Zelllinien von Affen und die Zelllinie CV-1. Weitere Beispiele für Säugetierwirtszellen umfassen Primat- und Nagerzelllinien, hierunter transformierte Zelllinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die von in vitro-Kultur primären Gewebes sowie primärer Explantate abgeleitet sind, sind auch geeignet. Kandidatzellen können genotypisch mangelhaft im Selektionsgen sein oder können ein dominierend funktionierendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete Säugetierwirtszellen umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Mäuse-Neuroblastom-N2A-Zellen, HeLa, L-929-Maüsezellen, 3T3-Linien, die von Swiss, Balb-c oder NIH-Mäusen abgeleitet sind, BHK- oder HaK-Hamsterzelllinien.
In ähnlicher Weise sind Bakteriezellen, die für die vorliegende Erfindung angemessen sind, als Wirtszellen geeignet. Zum Beispiel sind die verschiedenen E. coli-Stämme (z.B. HB101, DH5.alpha., DH10 und MC1061) im Bereich der Biotechnologie als Wirtszellen wohlbekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp., anderes Bacillus spp., Streptomyces spp. und desgleichen können auch in diesem Verfahren verwendet werden. Viele Stämme von Hefezellen, die dem Fachmann bekannt sind, sind auch als Wirtszellen zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung erhältlich.
Darüber hinaus können Insektzellsysteme bei Wunsch verwendet werden. Solche Systeme sind z.B. in Kitts et al. (Biotechniques, 14: 810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 [1993]) und Lucklow et al (J. Virol., 67: 4566-4579 [1993]) beschrieben. Bevorzugte Insektzellen sind Sf-9 und Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).
Einsetzen (auch als "Transformation" oder "Transfektion" bezeichnet) des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann unter Anwendung solcher Verfahren, wie Calciumchlorid, Elektroporierung, Mikroinjektion, Lipofektion oder des DEAE-Dextranverfahrens durchgeführt werden. Das ausgewählte Verfahren wird teilweise eine Funktion des Typs der Wirtszelle, die verwendet werden muss, sein. Diese Verfahren und andere geeignete Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in Sambrook et al., oben, beschrieben.
Die Wirtszellen, die den Vektor (d.h. transformiert oder transfiziert) enthalten, können unter Anwendung von standardmäßigen Medien, die dem Fachmann wohlbekannt sind, gezüchtet werden. Die Medien enthalten normalerweise alle Nährstoffe, die für das Wacstum und Überleben der Zellen notwendig sind. Geeignete Medien für das Züchten von E. coli-Zellen sind z.B. Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB). Geeignete Medien zum Züchten von eukaryoten Zellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM, die alle mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren ergänzt werden können, wie von der besonderen Zelllinie, die gezüchtet wird, erfordert. Ein geeignetes Medium für Insektkulturen ist Grace's Medium, bei Bedarf ergänzt mit Hefeolat, Lactalbuminhydrolysat und/oder fötalem Kalbsserum. Ein antibiotikum oder eine andere Verbindung, die typisch für selektives Wachstum der transformierten Zellen geeignet ist, wird den Medien nur als Zusatz beigefügt. Die Verbindung, die verwendet werden soll, wird vom wählbaren Markerelement diktiert, das auf dem Plasmid vorkommt, mit dem die Wirtszelle transformiert wurde. Wenn z.B. das wählbare Markerelement kanamycinresistent ist, wird die Verbindung, die dem Kulturmedium beigefügt ist, Kanamycin sein.
Die Menge des NTP-Peptids, die in der Wirtszelle produziert wird, kann unter Anwendung von Standardverfahren, die innerhalb der Technik bekannt sind, evaluiert werden. Solche Verfahren umfassen, ohne Begrenzung, Western blot-Analyse, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, nicht-denaturierende Gelelektrophorese, HPLC-Trennung, Massenspektroskopie, Immunpräzipitation und/oder Aktivitätsanalysen, wie z.B. DNA-Bindungsgelwechselanalysen.
Wenn das NTP-Peptid im Hinblick darauf konstruiert worden ist, aus den Wirtszellen ausgeschieden zu werden, kann die Mehrheit des NTP-Peptids im Zellkulturmedium gefunden werden. Proteine, die in dieser Weise hergestellt worden sind, besitzen typisch kein aminoterminales Methionin, da es während des Ausscheidens aus der Zelle entfernt wird. Wenn das NTP-Peptid aus den Wirtszellen jedoch nicht ausgeschieden wird, wird es im Cytoplasma und/oder im Kern (in Bezug auf eukaryote Wirtszellen) oder im Cytosol (in Bezug auf gramnegative Bakterienwirtszellen) vorkommen und kann ein aminoterminales Methionin besitzen.
In Bezug auf das NTP-Peptid, das sich im Wirtszellcytoplasma und/oder im Kern befindet, werden die Wirtszellen typisch zuerst mechanisch oder mit einem Reinigungsmittel unterbrochen, um die intrazellulären Gehalte in einer gepufferten Lösung freizugeben. NTP-Peptide können dann aus dieser Lösung isoliert werden.
Aufreinigung von NTP-Peptiden aus Lösungen kann unter Anwendung einer Reihe von Verfahren durchgeführt werden. Wenn das Protein synthetisiert worden ist, so dass es einen Tag, wie z.B. hexaHistidin (NTP-Protein/hexaHis) oder andere kleine Peptide, wie z.B. FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MI) oder calmodulinbindendes Peptid (Stratagene, La Jolla, CA) entweder an dessen carboxylterminalem oder aminoterminalem Ende enthält, kann es im wesentlichen in einem Einschrittverfahren aufgereinigt werden, indem die Lösung durch eine Affinitätssäule geleitet wird, wo die Säulematrix eine hohe Affinität für den Tag oder direkt für das Protein (d.h. einen monoklonalen Antikörper, der das NTP-Peptid spezifisch erkennt) hat. Zum Beispiel bindet Polyhistidin mit großer Affinität und Spezifizität an Nickel, Zink und Kobalt; immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie, die von einem Nickel-basierten Affinitätsharz (wie in Qiagen's QIAexpress System oder Invitrogen's Xpress System eingesetzt) oder einem kobalt-basierten Affinitätsharz (wie in BD Biosciences-CLONTECH's Talon System eingesetzt) Gebrauch macht, kann somit zur Aufreinigung von NTP-Protein/polyHis verwendet werden. (Siehe z.B. Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
Wenn das NTP-Peptid ohne einen angeknüpften Tag hergestellt ist und keine Antikörper vorhanden sind, können andere wohlbekannte Verfahren zur Aufreinigung verwendet werden. Solcher Verfahren umfassen, ohne Begrenzung, Ionenaustauchchromatographie, Hydroxyapatitchromatographie, hydrophobische Interaktionschromatographie, Molekularsiebchromatographie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Geleluierung sowie präparatives isoelektrisches Fokusieren ("Isoprime" Maschine/Teknik, Hoefer Scientific). In einigen Fällen können zwei oder mehrere dieser Verfahren kombiniert werden, um eine erhöhte Reinheit zu erhalten.
Wenn es vorgesehen ist, dass das NTP-Peptid hauptsächlich intrazellulär gefunden wird, kann das intrazelluläre Material (hierunter Inklusionskörper für gramnegative Bakterien) unter Anwendung irgendeines Standardverfahrens, das dem Fachmann bekannt ist, aus der Wirtszelle extrahiert werden. Zum Beispiel können die Wirtszellen lysiert werden, um die Gehalte des Periplasmas/Cytoplasmas durch "French press", Homogenisierung und/oder Ultraschallbehandlung gefolgt von Zentrifugierung freigegeben werden. Wenn das NTP-Peptid Inklusionskörper im Cytosol gebildet hat, können die Inklusionskörper oft an den inneren und/oder äußeren zellulären Membranen binden und werden somit nach der Zentrifugierung hauptsächlich im Pelletmaterial gefunden. Das Pelletmaterial kann dann bei extremen pH-Werten oder mit chaotropischem Mittel, wie z.B. ein Detergens, Guanidin, Guanidinderivaten, Harnstoff oder Harnstoffderivaten in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, wie z.B. Dithiothreitol bei basischem pH-Wert oder Triscarboxyethylphosphin bei saurem pH-Wert zur Freigebung, Trennung und Solubilisierung der Inklusionskörper behandelt werden. Das NTP-Petid in dessen jetzt lösbaren Form kann dann unter Anwendung von Gelelektrophorese, Immunausfällung oder desgleichen analysiert werden.
Wenn es erwünscht wird, das NTP-Peptid zu isolieren, kann die Isolation unter Anwendung von Standardverfahren, wie z.B. denjenigen, die unten und in Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264-275 [1990]) beschrieben sind, durchgeführt werden. In einigen Fällen mag das NTP-Peptid nach der Isolierung nicht biologisch aktiv sein. Verschiedene Verfahren zum "Neufalten" oder Umformen des Polypeptids zu dessen tertiären Struktur und Generierung von Disulfidbindungen können zum Wiederherstellen biologischer Aktivität verwendet werden. Solche Verfahren umfassen, dass das solubilisierte Polypeptid in Anwesenheit einer bestimmten Konzentration eines Chaotropen einem pH-Wert ausgesetzt wird, der normalerweise über 7 liegt. Die Auswahl des Chaotropen ist den Wahlmöglichkeiten sehr ähnlich, die für Inklusionskörpersolubilisierung verwendet werden, aber normalerweise bei einer niedrigeren Konzentration, und es ist nicht notwendigerweise der gleiche Chaotrop wie derjenige, der für die Solubilisierung verwendet wurde. In vielen Fällen enthält die Neufaltungs-/Oxidationslosung auch ein Reduktionsmittel oder das Reduktionsmittel zuzüglich dessen oxidierten Form in einem spezifischen Verhältnis, um ein besonderes Redoxpotential zu generieren, das es ermöglicht, dass bei der Bildung der Cysteinbrücke(n) des Proteins Disulfid-Verschieben auftritt. Einige der gewöhnlich verwendeteten Redoxpaare umfassen Cystein/Cystamin, Glutathion (GSH)/Dithiobis GSH, Kupfrichlorid, Dithiothreitol(DTT)/Dithian DTT, 2-Mercaptoethanol(bME)/Dithio-b(ME). In vielen Fällen ist ein Co-Lösungsmittel notwendig, um die Effizienz der Neufaltung zu erhöhen, und die gewöhnlicheren Reagenzien, die für diesen Zweck verwendet werden, umfassen Glycerol, Polyethylenglycol verschiedener Molekulargewichte und Arginin.
Wenn NTP-Peptidinklusionskörper in der Wirtszelle nicht im wesentlichen Umfang gebildet werden, befindet sich das NTP-Peptid hauptsächlich im Supernatant nach Zentrifugieren des Zellhomogenats, und das NTP-Peptid kann unter Anwendung von Verfahren, wie z.B. denjenigen, die unten beschrieben sind, isoliert werden.
In diesen Situationen, wo das NTP-Peptid vorzugsweise teilweise oder vollständig isoliert werden soll, kann die Aufreinigung unter Anwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Solcher Verfahren umfassen, ohne Begrenzung, Trennung durch Elektrophorese gefolgt von Elektroeluierung, verschiedene Typen von Chromatographie (Immunaffinität, Molekularsieb und/oder Innenaustausch) und/oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie. In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, mehr als eins dieser Verfahren für vollständige Aufreinigung zu verwenden.
Außer der Herstellung und Aufreinigung des NTP-Peptids unter Anwendung rekombinanter DNA-Verfahren, können die NTP-Peptide durch chemische Syntheseverfahren (wie z.B. Festphase-Peptidsynthese) unter Anwendung von Verfahren, die innerhalb der Technik bekannt sind, z.B. denjenigen, die von Merrifield et al., (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 [1963]), Houghten et al (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82: 5132 [1985]), und Stewart and Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. [1984]) beschrieben sind, hergestellt werden. Solche Polypeptide können mit oder ohne Methionin am aminoterminalem Ende synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte NTP-Peptide können unter Anwendung von Verfahren, die in diesen Referenzen beschrieben sind, zur Bildung von Disulfidbrücken oxidiert werden. Es wird erwartet, dass die NTP-Peptide biologische Aktivität vergleichbar mit NTP-Peptiden haben, die rekombinant produziert oder aus natürlichen Quellen aufgereinigt werden, und können somit auswechselbar mit rekombinantem oder natürlichem NTP-Peptid verwendet werden.
NTP-Peptide können unter Anwendung herkömmlicher Peptidsyntheseverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden.
Diese Verfahren umfassen chemische Kupplungsverfahren (cf. Wunsch, E: "Methoden der organischen Chemie", Volume 15, Band 1 + 2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), und Barrang, G.; Marrifield, R. B.: "The Peptides", red. E. Gross, J. Meienhofer, Volume 2, Kapitel 1, S. 1-284, Academic Press (1980)), enzymatic coupling methods (cf. Widmer, F. Johansen, J. T., Carlsberg Res. Commun., Band 44, S. 37-46 (1979) und Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987), und Widmer, F., Johansen, J. T. in "Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, red. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., S. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), oder eine Kombination von chemischen und enzymatischen Verfahren, sofern dies für die Prozessauslegung und Wirtschaftlichkeit vorteilhaft ist. Unter Anwendung der hierin bereitgestellten Richtlinien und Lehren ist der Fachmann imstande, die Peptidsequenz des NTP-Peptids zu variieren, um ein Homolog herzustellen, das die gleiche oder eine ähnliche biologische Aktivität (Bioaktivität) wie das ursprüngliche oder native NTP-Peptid besitzt.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf die Verwendung von NTP-Peptiden zur Behandlung von Zuständen, die das Entfernen von Zellen erfordern, wie z.B. gutartigen oder bösartigen Tumoren, drüsiger (z.B. Prostata) Hyperplasie, unerwünschtem Gesichtshaar, Warzen und unerwünschtem Fettgewebe. Solch eine Verwendung umfasst, dass einem bedürftigen Säugetier eine therapeutisch effektive Menge NTP-Peptid verabreicht wird.
Der Zustand kann z.B. Tumoren in Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Gehirn und dessen Abdeckungen, Rückenmark und dessen Abdeckungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Parathyroid, Thyroid, Gebärmutter, Hoden, Hypophyse, Fortpflanzungsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lympfsystem und anderen Organen.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck "bösartiger Tumor" alle Formen von humanen Karzinomen, Sarkomen und Melanomen, die in den gering differentierten, moderat differentierten und hochdifferentierten Formen vorkommen.
Die Erfindung erfüllt einen innerhalb der Technik bestehenden Bedarf an Behandlungen, die mit weniger Risiko und weniger unerwünschten Nebenwirkungen von Chirurgie, gutartige Tumoren entfernen können. Entfernen von gutartigen Tumoren in chirurgisch riskanten Bereichen, wie z.B. in tiefen Lokationen des Körpers (z.B. Gehirn, Herz, Lungen und ähnliches) ist besonders erforderlich.
Die Anwendung von NTP-Peptiden zur Behandlung von Zuständen, wo Zellen entfernt werden müssen, können zusammen mit herkömmlichen Verfahren zur Behandlung solcher Zustände, wie z.B. chirurgische Ektomie, Chemotherapie und Bestrahlung, verwendet werden. NTP-Peptide können vor, gleichzeitig mit oder nach solchen herkömmlichen Behandlungen verabreicht werden.
Der zu behandelnde Zustand kann auch eine Hyperplasie, Hypertrophy oder Überwachstum eines Gewebes sein, das aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Gehirn und dessen Abdeckungen, Rückenmark und dessen Abdeckungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Parathyroid, Thyroid, Gebärmutter, Hoden, Hypophyse, Fortpflanzungsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lympfsystem ausgewählt ist.
Ein weiterer Zustand, der durch die NTP-Peptide der Erfindung behandelt werden kann, ist ein viral, bakteriell oder parasitartig verändertes Gewebe, das aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Gehirn und dessen Abdeckungen, Rückenmark und dessen Abdeckungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Parathyroid, Thyroid, Gebärmutter, Hoden, Hypophyse, Fortpflanzungsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lympfsystem ausgewählt ist.
Der Zustand, der behandelt werden muss, kann auch eine Missbildung eines Gewebes sein, das aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Brust, Magen, Pankreas, Prostata, Blase, Knochen, Ovarium, Haut, Niere, Sinus, Dickdarm, Darm, Magen, Rektum, Speiseröhre, Blut, Gehirn und dessen Abdeckungen, Rückenmark und dessen Abdeckungen, Muskel, Bindegewebe, Nebenniere, Parathyroid, Thyroid, Gebärmutter, Hoden, Hypophyse, Fortpflanzungsorgane, Leber, Gallenblase, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mandeln, Mund, Lymphknoten und Lympfsystem ausgewählt ist.
Der Zustand, der behandelt werden muss, kann insbesondere Hypertrophie der Mandeln, prostatische Hyperplasie oder Hämorrhoiden sein. Der Zustand, der behandelt werden muss, kann eine Gefäßerkrankung, wie z.B. Atherosklerose oder Artheriosklerose, oder eine Gefäßerkrankung, wie z.B. Krampfadern, sein. Der Zustand, der behandelt werden muss, kann auch eine kosmetische Modifizierung eines Gewebes, wie z.B. Haut, Auge, Ohr, Nase, Hals, Mund, Muskel, Bindegewebe, Haar oder Brustgewebe, sein.
Therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Solche Zusammensetzungen können eine therapeutisch effektive Menge des NTP-Peptids im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Das Trägermaterial kann Wasser zur Injektion sein, vorzugsweise mit anderen Materialien ergänzt, die in Lösungen zur Verabreichung an Säugetieren gewöhnlich sind. Ein NTP-Peptid zur therapeutischen Anwendung wird typisch in der Form einer Zusammensetzung verabreicht, die aufgereinigtes NTP-Peptid zusammen mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern, Hilfsmitteln oder Verdünnungsmitteln umfasst. Neutrales gepuffertes Salzwasser oder Salzwasser gemischt mit Serumalbumin sind Beispiele für geeignete Träger. Das Produkt wird vorzugsweise als ein Lyophilisat unter Anwendung angemessener Hilfsmittel (z.B. Saccharose) formuliert. Andere Standardträger, Verdünnungsmittel und Hilfsmittel können eventuell einbezogen werden. Zusammensetzungen umfassen Puffer, die dem Fachmann bekannt sind, mit einem angemessenen Intervall von pH-Werten, hierunter Tris-Puffer von etwa pH 7,0-8,5, oder Acetatpuffer von etwa pH 4,0-5,5, die ferner Sorbitol oder einen geeignteten Ersatzstoff hierfür umfassen können.
Die NTP-Peptide können einzeln, zusammen oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie z.B. Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, apoptoseinduzierenden Mitteln, entzündingshemmenden Mitteln und/oder chemotherapeutischen Mitteln verwendet werden, die für die Indikation, die behandelt wird, angemessen ist.
Diese Erfindung umfasst auch therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden, die Dendrimeren, "Fullerenen" und andere synthetische Moleküle, Polymere und Makromoleküle verwenden, wo das NTP-Peptid im Molekül, Polymer oder Makromolekül eingeschlossen ist, entweder alleine oder zusammen mit anderen Molekülspezien, wie z.B. einem tumorspezifischen Marker. Zum Beispiel stellt US-Patent Nr. 5714166, Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates, ein Verfahren zur Herstellung und Anwendung von unter anderem dendritischen Polymerkonjugaten, die aus mindestens einem Dendrimer mit einem oder mehreren Zieldirektoren und mindestens einem bioaktiven Mittel, das damit konjugiert ist, bestehen, bereit.
Diese Erfindung umfasst auch therapeutische Zusammensetzungen von NTP-Peptiden und Trägern zur Verabreichung von Arzneimitteln, wie z.B. Lipidemulsionen, Mizellpolymeren, Polymermikrosphären, elektroaktiven Polymeren, Hydrogelen und Liposomen.
Feste Dosisformen zur oralen Verabreichung umfassen, aber begrenzen sich nicht auf, Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Körnchen. In solchen festen Dosisformen wird die aktive Verbindung mit mindestens einem der folgenden Substanzen gemischt: (a) ein oder mehrere inerte Hilfsmittel (oder Träger), wie z.B. Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat; (b) Füllstoffe oder Streckmittel, wie z.B. Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannitol und Kieselsäure; (c) Bindemittel, wie z.B. Carboxymethylzellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Acacia; (d) Befeuchtungsmittel, wie z.B. Glycerol; (e) Sprengmittel, wie z.B. Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffeln- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte komplexe Silikate und Natriumcarbonat; (f) Lösungsverzögerer, wie z.B. Paraffin; (g) Absorptionbeschleuniger, wie z.B. quaternäre Ammoniumverbindungen; (h) Benetzungsmittel, wie z.B. Acetylalkohol und Glycerolmonostearat; (i) Adsorptionsmittel, wie z.B. Kaolin und Bentonit; und (j) Schmiermittel, wie z.B. Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat oder Mischungen davon. Für Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosisformen auch Puffermittel umfassen.
Flüssige Dosisformen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixire. Außer den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosisformen inerte Verdünnungsmittel, die innerhalb der Technik gewöhnlich sind, z.B. Wasser oder andre Solubilisierungsmittel und Emulgierungsmittel, umfassen. Beispiele für Emilgierungsmittel sind Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, wie z.B. Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Riziniusöl, und Sesamöl, Glycerol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole, Fettsäureester von Sorbitan oder Mischungen dieser Stoffe und desgleichen.
Außer solchen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung auch Hilfsstoffe, wie z.B. Benetzungsmittel, Emulgatoren und Stellmittel, Süßstoffe, Aromastoffe und Parfümemittel umfassen.
Tatsächliche Dosisniveaus der aktiven Bestandteile in den Zusammensetzungen der Erfindung können variiert werden, um eine therapeutisch effektive Menge von NTP-Peptid, die wirksam ist, ein erwünschtes therapeutisches Aussprechen für eine bestimmte Zusammensetzung und ein bestimmtes Verabreichungsverfahren zu erhalten. Das gewählte Dosisniveau hängt deshalb von der erwünschten therapeutischen Wirkung, dem Verabreichungsweg, der erwünschten Behandlungsdauer, der Größe des Individuums oder Tiers, das behandelt wird, und anderen Faktoren ab.
Was Säugetiere, hierunter Menschen, angeht, können effektive Mengen auf der Basis der Körperfläche verabreicht werden. Der Zusammenhang von Dosierungen für Tiere verschiedener Größen, Arten und Menschen (basiert auf mg/m² der Körperfläche) ist von E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50(4): 219 (1966) beschrieben. Ausgehend von der Größe und dem Gewicht eines Individuums kann man in etwa die Körperfläche festlegen (siehe z.B. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. S. 537-538 (1970)). Unter Anwendung der Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, und unter Anwendung der hierin bereitgestellten Richtlinien und Lehren, kann der Fachmann die therapeutisch effektive Menge des NTP-Peptids, dass in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, festlegen.
Die gesamte tägliche Dosis des NTP-Peptids, die einem Wirt verabreicht wird, kann als Einzeldosis oder geteilte Dosen vorkommen. Dosierungseinheitzusammensetzungen können solche Mengen von solchen Teilen hiervon enthalten, die dafür verwendet werden können, die tägliche Dosis auszumachen. Es versteht sich jedoch, dass das spezifische Dosisniveau für irgendeinen bestimmten Patienten von einer Reihe von Faktoren abhängt, hierunter Körpergewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeitpunkt und -weg, Wirksamkeit des verabreichten Arzneimittels, Absorptions- und Ausscheidungsgeschwindigkeit, Kombination mit anderen Arzneimitteln und die Schwere der bestimmten Krankheit, die behandelt wird.
Die NTP-Peptidzusammensetzung der Erfindung kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal), intracerebroventrikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokular, intraarteriell, topisch, transdermal, durch ein Aerosol, eine Infusion, eine Bolusinjektion, eine Implantationseinrichtung, ein "Sustained release"-System etc. verabreicht werden.
Das NTP-Peptid der Erfindung kann auch über einen transdermalen oder transkutanen Weg verabreicht werden. Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform ist die Anwendung eines Pflasters. Ein Pflaster kann insbesondere mit einer feinen Suspension von NTP-Peptid in beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) oder einer Mischung von DMSO mit Baumwollsamenöl hergestellt werden und mit der Haut der tumortragenden Säugetiere von der Tumorstelle entfernt innerhalb eines Hautbeutels in Kontakt gebracht. Andere Medien oder Mischungen hiervon mit anderen Lösungsmitteln und festen Trägern würden genauso gut funktionieren. Das Pflaster kann die NTP-Peptidverbindung in der Form einer Lösung oder einer Suspension enthalten. Das Pflaster kann dann auf die Haut des Patienten aufgetragen werden, z.B. dadurch, dass es in einen Hautbeutel des Patienten eingesetzt wird, welcher Hautbeutel durch Falten und Zusammenhalten der Haut mit Hilfe von Fäden, Klemmen oder anderen Haltevorrichtungen ausgebildet wird. Dieser Beutel sollte so eingesetzt werden, dass ein ständiger Kontakt mit der Haut ohne Störung des Säugetiers gewährleistet wird. Außer der Anwendung eines Hautbeutels kann irgendeine Einrichtung verwendet werden, die das stabile Anbringen des Pflasters in Kontakt mit der Haut gewährleistet. Zum Beispiel könnte ein klebender Verband verwendet werden, um das Pflaster auf der Haut festzuhalten.
Das NTP-Peptid kann in einer "Sustained release"-Formulierung oder -Zusammensetzung verabreicht werden. Geeignete Beispiele für "Sustained release"-Zusammensetzungen umfassen halbpermeable Polymermatritzen in der Form von geformten Artikeln, z.B. Filmen oder Mikrokapseln. "Sustained release"-Matritzen umfassen Polyester, Hydrogele, Polylactide ( US 3773919 , EP 58481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al, Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), Poly (2-Hydroxyethyl-methacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] und Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), Ethylenvinylacetat (Langer et al., oben) oder Poly-D(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133988 ). "Sustained release"-Zusammensetzungen können auch Liposome umfassen, die durch irgendeins von mehreren innerhalb der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden können (z.B. Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; EP 36676 ; EP 88046 ; und EP 143949 ).
Ein anderer Verabreichungsweg für ein NTP-Peptid der Erfindung besteht in der direkten oder indirekten Infusion von NTP-Peptid in den Tumor oder in anderes Gewebe, der/das behandelt werden muss. Ein Beispiel für solch eine Ausführungsform ist die direkte Injektion von NTP-Peptid in den Tumor oder in anderes Gewebe, der/das behandelt werden muss. Die Behandlung kann aus einer einzigen Injektion, mehreren Injektionen an einer Gelegenheit oder einer Serie von Injektionen über einen Zeitraum von Stunden, Tagen oder Monaten, wo die Regression oder Zerstörung des Tumors oder anderem Gewebe, der/das behandelt werden muss, bestehen, durch Biopsie, Bildgebung oder andere Verfahren zum Überwachen von Gewebewachstum überwacht wird. Die Injektion in den Tumor oder in anderes Gewebe, der/das behandelt werden muss, kann durch eine Einrichtung durchgeführt werden, die in eine Öffnung, wie z.B. die Nase, den Mund, das Ohr, die Scheide, das Rektum oder die Urethra, oder durch einen Einschnitt eingesetzt wird, um zum Tumor oder Gewebe in vivo zu gelangen, und kann zusammen mit einer Abbildung oder einem optischen System, wie z.B. Ultraschall oder fiberoptischem Endoskop durchgeführt werden, um die angemessene Stelle der Injektion(en) zu identifizieren. Ein anderes Beispiel für eine solche Ausführungsform ist die Anwendung einer Einrichtung, die im Zeitablauf eine konstante Infusion von NTP-Peptid zum Gewebe bereitstellen kann.
Ein anderer Verabreichungsweg für ein NTP-Peptid der Erfindung wird zusammen mit einem chirurgischen oder ähnlichen Verfahren verwendet, um Tumoren oder anderes Gewebe oder zelluläre Elemente, die unbedingt oder wünschenswerterweise entfernt oder zerstört werden müssen, physisch herauszuschneiden, zu amputieren oder anderswie zu töten oder zerstören, wobei ein NTP-Peptid der Erfindung dem/den unmittelbaren Bereich(en) verabreicht werden, der/die den/die Bereich(e) umgibt/umgeben, wo der Tumor oder anderes Gewebe entfernt wurde, um das Wachstum irgendwelcher Tumorzellen oder anderer zellulärer Elemente, die im Verfahren nicht entfernt oder zerstört wurden, zu zerstören oder verhindern.
Ein anderer Verabreichungsweg für ein NTP-Peptid der Erfindung besteht in Implantation einer Einrichtung im Tumor oder in anderem Gewebe, der/das behandelt werden muss. Ein Beispiel für solch eine Ausführungsform ist die Implantation einer Scheibe, die NTP-Peptid im Tumor oder in anderem Gewebe, der/das behandelt werden muss, enthält. Die Scheibe gibt im Zeitablauf eine therapeutische Dosis von NTP-Peptid im Gewebe frei. Alternativ oder darüber hinaus kann die Zusammensetzung durch Implantation in den betroffenen Bereich einer Membran, eines Schwamms oder eines anderen angemessenen Materials, worauf das NTP-Peptid absorbiert worden ist, lokal verabreicht werden. Wenn eine Implantationseinrichtung verwendet wird, kann die Einrichtung in irgendein geeignetes Gewebe oder Organ implantiert werden, und Verabreichen des NTP-Peptids kann direkt durch die Einrichtung via Bolus oder via kontinuierliches Verabreichen oder via einen Katheter unter Anwendung kontinuierlicher Infusion durchgeführt werden.
Beispiel 1
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP-Peptid #43 auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
Acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan, jede in vier verschiedenen Punkten, und in Extremität-Skelettmuskel jede in zwei verschiedenen Punkten, mit NTP-Peptid #43 in Salzwasser in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml injiziert, verabreicht aus Kunststoffspritzen durch rostfreie Stahlkanülen Nr. 26.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang observiert und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 48 individuellen Infiltrationspunkte wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, eingefärbt und mit Hilfe von standardmäßigen histopathologischen Verfahren untersucht.
Ähnliche Gruppen von Kontrollratten bekamen eine Injektion mit
(1) Rinderserumalbumin 0,1% in Salzwasser, (2) normalem humanem Serum, (3) physiologischem Salzwasser, (4) nicht-infektiösen bakteriellen Proteinen, und (5) Kontrollpeptiden und wurden gereinigt und danach untersucht und wie oben getötet, indem die herausgeschnittenen Injektionspunkte wie oben behandelt wurden.
Ergebnisse
Injektion des NTP-Peptids #43 bewirkte reichliche akute Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Die Nekrose war in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis an den Stellen, wo das NTP-Peptid #43 injiziert wurde, deutlich. Nach 24 Stunden sahen die Zellen blaß, geschrumpft und nekrotisch aus, und Infiltration mit entzündlichen Zellen konnte festgestellt werden. Die Nekrose korrelierte mit den Injektionsbereichen und schienen nicht weit über der Injektionsstelle ausgebreitet zu sein.
Außer den Bereichen mit milder Entzündung zeigten die Kontrollen keinen Hinweis auf Nekrose oder Zellverlust. Im Gegensatz zu den NTP-Peptid #43-Injektionen, wo gesamte Bereiche von Muskelfaserschichten nekrotisch waren, zeigten die Kontrollen minimale oder keine Muskelveränderungen. Kontrollinjektionen hatten milde bis minimale akute Enzündung an den Injektionsstellen und Punktmikroblutungen von den Nadeln.
Beispiel 2
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP-Peptid #17 auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
Acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan, jede in vier verschiedenen Punkten, und in Extremität-Skelettmuskel jede in zwei verschiedenen Punkten, mit NTP-Peptid #17 in Salzwasser in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml injiziert, verabreicht aus Kunststoffspritzen durch rostfreie Stahlkanülen Nr. 26.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang observiert und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 48 individuellen Infiltrationspunkte wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, eingefärbt und mit Hilfe von standardmäßigen histopathologischen Verfahren untersucht.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse
Injektion des NTP-Peptids #17 bewirkte reichliche akute Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Die Nekrose war in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis an den Stellen, wo das NTP-Peptid #17 injiziert wurde, deutlich. Nach 24 Stunden sahen die Zellen blaß, geschrumpft und nekrotisch aus, und Infiltration mit entzündlichen Zellen konnte festgestellt werden. Die Nekrose korrelierte mit den Injektionsbereichen und schien nicht weit über der Injektionsstelle ausgebreitet zu sein.
Außer den Bereichen mit milder Entzündung zeigten die Kontrollen keinen Hinweis auf Nekrose oder Zellverlust. Im Gegensatz zu den NTP-Peptid #17-Injektionen, wo gesamte Bereiche von Muskelfaserschichten nekrotisch waren, zeigten die Kontrollen minimale oder keine Muskelveränderungen. Kontrollinjektionen zeigten milde bis minimale akute Enzündung an den Injektionsstellen und Punktmikroblutungen von den Nadeln.
Beispiel 3
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP-Peptid #20 auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
Acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan, jede in vier verschiedenen Punkten, und in Extremität-Skelettmuskel jede in zwei verschiedenen Punkten, mit NTP-Peptid #20 in Salzwasser in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml injiziert, verabreicht aus Kunststoffspritzen durch rostfreie Stahlkanülen Nr. 26.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang observiert und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 48 individuellen Infiltrationspunkte wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, eingefärbt und mit Hilfe von standardmässigen histopathologischen Verfahren untersucht.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse
Injektion des NTP-Peptids #20 bewirkte Absterben von Zellen und Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Das Absterben von Zellen war in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis an den Stellen, wo das NTP-Peptid #20 injiziert wurde, anwesend. Nach 24 Stunden sahen die Zellen in diesen Bereichen blaß, geschrumpft und nekrotisch aus, und Infiltration mit entzündlichen Zellen konnte festgestellt werden. Das Absterben von Zellen und die Nekrose kamen in den Injektionsbereichen vor und schienen nicht weit über der Injektionsstelle ausgebreitet zu sein.
Außer den Bereichen mit milder Entzündung zeigten die Kontrollen keinen Hinweis auf Nekrose oder Zellverlust. Im Gegensatz zu den NTP-Peptid #20-Injektionen, wo gesamte Bereiche von Muskelfaserschichten nekrotisch waren, zeigten die Kontrollen minimale oder keine Muskelveränderungen. Kontrollinjektionen zeigten milde bis minimale akute Enzündung an den Injektionsstellen und gelegentliche Punktmikroblutungen von den Nadeln.
Beispiel 4
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP-Peptid #19 auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
Acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan, jede in vier verschiedenen Punkten, und in Extremität-Skelettmuskel jede in zwei verschiedenen Punkten, mit NTP-Peptid #19 in Salzwasser in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml injiziert, verabreicht aus Kunststoffspritzen durch rostfreie Stahlkanülen Nr. 26.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang observiert und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 48 individuellen Infiltrationspunkte wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, eingefärbt und mit Hilfe von standardmässigen histopathologischen Verfahren untersucht.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse
Wie in den oben angeführten Beispielen bewirkte Injektion des NTP-Peptids #19 Absterben von Zellen und Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Kontrollen zeigten minimale oder keine Veränderungen bestehend aus akuter Entzündung an den Injektionsstellen und Punktmikroblutungen von den Nadeln.
Beispiel 5
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP-Peptid #16 auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
Acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan, jede in vier verschiedenen Punkten, und in Extremität-Skelettmuskel jede in zwei verschiedenen Punkten, mit NTP-Peptid #16 in Salzwasser in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml injiziert, verabreicht aus Kunststoffspritzen durch rostfreie Stahlkanülen Nr. 26.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang observiert und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 48 individuellen Infiltrationspunkte wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, eingefärbt und mit Hilfe von standardmässigen histopathologischen Verfahren untersucht.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse
Wie in den oben angeführten Beispielen bewirkte Injektion des NTP-Peptids #16 Absterben von Zellen und Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Kontrollen zeigten minimale oder keine Veränderungen bestehend aus akuter Entzündung an den Injektionsstellen und Punktmikroblutungen von den Nadeln.
Beispiel 6
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP-Peptid #15 auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
Acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan, jede in vier verschiedenen Punkten, und in Extremität-Skelettmuskel jede in zwei verschiedenen Punkten, mit NTP-Peptid #15 in Salzwasser in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml injiziert, verabreicht aus Kunststoffspritzen durch rostfreie Stahlkanülen Nr. 26.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang observiert und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 48 individuellen Infiltrationspunkte wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, eingefärbt und mit Hilfe von standardmäßigen histopathologischen Verfahren untersucht.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse
Wie in den oben angeführten Beispielen bewirkte Injektion des NTP-Peptids #15 Absterben von Zellen und Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Kontrollen zeigten minimale oder keine Veränderungen bestehend aus akuter Entzündung an den Injektionsstellen und Punktmikroblutungen von den Nadeln.
Beispiel 7
Der Zweck dieses Beispiels bestand darin, die Wirkung von NTP-Peptid #14 auf Gewebe an Injektionsstellen festzustellen.
Acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan, jede in vier verschiedenen Punkten, und in Extremität-Skelettmuskel jede in zwei verschiedenen Punkten, mit NTP-Peptid #14 in Salzwasser in Mengen von 100 bis 400 ml in Konzentrationen von 0,1-1 mg/ml injiziert, verabreicht aus Kunststoffspritzen durch rostfreie Stahlkanülen Nr. 26.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang observiert und nach 24 Stunden schmerzlos getötet. Die 48 individuellen Infiltrationspunkte wurden herausgeschnitten, in 10% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, eingefärbt und mit Hilfe von standardmässigen histopathologischen Verfahren untersucht.
Die Kontrollen waren die gleichen wie in Beispiel 1.
Ergebnisse
Wie in den oben angeführten Beispielen bewirkte Injektion des NTP-Peptids #14 Absterben von Zellen und Nekrose von Gewebe an den Injektionsstellen. Kontrollen zeigten minimale oder keine Veränderungen bestehend aus akuter Entzündung an den Injektionsstellen und Punktmikroblutungen von den Nadeln.
SEQUENZLISTE

Claims

NTP-Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51 und SEQ ID NO 52 ausgewählt ist.
NTP-Peptid nach Anspruch 1 zur Anwendung als ein Arzneimittel.
Anwendung eines NTP-Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der aus der Gruppe bestehend aus: einem gutartigen oder bösartigen Tumor; einer Hyperplasie, Hypertrophie, oder übermäßigem Wachstum; einem viral, bakteriell oder parasitartig veränderten Gewebe; einer Missbildung eines Gewebes; Hypertrophie der Mandeln; prostatischer Hyperplasie; einer kosmetischen Modifizierung des Gewebes; einer Gefäßerkrankung; Hämorrhoiden; Krampfadern; Atherosklerose oder Artheriosklerose; einer Entzündungserkrankung; autoimmuner Erkrankung; Stoffwechselerkrankung; vererblicher/genetischer Erkrankung; traumatischer Erkrankung; ernährungsbedingter Mangelerkrankung; Infektionskrankheit; Amyloiderkrankung; Fibroseerkrankung; kongenitaler Missbildung; Enzymdefekterkrankung; Strahlungserkrankung, endokriner Erkrankung und degenerativer Erkrankung ausgewählt ist.
Zusammensetzung, die ein NTP-Peptid nach Anspruch 1 und einen Träger dafür umfasst.