DE60317677T2

DE60317677T2 - Ox40 (=cd134) rezeptor agonisten und therapeutische verwendung

Info

Publication number: DE60317677T2
Application number: DE60317677T
Authority: DE
Inventors: Alexander Berthold Bakker; Pauline Marie Meester-Rood; Adrianus Quirinus Bakker
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2002-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2023-06-14
Also published as: US8133983B2; EP1525223B1; EP1525223A2; AU2003257419B2; US20060281072A1; WO2003106498A2; AU2003257419A1; ES2295639T3; CA2489004A1; DE60317677D1; US7550140B2; NZ536746A; WO2003106498A3; CA2489004C; US20110123552A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin, insbesondere auf agonistische Bindungsmoleküle, die spezifisch an den humanen OX40-Rezeptor binden können. Die Bindungsmoleküle sind nützlich in der Immuntherapie.
Hintergrund der Erfindung
Der OX40-Rezeptor (OX40R) (auch als CD134, ACT-4, ACT35 bekannt) ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie, die auf aktivierten CD4-positiven T-Zellen exprimiert wird (siehe WO 95/12673 ). Die Auslösung dieses Rezeptors über den OX40-Liganden, der OX40L, gp34 oder ACT-4-Ligand genannt wird und auf aktivierten B-Zellen und dendritischen Zellen vorhanden ist, verstärkt die Vermehrung von CD4-positiven T-Zellen während einer Immunantwort und beeinflusst die Bildung von CD4-positiven Gedächtnis-T-Zellen. Weiterhin vermittelt das OX40R-OX40L-System die Adhäsion von aktivierten T-Zellen an Endothelzellen und leitet so die aktivierten CD4-positiven T-Zellen zur Entzündungsstelle.
Entzündungs- und Autoimmunkrankheiten, wie rheumatoide Arthritis und entzündliche Darmkrankheit, sind durch eine Infiltration von aktivierten T-Zellen an der Entzündungsstelle gekennzeichnet, was vermutlich die Antwort manipuliert, die zur chronischen Gewebezerstörung führt. Bei Patienten mit entzündlicher Darmkrankheit sind OX40-positive, CD4-positive T-Zellen im Darm in Verbindung mit Entzündungsstellen zu finden. Außerdem sind bei Patienten, die unter akuter Graft-versus-Host-Disease leiden, erhöhte Konzentrationen von OX40-positiven peripheren CD4-positiven T-Zellen im peripheren Blut vorhanden. Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis sind OX40-positive, CD4-positive T-Zellen in der Gelenkflüssigkeit vorhanden, während sie im peripheren Blut praktisch fehlen. Weiterhin findet man OX40-positive, CD4-positive T-Zellen in entzündetem Synovialgewebe neben Zellen, die den Liganden für den OX40-Rezeptor exprimieren. Dies steht im Gegensatz zu Patienten, die unter Osteoarthritis leiden, einer Gelenkkrankheit, die nicht durch Entzündung vermittelt wird und bei der beide Zelltypen nicht in signifikanter Anzahl gefunden werden konnten.
Bei Patienten, die unter mehreren entzündlichen Störungen leiden, sind also an den Entzündungsstellen erhöhte Konzentrationen an OX40-positiven, CD4-positiven T-Zellen vorhanden, was darauf hinweist, dass diese Zellen am Fortschreiten der Autoimmunkrankheit beteiligt sein können. Eine Blockade des OX40R-OX40L-Wegs unter Verwendung von Antikörpern oder Fusionsproteinen führte bei mehreren Tiermodellen einer Autoimmunkrankheit zur Dämpfung des Krankheitsfortschritts.
Es hat sich gezeigt, dass OX40-positive T-Zellen neben ihrer Anwesenheit bei Autoimmunkrankheiten auch innerhalb von Tumorläsionen, die tumorinfiltrierende Lymphocyten enthalten, und in tumorzellenpositiven drainierenden Lymphknoten vorhanden sind (Weinberg et al., 2000). In mehreren Tumormodellen bei Mäusen wurde gezeigt, dass die Besetzung des OX40-Rezeptors in vivo während des Tumor-Priming das Auftreten von Tumoren im Vergleich zu kontrollbehandelten Mäusen erheblich verzögerte und verhinderte (Weinberg et al., 2000). Daher wurde in Betracht gezogen, die Immunantwort eines Säugers auf ein Antigen zu verstärken, indem man den OX40-Rezeptor durch Verabreichung eines OX40-Rezeptor-bindenden Mittels besetzt ( WO 99/42585 ; Weinberg et al., 2000). Eine Möglichkeit besteht darin, einen natürlichen Liganden des OX40-Rezeptors, d. h. den OX40-Liganden, oder Fusionsproteine davon als OX40-Rezeptor-bindenden Liganden zu verwenden. Solche Proteine haben jedoch eine feste Affinität zu dem Rezeptor, die sich nicht leicht ändern lässt, haben möglicherweise nicht die Retentionszeit im Kreislauf, um die gewünschte therapeuti sche Wirkung auszuüben, und können zu Immunogenität führen (Weinberg et al., 2000).
Eine weitere Möglichkeit, T-Zellen über den OX40-Rezeptorweg zu stimulieren, besteht in der Verwendung von Antikörpern gegen diesen Rezeptor (Kaleeba et al., 1998; Weinberg et al., 2000). Ein Ratten-Anti-Maus-OX40-Rezeptor-Antikörper, der OX86 genannt wird (Al-Shamkhani et al., 1996), schien den OX40-Rezeptor in Maustumormodellen zu besetzen (Weinberg et al., 2000; US 6,312,700 ).
Unseres Wissens sind agonistische Antikörper, insbesondere humane agonistische Antikörper, die den humanen OX40-Rezeptor stimulieren können, in der Technik nicht offenbart. Weiterhin ist wohlbekannt, dass die Verwendung nichthumaner Antikörper in vivo bei Menschen eingeschränkt ist. Probleme in Verbindung mit der Verabreichung von nichthumanen Antikörpern an Menschen sind unter anderem die kurze Serumhalbwertszeit, eine Unfähigkeit, bestimmte humane Effektorfunktionen auszulösen, und die Hervorrufung einer unerwünschten dramatischen Immunantwort gegen den nichthumanen Antikörper bei einem Menschen.
Im Allgemeinen haben Versuche, die mit der Verwendung von vollständig nichthumanen Antikörpern beim Menschen verbundenen Probleme zu überwinden, die gentechnische Veränderung der Antikörper beinhaltet, so dass die "humanähnlicher" sind. Ein erstes Stadium im Humanisierungsverfahren war die Herstellung von chimärischen Antikörpern, d. h. von Antikörpern, bei denen die variablen Bereiche der Antikörperketten von der nichthumanen Spezies abgeleitet sind und die konstanten Bereiche der Antikörperketten vom Menschen abgeleitet sind. Anschließend wurden Domänen zwischen den variablen Domänen, die die Antigenbindung spezifizieren, durch ihre humanen Gegenstücke ersetzt, was zu sogenannten humanisierten Antikörpern führte. Ein Nachteil dieser chimärischen und humanisierten Antikörper besteht darin, dass sie noch einige nichthumane Sequenzen beibehalten und daher immer noch eine uner wünschte Immunreaktion hervorrufen, insbesondere wenn sie längere Zeit verabreicht werden.
Im Lichte dessen besteht immer noch ein Bedürfnis nach humanen Antikörpern, die den humanen OX40-Rezeptor stimulieren. Diese Antikörper können unter anderem bei der Behandlung und/oder Prävention von Tumoren bei Menschen nützlich sein.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Bindung von Anti-Human-OX40-Rezeptor-Phagenantikörpern, die unter Verwendung von immobilisiertem humanen OX40-Ig-Fusionsprotein selektiert wurden, an humanes OX40-Ig-Fusionsprotein, mit dem ELISA-Platten beschichtet sind. Die Y-Achse zeigt die Extinktion bei 492 nm.
2 zeigt die Bindung von Anti-Human-OX40-Rezeptor-Phagenantikörpern, die unter Verwendung von immobilisiertem humanen OX40-Ig-Fusionsprotein selektiert wurden, an mit humanem OX40-Rezeptor transfizierte PER.C6^TM-Zellen. In jedem Bild handelt es sich bei der Gruppe von Zellen auf der linken Seite um kontrolltransfizierte PER.C6^TM-Zellen, und die Gruppe von Zellen auf der rechten Seite sind mit OX40-Rezeptor transfizierte PER.C6^TM-Zellen. Das Bild links oben zeigt die Bindung eines gegen Thyroglobulin gerichteten Kontrollphagenantikörpers.
In 3 ist die Bindung von Anti-Human-OX40-Rezeptor-Phagenantikörpern, die unter Verwendung von immobilisiertem humanen OX40-Ig-Fusionsprotein selektiert wurden, an OX40-positive, CD4-positive T-Zellen gezeigt. In 3A ist die Bindung der selektierten Phagenantikörper an eine Teilmenge von CD4-positiven T-Zellen innerhalb von mononukleären Zellen aus den Mandeln gezeigt. In 3B ist die Bindung der Phagenantikörper an eine Teilmenge von CD4-positiven T-Zellen innerhalb von mononukleären Zellen aus der Gelenkflüssigkeit gezeigt. In 3C ist die Bindung der selektierten Phagenantikörper an CD4-positive T-Zellen aus dem peripheren Blut gezeigt. Das obere FACS-Diagramm in den 3A, 3B und 3C zeigt eine Kontrollanfärbung von CD4-positiven T-Zellen unter Verwendung eines PE-markierten Maus-Anti-Human-OX40-Antikörpers.
4 zeigt die Bindung von Anti-Human-OX40-Rezeptor-Phagenantikörpern, die unter Verwendung von OX40-positiven, CD4-positiven T-Zellen selektiert wurden, an OX40-positive, CD4-positive T-Zellen (siehe 4A) und an mit humanem OX40-Rezeptor transfizierte PER.C6^TM-Zellen (siehe 4B).
5 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) der SC02008 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
6 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 3) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4) der SC02009 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
7 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6) der SC02010 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
8 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 7) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 8) der SC02011 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
9 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 9) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 10) der SC02012 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
10 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 11) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 12) der SC02021 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
11 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 13) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 14) der SC02022 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
12 zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 15) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 16) der SC02023 genannten scFv. Der CDR3-Bereich der schweren Kette ist unterstrichen.
13 zeigt die Konstruktion des bivalenten scFv-Expressionsvektors pPICZ-biFVH. In 13A ist der Vektor pPICZαB gezeigt, und in 13B ist der bivalente scFv-Expressionsvektors pPicZbiFVH gezeigt. 13C zeigt die Strategie der Klonierung von scFvs in pPicZbiFVH.
14 zeigt die funktionelle Aktivität der bivalenten Anti-Human-OX40-Rezeptor-scFvs SC02008 und SC02023 in einem in-vitro-T-Zell-Costimulierungsassay. 14A zeigt den Stimulierungsassay für das bivalente scFv SC02008, und 14B zeigt den Stimulierungsassay für das bivalente scFv SC02023.
15 zeigt die Bindung von humanen IgG-Molekülen, die 008, 011, 021 und 023 genannte werden, an mit humanem OX40-Rezeptor transfizierte PER.C6^TM-Zellen.
Beschreibung der Erfindung
Es folgen jetzt Definitionen von Ausdrücken, wie sie in der Erfindung verwendet werden.
Definitionen
Agonistisches Bindungsmolekül
Der hier verwendete Ausdruck "agonistisches Bindungsmolekül" bezieht sich im Allgemeinen auf ein Bindungsmolekül, das, wenn es mit einem Rezeptor, z. B. dem OX40-Rezeptor, auf einer Zelle kombiniert wird, an den Rezeptor binden kann und eine Reaktion oder Aktivität einleiten/nachbilden/stimulieren kann, die derjenigen, die vom natürlichen Liganden des Rezeptors, z. B. dem OX40-Liganden, eingeleitet/nachgebildet/stimuliert wird, ähnlich oder damit identisch ist. Ein agonistisches Bindungsmolekül des OX40-Rezeptors kann immunspezifisch an den von aktivierten CD4-positiven T-Zellen exprimierten OX40-Rezeptor binden und kann die Aktivierung eines Signalübermittlungswegs, der mit dem OX40-Rezeptor assoziiert ist, wie zum Beispiel die Aktivierung der aktivierten CD4-positiven T-Zellen, induzieren/erhöhen/verstärken/stimulieren.
Agonistische Bindungsmoleküle können unter anderem irgendwelche oder alle der folgenden Antworten induzieren/erhöhen/verstärken/stimulieren: Vermehrung von CD4-positiven T-Zellen während einer Immunantwort, Stimulation der Cytokinproduktion, Vermehrung von Th1- oder Th2-Effektorzellen, Entwicklung einer Th2-Antwort, Erzeugung von CD4-positiven Gedächtnis-T-Zellen. Ein agonistisches Bindungsmolekül kann eine oder mehrere der Antworten um 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, vorzugsweise 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, besonders bevorzugt 70%, 80%, 85% und am meisten bevorzugt 90%, 95%, 99% oder 100% induzieren/verstärken/stimulieren/erhöhen. Insbesondere aktiviert ein agonistisches Bindungsmolekül, das eine aktivierte CD4-positive T-Zelle induzieren/verstärken/stimulieren/erhöhen kann, eine aktivierte CD4-positive T-Zelle auf das 1–5fache, 5–10fache, 10–20fache oder mehr als 20fache im Vergleich zur Fähigkeit des agonistischen Bindungsmoleküls, eine ruhende T-Zelle zu aktivieren, d. h. T-Zellen, die den T-Zell-Aktivierungsmarker CD4 nicht exprimieren oder geringe bis nicht nachweisbare Mengen davon exprimieren. Verfahren zur Bestimmung der Aktivierung/Stimulation/Induktion/Verstärkung sind in der Technik bekannt; dazu gehören unter anderem antigenspezifische Proliferationsassays, Cytokin-ELISA-Assays, Elispot-Assays, Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen mit Hilfe von Durchflusscytometrieverfahren, bei denen Peptidtetramere des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) eingesetzt werden. Die agonistischen Bindungsmoleküle sind vorzugsweise gegen Epitope innerhalb der extrazellulären Domäne des OX40-Rezeptors gerichtet. Der hier verwendete Ausdruck "agonistisches Bindungsmolekül" deckt unter anderem agonistische humane monoklonale Anti-OX40-Rezeptor-Antikörper oder Teile davon und agonistische humane Anti-OX40-Rezeptor-Zusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität.
Aminosäuresequenz
Der hier verwendete Ausdruck "Aminosäuresequenz" bezieht sich auf natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle und auf eine Peptid-, Oligopeptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz.
Bindungsmolekül
Der hier verwendete Ausdruck "Bindungsmolekül" bezieht sich auf ein intaktes Immunglobulin einschließlich monoklonaler Antikörper, wie chimärischer, humanisierter oder humaner monoklonaler Antikörper, oder auf ein antigenbindendes und/oder eine variable Domäne umfassendes Fragment eines Immunglobulins, das mit dem intakten Immunglobulin um die spezifische Bindung an den Bindungspartner des Immunglobulins, z. B. den OX40-Rezeptor, konkurriert. Unabhängig von seiner Struktur bindet das antigenbindende Fragment an dasselbe Antigen, das auch vom intakten Immunglobulin erkannt wird. Ein antigenbindendes Fragment kann ein Peptid oder Polypeptid umfassen, das eine Aminosäuresequenz aus wenigstens 2 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 5 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 25 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 30 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 35 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 40 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 60 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 70 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 80 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 90 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 100 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 125 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 150 aufein anderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 175 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, aus wenigstens 200 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten oder aus wenigstens 250 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten der Aminosäuresequenz des Bindungsmoleküls umfasst.
Der hier verwendete Ausdruck "Bindungsmolekül" umfasst auch die in der Technik bekannten Immunglobulinklassen und -unterklassen. Je nach der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Bindungsmoleküle in die fünf Hauptklassen intakter Antikörper eingeteilt werden: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere davon können weiter in Unterklassen (Isotypen) eingeteilt werden, zum Beispiel IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4.
Zu den antigenbindenden Fragmenten gehören unter anderem Fab, F(ab'), F(ab')₂, Fv, dAb, Fd, Fragmente des komplementaritätsbestimmenden Bereichs (CDR), einzelkettige Antikörper (scFv), bivalente einzelkettige Antikörper, Diabodies, Triabodies, Tetrabodies, (Poly)peptide, die wenigstens ein Fragment eines Immunglobulins enthalten, das ausreicht, um dem (Poly)peptid usw. eine spezifische Antigenbindung zu verleihen. Die obigen Fragmente können synthetisch oder durch enzymatische oder chemische Spaltung von intakten Immunglobulinen hergestellt werden, oder sie können durch DNA-Rekombinationstechniken gentechnisch hergestellt werden. Die Herstellungsverfahren sind in der Technik wohlbekannt und sind zum Beispiel beschrieben in Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow und D. Lane (Hrsg.) (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Ein Bindungsmolekül oder ein antigenbindendes Fragment davon kann eine oder mehrere Bindungsstellen aufweisen. Wenn es mehr als eine Bindungsstelle gibt, können die Bindungsstellen identisch oder unterschiedlich sein.
Das Bindungsmolekül kann ein nacktes oder unkonjugiertes Bindungsmolekül sein. "Nacktes oder unkonjugiertes Bindungsmolekül" soll sich auf ein Bindungsmolekül beziehen, das nicht konjugiert, funktionell verknüpft oder in sonstiger Weise physikalisch oder funktionell mit einer Effektor-Struktureinheit oder einem Tag, wie unter anderem einer toxischen Substanz, einer radioaktiven Substanz, einem Liposom oder einem Enzym, assoziiert ist. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass "nackte oder unkonjugierte Bindungsmoleküle" keine Bindungsmoleküle ausschließt, die stabilisiert, multimerisiert, humanisiert oder in sonstiger Weise manipuliert wurden, außer durch die Bindung einer Effektor-Struktureinheit oder eines Tags. Dementsprechend sind alle posttranslational modifizierten nackten und unkonjugierten Bindungsmoleküle hier mit eingeschlossen, einschließlich solchen, bei denen die Modifikationen in der natürlichen, das Bindungsmolekül produzierenden Zellumgebung durch eine rekombinante, das Bindungsmolekül produzierende Zelle vorgenommen wurden, und werden nach anfänglicher Herstellung des Bindungsmoleküls von menschlicher Hand eingeführt. Selbstverständlich schließt der Ausdruck "nacktes oder unkonjugiertes Bindungsmolekül" nicht die Fähigkeit des Bindungsmoleküls aus, nach Verabreichung an den Körper funktionelle Assoziationen mit Effektorzellen und/oder Molekülen zu bilden, da einige dieser Wechselwirkungen notwendig sind, um eine biologische Wirkung auszuüben. Daher wird das Fehlen einer assoziierten Effektorgruppe oder eines Tags bei der Definition des "nackten oder unkonjugierten Bindungsmoleküls" in vitro, nicht in vivo, angewendet.
Komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDR)
Der hier verwendete Ausdruck "komplementaritätsbestimmende Bereiche" bedeutet Sequenzen innerhalb der variablen Bereiche von Bindungsmolekülen, wie Immunglobulinen, die die antigenbindende Stelle erzeugen, die in Bezug auf Form und Ladungsverteilung zu dem auf dem Antigen erkannten Epitop komplementär ist. Die CDR-Bereiche können spezifisch für lineare Epitope, diskontinuierliche Epitope oder konformatorische Epitope von Proteinen oder Proteinfragmenten sein, wie sie entweder auf dem Protein in seiner nativen Konformation vorhanden sind oder in manchen Fällen wie sie auf den, zum Beispiel durch Solubilisierung in SDS, denaturierten Proteinen vorhanden sind. Epitope können auch aus posttranslationalen Modifikationen von Proteinen bestehen.
Deletion
Der hier verwendete Ausdruck "Deletion" bezeichnet eine Veränderung in entweder der Aminosäure- oder der Nucleotidsequenz, wobei im Vergleich zum Stammmolekül, oft dem natürlich vorkommenden Molekül, ein oder mehrere Aminosäure- bzw. Nucleotidreste fehlen.
Expressionsregulierende Nucleinsäuresequenz
Der hier verwendete Ausdruck "expressionsregulierende Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf Polynucleotidsequenzen, die für die Expression einer funktionell verknüpften codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind und/oder diese beeinflussen. Wenn zwei Nucleinsäuresequenzen funktionell miteinander verknüpft sind, liegen sie im Allgemeinen in derselben Orientierung und gewöhnlich auch in demselben Leseraster vor. Sie sind gewöhnlich im Wesentlichen aufeinanderfolgend, obwohl dies möglicherweise nicht erforderlich ist. Bei den expressionsregulierenden Nucleinsäuresequenzen, wie unter anderem geeignete Transcriptionsinitiations-, Terminations-, Promotor-, Enhancersequenzen, Repressor- oder Aktivatorsequenzen, effiziente RNA-Prozessierungssignale, wie Spleiß- und Polyadenylierungssignale, Sequenzen, die cytoplasmatische mRNA stabilisieren, Sequenzen, die die Translationseffizienz verstärken (z. B. Ribosomenbindungsstellen), Sequenzen, die die Proteinstabilität verstärken, und gegebenenfalls Sequenzen, die die Proteinsekretion verstärken, kann es sich um jede Nucleinsäuresequenz handeln, die im Wirtsorganismus der Wahl Aktivität zeigt, und sie können von Genen abgeleitet sein, die Proteine codieren, welche in Bezug auf den Wirtsorganismus entweder homolog oder heterolog sind.
Funktionelle Variante
Der hier verwendete Ausdruck "funktionelle Variante" bezieht sich auf ein Bindungsmolekül, das eine Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenz umfasst, die im Vergleich zur Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenz des Stammbindungs moleküls um ein oder mehrere Nucleotide und/oder Aminosäuren verändert ist und noch mit dem Stammbindungsmolekül um die Bindung an den Bindungspartner, zum Beispiel den OX40-Rezeptor, konkurrieren kann. Mit anderen Worten, die Modifikationen in der Aminosäure- und/oder Nucleotidsequenz des Stammbindungsmoleküls beeinflussen oder verändern die Bindungseigenschaften des Bindungsmoleküls, das von der Nucleotidsequenz codiert wird oder die Aminosäuresequenz enthält, nicht signifikant, d. h. das Bindungsmolekül kann sein Target noch erkennen und binden. Die funktionelle Variante kann konservative Sequenzmodifikationen einschließlich Nucleotid- und Aminosäuresubstitutionen, -additionen und -deletionen aufweisen. Diese Modifikationen können durch in der Technik bekannten Standardtechniken, wie ortsspezifische Mutagenese und statistische PCR-vermittelte Mutagenese, eingeführt werden und können natürliche sowie nicht natürliche Nucleotide und Aminosäuren umfassen.
Zu den konservativen Aminosäuresubstitutionen gehören solche, bei denen der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit ähnlichen strukturellen oder chemischen Eigenschaften ersetzt ist. Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind in der Technik definiert. Zu diesen Familien gehören Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystin, Tryptophan), unpolaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin), beta-verzweigten Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Weiterhin kann eine Variante auch nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen aufweisen, zum Beispiel durch Ersatz einer Aminosäure durch einen Aminosäurerest mit anderen strukturellen oder chemischen Eigenschaften. Ähnliche kleinere Variationen können auch Aminosäuredeletionen oder -insertionen oder beides umfassen. Eine Anleitung bei der Bestimmung, welche Aminosäurereste substituiert, inseriert oder deletiert werden können, ohne die immunologische Aktivität aufzugeben, ist mit Hilfe von in der Technik bekannten Computerprogrammen zu finden.
Eine Mutation in einer Nucleotidsequenz kann eine einzelne Veränderung sein, die an einem Locus vorgenommen wird (eine Punktmutation), wie Transitions- oder Transversionsmutationen, oder alternativ dazu können auch mehrere Nucleotide an einem einzigen Locus inseriert, deletiert oder verändert werden. Außerdem können eine oder mehrere Veränderungen an einer beliebigen Zahl von Loci innerhalb einer Nucleotidsequenz vorgenommen werden. Die Mutationen können mit jedem in der Technik bekannten geeigneten Verfahren durchgeführt werden.
Wirt
Der hier verwendete Ausdruck "Wirt" soll sich auf einen Organismus oder eine Zelle beziehen, in den bzw. die ein Vektor, wie ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor, eingeführt wurde. Der Organismus oder die Zelle kann prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass sich dieser Ausdruck nicht nur auf den besonderen betroffenen Organismus oder die Zelle, sondern auch auf die Nachkommenschaft eines solchen Organismus oder einer solchen Zelle beziehen soll. Da in nachfolgenden Generationen entweder aufgrund von Mutation oder aufgrund von Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, ist eine solche Nachkommenschaft möglicherweise tatsächlich nicht mit dem Stammorganismus oder der Stammzelle identisch, gehört aber dennoch in den Umfang des Ausdrucks "Wirt", wie er hier verwendet wird.
Human
Wenn er auf die hier definierten Bindungsmoleküle angewendet wird, bezieht sich der Ausdruck "human" auf Moleküle, die entweder direkt von einem Menschen abgeleitet sind oder auf einer humanen Sequenz beruhen. Wenn ein Bindungsmolekül von einer humanen Sequenz abgeleitet ist oder auf einer solchen beruht und anschließend modifiziert wird, ist sie so, wie der Ausdruck in der gesamten Beschreibung verwendet wird, immer noch als human anzusehen. Mit anderen Worten, der Ausdruck "human", wenn er auf Bindungsmoleküle angewendet wird, soll Bindungsmoleküle umfassen, die variable und konstante Bereiche aufweisen, welche von humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen auf der Basis von variablen oder konstanten Bereichen, die entweder bei einem Menschen oder humanen Lymphocyten vorkommen oder auch nicht, oder in modifizierter Form abgeleitet sind. Die humanen Bindungsmoleküle können also Aminosäurereste umfassen, die nicht von humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen codiert werden, Substitutionen und/oder Deletionen umfassen (z. B. Mutationen, die zum Beispiel durch statistische oder ortsspezifische Mutagenese in vitro oder durch somatische Mutation in vivo eingeführt wurden). Der hier verwendete Ausdruck "auf der Basis von" bezieht sich auf die Situation, dass eine Nucleinsäuresequenz exakt von einer Matrize kopiert sein kann oder mit kleineren Mutationen, wie durch fehlerbehaftete PCR-Verfahren, oder synthetisch so hergestellt sein kann, dass sie genau oder mit kleineren Modifikationen zu der Matrize passt. Halbsynthetische Moleküle auf der Basis von humanen Sequenzen gelten so, wie der Ausdruck hier verwendet wird, ebenfalls als human.
Immunantwort
Der hier verwendete Ausdruck "Immunantwort" bezieht sich auf eine antagonistische und spezifische Reaktion des Wirts auf fremde Antigene oder Selbstantigene, die die Bildung von Antikörpern durch B-Zellen oder eine zellvermittelte Antwort durch T-Zellen beinhaltet.
Insertion
Der Ausdruck "Insertion", der auch als der Ausdruck "Addition" bekannt ist, bezeichnet eine Veränderung in einer Aminosäure- oder Nucleotidsequenz, die zur Addition von einer oder mehreren Aminosäure- bzw. Nucleotidresten im Vergleich zum Stammmolekül, häufig dem natürlich vorkommenden Molekül, führt.
Internalisierendes Bindungsmolekül
Der hier verwendete Ausdruck "internalisierendes Bindungsmolekül" bedeutet ein Bindungsmolekül, wie es hier definiert ist, das innerhalb der Zielzellen, an die es bindet, internalisiert werden kann. Mit anderen Worten, das Bindungsmolekül wird bei der Bindung an den Bindungspartner des Bindungsmoleküls von den Zielzellen aufgenommen, d. h. von außerhalb (Zelloberfläche) einer Zielzelle zum Innern transportiert, zum Beispiel in das endosomale Kompartiment oder ein anderes Kompartiment oder in das Cytoplasma der Zelle.
Isoliert
Wenn der Ausdruck "isoliert" auf Bindungsmoleküle angewendet wird, wie sie hier definiert sind, bezieht er sich auf Bindungsmoleküle, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Polypeptiden, insbesondere frei von anderen Bindungsmolekülen mit anderen antigenen Spezifitäten, sind und auch im Wesentlichen frei von anderem Zell- oder Gewebematerial und/oder chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien sind. Wenn die Bindungsmoleküle zum Beispiel rekombinant erzeugt werden, sind sie vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, und wenn die Bindungsmoleküle durch chemische Synthese hergestellt werden, sind sie vorzugsweise im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, d. h. sie werden von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind, getrennt. Vorzugsweise bedeutet "im Wesentlichen frei", dass das Bindungsmolekül typischerweise etwa 50, 60, 70, 80 oder 90 Gew.-% einer Probe, gewöhnlich etwa 95%, umfasst und vorzugsweise zu über 99% rein ist. Wenn der Ausdruck "isoliert" auf Nucleinsäuremoleküle angewendet wird, die Bindungsmoleküle codieren, wie sie hier definiert sind, soll er sich auf Nucleinsäuremoleküle beziehen, bei denen die Nucleotidsequenzen, die die Bindungsmoleküle codieren, frei von anderen Nucleotidsequenzen sind, insbesondere frei von Nucleotidsequenzen, die Bindungsmoleküle codieren, welche andere Bindungspartner als den OX40-Rezeptor binden. Weiterhin bezieht sich der Ausdruck "isoliert" auf Nucleinsäuremoleküle, die im Wesentlichen von anderen Zellkomponenten, die das native Nucleinsäuremolekül in seinem natürlichen Wirt natürlicherweise begleiten, zum Beispiel Ribosomen, Polymerasen oder genomischen Sequenzen, mit denen sie natürlicherweise assoziiert ist, getrennt sind. Außerdem können "isolierte" Nucleinsäuremoleküle, wie cDNA-Moleküle, im Wesentlichen frei von anderem Zellmaterial oder Kulturmedium sein, wenn sie durch rekombinante Techniken hergestellt werden, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn sie chemisch synthetisiert werden.
Monoklonaler Antikörper
Der hier verwendete Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezieht sich auf bezieht sich auf ein Präparat von Antikörpermolekülen einer einzigen molekularen Zusammensetzung. Ein monoklonaler Antikörper weist eine einzige Bindungsspezifität und Affinität zu einem bestimmten Epitop auf. Dementsprechend bezieht sich der Ausdruck "humaner monoklonaler Antikörper" auf einen Antikörper, der eine einzige Bindungsspezifität aufweist und der variable und konstante Bereiche besitzt, die von humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen abgeleitet sind oder auf diesen beruhen oder von vollständig synthetischen Sequenzen abgeleitet sind.
Natürlich vorkommend
Der hier verwendete Ausdruck "natürlich vorkommend", der auf ein Objekt angewendet wird, bezieht sich darauf, dass ein Objekt in der Natur zu finden ist. Zum Beispiel ist eine Polypeptid- oder Polynucleotidsequenz, die in einem Organismus vorhanden ist, welcher aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann, und die nicht absichtlich vom Menschen im Labor modifiziert wurde, natürlich vorkommend.
Neoplastische Zellen
Der hier verwendete Ausdruck "neoplastische Zellen" bezieht sich auf Zellen, die aus abnormem autonomen neuem Wachstum resultieren, das keine erkennbare physiologische Funktion hat. Eine neoplastische Zelle umfasst weiterhin transformierte Zellen und Krebszellen einschließlich Blutkrebserkrankungen (gutartig und bösartig).
Nucleinsäuremolekül
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Nucleinsäuremolekül" bezieht sich auf eine polymere Form von Nucleotiden und umfasst sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge von RNA, cDNA, genomischer DNA und synthetische Formen sowie gemischte Polymere der obigen. "Nucleotid" bezieht sich auf ein Ribonucleotid, Desoxyribonucleotid oder eine modifizierte Form eines der beiden Typen von Nucleotid. Der Ausdruck umfasst auch einzel- und doppelsträngige Formen von DNA. Außerdem kann ein Polynucleotid natürlich vorkommende und/oder modifizierte Nucleotide beinhalten, die durch natürlich vorkommende und/oder nicht natürlich vorkommende Nucleotidverknüpfungen miteinander verknüpft sind. Die Nucleinsäuremoleküle können chemisch oder biochemisch modifiziert sein oder können nichtnatürliche oder derivatisierte Nucleotidbasen enthalten, wie der Fachmann leicht einsehen wird. Zu diesen Modifikationen gehören zum Beispiel Marker, Methylierung, Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nucleotide durch ein Analogon, Internucleotid-Modifikationen, wie ungeladene Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate usw.), geladene Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw.), seitenständige Struktureinheiten (z. B. Polypeptide), Intercalatoren (z. B. Acridin, Psoralen usw.), Chelatoren, Alkylatoren und modifizierte Verknüpfungen (z. B. alpha-anomere Nucleinsäuren usw.). Der obige Ausdruck soll auch jede topologische Konformation einschließlich einzelsträngiger, doppelsträngiger, partiell duplexierter, Triplex-, Hairpin-, zirkulärer und Padlocked-Konformation. Ebenfalls mit eingeschlossen sind synthetische Moleküle, die Polynucleotide in ihrer Fähigkeit nachbilden, über Wasserstoffbrücken und andere chemische Wechselwirkungen an eine bezeichnete Sequenz zu binden. Solche Moleküle sind in der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel solche, bei denen Peptidbindungen im Gerüst des Moleküls an die Stelle von Phosphatbindungen treten. Die Erwähnung einer Nucleinsäuresequenz umfasst auch ihr Komplement, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Erwähnung eines Nucleinsäuremoleküls, das eine bestimmte Sequenz hat, sollte also so verstanden werden, dass auch sein komplementärer Strang mit seiner komplementären Sequenz mit umfasst wird. Der komplementäre Strang ist auch zum Beispiel für die Antisense-Therapie, Hybridisierungssonden und PCR-Primer geeignet.
Funktionell verknüpft
Der Ausdruck "funktionell verknüpft" bezieht sich auf zwei oder mehr Nucleinsäure-Sequenzelemente, die physikalisch miteinander verknüpft sind und in einer funktionellen Beziehung zueinander stehen. Zum Beispiel ist ein Promotor funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn der Promotor die Transcription oder Expression einer codierenden Sequenz einleiten oder regulieren kann; in diesem Fall sollte die codierende Sequenz als "unter der Kontrolle" des Promotors stehend verstanden werden. Wenn zwei Nucleinsäuresequenzen funktionell miteinander verknüpft sind, liegen sie im Allgemeinen in derselben Orientierung und gewöhnlich auch in demselben Leseraster vor. Sie werden gewöhnlich im Wesentlichen benachbart sein, auch wenn dies möglicherweise nicht erforderlich ist.
Pharmazeutisch annehmbarer Arzneimittelhilfsstoff
"Pharmazeutisch annehmbarer Arzneimittelhilfsstoff" bedeutet jede inerte Substanz, die mit einem aktiven Molekül, wie einem Wirkstoff, Mittel oder Bindungsmolekül, kombiniert wird, um eine angenehme oder zweckmäßige Darreichungsform herzustellen. Der "pharmazeutisch annehmbare Arzneimittelhilfsstoff" ist ein Arzneimittelhilfsstoff, der bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen für Empfänger nicht toxisch ist und mit anderen Bestandteilen der Zubereitung, die den Wirkstoff, das Mittel oder das Bindungsmolekül umfassen, verträglich ist.
Spezifisch binden
Der Ausdruck "spezifisch binden", wie er hier in Bezug auf die Wechselwirkung eines Bindungsmoleküls, zum Beispiel eines Antikörpers, und seines Bindungspartners, zum Beispiel eines Antigens, verwendet wird, bedeutet, dass die Wechselwirkung von der Anwesenheit einer bestimmten Struktur, zum Beispiel einer antigenen Determinante oder eines Epitops, auf dem Bindungspartner abhängt. Mit anderen Worten, der Antikörper bindet oder erkennt vorzugsweise den Bindungspartner, auch wenn der Bindungspartner in einem Gemisch von anderen Molekülen vorhanden ist. Die Bindung kann durch kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen oder eine Kombination von beiden vermittelt werden. Mit noch anderen Worten, der Ausdruck "spezifisch binden" bedeutet "immunspezifisch an ein Antigen oder ein Fragment davon binden und nicht immunspezifisch an andere Antigene binden". Ein Bindungsmolekül, das immunspezifisch an ein Antigen bindet, kann mit geringerer Affinität auch an andere Peptide oder Polypeptide binden, wie es zum Beispiel durch Radioimmunassays (RIA), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays), BIAcore oder andere in der Technik bekannte Assays bestimmt wird. Bindungsmoleküle oder Fragmente davon, die immunspezifisch an ein Antigen binden, können gegenüber verwandten Antigenen kreuzreaktiv sein. Vorzugsweise gehen Bindungsmoleküle oder Fragmente davon, die immunspezifisch an ein Antigen binden, keine Kreuzreaktion mit anderen Antigenen ein.
Substitutionen
Der hier verwendete Ausdruck "Substitution" bezeichnet den Ersatz von einer oder mehreren Aminosäuren oder Nucleotiden durch andere Aminosäuren bzw. Nucleotide.
Therapeutisch wirksame Menge
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge des hier definierten Bindungsmoleküls, die wirksam ist in Bezug auf die Verhinderung, Linderung oder Behandlung einer Störung oder Krankheit, bei der die OX40-Rezeptor-Moleküle eine Rolle spielen oder mit der sie assoziiert sind.
Behandlung
Der Ausdruck "Behandlung" bezieht sich auf eine therapeutische Behandlung sowie auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen, um eine Krankheit zu heilen oder ihr Fortschreiten aufzuhalten oder wenigstens zu verzögern. Zu denjenigen, die einer solchen Behandlung bedürfen, gehören solche, die bereits von einer Krankheit oder Störung betroffen sind, bei der OX40-Rezeptor-Moleküle eine Rolle spielen oder mit der sie assoziiert sind, sowie solche, bei denen die Krankheit oder Störung verhindert werden soll (Prävention). Prävention umfasst die Hemmung oder Reduktion der Ausbreitung der Krankheit oder Störung oder die Hemmung oder Reduktion des Einsetzend, der Entwicklung oder des Fortschreitens von einem oder mehreren der Symptome, die mit der Krankheit oder Störung, bei der OX40-Rezeptormoleküle eine Rolle spielen oder mit der sie assoziiert sind, verbunden sind.
Vektor
Der Ausdruck "Vektor" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, in das ein zweites Nucleinsäuremolekül zur Einführung in einen Wirt, wo es repliziert und in manchen Fällen exprimiert wird, eingefügt werden kann. Mit anderen Worten, ein Vektor kann ein Nucleinsäuremolekül, mit dem er verknüpft wurde, transportieren. Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" umfasst sowohl Klonierungs- als auch Expressionsvektoren. Zu den Vektoren gehören unter anderem Plasmide, Cosmide, bakterielle künstliche Chromosomen (BAC) und künstliche Hefechromosomen (YAC) sowie Vektoren, die von Bakteriophagen oder Pflanzen- oder Tierviren (einschließlich Humanviren) abgeleitet sind. Vektoren umfassen einen Replikationsstartpunkt, der von dem vorgeschlagenen Wirt erkannt wird, und im Falle von Expressionsvektoren einen Promotor und andere regulatorische bereiche, die vom Wirt erkannt werden. Ein Vektor, der ein zweites Nucleinsäuremolekül enthält, wird durch Transformation, Transfektion oder Ausnutzung von viralen Eintrittsmechanismen in eine Zelle eingeführt. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einen Wirt befähigt, in den sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren, die einen bakteriellen Replikationsstartpunkt aufweisen). Andere Vektoren können nach Einführung in den Wirt in das Genom eines Wirts integriert werden und werden dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt agonistische Bindungsmoleküle bereit, die zur spezifischen Bindung an den humanen OX40-Rezeptor befähigt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungsmoleküle humane Bindungsmoleküle. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Nucleinsäuremoleküle, die wenigstens den Bindungsbereich der Bindungsmoleküle codieren. Die Erfindung gibt weiterhin die Verwendung der Bindungsmoleküle oder Nucleinsäuren zur Verstärkung der Immunantwort bei einem Menschen, zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und zur Herstellung einer Medikaments zur Behandlung eines Menschen an, der unter einer Störung oder Erkrankung, wie einer neoplastischen Störung oder Erkrankung, leidet oder bei dem die Gefahr besteht, dass er eine solche Störung oder Erkrankung entwickelt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung agonistische Bindungsmoleküle bereit, die an den humanen OX40-Rezeptor binden, vorzugsweise spezifisch binden, oder sich an den humanen OX40-Rezeptor anlagern können. Die agonistischen Bindungsmoleküle können auch an ein Fragment des humanen OX40-Rezeptors binden, vorzugsweise spezifisch binden, wobei das Fragment wenigstens eine antigene Determinante des humanen OX40-Rezeptors umfasst, die von wenigstens einem der agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung erkannt wird. Der humane OX40-Rezeptor wird selektiv von aktivierten Immun zellen, wie aktivierten CD4-positiven T-Zellen, exprimiert. Die Bindungsmoleküle der Erfindung können aktivierte CD4-positive T-Zellen stimulieren und/oder aktivieren und/oder verstärken und/oder vermehren und/oder induzieren. Die Expression von CD4 auf aktivierten T-Zellen kann mit in der Technik bekannten Verfahren gemessen werden; dazu gehören unter anderem FACS-Analyse, Immunfluoreszenzassays, RT-PCR, Northern-Blot-Analyse und Western-Blot-Analyse.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die agonistischen Bindungsmoleküle gemäß der Erfindung humane agonistische Bindungsmoleküle. Vorzugsweise sind die humanen Bindungsmoleküle von einer halbsynthetischen Bibliothek, die auf humanen Sequenzen beruht, abgeleitet und unter Verwendung von fehlerbehafteter PCR mutiert, um Spezifitäten zu erhöhen. Ein humanes Bindungsmolekül gemäß der Erfindung, wie ein Antikörper, enthält keine von der Maus abgeleitete Sequenzen, im Gegensatz zu Maus-Antikörpern, die durch Hybridomtechnik erhalten werden (Kohler und Milstein, 1975), oder Varianten davon, wie chimärische Antikörper oder humanisierte Antikörper. Humane Antikörper haben den folgenden Vorteil: Wenn sie Menschen verabreicht werden, wird die immunogene Anti-Antikörper-Antwort äußerst gering sein oder fehlen, während die von der Maus abgeleiteten Antikörper in sehr ausgedehnter Weise zu solchen Reaktionen führen können (Van Kroonenburgh und Pauwels, 1988). Ein Bindungsmolekül beruht zum Beispiel auf einer humanen Sequenz, wenn es aus einer Bibliothek von humanen Bindungsmolekülen erhalten wurde. Eine solche Bibliothek kann auch humane Bindungsmoleküle umfassen, die auf einer humanen Sequenz beruhen, aber Mutationen enthalten, zum Beispiel eine halbsynthetische Bibliothek, wie sie verwendet wurde, um Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Der hier verwendete Ausdruck "beruhen auf" soll auch die synthetische Konstruktion von genetischer Information auf der Basis von Kenntnissen solcher genetischer Information umfassen. Zu diesen Verfahren gehören die Verwendung von humanem oder vom Menschen abgeleitetem genetischem Material als Matrize für die PCR zum Aufbau eines neuen Bindungsmolekülcodierenden Konstrukts, das auf der Sequenz der Matrize beruht, die Konstruktion von vollständig synthetischer genetischer Information mit einer gewünschten Sequenz, zum Beispiel durch Verknüpfen von synthetischen Oligonucleotiden zu einem gewünschten Konstrukt und dergleichen. Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass "beruhen auf" nicht ausschließlich eine direkte Klonierung der Wildtyp-DNA bedeutet. Der Fachmann wird sich auch der Möglichkeiten der Molekularbiologie bewusst sein, um mutante Formen eines bestimmten Stücks Nucleinsäure zu erhalten.
Die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung können intakte Immunglobulinmoleküle, wie polyklonale oder monoklonale Antikörper, insbesondere humane monoklonale Antikörper, sein, oder die Bindungsmoleküle können antigenbindende Fragmente sein; dazu gehören unter anderem Fab, F(ab'), F(ab')₂, Fv, dAb, Fd, Fragmente des komplementaritätsbestimmenden Bereichs (CDR), einzelkettige Antikörper (scFv), bivalente einzelkettige Antikörper, Diabodies, Triabodies, Tetrabodies und (Poly)peptide, die wenigstens ein Fragment eines Immunglobulins enthalten, das ausreicht, um den (Poly)peptiden eine spezifische Antigenbindung zu verleihen. Die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung können in nichtisolierter oder isolierter Form verwendet werden. Weiterhin können die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung allein oder in einem Gemisch/einer Zusammensetzung, die wenigstens ein agonistisches Bindungsmolekül (oder eine Variante oder ein Fragment davon) der Erfindung umfasst, verwendet werden. Das Gemisch/die Zusammensetzung kann weiterhin wenigstens ein anderes therapeutisches Mittel umfassen. In einer Ausführungsform kann das therapeutische Mittel ein natürlicher Ligand des OX40-Rezeptors oder eine Variante des natürlichen Liganden, die noch an den humanen OX40-Rezeptor binden kann, sein. Die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung können in vitro synergistisch mit dem natürlichen Liganden, zum Beispiel dem OX40-Liganden, zusammenwirken. Ein Vorteil von agonistischen Bindungsmolekülen, die synergistisch mit dem natürlichen Liganden zusammenwirken, könnte sein, dass sie die Wirkung des in vivo vorhandenen OX40-Liganden verstärken können, anstatt ihn nur zu substituieren. Eine solche synergistische Aktivität kann durch dem Fachmann bekannte funktionelle Assays bestimmt werden.
Typischerweise können agonistische Bindungsmoleküle gemäß der Erfindung an ihre Bindungspartner, d. h. den humanen OX40-Rezeptor, mit einer Affinitätskonstanten (K_d-Wert) binden, die kleiner ist als 0,2·10^–4 M, 1,0·10^–5 M, 1,0·10^–6 M, 1,0·10^–7 M, vorzugsweise kleiner als 1,0·10^–8 M, besonders bevorzugt kleiner als 1,0·10^–9 M, besonders bevorzugt kleiner als 1,0·10^–10 M, ganz besonders bevorzugt kleiner als 1,0·10^–11 M und insbesondere kleiner als 1,0·10^–12 M. Die Affinitätskonstanten können gemäß den Antikörperisotypen variieren. Zum Beispiel bezieht sich Affinitätsbindung bei einem IgM-Isotyp auf eine Bindungsaffinität von wenigstens etwa 1,0·10^–7 M. Affinitätskonstanten können mit Hilfe von Oberflächenplasmonresonanz gemessen werden, d. h. einem optischen Phänomen, das die Analyse von biospezifischen Echtzeitwechselwirkungen durch Nachweis von Veränderungen der Proteinkonzentrationen innerhalb einer Biosensormatrix ermöglicht, zum Beispiel mit Hilfe des BIAcore-Systems (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Schweden).
Das agonistische Bindungsmolekül der Erfindung kann nach Bindung an den humanen OX40-Rezeptor internalisieren. Weiterhin können die agonistischen Bindungsmoleküle gemäß der Erfindung an den humanen OX40-Rezeptor in löslicher Form binden, oder sie können an den humanen OX40-Rezeptor binden, der an einen Träger oder ein Substrat, zum Beispiel Mikrotiterplatten, Membranen und Beads usw., gebunden oder daran befestigt ist. Träger oder Substrate können aus Glas, Kunststoff (z. B. Polystyrol), Polysacchariden, Nylon, Nitrocellulose oder Teflon usw. bestehen. Die Oberfläche solcher Träger kann massiv oder porös sein und jede zweckmäßige Form haben. Weiterhin können die agonistischen Bindungsmoleküle an den humanen OX40-Rezeptor in gereinigter oder ungereinigter Form binden. Vorzugsweise können die agonistischen Bindungsmoleküle spezifisch an den humanen OX40-Rezeptor binden, der mit Zellen assoziiert ist, wie aktivierten CD4-positiven T-Zellen oder Teilen oder Bestandteilen dieser Zellen, die den humanen OX40-Rezeptor oder ein Fragment davon umfassen.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die Bindungsmoleküle der Erfindung wenigstens einen CDR3-Bereich, der die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 17 (DRYSQVHYALDY), SEQ ID Nr. 18 (DRYVNTSNAFDY), SEQ ID Nr. 19 (DMSGFHEFDY), SEQ ID Nr. 20 (DRYFRQQNAFDY), SEQ ID Nr. 21 (ARAAGTIFDY), SEQ ID Nr. 22 (DRYITLPNALDY), SEQ ID Nr. 23 (YDEPLTIYWFDS) und SEQ ID Nr. 24 (YDNVMGLYWFDY) besteht.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Bindungsmoleküle der Erfindung bereit, die eine schwere Kette umfassen, die die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 25, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28 besteht. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Bindungsmoleküle, die Folgendes umfassen: eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 25 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 29 umfasst, eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 26 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 30 umfasst, eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 27 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 31 umfasst, oder eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 28 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 32 umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst funktionelle Varianten von agonistischen Bindungsmolekülen oder Fragmente davon, wie sie hier definiert sind. Moleküle sind funktionelle Varianten eines Bindungsmoleküls, wenn die Varianten mit den Stammbindungsmolekülen um die spezifische Bindung an den humanen OX40-Rezeptor und vorzugsweise um dieselbe Bindungsstelle auf dem humanen OX40-Rezeptor konkurrieren können, mit anderen Worten, wenn die funktionellen Varianten noch immunspezifisch an den humanen OX40-Rezeptor oder einen Teil davon binden können. Weiterhin müssen die funktionellen Varianten aktivierte CD4-positive T-Zellen induzieren/stimulieren/verstärken/vermehren können. Mit anderen Worten, die funktionellen Varianten müssen auch agonistische Aktivität haben. Diese agonistische Aktivität kann stärker oder geringer sein als die agonistische Aktivität der Stammbindungsmoleküle der Erfindung. Zu den funktionellen Varianten gehören unter anderem Derivate, die in Bezug auf die Primärstruktursequenz im Wesentlichen gleich sind, aber zum Beispiel chemische und/oder biochemische in-vitro- oder in-vivo-Modifikationen enthalten, die man im Stammbindungsmolekül nicht findet. Zu diesen Modifikationen gehören unter anderem Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Häm-Struktureinheit, kovalente Bindung eines Nucleotids oder Nucleotid-Derivats, kovalente Bindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphatidylinosit, Vernetzung, Cyclisierung, Bildung von Disulfidbindungen, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, Pegylierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine, wie Arginylierung und Ubiquitinierung.
Alternativ dazu können funktionelle Varianten Bindungsmoleküle gemäß der Definition in der vorliegenden Erfindung sein, die eine Aminosäuresequenz umfassen, welche Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder Kombinationen davon von einer oder mehreren Aminosäuren im Vergleich zu den Aminosäuresequenzen der Stammbindungsmoleküle enthält. Weiterhin können funktionelle Varianten auch Verkürzungen der Aminosäuresequenz am Amino- und/oder Carboxyterminus umfassen. Funktionelle Varianten gemäß der Erfindung können dieselbe oder verschiedene, entweder höhere oder niedrigere, Bindungsaffinitäten im Vergleich zum Stammbindungsmolekül haben, aber immer noch an den humanen OX40-Rezeptor binden können, der zum Beispiel auf einer CD4-positiven T-Zelle vorhanden ist. Zum Beispiel können funktionelle Varianten gemäß der Erfindung erhöhte oder reduzierte Bindungsaffinitäten zu dem humanen OX40-Rezeptor im Vergleich zu den Stammbindungsmolekülen haben. Vorzugsweise sind die Aminosäuresequenzen der variablen Bereiche einschließlich unter anderem Rahmenbereichen, hypervariablen Bereichen, insbesondere den CDR3-Bereichen, modifiziert. Im Allgemeinen umfassen die variablen Bereiche der leichten Kette und der schweren Kette drei hypervariable Bereiche, die drei CDRs umfassen, und stärker konservierte Bereiche, die sogenannten Rahmenbereiche (FRs). Die hypervariablen Bereiche umfassen Aminosäurereste von CDRs und Aminosäurereste von hypervariablen Schleifen. Funktionelle Varianten, die in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen sollen, weisen wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 60%, wenigstens 70%, wenigstens 75%, besonders bevorzugt wenigstens 80%, wenigstens 85%, ganz besonders bevorzugt wenigstens 90%, wenigstens 95% und insbesondere wenigstens 97%, wenigstens 98%, wenigstens 99% Aminosäuresequenzhomologie mit den hier definierten Stammbindungsmolekülen auf. Computeralgorithmen, wie unter anderem Gap oder Bestfit, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um zu vergleichende Aminosäuresequenzen optimal aneinander abzugleichen und ähnliche oder identische Aminosäurereste zu definieren.
Funktionelle Varianten der Erfindung können erhalten werden, indem man die Nucleotidsequenz von Stammbindungsmolekülen oder Teile davon durch allgemeine Verfahren der Molekularbiologie, die in der Technik bekannt sind, einschließlich unter anderem fehlerbehafteter PCR, Oligonucleotid-Mutagenese und ortsspezifischer Mutagenese, verändert. Mutationen in den Nucleotidsequenzen können eine andere Funktionalität ergeben, aber sie können auch stumm sein in dem Sinne, dass bestimmte Mutationen die Funktionalität dieses besonderen DNA-Stücks und des davon codierten Proteins nicht verändern. Der Fachmann wird anerkennen, dass bestimmte Deletionen, Vertauschungen, (Punkt)Mutationen, Additionen, Substitutionen usw. immer noch zu einer Nucleinsäure führen können, die eine ähnliche Funktion wie die ursprüngliche Nucleinsäure hat. Mann sollte sich daher darüber im Klaren sein, dass solche Veränderungen, die die Funktionalität der codierten agonistischen Bindungsmoleküle gegen den humanen OX40-Rezeptor nicht signifikant verändern, in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Humane Antikörper gemäß der Erfindung können daher auch (halb)synthetische Bereiche enthalten, zum Beispiel in den CDR-Bereichen. Es ist zum Beispiel möglich, die CDR-Bereiche der variablen Domänen von Bindungsmolekülen durch ortsspezifische Mutagenese, Oligonucleotid-Mutagenese, fehlerbehaftete PCR, Klonierung von Restriktionsfragmenten und dergleichen zu verändern.
In noch einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Immunkonjugate, d. h. Moleküle, die wenigstens ein agonistisches Bindungsmolekül, wie es hier definiert ist, umfassen und weiterhin wenigstens ein Tag, wie eine therapeutische Struktureinheit, umfassen. In der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen werden Gemische von Immunkonjugaten gemäß der Erfindung oder Gemische von wenigstens einem Immunkonjugat gemäß der Erfindung und einem anderen Molekül, wie einem therapeutischen Mittel oder einem anderen Bindungsmolekül. In einer Ausführungsform umfassen die Immunkonjugate der Erfindung mehr als ein Tag. Diese Tags können gleich oder verschieden sein und können nichtkovalent mit den Bindungsmolekülen verknüpft/konjugiert werden. Die Tags können direkt über kovalente Bindung, einschließlich unter anderem Disulfidbindung, Wasserstoffbrückenbindung, elektrostatischer Bindung, rekombinanter Fusion und konformatorischer Bindung, mit den Bindungsmolekülen verknüpft/konjugiert werden. Alternativ dazu können die Tags auch mittels einer oder mehrerer Linker-Verbindungen mit den Bindungsmolekülen verknüpft/konjugiert werden. Techniken zum Konjugieren von Tags mit Bindungsmolekülen sind wohlbekannt, siehe zum Beispiel Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, S. 243–256 in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (1985), Herausgeber: Reisfeld et al., A. R. Liss, Inc.; Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, S. 623–653 in Controlled Drug Delivery, 2. Auflage (1987), Herausgeber: Robinson et al., Marcel Dekker, Inc.; Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents, S. 475–506 in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (1985), Herausgeber: Pinchera et al.; Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, S. 303–316, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (1985), Herausgeber: Baldwin et al., Academic Press.
In einer speziellen Ausführungsform umfassen die Tags eine Verbindung, die die Immunantwort weiter verstärkt, wie etwa eine Verbindung, die aktivierte Immunzellen, zum Beispiel aktivierte T-Zellen, wie aktivierte CD4-positive T-Zellen, stimuliert und/oder aktiviert und/oder verstärkt und/oder vermehrt und/oder induziert. Solche Verbindungen können unter anderem Bindungsmole küle, kleine Moleküle, organische oder anorganische Verbindungen, Enzyme, Polynucleotidsequenzen, Plasmide, Proteine, Peptide, Liposomen oder Kombinationen davon umfassen. Beispiele für Verbindungen, die die Immunantwort verstärken können, sind unter anderem Verbindungen, die einen Cytokin-Rezeptor aktivieren, wie unter anderem Cytokine, einschließlich unter anderem CSF-1, Flt3-Ligand, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, M-CSF und TNF-α; Chemokine, einschließlich unter anderem IP-10, MIG und MIP-1; Bindungsmoleküle, die immunspezifisch an einen Rezeptor binden, einschließlich unter anderem den CSF-1-Rezeptor, Flt3, G-CSF-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, IFN-α-Rezeptor, IFN-β-Rezeptor, IFN-γ-Rezeptor, IL-1β-Rezeptor, IL-2-Rezeptor, IL-3-Rezeptor, IL-4-Rezeptor, IL-5-Rezeptor, IL-6-Rezeptor, IL-7-Rezeptor, IL-8-Rezeptor, IL-9-Rezeptor, IL-10-Rezeptor, IL-12-Rezeptor, IL-15-Rezeptor, IL-18-Rezeptor, IP-10-Rezeptor, M-CSF-Rezeptor, MIG-Rezeptor, MIP-1-Rezeptor und TNF-α-Rezeptor. Analoga, Derivate oder Fragmente der oben aufgeführten Verbindungen, die immer noch funktionell sind, d. h. aktivierte Immunzellen, zum Beispiel aktivierte T-Zellen, wie aktivierte CD4-positive T-Zellen, stimulieren und/oder aktivieren und/oder verstärken und/oder vermehren und/oder induzieren können, können ebenfalls als Tags der Erfindung verwendet werden.
Fusionsproteine, die Verbindungen umfassen, die die Immunantwort verstärken können, und agonistische Bindungsmoleküle der Erfindung können mit in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, wie zum Beispiel rekombinant durch Aufbauen von Nucleinsäuremolekülen, die Nucleotidsequenzen, welche die agonistischen Bindungsmoleküle codieren, rastergleich mit Nucleotidsequenzen, die die geeigneten Verbindungen codieren, umfassen, und dann Exprimieren der Nucleinsäuremoleküle. Alternativ dazu können Fusionsproteine auch chemisch hergestellt werden, indem man agonistische Bindungsmoleküle, wie sie hier definiert sind, direkt oder indirekt über zum Beispiel einen Linker mit einer geeigneten Verbindung konjugiert.
Alternativ dazu können die Bindungsmoleküle, wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, mit Tags konjugiert und zum Nachweis und/oder für analytische und/oder diagnostische Zwecke verwendet werden. Weiche Tags zum Markieren der Bindungsmoleküle für diese Zwecke verwendet werden, hängt von den speziellen verwendeten Nachweis-/Analyse-/Diagnose-Techniken und/oder -Verfahren ab, wie unter anderem die immunhistochemische Färbung von Gewebeproben, der durchflusscytometrische Nachweis, der Scanning-Lasercytometrische Nachweis, Fluoreszenz-Immunassays, ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays), Radioimmunassays (RIAs), Bioassays (z. B. Wachstumshemmungsassays), Western-Blotting-Anwendungen usw. Für die immunhistochemische Anfärbung von Gewebeproben bevorzugte Marker sind Enzyme, die die Produktion und lokale Abscheidung eines nachweisbaren Produkts katalysieren. Enzyme, die typischerweise mit Bindungsmolekülen konjugiert sind, um deren immunhistochemisches Sichtbarmachen zu ermöglichen, sind wohlbekannt und umfassen unter anderem Alkalische Phosphatase, P-Galactosidase, Glucose-Oxidase, Meerrettich-Peroxidase und Urease. Zu den typischen Substraten für die Produktion und Abscheidung von visuell nachweisbaren Produkten gehören unter anderem o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG), o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD), p-Nitrophenylphosphat (PNPP), p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (PNPG), 3',3'-Diaminobenzidin (DAB), 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1-naphthol (CN), 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP), ABTS, BluoGal, Iodnitrotetrazolium (INT), Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT), Phenazinmethosulfat (PMS), Phenolphthaleinmonophosphat (PMP), Tetramethylbenzidin (TMB), Tetranitroblautetrazolium (TNBT), X-Gal, X-Gluc und X-Glucosid. Andere Substrate, die verwendet werden können, um Produkte für die lokale Abscheidung zu produzieren, sind lumineszierende Substrate. In Gegenwart von Wasserstoffperoxid kann Meerrettich-Peroxidase zum Beispiel die Oxidation von cyclischen Diacylhydraziden, wie Luminol, katalysieren. Weiterhin können Bindungsmoleküle der Erfindung auch unter Verwendung von kolloidalem Gold markiert werden, oder sie können mit Radioisotopen, wie ³³P, ³²P, ³⁵S, ³H und ¹²⁵I, markiert werden. Wenn die Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung für durchflusscytometrische Nachweise, Scanning-Laser-cytometrische Nachweise oder Fluoreszenz-Immunassays verwendet werden, können sie zweckmäßigerweise mit Fluorophoren markiert werden. Eine Vielzahl von Fluorophoren, die für die Fluoreszenzmarkierung der Bindungsmoleküle der Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem Alexa-Fluor- und Alexa-Fluor-&-Commat-Farbstoffe, BODIPY-Farbstoffe, Cascade Blue, Cascade Yellow, Dansyl, Lissamin-Rhodamin B, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 514, Pacific Blue, Rhodamin 6G, Rhodamingrün, Rhodaminrot, Tetramethylrhodamin, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Allophycocyanin (APC), R-Phycoerythrin (PE), Peridininchlorophyllprotein (PerCP), Texasrot, Fluoreszenzresonanzenergie-Tandem-Fluorophore, wie PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, PE-Texasrot und APC-Cy7. Wenn die Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung für den sekundären Nachweis unter Verwendung von markiertem Avidin, Streptavidin, Captavidin oder Neutravidin verwendet werden, können die Bindungsmoleküle mit Biotin markiert werden.
Weiterhin können die Bindungsmoleküle der Erfindung mit photoaktiven Agentien oder Farbstoffen, wie Fluoreszenzfarbstoffen und anderen Chromogenen oder Farbstoffen konjugiert werden, um die erhaltenen Immunkonjugate in der Photobestrahlungs-, Phototherapie oder photodynamischen Therapie zu verwenden. Zu den photoaktiven Agentien oder Farbstoffen gehören unter anderem Photofrin.RTM, synthetische Diporphyrine und Dichlorine, Phthalocyanine mit oder ohne Metallsubstituenten, Chloraluminiumphthalocyanin mit oder ohne verschiedene Substituenten, O-substituierte Tetraphenylporphyrine, 3,1-meso-Tetrakis(o-propionamidophenyl)porphyrin, Verdine, Purpurine, Zinn- und Zinkderivate von Octaethylpurpurin, Etiopurpurin, Hydroporphyrine, Bacteriochlorine der Tetra(hydroxyphenyl)porphyrin-Reihe, Chlorine, Chlorin e₆, Mono-1-aspartyl-Derivat von Chlorin e₆, Di-1-aspartyl-Derivat von Chlorin e₆, Zinn(IV)-Chlorin e₆, meta-Tetrahydroxyphenylchlorin, Benzoporphyrin-Derivate, Benzoporphyrinmonosäure-Derivate, Tetracyanoethylen-Addukte von Benzoporphyrin, Dimethylacetylendicarboxylat-Addukte von Benzoporphyrin, Diels-Alder-Addukte, Monosäure-Ring-"a"-Derivat von Benzoporphyrin, sulfoniertes Aluminium-PC, sulfoniertes AlPc, disulfoniertes, tetrasulfoniertes Derivat, sulfonierte Aluminiumnaphthalocyanine, Naphthalocyanine mit oder ohne Metallsubstituenten und mit oder ohne verschiedene Substituenten, Anthracendione, Anthrapyrazole, Aminoanthrachinon, Phenoxazin-Farbstoffe, Phenothiazin-Derivate, Chalcogenapyrylium-Farbstoffe, kationische Selens- und Tellurapyrylium-Derivate, ringsubstitu ierte kationische PC, Pheophorbid-Derivat, natürlich vorkommende Porphyrine, Hämatoporphyrin, ALA-induziertes Protoporphyrin IX, endogene Stoffwechselvorstufen, 5-Aminolävulinsäurebenzonaphthoporphyrazine, kationische Imminiumsalze, Tetracycline, Lutetiumtexaphyrin, Zinnetiopurpurin, Porphycene, Benzophenothiazinium und Kombinationen davon.
Wenn die Immunkonjugate der Erfindung für die diagnostische Verwendung in vivo verwendet werden, können die Bindungsmoleküle auch durch Konjugation zum Beispiel an Magnetresonanz-Bildgebungs(MRI)-Kontrastmittel einschließlich unter anderem Mitteln, die Cobalt(II), Kupfer(II), Chrom(III), Dysprosium(III), Erbium(III), Gadolinium(III), Holmium(III), Eisen(II), Eisen(III), Mangan(II), Neodym(III), Nickel(II), Samarium(III), Terbium(III), Vanadium(II) oder Ytterbium(III) umfassen, Ultraschall-Kontrastmitteln, Röntgenkontrastmitteln einschließlich unter anderem Mitteln, die Bismuth(III), Gold(III), Lanthan(III) oder Blei(II) umfassen, oder durch Radioisotopenmarkierung einschließlich unter anderem Mitteln, die Kupfer⁶⁷, Gallium⁶⁷, Gallium⁶¹, Indium¹¹³, Iod¹²³, Iod¹²⁵, Iod¹³¹, Quecksilber¹⁹⁷, Quecksilber²⁰³, Rhenium¹⁸⁶, Rhenium¹⁸⁸, Rubidium⁹⁷, Rubidium¹⁰³, Technetium^99m oder Yttrium⁹⁰ umfassen, nachweisbar gemacht werden.
Weiterhin können die Bindungsmoleküle der Erfindung auch an feste Träger gebunden sein, die für Immunoassays oder die Reinigung des Bindungspartners, d. h. des humanen OX40-Rezeptors, besonders gut geeignet sind. Solche festen Träger könnten porös oder nichtporös, planar oder nichtplanar sein und umfassen unter anderem Träger aus Glas, Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen. Die Bindungsmoleküle können für Zwecke der Immunaffinitätschromatographie auch zum Beispiel zweckmäßigerweise an Filtrationsmedien, wie NHS-aktivierte Sepharose oder CNBr-aktivierte Sepharose konjugiert sein. Sie können auch zweckmäßigerweise an paramagnetische Mikrosphären gebunden sein, typischerweise durch Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung. Die Mikrosphären können für die Isolierung von Zellen verwendet werden, die den humanen OX40-Rezeptor oder Fragmente davon exprimieren oder präsentieren. Als weiteres Beispiel können die Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung auch zweckmäßigerweise an die Oberfläche einer Mikrotiterplatte für ELISA gebunden sein.
Es ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein Nucleinsäuremolekül bereitzustellen, das wenigstens ein Bindungsmolekül oder funktionelles Fragment davon gemäß der Erfindung codiert. Solche Nucleinsäuremoleküle können als Zwischenstufen für Klonierungszwecke verwendet werden, zum Beispiel in dem oben beschriebenen Vorgang der Affinitätsreifung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleinsäuremoleküle isoliert oder gereinigt.
Der Fachmann wird anerkennen, dass funktionelle Varianten dieser Nucleinsäuremoleküle ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung sein sollen. Funktionelle Varianten sind Nucleinsäuresequenzen, die unter Verwendung des genetischen Standardcodes direkt translatiert werden können, um eine Aminosäuresequenz zu erhalten, die mit der von Stammnucleinsäuremolekülen translatierten identisch ist. Vorzugsweise codieren die Nucleinsäuremoleküle agonistische Bindungsmoleküle, die einen CDR3-Bereich umfassen, vorzugsweise einen CDR3-Beerich einer schweren Kette, der eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 17 (DRYSQVHYALDY), SEQ ID Nr. 18 (DRYVNTSNAFDY), SEQ ID Nr. 19 (DMSGFHEFDY), SEQ ID Nr. 20 (DRYFRQQNAFDY), SEQ ID Nr. 21 (ARAAGTIFDY), SEQ ID Nr. 22 (DRYITLPNALDY), SEQ ID Nr. 23 (YDEPLTIYWFDS) und SEQ ID Nr. 24 (YDNVMGLYWFDY) besteht. Ganz besonders bevorzugt codieren die Nucleinsäuremoleküle agonistische Bindungsmoleküle, die eine schwere Kette umfassen, welche eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 25, SEQ ID Nr. 26, SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28 besteht. In noch einer anderen Ausführungsform codieren die Nucleinsäuremoleküle Bindungsmoleküle, die eine schwere Kette umfassen, welche eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 25 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 29 umfasst, oder sie codieren eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 26 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 30 umfasst, oder sie codieren eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 27 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 31 umfasst, oder sie codieren eine schwere Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 28 umfasst, und eine leichte Kette, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 32 umfasst. Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Nucleinsäuremoleküle, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 39, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 41 und SEQ ID Nr. 42 besteht. Nucleinsäuremoleküle, die eine schwere Kette, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 39 umfasst, und eine leichte Kette, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 43 umfasst, eine schwere Kette, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 40 umfasst, und eine leichte Kette, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 44 umfasst, eine schwere Kette, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 41 umfasst, und eine leichte Kette, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 45 umfasst, oder eine schwere Kette, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 42 umfasst, und eine leichte Kette, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 46 umfasst, umfassen, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung ist ihr Potential zur Verwendung in Gentherapie- oder Impfanwendungen. Daher werden in einer anderen Ausführungsform der Erfindung Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung bereitgestellt, wobei das Nucleinsäuremolekül in einem Genabgabeträger vorhanden ist. Der hier verwendete Ausdruck "Genabgabeträger" bezieht sich auf eine Entität, die verwendet werden kann, um Nucleinsäuremoleküle in Zellen einzuführen, und umfasst Liposomen, rekombinante Viren und dergleichen. Bevorzugte Gentherapieträger der vorliegenden Erfindung sind im Allgemeinen virale Vektoren, wie Vektoren innerhalb eines rekombinanten Retrovirus, Herpes-simplex-Virus (HSV), Adenovirus, adenoassoziierten Virus (AAV), Cytomegalievirus (CMV) und dergleichen. Solche Anwendungen der Nucleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung sind in der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Der Fachmann wird sich der Möglichkeiten von rekombinanten Viren zur Verabreichung von interessierenden Sequenzen an Zellen bewusst sein. Die Verabreichung der Nucleinsäuren der Erfindung an Zellen kann zu einer verstärkten Immunantwort führen.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, Vektoren, d. h. Nucleinsäurekonstrukte, bereitzustellen, die ein oder mehrere Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Vektoren können abgeleitet sein von Plasmiden wie unter anderem F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti usw.; Cosmiden; Phagen, wie Lambda, Lambdoid, M13, Mu, P1, P22, Qp, T-gerade, T-ungerade, T2, T4, T7 usw.; Pflanzenviren, wie unter anderem Luzernemosaikvirus, Bromovirus, Capillovirus, Carlavirus, Carmovirus, Caulivirus, Clostervirus, Comovirus, Cryptovirus, Cucumovirus, Dianthovirus, Fabavirus, Fijivirus, Furovirus, Geminivirus, Hordeivirus, Ilarvirus, Luteovirus, Machiovirus, Marafivirus, Necrovirus, Nepovirus, Phytorepvirus, Pflanzenrhabdovirus, Potexvirus, Potyvirus, Sobemovirus, Tenuivirus, Tobamovirus, Tobravirus, Tomaten-Bronzefleckenvirus, Tombusvirus, Tymovirus usw.; oder Tierviren, wie unter anderem Adenovirus, Arenaviridae, Baculoviridae, Birnaviridae, Bunyaviridae, Calciviridae, Cardioviren, Coronaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Epstein-Barr-Virus, Enteroviren, Filoviridae, Flaviviridae, Maul-und-Klauenseuche-Virus, Hepadnaviridae, Hepatitisviren, Herpesviridae, Immunschwächeviren, Influenzavirus, Inoviridae, Iridoviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviren, Paramyxoviren, Parvoviridae, Picornaviridae, Poliovirus, Polydnaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviren, Rhabdoviridae, Rhinoviren, Semliki-Forest-Virus, Tetraviridae, Togaviridae, Toroviridae, Vacciniavirus, Vesicular-Stomatitis-Virus usw. Vektoren können für die Klonierung und/oder Expression der agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung verwendet werden und könnten sogar für Gentherapiezwecke verwendet werden. Vektoren, die ein oder mehrere Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung umfassen, welche mit einem oder mehreren expressionsregulierenden Nucleinsäuremolekülen funktionell verknüpft sind, sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls abgedeckt. Die Wahl des Vektors hängt von den befolgten rekombinanten Verfahren und dem verwendeten Wirt ab. Die Einführung von Vektoren in Wirtszellen kann unter anderem durch Calciumphosphattransfektion, Virusinfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofectamin-Transfektion oder Elektroporation bewirkt werden. Vektoren können autonom replizieren oder zusammen mit dem Chromosom, in das sie integriert wurden, replizieren. Vorzugsweise enthalten die Vektoren einen oder mehrere Selektionsmarker. Geeignete Marker hängen von den Wirtszellen der Wahl ab und sind dem Fachmann wohlbekannt. Dazu gehören unter anderem Kanamycin, Neomycin, Puromycin, Hygromycin, Zeocin, Thymidin-Kinase-Gen von Herpes-simplex-Virus (HSV-TK), Dihydrofolat-Reductase-Gen von der Maus (dhfr). Vektoren, die ein oder mehrere Nucleinsäuremoleküle umfassen, welche die oben beschriebenen agonistischen Bindungsmoleküle codieren, die funktionell mit einem oder mehreren Nucleinsäuremolekülen verknüpft sind, welche Proteine oder Peptide codieren, die zum Isolieren der Bindungsmoleküle verwendet werden können, werden von der Erfindung ebenfalls abgedeckt. Zu diesen Proteinen oder Peptiden gehören unter anderem Glutathion-S-Transferase, maltosebindendes Protein, metallbindendes Polyhistidin, grünes fluoreszierendes Protein, Luciferase und beta-Galactosidase.
Wirte, die eine oder mehrere Kopien der oben genannten Vektoren enthalten, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise sind die Wirte Wirtszellen. Zu den Wirtszellen gehören unter anderem Zellen, die von Säugern, Pflanzen, Insekten, Pilzen oder Bakterien stammen. Zu den Bakterienzellen gehören unter anderem Zellen von Gram-positiven Bakterien, wie mehrere Spezies der Gattungen Bacillus, Streptomyces und Staphylococcus, oder Zellen von Gram-negativen Bakterien, wie mehrere Spezies der Gattungen Escherichia und Pseudomonas. In der Gruppe der Pilzzellen werden vorzugsweise Hefezellen verwendet. Die Expression in Hefe kann erreicht werden, indem man Hefestämme wie unter anderem Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae und Hansenula polymorpha verwendet. Weiterhin können Insektenzellen, wie Zellen von Drosophila und Sf9, als Wirtszellen verwendet werden. Daneben können die Wirtszellen auch Pflanzenzellen sein, wie unter anderem Zellen von Kulturpflanzen, wie Forstpflanzen, oder Zellen von Pflanzen, die Nahrung und Rohstoffe bieten, wie Getreidepflanzen oder medizinische Pflanzen, oder Zellen von Zierpflanzen oder Zellen von Blumenzwiebelpflanzen. Transformierte (transgene) Pflanzen oder Pflanzenzellen werden nach bekannten Verfahren hergestellt, zum Beispiel durch Agrobacterium-vermittelte Genübertragung, Transformation von Blattscheiben, Protoplastentransformation durch Polyethylenglycol-induzierte DNA-Übertragung, Elektroporation, Ultraschallbehandlung, Mikroinjektion oder bolistische Genübertragung. Außerdem kann auch ein Baculovirussystem ein geeignetes Expressionssystem sein. Expressionssysteme unter Verwendung von Säugerzellen, wie Eierstockzellen chinesischer Streifenhamster (CHO), COS-Zellen, BHK-Zellen oder Bowes-Melanomzellen, sind in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Säugerzellen liefern exprimierte Proteine mit posttranslationalen Modifikationen, die natürlichen Molekülen, die von Säugern stammen, ganz ähnlich sind. Da sich die vorliegende Erfindung mit Molekülen beschäftigt, die möglicherweise an Menschen verabreicht werden müssen, wäre ein vollständig humanes Expressionssystem besonders bevorzugt. Daher sind die Wirtszellen ganz besonders bevorzugt humane Zellen, wie HeLa-, 911-, AT1080-, A549-, 293- oder PER.C6-Zellen (PER.C6 ist ein Warenzeichen der Crucell Holland B. V.), und durch genetische Modifikation mit antikörpercodierenden Expressionskonstrukten davon abgeleitete Zellen. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die produzierenden humanen Zellen wenigstens einen funktionellen Teil einer Nucleinsäuresequenz, die einen Adenovirus-E1-Bereich in exprimierbarem Format codiert. In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Wirtszellen von einer humanen Retina abgeleitet und mit Nucleinsäuren, die adenovirale E1-Sequenzen umfasse, immortalisiert, wie PER.C6^TM-Zellen und Derivate davon. Die Produktion von rekombinanten Proteinen in Wirtszellen kann nach in der Technik wohlbekannten Verfahren durchgeführt werden. Die Verwendung von PER.C6^TM-Zellen als Produktionsplattform für interessierende Proteine ist in WO 00/63403 beschrieben.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von agonistischen Bindungsmolekülen oder funktionellen Varianten davon, vorzugsweise humanen agonistischen Bindungsmolekülen oder funktionellen Varianten davon, gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. Das Verfahren umfasst die Schritte des a) Kultivierens eines Wirts, wie er oben beschrieben ist, unter Bedingungen, die zur Expression der agonistischen Bindungsmoleküle führen, und b) gegebenenfalls des Gewinnens der exprimierten agonistischen Bindungsmoleküle. Die exprimierten agonistischen Bindungsmoleküle können aus dem zellfreien Extrakt gewonnen werden, aber vorzugsweise werden sie aus dem Kulturmedium gewonnen. Verfahren zur Gewinnung von Proteinen, wie Bindungsmolekülen, aus zellfreien Extrakten oder Kulturmedium sind dem Fach mann wohlbekannt. Agonistische Bindungsmoleküle oder funktionelle Varianten davon, wie sie nach dem oben beschriebenen Verfahren erhältlich sind, sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Alternativ dazu können die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung oder funktionelle Fragmente davon neben der Expression in Wirten, wie Wirtszellen, auch synthetisch durch herkömmliche Peptidsynthesizer oder in zellfreien Translationssystemen unter Verwendung von RNAs, die von DNA-Molekülen gemäß der Erfindung abgeleitet sind, hergestellt werden. Agonistische Bindungsmoleküle, wie sie nach den oben beschriebenen synthetischen Produktionsverfahren oder mit zellfreien Translationssystemen erhältlich sind, sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
In noch einer anderen alternativen Ausführungsform können Bindungsmoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise humane agonistische Bindungsmoleküle, die spezifisch an den humanen OX40-Rezeptor oder Fragmente davon binden, durch transgene nichthumane Säuger, wie zum Beispiel transgene Mäuse oder Kaninchen, die humane Immunglobulin-Gene exprimieren, erzeugt werden. Vorzugsweise haben die transgenen nichthumanen Säuger ein Genom, das ein humanes Schwere-Kette-Transgen und ein humanes Leichte-Kette-Transgen umfasst, die die gesamten oder ein Teil der humanen agonistischen Bindungsmoleküle, wie sie oben beschrieben sind, codieren. Die transgenen nichthumanen Säuger können mit einem gereinigten oder angereicherten Präparat des humanen OX40-Rezeptors oder Fragments davon und/oder mit Zellen, die den humanen OX40-Rezeptor exprimieren, immunisiert werden. Vorschriften zur Immunisierung von nichthumanen Säugern sind in der Technik wohletabliert. Siehe Using Antibodies: A Laboratory Manual, Herausgeber: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, und Current Protocols in Immunology, Herausgeber: J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York. Immunisierungsvorschriften beinhalten häufig mehrere Immunisierungen, entweder mit oder ohne Adjuvantien, wie Freunds vollständiges Adjuvans und Freunds unvollständiges Adjuvans, aber können auch Immunisierungen mit nackter DNA beinhalten. In einer anderen Ausführungsform werden die humanen agonistischen Bindungsmoleküle durch B-Zellen oder Plasmazellen, die von den transgenen Tieren stammen, produziert. In noch einer anderen Ausführungsform werden die humanen agonistischen Bindungsmoleküle durch Hybridome erzeugt, die durch Fusion von B-Zellen, die aus den oben beschriebenen transgenen nichthumanen Säugern erhalten werden, mit immortalisierten Zellen hergestellt werden. B-Zellen, Plasmazellen und Hybridome, wie sie aus den oben beschriebenen transgenen nichthumanen Säugern erhältlich sind, und humane agonistische Bindungsmoleküle, wie sie aus den oben beschriebenen transgenen nichthumanen Säugern erhältlich sind, B-Zellen, Plasmazellen und Hybridome sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung. In noch einer anderen Ausführungsform können die humanen agonistischen Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung auch in transgenen nichthumanen Säugern, wie unter anderem Ziegen oder Rindern, produziert und in die Milch der transgenen Säuger sezerniert und gegebenenfalls daraus zurückgewonnen werden.
In einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Bindungsmolekülen, vorzugsweise humanen Bindungsmolekülen, wie humanen monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon, gemäß der Erfindung oder Nucleinsäuremolekülen gemäß der Erfindung an und umfasst die folgenden Schritte: a) In-Kontakt-Bringen einer Phagenbibliothek von Bindungsmolekülen, vorzugsweise humanen Bindungsmolekülen, mit Material, das den humanen OX40-Rezeptor oder einen Teil davon umfasst, b) wenigstens einmaliges Selektieren in Bezug auf eine Phagenbindung an das Material, das den humanen OX40-Rezeptor oder einen Teil davon umfasst, und c) Abtrennen und Gewinnen des an das Material bindenden Phagen, der den humanen OX40-Rezeptor oder einen Teil davon umfasst. Der Selektionsschritt gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in Gegenwart wenigstens eines Teils des humanen OX40-Rezeptors, zum Beispiel von Zellen, die mit Expressionsplasmiden für den humanen OX40-Rezeptor transfiziert sind, von isoliertem humanem OX40-Rezeptor, dem extrazellulären Teil davon, diesen umfassenden Fusionsproteinen und dergleichen durchgeführt.
Phagendisplayverfahren zum Identifizieren und Gewinnen von Bindungsmolekülen, zum Beispiel Antikörpern, sind inzwischen wohletablierte Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Sie sind zum Beispiel im US-Patent Nr. 5,696,108 ; Burton und Barbas, 1994, und de Kruif et al., 1995b, beschrieben. Für die Konstruktion von Phagendisplaybibliotheken werden Kollektionen von Genen des variablen Bereichs der schweren und leichten Kette von humanen monoklonalen Antikörpern auf der Oberfläche von Partikeln von Bakteriophagen, vorzugsweise filamentösen Bakteriophagen, zum Beispiel im Einzelketten-Fv (scFv) oder im Fab-Format exprimiert (siehe de Kruif et al., 1995b). Große Bibliotheken von Antikörperfragment-exprimierenden Phagen enthalten typischerweise mehr als 1,0·10⁹ Antikörperspezifitäten und können aus den Immunglobulin-V-Bereichen zusammengesetzt werden, die in den B-Lymphocyten von immunisierten oder nichtimmunisierten Individuen exprimiert werden. Alternativ dazu können Phagen-Display-Bibliotheken aus variablen Bereichen von Immunglobulinen aufgebaut werden, die in vitro partiell zusammengesetzt werden, um zusätzliche Antikörperdiversität in die Bibliothek einzuführen (halbsynthetische Bibliotheken). Zum Beispiel enthalten in vitro zusammengesetzte variable Bereiche Stücke von synthetisch produzierter, randomisierter oder partiell randomisierter DNA in denjenigen Bereichen der Moleküle, die für die Antikörperspezifität wichtig sind, z. B. CDR-Bereiche. Antigenspezifische Phagenantikörper können aus der Bibliothek selektiert werden, indem man Zielantigene, wie den humanen OX40-Rezeptor, oder Fragmente davon auf einer festen Phase immobilisiert und die Zielantigene anschließend einer Phagenbibliothek aussetzt, um die Bindung von Phagen, die für das festphasengebundene Antigen spezifische Antikörperfragmente exprimieren, zu ermöglichen. Nichtgebundene Phagen werden durch Waschen entfernt, und gebundene Phagen werden für die Infektion von Escherichia-coli(E. coli)-Bakterien und anschließende Vermehrung aus der festen Phase eluiert. Gewöhnlich sind mehrere Runden der Selektion und Vermehrung erforderlich, um Phagen, die spezifisch an das Zielantigen binden, ausreichend anzureichern. Phagen können auch in Bezug auf die Bindung an komplexe Antigene, wie komplexe Gemische von Proteinen oder ganzen Zellen, wie Zellen, die mit Expressionsplasmiden des humanen OX40-Rezeptors transfiziert sind, oder Zellen, die den humanen OX40-Rezeptor natürlicherweise exprimieren, selektiert werden. Die Selektion von Antikörpern auf ganzen Zellen hat den Vorteil, dass Zielantigene in ihrer nativen Konfiguration präsentiert werden, d. h. ungestört von möglichen Konformationsänderungen, die in einem Fall, in dem ein Antigen auf einer festen Phase immobilisiert ist, eingeführt werden könnten. Antigenspezifische Phagenantikörper können aus der Bibliothek selektiert werden, indem man eine interessierende Zellpopulation, die bekannte und unbekannte Antigene auf ihrer Oberfläche exprimiert, mit der Phagenantikörperbibliothek inkubiert, um zum Beispiel den scFv- oder Fab-Teil des Phagen an die Antigene auf der Zelloberfläche binden zu lassen. Nach der Inkubation und mehreren Waschvorgängen, um ungebundene und lose befestigte Phagen zu entfernen, werden die interessierenden Zellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern angefärbt und auf einem FACS (fluorescent activated cell sorter) aufgetrennt. Phagen, die mit ihrem scFv- oder Fab-Teil an diese Zellen gebunden haben, werden eluiert und verwendet, um Escherichia coli zu infizieren und so die Amplifikation der neuen Spezifität zu ermöglichen. Im Allgemeinen sind eine oder mehrere Selektionsrunden erforderlich, um die interessierenden Phagen von dem großen Überschuss an nichtbindenden Phagen abzutrennen. Monoklonale Phagenpräparate können auf ihre spezifischen Färbungsmuster analysiert werden, was die Identifikation der erkannten Antigens erlaubt (De Kruif et al., 1995a; Lekkerkerker und Logtenberg, 1999). Das Phagen-Display-Verfahren kann ausgedehnt und verbessert werden, indem man irrelevante bindende Moleküle während des Screening durch Zugabe eines Überschusses an Nichtzielmolekülen, die dem Ziel ähnlich, aber nicht damit identisch sind, abzieht und dadurch die Chance, relevante Bindungsmoleküle zu finden, stark erhöht (siehe US-Patent Nr. 6,265,150 ). Bei diesem Verfahren kann das Abziehen durch die Anwesenheit von T-Zellen und anderen Lymphocyten erfolgen, die den humanen OX40-Rezeptor nicht exprimieren.
In noch einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Bindungsmoleküls, vorzugsweise eines humanen Bindungsmoleküls, oder eines Nucleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung an, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Durchführen des oben beschriebenen Verfahrens zum Identifizieren von Bindungsmolekülen, vorzugsweise humanen Bindungsmo lekülen, wie humanen monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon gemäß der Erfindung, oder Nucleinsäuremolekülen gemäß der Erfindung und b) Isolieren des humanen Bindungsmoleküls und/oder der Nucleinsäure, die das humane Bindungsmolekül codiert, aus dem gewonnenen Phagen. Sobald mit dem oben genannten Verfahren zum Identifizieren von Bindungsmolekülen oder Nucleinsäuremolekülen, die die Bindungsmoleküle codieren, ein neuer monoklonaler Phagenantikörper festgestellt oder identifiziert wurde, kann die DNA, die das scFv oder Fab codiert, aus den Bakterien oder Phagen isoliert und mit molekularbiologischen Standardtechniken kombiniert werden, um Konstrukte herzustellen, die bivalente scFvs oder vollständige humane Immunglobuline einer gewünschten Spezifität (z. B. IgG, IgA oder IgM) codieren. Mit diesen Konstrukten können geeignete Zelllinien transfiziert werden, und vollständige Bindungsmoleküle, wie humane monoklonale Antikörper, können produziert werden (siehe Huls et al., 1999; Boel et al., 2000).
Vorzugsweise wird nach dem Identifizieren und Gewinnen eines Bindungsmoleküls, das spezifisch an den humanen OX40-Rezeptor bindet, festgestellt, ob das Bindungsmolekül agonistische Aktivität aufweist. Dies kann in vitro in einem Zellkultursystem oder in einem Tiermodellsystem getestet werden. Das Zellkultursystem kann Zellen umfassen, die aus einer Gewebeprobe von einem Patienten stammen. Zum Beispiel können aktivierte CD4-positive T-Zellen mit einem Bindungsmolekül der Erfindung oder einem Kontrollbindungsmolekül in Kontakt gebracht werden, und die Fähigkeit des Bindungsmoleküls der Erfindung zur Verstärkung der Aktivität von aktivierten CD4-positiven T-Zellen kann im Vergleich zu dem Kontrollbindungsmolekül bestimmt werden. Weiterhin könnte die durch das Bindungsmolekül der Erfindung induzierte Aktivierung mit einem wohlbekannten Induktor des OX40-Rezeptors, wie dem OX40-Liganden, verglichen werden. Außerdem kann mit dieser Art von Test ein Bindungsmolekül mit antagonistischer Aktivität identifiziert und gegebenenfalls bei der Behandlung einer Störung oder Krankheit verwendet werden, bei der antagonistische Bindungsmoleküle, die an den humanen OX40-Rezeptor binden können, nützlich sind. Die Fähigkeit von Bindungsmolekülen gemäß der Erfindung zum Modulieren (entweder verstärken oder senken) der Aktivität von aktivierten CD4-positiven T-Zellen kann bewertet werden, indem man die Vermehrung von CD4-positiven T-Zellen nachweist, die Aktivierung von Signalmolekülen nachweist, die Effektorfunktion von CD4-positiven T-Zellen nachweist, die Expression von Cytokinen oder Antigenen nachweist oder die Differenzierung von CD4-positiven T-Zellen nachweist. Weiterhin kann die agonistische Aktivität der Bindungsmoleküle durch einen Costimulationsassay mit zum Beispiel dem OX40-Liganden festgestellt werden, wie es in den vorliegenden Beispielen beschrieben ist. Dem Fachmann bekannte Techniken können verwendet werden, um diese Aktivitäten zu messen. Zum Beispiel kann die Zellvermehrung durch ³H-Thymidin-Einbauassays und Trypanblau-Zellzählungen bestimmt werden. Die Aktivierung von Signalmolekülen kann zum Beispiel durch Kinase-Assays und Elektromobilitätsverschiebungsassays (EMSA) bestimmt werden. Die Effektorfunktion von T-Zellen kann zum Beispiel durch Cytokin-ELISA-Assays oder Elispot-Assays gemessen werden. Die Cytokin- und Antigenexpression kann zum Beispiel durch Immunassays bestimmt werden; dazu gehören unter anderem kompetitive und nichtkompetitive Assaysysteme unter Verwendung von Techniken wie Western Blots, Immunhistochemie, Radioimmunassays, ELISA, Sandwich-Immunassays, Immunfällungsassays, Immundiffusionsassays, Agglutinationsassays, Komplementfixierungsassays, immunradiometrische Assays, Fluoreszenz-Immunassays, Protein-A-Immunassays und FACS-Analyse. Die Bindungsmoleküle der Erfindung können vor der Verwendung bei Menschen auch in geeigneten Tiermodellsystemen getestet werden. Zu diesen Tiermodellsystemen gehören unter anderem Mäuse, Ratten, Hühner, Rinder, Affen, Schweine, Hunde, Kaninchen usw. Jedes in der Technik wohlbekannte Tiersystem kann verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die wenigstens ein agonistisches Bindungsmolekül, wenigstens eine funktionelle Variante oder ein funktionelles Fragment davon, wenigstens ein Immunkonjugat gemäß der Erfindung oder eine Kombination davon umfassen. Außerdem können die Zusammensetzungen unter anderem stabilisierende Moleküle, wie Albumin oder Polyethylenglycol, oder Salze umfassen. Vorzugsweise sind die verwendeten Salze Salze, die die gewünschte biologische Aktivität der Bindungsmoleküle erhalten und keine unerwünschten toxikologischen Wirkungen verleihen.
Beispiele für solche Salze sind unter anderem Säureadditionssalze und Basenadditionssalze. Zu den Säureadditionssalzen gehören unter anderem solche, die von nichttoxischen anorganischen Säuren, wie Salz-, Salpeter, Phosphor-, Schwefel-, Bromwasserstoff-, Iodwasserstoff und Phosphorige Säure und dergleichen, sowie von nichttoxischen organischen Säuren, wie aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, phenylsubstituierten Alkansäuren, Hydroxyalkansäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen und aromatischen Sulfonsäuren und dergleichen abgeleitet sind. Zu den Baseadditionssalzen gehören unter anderem solche, die von Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen, sowie von nichttoxischen organischen Aminen, wie N,N'-Dibenzylethylendiamin, N-Methylglucamin, Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, Procain und dergleichen abgeleitet sind. Falls notwendig, können die Bindungsmoleküle der Erfindung in oder auf ein Material aufgetragen werden, um sie vor der Einwirkung von Säuren oder anderen natürlichen oder nichtnatürlichen Bedingungen, die die Bindungsmoleküle inaktivieren können, zu schützen.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, die wenigstens ein Nucleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Die Zusammensetzungen können wässrige Lösungen, wie wässrige Lösungen, die Salze (z. B. NaCl oder Salze, wie sie oben beschrieben sind), Tenside (z. B. SDS) und/oder andere geeignete Komponenten enthalten, umfassen.
Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die wenigstens ein agonistisches Bindungsmolekül gemäß der Erfindung, wenigstens eine funktionelle Variante oder ein funktionelles Fragment davon, wenigstens ein Immunkonjugat gemäß der Erfindung, wenigstens eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung oder Kombinationen davon umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung umfasst weiterhin wenigstens einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff. Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann weiterhin wenigstens ein weiteres therapeutisches, prophylaktisches und/oder diagnostisches Mittel umfassen. Alternativ dazu können die weiteren therapeutischen, prophylakti schen und/oder diagnostischen Mittel auch getrennt von der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können in vitro, ex vivo oder in vivo verendet werden. Therapeutische Mittel und prophylaktische Mittel können unter anderem toxische Substanzen, radioaktive Substanzen, Liposomen, Bindungsmoleküle (mit oder ohne Tags), die spezifisch an Krebszellantigene binden, Enzyme, Polynucleotidsequenzen, Plasmide, Proteine, Peptide oder Kombinationen davon umfassen. Zu den toxischen Substanzen gehören unter anderem cytotoxische Mittel, wie kleinmolekulare Toxine oder Chemotherapeutika, oder enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder Fragmente davon. Im Allgemeinen sind geeignete Chemotherapeutika in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (1990), Herausgeber: A. R. Gennaro, Mack Publishing Co., Philadelphia, und in Goodman und Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. Auflage (1985), Herausgeber: A. G. Gilman, L. S. Goodman, T. W. Rall und F. Murad, MacMillan Publishing Co., New York, beschrieben. Geeignete Chemotherapeutika, die noch in der experimentellen Phase sind, sind dem Fachmann bekannt und könnten auch als toxische Substanzen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einer speziellen Ausführungsform können Therapeutika und prophylaktische Mittel unter anderem Verbindungen umfassen, die aktivierte Immunzellen, zum Beispiel aktivierte T-Zellen, wie aktivierte CD4-positive T-Zellen, stimulieren und/oder aktivieren und/oder verstärken und/oder vermehren und/oder induzieren. Zu diesen Verbindungen können unter anderem Bindungsmoleküle, kleine Moleküle, organische oder anorganische Verbindungen, Enzyme, Polynucleotidsequenzen, Plasmide, Proteine, Peptide, Liposomen oder Kombinationen davon gehören. Beispiele für Verbindungen, die die Immunantwort verstärken können, sind unter anderem Verbindungen, die einen Cytokinrezeptor aktivieren, wie unter anderem Cytokine einschließlich unter anderem CSF-1, Flt3-Ligand, G-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, M-CSF und TNF-α; Chemokine einschließlich unter anderem IP-10, MIG und MIP-1; Bindungsmoleküle, die immunspezifisch an den CSF-1-Rezeptor, Flt3, G-CSF-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, IFN-α-Rezeptor, IFN-β-Rezeptor, IFN-γ-Rezeptor, IL-1-Rezeptor, IL-2-Rezeptor, IL-3- Rezeptor, IL-4-Rezeptor, IL-5-Rezeptor, IL-6-Rezeptor, IL-7-Rezeptor, IL-8-Rezeptor, IL-9-Rezeptor, IL-10-Rezeptor, IL-12-Rezeptor, IL-15-Rezeptor, IL-18-Rezeptor, IP-10-Rezeptor, M-CSF-Rezeptor, MIG-Rezeptor, MIP-1-Rezeptor und TNF-α-Rezeptor binden. Pharmazeutisch annehmbare Salze, Säuren oder Derivate, Analoga, Derivate oder Fragmente der oben aufgeführten Verbindungen, die noch funktionell sind, d. h. die aktivierte Immunzellen, zum Beispiel aktivierte T-Zellen, wie aktivierte CD4-positive T-Zellen, stimulieren und/oder aktivieren und/oder verstärken und/oder vermehren und/oder induzieren können, können ebenfalls als weitere Therapeutika oder prophylaktische Mittel verwendet werden. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung einen OX40-Liganden, vorzugsweise einen humanen OX40-Liganden. Dieser Ligand kann auch getrennt, entweder vor, im Anschluss an oder nach der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung verabreicht werden.
Alternativ dazu umfassen die weiteren therapeutischen oder prophylaktischen Mittel unter anderem antivirale, antimikrobielle, wie antibakterielle, oder fungizide Mittel. Solche Mittel können Bindungsmoleküle, kleine Moleküle, organische oder anorganische Verbindungen, Enzyme, Polynucleotidsequenzen usw. sein. Beispiele für antimikrobielle Mittel sind unter anderem Amifloxacin, Amikacin, Amoxicillin, Amphotericin B, Ampicillin, Azlocillin, Aztreonam, Bacampicillin, Bacitracin, Bifonazol, Cafamandol, Candicidin, Carbenicillin, Carbenicillinindanyl, Cefaclor, Cefadroxil, Cefazolin, Cefepim, Cefonicid, Cefoparazon, Ceforanid, Cefotaxim, Cefotetan, Cefoxitin, Cefpodoximproxetil, Ceftazidim, Ceftizoxim, Ceftriaxon, Cefuroxim, Cefuroximaxetil, Cepalospolin, Cephadrin, Cephalexin, Cephalothin, Chlortetracyclin, Cinoxacin, Ciprofloxacin, Clavulansäure, Cloxacillin, Clotrimazol, Demeclocyclin, Dicloxacillin, Doxycyclin, Econazol, Erythromycin, Fleroxacin, Floxacillin, 5-Fluorcytosin, Fluconazol, Gentamicin, Griseofulvin, Haloprogin, Imipenem, Itraconazol, Kanamycin, Ketoconazol, Lomefloxacin, Loracarbef, Methacyclin, Methicillin, Metronidazol, Mezlocillin, Miconazol, Minocyclin, Moxalactam, Nafcillin, Natamycin, Neomycin, Netilmicin, Norfloxacin, Nystatin, Ofloxacin, Oxacillin, Oxytetracyclin, para-Aminobenzoesäure, Pefloxacin, Penicillin G, Penicillin V, Pentamidin, Piperacillin, Sparfloxacin, Streptomycin, Sulfacetamid, Sulfadiazin, Sulfamethoxazol, Sulfanilamid, Sulfisoxazol, Tetracyclin, Ticarcillin, Tobramycin, Trimethoprimsulfamethoxazolnalidixinsäure, Vancomycin, Vibunazol und pharmazeutisch annehmbare Salze, Säuren oder Derivate eines der obigen.
Beispiele für antivirale Mittel sind unter anderem Abacavir, Acyclovir, Adefovir, Afovirsen, Amantadin, Amprenavir, AZT, Camptothecine, Castanospermin, Cidofovir, D4T, ddC, ddI, d4T, Delavirdin, Didanosin, Efavirenz, Famciclovir, Fialuridin, Foscarnet, FTC, Ganciclovir, GG167, Idoxuridin, Indinavir, Interferon a, Lamivudin, Lobucavir, Lovirid, Nelfinavir, Nevirapin, Oseltamivir, Penciclovir, Pirodavir, Ribavirin, Rimantadin, Ritonavir, Saquinavir, sICAM-1, Sorivudin, Stavudin, Trifluridin, 3TC, Valacyclovir, Vidarabin, Zalcitabin, Zanamivir, Zidovudin und pharmazeutisch annehmbare Salze, Säuren oder Derivate eines der obigen.
Beispiele für fungizide Mittel sind unter anderem Amphotericin B, Benzoesäure, Butoconazol, Caprylsäure, Ciclopiroxolamin, Clotrimazol, Econazol, Fluconazol, Flucytosin, Griseofulvin, Haloprogin, Imidazole, Itraconzol, Ketoconazol, Miconazol, Naftifin, Nystatin, Kaliumiodid, Propionsäure, Salicylsäure, Terbinafin, Terconazol, Tolnaftat und Triazole, Undecylensäure und pharmazeutisch annehmbare Salze, Säuren oder Derivate eines der obigen.
Typischerweise müssen pharmazeutische Zusammensetzungen unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung steril und stabil sein. Die agonistischen Bindungsmoleküle, Varianten oder Fragmente davon, Immunkonjugate, Nucleinsäuremoleküle oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Pulverform zur Rekonstitution im geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelhilfsstoff vor oder zum Zeitpunkt der Abgabe vorliegen. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung (Lyophilisierung), die ein Pulver des Wirkstoffs plus gegebenenfalls zusätzlicher gewünschter Bestandteile aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
Alternativ dazu können sich die agonistischen Bindungsmoleküle, Varianten oder Fragmente davon, Immunkonjugate, Nucleinsäuremoleküle oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch in Lösung befinden, und der geeignete pharmazeutisch annehmbare Arzneimittelhilfsstoff kann vor oder zum Zeitpunkt der Abgabe hinzugefügt und/oder zugemischt werden, so dass man eine injizierbare Dosierungseinheit erhält. Vorzugsweise ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete pharmazeutisch annehmbare Arzneimittelhilfsstoff bis zu einer hohen Wirkstoffkonzentration geeignet, kann die richtige Fluidität aufrechterhalten und kann gegebenenfalls die Resorption verzögern.
Die Wahl des optimalen Verabreichungswegs für die pharmazeutischen Zusammensetzungen wird von mehreren Faktoren einschließlich der physikalisch-chemischen Eigenschaften der aktiven Moleküle innerhalb der Zusammensetzungen, der Dringlichkeit der klinischen Situation und der Beziehung der Plasmakonzentrationen der aktiven Moleküle zu der gewünschten therapeutischen Wirkung beeinflusst. Falls notwendig, können die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung zum Beispiel mit Trägern hergestellt werden, die sie vor einer schnellen Freisetzung schützen, wie eine Zubereitung mit regulierter Freisetzung einschließlich Implantaten, Transdermalpflastern und mikroverkapselten Abgabesystemen. Unter anderem können biologisch abbaubare, bioverträgliche Polymere verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Weiterhin kann es notwendig sein, die agonistischen Bindungsmoleküle mit einem Material oder einer Verbindung, das bzw. die die Inaktivierung der agonistischen Bindungsmoleküle verhindert, zu beschichten oder die agonistischen Bindungsmoleküle zusammen damit zu verabreichen. Zum Beispiel können die agonistischen Bindungsmoleküle einem Probanden in einem geeigneten Teräger, zum Beispiel Liposomen, oder einem Verdünnungsmittel verabreicht werden.
Die Verabreichungswege können in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden, orale und parenterale Verabreichung. Zu diesen beiden Kategorien gehören unter anderem Bolus-, bukkale, epidermale, epidurale, Inhalations-, intraabdominale, intraarterielle, intraartikuläre, intrabronchiale, intrakapsulare, intrakardi ale, intracartilaginöse, intracavitäre, intraceliale, intracerebellare, intracerebronventrikuläre, intrakolische, intrazervikale, intradermale, intragastrische, intrahepatische, intramedulläre, intramuskuläre, intramyokardiale, intranasale, intraokulare, intraorbitale, intraosteale, intrapelvische, intraperikardiale, intraperitoneale, Intraplaque-, intrapleurale, intraprostatische, intrapulmonale, intrarektale, intrarenale, intraretinale, intraspinale, intrasternale, intrasynoviale, intrathekale, intrathorakale, intratumorale, intrauterine, intravenöse, intraventrikuläre, intravesikale, rektale, spinale, subarachnoide, subkapsuläre, subkutane, subcuticuläre, sublinguale, topische, transdermale und transmucosale, transtracheale, vaginale Verabreichung.
Orale Darreichungsformen können unter anderem als Tabletten, Trochisci, Pastillen, wässrige oder ölige Suspensionen, dispergierbare Pulver oder Granulate, Emulsionen, Hartkapseln, Weichgelatinekapseln, Sirupe oder Elixiere, Pillen, Dragees, Flüssigkeiten, Gele oder Aufschlämmungen zubereitet werden. Diese Zubereitungen können Folgendes enthalten: pharmazeutische Arzneimittelhilfsstoffe, einschließlich unter anderem inerten Verdünnungsmitteln, wie Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Lactose, Calciumphosphat oder Natriumphosphat; Granulierungs- und Sprengmittel, wie Maisstärke oder Alginsäure; Bindungsmittel, wie Stärke, Gelatine oder Gummi arabicum; Gleitmittel, wie Calciumstearat, Glycerylbehenat, hydrierte Pflanzenöle, Magnesiumstearat, Mineralöl, Polyethylenglycol, Natriumstearylfumarat, Stearinsäure, Talk, Zinkstearat; Konservierungsstoffe, wie n-Propyl-p-hydroxybenzoat; Färbe-, Aroma- oder Süßungsmittel, wie Saccharose, Saccharin, Glycerin, Propylenglycol oder Sorbit; Pflanzenöle, wie Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosöl; Mineralöle, wie flüssiges Paraffin; Netzmittel, wie Benzalkoniumchlorid, Docusatnatrium, Lecithin, Poloxamer, Natriumlaurylsulfat, Sorbitanester; und Verdickungsmittel, wie Agar, Alginsäure, Bienenwachs, Carboxymethylcellulose-Calcium, Carrageen, Dextrin oder Gelatine.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch für die parenterale Verabreichung zubereitet werden. Zubereitungen für die parenterale Verabreichung können unter anderem in Form von wässrigen oder nichtwässrigen isotonischen sterilen nichttoxischen Injektions- oder Infusionslösungen oder -suspensionen vorliegen. Zu den bevorzugten parenteralen Verabreichungswegen gehören intravenöse, intraperitoneale, epidurale, intramuskuläre und intratumorale Injektion oder Infusion. Die Lösungen oder Suspensionen können Mittel umfassen, die bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen für Empfänger nicht toxisch sind, wie 1,3-Butandiol, Ringer-Lösung, Hank-Lösung, isotonische Natriumchloridlösung, Öle, wie synthetische Mono- oder Diglyceride, oder Fettsäuren, wie Ölsäure, lokalanästhetische Mittel, Konservierungsstoffe, Puffer, Viskositäts- oder löslichkeitserhöhende Mittel, wasserlösliche Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Cystein-Hydrochlorid, Natriumhydrogensulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit und dergleichen, öllösliche Antioxidantien, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, α-Tocopherol und dergleichen, und Metalchelatoren, wie Zitronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung die Verwendung eines agonistischen Bindungsmoleküls, einer funktionellen Variante, eines Immunkonjugats, eines Nucleinsäuremoleküls, einer Zusammensetzung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung zum Stimulieren von T-Zellen, vorzugsweise aktivierten CD4-positiven T-Zellen in vitro. Die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung können auch zusammen mit antigenpräsentierenden Zellen mit T-Zellen in Kontakt gebracht werden, um die T-Zell-Proliferation in vitro zu stimulieren.
Die agonistischen Bindungsmoleküle, vorzugsweise die humanen agonistischen Bindungsmoleküle, wie humane agonistische monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung, die Varianten oder Fragmente davon, die Immunkonjugate gemäß der Erfindung, die Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung, die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können als Medikamente verwendet werden. Sie können unter anderem bei der Diagnose, Prophylaxe, Behandlung oder einer Kombination davon einer neoplastischen, viralen oder bakteriellen Störung oder Erkran kung verwendet werden. Vorzugsweise ist die neoplastische Störung oder Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Schwerkettenerkrankung, Leukämien (z. B. akuter myeloider Leukämie, chronischer myeloider Leukämie, chronischer myelomonocytischer Leukämie, akuter promyelocytischer Leukämie, myelodysplastischem Syndrom, juveniler myelomonocytischer Leukämie usw.), Metastasen, Neoplasmen, Tumoren (z. B. akustischem Neurom, Adenokarzinom, Nebennierenrindentumor, Analkarzinom, Angiosarkom, Astrocytom, Basalzellenkarzinom, Gallengangkarzinom, Blasenkarzinom, Hirntumor, Brustkrebs, bronchogenem Karzinom, Bauchfellkrebs, Zervixkarzinom, Chondrosarkom, Chordom, Choriokarzinom, Colonkarzinom, Colorektalkarzinom, Craniopharyngiom, Cystadenokarzinom, embryonalem Karzinom, endometrialem Karzinom, Endotheliosarkom, Ependymom, Epithelkarzinom, Ösophaguskarzinom, Ewing-Tumor, Fibrosarkom, Gastrointestinalkarzinom, Urogenitalkarzinom, Glioblastom, Gliom, Kopfkrebs, Hämangioblastom, Hepatom, Morbus Hodgkin, Nierenkrebs, Leiomyosarkom, Liposarkom, Leberkrebs, Lungenkarzinom, Lymphangioendotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphome, maligner Hypercalcämie, malignem Insulinom, medullärem Karzinom, Medulloblastom, Melanom, Meningiom, Mesotheliom, Halskrebs, Neuroblastom, Nicht-Hodgkin-Lymphom, nichtkleinzelligem Lungenkarzinom, Oligodendrogliom, osteogenem Sarkom, Eierstockkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, papillären Adenokarzinomen, papillärem Karzinom, Peniskarzinom, Pinealom, prämalignen Hautläsionen, primären Hirntumoren, primärer Makroglobulinämie, primärer Thrombocytose, Prostatakrebs, Rektalkarzinom, Nierenzellenkarzinom, Retinoblastom, Rhabdomyosarkom, Speicheldrüsenkrebs, Sarkom, Talgdrüsenkrebs, Seminom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Magenkrebs, Synoviom, Schweißdrüsenkarzinom, Hodenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Vulvakarzinom und Wilms-Tumor) oder irgendeiner Erkrankung oder Störung, die durch unkontrolliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist, besteht. Die Bindungsmoleküle der Erfindung sind für die Behandlung von noch unbehandelten Patienten, die unter irgendwelchen der obigen Störungen und Erkrankungen leiden, von Patienten, die behandelt oder noch behandelt werden und in Remission oder nicht in Remission sind, und von Patienten mit rezidivierenden/hartnäckigen Störungen oder Erkrankungen geeignet.
Vorzugsweise ist die virale Störung oder Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Störungen oder Erkrankung besteht, die mit dem für SARS (severe acute respiratory syndrome), Herpes-simplex-Virus (HSV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), humanen T-Zell-lymphotrophen Virus (HTLV) Typ I und II, humanen Immunschwächevirus (HIV) Typ I und II, Cytomegalievirus, Papillomvirus, Polyomviren, Adenoviren, Epstein-Barr-Virus, Pockenviren, Influenzavirus, Masernvirus, Rabiesvirus, Sendaivirus, Poliomyelitisvirus, Coxsackieviren, Rhinoviren, Reoviren und Rubellavirus verbunden sind.
Vorzugsweise ist die bakterielle (die der Einfachheit halber auch durch Hefe und Pilze verursachte Störungen und Erkrankungen mit einschließt) Störung oder Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Störungen oder Erkrankung besteht, die mit Acinetobacter sp., Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus, Bacteroides fragilis, Bacteroides ovatus, Bacteroides ureolyticus, Bacteroides vulgatus, Borrelia burgdorferi, Borrelia vincentii, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter (Vibrio) fetus, Campylobacter jejuni, Chlamydia spp., Citrobacter diversus, Citrobacter freundii, Corynebacterium jeikeium, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Clostridium sporogenes, Clostrdium sp., Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Edwardsiella tarda, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozaenae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromotis, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma spp., Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus asaccharolyticus, Peptostreptococcus magnus, Pneumocystis carinii, Prevotella bivia und Prevotella melaninogenica, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzen, Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus Gruppe C, Streptococcus Gruppe G, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus simulas, Staphylococcus warnen, Staphylococcus xylosus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalacti ae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pyogenes, Toxoplasma gondii, Treponema carateneum, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Vibrio cholera, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis und Yersinia pseudotuberculosis verbunden sind.
Vorzugsweise können die agonistischen Bindungsmoleküle, vorzugsweise die humanen agonistischen Bindungsmoleküle, wie die humanen agonistischen monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung, die Varianten oder Fragmente davon, die Immunkonjugate gemäß der Erfindung, die Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung, die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung verwendet werden, um die Immunantwort bei einem Menschen oder Tier zu verstärken, besonders bevorzugt um die Immunantwort gegen ein Tumor-, bakterielles oder virales Antigen bei einem Menschen oder Tier zu verstärken. In einer speziellen Ausführungsform können die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung in Kombination mit dem OX40-Liganden, vorzugsweise dem humanen OX40-Liganden, verwendet werden. Diese Verbindungen können eine costimulatorische Wirkung ausüben.
Als weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Modulieren einer T-Zell-Antwort bei einem Menschen, das den Schritt des Verabreichens einer effektiven Dosis eines Bindungsmoleküls gemäß der Erfindung oder einer funktionellen Variante gemäß der Erfindung, eines Immunkonjugats gemäß der Erfindung, eines Nucleinsäuremoleküls gemäß der Erfindung, eines Vektors gemäß der Erfindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung an den Menschen umfasst. Vorzugsweise umfasst die Modulation die Stimulierung der T-Zell-Proliferation.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines agonistischen Bindungsmoleküls, einer funktionellen Variante, eines Immunkonjugats, eines Nucleinsäuremoleküls, einer Zusammensetzung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Herstellung einer Medikaments zur Behandlung einer neoplastischen, viralen oder bakteriellen Störung oder Erkrankung, wie sie hier beschrieben ist. Besonders bevorzugt ist es die Verwendung zur Herstellung einer Medikaments zur Verstärkung der Immunantwort bei einem Menschen oder Tier, und besonders bevorzugt ist es die Verwendung zur Herstellung einer Medikaments zur Verstärkung der Immunantwort gegen ein Tumor-, bakterielles oder virales Antigen bei einem Menschen oder Tier.
Die Moleküle sind in den Zusammensetzungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung typischerweise in einer therapeutisch, prophylaktisch oder diagnostisch effektiven Menge zubereitet, wie zum Beispiel 1–100 mg/kg, vorzugsweise 1–25 mg/kg, besonders bevorzugt 3–10 mg/kg. Die Dosisvorschriften können so angepasst werden, dass man die optimale gewünschte Reaktion (z. B. eine therapeutische Reaktion) erhält. Zum Beispiel kann ein einziger Bolus verabreicht werden, mehrere Teildosen können mit der Zeit vberabreicht werden, oder die Dosis kann proportional reduziert oder erhöht werden, wie es durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation angezeigt ist. Die Moleküle oder Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise steril. Verfahren, um diese Moleküle und Zusammensetzungen steril zu machen, sind in der Technik wohlbekannt.
Alternativ dazu werden Patienten in vivo Zellen verabreicht, die gentechnisch so verändert sind, dass sie die humanen agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung exprimieren. Solche Zellen können von einem Tier oder Patienten oder einem MHC-verträglichen Spender erhalten werden und können unter anderem Fibroblasten, Knochenmarkzellen, Blutzellen (z. B. Lymphocyten), Adipocyten, Muskelzellen, Endothelzellen usw. umfassen. Die Zellen werden in vitro gentechnisch verändert, wobei man DNA-Rekombinationstechniken verwendet, um die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung in die Zellen einzuführen.
Vorzugsweise werden die agonistischen Bindungsmoleküle von den Zellen sezerniert. Die gentechnisch veränderten Zellen, die die Bindungsmoleküle, wie sie hier beschrieben sind, exprimieren und vorzugsweise sezernieren, können zum Beispiel systemisch, zum Beispiel im Kreislauf, oder intraperitoneal in den Patienten eingebracht werden. In anderen Ausführungsformen können die Zellen in eine Matrix eingebaut oder eingekapselt und in den Körper implantiert werden.
In einer anderen Ausführungsform werden aktivierte CD4-positive T-Zellen aus einem Patienten entnommen und in vitro mit den agonistischen Bindungsmolekülen der Erfindung in Kontakt gebracht. Danach werden die behandelten aktivierten CD4-positiven T-Zellen an den Patienten verabreicht. In noch einer weiteren spezifischen Ausführungsform werden die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung und antigenpräsentierende Zellen in vitro mit T-Zellen in Kontakt gebracht, um die T-Zell-Proliferation in vitro zu stimulieren.
In einer speziellen Ausführungsform können neoplastische, virale oder bakterielle Antigene oder Kombinationen davon vor, während oder nach der Verabreichung der agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Antigene einem Patienten mit einer neoplastischen oder infektiösen Störung oder Krankheit vor (z. B. 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 45 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden, 8 Stunden, 10 Stunden, 12 Stunden, 14 Stunden, 16 Stunden, 18 Stunden, 20 Stunden, 22 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage, 4 Tage, 5 Tage, 7 Tage, 2 Wochen, 4 Wochen oder 6 Wochen vor) der Verabreichung der agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung verabreicht. Zu den Antigenen gehören unter anderem rekombinant erzeugte Antigene, gereinigte Antigene, Zusammensetzungen, die die Antigene umfassen, neoplastische Zellen, die die Antigene umfassen, Teile von neoplastischen Zellen, wie zum Beispiel Membranen, die die Antigene umfassen, Fragmente der Antigene, Viren, Bakterien, Pilze, Hefe und andere Mikroorganismen. Wenn Zellen verwendet werden, können die Zellen direkt nach der Entnahme aus dem Patienten verwendet werden, aber vorzugsweise werden die Zellen zuerst abgeschwächt, bevor man sie einem Patienten verabreicht. Wenn Viren oder Bakterien oder andere infektiöse Organismen verwendet werden, werden die Organismen vorzugsweise zuerst abgeschwächt, bevor man sie einem Patienten verabreicht.
Verfahren zur Abschwächung sind in der Technik bekannt und umfassen unter anderem Bestrahlung, Wärmebehandlung und chemische Inaktivierung.
In Verbindung mit der Behandlung von neoplastischen Störungen oder Erkrankungen können die agonistischen Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung in Kombination mit klassischen Ansätzen, wie Chirurgie, Strahlentherapie, Chemotherapie und dergleichen, verwendet werden. Die humanen agonistischen Bindungsmoleküle und die chemotherapeutischen, radiotherapeutischen oder antiangiogenen Mittel können in einer einzigen Zusammensetzung oder als zwei getrennte Zusammensetzungen unter Verwendung von identischen oder verschiedenen Verabreichungswegen verabreicht werden. Die Erfindung stellt daher auch kombinierte Therapien bereit, in denen die agonistischen Bindungsmoleküle der Erfindung gleichzeitig mit, vor oder nach einer Operation, Strahlentherapie oder Chemotherapie verabreicht werden oder Patienten mit, vor oder nach herkömmlichen chemotherapeutischen, radiotherapeutischen oder antiangiogenen Mitteln verabreicht werden. Wenn die Verabreichung des humanen agonistischen Bindungsmoleküls der Verabreichung der chemotherapeutischen, radiotherapeutischen oder antiangiogenen Mittel vorangeht oder folgt, können zwischen den verschiedenen Verabreichungen Intervalle im Bereich von Minuten bis Wochen liegen. Es muss jedoch gewährleistet werden, dass zwischen den Zeitpunkten der Verabreichungen jeweils keine erhebliche Zeit verstreicht, so dass die Zusammensetzung, die das Mittel umfasst, und die Zusammensetzung, die das agonistische Bindungsmolekül umfasst, noch eine vorteilhaft kombinierte Wirkung auf das Neoplasma oder den Tumor ausüben können. In solchen Fällen wird in Betracht gezogen, dass man das Neoplasma oder den Tumor mit beiden Zusammensetzungen innerhalb von etwa 2 Minuten bis etwa einer Woche und besonders bevorzugt innerhalb von etwa 12–72 Stunden kontaktiert, wobei eine Verzögerungszeit von nur etwa 12–48 Stunden am meisten bevorzugt ist.
In Verbindung mit der Behandlung von viralen oder bakteriellen Störungen oder Erkrankungen, wie sie oben erwähnt sind, können die agonistischen Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung in Kombination mit antiviralen und/oder antibakteriellen Verbindungen, wie sie oben beschrieben sind, verwendet werden. Eine ähnliche Dosisvorschrift, wie sie für die Behandlung von neoplastischen Störungen und Erkrankungen angezeigt ist, kann auch auf die viralen oder bakteriellen Störungen oder Erkrankungen angewendet werden, d. h. eine oder mehrere humane agonistische Bindungsmoleküle oder Zusammensetzungen, die sie umfassn, können einem Patienten mit einer Infektionskrankheit verabreicht werden, und zwar vor (z. B. 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 45 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden, 8 Stunden, 10 Stunden, 12 Stunden, 14 Stunden, 16 Stunden, 18 Stunden, 20 Stunden, 22 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage, 4 Tage, 5 Tage, 7 Tage, 2 Wochen, 4 Wochen oder 6 Wochen vor), während oder nach (z. B. 2 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 45 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden, 8 Stunden, 10 Stunden, 12 Stunden, 14 Stunden, 16 Stunden, 18 Stunden, 20 Stunden, 22 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage, 4 Tage, 5 Tage, 7 Tage, 2 Wochen, 4 Wochen oder 6 Wochen nach) der Verabreichung von einer oder mehreren antiviralen und/oder antibakteriellen Verbindungen.
Weiterhin sind pharmazeutische Packungen oder Kits, die wenigstens ein agonistisches Bindungsmolekül, vorzugsweise humane agonistische Bindungsmoleküle, wie humane agonistische monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung, wenigstens eine Variante oder ein Fragment davon, wenigstens ein Immunkonjugat gemäß der Erfindung, wenigstens ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung, wenigstens eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung, wenigstens eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung, wenigstens einen Vektor gemäß der Erfindung, wenigstens einen Wirt gemäß der Erfindung oder eine Kombination davon umfassen, ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Gegebenenfalls enthalten die Kits auch andere therapeutische oder prophylaktische Verbindungen. Gegebenenfalls sind die oben beschriebenen Komponenten der Kits der Erfindung in geeigneten Behältern verpackt und für die Diagnose, Prophylaxe und/oder Behandlung der angezeigten Zustände markiert. Die oben genannten Komponenten können in Dosiseinheits- oder Multidosisbehältern aufbewahrt werden, zum Beispiel in geschlossenen Ampullen, Vials, Flaschen, Spritzen und Reagenzgläsern, und zwar als wäss rige, vorzugsweise sterile, Lösung oder als lyophilisierte, vorzugsweise sterile, Zubereitung für die Rekonstitution. Die Behälter können aus einer Vielzahl von materialien, wie Glas oder Kunststoff, gebildet sein unhd können einen sterilen Anschluss haben (zum Beispiel kann der Behälter ein Beutel für eine intravenöse Lösung oder ein Vial mit einem Stopfen, der von einer hypodermalen Injektionsnadel durchstochen werden kann, sein). Der Kit kann weiterhin noch weitere Behälter umfassen, die einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung umfassen. Er kann weiterhin noch andere Materialien umfassen, die von einem kommerziellen Standpunkt und dem des Anwenders aus gesehen wünschenswert sind, einschließlich weiterer Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen, Kulturmedium für einen oder mehrere der geeigneten Wirte. Den Kits können Anweisungen beiliegen, die üblicherweise in kommerziellen Verpackungen von therapeutischen, prophylaktischen oder diagnostischen Produkten enthalten sind und die Informationen zum Beispiel über die Indikationen, die Verwendung, Dosierung, Zubereitung, Verabreichung, Kontraindikationen und/oder Warnhinweise bezüglich der Verwendung solcher therapeutischer oder diagnostischer Produkte enthalten. Die Dokumente, die Anweisungen für die Verwendung der Mittel des Kits liefern, können zum Beispiel in schriftlicher und/oder elektronischer Form vorliegen.
Beispiele
Zur Erläuterung der Erfindung werden die folgenden Beispiele angegeben.
Beispiel 1
Selektion von Phagen, die einzelkettige Fv-Fragmente tragen, welche spezifisch den humanen OX40-Rezeptor erkennen, unter Verwendung eines OX40-Ig-Fusionsproteins.
Antikörperfragmente wurden unter Verwendung von Antikörper-Phagen-Display-Bibliotheken und Mabstract^TM-Technik selektiert, im Wesentlichen so, wie es im US-Patent 6,265,150 und in WO 98/15833 beschrieben ist. Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. Ein humanes OX40-Ig-Fusionsprotein, das aus der extrazellulären Domäne des humanen OX40-Rezeptors bestand, der mit den Domänen CH2 und CH3 von humanem IgG1 verknüpft war, wurde kommerziell erhalten (Alexis Biochemicals) und 2 Stunden lang bei 37°C in einer Konzentration von 1,25 μg/ml auf die Oberfläche von Maxisorp^TM-Kunststoffröhrchen (Nunc) aufgetragen. Die Röhrchen wurden 1 Stunde lang in 2% Magermilchpulver, das in PBS gelöst war (MPBS), blockiert. Gleichzeitig wurden 500 μl (ungefähr 10¹³ cfu) einer Phagen-Display-Bibliothek, die einzelkettige Fv-Fragmente (scFvs) exprimierte und im Wesentlichen so hergestellt wurde, wie es in De Kruif et al. (1995a) und der dort zitierten Literatur beschrieben wurde, zu zwei Volumina 4% MPBS gegeben. Außerdem wurde humanes Serum bis zu einer Endkonzentration von 15% hinzugefügt, und man ließ die Blockierung 30–60 Minuten lang voranschreiten. Die OX40-Ig-beschichteten Röhrchen wurden geleert, und die blockierte Phagenbibliothek wurde hinzugefügt. Das Röhrchen wurde verschlossen und 1 Stunde lang langsam rotieren gelassen, und dann erfolgten 2 Stunden Inkubation ohne Rotation. Die Röhrchen wurden geleert und zehnmal in PBS, das 0,1% Tween-20 enthielt, und dann fünfmal in PBS gewaschen. 1 ml Glycin-HCl, 0,05 M, pH 2,2, wurde hinzugefügt, und das Röhrchen wurde 10 Minuten lang langsam rotieren gelassen. Die eluierten Phagen wurden zu 500 μl 1M Tris-HCl, pH 7,4, gegeben. Zu diesem Gemisch wurden 3,5 ml exponentiell wachsende XL-1-Blue-Bakterienkultur gegeben. Die Röhrchen wurden 30 Minuten lang bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Dann wurden die Bakterien auf 2TY-Agarplatten, die Ampicillin, Tetracyclin und Glucose enthielten, ausgestrichen. Nach Inkubation der Platten über Nacht bei 37°C wurden die Kolonien von den Platten abgekratzt und im Wesentlichen so, wie es in De Kruif et al. (1995a) beschrieben ist, verwendet, um eine angereicherte Phagenbibliothek herzustellen. Kurz gesagt, die abgekratzten Bakterien wurden verwendet, um 2TY-Medium, das Ampicillin, Tetracyclin und Glucose enthielt, zu beimpfen, und bei einer Temperatur von 37°C bis zu einem OD_{600 nm} von ca. 0,3 gezüchtet. Helferphagen wurden hinzugefügt und die Bakterien infizieren gelassen, und danach wurde das Medium gegen 2TY, das Ampicillin, Tetracyclin und Kanamycin enthielt, ausgewechselt. Die Inkubation wurde über Nacht bei 30°C fortgesetzt. Am nächsten Tag wurden die Bakterien durch Zentrifugation aus dem 2TY-Medium entfernt, und danach wurden die Phagen mit Hilfe von Polyethylenglycol 6000/NaCl ausgefällt. Schließlich wurden die Phagen in einem kleinen Volumen PBS, das 1% BSA enthielt, aufgelöst, sterilfiltriert und für eine nächste Selektionsrunde verwendet. Das Verfahren der Selektion/Reinfektion wurde zweimal durchgeführt. Nach der zweiten Selektionsrunde wurden einzelne E.-coli-Kolonien verwendet, um monoklonale Phagenantikörper herzustellen. Im Wesentlichen wurden einzelne Kolonien bis zur logarithmischen Phase wachsen gelassen und mit Helferphagen infiziert, und danach ließ man die Produktion von Phagenantikörpern über Nacht fortschreiten. Phagenantikörper enthaltende Überstände wurden in ELISA auf Bindungsaktivität gegenüber mit humanem OX40-Ig beschichteten 96-Napf-Platten getestet.
Beispiel 2
Bewertung der für humanes OX40R spezifischen scFvs.
Ausgewählte Phagenantikörper, die bei dem oben beschriebenen Screening erhalten wurden, wurden in ELISA in Bezug auf ihre Spezifität bewertet. Zu diesem Zweck wurde humanes OX40-Ig auf Maxisorp^TM-ELISA-Platten aufgetragen. Nach der Beschichtung wurden die Platten in 2% MPBS blockiert. Die ausgewählten Phagenantikörper wurden in einem gleichen Volumen von 4% MPBS inkubiert. Die Platten werden geleert, einmal in PBS gewaschen, und danach wurden die blockierten Phagen hinzugefügt. Man ließ die Inkubation 1 Stunde lang voranschreiten, die Platten wurden in PBS, das 0,1% Tween-20 enthielt, gewaschen, und die gebundenen Phagen wurden unter. Verwendung eines mit Peroxidase konjugierten Anti-M13-Antikörpers nachgewiesen. Als Kontrolle wurde das Verfahren gleichzeitig unter Verwendung eines gegen Thyroglobulin gerichteten Kontrollphagenantikörpers (De Kruif et al., 1995a und 1995b) durchgeführt, der als negative Kontrolle diente. Wie in 1 gezeigt ist, zeigten die ausgewählten Phagenantikörper, die SC02008, SC02009, SC02010, SC02011, SC02012 und SC02021 genannt wurden, eine signifikante Bindung an das immobilisierte humane OX40-Ig-Fusionsprotein.
Die Phagenantikörper, die an humanes OX40-Ig banden, wurden anschließend auf die Bindung an humanes Serum-IgG getestet, um die Möglichkeit auszuschließen, dass sie den Fc-Teil des Fusionsproteins erkannten. Keiner der ausgewählten Anti-OX40-Rezeptor-Phagen zeigte eine Bindung an humanes IgG.
In einem anderen Assay wurden die Phagenantikörper auf ihre Fähigkeit analysiert, PER.C6^TM-Zellen zu binden, die rekombinant humanen OX40-Rezeptor exprimieren. Zu diesem Zweck wurden PER.C6^TM-Zellen mit einem Plasmid, das eine cDNA-Sequenz trägt, die humanen OX40-Rezeptor codiert, oder mit dem leeren Vektor transfiziert, und stabile Transfektanten wurden mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Standardtechniken selektiert (Coligan et al., 2001). Für die durchflusscytometrische Analyse wurden Phagenantikörper zuerst 15 Minuten lang bei 4°C in einem gleichen Volumen von 4% MPBS blockiert, bevor die mit OX40-Rezeptor und Kontrolle transfizierten PER.C6^TM-Zellen angefärbt werden. Die blockierten Phagen wurden zu einem Gemisch von unmarkierten kontrolltransfizierten PER.C6^TM-Zellen und OX40-Rezeptor-transfizierten PER.C6^TM-Zellen, die mit Hilfe eines lipophilen Farbstoffs (PKH67, Sigma) grün markiert wurden, gegeben. Die Bindung der Phagenantikörper an die Zellen wurde mit Hilfe eines biotinylierten Anti-M13-Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology) und dann mit Streptavidin-Phycoerythrin (Caltag) sichtbar gemacht. Wie in 2 gezeigt ist, färbten die ausgewählten Anti-Human-OX40-Rezeptor-Phagenantikörper, die SC02008, SC02009, SC02010, SC02011, SC02012 und SC02021 genannt wurden, selektiv die PER.C6^TM-OX40-Rezeptor-Transfektante, während sie die Kontrolltransfektante nicht banden.
In einem anderen Assay wurden die Phagenantikörper auf ihre Fähigkeit analysiert, an OX40-Rezeptor-positive, CD4-positive T-Zellen zu binden, die aus entzündeten Mandeln oder aus Gelenkflüssigkeit von Patienten, die an rheumatoider Arthritis litten, stammten. Als Kontrolle ist das Färbemuster der Anti-OX40-Rezeptor-Phagenantikörper auf mononukleären Zellen des peripheren Bluts (MNC) ebenfalls gezeigt.
Entzündete Mandeln wurden von Patienten erhalten, die einer Routine-Tonsillektomie unterzogen wurden. Die mandeln wurden zerkleinert, und die MNC-Fraktion wurde durch Dichtezentrifugation isoliert. Eine durchflusscytometrische Analyse der Bindung der Anti-OX40-Rezeptor-Phagenantikörper an die OX40-positiven, CD4-positiven T-Zellen wurde so durchgeführt, wie es oben beschrieben ist. Die CD4-positiven T-Zellen wurden mit Hilfe eines gegen CD4 gerichteten FITC-konjugierten Antikörpers von Gesamt-Mandel-MNC unterschieden. Wie in den 3A und 3B gezeigt ist, färben die ausgewählten Anti-Human-OX40-Rezeptor-Phagenantikörper, die SC02008, SC02009, SC02010, SC02011, SC02012 und SC02021 genannt wurden, selektiv eine Teilmenge der CD4-positiven T-Zellen innerhalb der mononukleären Zellen aus Mandeln bzw. Gelenkflüssigkeit, während sie nur eine geringfügige Färbung von CD4-positiven T-Zellen aus peripherem Blut zeigen (3C).
Beispiel 3
Selektion von Phagen, die einzelkettige Fv-Fragmente tragen, welche spezifisch den humanen OX40-Rezeptor erkennen, unter Verwendung von OX40-positiven, CD4-positiven T-Zellen.
Phagenselektionsexperimente wurden so durchgeführt, wie es oben beschrieben ist, wobei Lymphocyten als Ziel verwendet wurden. Ein Aliquot der Phagenbibliothek (500 μl, ungefähr 10¹³ cfu) wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 ml RPMI/10% FCS/1% NHS blockiert. Mandel-MNC (ca. 10·10⁶ Zellen) wurden zu der blockierten Phagenbibliothek gegeben, und es wurde 2,5 Stunden lang inkubiert, während man langsam bei 4°C rotieren ließ. Anschließend wurden die Zellen zweimal gewaschen und in 500 μl RPMI/10% FCS resuspendiert und 15 Minuten lang auf Eis mit einem FITC-konjugierten Anti-CD4-Antikörper (Becton Dickinson) und einem Phycoerythrin-konjugierten Anti-OX40-Rezeptor-Antikörper (Becton Dickinson) inkubiert. Die Zellen wurden einmal gewaschen und in ein 4-ml-Röhrchen übergeführt. Eine Zellsortierung wurde mit einem FACSvantage Fluoreszenzaktivierungs-Zellsortierer (Becton Dickinson) durchgeführt, und es wurden ca. 15 000 CD4-positive, OX40-positive Zellen aussortiert. Die aussortierten Zellen wurden abzentrifugiert, der Überstand wurde aufbewahrt, und die gebundenen Phagen wurden aus den Zellen eluiert, indem man die Zellen in 500 μl 50 mM Glycin, pH 2,2, resuspendierte und anschließend 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubierte. Das Gemisch wurde mit 250 μl 1M Tris-HCl, pH 7,4, neutralisiert und zu dem aufbewahrten Überstand gegeben. Diese Phagen wurden kollektiv verwendet, um eine angereichjerte Phagenbibliothek herzustellen, wie es schon früher beschrieben wurde. Das Verfahren der Selektion/Reinfektion wurde zweimal durchgeführt. Nach der zweiten Selektionsrunde wurden monoklonale Phagenantikörper hergestellt und auf die Bindung an tonsilläre OX40-positive, CD4-positive T-Zellen getestet. Ausgewählte Phagenantikörper, die dieses Kriterium erfüllten, wurden anschließend auf die Bindung an mit OX40-Rezeptor transfizierte PER.C6^TM-Zellen getestet. Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass die ausgewählten Phagenantikörper, die SC02022 und SC02023 genannt werden, selektiv an eine Teilmenge von CD4-positiven T-Zellen innerhalb von mononukleären Zellen aus den Mandeln binden (4A) und dass sie an die Human-OX40-Rezeptor-PER.C6^TM-Transfektante binden (siehe 4B).
Beispiel 4
Charakterisierung der für den humanen OX40-Rezeptor spezifischen scFvs.
Aus den ausgewählten, für den humanen OX40-Rezeptor spezifischen Phagen-Antikörper(scFv)-Klonen wurde Plasmid-DNA erhalten, und die Nucleotidsequenzen wurden mit Standardtechniken bestimmt. Die Nucleotidsequenzen und Aminosäure-Translationen der scFvs, die SC02008, SC02009, SC02010, SC02011, SC02012, SC02021, SC02022 und SC02023 genannt wurden, sind in den 5–12 gezeigt. Die Nucleotidsequenzen der scFvs, die SC02008, SC02009, SC02010, SC02011, SC02012, SC02021, SC02022 und SC02023 genannt wurden, sind auch in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 13 bzw. SEQ ID Nr. 15 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen der scFvs, die SC02008, SC02009, SC02010, SC02011, SC02012, SC02021, SC02022 und SC02023 genannt wurden, sind in SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr, 10, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 14 bzw. SEQ ID Nr. 16 gezeigt. Die VH- und VL-Gen-Identität und die Schwerketten-CDR3-Zusammensetzungen der Anti-Human-OX40-Rezeptor-scFvs sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 5
Produktion von für humanen OX40-Rezeptor spezifischen bivalenten scFv in Pichia pastoris.
Verfahren zur Klonierung und Expression von bivalenten scFv-Fragmenten im Pichia-pastoris-System beruhten auf Vorschriften, die vom Hersteller (Invitrogen) in "A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris (Version F)" angegeben wurden. Der bivalente scFv-Expressionsvektor pPicZbiFVH (siehe 13B) wurde nach dem Fachmann bekannten Standardtechniken der Molekularbiologie aus dem Vektor pPICZaB (Invitrogen) (siehe 13A) konstruiert. Drei Modifikationen wurden in pPICZαB eingeführt (siehe 13C):

1. Eine Restriktionsstelle (NcoI) wurde durch eine PCR-erzeugte Punktmutation direkt hinter der KEK2-Spaltungsstelle des Signalpeptids eingeführt, um die Klonierung in den Vektor zu erleichtern.
2. Eine zweite NcoI-Restriktionsstelle wurde durch eine PCR-erzeugte Punktmutation innerhalb des codierenden Bereichs des sh-ble-Gens entfernt.
3. Ein synthetisches Fragment, das den Scharnierbereich von murinem IgG3 und ein Linkerfragment umfasst, wurde zwischen den Restriktionsstellen NotI und XbaI eingeführt.

Alle Modifikationen wurden durch Sequenzierung bestätigt. ScFvs wurden in pPicZbiFVH aus dem Phagen-Display-Expressionsvektor durch direktionales Klonieren unter Verwendung der Restriktionsstellen NcoI und NotI kloniert. Der Pichia-pastoris-Stamm SMD1168 kek1:suc1 (ATCC-Nr. 204414) wurde durch Elektroporation nach den Anweisungen des Herstellers (s. o.) mit 5–10 μg linearisierter Konstrukt-cDNA transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf YPDS-Agar, der 250 μg/ml Zeocin enthielt, ausgestrichen und 3–4 Tage lang bei 30°C inkubiert. Hochproduktive Klone wurden wie folgt durch Colony-Lift-Immunoblot-Screening selektiert. Vorab angefeuchtete Nitrocellulosemembranen wurden über die Transformationsplatten geschichtet, und eine Fraktion von jeder Kolonie wurde auf die Membran gehoben. Dann wurde die Membran mit der Kolonieseite nach oben auf YPD-Agar, der 0,5% Methanol enthielt, gelegt und über Nacht bei 30°C inkubiert. Dann wurden die Membranen wiederholt mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,5% Tween-20 (TEST) enthielt, gewaschen, um Kolonien zu entfernen, dann 30 Minuten lang mit TEST und 4% Magermilchpulver blockiert. Dann wurden die Membranen 1 Stunde lang in TEST gegeben, das 4% Magermilchpulver und mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten Anti-c-myc-Antikörper (Roche) enthielt. Schließlich wurden die Membranen gründlich in TEST gewaschen, dann erfolgte ein PBS-Waschschritt, und scFv-sezernierende Kolonien wurden durch ein Chemofluoreszenz-Nachweissystem (Apbiochem) sichtbar gemacht. Ausgewählte hochproduktive Kolonien wurden durch Ausstreichen auf YPD-Platten gereinigt und anschließend für die Expression von bivalenten scFv verwendet. Expressionskulturen im kleinen Maßstab wurden im Wesentlichen so, wie es in den Anweisungen des Herstellers (s. o.) beschrieben ist, in Schüttelkolben durchgeführt. Für die Zellexpansionsphase wurde BMGY-Medium verwendet, während in der Phase der Expression der bivalenten scFv BMMY-Medium verwendet wurde. Nach 48 Stunden Induktion wurden die Überstände durch wiederholte Zentrifugation geklärt. Der Überstand wurde durch Zugabe von 1M Na₂HPO₄, pH 8, bis zu einer Konzentration von 20 mM, 0,5 M Imidazol bis zu einer Konzentration von 10 mM, 5 M NaCl bis zu einer Konzentration von 500 mM für die Reinigung konditioniert. Danach wurden die Proben durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie und anschließende Anionenaustausch-Chromatographie auf einem AKTAprime-FPLC-System (Pharmacia) gereinigt. Eine 5-ml-HiTrap-Chelatisierungssäule (Pharmacia) wurde mit NiSO₄ beladen und nach den Anweisungen des Herstellers äquilibriert. Konditionierter Überstand wurde direkt auf die Säule geladen und gründlich in Äquilibrierungspuffer (20 mM Na₂PO₄, pH 8, 10 mM Imidazol) gewaschen.
Bivalente scFv wurden in Gegenwart von 250 mM Imidazol, pH 8,5, direkt von der Säule auf eine 1-ml-Sepharose-Q-HP-Säule (Pharmacia) eluiert. Dann wurde die Säule in 20 mM Tris-HCl, pH 8, dann kurz in 20 mM Na₂PO₄, pH 7,3, gewaschen, und bivalente scFvs wurden in 7 Säulenvolumina über einen Gradienten von 0–0,5 M NaCl aus der Säule eluiert. Dann wurde der Proteingehalt der Fraktionen gemessen, und sie wurden auf Aktivität und Reinheit analysiert. Die bivalenten scFv-Klone von SC02008, SC02010, SC02011 und SC02023 wurden am 15. Mai 2002 bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Großbritannien, unter den Zugriffsnummern 02051563, 02051560, 02051561 und 02051562 hinterlegt.
Beispiel 6
Funktionelle Analyse von bivalenten scFv, die spezifisch humanen OX40-Rezeptor erkennen.
Die bivalenten Anti-Human-OX40-Rezeptor-scFvs wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit bewertet, an OX40-positive, CD4-positive T-Zellen innerhalb von Mandel-MNC zu binden. Mandel-MNC-Proben wurden so erhalten, wie es oben beschrieben ist, und bei 4°C mit den bivalenten scFvs in einer Konzentration von 5 μg/ml angefärbt. Die Bindung der bivalenten scFvs wurde unter Verwendung eines biotinylierten Anti-myc-Antikörpers (9E10, Santa Cruz Biotechnology) und dann Streptavidin-Phycoerythrin (Caltag) sichtbar gemacht. Die bivalenten Anti-Human-OX40-Rezeptor-scFvs zeigten im Phagenantikörperformat ein ähnliches Färbungsmuster wie die entsprechenden scFvs.
Die bivalenten Anti-Human-OX40-Rezeptor-scFvs wurden in einem Costimulationsassay in Bezug auf ihre Fähigkeit analysiert, in die vom OX40-Rezeptor vermittelte Signalwirkung einzugreifen. Zu diesem Zweck wurden 293T-Zellen entweder mit dem leeren Vektor oder mit einem Plasmid, das OX40-Ligand-cDNA enthält (pCDNA3.1zeo(+), InVitrogen), transfiziert, wobei man das Lipofectamin-Reagens gemäß Standardvorschriften verwendete. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, mit Paraformaldehyd fixiert und mittels Durchflusscytometrie auf die Expression von OX40-Ligand auf der Zelloberfläche analysiert (der OX40-Ligand wurde mit Hilfe des OX40-Ig-Fusionsproteins und anschließende Inkubation mit einem biotinylierten polyklonalen Ziegen-Anti-Human-Fc-Antikörper (Caltag) und Streptavidin-Phycoerythrin (Caltag) sichtbar gemacht). Zu Cokulturen von 1,5·10³ 293T-Transfektanten und 4·10⁵ T-Zellen, die mit einer submitogenen Dosis von 50 ng/ml PHA (Abbot Murex) aktiviert wurden, wurden mehrere Konzentrationen der bivalenten Anti-Human-OX40-Rezeptor- oder Kontroll-scFvs gegeben. T-Zellen wurden durch negative Selektion mit Hilfe des MACS-Systems und eines Pan-T-Zell-Isolierungskits (Myltenyi Biotec) durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten von PBMC gereinigt, die von gesunden Spendern erhalten wurden. Die Kulturen wurden 5 Tage lang in 96-Napf-Platten mit U-Boden durchgeführt, und die Vermehrung der T-Zellen wurde durch Einbau von ³H-Thymidin während der letzten 16 Stunden der Kultur gemessen. Wie in den 14A und 14B gezeigt ist, zeigen die bivalenten scFvs SC02008 und SC02023 insofern eine agonistische (stimulierende) Funktion, als sie die T-Zell-Proliferation in konzentrationsabhängiger Weise induzieren, wenn sie mit den scheintransfizierten 293T-Zellen inkubiert werden. Interessanterweise zeigen diese agonistischen bivalenten Anti-Human-OX40-Rezeptor-scFvs eine synergistische stimulierende Wirkung, wenn sie mit dem mit OX40-Ligand transfizierten 293T-Zellen coinkubiert werden, im Vergleich zu dem Niveau der Proliferation, das mit derselben Transfektante in Gegenwart eines bivalenten Kontroll-scFv-Antikörpers erreicht wird.
Beispiel 7
Konstruktion von vollständig humanen Immunglobulinmolekülen aus den ausgewählten Anti-Human-OX40-Rezeptor-Einzelketten-Fv-Fragmenten.
Um die ausgewählten Antikörperfragmente, die humanen OX40-Rezeptor erkennen, für di therapeutische Anwendung beim Menschen zu verwenden, ist es wünschenswert, humane Immunglobulinmoleküle zu erzeugen. Die gentechnische Gestaltung und Produktion der humanen monoklonalen IgG1-Antikörper wird im Wesentlichen so durchgeführt, wie es im Einzelnen in Boel et al. (2000) beschrieben ist. Im Einzelnen: scFv wurden in den IgG-Expressionsvektor C01 (pCRU-KO1) rekloniert. Zu diesem Zweck wurden die V_H- und V_L-Bereiche durch PCR amplifiziert, wobei man dafür bestimmte Primer verwendete, um Restriktionsstellen anzuhängen und vollständige humane Gerüste wiederherzustellen. Die PCR-Fragmente wurden in pTOPO (Invitrogen) kloniert, die Integrität der PCR-Fragmente wurde durch Sequenzieren überprüft, und danach wurden die Inserts nacheinander in den IgG-Expressionsvektor C01 kloniert (EcoRI-BamHI für V_H und XhoI-NotI für V_L).

ScFv 5'V_H oligo 3'V_H oligo 5'V_L oligo 3'V_L oligo

02-008 5H-B 3H-B 5K-E 3K-E

02-011 5H-B 3H-B 5K-E 3K-E

02-021 5H-B 3H-B 5K-G 3K-B

02-023 5H-B 3H-B 5K-H 3K-F
Primersequenzen:
Die resultierenden Expressionskonstrukte pgG102-008C01, pgG102-011C01, pgG102-021C01 und pgG102-023C01, die die gegen den humanen OX40-Rezeptor gerichteten humanen IgG1-Antikörper codieren, wurden transient in PER.C6^TM-Zellen exprimiert, und es wurden Überstände erhalten, die IgG1-Antikörper enthalten. Die Expressionskonstrukte pgG102-008C01, pgG102-011C01, pgG102-021C01 und pgG102-023C01 wurden am 9. Juni 2003 bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Großbritannien unter den vorläufigen Zugriffsnummern 03060601, 03060602, 03060603 und 03060604 hinterlegt.
Die Nucleotidsequenzen der schweren Ketten der Antikörper, die 008, 011, 021 und 023 genannt werden, sind in SEQ ID Nr. 39–42 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen der schweren Ketten der Antikörper, die 008, 011, 021 und 023 genannt werden, sind in SEQ ID Nr. 25–28 gezeigt. Die Nucleotidsequenzen der leichten Ketten der Antikörper, die 008, 011, 021 und 023 genannt werden, sind in SEQ ID Nr. 43–46 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen der leichten Ketten der Antikörper, die 008, 011, 021 und 023 genannt werden, sind in SEQ ID Nr. 29– 32 gezeigt. Anschließend wurden die Antikörper über Ausschlusschromatographiesäulen und Protein-A-Säulen gereinigt, wobei man Standardreinigungsverfahren verwendete, die im Allgemeinen für Immunglobuline verwendet werden (siehe zum Beispiel WO 00/63403 ).
Die Anti-OX40-Rezeptor-IgG1-Antikörper wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit bewertet, an mit humanem OX40-Rezeptor transfizierte PER.C6^TM-Zellen zu binden. Zu diesem Zweck wurden schein- und mit humanem OX40-Rezeptor transfizierte Zellen mit den IgG1-Antikörpern in einer Konzentration von 20 μg/ml bei 4°C angefärbt. Die Bindung der Antikörper, die 008, 011, 021 und 023 genannt werden, wurde mit einem biotinylierten Ziegen-Anti-Human-IgG (Fc-spezifisch, Caltag) und dann Streptavidin-Phycoerythrin (Caltag) sichtbar gemacht). Die angefärbten Zellen wurden mittels Durchflusscytometrie analysiert. Alle Antikörper erkannten spezifisch den humanen OX40-Rezeptor auf mit OX40-Rezeptor transfizierten PER.C6^TM-Zellen (ausgefüllte Histogramme in 15), während sie die scheintransfizierte Zelllinie nicht banden (leere Histogramme in 15).
Beispiel 8
Funktionelle Analyse von vollständig humanen IgG-Molekülen, die den humanen OX40-Rezeptor spezifisch erkennen.
Die Anti-OX40-Rezeptor-IgG1-Moleküle werden in einem Costimulationsassay, wie er oben beschrieben ist, in Bezug auf ihre Fähigkeit analysiert, in die OX40R-vermittelte Signalwirkung einzugreifen. Es ist zu erwarten, dass wenigstens eines der IgG1-Moleküle die Proliferation von T-Zellen stimuliert.
Beispiel 9
Immunhistochemie
Die Anti-OX40-Rezeptor-IgG-Moleküle werden biotinyliert und anschließend durch Immunhistochemie in Bezug auf ihre Fähigkeit analysiert, an OX40- positive Zellen in Schnitten von entzündeten Mandeln und Tumoren mit infiltrierenden Lymphocyten zu binden. Weiterhin werden sie auf ihre Fähigkeit analysiert, an normale Gewebe zu binden. Zu diesem Zweck werden Gefrierschnitte der folgenden normalen Gewebe sowie von entzündeten Geweben und Tumorgeweben angefertigt, auf Objektträger montiert und bei Raumtemperatur getrocknet: Nebenniere, Harnblase, Gehirn (Klein- und Großhirn), Blutgefäße (Aorta und Koronararterie), Eileiter, Speiseröhre, Magen (Antrum und Korpus), Zwölffingerdarm, Krummdarm, Dickdarm, Herz, Niere, Leber, Lunge, Lymphknoten, Eierstock, Pankreas, Nebenschilddrüse, periphere Nerven, Hypophyse, Plazenta, Prostata, Speicheldrüse, Haut, Rückenmark, Milz, gestreifte Muskulatur, Hoden, Mandeln, Schilddrüse, Harnröhre und Gebärmutter (Hals und Endometrium). Die Schnitte werden 20 Minuten lang mit 50 mM Natriumazid, das 0,03% H₂O₂ enthält, in Bezug auf endogene Peroxidase blockiert und dann gemäß der gelieferten Vorschrift (X0590, Dako) in Bezug auf endogenes Biotin blockiert. Anschließend werden die Schnitte mit PBS blockiert, das 4% BSA und 10% normales humanes Serum enthält, bevor sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur mit den biotinylierten Anti-Human-OX40-Rezeptor-IgGs inkubiert werden. Um gebundene IgG-Moleküle nachzuweisen, werden die Schnitte mit Streptavidin-gekoppelter Meerrettich-Peroxidase (Dako) inkubiert, woraufhin eine Inkubation mit Diaminobenzidin (Sigma) erfolgt, was zu einer lokalen Abscheidung von braunen Kristallen führt. Die Schnitte werden mit Hämatoxilin gegengefärbt, um zellkernhaltige Zellen innerhalb der Schnitte sichtbar zu machen. Vor der Analyse werden die Schnitte dehydratisiert, und die Objektträger werden mit Eukitt (BDH) zu Dauerpräparaten verarbeitet.
Beispiel 10
In-vivo-Analyse einer verstärkten Immunantwort, die durch agonistische Anti-Human-OX40-Rezeptor-Bindungsmoleküle induziert wird.
Um die Kreuzreaktivität der Anti-Human-OX40-Rezeptor-Antikörper mit dem Maus-OX40-Rezeptor zu bestimmen, werden OX40-positive, CVD4-positive T-Zellen aus der Milz mittels Durchflusscytometrie analysiert. Murine OX40-positive T-Zellen werden erzeugt, indem man CD4-positive T-Zellen C57B16 aus der Milz, welche mit Hilfe eines Anti-CD4-Phycoerythrin-Antikörpers (Pharmingen) und mit Anti-Phycoerythrin markierten MACS-Beads (Myltenyi Biotec) isoliert werden, mit einer amitogenen Dosis von PHA und IL2 stimuliert. Die Zellen werden nach 72 Stunden Stimulation mit einem Rattenantikörper gegen den murinen OX40-Rezeptor und mit dem Panel von Anti-Human-OX40-Rezeptor-Antikörpern (siehe oben) analysiert. Für den Fall, dass die agonistischen Anti-Human-OX40-Rezeptor-Antikörper eine Kreuzreaktivität mit dem Maus-OX40-Rezeptor aufweisen, kann der OX40-Rezeptor in vivo mit diesen agonistischen Antikörpern besetzt werden, um die Abgabe eines costimulatorischen Signals an Effektor-T-Zellen nachzuweisen. Um die Wirkung der Bereitstellung eines agonistischen Anti-OX40-Rezeptor-Antikörpers gegenüber T-Zellen während des Tumor-Primings in vivo nachzuweisen, wird ein MCA-303-Sarkomtumormodell in C57BL/6-Mäusen verwendet, wie es von Weinberg et al. (2000) und in WO 99/42585 beschrieben wird. Mäuse werden am Tag 0 subkutan mit 1 – 3·10⁵ MCA-303-Sarkomtumorzellen geimpft. Drei Tage später erhalten die Tiere intraperitoneale Injektionen mit den agonistischen Anti-Human-OX40-Rezeptor-Antikörpern in Dosen, die im Bereich von 100–500 μg pro Tier liegen. Eine zweite Dosis wird 7 Tage nach der Impfung mit dem Tumor gegeben. Dann werden die Tiere über 50 Tage lang in bezug auf Tumorwachstum überwacht, und die Tiere werden getötet, wenn die Tumorgrößen 1 cm³ überschreiten. Wenn Tiere, denen die agonistischen Anti-Human-OX40-Rezeptor-Antikörper gegeben werden, tumorfrei bleiben (oder kleinere Tumoren haben als die Kontrolltiere), während Tiere, die nur die Tumorzellen erhalten, getötet werden müssen, weist dies darauf hin, dass die Besetzung des OX40-Rezeptors durch die agonistischen Anti-Human-OX40-Rezeptor-Antikörper Effektor-T-Zellen costimuliert, so dass sie ihre Tumor-eradizierende Funktion ausüben. Alternativ dazu kann das oben beschrieebne Experiment auch in einem transgenen Mausmodell durchgeführt werden, in dem humaner OX40-Rezeptor unter einem T-Zell-spezifischen Promotor exprimiert wird. Eine solche Maus kann nach Vorschriften, die dem Fachmann auf dem gebiet der transgenen Mausmodelle bekannt sind, geschaffen werden.
Tabelle 1
Literatur

Al-Shamkhani, A., Birkeland, M. L., Puklavec, M., Brown, M. H., James, W., and Barclay, A. N. (1996) OX40 is differentially expressed on activated rat and mouse T cells and is the sole receptor for the OX40 ligand. Eur J Immunol 26: 1695–1699.
Boel E, Verlaan S, Poppelier MJ, Westerdaal NA, Van Strijp JA and Logtenberg T (2000) Functional human monoclonal antibodies of all isotypes constructed from phage display library-derived single-chain Fv antibody fragments. J Immunol Methods 239: 153–166.
Burton DR and Barbas CF (1994) Human antibodies from combinatorial libraries. Adv Immunol 57: 191–280.
Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW and Wingfield PT (eds.) (2001) Current protocols in protein science, volume I. John Wiley & Sons, Inc., New York.
De Kruif J, Terstappen L, Boel E and Logtenberg T (1995a) Rapid selection of cell subpopulation-specific human monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library. Proc Natl Acad Sci USA 92: 3938.
De Kruif J, Boel E and Logtenberg T (1995b) Selection and application of human single chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions. J Mol Biol 248: 97.
Huls G, Heijnen IJ, Cuomo E, van der Linden J, Boel E, van de Winkel J and Logtenberg T (1999) Antitumor immune effector mechanisms recruited by phage display-derived fully human IgG1 and IgA1 monoclonal antibodies. Cancer Res 59: 5778–5784.
Kaleeba, J. A., Offner, H., Vandenbark, A. A., Lublinski, A., and Weinberg, A. D. (1998) The OX-40 receptor provides a potent co-stimulatory signal capable of inducing encephalitogenicity in myelin-specific CD4+ T cells. Int Immunol 10: 453–461.
Kohler G and Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495–497.
Lekkerkerker A and Logtenberg T (1999) Phage antibodies against human dendritic cell populations obtained by flow cytometry-based selection on freshly isolated cells. J Immunol Methods 231: 53–63.
Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Van Kroonenburgh, M. J., and Pauwels, E. K. (1988) Human immunological response to mouse monoclonal antibodies in the treatment or diagnosis of malignant diseases. Nucl Med Commun 9: 919–930.
Weinberg, A. D., Rivera, M. M., Prell, R., Morris, A., Ramstad, T., Vetto, J. T., Urba, W. J., Alvord, G., Bunce, C., and Shields, J. (2000) Engagement of the OX-40 receptor in vivo enhances antitumor immunity. J Immunol 164: 2160–2169.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Agonistisches Bindungsmolekül, das an den humanen OX40-Rezeptor binden und diesen stimulieren kann, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsmolekül ein humanes Bindungsmolekül ist, das eine synergistische stimulatorische Wirkung hat, wenn es mit OX40-Ligand coinkubiert wird, wobei das Bindungsmolekül einen schwere-Kette-CDR3-Bereich umfasst, der die Aminosäuresequenz DRYSQVHYALDY (SEQ ID Nr. 17) oder die Aminosäuresequenz YDNVMGLYWFDY (SEQ ID Nr. 24) umfasst.
Bindungsmolekül gemäß Anspruch 1, wobei das Bindungsmolekül eine schwere Kette umfasst, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 25 oder SEQ ID Nr. 28 umfasst.
Nucleinsäuremolekül, das ein Bindungsmolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert.
Verfahren zur Herstellung eines Bindungsmoleküls gemäß Anspruch 1 oder 2, das die folgenden Schritte umfasst: a) Kultivieren einer Wirtszelle, die eine Nucleinsäure gemäß Anspruch 3 umfasst, unter Bedingungen, die zur Expression des Bindungsmoleküls führen; und b) Gewinnen des exprimierten Bindungsmoleküls.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Bindungsmolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, die weiterhin einen OX40-Liganden umfasst.
Verwendung eines Bindungsmoleküls gemäß Anspruch 1 oder 2 zum Stimulieren von T-Zellen in vitro.
Bindungsmolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5–6 zur Verwendung als Medikament, vorzugsweise für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung einer neoplastischen, viralen oder bakteriellen Störung oder Erkrankung.
Verwendung eines Bindungsmoleküls gemäß Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer neoplastischen, viralen oder bakteriellen Störung oder Erkrankung.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Medikament dem Menschen oder Tier in Kombination mit einem OX40-Liganden verabreicht wird.