DE68920931T2

DE68920931T2 - Rekombinanter natürlicher Killerzellen-Aktivator.

Info

Publication number: DE68920931T2
Application number: DE68920931T
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Hasegawa; Yukio Ohya; Toshiaki Osawa; Toshio Seto; Yasushi Shikata; Isao Tanaka; Kentaro Yoshimatsu
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1988-08-31
Filing date: 1989-08-31
Publication date: 1995-07-06
Anticipated expiration: 2009-09-01
Also published as: FI893833A7; ATE118037T1; EP0357067A3; DK424989D0; FI893833A0; KR900003371A; AU4009789A; US5185431A; EP0357067A2; CA1335360C; DK424989A; NO893452D0; EP0357067B1; NO893452L; DE68920931D1; US5316933A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, das die Aktivität natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) bei der Lyse menschlicher Tumorzellen verstärkt; ein gentechnisches Verfahren, das seine Herstellung betrifft, und ein Arzneimittel, das dieses Peptid als wirksamen Bestandteil enthält. Die vorliegende Erfindung ist deshalb auf dem Arzneimittelgebiet anwendbar.

Stand der Technik

Es war bekannt, daß es natürliche Killerzellen (NK-Zellen) gibt, die auf spezifische Krebszellen eine zerstörerische Wirkung zeigen. Deshalb haben Lymphokine, die die Aktivität dieser NK-Zellen beeinflussen, Beachtung gefunden. Es wird z.B. darüber berichtet, daß Interleukin-2 und Interferon die Aktivität von NK-Zellen erhöhen (R.B. Herberman et al., Immunol. Rev., 44 (1979) 13; B.M. Vose et al., J. Immunol., 130 (1983) 768; W. Domzig et al., J. Immunol. 130 (1983) 1970).
NK-Zellen spielen verschiedene wichtige Rollen als nicht spezifische Wirts-Abwehrsysteme, z.B. als erste Stufe der Abwehr gegen Krebszellen, bei der Unterdrückung der Metastase von Krebszellen, der Widerstandsfähigkeit gegen virale Infektion und Regulierung der Hematopoiesis in Knochenmark (K. Kumagai und K. Ito, Nippon Rinsho, Special Spring Issue 42 (1984) 859).
Die folgenden Tatsachen zeigen, daß NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der Wirtsabwehr gegenüber Krebs spielen. Eine nackte Maus mit einem Mangel an T-Zellen, aber mit einer hohen NK- Aktivität leidet unter Hochfrequenz nicht immer unter einer spontanen oder chemisch induzierten Carcinogenese (J. Rygaard et al., Immunol. Rev. 28 (1975) 43; D. Stutman et al., Science 183 (1974) 534); und die Metastase transplantierter Krebszellen wird in einer beigen Maus mit T-Zellen aber einer kinetisch niedrigen NK-Aktivität gefördert (K. Shimamura und K. Tamaoki, Jikken Igaku 2 (1984) 398; E. James, Talmadge et al., Nature 284 (1980) 622) und in einer Maus mit künstlich verringerter NK-Aktivität (K. Shimamura und K. Tamaoki, Jikken Igaku, 2 (1984) 398).
Sistar et al. berichten darüber, daß aus Maus-Thymocyten ein von Interleukin-2 verschiedenen die NK-Zellenaktivität erhöhender Faktor erzeugt und freigesetzt wird (K. Sitara, O. Ichimura, T. Mitsuno und J. Osawa, Immunol. 134 (1985) 1039).
Einige der Erfinder vermuteten die Gegenwart eines Lymphokins, das zur Aktivierung von NK-Zellen fähig ist, und stellten verschiedene Zellinien von Lymphokin erzeugenden menschlichen T-Zellhybridomas her und zeigten die Gegenwart einiger Lymphokine, wie z.B. eines Makrophagen migrationsinhibierenden Faktors (MIF) und eines Makrophagen aktivierenden Faktors (MAF) (Y. Kobayashi, M. Higuchi und T. Osawa, J. Immunol. 128 (1982) 2714; M. Asada, M. Higuchi, Y. Kobayashi und T. Osawa, Cell. Immunol. 77 (1983) 150; M. Higuchi, M. Asada, Y. Kobayashi und T. Osawa, Cell. Immunol. 78 (1983) 257).
Insbesondere fanden sie, daß ein menschliches T-Zellenhybridoma aus mit Schlüsselloch Nacktschnecken-Hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) behandelten T-Zellen einen vollständig neuen NK- Zellen aktivierenden Faktor erzeugen, der nachfolgend als NKAF abgekürzt wird, und verschieden ist von irgendeinem bekannten Lymphokin, wie in der Japanischen Offenlegunsschrift Nr. 97224/1986 beschrieben. In dieser Erfindung war der erhaltene NKAF ein natürliches Produkt per se und seine Aminosäuresequenz als Peptid war nicht klar spezifiziert.
Um einen NKAF als Arzneimittel in industriellem Maßstab anzuwenden, ist es notwendig, seine Aminosäuresequenz als Peptid aufzuklären und ihn als genetisches Rekombinationsprodukt, das nach einem gentechnischen Verfahren erhalten wird, zu erzeugen.
Die Erfinder haben deshalb versucht, den NKAF, der die Aktivität von NK-Zellen erhöht, zu isolieren und zu identifizieren, um sein Gen zu erhalten.
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, den in der Japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 97224/1986 beschriebenen natürlichen NKAF zu reinigen und seine partielle Aminosäuresequenz zu spezifizieren. Eine zweite Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es, ein spezifisches cDNA-Klon aus einer aus der mRNA des auf der vorstehend erwähnten Sequenz basierenden menschlichen T- Zellhybridomas hergestellten cDNA-Bank auszuwählen um dadurch schließlich ein rekombinantes NKAF-Produkt zu erhalten.
Um diese Ziele zu erreichen, haben die Erfinder als erste Stufe das natürliche NKAF durch Immunoaffinitätssäulenchromatographie gereinigt und die partielle Aminosäuresequenz davon spezifiziert.
Danach wählten sie aus einer von der mRNA des menschlichen T- Zellen-Hybridoma (C-108), das auf der vorstehend spezifizierten Aminosäuresequenz (KR-21) basierte, einen cDNA-Klon aus. Danach wurde die Aminosäuresequenz des NKAF aus der Basensequenz des so erhaltenen cDNA-Klons pNK8308 spezifiziert. Ferner wurde der rekombinante NKAF aufgeklärt und seine Aktivität bestätigt.
Auf diesen Ergebnissen basierend wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Die vorliegende Erfindung wird nun im einzelnen beschrieben.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt einen rekombinanten natürlichen Killerzellen aktivierenden Faktor bereit, der im Peptid die folgende Aminosäuresequenz in seinem Molekül besitzt. Die Erfindung stellt ein cDNA, das für einen rekombinanten natürlichen Killerzellen aktivierenden Faktor codiert, bereit, ein Manifestationsplasmid, das die cDNA umfaßt, einen mit dem Plasmid transformierten Wirt, ein anti-Tumormittel, das den rekombinanten natürlichen Killerzellen aktivierenden Faktor enthält, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine pharmakologisch wirksame Menge des anti-Tumormittels und einen pharmakologisch annehmbaren Träger umfaßt.
Das erfindungsgemäße Endprodukt kann mittels gentechnischer Verfahren hergestellt werden.
Deshalb stellt eine cDNA die den erfindungsgemäßen rekombinanten NKAF codiert, und ein Manifestationsplasmid, das diese cDNA als Fremdgen enthält und erhalten wurde durch Linking auf solche Weise, um die Regulierung und Manifestation eines ausgewählten Wirts zu ermöglichen, wobei beide für die Herstellung des erfindungsgemäßen Endproduktes erforderliche Zwischenprodukte sind, zusammen die vorliegende Erfindung dar weil sie zur Lösung des gleichen Problems beitragen.
Eine bevorzugte cDNA ist die cDNA gemäß Anspruch 3.
Ein mit dem Manifestationsplasmid transformierter Wirt ist ebenfalls, so wie die vorstehend erwähnte cDNA und das Manifestationsplasmid, Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Als Wirt können Escherichia coli, Hefe- und tierische Zellen, wie z.B. BHK-Zellen und CHO-Zellen, verwendet werden.
Ein Beispiel für einen E. coli-Stamm, der die cDNA trägt, ist ein als XL1-Blue/pNK 8308B bezeichneter Stamm, der im Beispiel 1 beschrieben wird. Der Stamm wurde beim Fermentation Research Institute als FERM P-10161 hinterlegt, nun auf die internationale Hinterlegung FERM BP-2468 übertragen.
Der erfindungsgemäße rekombinante NKAF, d.h. das Endprodukt, hat eine anti-Tumor-Wirkung, wie dies in den nachfolgenden Beispielen gezeigt wird.
Ähnlich zum natürlichen NKAF, der als aktiver Bestandteil einer Arzneimittelzusammensetzung verfügbar und medizinisch verwendet wird, kann der erfindungsgemäße rekombinante NKAF als aktiver Bestandteil einer Arzneimittelzusammensetzung verwendet werden, und ist deshalb aufgrund seiner Wirkung für therapeutische Zwecke brauchbar.
In diesem Fall kann die Arzneimittelzusammensetzung auf übliche Weise als intravenöse Injektion formuliert sein.
Die Injektion kann auf diesem Gebiet übliche Weise hergestellt werden durch Formulierung einer geringen Mmenge einer physiologisch wirksamen Substanz zu einer Injektionslösung.
Der erfindungsgemäße rekombinante NKAF kann z.B. in einer wässerigen Lösung entweder allein oder zusammen mit geeigneten Füllern oder Lösungsvermittlern formuliert werden, unter sterilen Bedingungen filtriert werden, und zusammen mit einer wässerigen Lösung zur Auflösung lyophilisiert verpackt werden. Es kann deshalb ein Injektionspräparat, das bei der Verwendung gelöst wird, hergestellt werden.

Verfahren

Nachfolgend wird die Herstellung und Bestimmung des natürlichen NKAF beschrieben.

1. Herstellung des gereinigten natürlichen NKAF:

Um den rekombinanten NKAF herzustellen, werden die Reinigung des natürlichen NKAF und seine Strukturanalyse auf folgende Weise durchgeführt.
Natürlicher NKAF kann aus einem serumfreien Kulturüberstand einer Klon C-108 Linie von natürlichem NKAF-produzierendem menschlichem T-Zellhybridoma KC-8-1-10 (vgl. die Japanische Offenlegungsschrift Nr. 97224/1986) mittels verschiedener Verfahren einschließlich Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden.
Die Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz des so erhaltenen gereinigten NKAF und der Aminosäuresequenz eines gereinigten NKAF-Fragmentpeptids, das durch enzymatische Verdauung desselben mit Trypsin erhalten wurde, erlaubt die Klonierung der cDNA.
Die Wirkung des NKAF zur Erhöhung der NK-Aktivität kann durch Verwendung der Aktivität von nicht an Kunststoff anhaftenden menschlichen peripheren Blutlymphocyten (plastic nonadherent PBLs) bei der Abtötung menschlicher Krebszellinien K-562 Zellen (NK-Aktivität) als Richtlinie bestimmt werden. Eine Probe wird einer Doppelserienverdünnung mit einem RPMI-1640 Medium, das 10 % fötales Kälberserum (10 % FCS-RPMI-1640) enthält, unterworfen. 50-ul-Anteile der verdünnten Proben wurden in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte gebracht. Danach wurden 1 x 10&sup5;/50 ul der plastic nonadherenten PBLs zugegeben und darin bei 37 ºC 16 Stunden lang inkubiert. Dann wurden 1 x 10&sup4;/100 ul einer &sup5;¹Cr- markierten K-562-Zellsuspension dazugegeben und darin bei 37 ºC weitere 4 Stunden inkubiert.
Getrennt davon wurden 100 ul des 10 %-igen FCS-RPMI-1640- Mediums 16 Stunden lang inkubiert und dann 100 ul einer &sup5;¹Cr- markierten K-562-Zellsuspension dazugegeben, gefolgt von einer Inkubierung für weitere 4 Stunden als Kontrolle. Das freigesetzte &sup5;¹Cr in 100 ul der Inkubierung wird bestimmt.
NK-Aktivität (%) =
(b - a)/(c - a) x 100
In der obigen Gleichung stellt b das freigesetzte &sup5;¹Cr (cpm) der Probe dar; a bedeutet das freigesetzte &sup5;¹Cr (cpm) der Kontrolle; und c bedeutet das Gesamt-&sup5;¹Cr (cpm) in 100 ul der Cr-markierten K-562-Zellsuspension (10&sup5;/ml). Die Bestimmung wird dreimal durchgeführt und der Mittelwert berechnet.
Die 50 % des unter diesen Bedingungen maximalen Verstärkungseffektes entsprechende NKAF-Aktivität kann als 1U definiert werden.
Ein Beispiel für die Herstellung des natürlichen NKAF ist das folgende.

(1) Reingung von natürlichem NKAF:

Ein menschliches T-Zellenhybridoma KC8-1-10 C-108-Linie, wurde in einem 10 %-igen FCS-RPMI-1640-Medium in einem 10 l Glaskolben gezüchtet, bis die Zelldichte 1 bis 2 x 10&sup6; Zellen/ml erreichte.
Nach Vervollständigung der Inkubierung wurden die Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und mit RDF-Medium gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in dem RDF-Medium so suspendiert, um eine Dichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml zu ergeben. Die erhaltene Suspension wurde kontinuierlich in einem Glaskolben bei 37 ºC 14 bis 20 Tagen lang inkubiert.
Der Überstand wurde kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 10 l/Tag durch einen frischen ersetzt, und das NKAF wurde aus dem NKAF-enthaltenden Überstand nach dem folgenden Verfahren gereinigt.
200 l des serumfreien Kulturüberstandes wurden durch ein Glasfaser-Filterpapier GF/F, erhältlich von Whatman Inc., filtriert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Das Filtrat wurde über eine mit Sepabeads SP-900, erhältlich von Mitsubishi Chemical Ltd., gefüllte Säule bei einem Gelvolumen von 2 l und einer Fließgeschwindigkeit von 25 l/Stunde eluiert, um hydrophobe Substanzen niedrigen Molekulargewichts, wie z.B. Phenolrot, zu entfernen. Die Eluate wurden gesammelt und die elektrische Leitfähigkeit davon wurde auf die eines 10 mM-Tris- HCl-Puffer (pH = 8), der 0,2 M NaCl enthielt, eingestellt. Dann wurde mit einer DEAE-Sepharosesäule (hergestellt von Pharmacia; Gelvolumen: 2 l), die mit dem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH = 8), der 0,2 M NaCl enthielt, equilibriert war, bei einer Fließgeschwindigkeit von 12 l/Stunde behandelt. Diese Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und dann mit einem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH = 8), der 0,6 M NaCl enthielt, eluiert.
4 l der eluierten Fraktion, die die NKAF-Aktivität zeigte, wurden an einer Ultrafiltrationsmembran (YM-5, hergestellt von Amicon) auf das ca. 1000-fache konzentriert. Die konzentrierte Fraktion wurde dann mit einer Sephadex G-75 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia; 50 (Innendurchmesser) x 900 mm), die mit einer 0,1 M wässerigen Lösung von NH&sub4;HCO&sub3; equilibriert war, bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/Stunde behandelt, um Substanzen mit hohem Molekulargewicht, wie z.B. Nucleinsäuren, zu entfernen. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt. Die vereinigten aktiven Fraktionen (ca. 900 ml) wurden an einer YM-5-Membran auf das ca. 20-fache konzentriert und dann lyophilisiert.
Das so erhaltene Lyophilisat wurde dann in 5 ml einer Mischung aus 0,1 M CH&sub3;COONa-Puffer (pH = 5) mit 0,1 M Na&sub2;SO4-Puffer (pH = 5) (1:1) gelöst.
Die so erhaltene Lösung wurde an einer Phenyl-5PW-RP-Säule zur Fraktionierung (hergestellt von Tosoh, 21,5 x 150 mm) adsorbiert. Dann wurde sie unter Verwendung des Eluents A [0,1 M CH&sub3;COONa-Puffer (pH = 5)/0,1 M Na&sub2;SO4-Puffer (5,0) = 1/1] und Eluents B [Eluent A/CH&sub3;CN = 1/1] eluiert.
Die Elution wurde durchgeführt, indem der Anteil des Eluents B von 0 auf 100 % innerhalb von 3 Stunden linear erhöht wurde, um auf diese Weise den NKAF zu eluieren.
Auf diese Weise wurde während einer Retentionszeit von 100 bis 110 Minuten die Hauptfraktion eluiert, und einige Anteile davon wurden unter den obigen Bedingungen während 110 bis 140 Minuten eluiert.
Durch EIA wurde bestätigt, daß diese aktive Fraktion mit monoklonalen Antikörpern reagiert, was nachfolgend beschrieben wird.
Die während der Retentionszeit von 100 bis 110 Minuten eluierten aktiven Hauptfraktionen wurden lyophilisiert und das partiell gereinigte natürliche NKAF erhalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Figur 1 ist ein Chromatogramm, das das Ergebnis der Reinigung von natürlichem NKAF durch eine monoklonale Antikörper-Säule zeigt.
Figur 2 zeigt den EIA mit 2 monoklonalen Antikörpern.
Figur 3 ist ein Chromatogramm, das das Ergebnis der Reinigung von NKAF durch Umkehrphasen-HPLC zeigt.
Figur 4 zeigt das Ergebnis von SDS-PAGE.
Die Figuren 5 und 6 zeigen jeweils die Aminosäuresequenz einer Peptidkette.
Die Figur 7 zeigt das Ergebnis der Trennung und Isolierung des C-terminalen Peptids.
Die Figur 8 ist die Restriktionsenzym-Kartierung des cDNA- Klons.
Figur 9 zeigt die Basensequenz der cDNA von pNK 8308 und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des NKAF.
Die Figur 10 zeigt das Konstruktionsverfahren von pNK 8602 unter Verwendung von pcD-Vektor.

(2) Herstellung des monoklonalen Antikörpers für natürlichen NKAF und seine Säule:

Das nach dem obigen Verfahren (1) erhaltene partiell gereinigte natürliche NKAF, das als Immunisierungs-Antigen verwendet wurde, wurde mit komplettem Freundschen Adjuvans gemischt, um eine Emulsion zu ergeben. 0,2 ml/Tier dieser Emulsion wurden dreimal an Mäuse verabreicht, um diese Tiere zu immunisieren. Danach wurde der partiell gereinigte natürliche NKAF an Mäuse durch die Schwanzvenen verabreicht und die Milz jedes Tieres wurde 3 Tage später entnommen.
Die so erhaltenen Milzzellen wurden mit Maus-Myelomzellen X63- Ag 8, 6, 5, 3 (Flow Lab.) unter Verwendung von 45 % Polyethylenglykol 3350 (hergestellt von Sigma) fusioniert.
Die fusionierten Zellen wurden dann auf konventionelle Weise (G. Galfre und C. Milstein et al., Methods in Enzymology 73 (1981) 3) gezüchtet.
Dann wurden 2 Typen von Hybridoma-Zellen 19-E-7 und 29-C-8, die einen die NKAF-Aktivität absorbierenden Antikörper produzierten, aufgewählt.
Die erhaltenen Hybridoma-Zellen wurden in die Bauchhöhle von Mäusen transplantiert, denen 0,5 ml-Anteile von Pristan (von Aldrich) eine Woche vorher oder früher intraperitoneal verabreicht wurde, und die in der Bauchhöhle jedes Tieres sich ansammelnde Ascitesflüssigkeit wurde gesammelt.
Beide monoklonalen Antikörper (29-C-8 und 19-E-7) waren IgG&sub1;.
Die erhaltenen monoklonalen Antikörper wurden unter Verwendung von Protein A-Agarose von Repligen gereinigt und mit Bromcyan- aktivierter Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia) umgesetzt, um ein immobilisiertes monoklonales Antikörpergel zu ergeben.

2. Strukturanalyse von hochgereinigtem natürlichem NKAF:

Der in der obigen Stufe 1-(1) erhaltene partiell gereinigte natürliche NKAF (Sephadex G-75-Fraktion) wurde einer Affinitätschromatographie unter Verwendung des wie vorstehend unter (2) hergestellten immobilisierten monoklonalen Antikörpergels unterworfen und die aktive Fraktion gesammelt (vgl. Figur 1).
Das erhaltene Produkt war hochgereinigter natürlicher NKAF mit einer spezifischen Aktivität von 1 x 10&sup5; U/mg Protein.
Die Eigenschaften des Produktes wurden analysiert und die folgenden Ergebnissen erhalten.

(1) Analyse auf Aminosäurezusammensetzung:

Der entsalzte natürliche NKAF wurde durch Trocknen am Boden eines kleinen Reagenzglases zur Hydrolyse verfestigt. Dann wurde dieses Reagenzglas in ein Glasfläschchen gegeben und 500 ul 6 N HCl auf den Boden des Fläschchens gegossen. Danach wurde das Material zusammen mit dem Fläschchen evakuiert und mit Chlorwasserstoffsäure bei 110 ºC 24 Stunden lang hydrolysiert. Das so erhaltene NKAF-Hydrolysat wurde mit einem Aminosäureanalysator 6300 von Beckman Systems analysiert.
Die Tabelle zeigt die Ergebnisse. Tabelle 1: Aminosäureanalyse Gefunden Berechnet

(2) Analyse auf Zuckerzusammensetzung.

Der mittels der Orcin-Schwefelsäure-Methode bestimmte neutrale Zuckergehalt des erhaltenen natürlichen NKAF betrug ca. 120 ug/mg Protein. Der durch die Carbazol-Schwefelsäuremethode bestimmte darin vorhandene Gehalt an Uronsäure betrug ca. 300 ug/mg Protein.
Danach wurde die Zuckerzusammensetzung des natürlichen NKAF analysiert. Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
Auf diese Weise wurde bestätigt, daß der erhaltene natürliche NKAF ein Glycoprotein war, das eine große Menge an Zuckerketten von O-Glycosidtyp (Mucopolysaccharide und Zuckerketten vom Mucintyp) enthielt. Tabelle 2: Zuckerzusammensetzung Zucker Gehalt (ug/mg Protein) N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin Mannose Galactose Sialinsäure

(3) Bestimmung des NKAF durch EIA

Ein Loch wurde mit einem der zwei monoklonalen Antikörpern, 29- C-8, beschichtet und gewaschen. Dann wurde das NKAF dazugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang reagieren gelassen. Danach wurde ein anderer monoklonaler Antikörper, 19-E-7, der biotinisiert wurde, dazugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur eine Stunde lang reagieren gelassen. Nach dem Waschen wurde noch Avidin-Peroxidase dazugegeben und die erhaltene Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten reagieren gelassen. Nach dem Waschen wurde eine Lösung von o- Phenylendiamin, d.h. dem Substrat, zugegeben. Bei Raumtemperatur entwickelte sich eine Färbung. 15 Minuten danach wurde die Reaktion mit 1 N HCl beendet und die Extinktion (OD&sub4;&sub9;&sub2;) gemessen. Die Figur 2 zeigt die so erhaltene Eichkurve.

(4) Entfernung der Zuckerketten:

Da NKAF eine Anzahl von Zuckern enthielt, wurde die Entfernung der Zuckerketten durch Aminosäuresequenzierung untersucht.
Die Analyse wurde mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese) und Western-Immunoblot durchgeführt. Präziser ausgedrückt wurde der entsalzte und gereinigte NKAF mit Sialidase, O-Glycanase, Chondroitinase und Heparitinase behandelt und mittels SDS-PAGE geprüft, ob dadurch Zuckerketten geschnitten wurden oder nicht.
Vor und nach der Behandlung mit Heparitinase wurde keine Veränderung beobachtet. Das Molekulargewicht der Hauptbande des NKAF wurde durch Behandlung mit Sialidase oder O-Glycanase erniedrigt, woher die Verschmierung nicht verschwand. Bei Verwendung von Chondroitinase verschwand die Verschmierung und bei 35 KD wurde eine Hauptbande beobachtet. Durch Western- Immunoblot wurde bestätigt, daß diese Bande mit dem anti-NKAF- monoklonalen Antikörper und dem Kanninchen-anti-NKAF-Antikörper reagiert. Nach Behandlung mit Chondroitinase blieb die Aktivität erhalten.
Der entsalzte und gereinigte NKAF wurde einer reduktiven Carboxamidomethylierung unterworfen und in 100 ml mM Tris-HCl- Puffer (pH = 8), der 0,5 U Chondroitinase und 30 mM CH&sub3;CHOONa enthielt, gelöst. Er wurde dann bei 37 ºC 60 Minuten lang reagieren gelassen, um auf diese Weise die Chondroitinsulfatkette zu schneiden.
Die Reaktionsmischung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac C4-Säule und eines 0,1 % TFA (Trifluoressigsäure)/CH&sub3;CH-Systems als Lösungsmittel gereinigt, wobei der Anteil an CH&sub3;CN innerhalb von 30 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/min von 0 auf 100 % geändert wurde (vgl. Figur 3).
Wenn die Fraktion 1 und Fraktion 2 des Chromatogramms der Figur 3 einer SDS-PAGE unterworfen wurden, zeigte die Fraktion 1 eine Monobande bei 35 RD, während die Fraktion 2 eine verschmierte Bande, die 35 KD überschritt, zeigte (vgl. Figur 4). Die Fraktion 2 wurde in 50 mM Tris-HCl (pH = 9), der 6 M Guanidinhydrochlorid enthielt, gelöst und einer Umkehrphasen- HPLC unterworfen. Als Ergebnis wanderte die Fraktion 2 gegen Fraktion 1, was darauf hinweist, daß die Fraktion 2 ein Aggregationsprodukt der Fraktion 1 war.

(5) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz:

Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung der Fraktion 1 der Figur 3 analysiert. Auf diese Weise wurden 28 N- terminale Reste, beginnend von Leucin, wie folgt spezifiziert.
Leu-His-Leu-Arg-Ser-Glu-Thr-XXX-XXX-Phe-Glu- XXX-Pro-Leu-Gly-Ala-Lys-Thr-Leu-Pro-Glu-Asp- Glu-Glu-Thr-Pro-Glu-Gln.
An den 8., 9. und 12. Resten zeigte sich keine Aminosäure. Diese wurde deshalb als Ser oder Thr an, die eine Zuckerkette vom O-Glycosidtyp gebunden war, angenommen.

(6) Peptidkartierung von enzymatisch mit Trypsin verdautem natürlichem NKAF.

Fraktion 1 von Figur 3 wurde in 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat (pH = 8), das 2 M Harnstoff enthielt, gelöst, und Trypsin dazugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei 37 ºC 16 Stunden lang reagieren gelassen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac C4-Säule und eines Lösungsmittelsystems aus 0,1 % TFA/CH&sub3;CN gereinigt, wobei der Anteil des CH&sub3;CN innerhalb einer Stunde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute von 0 auf 60 % geändert wurde.
Die Aminosäurezusammensetzung und Aminosäuresequenzen der so erhaltenen 21 Peptidfragmente wurden analysiert (vgl. Tabelle 3). Tabelle 3: Aminosäuresequenz der mit Trypsin verdauten Peptide
Alle Aminosäuresequenzen der analysierten Peptidfragmente wurden an den cDNA-Sequenzen des rekombinanten NKAF identifiziert, was nachfolgend beschrieben wird (vgl. Figur 5 und 6).

(7) C-terminale Aminosäuresequenz:

Die tryptischen Peptide wurden durch eine Anhydrotrypsin- Agarose-Säule, die mit 0,05 M Natriumcarbonat (pH = 5), das 0,02 M Calciumchlorid enthielt, equilibriert war, hindurchgeführt und nicht absorbierte Fraktionen gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden einer Umkehrphasen-HPLC unter den obigen Bedingungen unterworfen, um auf diese Weise das C- terminale Peptidfragment abzutrennen (vgl. Figur 7).
Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse wurde die Aminosäuresequenz dieses Peptidfragmentes bestimmt als Arg-Leu- Pro-Phe-Ile-Cys-Ser-Tyr, was mit der Aminosäuresequenz von KR- 17 übereinstimmte.

Beispiele

Auf der Basis der wie oben beschriebenen Aminosäuresequenz der Trypsin-hydrolysierten Fragmente der gereinigten Proben von natürlichem NKAF wurde die Basensequenz der mRNA, die für den NKAF kodiert, veranschlagt und ein entsprechendes DNA-Oligomer synthetisiert. Danach wurde ein cDNA-Klon mit einer Sequenz, die für den NKAF codiert, durch Screenen mittels Hybridizierung einer cDNA-Bank aus der mRNA von C-108 Zellen unter Verwendung des vorstehend erwähnten Oligomers als Sonde ausgewählt.
Um die Erfindung weiter zu veranschaulichen, werden die folgenden Beispiele angegeben.

Beispiel 1

(1) Isolierung von mRNA:

1,2 x 10&sup9; Zellen von KC-8-1-10 C-108 Linie, die mit 4 ul/ml Pole Weed Mitogen, PWM von GIBCO, in RPMI-1640-Medium 8 Stunden lang stimuliert worden waren, wurden gesammelt und daraus RNA durch ein von Chrigwin et al. (Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979) 5294) beschriebenes Verfahren extrahiert.
3 Volumenteile des Extraktes wurden dann über 1 Volumenteil einer 5,7 M CsCl-0,1 M EDTA-Lösung überschichtet und bei 26000 rpm bei 25 ºC 36 Stunden lang mit einer Ultrazentrifuge (SRP 28 SA Roter; hergestellt von Hitachi) zentrifugiert. Auf diese Weise wurde die angestrebte RNA in Form von Pellets erhalten.
Die so erhaltene RNA wurde in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH = 7,4) gelöst und Ethanol zugegeben. Die erhaltene Mischung wurde bei -70 ºC eine Stunde lang stehen gelassen. Die RNA wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und dann in 10 mM Tris-HCl (pH = 7,4) gelöst. Dann wurden 0,5 M KCl dazugegeben.
Die erhaltene Mischung wurde auf eine Oligo-(dT)Cellulosesäule (20 mm x 150 mm) die mit dem gleichen Puffer equilibriert war, aufgebracht. Nach sorgfältigem Waschen mit 0,5 M KCl und 10 mM Tris-HCl wurde die mRNA mit einer 10 mM wässerigen Lösung von Tris-HCl eluiert.
500 ug der aus den C-108-Zellen stammenden mRNA wurden auf 15 ml einer Lösung, die einen Sucrose-Konzentrationsgradienten von 10 % bis 28 % in 50 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4, 0,2 m NaCl und 1 mM EDTA enthielt, aufgeschichtet. Die resultierende Mischung wurde bei 26000 upm und bei 20 ºC 16 Stunden lang in einer Ultrazentifuge (SRP 28 Roter; hergestellt von Hitachi) zentrifugiert.
Die erhaltene Mischung wurde in 500 ul Anteilen fraktioniert und zu jeder Fraktion Ethanol zugegeben, wodurch die mRNA ausgefällt wurde.
Die mRNA jeder Fraktion wurde in sterilisiertem Wasser auf solche Weise gelöst, um eine mRNA-Konzentration von 1 ug/ml zu ergeben.
Die mRNA einer Größe von ca. 2 bis 0,5 kb enthaltenen Fraktionen wurden gesammelt und der nachfolgenden Reaktion zur Synthese der cDNA unterworfen.

(2) Bildung der cDNA-Bank:

Die cDNA wurde gemäß einer von U.Gubler et al. (U. Gubler et al., Gene 25 (1983) 263) beschriebenen Methode synthetisiert.
D.h. es wurde 1 ug der gereinigten mRNA mit einem Amersham cDNA-Synthesekit (Code Nr. RPN 12560 von Amersham) behandelt.
Die doppelsträngige cDNA wurde durch eine Sepharose CL-6B-Säule geleitet und unter Verwendung einer Modifikatorenzym EcoRI- Methylase methyliert. Zu der so methylierten cDNA wurde EcoRI - Linker (pGGAATTCC) angebunden. Danach wurde das Material mit EcoRI geschnitten, um ein EcoRI-cohesives Ende zu ergeben. Diese cDNA wurde durch eine Sepharose CL-6B-Säule geführt, um den überschüssigen EcoRI-Linker zu entfernen.
Die so gereinigte cDNA wurde an γ-gt 11 angebunden, das mit EcoRI geschnitten wurde, und mit Phosphatase bei einem Molverhältnis von 0,8:1 behandelt, und in Phagenteilchen gepackt. Auf diese Weise wurde eine cDNA-Bank, die 8 x 10&sup6; bis 1,4 x 10&sup7;-Klone umfaßte, erhalten.
Dieser Phage wurde auf 10 Platten eines Durchmessers von 15 cm aufgeschichtet und darauf wachsen gelassen. Auf diese Weise wurden 160 ml einer Phagenlösung einer Konzentration von 10¹¹ pfu/ml erhalten.
Ca. 90 % der Klone der Bank wiesen Insertionen auf. Acht Klone, die statistisch aus den 10 Klonen ausgewählt wurden, wiesen Insertionen von 300 bp bis 2 kbp auf. Die durchschnittliche Größe dieser Insertionen betrug 1,2 kbp.

(3) Herstellung der DNA-Sonde:

Eine Sonde, die den ersten 12 Resten im Bereich von Trypthophan bis Tryptophan der Aminosäuresequenz des Trypsin-hydrolysierten Fragments KR-21 (W-N-F-A-Y-X-A-A-H-Q-P-W-S-R) des natürlichen NKAF entsprach, wurde hergestellt.
Der nicht identifizierte Rest X der obigen Sequenz wurde versuchsweise als Ser angenommen. Wenn eine Zuckerkette an diesen Rest gebunden wurde, sollte dieser Ser oder Thr sein. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung zeigte jedoch, daß diese Sequenz kein Thr umfaßte. Deshalb wurde eine Sonde unter der Annahme, daß der Rest Ser ist, hergestellt.
Auf der anderen Seite wurde die Sequenz der für KR-21 codierenden mRNA unter Bezugnahme auf Untersuchungen zur Frequenz der Verwendung menschlicher genetischer Codons (R. Lathe, J. Mol. Biol. 183 (1985) 1) veranschlagt und eine DNA- Hybridisierungssonde PKR-21, die 36 damit komplementäre Nukleotide umfaßte, entworfen.
Die Sequenz von PKR-21 war die folgende:
5'CCATGGCTGGTGGGGCAGCAGAGTAGGCAAAGTTCCA3'
Sie wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (hergestellt von Applied Biosystems) synthetisiert. Diese Sonde war am 5'-Ende mit gamma-³²P-ATP und T4 Polynukleotidkinase auf übliche Weise markiert.

(4) Identifizierung der cDNA-Klone, die die für NKAF codierende Sequenz enthalten:

Ca. 160000 rekominante Phagen wurden für die gamma-gt 11 cDNA- Bank durch das DNA-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der ³²P-markierten PKR-21-Sonde gescreent.
10 rechteckige Platten (10 x 14 cm) wurden mit rekombinanten Phagen beschichtet, und zwar mit ca. 16000 Plaques auf jeder Platte. Diese Plaques wurde auf übliche Weise (T. Mariatis et al., "Molecular Cloning", Seiten 320 bis 321, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) auf Nitrocelulosemembranen überführt, um die DNA dadurch zu denaturieren und zu immobilisieren.
Diese Membranen wurden in 6 x SSC (1 x SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat (pH = 7)), 50 mM Natriumphosphat (pH = 7), 5 x Denhardt's (100 x Denhardt's = 2 % Rinderserumalbumin, 2 % Polyvinylpyrrolidon, 2 % Ficoll) und 100 mg pro ml Kälberthymus DNA bei 58 ºC 2 Stunden lang pre-hybridisiert.
Danach wurden sie mit der ³²P-markierten PKR-21-Sonde in 6 x SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH = 7) und 5 x Denhardt's bei 58 ºC ca. 12 Stunden lang hybridisiert und mit 6 x SSC-50 mM Natriumphosphat bei Raumtemperatur während 10 Minuten zweimal, und bei 58 ºC während 30 Minuten zweimal und bei 65 ºC während 45 Minuten einmal gewaschen. Die zur Hybridisierung mit pKR-21 fähigen Klone wurden durch Autoradiographie bestimmt.
Als Ergebnis wurden ca. 30 Plaques getrennt mit dem PKR-21 hybridisiert. Aus den vorstehend genannten wurden aus 4 Klonen mit EcoRI cDNAs geschnitten und in einem Plasmidvektor pBluescript Ks, M13+ (hergestellt von Stratagene) subkloniert,um auf diese Weise pNK 8302, pNK 8303, pNK8306 und pNK 8308 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute als FERM P-10161, nun auf die vorstehend genannte internationale Hinterlegung übertragen) zu ergeben.
Die Basensequenzen dieser cDNA-Insertionen wurden teilweise durch das Verfahren der Dideoxy-Kettenterminierung (A. Smith, Method in Enzymol., 65, 560; F. Sanger et al., Proc. Acad. Sci. 74 (1977) 5463) bestimmt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß alle von Ihnen cDNAs waren, die verschiedene Längen besaßen, die Sequenzen umfaßten, die die Aminosäuresequenz von NKAF codieren. Figur 8 zeigt ihre Restriktionsenzym-Kartierung.
Unter diesen cDNAs hatte die längste (pNK 8308) eine Sequenz von 850 bp, ausgenommen Poly (A), in welcher ein offener Leserahmen (ORF) (666 bp), beginnnend bei einem Initiatorcodon und kontinuierlich 222 Aminosäurereste kodierend beobachtet wurde (vgl. Figur 9). In diesem ORF wurde die Peptidsequenz des KR-21 als Fragment im Bereich von ¹&sup6;&sup4;W bis ¹&sup7;&sup7;R identifiziert. Der nicht-identifizierte Rest X in KR-21 war aber nicht S sondern W.
Auf diesem ORF wurden andere Trypsin-hydrolysierte Peptidsequenzen alle identifiziert, was bestätigte, daß diese cDNA aus der für NKAF kodierenden mRNA stammt.
Es war bekannt, daß die N-terminale Aminosäuresequenz der gereinigten NKAF-Probe ¹L-²H-²L-&sup4;R .... war, und es wurde außerdem angenommen, daß das durch die cDNA pNK 8308 kodierte Polypeptid eine hohe hydrophobe zusätzliche Sequenz aus 16 Resten vor der N-terminalen Sequenz besitzt.
Dies könnte eine Signalsequenz zur Sekretion des NKAF aus Zellen sein, geschnitten an der Sekretion, um dadurch ausgereiften NKAF aus ¹L zu ergeben.

Beispiel 2:

Manifestation von cDNA mit COS7-Zellen:

Der pCD-Vektor stammt aus Replikation und dem frühen Promotor von SV 40-Virus. Vgl. H. Okayama und P. Berg, Mol. Cell. Biol. 3 (1983) 280. Wenn die cDNA in den flußaufwärtigen Teil des Promotors integriert wird und in einen Zellstamm COS7 eingeführt wird, wie von Y. Glutzman, Cell. 231 (1981) 75 beschrieben, der das T-Antigen von SV40 produziert, wird das rekombinante Plasmid amplifiziert, wodurch eine intensive transiente Manifestation der cDNA induziert wird.
Ein Bgl II-Xho I Fragment, das die gesamte Codierungsregion von NKAF cDNA umfaßt, wurde aus dem Klon pNK 8308 B der vollen Länge herausgeschnitten und an den mit Xho I und Hind III gespaltenen pcDVl Vektor angefügt, zusammen mit einem Hind 111-Bam H I Fragment von pLl, um auf diese Weise pNK 8602 zu bilden. Siehe Figur 10. Vgl. H. Okayama und P. Berg., Mol. Cell. Biol., 3 (1980) 280.
Die cDNA wurde in den flußabwärtigen Teil des Promotors in der korrekten Orientierung integriert.
Die Plasmid-DNA von pNK 8602 wurde hergestellt und in COS7- Zellen mittels der DEAE-Dextranmethode [T. Yokohama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 68] transferiert. Die so transferierten Zellen produzierten im Kulturüberstand ca. einen Tag nach Transfektion NKAF und setzten die Produktion während ca. 5 Tagen fort. Siehe Tabelle 4. Tabelle 4 Gehalt (ug) von pNK 8602 DNA pro 9,6 cm²-Loch Tag Anmerkung: Bestimmt durch EIA unter Verwendung von 2 monoklonalen Antikörpern
In der vorstehenden Bestimmung wurde entweder DMEM-Medium, das 5 % FCS enthielt, oder serumfreies HL-1-Medium verwendet. Siehe Tabelle 5. Tabelle 5: NKAF in Kulturüberstand von COS7-Zellen, transferiert mit pNK 8602 (6 Tage lang inkubiert) Medium Gehalt an pNK 8602 DNA (ug) Anmerkung: Bestimmt durch EIA unter Verwendung von 2 monoklonalen Antikörpern.

Beispiel 3

Manifestation von NKAF in Säugetierzellinien:

MTX(Methotrexat)-resistente Klone wurden durch Co-Transfektion des im Beispiel 1 erhaltenen pNK 8602 und pSV2-dhfr (S. Subramani, R. Mulligan, P. Berg, Mol. Cell. Biol. 1 (1981) 854) in BHK-Zellen (ATCC, CRL 1632 tKts13, Dainippon Seiyaku) entweder nach der Methode der Elektroporation (Bio-Rad, Gene Pulser , 0,4 kV/o,4cm, 500 uF, 10-15 msec, zweimal) oder der Calciumphosphatmethode (Pharmacia, Cell Phect ) und nachfolgende Selektion mit 250 mM Methotrexat erhalten.
Diese Klone produzierten ca. 100 bis 1000 ng/ml rNKAF im Medium (vgl. Tabelle 6).
Ferner wurden G418-resistente Klone durch Co-Transfektion von pNK 8602 zusammen mit pSV2-dhfr und pSV2-neo (P.J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Gent., 1 (1982) 327) auf CHO-Kl-Zellen nach der Calciumphosphatmethode (F.T. Kao und T.T. Puck, Proc. Natl. Acad. Sci. 60 (1981) 1275) und nachfolgende Selektion mit 1 mg/ml G-418 erhalten. Die erhaltenen Klone wurden ferner in einem Medium, das 5 uM MTX enthielt, kultiviert, und ergaben Klone, die dazu fähig waren, ca. 30 bis 400 ng/ml rNKAF zu produzieren (vgl. Tabelle 7). Tabelle 6: NKAF in BHK/pNK 8602.pSV&sub2;-dhfr-Klonüberstand Tabelle 7: NKAF in CHO/pNK 8602.pSV&sub2;-dhfr.pSV&sub2;- neo-Klonüberstand Klon aus BHK Anmerkung: Bestimmt durch EIA Klon aus CHO
Um die erfindungsgemäßen Wirkungen zu veranschaulichen, werden die folgenden Testbeispiele angegeben.

Testbeispiel 1

1. Antitumor-Aktivität von natürlichem NKAF.

Nicht an Kunststoff gebundene PBLs (plastic nonadherent PBLs) und NKAF wurden zu 10 % FCS-RPMI-1640 Medium hinzugegeben und darin bei 37 ºC 2,5 Stunden und 16 Stunden lang inkubiert. Dann wurde die cytotoxische Aktivität gegen &sup5;¹Cr-markierte K-562, Molt-4 oder Daudi-Zellen bestimmt, um auf diese Weise die die NK-Aktivität erhöhende Wirkung des NKAF zu ermitteln. Die Tabellen 8 und 9 zeigen die Ergebnissen, worin die Kontrolle mit 100 % angenommen wurde. Tabelle 8 Die die NK-Aktivität erhöhende Wirkung von natürlichem NKAF Beispiel 1 Beispiel 2 Zielzelle Kontrole Natürliches NKAF Anmerkung: Die NK-Aktivität der Kontrolle wurde mit 100% angenommen Beispiel 1: NK-Aktivität der Kontrolle: 67% Beispiel 2: NK-Aktivität der Kontrolle: 40% Tabelle 9 NK-Aktivität von natürlichem NKAF auf verschiedenen Zielzellen Zielzelle Inkubationszeit Kontrole Natürlicher NKAF
Aus den Tabellen 8 und 9 ist es ersichtlich, daß der natürliche NKAF eine die NK-Aktivität erhöhende Wirkung zeigte, die mit der von rekombinantem Inerleukin-2 (r-IL-2; hergestellt von Shionogi) und Interferon-γ (IFN-γ; hergestellt von Cellular Products Inc.) vergleichbar war.
An Kunststoff nicht anhaftende PBLs (plastic nonadherent PBLs) wurden mit Raji-Zellen vermischt, die mit Mitomycin C behandelt wurden, und in einem 10 % FCS-RPMI-1640-Medium bei 37 ºC 6 Tage lang inkubiert. Dann wurde NKAF zugegeben und die Inkubation für einen weiteren Tag fortgesetzt. &sup5;¹Cr-markierte Raji-Zellen wurden dann dazugegeben und die Inkubation 4 Stunden lang durchgeführt. Dann wurden 100 ul des Überstandes gesammelt und davon die &sup5;¹Cr-Radioaktivität gemessen, um auf diese Weise die durch die MLTR (mixed lymphocyte tumor cell reaction) induzierte Aktivität der Killer T Zellen zu prüfen. Die Tabelle 10 zeigt die Ergebnisse.
Es wurde gefunden, daß NKAF die Aktivität von durch MLTR induzierte Killer T Zellen erhöhen konnte. Tabelle 10 Aktivität der Killer T Zellen (%) Kontrolle Natürlicher NKAF

Testbeispiel 2

Antitumor-Aktivität des rekombinanten NKAF

Die NKAF-Aktivität des BJK/pNK 8602.pSV&sub2;-dhfr-Klonüberstandes wurde auf der Basis der Erhöhung der NK-Zellenaktivität unter Verwendung von menschlichen Krebszellen vom Zellstamm K-562 als Zielzellen bestimmt. Die Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse.
Die erhöhende Wirkung wurde bestimmt unter der Annahme, daß die NK-Aktivität der Kontrolle 100 % beträgt. Die Tabelle 12 zeigt die Ergebnisse.
Die Wirkungen des rekombinanten NKAF waren somit fast vergleichbar mit denen von natürlichem NKAF. Tabelle 11: NKAF-Aktivität des BHK/pNK 8602.pSV&sub2;-dhfr-Klonüberstands Tabelle 12: NK-Aktivität von BHK/pNK 8602.pSV2-dhfr- Klonüberstand (Zielzellen: K-562) Klon aus BHK-Zellen NKAF-Aktivität (U/ml) BHK-Zell-Klon Verdünnung des Klonüberstandes (-fach) Kontrolle Anmerkung: Die NK-Aktivität der Kontrolle wurde mit 100 % angenommen.

Beispiel 4: Der NKAF-Patentanmeldung angefügtes Beispiel (NKAF-Expression in Escherichia coli)

1. Herstellung des Expressionsplasmids

Der DNA kodierende ausgereifte NKAF wurde hergestellt durch Entfernen des Signalsequenz von NKAF cDNA und wurde zwischen den PL Promotor von Bakteriophage und rrnB-Terminator von E.coli eingefügt. Diese Expressionseinheit wurde mit dem Vektor pBR322 d-rop verknüpft, der eine große Zahl von Kopien stabil aufrecht erhielt, um einen Expressionsvektor pNK8001 zu konstruieren.

(1) Konstruktion von pBRD5001 (Fig. 11)

pBRD5001 wird erhalten durch Ersatz des Vektoranteils des Lymphotoxinexpressionsplasmids pTT5001 (Japanische Patentanmeldung 272031/1987) durch pBR322 d-rop (Japanische Patentanmeldung 272034/1987), wobei erwartet wird, daß er eine große Zahl von Kopien des Plasmids stabil aufrechterhält. Diese Expressionsvektor besaß den von pKK233-2 (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals Co.) abgeleiteten trc-Promotor und rrnB-Terminator.

(2) Konstruktion von pPL9-5001 (Fig. 12)

PPL9-5001 wurde aus pBRD5001 konstruiert, indem der Promotor durch PL-Promotor von Bakteriophage. pPL (hergestellt von Pharmacia Fine Chemical Co.), der mit EcoRI und HpaI gespalten wurde, ersetzt wurde, um ein ca. 470 bp-Fragment, das den PL- Promotor enthielt, zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit Hae III gespalten, um ein ca. 265 bp-Fragment zu erhalten, und das Fragment wurde zusammen mit dem DNA-Fragment der folgenden synthetischen SD-Sequenz
mit durch EcoRI-BglII gespaltenem pUG131-Plasmid (das Plasmid wurde erhalten durch Ersatz des Polylinkers von pUC13 (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals Co.) für den Polylinker M13 tg131 (hergestellt von Amercham Co.) (Japanische Patentanmeldung 272034/1987)) verknüpft, um die pPL9 zu erzeugen. pBRD5001 wurde mit EcoRI und BglII gespalten, um ein ca. 300 bp-Fragment, das trc-Promotor enthielt, zu entfernen, und das Fragment (PL Promotor + SD) von ca. 280 bp, das durch Spaltung von pPL9 mit EcoRI hergestellt wurde, wurde eingefügt, um pPL9-5001 zu bilden.

(3) Konstruktion von pBRD702 (Figuren 13 und 14)

Die Nukleotidsequenz CATATA, die His Leu von NKAF cDNA kodiert, wurde mittels in vitro Mutagenese in CATCTA überführt. Durch die Mutation wurde eine neue Spaltstelle für AflII eingeführt.
Diese NKAF cDNA-Variante wurde mit Afl lI ausgeschnitten um das NKAF-Fragment ohne Signalsequenz zu ergeben. Ein synthetischer DNA-Linker mit einem Bgl II-kohesiven Ende und einem Initiatorcodon, gefolgt durch eine für Leu His codierende Sequenz, wurde flußaufwärts vom NKAF cDNA-Fragment eingefügt und mit dem Vektorfragment (Bgl II - SalI) von pEH7084 verknüpft (Japanische Patentanmeldung 253302/1988), wobei pENK702 gebildet wurde (Fig. 13). In dieses Plasmid wurde die für den ausgereiften NKAF codierende cDNA flußabwärts von trc- Promotor von pENK702 via Bgl II-Stelle verbunden. Ein Bgl II - Pvul-Vektorfragment von pBRD5001 und ein Bgl II-Pvul NKAF cDNA- Fragment von pENK702 wurde dann damit verbunden, um pBRD702 zu ergeben (Fig. 14.).

(4) Konstruktion von pNK8001 (Fig. 15)

pPL9-5001, gespalten mit BglII und dann partiell gespalten mit Hind III, wurde durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt, um ein Vektorfragment zu isolieren, das Promotor und Terminator enthielt. Auf der anderen Seite wurde pBRD702 mit Bgl II und Hind III gespalten, um das NKAF cDNA-Fragment zu isolieren, das mit dem vorstehenden Vektorfragment verknüpft wurde, um pNK8001 zu ergeben. Dies ergab das Expressionsplasmid, in dem der PL- Promotor, die ausgereifte NKAF cDNA und rrnB-Terminator an den pBR322 d-rop-Vektor gebunden ist. Die folgenden Expressionsexperimente wurden unter Verwendung von pNK8001 durchgeführt.

2. NKAF-Expression in E.coli

Eine E.coli-Stamm, N4840 CI857 besaß einen Temperatur empfindlichen Mutationsrepressor, und die Induktion des PL- Promotors wird durch Hochtemperaturverschiebung erreicht.
pNK8001 und sein equivalentes Lymphotoxin-Expressionsplasmid pPL9-5001 wurden via Transformation in den Stamm N4840 eingeführt, um bei 30 ºC Ampicilen-resistente Transformanden zu ergeben. Der Transformand jedes Plasmids wurde durch Schütteln in LB-Medium bei 32 ºC gezüchtet, bis die OD&sub6;&sub0;&sub0; des Mediums ca. 0,2 (Zeit 0) erreichte. Dann wurde die Temperatur auf 42 ºC verschoben und die Kultur fortgesetzt. Nach der Verschiebung wurde das Kulturmedium bei jedem festgelegten Zeitabschnitt entnommen und der Analyse unterzogen.
Die den 10 OD&sub6;&sub0;&sub0; (im Falle von OD-1 wurden 10 ml des Kulturmediums durch Zentrifugieren gewonnen und resuspendiert in 0,4 ml des aufbrechenden Puffers (0,2 M Tris mit einem pH- Wert von 7,6, 0,2 M NaCl, 0,01 M Mg-Acetat, 0,01 M 2- Mercaptoethanol, 5 % Glycerin))-Zellen equivalenten Bakterienzellen wurden durch Beschallung aufgebrochen und das Homogenisat wurde zur Entfernung von Zelltrümmern zentrifugiert. Die Konzentration an NKAF im Zellextrakt wurde durch EIA unter Verwendung von Kaninchen-anti-nativem NKAF- Antikörper (Tabelle 13) bestimmt. Die Produktion von NKAF wurde nur im Transformanden, der pNK8001 besaß, beobachtet, und seine Expression wurde durch Temperaturverschiebung induziert. Die Produktion erreichte ein Maximum bei 3 bis 5 Stunden nach der Verschiebung. Tabelle 13:NKAF-Expression in E.coli N 4840 Zeit nach Temperaturverschiebung Plasmid
Der Bakterienextrakt wurde einem EIA unter Verwendung von Kaninchen-anti-nativem NKAF-Antikörper unterworfen. 1 ml des Bakterienextrakts entsprach 25 OD&sub6;&sub0;&sub0; Bakterienzellen.

Beispiel 5

(1) Herstellung eines sekretorischen (sekretiven) Expressionsvektors

Eine ausgereiften NKAF codierende DNA wurde hergestellt durch Entfernen der Signalsequenz aus NKAF cDNA,und wurde flußabwärts von der GAL7 Promotor alpha-prepro Signalfrequenz eingefügt. Sie wurde mit YEp13 mit einem Kopierursprung bei 2 um verbunden und der sekretorische Expressionsvektor pYNK1902 erhalten.

(1-1) pTN1071

Das in Figur 16 gezeigte pTN1071 wies eine solche Struktur auf, das GAL7-Promotor, beschrieben in der Japanischen Patentveröffentlichung A 60-248181, synthetisches OLIGO#01 und alpha-prepro Signalsequenz, beschrieben in Herskowitz et al., Cell 30 (1982) 933-943, in pUC12 eingefügt sind. Der Vektor besaß ein Startcodon ATG an der gleichen Stelle wie GAL7 und aus diesem Grund wird eine größere Menge an Trasfer erwartet.

(1-2) pYNK1902 (Fig. 17)

Ein HindIII-BgIII Fragment von pTN1071 und ein BgIII-XbaI- Fragment von pNK8308 wurden in HindIII, XbaI-Stelle des bei Messing et al, Gene 33 (1985) 103-119 beschriebenen M13 pM1901 eingefügt, um pM1901 zu erhalten. Es wurde ein in vitro- Mutagenese durchgeführt unter Verwendung des Phagen für einen Ausguß (Casting Master) und synthetischem OLIOGO#02, um pM1902 so zu erhalten, daß die für ein ausgereiftes Protein von NKAF codierende DNA gleich nach der alpha-prepro-Signalfrequenz zugefügt wurde und zur gleichen Zeit ohne Veränderung der Sequenz der Aminosäuren eine AflII-Stelle eingeführt wurde. pM1902 wurde mit BamHI in Fragmente geschnitten. Das Fragment wurde in YEp13 an der BamHI-Stelle eingeführt, um pYNK 1902 zu ergeben. Dieses Plasmid besaß einen GAL7 Promotor und aus diesem Grund wird erwartet, daß es eine hohe Transferexpression nur dann zeigt, wenn eine Kultur keine Glucose, sondern Galactose enthält. Es wird auch erwartet, daß aufgrund der alpha-prepro-Signalsequenz NKAF in die Kultur sekretiert wird.

(2) Expression von NKAF mit einer Hefe

Nach der bei Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168 beschriebenen Lithiummethode wurde pYNK1902 in die in Tabelle 14 dargestellten EHA-1C und EHF-2C-Hefen transformiert. In den Angaben bedeutet och2 eine variable Species, die bei der Temperatursensitivität keine Zugabe von Mannose akzeptiert. Siehe die Japanische Patentveröffentlichung A 63-309180. Die erhaltenen Produkte wurden unter Rühren bei 25 ºC in einem ausgewählten Kulturmedium, das kein Leucin enthält, kultiviert. Dann wurde als Kohlenstoffquelle Glucose durch Galactose ersetzt und die Kultivierung durch Erhöhung der Temperatur auf 34 ºC fortgesetzt. Von Zeit zur Zeit wurde eine Probenahme durchgeführt. Die Probe wurde in Bakterienzellen und den Überstand des Mediums getrennt. Die Zellen wurden mit PBS und Glasperlen gemischt, und der resultierende Überstand wurde mit Voltex aufgebrochen und der Überstand des Mediums verdünnt, um einen EIA für natürliches NKAF mit polyklonalen Antikörpern und monoklonalen Antikörpern durchzuführen. Vgl. Tabelle 15. Es wurde gefunden, daß NKAF in den Zellen vorhanden war, und dann im Überstand des Mediums sekretiert und exprimiert wurde. Tabelle 15 Tabelle 16 EIA Stamm Genotyp Monoklonaler Antikörper Polyklonaler Antikörper Stunde Zellen Brühe

Claims

1. Rekombinante natürliche Killerzellen aktivierender Faktor, dadurch gekennzeichnet, daß er in seinem Molekül ein Peptid der folgenden Aminosäuresequenz besitzt:

2. cDNA, die für einen rekombinanten natürliche Killerzellen aktivierenden Faktor gemäß Anspruch 1 codiert.

3. cDNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Basensequenz besitzt:

4. Manifestationsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine cDNA nach Anspruch 2 oder 3 als Fremdgen enthält, und erhalten wurde, indem die Verknüpfung auf eine solche Weise durchgeführt wurde, um eine Regulierung und Manifestation in einem ausgewählten Wirt zu ermöglichen.

5. Wirt, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem Plasmid nach Anspruch 4 transformiert ist.

6. Antitumoragens umfassend einen rekombinanten natürlichen Killerzellen aktivierenden Faktor nach Anspruch 1.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine pharmakologisch wirksame Menge des Antitumormittels nach Anspruch 6 und einen pharmakologisch annehmbaren Träger umfaßt.