DE68923556T2

DE68923556T2 - Säureempfindliche subeinheit eines insulinähnlichen wachstumfaktors-bindeprotein-komplexes.

Info

Publication number: DE68923556T2
Application number: DE68923556T
Authority: DE
Inventors: Robert Baxter
Original assignee: Sydney West Area Health Service SWAHS
Current assignee: Sydney West Area Health Service SWAHS
Priority date: 1988-07-15
Filing date: 1989-07-14
Publication date: 1996-04-11
Anticipated expiration: 2009-07-15
Also published as: DE68923556D1; ATE125268T1; JP2001252087A; JPH03506030A; JP3178714B2; CA1341598C; HK206196A; EP0424416A1; JP2005118052A; EP0424416B1; WO1990000569A1; JP2003319791A; EP0424416A4; US5936064A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein bislang unbekanntes und nicht charakterisiertes Polypeptid, das nachstehend als säureempfindliche Subeinheit ("acid-labile sub-unit", ALS) des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor (IGF) mit Bindeprotein bezeichnet wird.
Peptide aus der Familie der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) sind sowohl hinsichtlich ihrer Struktur als auch vieler Aspekte ihrer Wirkungsweise mit Insulin zu vergleichen. Die IGF-Familie besteht aus zwei Mitgliedern - IGF-I und IGF-II (IGFs). Die IGFs weisen ein breites Spektrum biologischer Aktivität auf; dazu gehören anabolische, insulinähnliche Wirkungen (z.B. die Stimulierung des Aminosäure-Transports und der Glykogen-Synthese), mitogene Aktivität und die Stimulierung der Zelldifferenzierung.
Menschlicher IGF-I und IGF-II wurden umfassend charakterisiert und besitzen, wie sich herausstellte, ein Molekulargewicht von etwa 7,6 kD (IGF-I) und 7,47 kD (IGF-II).
Im Gegensatz zu den meisten Peptidhormonen sind IGFs im Kreislauf (in vivo) und im Zellkulturmedium in Verbindung mit einem oder mehreren Bindeproteinen vorhanden. Die Beschaffenheit des oder der mit den IGFs assoziierten Bindeproteine war Gegenstand von Erörterungen. Wilkins, J.R. und D'Ercole, A.J. (1985, J. Clin. Invest. 75, 1350 - 1358) schlugen vor, daß die in-vivo-Form von IGF ein Komplex ist, der IGF in Verbindung mit sechs identischen Subeinheiten mit einem Molekulargewicht von 24 kD bis 28 kD umfaßt. In einem zweiten Vorschlag ist die in-vivo-Form von IGF angeblich mit einem säureunempfindlichen Bindeprotein und einem oder mehreren säureempfindlichen Proteinen verbunden, um einen Komplex von etwa 150 kD zu bilden (Furlanetto, R.W. (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51, 12 - 19).
Die Autoren der vorliegenden Anmeldüng identifizierten ein säureunempfindliches Serumprotein, das eine einzelne IGF-Bindungsstelle pro Molekül aufweist, mit der 150 kD-in-vivo-Form von IGF immunologisch verwandt ist und ein offenkundiges Molekulargewicht von etwa 53 kD aufweist (Baxter, R.C., und Martin, J.L. (1986) J. Clin. Invest. 78, 1504 - 1512; und Martin, J.L. und Baxter, R.C. (1986) J. Biol. Chem. 261, 8754 - 8760). Dieses 53 kD-IGF-Bindeprotein (BP53) scheint dem durch Furlanetto vorgeschlagenen säureunempfindlichen Bindeprotein zu entsprechen. Das 53 kD- Protein ist jenes Mitglied der Familie säureunempfindlicher IGF-Bindeproteine mit dem höchsten Molekulargewicht. Andere Mitglieder dieser Familie besitzen Molekulargewichte von etwa 20, 34, 36, 30 und 47 kD und fallen allesamt unter die Definition "säureunempfindliches IGF-Bindeprotein".
Die Autoren der vorliegenden Anmeldung identifizierten überraschenderweise ein säureempfindliches Protein, das beim Inkubieren mit dem an IGF gebundenen säureunempfindlichen 53 kD-Protein dieses zu einem hochmolekularen Komplex umwandelt, der der in-vivo-Form von IGF entspricht.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die säureempfindliche Subeinheit (acid-labile sub-unit, ALS) des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein in biologisch reiner Form bereitgestellt, die vorzugsweise die folgende N-terminale Teil- Aminosäuresequenz aufweist:
worin die erste Aminosäure Gly oder Ala sein kann.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Stoffzusammensetzung bereitgestellt, die im wesentlichen aus der säureempfindlichen Subeinheit (ALS) des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein besteht.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die aus drei Polypeptid-Komponenten, u.zw. IGF, BP-53 und ALS, aufgebaut ist. Die Zusammensetzung kann so formuliert werden, daß sie mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Exzipienten verbunden ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von ALS bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Aufbringen einer ALS-Quelle auf eine Trägermatrix, an der IGF angebracht ist, der an das säureunempfindliche IGF-Bindeprotein gebunden oder daran assoziiert ist, wodurch sich die ALS in dem aufgebrachten Material an das säureunempfindliche Bindeprotein bindet und nicht-gebundenes Material von der Trägermatrix abgetrennt wird; und
(b) selektives Eluieren und Gewinnen des ALS-Proteins aus dem IGF-Protein-Komplex.
Vorzugsweise wird ALS nach einem Verfahren gebildet, das die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Binden von IGF an eine Trägermatrix;
(b) Zugeben des säureunempfindlichen IGF-Bindeproteins zur Trägermatrix, damit es sich an den IGF bindet oder daran assoziiert wird;
(c) Aufbringen einer ALS-Quelle auf die Trägermatrix, wodurch sich die ALS in dem aufgebrachten Material an das säureunempfindliche Protein bindet und nicht- gebundenes Material von der Trägermatrix abgetrennt wird;
(d) selektives Eluieren des ALS-Proteins aus dem IGF-Proteinkomplex; und
(e) gegebenenfalls das weitere Fraktionieren der gewonnenen ALS durch HPLC oder FPLC.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen der Mengen an ALS in Körperflüssigkeiten bereitgestellt, umfassend das Fraktionieren der Körperflüssigkeiten auf einer Größenfraktionierungs-Matrix, um freie ALS von anderen Komponenten des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein abzutrennen, und das anschließende Quantifizieren der Mengen an ALS in der fraktionierten Probe.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine rekombinante Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, die für die säureempfindliche Subeinheit (ALS) des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein kodiert. Die rekombinante Nukleinsäuresequenz kodiert vorzugsweise für ein Polypeptid mit der folgenden N- terminalen Teil-Aminosäuresequenz:
worin die erste Aminosäure Gly oder Ala ist.
Die Erfindung betrifft auch einen Expressionsvektor, der eine für ALS kodierende, rekombinante Nukleinsäuresequenz, mit einem solchen Vektor transformierte Wirtszellen und ALS enthält, wenn diese durch solche Wirtszellen erzeugt wird.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Polypeptide, die Fragmente von ALS umfassen, und Nukleinsäuren bereitgestellt, die dafür kodierende Sequenzen umfassen, die die folgenden Reste enthalten oder dafür kodieren: 1-5, 2-7, 5-9, 7-11, 8-14, 11-15, 13-17, 3-9, 2-8, 4-10, 6-12, 8-14, 10-16, 12-18, 1-6, 3-9, 5-11, 7-13, 9-15, 11-17, 4-9, 6- 11, 8-13, 10-15 oder 12-17 von ALS.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFlNDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ALS, ein Polypeptid, das sich an einen Komplex aus IGF und dessen säureunempfindlichem Bindeprotein BP-53 bindet und diesen in vivo stabilisiert. IGF kann IGF-I oder IGF-II sein.
BP-53 ist ein Glykoprotein, d.h. eine oder mehrere Kohlenhydrat-Ketten sind mit der BP 53-Polypeptidsequenz verbunden. Unter Bezugnahme auf das säureunempfindliche IGF-Bindeprotein oder BP-53 ist zu beachten, daß sich diese Ausdrücke auf ein säureunempfindliches Protein beziehen, das sich an einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor binden und mit ALS und IGF einen Komplex bilden kann. Solange das säureunempfindliche IGF-Bindeprotein oder BP-53 diese Funktionen erfüllt, kann es nicht-glykosyliert, teilweise glykosyliert, durch Aminosäurelöschungen, -substitutionen oder -einfügungen modifiziert sein und ein Molekulargewicht von 20, 30, 34, 36, 47 und 53 kD aufweisen. Das genaue Molekulargewicht dieser Komponente ist im allgemeinen unwichtig.
Gemäß der vorliegenden Erfindung und unter Anwendung der hierin geoffenbarten Verfahren ist die ALS biologisch rein. Unter "biologisch rein" ist eine Zusammensetzung zu verstehen, die zumindest 65 Gew.-%, vorzugsweise zumindest 75 Gew.-%, ALS aufweist. Noch bevorzugter umfaßt die Zusammensetzung zumindest 80% ALS. Demzufolge kann die Zusammensetzung homogene ALS enthalten. In der vorliegenden Beschreibung hat der Ausdruck "biologisch rein" die gleiche Bedeutung wie "im wesentlichen rein".
Wenn sich die Erfindung auf eine Stoffzusammensetzung bezieht, die im wesentlichen aus ALS besteht, ist der Ausdruck "Stoffzusammensetzung" breit gefaßt auszulegen. Die Stoffzusammensetzung kann ALS selbst oder ALS in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch oder veterinär annehmbaren Trägern oder Exzipienten sein. Geeignete Träger können Wasser, Glyzerin, Saccharose, Puffer oder andere Proteine, wie z.B. Albumin usw., enthalten. Der Ausdruck "bestehen im wesentlichen aus" ist gleichbedeutend mit obigem "biologisch rein".
Das Binden an IGF bezieht sich auf die Fähigkeit von ALS, sich an Komplexe zu binden, die sich bilden, wenn IGF an eine säureunempfindliche Komponente - BP-53 - gebunden oder daran assoziiert wird.
ALS ist ein Glykoprotein, d.h., eine oder mehrere Kohlenhydratketten sind mit der ALS- Polypeptidsequenz verbunden. Die vorliegende Erfindung betrifft ALS in seinen voll glykosylierten, teilweise glykosylierten oder nicht-glykosylierten Formen, die gemäß den auf dem Gebiet wohlbekannten Verfahren problemlos hergestellt werden können. Die gemäß den hierin geoffenbarten Verfahren hergestellte ALS kann beispielsweise mit Enzymen, wie z.B. Endoglycosidasen, umgesetzt werden, um N-gebundenes Kohlenhydrat teilweise oder vollständig zu entfernen. O-gebundenes Kohlenhydrat kann ähnlich mittels wohlbekannter Verfahren entfernt werden.
Wie bereits erwähnt, besitzt ALS vorzugsweise die folgende N-terminale Teil- Aminosäuresequenz:
worin die erste Aminosäure Gly oder Ala sein kann.
Man beachte jedoch, daß die erfindungsgemäße ALS nicht darauf beschränkt ist, die obige N-terminale Aminosäuresequenz zu besitzen. ALS ist vielmehr funktionell als säureempfindliches Polypeptid definiert, das sich an Komplexe binden oder daran assoziieren kann, die sich bilden, wenn IGF mit dem oben definierten säureunempfindlichen Bindeprotein BP-53 gebunden oder daran assoziiert wird. Die Definition ALS erstreckt sich auch auf synthetische und natürlich vorkommende Aminosäuresubstitutionen, -löschungen und/oder -einfügungen der natürlichen Sequenz von ALS, wie dies für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig ist. Man kann sich z.B. problemlos gentechnischer Mittel unter Anwendung bekannter Verfahren bedienen, um Aminosäuren zu substituieren, zu löschen und/oder einzufügen.
Im allgemeinen kann ALS, ohne die Erfindung einzuschränken, dadurch gekennzeichnet sein, daß sie:
(i) säureempfindlich, d.h. bei einem pH-Wert von weniger als 4 instabil ist,
(ii) sich an ein säureunempfindliches IGF-Bindeprotein bindet, das mit IGF verbunden ist, und
(iii) ein durch SDS-PAGE bestimmtes, ungefähres Molekulargewicht zwischen 80 kD und 115 kD besitzt.
Die hierin beschriebene ALS ist menschliche ALS. Tierische ALS, die einen Komplex mit tierischem IGF bilden kann, fällt jedoch auch in den Bedeutungsumfang des Ausdrucks ALS.
ALS eignet sich zur Bildung des physiologischen IGF-Komplexes, der IGF, BP-53 und ALS umfaßt. Ein derartiger Komplex eignet sich für die Wundheilung und verwandte Therapien, die sich mit dem Nachwachsen von Gewebe, wie z.B. Bindegewebe, Haut und Knochen, befassen; zur Förderung des Körperwachstums von Menschen und Tieren; und zur Stimulation anderer, mit dem Wachstum in Zusammenhang stehender Verfahren. Das ALS-Protein führt auch zu einer deutlichen Zunahme der Halbwertszeit von IGF in vivo. Die Halbwertszeit von IGF an sich (ohne Beteiligung der Bindeproteine) beträgt nur einige wenige Minuten. Wenn IGF in Form eines Komplexes mit dem säureunempfindlichen IGF-Bindeprotein und dem ALS-Protein vorliegt, verlängert sich seine Halbwertszeit auf mehrere Stunden, wodurch die Bio-Verfügbarkeit von IGF mit seinen zugehörigen therapeutischen Wirkungen erhöht wird. Außerdem kann reine ALS zur Züchtung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper verwendet werden, um einen Radioimmunoassay oder einen anderen Assay für ALS zu schaffen.
Die Messung von ALS in menschlichen Serum kann bei der Diagnose des Wachstumshormon-Status von Patienten mit Wachstumsstörungen nützlich sein.
Der IGF-Bindeprotein-Komplex, der durch Vermischen von ALS, IGF und dem säureunempfindlichen Protein BP-53 gebildet wird, worin jede Komponente vorzugsweise in biologisch reiner Form vorhanden ist, kann mit geeigneten, pharmazeutisch und/oder therapeutisch oder veterinär annehmbaren Trägern formuliert und beispielsweise bei der Wachstumsförderung oder Wundbehandlung bei Menschen und Tieren eingesetzt werden. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Träger sind physiologische Salzlösungen, Serumalbumin oder Plasmapräparate. Je nach Art der beabsichtigten Verabreichung können Zusammensetzungen des IGF-Bindeprotein- Komplexes in Form von Präparaten zur festen, halbfesten oder flüssigen Dosierung vorliegen, z.B. als Tabletten, Pillen, Pulver, Kapseln, Flüssigkeiten, Suspensionen u.dgl. Alternativ dazu kann der IGF-Bindeprotein-Komplex in ein Implantat für langsame Freisetzung, z.B. osmotische Pumpen, zur Freisetzung von Material über einen längeren Zeitraum, eingebaut werden.
Die Menge des aus therapeutischen Gründen an menschliche Patienten oder Tiere verabreichten IGF-Bindeprotein-Komplexes hängt von der jeweils zu behandelnden Störung oder Erkrankung, der Verabreichungsart und dem Urteil des verschreibenden Arztes oder Tierarztes ab.
ALS kann aus menschlichem Serum oder Plasma oder Plasmafraktionen, wie z.B. Cohn Fraktion IV, gereinigt werden. Die Reinigung aus Vollserum ist vorzuziehen, da dies die wirtschaftlichste und ergiebigste Materialquelle ist und die höchste Ausbeute erzielt. Die Reinigung von ALS macht sich die physiologische Wechselwirkung zwischen IGF, BP-53 und ALS zunutze. ALS wird aus menschlichem Serum gewonnen, indem das Serum durch eine Trägermatrix geschickt wird, an die IGF-BP-53 gebunden bzw. assoziiert ist. Assoziation bezieht sich hier auf eine nicht-kovalente Wechselwirkung, z.B. elektrostatische Anziehung oder hydrophobe Wechselwirkungen. Die an die IGF- BP-53-Affinitätsmatrix gebundene ALS kann dann durch Unterbrechen der Wechselwirkung zwischen ALS und der Affinitätsmatrix, z.B. durch Erhöhen der Ionenstärke (z.B. zumindest 0,3 M NaCl oder ein äquivalentes Salz) oder Bedingungen mit alkalischem pH-Wert (über 8), eluiert werden.
Eine ALS-Quelle, wie z.B. Vollplasma oder die Cohn Fraktion IV davon, kann auf einem ionischen Harz fraktioniert werden, um die ALS-Menge vor dem Aufbringen auf die Affinitätsmatrix anzureichern. Ein Kationenaustausch-Harz ist vorzuziehen. Gegebenenfalls wird die durch Affinitätschromatographie gereinigte ALS einem weiteren Reinigungsschritt, wie z.B. HPLC oder FPLC (Markenbezeichnung, Pharmacia), unterzogen. Der HPLC-Schritt kann beispielsweise unter Verwendung einer Umkehrphasenmatrix, einer Gelpermeationsmatrix oder einer Ionenmatrix erfolgen.
Wenn die Erfindung Antikörper betrifft, die in der Lage sind, sich an ALS zu binden, können die Antikörper monoklonal oder polyklonal sein. Solche Antikörper können dazu dienen, ALS-Werte in Serum zu messen, und können einen Teil eines Diagnosesets zur Untersuchung von mit dem Wachstum in Zusammenhang stehenden Störungen bilden. Antikörper gegen ALS können durch Immunisieren von Tieren (beispielsweise von Mäusen, Ratten, Ziegen, Hasen, Pferden, Schafen oder sogar Menschen) mit gereinigter ALS nach herkömmlichen Verfahrensweisen gebildet werden (Goding, J. W. (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practices, 2. Ausgabe, Academic Press). Serumproteine können beispielsweise an einer Trägermatrix angebracht und mit Anti-ALS-Antikörpern inkubiert werden, die mit Reporter-Gruppen (beispielsweise fluoreszierenden Gruppen, Enzymen oder kolloidalen Gruppen) markiert sein können, um ALS nachzuweisen. Alternativ dazu können nicht-markierte, an ALS gebundene Anti-ALS-Antikörper mit geeigneten Agentien (z.B. Antikörpern gegen Anti-ALS-Antikörper oder Anti-Immunoglobulin-Antikörper) umgesetzt werden, um Antikörperbindung festzustellen und somit ALS-Werte zu quantifizieren.
Wenn die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül betrifft, ist dieses hierin als DNA oder RNA definiert, die für ALS oder Teile davon kodiert. In einer Ausführungsform ist das rekombinante Nukleinsäuremolekül komplementäre DNA (cDNA), die für Säugetier-, vorzugsweise menschliche, ALS oder Teile davon kodiert, einschließlich irgendeiner Basenlöschung, -einfügung oder -substitution oder jeder anderen beliebigen Änderung der Nukleotidsequenz oder chemischen Zusammensetzung (z.B. Methylierung). Durch cDNA kodierte ALS wird hierin als rekombinante ALS bezeichnet.
Eine rekombinante Nukleinsäure, die zumindest 60% oder mehr Sequenzhomologie, vorzugsweise 80 bis 99% Homologie, mit einer Nukleinsäure (cDNA, DNA, RNA) aufweist, die für ALS oder für ein Protein mit der biologischen Aktivität von ALS kodiert, ist als für ALS kodierende Nukleinsäure zu betrachten.
Verfahren, die zur Bildung rekombinanter ALS-cDNA als geeignet gelten, sind bei Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, S. 1 - 545 enthalten. Kurz gesagt wird polyadenylierte mRNA aus einer zweckmäßigen Zell- oder Gewebequelle, z.B. Leber, gewonnen. Gegebenenfalls wird mRNA auf Agarosegelen oder durch Gradientenzentrifugation fraktioniert und hinsichtlich ALS translatiert und geprüft, z.B. durch Immunfällung. Angereicherte oder nicht-angereicherte mRNA dient als Schablone zur cDNA-Synthese. Sammlungen von cDNA-Klonen werden an der PstI-Stelle eines Vektors, wie z.B. pBR 322 (unter Verwendung von Homopolymer-Schwänzen) oder anderer Vektoren, konstruiert; oder sie werden durch Ligieren von Linkern (z.B. EcoRI-Linkern) an den Enden von cDNA konstruiert, die dann in einen Vektor kloniert wird, der über zu den Linkern komplementäre Stellen verfügt. Spezifische cDNA-Moleküle in einem Vektor in einer Sammlung werden dann unter Verwendung spezifischer Oligonukleotide auf der Grundlage der oben erwähnten N-terminalen Aminosäuresequenz von ALS ausgewählt. Alternativ dazu können handelsübliche, menschliche λ-Sammlungen mit Oligonukleotiden gescreent werden. In einem alternativen Ansatz kann die cDNA in einen Expressionsvektor, wie z.B. λ gt 11 eingefügt werden, wobei die Auswahl auf der Reaktion des exprimierten Proteins mit einem spezifischen Antikörper gegen gereinigte ALS beruht. Sobald sie identifiziert sind, werden cDNA-Moleküle, die für die gesamte ALS oder einen Teil davon kodieren, jedenfalls in Expressionsvektoren ligiert. Zusätzliche genetische Eingriffe erfolgen in herkömmlicher Weise, um die Expression der cDNA im jeweils verwendeten Wirt zu maximieren.
Demzufolge wird ALS in vivo durch Einfügen der cDNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, Transformieren des resultierenden, rekombinanten Moleküls in einen geeigneten Wirt und anschließendes Kultivieren oder Züchten des transformierten Wirts unter für die Synthese des Moleküls erforderlichen Bedingungen synthetisiert. Das hierin definierte, rekombinante Molekül sollte eine Nukleinsäuresequenz, die für ein erwünschtes Polypeptid kodiert und stromab von einem im gewünschten Wirt funktionalen Promotor eingefügt ist, ein eukaryotisches oder prokaryotisches Replicon und einen auswählbaren Marker umfassen, z.B. einen, der gegenüber einem Antibiotikum resistent ist. Das rekombinante Molekül erfordert möglicherweise auch eine Signalsequenz zur Erleichterung des Transports des synthetisierten Polypeptids in die extrazelluläre Umgebung. Alternativ dazu kann das Polypeptid zunächst durch Lysieren der Wirtszelle mittels einer Vielzahl an Verfahren gewonnen werden (z.B. durch Ultraschallbehandlung, Druckaufschluß oder Detergentien-Behandlung). Die gemäß der vorliegenden Erfindung geeigneten Wirte können aus der Gruppe, bestehend aus Prokaryoten (z.B. Escherichia coli, Bacillus sp., Pseudomonas sp.) und Eukaryoten (z.B. Säugetierzellen, Hefe- und Pilzkulturen, Insektenzellen und Pflanzenkulturen), ausgewählt werden. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet auch offenkundig, daß eine bestimmte Aminosäuresequenz Löschungen, Substitutionen und Hinzufügungen von Nukleotiden oder Nukleotid-Tripletts (Codons) unterzogen werden kann. Solche Variationen fallen alle in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich kann je nach dem rekombinante ALS exprimierenden Wirt diese glykosyliert sein oder nicht. Im allgemeinen glykosylieren eukaryotische Zellen, beispielsweise Säugetierzellen u.dgl., die rekombinante ALS. Prokaryotische Zellen, z.B. Bakterien wie Escherichia coli u.dgl., glykosylieren die rekombinante ALS nicht. Sowohl glykosylierte als auch nicht-glykosylierte ALS ist, wie bereits erwähnt, im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung enthalten.

ABKÜRZUNGEN

IGF - insulinähnlicher Wachstumsfaktor ("insulin-like growth factor")
SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
kD oder K - Kilodalton
GH - Wachstumshormon ("growth hormone")
Die folgenden Abbildungen und Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung, schränken sie aber nicht ein.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig.1: Affinitätschromatographie von ALS. Ein 132 ml-Pool von Fraktionen, die teilweise durch Chromatographie mit DEAE-Sephadex (eingetragenes Warenzeichen) gereinigt worden waren, wurde mit 0,13 ml/min auf eine 1 x 15 cm Affinitätssäule aufgebracht, die eine Mischung aus IGF-I und IGF-II (kovalent an Agarose gebunden) enthielt, an die BP-53 nicht-kovalent adsorbiert worden war. Die Säule wurde mit 150 ml 50 mM Na- Phosphat, pH-Wert 6,5 (Waschung Nr.1), und 50 ml 5 mM Na-Phosphat, 50 mM NaCl, pH-Wert 6,5 (Waschung Nr.2), mit 1 ml/min gewaschen. ALS wurde durch Aufbringen von 50 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl, pH-Wert 8,5, mit 0,5 ml/min eluiert.
Fig.2: SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese von gereinigter ALS. Linkes Feld: Unbehandelte, angesäuerte und mit N-Glycanase behandelte Proben (15 ug/Bahn), Laufen gelassen unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Rechtes Feld: die gleichen Proben in umgekehrter Reihenfolge, Laufen gelassen unter reduzierenden Bedingungen. Gele wurden mit Coomassie-Blau (eingetragenes Warenzeichen) eingefärbt. Die Molekülmassen (in kD) von Standardproteinen, die für das reduzierte Gel in der rechten Bahn dargestellt sind, werden durch Pfeile auf der linken Seite für auf nicht-reduziertem Gel Laufen gelassenen Standards angezeigt.
Fig.3 zeigt die Fraktionierung von menschlichem Serum auf einer Säule aus DEAE- Sephadex A-50. 1 ml dialysiertes Serum wurde auf ein 1 x 1 7,5 cm Gelbett aufgebracht, die Säule mit 35 ml 0,05 Mol/l Tris-HCl, pH-Wert 8,2, ausgewaschen und die Elution mit 50 ml des gleichen, 0,15 Mol/l NaCl enthaltenden Puffers begonnen. Die Elution wurde dann mit dem gleichen, 0,6 Mol/l NaCl enthaltenden Puffer fortgesetzt. Fraktionen von 1 ml wurden abgenommen und hinsichtlich Absorptionsvermögen bei 280 nm und BP-53 durch RIA geprüft. ALS wurde an 20 ul-Aliquoten von Peak B- Fraktionen nach dem herkömmlichen Assayverfahren bestimmt.
Fig.4 zeigt die Erzeugung des 150 K Komplexes aus mittels DEAE-Sephadex fraktioniertem Serum. Pools von Peak A und B wurden wie in Fig.3 durch Chromatographie mit DEAE-Sephadex von 10 ml Serum hergestellt und dann durch Chromatographie mit Superose-12 (eingetragenes Warenzeichen) fraktioniert. Die Proben, die jeweils in ein Volumen von 200 ul injiziert wurden, waren Peak A (a: 100 ul), Peak B (b: 100 ul), Peak A und B (c: jeweils 100 ul), vermischt und bei 22ºC über den Zeitraum von 1 Stunde vor dem Aufbringen inkubiert und Vollserum (d: 33 ul). Die BP-53-Immunreaktivität wurde an 50 ul jeder 0,5 ml-Fraktion gemessen. Pfeile zeigen 150K, 60K und 35K Marker an.
Fig.5 zeigt den Vergleich von BP-53-Immunreaktivität und ALS-Aktivität (angezeigt in über Superose-12 fraktioniertem Serum). Jede Fraktion bestand aus 0,5 ml. Die Pfeile zeigen 150K, 60K und 35K Marker an. Man beachte, daß das zum Nachweis von ALS- Protein verwendete Verfahren nur Protein nachweist, das nicht als 150K Komplex vorhanden ist.
Fig.6 zeigt die Säureempfindlichkeit der ALS-Akvitität. Proben vom normalem Serum (a) oder teilweise reiner ALS (b) wurden mit ALS-Assaypuffer verdünnt und mit 1 Mol/l HCl oder NaOH auf die gezeigten pH-Werte eingestellt. Nach 30 min bei 22ºC wurden die Proben wieder neutralisiert und im Routine-Assay (10 ul Serum oder 600 ng ALS- Präparat/Inkubation) hinsichtlich ALS-Aktivität geprüft.
Fig.7 zeigt die Wirkung von IGFs auf die ALS-Bindung an BP-53. Linkes Feld: Steigende BP-53-Konzentrationen wurden in 300 ul Rekationsvolumen mit [¹²&sup5;I]-markiertem ALS- Tracer in Gegenwart oder Abwesenheit von IGF-I oder IGF-II (50 ng/Reagenzglas) inkubiert, wie angezeigt. Rechtes Feld: Untersuchung hinsichtlich konkurrierender Bindung, worin 10 ng BP-53 plus 10 ng IGF-I oder IGF-II mit ALS-Tracer und steigenden Konzentrationen unmarkierter ALS in 300 ul inkubiert wurden. An BP-53 gebundener Tracer wurde mit Anti-BP-53-Antiserum R-7 immungefällt.
Fig.8 zeigt die Wirkung von ALS auf die IGF-Bindung an BP-53. Linkes Feld: Steigende Konzentrationen von BP-53 wurden in 300 ul Reaktionsvolumen mit [¹²&sup5;I]-markiertem IGF-I- oder IGF-II-Tracer (IGF-I* oder IGF-II*) in Gegenwart oder Abwesenheit von ALS (100 ng/Reagenzglas) inkubiert, wie angezeigt. Rechtes Feld: Untersuchung hinsichtlich konkurrierender Bindung, worin 0,25 ng BP-53 in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 ng ALS mit IGF-II-Tracer und steigenden Konzentrationen von unmarkiertem IGF-I oder IGF-II in 300 ul inkubiert wurden, wie angezeigt. An BP-53 gebundener Tracer wurde mit Anti-BP-53-Antiserum R-7 immungefällt.
Fig.9 zeigt die Wirkung von BP-53 und ALS auf das gelchromatographische Profil von [¹²&sup5;I]-markiertem IGF-II-Tracer. Proben von 200 ul, die 50.000 cpm IGF-II-Tracer enthielten und 2 h lang bei 22ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von BP-53 (1 ng/200 ul) oder ALS (100 ng/200 ul) vorinkubiert worden waren, wurden auf einer Superose-12- Hochleistungs-Chromatographie-(HPC-)Säule in 50 mM Na-Phosphat, 0,15 M NaCl, 0,02% Na-Azid, 0,1% Rinder-Album in, pH-Wert 6,5, chromatographiert. Fraktionen von 0,5 ml wurden mit 1 ml/min gesammelt und die Radioaktivität jeder Fraktion bestimmt. Auf jedem Feld zeigen die drei Pfeile van links nach rechts die Molekulargewichts-Marker von 150 kD, 60 kD und 7,5 kD. Linkes Feld: volle Zeichen, IGF-II-Tracer; offene Zeichen, Tracer plus ALS. Rechtes Feld: volle Zeichen, Tracer plus BP-53; offene Zeichen, Tracer plus BP-53 plus ALS.
Fig.10 zeigt die Konkurrenz durch zunehmende Konzentrationen von angesäuertem bzw. neutralisiertem, menschlichem Serum aus normalen, an Hypopituitarismus oder an Akromegalie leidenden Probanden im routinemäßigen ALS-Assay, worin 600 ng teilweise gereinigte ALS/250 ul Inkubationsmedium (d.h. 2,4 ug/ml) in Abwesenheit von Serum ein 150K/60K-Verhältnis von etwa 1 ergab. Die Serumkonzentration ist als Volumen (a) oder als immunreaktiver BP-53-Anteil (b) ausgedrückt. Die dargestellten angesäuerten bzw. neutralisierten Serumproben enthielten 4,49 ug/ml (normal), 0,93 ug/ml (Hypopituitarismus) oder 10,49 ul/ml (Akromegalie) BP-53 durch RIA.
Fig.11 zeigt die Konkurrenz durch reines BP-53 im Routine-ALS-Assay, Feld (a) zeigt die Auswirkung von steigenden BP-53-Konzentrationen nach der Vorinkubation ohne IGFs oder mit einem 3,5-fachen molaren Überschuß von reinem, menschlichem IGF-I oder IGF-II, wie angezeigt. Feld (b) zeigt die Auswirkung einer fixen BP-53-Konzentration (0,8 ug/ml), die mit steigenden Konzentrationen von IGF-I oder IGF-II vorinkubiert worden war.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Materialien:

Frisches, menschliches Serum wurde zur ALS-Herstellung aus Labor-Freiwilligen gewonnen. Cohn Fraktion IV von menschlichem Plasma, das von den Commonwealth Serum Laboratories, Melbourne (Australien), stammte, wurde als Ausgangsmaterial verwendet, um menschlichen IGF-I und IGF-II und das IGF-Bindeprotein BP-53 herzustellen. DEAE-Sephadex A-50, SP-Sephdex C-25, Elektrophorese-Standards und die Superose-12 HR 10/30-Säule stammten von Pharmacia, Sydney; Affi-Gel 10 und Affi-Gel 15 (eingetragene Warenzeichen) stammten von Bio-Rad; und die PolyWAX LP (eingetragenes Warenzeichen) (Polyethylenimin)-Anionenaustausch-HPLC-Säule (200 x 4,6 mm) stammte von PolyLC, Columbia, MD. Alle anderen Reagenzien wiesen zumindest analytische Qualität auf.
Menschlicher IGF-I und IGF-II wurden gemäß früheren Beschreibungen isoliert und iodiert (Baxter, R.C., und De Mellow, J.S.M. (1986) Clin. Endocrinol. 24, 267 - 278; und Baxter, R.C., und Brown, A.S. (1982) Clin. Chem. 28, 485); IGF-I-Tracer wurde durch hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie (Baxter, R.C., und Brown, A.S. (1982) Clin. Chem. 28, 485) weiter gereinigt. Das 53K IGF-Bindeprotein BP-53 wurde gemäß früheren Beschreibungen aus Cohn Fraktion IV gereinigt (Martin, J.L., und Baxter, R.C. (1986) J. Bio. Chem. 261, 8754 - 8760), und ein kovalenter Komplex mit [¹²&sup5;I]IGF-I, mittels Disuccinimidylsuberat vernetzt, wurde nach dem Verfahren von Baxter, R.C., und Martin, J.L. (1986) J. Clin. Invest. 78, 1504 - 1512 hergestellt und durch Gelchromatographie gereinigt. Ein 28K IGF-Bindeprotein BP-28 wurde aus menschlichem Fruchtwasser durch Affinitätschromatographie und Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wobei dabei das Verfahren von Baxter, R.C., Martin, J.L. und Wood, M.H. (1987), J.Clin. Endocrinol. Metab. 65, 423 - 431 zum Einsatz kam.

ALS-Iodierung und Radioimmunoassay

[¹²&sup5;I]-markierte ALS wurde durch Umsetzen von 5 ug ALS in 50 ul M Na-Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 20 s lang mit 1 mCi Na¹²&sup5;I und 10 ug Chloramin-T und anschließenden Abbruch der Reaktion mit 50 ug Na-Metabisulfit hergestellt. Ein Antiserum gegen ALS wurde durch Immunisieren eines Hasen über einen Zeitraum von 7 Wochen mit 4 Dosen von etwa 100 Pg gereinigter ALS gebildet. Radioimmunoassay-Inkubationen in 0,5 ml Endvolumen enthielten Antiserum in einer Endverdünnung von 1:50.000, [¹²&sup5;I]- markierte ALS (etwa 10.000 cpm pro Reagenzglas) und ALS im Bereich von 0,5 - 100 ng/Reagenzglas. Nach einer 1 6-stündigen Inkubation bei 22ºC wurden gebundener und freier Tracer nach der Zugabe von Ziegen-Anti-Hasen-Immunoglobulin (2 ul), normalem Hasenserum als Träger (0,5 ul) und - nach 30 min - von 1 ml 6%-iges Polyethylenglykol in 0,15 M NaCl durch Zentrifugieren abgetrennt.

ALS-Assay

Der Routineassay hinsichtlich ALS-Aktivität wurde auf der Grundlage der Umwandlung eines kovalenten BP-53-IGF-I-Komplexes von etwa 60K zur 150K-Form in Gegenwart von ALS entwickelt.
Die hinsichtlich ALS-Aktivität zu untersuchenden Proben wurden in einem Puffer auf 200 ul verdünnt, der 50 mMol/l Natriumphosphat, 0,15 Mol/l NaCl und 0,2 g/l Natriumazid, pH-Wert 6,5, mit 10 g/l Rinder-Albumin enthielt. Vernetzter BP-53-IGF-I- Tracer ( 80.000 cpm; 4 ng) wurde zu 50 ul des gleichen Puffers hinzugefügt. Nach 25- 30-minütiger Inkubation bei 22ºC wurden 200 ul des Gemischs unter Verwendung eines V-7-Injektorventils (Pharmacia) auf eine Superose-12-Gelpermeationssäule aufgebracht und mit 1,0 ml/min (Druck: 2 MPa) in einem Assaypuffer ohne Albumin eluiert. Die Säule wurde geeicht mit: Hasen-Immunoglobulin G (Pentex; 150K), das hauptsächlich in Fraktionen 22 - 24 eluierte und einen Peak in Fraktion 23 aufwies; BP- 53-IGF-I-Tracer ( 60K), der hauptsächlich in Fraktionen 25 - 27 eluierte und in Fraktion 26 einen Peak aufwies; an BP-28 gebundenem IGF-I-Tracer ( 35K, Peak in Fraktion 28); und IGF-I-Tracer (7,5K, Peak in Fraktion 33). Als Logarithmus der Molekülmasse über dem Elutionsvolumen aufgetragen ergaben diese vier Marker eine (nicht dargestellte) lineare Eichkurve. Als quantitativer Index der ALS-Aktivität (d.h. der Umwandlungsgrad von BP-53 zum 150K-Komplex) wurde die Gesamtradioaktivität der Fraktionen 22 - 24 durch jene der Fraktionen 25 - 27 dividiert, um ein 150K/60K-Verhältnis zu ergeben. Die Werte dieses Verhältnisses variierten typischerweise zwischen 0,1 und 2,0. Der Variationskoeffizient des 150K/60K-Verhältnisses basierte auf der Varianzanalyse von acht Doppelbestimmungen in einem breiten Wertebereich und betrug 3,2%. Da jeder Chromatographie-Lauf 30 min dauerte und die Genauigkeit des Assays hoch war, wurde jede Bestimmung im allgemeinen in jedem Versuch einzeln durchgeführt.
Bei Abwesenheit von ALS wurde die Radioaktivität überwiegend in den Fraktionen 25 - 27 festgestellt; dies entsprach einer Molekülmasse von 60K und ergab typischerweise ein 150K/60K-Verhältnis von 0,10 oder weniger. Steigende ALS-Konzentrationen bei der Vorinkubation bewirkten zunehmende Umwandlung des 60K-Tracers zur 150K-Form (Fraktionen 22 - 24), was zu höheren Werten für das 150K/60K-Verhältnis führte. Sowohl der IGF-I- als auch der IGF-II-Tracer, die mit reinem BP-53 vorinkubiert, jedoch nicht kovalent vernetzt worden waren, konnten auch durch Inkubation mit ALS zu 150K umgewandelt werden. Andere säureunempfindliche IGF-Bindeproteine, die strukturell mit BP-53 verwandt sind, doch eine geringere Größe aufweisen (z.B. jene von 20, 24, 26, 30 und 47 K), nehmen auch an dieser Reaktion teil, um dementsprechend kleinere Komplexe zu bilden. Vernetzter BP-53-IGF-II-Tracer wurde nicht untersucht. Eine Dosis- Response-Kurve unter Verwendung des gemäß Beispiel 2 erzeugten, gereinigten ALS- Präparats wurde mittels des vernetzten BP-53-IGF-I-Tracers erstellt. Man erhielt eine sehr gut reproduzierbare, halblogarithmische S-förmige Kurve, die als Standardkurve zur Quantifizierung der ALS in unbekannten Proben (z.B. während der Reinigung) verwendet werden konnte. Ein ähnliches Ergebnis wird erzielt, wenn der mit ALS komplexierte Tracer mit einem Anti-ALS-Antiserum ausgefällt und nicht über eine Superose-1 2-Säule fraktioniert wird.

BEISPIEL 2

Reinigung von ALS:

Frisches, menschliches Serum oder Cohn Fraktion IV-Paste von menschlichem Plasma wurde als ALS-Quelle verwendet. Frisches, menschliches Serum (100 - 130 ml) wurde gegen 2 x 50 Volumsteile 0,05 M Tris-HCl, pH-Wert 8,2, bei 2ºC dialysiert, dann auf eine Säule von DEAE-Sephadex A-50 (5 x 23 cm) aufgebracht, die mit Dialysepuffer bei 22ºC äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 2 l Dialysepuffer und dann mit 2 - 2,5 l des gleichen, 0,15 M NaCl enthaltenden Puffers gewaschen. Dieser Schritt entfernte sämtlichen immunreaktiven BP-53 aus der Säule. ALS wurde durch Aufbringen von 1 l 0,05 M Tris-HCl, 0,6 M NaCl (pH-Wert 8,2) bei einer Pumprate von 1 ml/min eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden abgenommen und hinsichtlich ALS-Aktivität und Absorptionsvermögen bei 280 nm geprüft. Aktive Fraktionen wurden kombiniert (etwa 140 ml insgesamt) und bei 2ºC gegen 5 l 50 mM Natriumphosphat, 0,02% Na-Azid, pH-Wert 6,5, dialysiert.
Unter Verwendung von Cohn Fraktion IV als ALS-Quelle wurde die gefrorene Paste (600 g) in kleine Stücke zerteilt und 16 h lang bei 2ºC durch Rühren mit 3 l 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,02% Natriumazid, pH-Wert 8,2, extrahiert. Das Gemisch wurde 30 min lang bei 12.000 U/min im GSA-Rotor einer Sorvall RCSC-Zentrifuge zentrifugiert, wodurch eine trübe, grün-braune Überstandsfraktion (2,8 l) entstand. Diese wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt und durch Schwerkraftzuführung auf zwei Säulen von mit Extraktionspuffer äquilibrierter DEAE-Sephadex A-50 (5 x 22 cm) aufgebracht, wobei jede Säule mit 2 l Puffer gewaschen wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine vorherrschende, blaugrüne Bande in der oberen Hälfte der Säule konzentriert. Manchmal begann diese Bande während des Waschschritts durch die Säule zu wandern; in diesen Fällen wurde das Waschvolumen auf 1 l verringert. ALS wurde mittels eines linearen 0,15 - 0,35 M NaCl-Gradienten in 50 mM Tris-HCl, 0,02% Natriumazid, pH 8,2 (2 l Gesamtvolumen) aus der Säule eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden abgenommen und hinsichtlich ALS-Aktivität und Absorptionsvermögen bei 280 nm (oder Protein, nach einem Biuret-Verfahren) geprüft. Aktive Fraktionen aus den beiden parallelen Säulen wurden vereinigt (etwa 1 l insgesamt), mit 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,5, auf das Doppelte verdünnt und der pH-Wert durch langsame Zugabe von 1 M HCl auf 6,5 eingestellt. Da die aktiven Fraktionen eng mit dem blaugrünen Protein in den eluierten Fraktionen in Zusammenhang standen, bot dies einen geeigneten visuellen Marker für das Fortschreiten der Aktivität beim Ionenaustauschverfahren.
Die aus Plasma oder Cohn Fraktion IV gewonnenen, ALS-enthaltenden Fraktionen (wie oben ausführlich beschrieben) wurden auf eine der beiden folgenden IGF- Affinitätssäulen aufgebracht: (1) Affi-Gel 15-Säule (1 x 12 cm), an die 3 mg IGF-II, genau wie zuvor beschrieben, gekoppelt worden waren (Martin, J.L., und Baxter, R.C. (1986) J. Biol. Chem. 261, 8754 - 8760) oder (2) Affi-Gel 10-Säule (1 x 15 cm), an die ein Gemisch, das etwa 5 mg IGF-I und 2 mg IGF-II enthielt, nach dem gleichen Verfahren gekoppelt worden war. Die Affinitätssäule wurde mit BP-53 beladen, das genau wie zuvor beschrieben hergestellt worden war (Martin, J.L., und Baxter, R.C. (1986) oben)). Kurz gesagt wurden 600 g Cohn-Paste, mit 5 Volumgeilen 2 M Essigsäure, 75 mM NaCl, homogenisiert, das Gemisch zentrifugiert und der Überstand durch 2-3-tägiges Rühren mit etwa 400 ml gepacktem Volumen von SP-Sephadex C-25, das im homogenisierenden Puffer bei einem pH-Wert von 3,0 äquilibriert worden war, von endogenen IGFs befreit. Das Gemisch wurde zur Entfernung des Gels zentrifugiert und der Überstand in zwei Schritten auf einen pH-Wert 6,5 eingestellt, wie bereits beschrieben (Martin, J.L., und Baxter, R.C. (1986), oben). Der Überstand mit einem pH- Wert von 6,5 wurde dann mit etwa 0,5 ml/min auf die Affinitätssäule gepumpt und die Säule mit 1 - 2 ml/min mit 250 ml 50 mM Na-Phosphat, 0,5 M NaCl, pH-Wert 6,5, und 100 ml 50 mM Na-Phosphat, pH-Wert 6,5, gewaschen.
ALS-haltige Fraktionen aus der DEAE-Sephadex-Chromatographie wurden mit 0,1 - 0,15 ml/min auf die mit BP-53 beladene IGF-Affinitätssäule gepumpt. Dies führte typischerweise zum Festhalten von mehr als 90% der ALS-Aktivität. Die Säule wurde mit 1 ml/min mit 150 ml 50 mM Na-Phosphat, pH-Wert 6,5, und 50 ml mM NaCl, 5 mM Na-Phosphat, pH-Wert 6,5, gewaschen, um die Pufferkapazität der Säule zu senken. ALS wurde durch Aufbringen von 50 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl, pH-Wert 8,5, auf die Säule mit 0,5 ml/min eluiert. Dies ist aus Fig.1 ersichtlich, die eine Darstellung des Elutionsvolumens aus der Affinitätssäule über ALS (ug/ml) und Absorptionsvermögen bei 280 nm zeigt. Fraktionen von 2 ml wurden in silikonisierten Glasröhrchen abgenommen und hinsichtlich ALS-Aktivität geprüft.
SDS-PAGE (10%) der immungereinigten ALS ergab unter reduzierenden Bedingungen ein Dublett von eng beeinander stehenden Banden mit einem ungefähren Molekulargewicht von 90K. Das Dublett kann auf die variierende Glykosylierung von ALS zurückzuführen sein. Keine anderen Banden waren vorhanden, was anzeigt, daß die ALS homogen war.
Als wahlweise durchgeführter Endreinigungsschritt wurde affinitätsgereinigte ALS mittels Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie fraktioniert. Probeladungen von 0,5 ml pro Versuch wurden auf eine PolyWAX-Hochleistungs-Anionenaustauschsäule aufgebracht, die mit 1,5 ml/min in 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonat äquilibriert worden war (nicht-eingestellter pH = 7,8). Die ALS wurde durch Anwendung eines linearen Salzgradienten (Model 680 Gradient Controller, Waters, Milford, MA) aus 0,05 M bis 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat (mit eingestelltem pH) 15 min lang mit 1,5 ml/min eluiert. In einigen Präparaten wurde ein konkaver Gradient (Gradient # 7, Mode 680 Gradient Controller) im gleichen Konzentrationsbereich mit vergleichbaren Ergebnissen verwendet. Das Absorptionsvermögen bei 280 nm wurde unter Verwendung eines Waters Model 441 Absorbance Detectors überwacht. Fraktionen von 0,75 ml wurden abgenommen und hinsichtlich ALS-Aktivität geprüft. Bei Verwendung eines linearen Gradienten trat aus der Säule nach 9-10-minütigem Eluieren mit 1,5 ml/min ein einziger großer Proteinpeak aus; bei Verwendung eines konkaven Gradienten betrug die Zeit 11 - 12 min. Die gesamte nachweisbare und durch RIA bestimmte ALS-Aktivität stand mit diesem Peak, durch den schätzungsweise mehr als 75% der aufgebrachten Aktivität zurückgewonnen wurden, und einer weiteren Zunahme der spezifischen Aktivität um das 1,6fache in Zusammenhang. Die ALS- Aktivität befand sich immer in einem einzelnen Peak.
Fig.2 zeigt gereinigte ALS nach der HPLC-Fraktionierung, die unter sowohl reduzierenden als auch nicht-reduzierenden Bedingungen auf einem linearen 10 - 15%- igen Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen wurde. Das Präparat trat sowohl unter nicht-reduzierenden (linkes Feld) als auch unter reduzierenden Bedingungen als ein Dublett mit einer offensichtlichen Molekularmasse von 84 und 86 kD auf. Ansäuern des Proteins (erzeugt durch Einstellen von 35 ug ALS in 50 ul 0,05 M Ammoniumhydrogencarbonat auf einen pH-Wert von 3 mit 20 ul 1 M Essigsäure, 15- minütiges Inkubieren bei 22ºC und Neutralisieren mit 10 ul 2 M Tris-Base), was zu einem beträchtlichen Aktivitätsverlust führt, hatte auf die Mobilität des Proteins bei SDS- PAGE keine Auswirkung, weder in der reduzierten noch in der nicht-reduzierten Form. Die Behandlung mit N-Glykanase (25 ug ALS, gekocht in 40 ul 0,5% SDS über einen Zeitraum von 3 min, dann in 0,55 M Na-Phosphat, pH-Wert 8,6, und Nonidet P-40 auf Endkonzentrationen von 0,2 M bzw. 1,25% verdünnt; danach wurde N-Glykanase (Genzyme Corp., Boston, MA) bis zu einer Endkonzentration von 60 Einheiten/ml hinzugefügt und das Gemisch bei 27ºC 16 h Stunden lang inkubiert), um N-gebundenes Kohlenhydrat zu entfernen, führte zu einer deutlichen Abnahme der offensichtlichen Molekülmasse auf 80 kD (nicht-reduziert, linkes Feld) und 66 kD (rechtes Feld). Das Protein wanderte nach der Deglykosylierung mit N-Glykanase als Einzelbande, was nahelegt, daß das im nativen Präparat festgestellte Dublett auf zumindest zwei Glykosylierungsvarianten zurückzuführen ist. Unter reduzierenden Bedingungen zeigte das deglykosylierte Präparat mehrere Banden im Bereich von 50 - 60 kD, was den Schluß zuläßt, daß weitere Deglykosylierung möglich ist.
Tabelle 1 faßt die Ergebnisse einer typischen ALS-Reinigung zusammen, wobei eine von vier in ähnlichem Maßstab und mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt wurde. Die aus der DEAE-Sephadex-Säule mit 0,05 M Tris-HCl, 0,6 M NaCl (pH-Wert 8,2) eluierten Fraktionen (DEAE-Eluat Nr.2) enthielten mehr als 60% der aufgebrachten ALS- Immunreaktivität und 13% des Gesamtproteins, während Fraktionen, die mit 0,15 M NaCl enthaltendem Puffer eluiert wurden (DEAE-Eluat Nr.1), nur 15% der ALS-Aktivität, jedoch 79% des Proteins enthielten. Die weitere Reinigung der DEAE-Eluat Nr.2- Fraktionen durch Affinitätschromatographie auf einer Säule von nicht-kovalent an Agarose-IGF gebundenem BP-53 ergab eine 200fache Zunahme der spezifischen ALS- Aktivität.
Die angewandte Reinigungsstrategie wurde durch die Tatsache erschwert, daß die Subeinheit bei einem niedrigen pH-Wert irreversibel inaktiviert wird, machte sich jedoch die Tatsache zunutze, daß sie bei einem hohen pH-Wert reversibel vom BP-IGF- Komplex dissoziiert wird. Der Schlüssel-Schritt bei der Reinigung ist eine ungewöhnliche Anwendung der Affinitätschromatographie, bei der der Affinitätsligand (BP-53) nicht durch eine kovalente Bindung an der Agarosematrix befestigt ist, sondern als nicht-kovalente Brücke zwischen den Agarose-IGF-Perlen und der ALS zu fungieren scheint. Rückblickend betrachtet ist es klar, daß die Verwendung einer kovalenten Agarose-BP-53-Matrix nicht funktioniert hätte, da nicht mit BP-53 verbundener IGF-I oder IGF-II nicht zur ALS-Bindung fähig ist. Der wahlweise durchgeführte letzte Schritt - die Hochleistungs-Chromatographie auf einer PolyWAX-Säule (WAX steht für schwachen Anionenaustausch, "weak anion-exchange") mit Salzgradient-Elution - ist im wesentlichen eine Wiederholung des anfänglichen Schritts der DEAE-Sephadex- Chromatographie, jedoch mit einer viel höheren Auflösung.

BEISPIEL 3

Aminoterminale Sequenz von ALS:

Die N-terminale Sequenz von ALS wurde an einer Probe von geschätzten 35 ul von HPLC-gereinigtem Material mittels Edman-Abbau unter Verwendung eines automatischen Gasphasen-Proteinsequenzers 470A von Applied Biosystems, der mit einem 120A PTH-Analyzer gekoppelt war, unter Verwendung eines Standard-PTH- Programms bestimmt. Cys-Reste wurden auf einer zweiten Probe nach Reduktion mit Mercaptoethanol und Carboxymethylierung mit Jodessigsäure bestätigt.
Bei zwei Bestimmungen zeigte die aminoterminale Analyse für den ersten Rest etwa äquimolare Mengen von Gly und Ala - trotz der Tatsache, daß das analysierte Präparat aus dem Serum eines einzigen Spenders stammte. Die Analyse der ersten 18 Reste ergab die Sequenz Gly(Ala)-Asp-Pro-Gly-Thr-Pro-Gly-Glu-Ala-Glu-Gly-Pro-Ala-Cys-Pro- Ala-Ala-Cys-, wobei die Cys-Reste an den Positionen 14 und 18 an einer reduzierten und carboxymethylierten Probe bestätigt wurden. Diese Aminosäuresequenz zeigt keine offensichtliche Homologie mit anderen IGF-Proteinen oder -Rezeptoren.

BEISPIEL 4

DEAE-Sephadex-Fraktionierung von Serum:

Das Ausgangsmaterial war eine Ammoniumsulfat-Fraktion von Serum aus 30 - 50%-iger Sättigung, hergestellt gemäß bereits veröffentlichter Tabellen (Green, A.A., und Hughes, W.L., Methods of Enzymol. 1, 67). Der resultierende Niederschlag (dialysiert gegen einen Überschuß von 50 Mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 8,2) enthielt etwa 75% der BP-53- Immunreaktivität von Vollserum. In nachfolgenden Untersuchungen stellte sich die Ammoniumsulfat-Fraktionierung als nicht erforderlich heraus, und es wurde gegen Tris- HCL-Puffer dialysiertes Vollserum verwendet. Eine 1 x 17,5 cm Säule aus DEAE- Sephadex A-50 (äquilibriert in 50 Mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 8,2) wurde mit einer dialysierten Probe von 1 ml beladen und mit 35 ml Ausgangspuffer, 50 ml Ausgangspuffer plus 0,15 Mol/l NaCl und 50 ml Ausgangspuffer plus 0,6 Mol/l NaCl eluiert. In einer Vorschrift größeren Maßstabs wurden dialysierte Proben von 10 ml auf eine 1,5 x 20 cm Säule geladen und mit 50, 100 bzw. 100 ml der drei Puffer eluiert. Der Haupt-Proteinpeak, der in Gegenwart von 0,15 Mol/l NaCl eluierte, wurde als Peak A und der in 0,6 Mol/l NaCl austretende Peak als Peak B bezeichnet (Fig.3).
Der Großteil von immunreaktivem BP-53 wurde im ersten Peak (Peak A) festgestellt, während der zweite Peak (Peak B) ALS-Aktivität mit sehr wenig an BP-53- Immunreaktivität enthielt (Fig.3 unten). Eine geringe Menge an ALS-Aktivität wurde auch in Fraktionen nachgewiesen, die der abfallenden Seite von Peak A entsprachen (nicht dargestellt). In sechs getrennten Versuchen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.
Fig.4, die drei ähnliche Versuche darstellt, zeigt die BP-53-Immunreaktivitätsprofile für diese Proteinpeaks - getrennt und gemeinsam nach der Vorinkubation und Fraktionierung durch Superose-12-Chromatographie. Die BP-53-Immunreaktivität aus Peak A eluierte vorrangig in einem breiten Peak zwischen den Fraktionen 25 und 30, was einem Molekülmassenbereich von etwa 30 - 60 K entsprach, wobei ein kleiner Peak in den Fraktionen 22 - 24 festzustellen war, der 150 K entsprach (Fig.4a). Die kaum nachweisbare BP-53-Aktivität von Peak B eluierte aus Superose-12 vor allem in den Fraktionen 23 - 25 (Fig.4b). Nach dem Vermischen von Peak A und B und 60- minütigem Vorinkubieren bei 22ºC hatten sich mehr als 50% der BP-53-Aktivität von Peak A von 30 - 60 K auf 150 K verlagert, wobei der Rest nach wie vor bei 30 - 60 K lag (Fig.4c). Dies kann mit dem BP-53-Profil in Vollserum verglichen werden, worin mehr als 90% der Aktivität bei 150K und nur 5 - 10% im Bereich von 30 - 60 K auftraten (Fig.4d). Die ALS-Aktivität von Peak B wurde, wie in Fig.4c dargestellt, durch die Dialyse von Peak B-Fraktionen gegen Tris-Puffer, der kein NaCl oder 0,6 Mol/l NaCl enthielt, nicht beeinflußt, was darauf hindeutet, daß weder der hohe Salzgehalt noch irgendein anderes, dialysierbares Molekül an der Reaktion zwischen BP-53 und der ALS in Peak B beteiligt war.

Superose-12-Fraktionierung von Serum:

Serum aus normalen Probanden wurde 1:1 mit 50 mMol/l Natriumphosphat, 0,15 Mol/l NaCl und 0,2 g/l Natriumazid (pH-Wert 6,5) verdünnt, 200ul auf die Superose-12-Säule aufgebracht und wie beim Routine-ALS-Assay eluiert. Jede Fraktion wurde dann hinsichtlich BP-53- und ALS-Aktivität untersucht.
Wie bereits in Fig.4d dargestellt, wies die BP-53-Immunreaktivität in Fraktion 23 einen Peak auf, der 150 K entsprach (Fig.5). Im Gegensatz dazu eluierte die Peak-ALS-Aktivität in drei Versuchen in reproduzierbarer Weise in Fraktion 24 (Fig.5), was 90 - 110 K entsprach und den Schluß nahelegt, daß es im Vergleich zu BP-53 einen ALS-Überschuß im Serum gibt und daß die freie Subeinheit eine offensichtliche Molekülmasse von 90 - 110 K besitzt. Ein ähnlicher Peak von ALS-Aktivität wurde in Serum festgestellt, aus dem mehr als 990/o von immunreaktivem BP-53 (d.h. im wesentlichen der gesamte 150 K- Komplex) durch Affinitätschromatographie auf einer Säule von an Agarose gekoppeltem Anti-BP-53-Antikörper (nicht dargestellt) entfernt worden war; dies bestätigte, daß die bei 90 - 110 K nachweisbare ALS nicht mit BP-53 komplexiert war. Ein vergleichbares Ergebnis wurde festgestellt, als Serum durch Ionenaustausch-Chromatographie fraktioniert (siehe Fig.3) und Peak B Superose-12-Chromatographie unterworfen wurde.
Steigende Volumina von Serum ergaben bei ihrer Untersuchung im Routine-ALS-Assay einen dosisabhängigen Anstieg des Verhältnisses von 150 K/60 K (nicht dargestellt). Die in Vollserum nachweisbare ALS schien GH-abhängig zu sein, da eine höhere Aktivität im Serum von fünf Probanden mit Akromegalie und eine niedrigere Aktivität im Serum von fünf Probanden mit GH-Mangel als in Proben von normalen Probanden festgestellt wurde. Diese GH-Abhängigkeit bietet die Grundlage für einen diagnostischen Assay zur Bestimmung von GH-Werten in Serum und kann bei der Diagnose von Wachstumsstörungen, beispielsweise unter Verwendung von gegen ALS gerichteten Antikörpern, ausgenutzt werden.

BEISPIEL 5

Säureempfindlichkeit von ALS:

Die Säureempfindlichkeit von gereinigter ALS oder ALS in Vollserum (unter Anwendung der Verfahrensweise aus Beispiel 2) wurde durch ihre irreversible Inaktivierung bei niedrigem pH-Wert bestätigt. Das Protein erwies sich bei niedrigen pH-Werten von z.B. als recht stabil, büßte darunter aber rasch an Aktivität ein (Fig.7); bei einem pH-Wert von 3 nahm das 150 K/60 K-Verhältnis um mehr als 80% ab. Diese Abnahme des 150 K/60K-Verhältnisses entspricht einer Abnahme der offensichtlichen ALS-Aktivität von mehr als 99%. Im Gegensatz dazu hatte das Ausgesetztsein gegenüber hohen pH- Werten (bis zu 10) keine Auswirkung auf die ALS-Aktivität in Vollserum oder dem gereinigten Präparat.

BEISPIEL 6

Funktionelle Untersuchungen:

Zur Bestimmung der Bindungskinetik von ALS an BP-53 wurden Inkubationen durchgeführt, die [¹²&sup5;I]-markierte ALS und verschiedene Konzentrationen von BP-53 und IGF-I oder IGF-II enthielten. Komplexe von ALS-Tracer mit BP-53 wurden nach der Immunfällung unter Verwendung von Antiserum gegen BP-53 nachgewiesen, das - wie bereits gezeigt - mit dem BP sowohl in freier als auch komplexer Form reagiert (Baxter, R.C. und Martin, J.L. (1986) J. Clin. Invest. 78, 1504 - 1512). Fig.7 (links) zeigt die Auswirkung von zunehmenden BP-53-Konzentrationen in einem Bereich von 0,25 bis 100 ng/Reagenzglas (0,016 bis 6,3 nM) auf die Komplexbildung. In Abwesenheit von IGF-I oder IGF-II gab es wenig oder überhaupt keine Reaktion zwischen ALS-Tracer und BP-53. In Gegenwart eines molaren Überschusses von IGF-I oder IGF-II (50 ng/Reagenzglas oder 22 nM) wurde eine dosisabhängige Zunahme der ALS- Tracerbindung festgestellt, die auf zu 50% spezifische Bindung an 100 ng/Reagenzglas BP-53 anstieg. Höhere Konzentrationen von BP-53 konnten aufgrund der Beschränkungen des Immunfällungssystems nicht untersucht werden. Die Komplexbildung war in Gegenwart von IGF-I durchwegs höher als bei IGF-II.
Die Bindungsaffinität zwischen ALS und BP-IGF-Komplexen wurde anhand von Untersuchungen hinsichtlich kompetitiver Bindung abgeschätzt. Wie dies für einen typischen Versuch in Fig.7 (rechts) gezeigt wird, war die Bindung von [¹²&sup5;I]-markierter ALS wiederum in Gegenwart von IGF-I stärker als bei IGF-II. In drei ähnlichen Versuchen betrug die mittlere spezifische Bindung (± SEM) an 10 ng/Reagenzglas BP-53 um die in Abwesenheit von BP-53 ausgefällte Radioaktivität korrigiert) 24,3±4,4% in Gegenwart eines Überschusses an IGF-I und 19,6±3,9% in Gegenwart eines Überschusses an IGF-II (P = 0,009 laut doppelten t-Tests). Zunehmende Konzentrationen unmarkierter ALS bewirkten eine dosisabhängige Verdrängung von [¹²&sup5;I]-markierter ALS aus den immungefällten Komplexen. Die Analyse der Bindungsdaten durch Scatchard-Abbildung zeigte eine nicht-spezifische Bindungskomponente (Assoziationskonstante < 10&sup6; Mol&supmin;¹) und eine einzelne spezifische Bindungskomponente mit einer geringfügig höheren Affinität für BP-IGF-I als für BP-IGF-II. In drei ähnlichen Versuchen betrug die mittlere Assoziationskonstante (± SEM) für die ALS-Bindung an BP-IGF-I 6,06±0,71 x 10&sup8; Mol&supmin;¹ und für die ALS-Bindung an BP-IGF-II 4,12±0,29 x 10&sup8; Mol&supmin;¹. Die Bindungsstellenkonzentration betrug 1,28± 0,46 Mol ALS/Mol BP-53 in Gegenwart von IGF-I und 1,18±0,29 Mol/Mol in Gegenwart von IGF-II, wenn man annimmt, daß die Molekülmassen von ALS und BP-53 86 bzw. 53 kD betragen. Wenn die Berechnung auf der reduzierten Molekülmasse von 43 kD für BP-53 beruht, sind die Bindungsstellen-Konzentrationen 1,04±0,37 Mol/Mol bzw. 0,96±0,33 Mol/Mol. Dieses Ergebnis stimmt mit einer einzelnen Bindungsstelle für ALS pro Molekül BP-53 überein.
Die mangelnde Auswirkung von ALS auf die Wechselwirkung zwischen BP-53 und den IGFs ist in Fig.8 dargestellt. [¹²&sup5;I]-markierter IGF-II zeigte durchwegs eine höhere Bindung bei steigenden Konzentrationen von BP-53 als [¹²&sup5;I]-markierter IGF-I. Die Bindung beider Tracer wurde durch die Zugabe von 100 ng reiner ALS pro Reagenzglas (Fig.8, links) nicht beeinflußt. Kurven der kompetitiven Bindung für die Verdrängung von [¹²&sup5;I]-markiertem IGF-II von BP-53 durch steigende Konzentrationen von unmarkiertem IGF-I und IGF-II sind in Fig.8 dargestellt (rechts). IGF-II war bei der Verdrängung des Tracers von BP-53 durchwegs wirksamer als IGF-I, und keine der beiden Verdrängungskurven wurde durch die Zugabe von 100 ng/Reagenzglas ALS beeinflußt. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, als man [¹²&sup5;I]-markierten IGF-I als Tracer verwendete (nicht dargestellt).
Zur Bestätigung, daß reine ALS BP-53 in die 150 kD-Form umwandeln kann, wurden Inkubationsgemische, die jenen ähnelten, die in den Versuchen hinsichtlich konkurrierender Bindung, die in Fig.8 dargestellt und verwendet wurden, durch Gelchromatographie auf Superose 12 fraktioniert.
[¹²&sup5;I]-markierter IGF-II trat als einzelner Radioaktivitätspeak auf, wobei in Fraktion 34 der Spitzenwert erreicht wurde. Die Inkubation dieses Tracers mit reiner ALS (100 ng/200 ul) vor der Fraktionierung hatte keine Auswirkung auf das Radioaktivitätsprofil, was anzeigt, daß ALS alleine IGF-II-Tracer nicht binden konnte (Fig.9, links). Die Inkubation von IGF-II-Tracer mit 1 ng/200 ul reines BP-53 führte zur Umwandlung von 70% der Radioaktivität in eine Form von 60 kD, d.h. BP-53-IGF-I. Als diese Inkubation auch 100 ng/200 ul reine ALS beinhaltete, wurde der 60 kD-Komplex im wesentlichen in eine 150 kD-Form umgewandelt (Fig.4, rechts), was zeigte, daß die Komplexbildung keine anderen Komponenten als reinen IGF, reines BP-53 und reine ALS benötigte.

BEISPIEL 7

Hemmung der ALS-Bindung an BP-53-IGF-I:

Verschiedene Substanzen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, das Binden von Tracer BP-53-IGF-I an ALS zu hemmen. Menschliches Serum enthielt, wenn es angesäuert und wieder neutralisiert wurde, um seine endogene ALS-Aktivität zu zerstören und sein säureunempfindliches BP-53 intakt zu lassen, eine hochwirksame, kompetitive Aktivität. Bei Vergleich mit Proben von normalen, an Akromegalie und GH-Mangel leidenden Probanden zeigte die kompetitive Aktivität auf diese Weise in drei getrennten Versuchen eine starke GH-Abhängigkeit, wie für das endogene BP-53 in solchen Proben zu erwarten war. Ein solcher Versuch ist in Fig.10a dargestellt. Als die Kurven in Fig.8a hinsichtlich ihres immunreaktiven BP-53-Anteils jeder Probe erneut aufgetragen wurden, konnte man sie übereinanderlegen (Fig.10b); dies zeigt an, daß das endogene BP-53 in angesäuertem Vollserum mit vernetztem Tracer in der ALS-Reaktion konkurrieren konnte. Unter den in diesem Assay herrschenden Bedingungen wurde der vernetzte Tracer durch etwa 1 Pg BP-53/ml Reaktionsvolumen (d.h. 250 ng/250 ul) vollständig aus dem BP-ALS-Komplex verdrängt, wobei die Hälfte der maximalen Verdrängung bei 200 - 250 ng/ml BP-53 auftrat.
Im Gegensatz zum endogenen BP-53 in angesäuertem Serum war reines BP-53 bei der Untersuchung mit bis zu 0,8 ug/ml nicht in der Lage, mit dem vernetzten Tracer in der ALS-Reaktion zu konkurrieren (Fig.11). Nach 30-minütiger Vorinkubation bei 22ºC mit einem 3,5fachen molaren Überschuß von reinem, menschlichem IGF-I oder IGF-II (d.h. 500 ng IGF/ug BP-53) konnte jedoch gereinigtes BP-53 den vernetzten Tracer vollständig aus dem BP-53-ALS-Komplex verdrängen. Die folgenden Substanzen wurden auch untersucht, wobei sich zeigte, daß sie in der ALS-Reaktion nicht konkurrierten: BP-28 aus gereinigtem Fruchtwasser (0,8 ug/ml), mit überschüssigem IGF-I oder IGF-II vorinkubiertes BP-28 (0,5 ug/ml) oder menschliches GH (20 ug/ml). Diese Versuche zeigen wiederum, daß nur an IGF-I oder IGF-II gebundenes BP-53 an der Reaktion mit ALS beteiligt sein kann und stellen deutliche Hinweise dar, daß BP-28, gebunden oder nicht, mit ALS nicht reagieren kann. TABELLE 1 Reinigung der säureempfindlichen Subeinheit aus menschlichem Serum Die Reinigungsschritte waren wie in Beispiel 2 beschrieben. Die ALS is ein reines Standardpräparat, wie durch Radioimmunoassay bestimmt. DEAE-Eluat Nr-1 bezieht sich auf den Pool von Fraktionen, die mit 0,15 M NaCl enthaltendem Puffer aus DEAE- Sephadex eluiert werden. DEAE-Eluat Nr-2 bezeiht sich auf den Pool von Fraktionen, die mit 0,5 M NaCl enthaltendem Puffer eluiert werden; dieser Pool wurde vor dem Assay dialysiert. Affinitätseluat ist der Pool von Fraktionen, die aus der Affinitätssäule eluiert und dann durch Ultrafiltration aufkonzentriert werden. HPLC-Pool ist der Pool der aus dem HPLC-Schritt gewonnenen aktiven Fraktionen. Reinigungsschritte Volumen Gesamtprotein Gesamt-ALS ALS-spezifische Aktivität Reinigungs-Faktor Gewinnung ug/mg Protein fach Serum DEAE-Eluat Affinitätseluat HPLC-Pool

Claims

1. Säureempfindliche Subeinheit ("acid-labile sub-unit", ALS) des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein in biologisch reiner Form mit einer Reinheit von zumindest 65 Gew.-%, gekennzeichnet durch ihre Unfähigkeit, sich an nicht-komplexierten IGF-I, IGF-II oder BP-53 zu binden, und ihre Fähigkeit, sich an mit IGF-I komplexiertes BP-53 zu binden.

2. Stoffzusammensetzung, die die ALS nach Anspruch 1 umfaßt.

3. ALS nach Anspruch 1 oder 2, die ein Molekulargewicht von ungefähr 80 - 115 kD aufweist, mittels reduzierender SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt.

4. ALS nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 3 mit der folgenden N-terminalen Teil- Aminosäuresequenz:

worin die erste Aminosäure Gly oder Ala sein kann.

5. Verfahren zur Herstellung des in-vivo-IGF-Bindeprotein-Komplexes, umfassend den Schritt des miteinander Vermischens von IGF, säureunempfindlichem IGF- Bindeprotein (BP-53) und der ALS nach Anspruch 1.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der IGF und BP-53 biologisch rein sind.

7. Zusammensetzung, die den in-vivo-IGF-Protein-Komplex enthält und nach Anspruch 5 oder 6 hergestellt wurde, in Verbindung mit einem pharmazeutisch oder tierärztlich annehmbaren Träger oder Exzipienten.

8. In-vivo-IGF-Protein-Komplex, der nach Anspruch 5 oder 6 hergestellt wurde, zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden.

9. In-vivo-IGF-Protein-Komplex, der nach Anspruch 5 oder 6 hergestellt wurde, zur Verwendung bei der Förderung des Zellwachstums von Tieren und Menschen.

10. Verfahren zur Reinigung von ALS, der säureempfindlichen Subeinheit des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein, umfassend die Schritte:

(a) Aufbringen einer ALS-Quelle auf eine Trägermatrix, an der IGF angebracht ist, der an das säureunempfindliche IGF-Bindeprotein gebunden oder daran assoziiert ist, wodurch sich die ALS in dem aufgebrachten Material an das säureunempfindliche Bindeprotein zu einem ternären Komplex bindet, und nicht-gebundenes Material von der Trägermatrix abgetrennt wird; und

(b) selektives Eluieren und Gewinnen des ALS-Proteins aus dem IGF-Protein- Komplex.

11. Verfahren zur Reinigung von ALS, der säureempfindlichen Subeinheit des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein, umfassend die Schritte:

(a) Binden von IGF an eine Trägermatrix;

(b) Zugeben des säureunempfindlichen IGF-Bindeproteins zur Trägermatrix, damit es sich an den IGF bindet;

(c) Aufbringen einer ALS-Quelle auf die Trägermatrix, wodurch sich die ALS in dem aufgebrachten Material an das säureunempfindliche Bindeprotein zu einem ternären Komplex bindet, und nicht-gebundenes Material von der Trägermatrix abgetrennt wird; und

(d) selektives Eluieren und Gewinnen des ALS-Proteins aus dem IGF-Protein- Komplex.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die ALS-Quelle menschliches Plasma oder die Cohn-Fraktion IV von menschlichem Plasma ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die auf die Trägermatrix aufgebrachte ALS-Quelle teilweise gereinigt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die ALS-Quelle durch Fraktionierung auf einem ionischen Harz teilweise gereinigt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das ionische Harz ein Kationenaustauschharz ist.

16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 - 15, worin die eluierte ALS aus Schritt (d) durch HPLC oder FPLC weiter fraktioniert wird.

17. ALS nach Anspruch 1, gereinigt nach dem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 - 16.

18. Verfahren zum Bestimmen von ALS, der säureempfindlichen Subeinheit des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein, umfassend die Schritte:

(a) Binden von Proteinen aus einer biologischen Flüssigkeit an eine Trägermatrix;

(b) Umsetzen der Trägermatrix mit Antikörpern gegen ALS; und

(c) Bestimmen der Antikörper-Bindung.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die biologische Flüssigkeit Serum ist.

20. Verfahren zum Bestimmen der Mengen an ALS, der säureempfindlichen Subeinheit des Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein, in einer Körperflüssigkeit, das das Fraktionieren der Körperflüssigkeit auf einer Größenfraktionierungs-Matrix, um freie ALS von anderen Komponenten des den Insulinwachstumsfaktor bindenden Komplexes zu trennen, und anschließendes Quantifizieren der Mengen an ALS in der fraktionierten Probe umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Mengen an ALS in der dem Körper entnommenen Probe durch Messen des Ausmaßes der Bildung eines rekonstituierten Komplexes von insulinähnlichem Wachstumsfaktor mit Bindeprotein bestimmt werden.

22. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Mengen an ALS durch Bestimmen des Ausmaßes der Bindung von Anti-ALS-Antikörpern an ALS in der fraktionierten Probe quantifiziert werden.

23. Rekombinante Nukleinsäuresequenz, die für die säureempfindliche Subeinheit (ALS) von insulinähnlichem Wachstumsfaktor kodiert.

24. Rekombinante Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 23, die für ALS kodiert, wobei die ALS die folgende N-terminale teilweise Aminosäuresequenz aufweist:

worin die erste Aminosäure Gly oder Ala sein kann.

25. Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 23 enthält.

26. Wirtszelle, die eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle ist und mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 25 transformiert wurde.

27. Rekombinante Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 23, die cDNA ist.

28. ALS, produziert durch die Wirtszelle nach Anspruch 26.

29. Antikörper-Reagens, das zur Bindung an ALS befähigt ist.

30. Antikörper-Reagens nach Anspruch 29, das ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.

31. Antikörper-Reagens nach Anspruch 29 oder 30, das mit einer oder mehreren Reportergruppen markiert ist.

32. Antikörper-Reagens nach Anspruch 31, worin die Reportergruppe aus fluoreszierenden Gruppen, Enzymen oder kolloidalen Gruppen ausgewählt ist.

33. Nukleinsäure-Isolat, umfassend Nukleinsäure, die für die Sequenz:

kodiert, worin die erste Aminosäure Gly oder Ala sein kann.

34.Nukleinsäure-Isolat, umfassend Nukleinsäure, die für die Reste

1-5, 2-7, 5-9, 7-11, 8-14, 11-15, 13-17, 3-9, 2-8, 4-10, 6-12, 8-14, 10-16, 12-18, 1-6, 3-9, 5-11, 7-13, 9-15, 11-17, 4-9, 6-11, 8-13, 10-15 oder 12-17 von ALS kodiert.

35. Nukleinsäure-Isolat nach Anspruch 33 oder 34, das weiters einen replizierbaren Vektor umfaßt.

36. Nukleinsäure-Isolat nach Anspruch 33, das weiters Nukleinsäure umfaßt, die für eine Sekretionssignalsequenz kodiert, die an das 5'-Ende von Nukleinsäure ligiert ist, die für die Sequenz:

kodiert, worin die erste Aminosäure Gly oder Ala sein kann.

37. Wirtszelle, die mit dem Isolat nach irgendeinem der Ansprüche 33 - 36 transformiert wurde.

38.Polypeptid, das ein ALS-Fragment umfaßt, das eine Sequenz der Reste 1-5, 2-7, 5-9, 7-11, 8-14, 11-15, 13-17, 3-9, 2-8, 4-10, 6-12, 8-14, 10-16, 12-18, 1-6, 3-9, 5-11, 7-13, 9-15, 11-17, 4-9, 6-11, 8-13, 10-15, oder 12-17 von ALS enthält.

39. ALS nach Anspruch 1 mit einer Reinheit von zumindest 75 Gew.-%.

40. ALS nach Anspruch 1 mit einer Reinheit von zumindest 80 Gew.-%.