DE68923107T2

DE68923107T2 - DNA-Sequenzen, rekombinante DNA-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von Lipocortin III, IV, V, und VI.

Info

Publication number: DE68923107T2
Application number: DE68923107T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey L Browning; R Blake Pepinsky; Barbara P Wallner
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-20
Publication date: 1996-01-18
Anticipated expiration: 2009-02-21
Also published as: ATE124087T1; EP0330396B1; EP0330396A3; ES2096556T3; DE68923107D1; EP0330396A2; US5298489A; US5484711A; JPH025869A; GR3017474T3

Description

Stand der Technik

Lipocortine sind eine Familie von Proteinen, die an der Regulation verschiedener Entzündungsparameter beteiligt sind [R. J. Flower et al., Macrocortin And The Mechanism Of Action Of The Glucocorticoids", Advances in Inflammation Research 7 (1984), 61-69; M. DiRosa, "Role In Inflammation Of Glucocorticoid-Induced Phospholipase Inhibitory Proteins", Prof. Biochem. Pharmacol. 20 (1985), 55-62]. Man nimmt an, daß Lipocortine ihre entzündungshemmende Wirkung ausüben, indem sie Phospholipase A&sub2; hemmen [F. Hirata et al., "A Phospholipase A&sub2; Inhibitory Protein In Rabbit Neutrophils Induced By Glucocorticoids", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 Nr. 5, (1980), 2533- 2536]. Das Enzym Phospholipase A&sub2; wirkt auf Membranphospholipide, wobei Arachidonsäure freigesetzt wird, diese ist ein Vorläufer in der Synthese von Verbindungen, wie Prostaglandinen, Hydroxysäuren und Leukotrienen, die an der Entzündungsreaktion beteiligt sind.
Mit Protein-Rohpräparaten wurden bereits zahlreiche Studien durchgeführt, kürzlich haben die mit gereinigten Lipocortinen durchgeführten Studien bestätigt, daß diese Proteine wirksam die Produktion von Entzündungsmediatoren hemmen [B. Rothhut et al., "Purification and Characterisation Of A 32 kDa Phospholipase A&sub2; Inhibitory Protein (Lipocortin) From Human Peripheral Blood Mononuclear Cellsu, FEBS Letters 219 (1987), 169-175]. Außerdem wurde gezeigt, daß rekombinante Lipocortine die Wirkung von Phospholipase hemmen, sowohl in in vitro-Tests [G. Cirino et al., "Recombinant Human Lipocortin 1 Inhibits Thromboxane Release From Guinea-Pig Isolated Perfused Lung", Nature 328 (1987), 270-272; G. Cirino und R. J. Flower, "Human Recombinant Lipocortin 1 Inhibits Prostacyclin Production By Human Umbilical Artery In Vitro", Prostaglandins 34 (1987), 59-62] als auch in einem in vivo-Modell der Entzündungsreaktion [G. Cirino et al., "Anti-Inflammatory Action of Human Recombinant Lipocortin 1 In The Rat Paw Oedema Test", eingereicht bei Nature].
Die Lipocortine sollten aufgrund ihrer gezeigten entzündungshemmenden Wirkung nützlich sein, um solche Störungen zu behandeln, die durch entzündliche Prozesse gekennzeichnet sind. Beispiele umfassen arthritische, allergische, dermatologische, ophthalmologische und Kollagen-Krankheiten. Außerdem könnte die Verwendung von Lipocortinen Nebenwirkungen verhindern, die bei Behandlung mit den herkömmlichen entzündungshemmenden Mitteln auftreten.
Bis jetzt wurden in verschiedenen tierischen Geweben verwandte Lipocortin-Proteine mit Molekulargewichten von etwa 70, 55, 40, 30 und 15 kd entdeckt, K.-S. Huang et al., "Two Human 35 kd Inhibitors of Phospholipase A&sub2; Are Related To Substrates Of pp60v-src And Of The EGF Receptor/Kinase", Cell 46 (1986), 191-199. Eine genaue Beschreibung der Familie der Lipocortine war jedoch bisher schwierig, da es noch keine Strukturuntersuchungen gab.
Die DNA-Rekombinations-Technik verspricht einen bahnbrechenden Fortschritt auf diesem Gebiet. Erstens wird diese Technologie dazu beitragen, den Umfang der Familie der Lipocortine zu definieren, indem die Primärstruktur der dazugehörigen Proteine aufgeklärt wird. Zweitens ist es wünschenswert, daß unter Anwendung der DNA-Rekombinations-Technik große Mengen von Lipocortinen hergestellt werden können. Lipocortine können zwar aus biologischen Quellen gereinigt werden, die Herstellung durch rekombinante Verfahren ist jedoch wirtschaftlicher. Außerdem ermöglichen rekombinante Verfahren die Synthese großer Mengen von gewünschten Fragmenten oder anders modifizierten Versionen nativer Lipocortine.
Zwei Lipocortin-Gene wurden bereits früher cloniert [Wallner et al., "Cloning And Expression of Human Lipocortin, A Phospholipase A&sub2; Inhibitor With Potential Anti-Inflammatory Activity", Nature 320 (1986), 77-80; Huang et al., (1986); C. J. M. Saris et al., "The Sequence Of The cDNA For The Protein Kinase Substrate, p36, Reveals A Multi-domain Protein With Internal Repeats", Cell 46 (1986), 201-212]. Beide codieren homologe 38 kd-Proteine mit 50% Aminosäurehomologie. Diese zwei Proteine wurden von Huang et al., 1986, mit Lipocortin I und Lipocortin II bezeichnet.
WO88/05659 offenbart die Isolierung von Lipocortinen, die PAP-I, das mit Lipocortin V identisch zu sein scheint, PAP-II, PAP-III, PAP-IV genannt werden, und die Herstellung von PAP-I in Hefe.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt rekombinante DNA-Moleküle, die durch eine DNA-Sequenz gekennzeichnet sind, die ein Lipocortin codiert und die ausgewählt ist aus der Gruppe:
(a) codierende Sequenz der cDNA-Insertion von λHLipo III-5 (ATCC Nr. 68806),
(b) DNA-Sequenzen, die mit der vorstehenden DNA-Insertion hybridisieren und die bei Expression ein Lipocortin codieren, und
(c) DNA-Sequenzen, die hinsichtlich einer der Sequenzen von (a) oder (b) degeneriert sind.
Außerdem sind rekombinante DNA-Moleküle, die diese Sequenzen enthalten, mit ihnen transformierte Wirte und Lipocortin III Teil dieser Erfindung.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, rekombinanten DNA- Moleküle, Wirte und Verfahren ermöglichen die Produktion von Lipocortin III zur Verwendung in der Behandlung von arthritischen, allergischen, dermatologischen, ophthalmologischen und Kollagen-Krankheiten, die entzündliche Prozesse beinhalten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In Figur 1 ist die Absorption der Fraktionen dargestellt, die von einer DEAE-Cellulose-Säule gesammelt wurden, die mit einem nicht-partikelförmigen Extrakt aus vereinigten Ratten- Peritonealspülflüssigkeiten beladen worden war. Die durchgezogenen Linien geben die Phospholipase-A&sub2;-Hemmaktivität an. Die gestrichelten Linien geben das Gesamtprotein an.
Figur 2 zeigt eine Analyse von gereinigten Ratten-Peritonealproteinen durch Polyacrylamid-Elektrophorese in SDS ("SDS- PAGE"), die eine Hemmwirkung auf Phospholipase A&sub2; zeigten. Die Proteine wurden entweder mit Coomassie-Blau gefärbt oder einem Western-Blotting mit Antiseren gegen Lipocortine unterworfen. Die Bahnen 1, 3 und 4 wurden mit den Ratten-Lipocortinen I, III bzw. V beladen, die Bahnen 2 und 5 wurden mit den Rinder- Lipocortinen II und VI beladen.
Figur 3 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz für menschliches Lipocortin III, die durch Analyse von λHLipo III- 5 bestimmt wurde, sowie die vorausgesagte Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins.
Figur 4 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz für menschliches Lipocortin V, das durch die Analyse von λHLipo V-1 bestimmt wurde, und die vorausgesagte Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins.
Figur 5 zeigt eine Analyse von aus Rinder-Darmschleimhaut isolierten Lipocortinen durch SDS-PAGE. Bahn 1' zeigt das Gelprofil der intakten Form und der 33 kd-Form (Bahn 1) des rekombinanten menschlichen Lipocortin I, während die Bahnen 2 bis 6 die Gelprofile der fünf gereinigten Rinderproteine (Lipocortine II bis VI) zeigen. Die Bahnnummern bezeichnen die einzelnen Mitglieder der Familie.
Figur 6 zeigt Peptidkarten von Bromcyan-Fragmenten von menschlichen Lipocortinen und Rinderdarm-Lipocortinen aus dem in Figur 5 dargestellten Gel. Die Peptidfragmente wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Bahnnummern bezeichnen die einzelnen Mitglieder der Familie.
Figur 7 zeigt tryptische Karten von Rinder-Lipocortinen. HPLC-gereinigte Rinder-Lipocortine wurden mit Trypsin gespalten, wie von Huang et al., 1986, beschrieben, und durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C&sub8;-Säule mit engem Durchmesser aufgetrennt. Die einzelnen Lipocortine sind jeweils in der Figur angegeben.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die folgende ausführliche Beschreibung dient dem besseren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung.
In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet:

Nucleotid

-- Monomere Einheit von DNA oder RNA, die aus einem Zuckerrest (Pentose), einem Phosphat und einer heterocyclischen Stickstoffbase besteht. Die Base ist mit dem Zuckerrest über das glykosidische Kohlenstoffatom (1'-Kohlenstoffatom der Pentose) verbunden, wobei diese Kombination aus Base und Zucker ein Nucleosid genannt wird. Das Nucleotid wird durch die Base charakterisiert. Die vier DNA-Basen sind Adenin Guanin ("G") , Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").

DNA-Sequenz

-- Lineare Anordnung von Nucleotiden, die untereinander durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und 5'-Kohlenstoffatomen der nebeneinanderliegenden Pentosen verknüpft sind.

Codon

-- DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (Triplett), die über mRNA eine Aminosäure, ein Translations-Startsignal oder ein Translations-Terminationssignal codiert. Z.B. codieren die Nucleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translations- Stoppsignale und ATG ist ein Translations-Startsignal.

Leseraster

-- Gruppierung von Codons während der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen. Während der Translation muß das richtige Leseraster erhalten bleiben. Z.B. kann die DNA-Sequenz GCTGGTTGTAAG in drei Leserastern oder -phasen exprimiert werden, von denen jedes/jede eine andere Aminosäuresequenz ergibt: (STOPP)

Polypeptid

-- Lineare Anordnung von Aminosäuren, die untereinander durch Peptidbindungen zwischen der α-Aminogruppe und der Carboxygruppe der nebeneinanderliegenden Aminosäuren verknüpft sind.

Peptidase

-- Enzym, das Peptidbindungen hydrolysiert.

Genom

-- Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Es umfaßt u. a. das Strukturgen, das die Polypeptide der Substanz codiert, außerdem Operator-, Promotor- und Ribosomenbindungs- und interagierende Sequenzen, einschließlich Sequenzen, wie z .B. die Shine-Dalgarno-Sequenzen.

Gen

-- DNA-Sequenz, die mittels ihrer Matrize oder Messenger-RNA ("mRNA") eine Sequenz von Aminosäuren codiert, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist.

Transkription

-- Prozess, bei dem mRNA aus einem Gen oder einer DNA-Sequenz erzeugt wird.

Translation

-- Prozess, bei dem ein Polypeptid aus mRNA erzeugt wird.

Expression

-- Prozess, der von einem Gen oder einer DNA- Sequenz durchlaufen wird, wobei ein Polypeptid hergestellt wird. Sie stellt eine Kombination aus Transkription und Translation dar.

Plasmid

-- Nichtchromosomale doppelsträngige DNA-Sequenz, umfassend ein intaktes "Replikon", so daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingebracht wird, können die Eigenschaften dieses Organismus aufgrund der DNA des Plasmids verändert oder transformiert werden. Ein Plasmid, das das Gen für Tetracyclin-Resistenz (TET ) trägt, transformiert z.B. eine vorher gegen Tetracyclin empfindliche Zelle zu einer Zelle, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird "Transformante" genannt.

Phase oder Bakteriofhage

-- Bakterienviren, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in einer Proteinhülle oder -mantel ("Capsid") eingekapselt sind.

Cosmid

-- Plasmid, das die kohäsive ("cos")-Endstelle des Bakteriophagen Lambda enthält. Cosmide können aufgrund des Vorliegens der cos-Stelle in Lambda-Hüllprotein verpackt werden und zur Infektion eines geeigneten Wirtes verwendet werden. Die Cosmide sind als Clonierungsvehikel nützlich, da sie ein Fassungsvermögen aufweisen, das für große Fragmente fremder DNA geeignet ist.

Clonierungsvehikel

-- Plasmid, Phagen-DNA, Cosmid oder andere DNA-Sequenz, die befähigt ist, sich in einer Wirtszelle zu replizieren, gekennzeichnet durch eine oder eine kleine Zahl von Endonuclease-Erkennungsstellen, an denen solche DNA- Sequenzen in bestimmbarer Art und Weise gespalten werden können, ohne daß dabei eine essentielle biologische Funktion der DNA, z.B. die Replikation, die Produktion von Hüllproteinen, verlorengeht oder ohne daß Promotor- oder Bindestellen verlorengehen, außerdem enthalten diese DNA-Sequenzen einen Marker, der zur Identifizierung transformierter Zellen geeignet ist, wie z.B. die Tetracyclin-Resistenz oder die Ampicillin- Resistenz. Ein Clonierungsvehikel wird häufig Vektor genannt.

Clonierung

-- Prozess zum Erhalt einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem solchen Organismus oder von einer solchen DNA-Sequenz stammen, durch asexuelle Reproduktion.

Rekombinantes DNA-Molekül oder Hybrid-DNA

-- Molekül, das aus DNA-Abschnitten aus verschiedenen Genomen besteht, die außerhalb lebender Zellen End-zu-End verknüpft worden sind und die in lebenden Zellen aufrechterhalten werden können.

Expressionskontrollsequenz

-- Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen funktionell verbunden ist. Sie umfassen das lac-System, das β-Lactamase-System, das trp-System, die tac- und trc-Systeme, die Haupt-Operator- und -Promotorregionen des Phagen Lambda, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, die frühen und späten Promotoren von SV40, von Polyomavirus und Adenovirus stammende Promotoren, Metallothionin-Promotoren, den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z.B. Phos, die Promotoren der Hefe-α-mating-Faktoren und andere Sequenzen, die bekanntermaßen die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren oder Kombinationen davon kontrollieren. Für Säugerzellen kann das Gen mit einem eukaryotischen Promotor, wie z.B. dem für die frühe Region von SV40, verknüpft, an das Dihydrofolatreductase-codierende Gen gekoppelt und in Ovarzellen des chinesischen Hamsters selektiv vermehrt werden, wodurch eine Zellinie hergestellt wird, die viele Kopien aktiv transkribierter eukaryotischer Gene enthält.

Lipocortin

-- Protein, das das Enzym Phospholipase A&sub2; hemmt und mindestens eine Kopie der Consensus-Sequenz aufweist, die im wesentlichen die Aminosäuresequenz: MetLysGly LeuGlyThrAspGluAspThrLeuIleGluIleLeuThrSerArg enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Moleküle, die die Lipocortine III, IV, V und VI codieren, und Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide.
Wir hatten zwar die Möglichkeit, zur Isolierung und Clonierung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verschiedene Techniken zur Selektion und DNA-Clonierung zu verwenden, wir führten jedoch in einer Ausführungsform der Erfindung die Selektion nur auf eine bestimmte Art und Weise durch, die auf Ratten-Lipocortinen beruhte. Demgemäß reinigten wir die Ratten-Lipocortine III und V aus dem extrazellulären Überstand von Zellen des Ratten-Peritonealexsudats und bestimmten die Aminosäuresequenz von verschiedenen Fragmenten dieser Proteine. Aufgrund dieser Proteinsequenzen sythetisierten wir sodann mehrere Antisense-Oligonucleotid-DNA-Sonden, die denjenigen Bereichen des gereinigten Rattenproteins entsprachen, die eine minimale Nucleotid-Degeneration aufwiesen. Anschließend haben wir diese Sonden eingesetzt, um eine Ratten-cDNA-Genbank abzusuchen, umfassend E. coli-Zellen, die cDNA-Sequenzen enthielten, welche in einen Phagen-Clonierungsvektor eingefügt waren.
Zum Absuchen hybridisierten wir die Oligonucleotidsonden mit einer Rattenlungen-cDNA-Genbank, wobei wir einen Plaque- Hybridisierungs-Absuchtest verwendeten, und wir selektierten Clone, die mit einer ganzen Anzahl unserer Sonden hybridisierten. Nach Isolierung und Subclonierung der selektierten Ratten-cDNA-Insertionen in Plasmide bestimmten wir ihre Nucleotidsequenzen und verglichen sie mit unseren Aminosäuresequenzen aus den Peptiden des gereinigten Ratten-Lipocortins. Als Ergebnis dieses Vergleichs fanden wir, daß die Nucleotidsequenzen der isolierten Clone Aminosäuresequenzen codierten, die mit den Aminosäuresequenzen der Peptide aus unseren gereinigten Ratten-Lipocortinen identisch waren. Sodann setzten wir verschiedene Restriktionsfragmente aus den Ratten-cDNAs als Hybridisierungssonden ein, um die entsprechenden menschlichen cDNA-Genbanken abzusuchen. Wir konnten bestätigen, daß die isolierten Clone die Sequenz in voller Länge enthielten, die die menschlichen Lipocortine III und V codiert, indem wir die Sequenzen mit den bekannten Sequenzen der menschlichen Lipocortine I und II verglichen, indem wir die Position der Startund Stopp-Codons in den richtigen Leserastern feststellten und indem wir die erwartete Größe des Proteins berücksichtigten.
Die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen können mit Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden werden und sie können in verschiedenen Säugern oder anderen eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszellen dazu verwendet werden, um die durch sie codierten menschlichen Lipocortin-Polypeptide herzustellen.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung isolierten wir aus der Rinder-Darmschleimhaut die Lipocortine IV und VI. Wir bestimmten die Aminosäuresequenzen von tryptischen Fragmenten dieser Polypeptide. Aufgrund der Daten der Aminosäuresequenz können synthetische DNA-Sonden hergestellt werden, die Sonden können sodann verwendet werden, um eine Rinder-Genbank auf die cDNAs abzusuchen, die die Lipocortine IV und VI codieren. Die menschlichen cDNAs können isoliert werden, indem man Rinder-cDNAs als Sonden in gleicher Art und Weise einsetzt, wie für die Lipocortine III und V beschrieben. Die vollständige Sequenz der menschlichen Lipocortine IV und VI kann anschließend bestimmt werden, indem die auf diese Weise isolierte cDNA sequenziert wird. Ferner kann die cDNA in eukaryotischen und prokaryotischen Wirtszellen zur Expression der Lipocortin-Proteine eingesetzt werden.
Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten menschlichen Lipocortine sind als entzündungshemmende Mittel und in entzündungshemmenden Verfahren und Therapien nützlich. Solche Mittel können z.B. eine bestimmte Menge eines Lipocortins, das als entzündungshemmendes Mittel pharmazeutisch wirksam ist, und einen pharinazeutisch verträglichen Träger umfassen. Solche Therapien umfassen im allgemeinen ein Verfahren zur Behandlung von Patienten mit diesen Mitteln in pharmazeutisch verträglicher Art und Weise.

Material und Methoden

Zur Clonierung oder Expression der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, die die menschlichen Lipocortine codieren, können verschiedene Wirt/Clonierungsvehikel-Kombinationen verwendet werden. Nützliche Clonierungs- oder Expressionsvehikel können z.B. bestehen aus Abschnitten von chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen, wie z.B. verschiedenen bekannten Derivaten von SV40 und bekannten bakteriellen Plasmiden, z.B. Plasmiden von E. coli, einschließlich colE1, pCR1, pBR322, pMB9 und ihren Derivaten; Plasmiden mit größerem Wirtsbereich, z.B. RP4, Phagen-DNAs, z.B. den zahlreichen Derivaten des Phagen Lambda, z.B. NM 989; sowie anderen DNA-Phagen, z.B. M13 und filamentösen, einzelsträngigen DNA-Phagen und Vektoren, hergeleitet aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs, wie z.B. Plasmiden, die zum Einsatz von Phagen-DNA modifiziert worden waren, oder anderen Expressionskontrollsequenzen oder Hefeplasmiden, wie z.B. dem 2u-Plasmid oder Derivaten davon.
In jedem spezifischen Clonierungs- oder Expressionsvehikel können verschiedene Stellen für die Insertion der erfindungsgemäßen menschlichen Lipocortinprotein-DNA-Sequenzen ausgewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise durch die Restriktionsendonuclease bezeichnet, die an diesen Stellen spaltet, wobei sie dem Fachmann wohlbekannt sind. Verschiedene Verfahren sind bekannt, mit denen man durch Insertion von DNA- Sequenzen in diese Stellen rekombinante DNA-Moleküle erzeugen kann. Diese umfassen z.B. dG-dC- oder dA-dT-Tailing, die direkte Ligierung, synthetische Linker, Reaktionen unter Beteiligung von Exonuclease und Polymerase mit anschließender Ligierung oder Verlängerung des DNA-Strangs mit DNA-Polymerase und einer geeigneten einzelsträngigen Matrize mit anschließender Ligierung. Natürlich muß es so verstanden werden, daß ein in dieser Erfindung nützliches Clonierungs- oder Expressionsvehikel nicht unbedingt eine Restriktionsendonucleasestelle zur lnsertion des ausgewählten DNA-Fragments haben muß. Stattdessen kann das Vehikel auch auf andere Art und Weise mit dem Fragment gekoppelt werden.
Außerdem können verschiedene Expressionskontrollsequenzen ausgewählt werden, um die Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen zu bewirken. Diese Expressionskontrollsequenzen umfassen z.B. das lac-System, das β-Lactamase-System, das trp- System, das tac-System, das trc-System, die Haupt-Operator- und -Promotorregionen des Phagen Lambda, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor für 3-Phosphorglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z.B. Phos, die Promotoren der Hefe-α-mating-Faktoren oder von Actin, Promotoren für Säugerzellen, wie z.B. den frühen Promotor von SV40, den späten Promotor von Adenovirus und den Metallothionin-Promotor, sowie andere Sequenzen die bekanntermaßen die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen, ihrer Viren und verschiedener Kombinationen davon kontrollieren. Bei Säugerzellen ist es außerdem möglich, die Expressionseinheiten zu vermehren, indem man das Gen an das Gen für Dihydrofolatreduktase koppelt und eine Auswahl davon auf Wirtsovarzellen des chinesischen Hamsters aufträgt.
Zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen werden diese DNA-Sequenzen mit einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Expressionskontrollsequenzen im Expressionsvektor funktionell verbunden. Eine solche funktionelle Kopplung, die durchgeführt werden kann, bevor oder nachdem die gewählte menschliche Lipocortin-DNA-Sequenz in ein Clonierungsvehikel eingefügt wird, bewirkt, daß die Expressionskontrollsequenzen die Expression der DNA-Sequenzen kontrollieren und unterstützen.
Der Vektor oder das Expressionsvehikel und insbesondere die Stellen darin, die für die Insertion des selektierten DNA- Fragments und der in dieser Erfindung verwendeten Expressionskontrollsequenz ausgewählt werden, werden durch verschiedene Faktoren bestimmt, z.B. Anzahl der Stellen die für ein bestimmtes Restriktionsenzym empfindlich sind, Größe des zu exprimierenden Proteins, Expressionsmerkmale, wie z.B. die Lage der Start- und Stopp-Codons bezogen auf die Vektorsequenzen, und andere Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind. Die Auswahl eines Vektors, einer Expressionskontrollsequenz und einer Insertionsstelle für eine bestimmte Lipocortin-Sequenz wird durch ein Gleichgewicht dieser Faktoren bestimmt, wobei in einem gegebenen Fall nicht jede Zusammenstellung gleich wirksam ist.
Außerdem sollte es so verstanden werden, daß die die erfindungsgemäßen Lipocortin-Proteine codierenden DNA-Sequenzen&sub7; die an der ausgewählten Stelle eines Clonierungs- oder Expressionsvehikels eingefügt werden, auch Nucleotide umfassen können, die nicht Teil des eigentlichen Gens sind, welches das gewünschte Lipocortin codiert, oder daß sie auch nur ein Fragment des gesamten Gens für dieses Protein umfassen können. Die einzige Voraussetzung dabei ist, welche DNA-Sequenz auch verwendet wird, daß es dazu kommt, daß ein transformierter Wirt ein Lipocortin-Protein produziert. Z.B. können die erfindungsgemäßen Lipocortin-DNA-Sequenzen im gleichen Leseraster in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor an mindestens einen Teil einer DNA-Sequenz, die mindestens ein eukaryotisches oder prokaryotisches Carrier-Protein codiert, oder einer DNA-Sequenz, die mindestens eine eukaryotische oder prokaryotische Signalsequenz codiert, oder Kombinationen davon fusioniert werden. Solche Kontruktionen können zur Expression der gewünschten Lipocortin-DNA-Sequenz beitragen, die Reinigung verbessern oder die Freisetzung, und vorzugsweise die Reifung, des Lipocortins aus der Wirtszelle bewirken. In einer anderen Ausführungsform kann die Lipocortin-DNA-Sequenz ein ATG-Start- Codon alleine oder zusammen mit anderen Codons umfassen, das direkt an die Sequenz fusioniert ist, die die erste Aminosäure eines reifen, nativen Lipocortins codiert. Solche Konstruktionen ermöglichen die Produktion z.B. eines Methionyl- oder anderen Peptidyl-Lipocortins, das Teil der Erfindung ist. Das N- terminale Methionin oder Peptid kann anschließend nach verschiedenen bekannten Verfahren intra- oder extrazellulär abgespalten werden, oder das Polypeptid, bei dem das Methionin an dem Peptid gebunden bleibt, kann in den entzündungshemmenden Mitteln und Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden. Außerdem kann das Lipocortin direkt ohne Spaltung dieser oder anderer Peptid-Präsequenzen eingesetzt werden.
Das Clonierungsvehikel oder der Expressionsvektor, das/der die erfindungsgemäße Lipocortin-codierende Sequenz enthält, wird gemäß dieser Erfindung verwendet, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, so daß dieser Wirt sodann das Lipocortin-Protein exprimiert, welches durch die DNA-Sequenz codiert wird.
Nützliche Wirte zur Clonierung oder Expresssion umfassen Stämme von E. coli, wie z.B. E. coli W3110IQ, E. coli Ja221, E. coli ED8767, E. coli DH1, E. coli LE392, E. coli HB101, E. coli X1776, E. coli X2282, und Insektenzellen, Streptomyces, Hefen und andere Pilze, tierische Zellen, wie z.B. CHO-Zellen oder Mauszellen, andere tierische (einschließlich menschliche) Wirte, Pflanzenzellen in Kultur oder andere Wirte.
Auch die Auswahl eines geeigneten Wirts wird durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt, die dem Fachmann bekannt sind. Diese umfassen z.B. die Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, die Toxizität der durch das Hybridplasmid codierten Proteine, die Empfindlichkeit des gewünschten Proteins gegenüber proteolytischem Abbau durch die Enzyme der Wirtszelle, die Verunreinigung oder die Bindung des zu exprimierenden Proteins durch bzw. an Wirtszellenproteine, die während der Reinigung nur schwierig entfernt werden können, die einfache Gewinnung des gewünschten Proteins, die Expressionseigenschaften, die biologische Sicherheit und die Kosten. Ein Gleichgewicht dieser Faktoren muß unter Berücksichtigung der Tatsache abgewogen werden, daß möglicherweise nicht alle Wirt/Vektor- Kombinationen für die Clonierung oder für die Expression eines bestimmten rekombinanten DNA-Moleküls gleich wirksam sind.
Es sollte so verstanden werden, daß die gemäß dieser Erfindung hergestellen menschlichen Lipocortine Polypeptide umfassen können, die in Form von fusionierten Proteinen (z.B. gebunden an ein prokaryotisches, eukaryotisches oder kombiniertes N-terminales Segment, wodurch die, Freisetzung gesteuert, die Stabilität erhöht, die Reinigung verbessert oder eine mögliche Abspaltung des N-terminalen Segments erleichtert wird), in Form einer Vorstufe von Lipocortin-Proteinen (z.B. Start mit der gesamten oder mit Teilen einer Lipocortin-Signalsequenz oder anderen eukaryotischen oder prokaryotischen Signalsequenzen), in Form eines reifen Lipocortins oder in Form eines f-met-Lipocortins (d.h. eines Lipocortins, bei dem das am Anfang stehende Methionin nicht entfernt worden ist) vorliegen.
Eine besonders nützliche Form eines Proteins gemäß dieser Erfindung oder zumindest eine Vorstufe davon ist ein reifes Lipocortin mit einer einfach abzuspaltenden Aminosäure oder einer Reihe von Aminosäuren, die am Amino-Terminus angehängt sind. Eine solche Konstruktion ermöglicht die Synthese des Proteins in einem geeigneten Wirt, wobei ein Startsignal nötig ist, das im reifen Lipocortin möglicherweise nicht vorhanden ist, und außerdem die in vivo- oder in vitro-Spaltung der Extra-Aminosäuren, wodurch reife Lipocortine erzeugt werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Vgl. z.B., US-Patente 4 332 892, 4 338 397 und 4 425 437. Außerdem können die Polypeptide glykosyliert oder unglykosyliert sein, oder sie können ein Glykosylierungsmuster aufweisen, das von dem der nativen Lipocortine verschieden ist. Solche Glykosylierungsmuster können durch die Wirtszelle zustande kommen oder durch Behandlungen entstehen, die nach der Expression durchgeführt werden, wobei sie für das jeweilige Lipocortin ausgewählt werden müssen.
Die erfindungsgemäßen Proteine umfassen außerdem biologisch wirksame Polypeptidfragmente, die aus Lipocortinen hergeleitet wurden, indem diese mit Proteasen behandelt wurden oder indem nur ein Fragment der Lipocortin-codierenden DNA-Sequenz exprimiert wird. Die erfindungsgemäßen Proteine umfassen außerdem Lipocortine, die bei Expression durch solche DNA-Sequenzen codiert werden, die in einigen oder allen Codons der vorliegenden DNA-Sequenzen durch unterschiedliche Codons gekennzeichnet sind. Diese substituierten Codons können Aminosäuren codieren, die mit den Aminosäuren identisch sind, die durch die ursprünglichen Codons codiert werden, wobei hier jedoch eine höhere Ausbeute des Polypeptids erhalten wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Austausch eines oder einer Kombination von Codons, der zu einem Aminosäureaustausch oder zu einem längeren oder kürzeren Lipocortin führt, die Eigenschaften des Lipocortins in nützlicher Art und Weise verändern. Z.B. kann durch eine solche Anderung die Stabilität vergrößert, die Löslichkeit gesteigert oder die therapeutische Wirksamkeit erhöht werden.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Beispiele angeführt. Diese Beispiele dienen ausschließlich der Erläuterung und sollen den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken.

Beispiele

A. Reinigung der Ratten-Lipocortine III und V

Ratten-Peritonealspülflüssigkeiten wurden hergestellt, wie bereits früher beschrieben. [R. B. Pepinsky et al., "Purification And Partial Sequence Analysis Of A 37-kDa Protein That Inhibitis Phospholipase A&sub2; Activity From Rat Peritoneal Exudates", J. Biol. Chem. 261 (1986), 4239-4246]. Die dialysierten Spülflüssigkeiten wurden mit flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -70ºC gelagert. Dabei wurden Ansätze verarbeitet, die 125 Rattenspülflüssigkeiten umfaßten. Partikel wurden 30 Minuten abzentrifugiert (10 000 UpM, GSA-Rotor), der Überstand wurde einer DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie (DE52 Whatman, 2,5 x 15 cm) in 25 mM Tris-HCl bei pH 7,7 unterworfen. Gebundene Proteine wurden mit einem NaCl-Gradienten (0 bis 0,3 M) im gleichen Puffer eluiert. Fraktionen zu je 18 ml wurden gesammelt, die Absorption bei 280 nm bestimmt und die Phospholipase A&sub2;-Hemmaktivität gemessen, wie von Pepinsky et al., 1986, beschrieben. Zwei hemmend wirkende Proteinpeaks, die mit NaCl eluiert wurden, wurden nachgewiesen. Beide Peaks wurden weiter chromatographiert, wobei eine Gelfiltration und eine Fast-Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) auf einem Mono S-Kationenaustauscherharz (HR 5/5, Pharmacia) durchgeführt wurden. Für die Gelfiltration wurden die Hemmpeaks durch Ultrafiltration auf 5 ml eingeengt und auf eine P150-Säule (Biorad, 2,5 x 40 cm) in 25 mM Tris-HCl, pH 7,7, aufgetragen. Fraktionen zu 3e 5 ml wurden gesammelt. Beide Inhibitoren wurden jeweils als einzelner Peak eluiert. Lipocortin V wurde mit einer augenscheinlichen Masse von 30 kd eluiert, während Lipocortin III ungewöhnlich wanderte, als ob es nur 20 kd aufweisen würde. Aktive Fraktionen der Gelfiltration wurden mittels FPLC weiter verarbeitet, im wesentlichen wie von Huang et al., 1986, beschrieben. Lipocortin V lief durch die Kationenaustauscher-Matrix durch, während Lipocortin III an die Mono S-Matrix gebunden und sodann mit 100 mm NaCl eluiert wurde. Aus einem Ansatz von Rattenspülflüssigkeiten erhielten wir typischerweise 50 ug Lipocortin III und 200 ug Lipocortin V.
Für Strukturuntersuchungen wurden die FPLC-gereinigten Proben gefriergetrocknet, gegen 0,1% SDS dialysiert und einer präparativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese in SDS unterworfen. Die entsprechenden Banden wurden mit einer Rasierklinge herausgeschnitten und die Proteine aus dem Gel elektroeluiert, [M.W. Hunkapiller und L.E. Hood, "Analysis Of Phenylthiohydantoins By Ultrasensitive Gradient High Performance Liquid Chromatography", Meth. Enzymol. 91 (1985), 486-493]. Von jedem Präparat wurden Proben zu jeweils 60 ug mit 20% Trichloressigsäure ausgefällt und gewaschen, wie von Pepinsky et al., 1986, beschrieben. Die getrockneten Pellets wurden in 400 um 0,1 M Ammoniumbicarbonat, 0,1 mM CaCl&sub2;, suspendiert und mit 3 ug Trypsin 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Trypsin wurde in drei gleichen Mengen zugegeben; die erste zur Zeit Null, die zweite nach 4 Stunden und die dritte nach 12 Stunden. Die Spaltprodukte wurden mit Ameisensäure auf 20 % angesäuert und die Fragmente durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf einer C&sub1;&sub8;-Säule (0,46 x 25 cm, Spectrophysics) bei 39ºC mit einer Durchflußrate von 1,4 ml/min fraktioniert. Die Peptide wurden mit einem Acetonitril-Gradienten (0 bis 75%) in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Die Säuleneluate wurden bei 214 nm überwacht. Die Peak-Fraktionen wurden einer Sequenzanalyse in einem Applied Biosystems 470A-Gasphasensequenzer in Gegenwart von Polybrene unterworfen [Hewick et al., "A Gas-Liquid Solid Phase Peptide And Protein Sequenator", J. Biol. Chem. 256 (1981), 7990-7997]. Die PTH-Aminosäuren wurden direkt identifiziert, wobei ein Applied Biosystems 120A PTH-Analysator verwendet wurde.

B. Lipocortin-Antiseren

Antiseren gegen rekombinantes menschliches Lipocortin I und gegen menschliches Plazenta-Lipocortin II wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt, [Huang et al., 1986, R. B. Pepinsky, und L. K. Sinclair, "Epidermal Growth Factor-Dependent Phosphorylation Of Lipocortin", Nature 321 (1986), 81- 84]. Antiseren gegen Ratten-Lipocortin V wurden in Kaninchen unter Verwendung des Lymphknoten-Immunisierungsverfahrens hergestellt. [M. B. Sigel et al., "Production Of Antibodies By Inoculation Into Lymph Nodes", Methods Enzymol. 93 (1983), 3- 12]. Als Immonogen wurde elektroeluiertes Lipocortin V (50 ug pro Kaninchen) verwendet, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert wurde.

C. Charakterisierung der Ratten-Lipocortine III und V

Wenn man Präparate der Ratten-Peritonealspülflüssigkeiten auf DEAE-Cellulose chromatographierte, zeigten sich fünf Peaks mit Phospholipase A&sub2;-Hemmaktivität. In Figur 1 sind die Ergebnisse einer solchen Analyse dargestellt. Der Hauptaktivitätspeak ist die Durchflußfraktion, die früher als Quelle von Lipocortin I verwendet wurde, Pepinsky et al., 1986. Vier andere Peaks wurden mit Salz eluiert. Wir haben ausführlich die zwei Aktivitätspeaks untersucht, die mit 125 mm Nacl (I) und mit 225 mm NaCl (II) eluiert wurden. Die Peaks I und II enthielten jeweils Proteine, die beide Aminosäuresequenzen aufwiesen, die zu den bereits bekannten Lipocortin-Sequenzen (Lipocortine I und II) homolog waren, dies wurde durch Sequenzierung gezeigt. Wir bezeichnen den Inhibitor von Peak I als Lipocortin III und den Inhibitor von Peak II als Lipocortin V. Um die Effizienz des DEAE-Schritts während der präparativen Reinigung der Aktivitäten von Peak I und Peak II zu verbessern, wurden die Inhibitoren mit einem leichten Salzgradienten von 0 bis 0,3 M NaCl eluiert. Jeder Hemmpeak wurde anschließend weiter chromatographiert, wobei Gelfiltration und Mono S FPLC-Matrizes verwendet wurden. Die Analyse durch SDS-PAGE zeigte, daß die beiden Endpräparate ein einziges Hauptprotein mit 35 kd enthielten. Die spezifischen Aktivitäten der Inhibitoren in einem in vitro-Phospholipase A&sub2;-Hemmtest unter Verwendung von Schweinepankreas-Phospholipase A&sub2; als Enzymquelle betrugen in beiden Fällen 10 000 Einheiten/mg und waren somit mit den spezifischen Aktivitäten vergleichbar, die früher für die Lipocortine I und II bestimmt wurden, Huang et al., 1986, Pepinsky et al., 1986.
Figur 2 zeigt Gelprofile von gereinigtem Ratten-Lipocortin III (Bahn 3) und Ratten-Lipocortin V (Bahn 4), gefärbt mit Coomassie-Blau. Zum Vergleich werden auch Ratten-Lipocortin I (Bahn 1) und die Rinder-Lipocortine II und VI (Bahnen 2 und 5) dargestellt. Die restliche Abbildung zeigt Blots der gleichen Präparates die mit Antiseren gegen Lipocortin 1 (α-L1), Lipocortin II (α-L2) und Lipocortin V (α-L5) getestet wurden. Während das Lipocortin V-Antiserum für Lipocortin V spezifisch ist, weist das Lipocortin I-Antiserum einen niedrigen Titer von Antikörpern auf, die Lipocortin II erkennen, und das Lipocortin II-Antiserum besitzt einen niedrigen Titer von Antikörpern, die Lipocortin I erkennen. Das Lipocortin I-Antiserum, das gegen rekombinantes Protein erhalten worden war, zeigt einen hohen Titer gegen Ratten-Lipocortin III. Um sicherzustellen, daß die immunreaktive Komponente im Lipocortin III- Präparat wirklich Lipocortin III ist und nicht ein Fragment von Lipocortin I, wurden die Ratten-Lipocortine I und III einer BrCN-Kartierung unterworfen, wobei Spaltprodukte durch Western-Blotting unter Verwendung von Lipocortin I-Antiseren nachgewiesen wurden, wodurch immunreaktive Fragmente sichtbar gemacht wurden. Die zwei Profile waren verschieden. Alle Lipocortin III-Fragmente wurden nach diesem Verfahren verglichen, wobei sich zeigte, daß sie ähnlich waren.

D. Isolierung und Sequenzierung von Genen, die die menschlichen Lipocortine III und V codieren

Oligonucleotid-Sonden wurden auf einer Applied Biosystems 380A DNA-Syntheseapparatur synthetisiert und durch Gelelektrophorese gereinigt. [M. D. Matteucci und M. H. Carruthers, "Synthesis Of Deoxyoligonucleotides On A Polymer Support", J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185-3191]. Die Oligonucleotide wurden mit Polynucleotidkinase und [γ-³²P]-ATP markiert und durch Gelelektrophorese gereinigt. [A. Maxam und W. Gilbert, "Sequencing End-Labeled DNA With Base-Specific Chemical Cleavages", Meth. Enzym. 65 (1980), 499-560]. Der Oligonucleotid-Sonden-Pool Rlip 4-6 besteht aus 20 Nucleotiden mit 256-facher Degeneration, basierend auf dem tryptischen Peptid T26 (Aspleuvalasnaspmetlys) von Ratten-Lipocortin V. ("T 26" bezieht sich auf tryptische Fragmente des gereinigten Ratten- Lipocortins, isoliert durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C&sub1;&sub8;- Säule, wie bereits beschrieben. Die Fragmente wurden anschließend mit einem Gasphasensequenzer sequenziert, wie bereits beschrieben.) Um die Degeneration der Sonden zu vermindern, wurden sie in 4 Subpools mit jeweils 64-facher Degeneration synthetisiert. Die einzelnen Subpools wurden in einer Northern- Blot-Analyse mit Rattenlungen-poly(A)-RNA hybridisiert, wie früher von Wallner et al., 1986, beschrieben. Bei Ratten-Lipocortin III wurden zwei Sätze von Sonden-Pools verwendet, Elip 1-4 und ELip 5-8. ELip 1-4 besteht aus 17 Nucleotiden mit 128- facher Degeneration, basierend auf dem tryptischen Peptid T2 (GlyAlaGlyThrAspGluPheThrLeuAsnArg), und ELip 5-8 besteht aus Nucleotiden mit 512-facher Degeneration, basierend auf Fragment T3 (GluIleSerGlnAlaTyrTyrThrAlaTyrLys). Beide wurden in 4 Subpools synthetisiert. Für beide Proteine wurden zum Absuchen einer Rattenlungen-λgt10-cDNA-Genbank einzelne Subpools verwendet, die mit einem Transkript von etwa 1 800 Nucleotiden unter stringenten Bedingungen hybridisierten, wobei die Genbank aus Rattenlungen-poly(A)-RNA konstruiert wurde, im wesentlichen wie früher beschrieben, Wallner et al., 1986. Der positve Phage λRlipo III-5 für Ratten-Lipocortin III und λR- Lipo V-1 für Ratten-Lipocortin V, die die entsprechenden cDNAs in voller Länge enthielten, wurden in Plasmid pNNO1 bzw. pNN09 subcloniert und die DNA-Sequenzen nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (1980) und dem ähnlichen Verfahren von G. M. Church und W. Gilbert, "Genomic Sequencing", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1991-1995, bestimmt.
Menschliches Lipocortin III wurde aus einer λgtll-cDNA- Genbank aus menschlicher Lunge, erhalten von Clonetech Laboratories, unter Verwendung der gesamten Ratten-Lipocortin III- cDNA-Insertion von λRLipo III-5 als Hybridisierungssonde erhalten. Menschliche Lipocortin V-cDNA wurde isoliert, indem eine λgt10-cDNA-Genbank aus menschlichen peripheren Blutlymphocyten mit der kompletten Ratten-Lipocortin V-cDNA-Insertion von λRLipo V-1 abgesucht wurde.
Die cDNA-Genbank wurde aus Lymphocyten-poly (A)-RNA konstruiert (Zellen wurden mit Interferon-gamma und Phytohämagglutinin stimuliert). Die Absuchverfahren wurden im wesentlichen durchgeführt, wie von Wallner et al., 1986, beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Temperatur der Waschgänge und Filterdurchgänge bei 55ºC gehalten wurde, um Nucleotid- Fehlpaarungen zwischen den Spezies zuzulassen. Die vollständigen DNA-Sequenzen von menschlichen cDNA-Clonen für Lipocortin III (λHLipo III-5) und Lipocortin V (λHLipo V-I) wurden bestimmt, wie vorstehend beschrieben, sie werden in den Figuren 3 bzw. 4 gezeigt.
Die Figuren 3 und 4 zeigen zum einen die Sequenzen der menschlichen Lipocortine III und V in voller Länge und zum anderen die daraus hergeleiteten Aminosäuresequenzen der entsprechenden Proteine. Der cDNA-Clon für das menschliche Lipocortin III (1339 Bp) enthält 46 Bp von 5'- und 324 Bp von 3'- untranslatierten Sequenzen und codiert ein Protein mit 323 Aminosäuren. Der Clon für Lipocortin V (1574 Bp) enthält 142 Bp von 5-' und 472 Bp von 3'-untranslatierten Sequenzen und codiert ein Protein mit 320 Aminosäuren. Wir haben den Amino- Terminus der reifen Proteine zwar nicht bestimmt, da sie blockiert waren, wir nehmen jedoch an, daß das am Anfang stehende Methionin in Lipocortin III durch ATG in Position 47 des menschlichen Gens codiert wird. Dies beruht auf dem Vergleich der Aminosäuresequenz, die für das menschliche Lipocortin III hergeleitet wurde, mit den Aminosäuresequenzen von Lipocortin I und II, wobei die Lage des am Anfang stehenden Methionins bestimmt wurde. Genauso nehmen wir auch an, daß das am Anfang stehende Methionin von Lipocortin V durch das ATG in Position 143 des menschlichen Gens codiert wird.
Wir subclonierten λHLipo III-5 und λHLipo V-1 in die E. coli-pUC-Plasmide pNN01 und pNNOg, wodurch Plasmide erhalten wurden, die mit pHLipo III-3-5 bzw. pHLipo V-3b bezeichnet wurden. Als Beispiele der Mikroorganismen, die durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, wurde in der Kultursammlung der "In Vitro International", Linthicum, Md, eine Kultur hinterlegt. Die Kulturen wurden am 19. Februar 1988 hinterlegt und folgendermaßen bezeichnet:
E. coli MC 1061: hLipo III-3-5 IVI Nr. 10158 (Lipocortin III)
E. coli MC 1061: hLipo V-3b IVI Nr. 10159 (Lipocortin V)
Am 20. Juni 1991 übertrugen wir die hier angegebenen Hinterlegungen von "In Vitro International", Inc., ("IVI") zur "American Type Culture Collection" ("ATCC") in Rockville, Maryland. Die Hinterlegungen, die die IVI-Hinterlegungsnummern 10158 und 10159 tragen, wurden mit den ATCC-Hinterlegungsnummern 68806 bzw. 68805 bezeichnet.

E. Isolierung und Charakterisierung von Lipocortinen aus der Rinder-Darmschleimhaut

Wir isolierten Lipocortine aus Rinderquellen und charakterisierten sie durch Peptidkartierung und Sequenzanalyse. Rinderproteine wurden aus Kälberdünndarm extrahiert, unter Verwendung des Verfahrens von V. Gerke und K. Weber (1984), "Identity Of p36K Phosphorylated Upon Rous Sarcoma Virus Transformation With A Protein Purified From Brush Borders; Calcium-Dependent Binding To Non-Erythroid Spectrin And F-actin", EMBO J. 3 (1984), 227-233. Der EGTA-Extrakt wurde gegen 10 mM Imidazol-HCl, pH 7,5, 1 mM NaN&sub3;, 0,1 mM EDTA, dialysiert und einer DEAE-Cellulose-Chromatographie unterworfen. Gebundene Proteine wurden mit einem NaCl-Gradienten (0 bis 0,3 M) im gleichen Puffer eluiert. Drei Peaks mit Phospholipase A&sub2;-Hemmaktivität wurden nachgewiesen, diese entsprachen der Durchflußfraktion und den Peaks I und II aus dem Präparat der Ratten-Peritonealspüllösung. Jeder Peak wurde einer Kationenaustauscher-Chromatographie auf Fast-Flow-S-Sepharose (Pharmacia) unterworfen. Gebundene Proteine wurden mit 0 bis 0,2 M Nacl in 50 mM MES, pH 6,5, 1 mM EDTA, eluiert. Für die Fast S-Chromatographie des DEAE-Cellulose-Durchflußpeaks wurde das Präparat zuerst durch Ultrafiltration 10-fach eingeengt und sodann mit 50 mM MES, pH 6,0, 1:1 verdünnt. Ein einzelner Aktivitätspeak wurde mit Salz eluiert. Zur Fraktionierung der Peak I- und Peak II-Aktivitäten wurden die Hemmfraktionen 4-fach mit 25 mM MES, pH 6,0, verdünnt. Beide Präparate enthielten zwei Inhibitoren: Einer floß durch die Ionenaustauscher-Matrix durch, der andere wurde an die Fast S-Matrix gebunden und mit Salz eluiert. Durch Peptidkartierung und immunologische Analysen wurde gezeigt, daß jeder Inhibitor ein einziges Protein darstellt.
Früher haben wir festgestellt, daß der wichtigste Inhibitor aus dem Rinderdarm in der DEAE-Durchflußfraktion das Lipocortin II war [Huang et al., 1986]. Jetzt haben wir nach den gleichen Kriterien nachgewiesen, daß der Rinder-Peak I-Inhibitor, der an die Fast S-Matrix gebunden wurde, dem Ratten-Lipocortin III entspricht und daß der Peak II-Inhibitor, der durch die Fast S-Matrix durchfloß, dem Ratten-Lipocortin V entspricht. Der Einfachkeit halber bezeichnen wir den Peak I-Inhibitor, der durch die Fast S-Matrix durchfloß, als Lipocortin IV und den Peak II-Inhibitor, der an die Fast S-Matrix gebunden wurde, als Lipocortin VI. Im nachstehenden Schema sind die Schritte zusammengefaßt, die zur Reinigung der Rinderlipocortine eingesetzt wurden. DEAE-Cellulose-Chromatographie Durchfluß (Lipocortin II) Peak Fast S Eluat Durchfluß
Für Strukturuntersuchungen und zur endgültigen Bestimmung der Reinheit wurden die verschiedenen Inhibitoren einer Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf einer C&sub4;- Säule unterworfen. Jeder Inhibitor zeigte ein unterschiedliches Elutionsprofil, das wir nun als Verfahren zur Identifizierung einsetzen. Figur 5 zeigt die Gelprofile der gereinigten Inhibitoren. Das 33 kd-Fragment von Rinder-Lipocortin II (Bahn 2) und Rinder-Lipocortin III bis V (Bahnen 3 bis 5) zeigen in der Elektrophorese alle ähnliche Laufeigenschaften. Außerdem sind rekombinantes menschliches Lipocortin I (Bahn 1') und das 33 kd-Fragment des menschlichen Lipocortin I (Bahn 1) dargestellt. Die zwei Banden in Bahn 5 stammen vermutlich von einem einzigen Protein, da beide Spezies mit Ratten-Lipocortin V-Antiseren reagieren und bei der BrCN-Kartierung ähnliche Proteinkarten aufweisen.
Figur 6 zeigt BrCN-Peptidkarten für jedes der Rinderproteine und für das 33 kd-Fragment des menschlichen Lipocortin I. Jedes Profil ist unterschiedlich und kann aus diesem Grund zur Identifizierung der einzelnen Familienmitglieder dienen. Für Lipocortin V wird nur das Spaltprofil der kleineren Form gezeigt.
Figur 7 zeigt tryptische Peptidkarten der fünf Rinderproteine. Die tryptischen Peptidkarten bestätigen, wie auch die BRCN-Spaltprofile# daß aus der Rinderdarmschleimhaut fünf unterschiedliche Lipocortine isoliert wurden. Die Identität der verschiedenen Proteine wird durch die chromatographischen Eigenschaften deutlich, wegen der Komplexizität wurde jedes Protein durch Sequenzanalyse weiter charakterisiert. Tabelle I zeigt repräsentative Sequenzabschnitte für Lipocortin IV und Lipocortin VI unter Verwendung der tryptischen Fragmente, die in Figur 7 gezeigt werden. Die jeweiligen Fragmentnummern beziehen sich auf die in Figur 7 dargestellten Fraktionsnummern. TABELLE I Lipocortin
Wir haben 150 Aminosäuren der Sequenz von Lipocortin VI identifiziert, die für etwa 25% von dessen Primärstruktur stehen. Wie die Sequenzen der Lipocortine I bis V, zeigen auch die Teilsequenzen von Lipocortin VI deutlich, daß Homologien mit den Sequenzen anderer Lipocortine vorliegen. Übereinstimmungen der Sequenzen liegen im Bereich von 27% mit Lipocortin III bis zu 37% mit Lipocortin V. Im gleichen Bereich zeigten die Lipocortin I- und Lipocortin II-Sequenzen 49% Übereinstimmung. Insbesondere die Aminosäuresequenz von Fraktion T88 entspricht der übereinstimmenden Sequenz, die, wie wir gefunden haben, für die Lipocortin-Familie charakteristisch ist. [M. J. Geisow und J. H. Walker, "New Proteins Involved Cell Regulation By Calcium And Phospholipids", Trends in Biochemistry 11 (1986), 420-423; R. H. Kretsinger und C. E. Creutz, "Consensus In Exocytosis" Nature 320 (1986), 573].
Der Vergleich der Aminosäuresequenzen der Rinder-Lipocortine II bis VI mit den entsprechenden menschlichen Lipocortinen und Ratten-Lipocortinen zeigt einen hohen Konservierungsgrad. Die Lipocortine I, III und V sind in den verschiedenen Arten zu etwa 85% konserviert, während Lipocortin II zu etwa 98% konserviert ist. Darüberhinaus ist die Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen von bestimmten Bereichen der Lipocortine, zusammen mit dem funktionellen Merkmal der Phospholipase A&sub2;- Hemmung, ein deutlicher Beweis dafür, daß diese Proteine Mitglieder einer einzigen Familie sind und daß die Familie in der Evolution konserviert worden ist.
Die vollständige Sequenz der menschlichen Lipocortine IV und VI kann erhalten werden, indem man die von uns hier beschriebene Aminosäuresequenz der tryptischen Fragmente verwendet. Ein Merkmal der Lipocortin-Proteine besteht darin, daß sie eine Konservierung in den verschiedenen Arten zeigen. Ein allgemeiner Vergleich der Nucleotidsequenzen der vier Lipocortine, für die Sequenzdaten für den Menschen und für eine andere Art verfügbar sind, zeigt bei den Lipocortinen I, III und V einen Homologiegrad von etwa 85 bis 90% und bei Lipocortin II von etwa 98%. [R. B. Pepinsky et al., "Five Distinct Calcium And Phospholipid Binding Proteins Share Homology With Lipocortin I", J. Biol. Chem. 262 (1988), 10799-811]. Aufgrund dieses Konservierungsgrades können die Aminosäuresequenzen der tryptischen Fragmente, die hier beschrieben werden, indirekt dazu verwendet werden, um die entsprechenden menschlichen Gene der Lipocortine IV und VI zu isolieren.
Unter Einsatz des Verfahrens von Wallner et al., 1986, können die Aminosäuresequenzen der tryptischen Fragmente, die wir erhalten haben, zur Synthese von Antisense-Sonden für die Rinder-Lipocortine IV und VI verwendet werden. Vorzugsweise können diese Sonden eingesetzt werden, um das vollständige Rindergen dieser zwei Lipocortine zu isolieren, indem man die Oligonucleotidsonden mit einer vollständigen Rinden-cDNA-Genbank unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wie vorher für die Isolierung von Ratten-Lipocortin-cDNAs beschrieben. Die Rinder-cDNA-Fragmente können sodann vorzugsweise zur Isolierung der entsprechenden menschlichen cDNA verwendet werden, indem man Rinder-cDNA-Sonden mit einer menschlichen cDNA-Genbank unter herkömmlichen Bedingungen hybridisiert, Pepinsky et al. (1988). (Herkömmliche Hybridisierungsbedingungen können als 2 X SET (oder äquivalenten Puffer) bei 68ºC definiert werden.)
In einer anderen Ausführungsform können Antisense-Sonden, die auf den Sequenzen der tryptischen Fragmente beruhen, verwendet werden, um eine menschliche cDNA-Genbank direkt mittels Sonden zu untersuchen, ohne zuerst das entsprechende Rindergen zu isolieren, wie von Huang et al., 1986, beschrieben.
Die Start-Codons für die Lipocortine IV und VI können aus der Nucleotidsequenz für die Moleküle mit voller Länge ersehen werden, wie das hier bei den Lipocortinen III und V durchgeführt wurde. Alle Mitglieder der Lipocortin-Familie beginnen mit der Aminosäuresequenz MetAlaMet. Der Punkt der Translationsinitiation wird somit dadurch markiert, daß dort die entsprechenden Codons erstmalig auftreten.

F. Expression des menschlichen Lipocortin V in E. coli

Wir exprimierten das menschliche Lipocortin V in E. coli unter Verwendung des Expressionsvektors pkk233-2, wie in der PCT-Anmeldung WO 86/04094 beschrieben. In diesem Konstrukt wird Lipocortin V unter der Kontrolle des trc-Promotors exprimiert. Die Induktion des Promotors wird mit 2 mM IPTG bewirkt. Das Ncoi/HindIII-Restriktionsfragment von pHLipoV-3b wurde unter Verwendung von Standardverfahren in das mit NcoI/HindIII gespaltene Plasmid pkk233-2 eingefügt. Die Konstruktion dieses Plasmids wird in Figur 8 schematisch gezeigt. Das resultierende Plasmid wurde in E. coli Stamm JA221 transformiert. Zur Expression von Lipocortin V wurden die Zellen bis OD&sub5;&sub5;&sub0; 1,0 gezüchtet und zwei Stunden vor der Ernte durch Zusatz von 2 mM IPTG induziert. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in 25 mM Tris-HCl resuspendiert. Die Zellen wurden bei 12 000 psi durch eine French-Press-Zelle gedrückt und das Protein gereinigt, indem verschiedene Chromatographieschritte kombiniert wurden, als erstes eine Trennung auf DEAE-Cellulose und sodann eine Gelfiltration auf einer P150-Säule. Das gereinigte Protein war im Phospholipase A&sub2;-Hemmtest, der von Pepinsky et al., 1986, beschrieben wurde, mit einer spezifischen Aktivität von 10 000 Einheiten/mg aktiv.

Verbesserung der Ausbeute und Aktivität von erfindungsgemäß hergestellten menschlichen Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden

Wie gut die Produktion eines Proteins läuft, wird durch drei Hauptfaktoren bestimmt; die Zahl der Kopien dieses Gens in der Zelle, die Effizienz, mit der diese Genkopien transkribiert werden, und die Effizienz, mit der sie translatiert werden. Die Effizienz von Transkription und Translation (die zusammen die Expression ausmachen) ist wiederum abhängig von den Nucleotidsequenzen, die normalerweise vor der gewünschten codierenden Sequenz liegen. Diese Nucleotidsequenzen oder Expressionskontrollsequenzen bestimmen u.a. die Stelle, an der die RNA-Polymerase angreift, um die Transkription zu starten (Promotorsequenz), und an der die Ribosomen an die mRNA (Produkt der Transkription) binden und mit ihr interagieren, um die Translation zu starten. Solche Expressionskontrollsequenzen funktionieren nicht alle mit der gleichen Effizienz. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, die spezifischen Lipocortincodierenden Sequenzen dieser Erfindung von ihren benachbarten Nucleotidsequenzen abzutrennen und sie stattdessen mit anderen bekannten Expressionskontrollsequenzen zu fusionieren, um auf diese Weise eine höhere Ausbeute an Expression und Produktion von Lipocortin-ähnlichen Polypeptiden zu erhalten. Wenn man dies erreicht hat, kann man die gentechnisch neu hergestellten DNA-Fragmente in Plasmide mit erhöhter Kopienzahl oder Bakteriophagen-Derivate einfügen, um die Zahl der Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen, und dadurch die Ausbeute der exprimierten Lipocortin-ähnlichen Polypeptide weiter zu steigern.
Verschiedene Expressionskontrollsequenzen können verwendet werden, wie vorstehend beschrieben. Diese umfassen Operator-, Promotor- und Ribosomen-bindende und -interagierende Sequenzen (einschließlich Sequenzen, wie z.B. die Shine-Dalgarno-Sequenzen) des Lactose-Operons von E. coli ("das lac-System"), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E. coli ("das trp-System"), die Haupt-Operator- und -Promotorregionen des Phagen Lambda (OLPL wie vorstehend beschrieben und ORPR), eine Kontrollregion von filamentäsen einzelsträngigen DNA-Phagen, das tac- oder trc-System, den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z.B. Phos, die Promotoren der Hefe-α-mating-Faktoren, Promotoren für Säugerzellen, wie z.B. die frühen und späten Promotoren von SV40, der späte Promotor von Adenovirus und der Metallothionin-Promotor, sowie andere Sequenzen, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren oder Kombinationen davon kontrollieren.
Um die Produktion der erfindungsgemäßen Lipocortin-ähnlichen Polypeptide zu verbessern, können die DNA-Sequenzen für diese Polypeptide hergestellt werden, wie vorstehend beschrieben, und sodann in ein rekombinantes DNA-Molekül näher bei ihrer bisherigen Expressionskontrollsequenz oder unter der Kontrolle einer der vorstehenden verbesserten Expressionskontrollsequenzen eingefügt werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Andere Verfahren, die die Effizienz der Translation steigern, umfassen die Insertion von chemisch oder enzymatisch hergestellten Oligonucleotiden vor dem Start-Codon der erfindungsgemäßen Lipocortin-ähnlichen DNA-Sequenzen oder den Austausch von Codons am N-terminalen Ende der DNA-Sequenz gegen chemisch oder enzymatisch hergestellte Oligonucleotide. Auf diese Weise kann eine bessere Primärstruktur und eine bessere Struktur höherer Ordnung der Messenger-RNA erhalten werden. Insbesondere kann eine Sequenz so gestaltet werden, daß das Start-Codon ATG an einer gut zugänglichen Stelle (d.h. nicht durch die Sekundärstruktur versteckt) entweder am oberen Ende einer Haarnadelschleife oder in anderen einzelsträngigen Bereichen vorliegt. Die Lage und Sequenz des vorstehen erwähnten Shine-Dalgarno-Segments kann auf ähnliche Art und Weise optimiert werden. Wie wichtig die allgemeine Struktur (Faltung) der Messenger-RNA ist, wurde bereits dokumentiert. [D. Iserentant und W. Fiers, "Secondary Structure Of mRNA And Efficiency Of Translation Initiation", Gene 9 (1980), 1-12].
Die zelluläre Ausbeute der erfindungsgemäßen Lipocortinähnlichen Polypeptide kann weiter gesteigert werden, indem man die Anzahl der Gene erhöht, die in der Zelle zur Verfügung stehen. Das kann erreicht werden, indem man das Lipocortin-Gen (mit oder ohne seine Transkriptions- und Translationskontrollelemente) in ein Plasmid mit erhöhter Kopienzahl oder in ein Plasmid mit Temperatur-kontrollierter Kopienzahl einfügt (d.h. ein Plasmid, das eine Mutation trägt, wobei nach einer Temperaturänderung die Kopienzahl des Plasmids ansteigt). [B. Uhlin et al., "Plasmids With Temperature-Dependent Copy Number For Amplification Of Cloned Genes And Their Products", Gene 6 (1979), 91-106].
In einer anderen Ausführungsform kann die Dosierung des Gens erhöht werden, indem man z.B. rekombinante DNA-Moleküle, die in der vorstehend beschriebenen Art und Weise gentechnisch hergestellt wurden, in den temperenten Bakteriophagen Lambda einfügt, wobei man am einfachsten das Plasmid mit einem Restriktionsenzym spaltet, so daß ein lineares Molekül erhalten wird, dieses sodann mit einem gespaltenen Phagen Lambda-Clonierungsvehikel mischt (z.B. der Art, beschrieben von N. E. Murray et al., "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants", Mol. Gen. Genet. 150 (1977), 53-61, und N. E. Murray et al., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4", J. Mol. Biol. 132 (1979), 493- 505) und sodann das rekombinante DNA-Molekül durch Inkubation mit DNA-Ligase erzeugt. Anschließend wird der gewünschte rekombinante Phage selektiert und zur Lyse eines E. coli-Wirtsstammes eingesetzt.
Aus diesem Grunde sollte es so verstanden werden, daß die erfindungsgemäßen Sequenzen, die das Lipocortin-ähnliche Polypeptid codieren, aus den beschriebenen Vektoren entfernt und in andere Expressionsvektoren eingefügt werden können, wie vorstehend beschrieben (a.a.O.), und daß diese Vektoren in verschiedenen Wirten verwendet werden können, wie vorstehend beschrieben (a.a.O.), um die Produktion der erfindungsgemäßen menschlichen Lipocortin-ähnlichen Polypeptide zu steigern.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, das durch eine DNA-Sequenz gekennzeichnet ist, die ein Lipocortin codiert und die ausgewählt ist aus:

(a) der codierenden Sequenz der cDNA-Insertion von λHLipo III-5 (ATCC-Nr. 68806),

(b) DNA-Sequenzen, die mit der vorstehenden DNA-lnsertion hybridisieren und die bei Expression ein Lipocortin codieren, und

(c) DNA-Sequenzen, die hinsichtlich einer der Sequenzen von (a) oder (b) degeneriert sind.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die DNA- Sequenz besteht aus:

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz mit einer Expressionskontrollsequenz im Molekül funktionell verbunden ist.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus dem lac- System, dem β-Lactamase-System, den Haupt-Operator- und -Promotorregionen des Phagen Lambda, der Kontrollregion des fd-Hüllproteins, dem Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, den Promotoren der sauren Phosphatase, den Promotoren der Hefe-α-mating- Faktoren, Actinpromotoren, Promotoren für Säugerzellen, den frühen und späten Promotoren von SV40, dem späten Promotor von Adenovirus und dem Metallothionin-Promotor sowie anderen Sequenzen, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren und Kombinationen davon kontrollieren.

5. Einzelliger Wirt, der mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder 4 transformiert ist.

6. Transformierter Wirt nach Anspruch 5, ausgewählt aus Stämmen von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Insektenzellen, Hefen anderen Pilzen, der Maus oder anderen tierischen Wirten, Pflanzenwirten und menschlichen Gewebezellen.

7. Präparat von mindestens einem menschlichen Lipocortin, ausgewählt aus:

(a) reifem Lipocortin III (Figur 3) und

(b) f-met-Lipocortin III (Figur 3) wobei das Präparat im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen menschlichen Ursprungs.

8. Menschliches Lipocortin, umfassend die Aminosäuresequenz:

wobei das Lipocortin im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen menschlichen Ursprungs.

9. Isolierter Polynucleotidstrang, umfassend die DNA- Sequenz:

10. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Lipocortin- Polypeptids, umfassend die Züchtung eines Wirts, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 transformiert ist, und die Gewinnung des Polypeptids.

11. Pharmazeutisch verträgliches Mittel, das zur Behandlung von arthritischen, allergischen, dermatologischen, ophthalmologischen und Kollagen-Krankheiten und anderen Störungen nützlich ist, die entzündliche Prozesse beinhalten, wobei das Mittel eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Polypeptids nach Anspruch 7 oder 8 umfaßt.