Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft gereinigte Enzym-Luciferase und ein
für dieses Enzym codierendes Gen. Die Erfindung stellt
außerdem eine neue rekombinante Vektor-DNA, in die das Gen
eingeschoben ist, eine diese Vektor-DNA enthaltende
Transformante und ein Verfahren zur Herstellung von Luciferase
unter Anwendung dieser Transformante bereit.
Hintergrund dieses Fachgebietes
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Cypridina hilgendorfii ist ein an der Meeresküste von
Japan lebender Muschelkrebs (Ostracod crusfacean), der bei
der Zerstörung eine schwach blaue Lumineszenzflüssigkeit
freisetzt. Die Lumineszenz wird durch Oxidation von
Ludferin durch Enzym-Luciferase erzeugt. Das
Lumineszenzsystern ist sehr einfach, da im Gegensatz zur Lumineszenz von
Leuchtkäfern und Lumineszenzbakterien keine weitere
unerläßliche Komponente notwendig ist, so daß die Anwendung
dieses Lumi-neszenzsystems bei der Untersuchung einer
Komponente erwartet werden kann, die in einer Spurenmenge in
einer Probe enthalten ist.
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Obwohl Luciferin in großer Menge chemisch synthetisiert
werden kann, kann Luciferase jedoch nicht chemisch
synthetisiert werden, da sie ein Enzym darstellt, so daß die
Gewinnung von Luciferase in großer Menge schwierig ist.
Diese
Situation trifft auch für Luciferase von Cypridina
hilgendorfii zu, und hochreine Luciferase von Cypridina
hilgendorfii wurde noch nicht erhalten.
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Ein Verfahren zur Herstellung von Luciferase aus
gemahlenern Pulver von Cypridina hilgendorfii wird in Methods of
Enzymology, Bd. 57, 1978, S. 364-372, Tsuji, F.
beschrieben.
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Aufgrund der Meeresverschmutzung ist zudem der Fang von
Cypridina hilgendorfii drastisch zurückgegangen. Somit ist
die konstante Lieferung von Luciferase von Cypridina
hilgendorfii nicht gesichert. Es ist deshalb erwünscht, ein
Verfahren zur Massenproduktion des Enzyms zu erstellen,
das ein genetisches Rekombinationsverfahren anwendet.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die
Synthese von stark gereinigter Luciferase durch ein
genetisches Rekombinationsverfahren zu erreichen, wodurch ein
für dieses Protein codierendes Gen bereitgestellt wird, so
daß die Expression eines geklonten Gens in einer
Tierzelle, einer Hefezelle, in einer E.coli-Zelle oder
dergleichen erreicht wird, und das stark gereinigte Enzym
unter Anwendung dieser Zelle in großer Menge produziert
wird.
Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur
Herstellung von Luciferase bereit, das die Züchtung einer
Transformante mit einer Vektor-DNA umfaßt, die für
Luciferase codiert, die die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz
aufweist und ein Gen umfaßt, das die in Fig. 1 gezeigte
Nucleotidsequenz hat.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1a, 1b, 1c und 1d zeigen die Nucleotidsequenz von
Luciferase von Cypridina hilgendorfii und auch
deren Aminosäuresequenz. Die obere Zeile in jeder
Reihe zeigt die Aminosäuresequenz und die untere
Zeile in jeder Reihe zeigt die Nucleotidsequenz
der cDNA.
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Fig. 2 zeigt die Konstruktion des rekombinanten Plasrnids
pCL07, das die cDNA enthält, die für Luciferase
von Cypridina hilgendorfii codiert, als auch
dessen Restriktionskarte
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Fig. 3 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors
pSVLCL5 von Luciferase von Cypridina hilgendorfii
für Tierzellen.
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Fig.4a zeigt die Restriktionskarten der
Expressionsvektoren pMEF3A, pMFE3B, pMFE3C und pMFE3D von
Luciferase von Cypridina hilgendorfii für Hefezellen,
und Fig. 4b zeigt die Nucleotidsequenz der Region
in der Nähe der Verbindungsregion eines α-
Pheromon-Gens und der cDNA von Luciferase als auch
deren Aminosäuresequenz
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Fig. 5 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pGL1
von Luciferase von Cypridina hilgendorfii für
Hefezellen.
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Fig. 6 zeigt das Konstruktionsverfahren der
Expressionsvektoren pMT-CLP, pMT-CLS und pMT-CLT von
Luciferase von Cypridina hilgendorfii für E.coli.
Beispiele
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Die erfindungsgemäße Luciferase ist ein Protein, das 555
Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz von der 1. bis zur
555. Aminosäure in der in Fig. 1 gezeigten
Aminosäuresequenz enthält, ein Protein, das 527 Aminosäuren mit
der Aminosäuresequenz enthält, die in Fig. 1 von der
29. Aminosäure Prolin beginnt, ein Protein, das 526
Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz enthält, die in Fig.
1 bei der 30. Aminosäure Serin beginnt, ein Protein,
das 525 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz enthält, die
von der 31. Aminosäure Serin beginnt, oder ein
Protein das 524 Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz
enthält, die von der 32. Aminosäure Threonin beginnt.
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Das erfindungsgemäße Gen ist ein für die oben beschriebene
Luciferase codierendes Gen und hat die in der unteren
Zeile in Fig. 1 gezeigte DNA-Sequenz.
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Nachfolgend wird das Verfahren zur Herstellung des Gens
beschrieben, das für die erfindungsgemäße Luciferase
codiert. Erstens wird Cypridina hilgendorfii in einer
Guanidinthiocyanatlösung aufgebrochen, und die gesamten RNA
werden daraus extrahiert, danach folgt die Reinigung der
Poly(A)&spplus;-RNA durch Säulenchromatographie mit Oligo-(dT)-
Cellulose. Nach der Synthese der cDNA mit den Poly(A)&spplus;-RNA
werden die cDNA in λgt10 geklont, wodurch eine cDNA-Bank
erhalten wird.
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Auf der anderen Seite werden die Aminosäuresequenz der
Region in der Nähe des N-Terminus des Luciferase-Proteins, das
aus Cypridina hilgendorfii gereinigt wurde, und die
Aminosäuresequenzen der Oligopeptide, die durch Digerieren
mit Lysylendopeptidase erhalten wurden, bestimmt, und es
werden verschiedene Oligonucleotide chemisch
synthetisiert,
die Nucleotidsequenzen aufweisen, die diesen
bestimmten Sequenzen entsprechen. Diese Oligonucleotide
werden als Sonden für die Prüfung der oben beschriebenen
cDNA-Bank verwendet.
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Es wird die Nucleotidsequenz des in die Rekombinanten
eingeschobenen Gens bestimmt, die bei der Plaque-
Hybridisierung mit den Sonden ein Hybrid bilden. Wenn sie
mit der Aminosäuresequenz des Luciferase-Proteins
übereinstimmt, kann das eingeschobene Gen als Teil des Gens
identifiziert werden, das für das Luciferase-Protein
codiert.
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Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante Vektor-
DNA, die jede oben beschriebene DNA enthalten, die an der
Stelle stromabwärts des Promotors ligiert sind, durch die
das Gen in einer Wirtszelle, z.B. Tierzellen, Hefezellen
und E.coli-Zellen, ausgeprägt werden kann, die mit diesen
rekombinanten Vektor-DNA transformierten Transformanten
und Verfahren zur Herstellung von Luciferase unter
Verwendung dieser Transformaten bereit.
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Insbesondere können die rekombinanten Vektor-DNA der
vorliegenden Erfindung durch Ligation der cDNA, die die
Luciferase von Cypridina hilgendorfii codiert, mit einer
Vektor-DNA erhalten werden, die in Tierzellen, Hefezellen
oder E.coli-Zellen stabil erhalten wird, wobei diese
Vektor-DNA einen Promotor enthält, durch den das
eingeschobene Gen in den Wirtszellen ausgeprägt werden kann.
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Der Promotor ist das Signal für die Einleitung der RNA-
Synthese, der durch RNA-Polymerase erkannt und dadurch
gebunden wird. Die DNA-Sequenz stromabwärts des Promotors
wird zu mRNA transkribiert. Damit das für Luciferase von
Cypridina hilgendorfii codierende Gen zu mRNA
transkribiert
wird, muß das Gen stormabwärts des Promotors
angeordnet sein, der in der Wirtszelle wirkt.
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Somit können die rekombinanten Vektoren verwendet werden,
die durch Spaltung der Vektor-DNA an einer geeigneten
Stelle stromabwärts des Promotors, der im Vektor enthalten
ist, und Einschub der DNA hergestellt werden, die das für
Luciferase codierende Gen enthält.
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Der hier verwendete Promotor kann jeder Promotor sein,
sofern er als Wirtszelle wirkt. Für die Konstruktion des
rekombinanten Vektors, der in der Tierzelle wirkt, können
z.B. Promotoren von tierischen Genen und tierischen Virus--
Genen verwendet werden. Insbesondere umfassen Beispiele
der Promotoren den späten Promotor von SV40, den Promotor
des Thymidin-Kinase-Gens, den frühen Promotor von SV40,
den Promotor des cytomegalievirus und dergleichen. Bei
Hefezellen können Promotoren von Hefegenen verwendet werden.
Es können z.B. Promotoren des reprirnierbaren
Säurephosphatase-Gens (PH05), des Galactokinase-Gens (GAL1), des α-
Pheromon-Gens (MFα1) des Gens von Hefe und dergleichen
verwendet werden. Bei E.coli können Promotoren von E.coli-
Genen und E.coli-Phagen-Gene verwendet werden. Der
Promotor des Lactose-Operons (lac), der Promotor des try-
Operons, der PL-Promotor des λ-Phagen und dergleichen
verwendet werden. Außerdem können auch der synthetische tac-
Promotor und dergleichen verwendet werden.
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Es kann jede Vektor-DNA verwendet werden, die in der
Wirtszelle stabil erhalten bleibt und die einen Promotor
aufweist, der in der Wirtszelle wirkt. Bei Tierzellen
können z.B. Plasmid-Vektoren und Virus-Vektoren verwendet
werden. Insbesondere können pSV2 (ein Vektor der den
frühen Promotor von SV40 enthält, J. Mol. Appl. Genet. USA,
1, 327 (1982)), pSVL (ein Vektor, der den späten Promotor
von SV40 enthält, von Pharmacia im Handel erhältlich) und
dergleichen verwendet werden. Bei Hefezellen können pMFα8
(ein Vektor, der den Promotor des α-Pheromon-Gens (MFα1)
enthält, Gene, 3155 (1985)), pAM85 (ein Vektor, der den Promotor
des reprimierbaren Säurephosphatase-Gens (PH05) enthält,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1 (1983)) und dergleichen
verwendet werden. Bei E.coli können pMT-1 (stammt vom
Expressionsvektor pKM6, der den Promotor des trp-Operons
enthält (Japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 61-
247387), pUC18/pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)) und
dergleichen verwendet werden.
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Durch Einschub der cDNA, die für Luciferase codiert,
stromabwärts der Nucleotidsequenz, die das Signalpeptid
für die Proteinsekretion codiert, das in der Wirtszelle
wirkt, kann die Luciferase aus der Zelle ausgeschieden
werden. Die Signalsequenz ist nicht auf eine bestimmte
begrenzt, und es kann z.B. die Signalsequenz von
Interleukin-2 (IL-2) für Tierzellen verwendet werden. Bei Hefe
kann die Signalsequenz von α-Pheromon und dergleichen
verwendet werden. Bei E.coli kann die Signalsequenz von β-
Lactamase und dergleichen verwendet werden. Wenn sich die
Luciferase in den Zellen ansammeln soll, muß die
Signalsequenz nicht ligiert werden.
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Wenn E.coli als Wirtszelle verwendet wird, und die
erzeugte Luciferase in der Zelle angereichert werden soll, muß
die Nucleotidsequenz von "ATG", die Methionin codiert, an
das 5'-Ende des Gens angefügt werden, das ausgeprägt
werden soll, und das entstehende Gen mit "ATG" am 5'-Ende
an einer Stelle stromabwärts des Promotors und die SD-Sequenz
müssen ligiert werden, die in der E.coli-Zelle wirkt. Die
SD-Sequenz ist das Signal für die Einleitung der
Proteinsynthese vom "ATG"-Codon stromabwärts von ihr, wobei diese
Sequenz in mRNA erkannt und vom Ribosom gebunden wird. Der
Grund für das Binden von Methionin besteht darin, daß der
größte Teil der eukaryotischen Gene, die das
auszuscheidene Protein codieren, das reife Protein stromabwärts der
Signalsequenz für die Ausscheidung des Proteins codieren,
so daß ein Präkursor-Protein mit einem Signalpeptid
produziert wird, und das reife Protein wird durch Abspalten des
Signalpeptids während des Verfahrens der
Proteinausscheidung erzeugt wird, so daß der größte Teil der eukaryotischen
reifen Proteine kein Methionin enthält, bei dem das Codon
für die Einleitung der Proteinsynthese unerläßlich ist. Da
die natürliche Luciferase, die von Cypridina hilgendorfii
gereinigt wird, eine Mischung von zwei Proteinen ist,
deren N-Termini Benn bzw. Treonin sind, und da der größte
Teil der eukaryotischen Signalsequenz neben Alanin-X-
Alanin abgespalten wird, und eine Sequenz von Alanin-
Glutaminsäure-Alalin-Prolin in der Aminosäuresequenz
existiert, die von der Nucleotidsequenz von Luciferase von
Cypridina hilgendorfii hergeleitet ist, werden drei Arten
des Expressionsvektors mit einer N-terminalen Region
stromabwärts des Methionin-Codons angewendet, das die
Luciferase codiert, die von Prolin, Serin bzw. Methionin
beginnt.
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Die durch Transformation einer Wirtszelle, z.B.
Tierzellen, Hefezellen und E.coli-Zellen, mit jedem oben
genannten rekombinanten Vektor erhaltenen Transformanten werden
durch Einführen der rekombinanten Vektor-DNA in die
Wirtszelle hergestellt.
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Die Tierzellen, die bei der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können, sind nicht begrenzt. Beispiele der
Tierzellen umfassen die COS-1-Zelle (eine mit SV40
transformierte Zelle von der Niere eines jungen Afrikanischen
Affen), die CHO-Zelle (die von den Ovarien des
Chinesischen Hamsters stammt) und dergleichen, und die COS-1-
Zelle ist bevorzugt. Die Hefezellen, die bei der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nicht
begrenzt. Beispiele der Hefe umfassen Saccharomyces
cerevisiae, Shizosaccaromyces pombe, Pichia pastoris und
dergleichen. Die bei der vorliegenden Erfindung verwendbaren
E.coli-Zellen sind nicht begrenzt, und Beispiele davon
umfassen HB101, JM109 und dergleichen.
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Das Verfahren zur Einführung der rekombinanten Vektor-DNA
in die Wirtszelle ist nicht begrenzt. Wenn die Wirtszelle
z.B. eine Tierzelle ist, können das DEAE-Dextran-Verfahren
(Mol. Cell Biol., 5, 1188 (1985)), das Calcium-Phosphat-
Cosedimentationsverfahren (Cell, 14, 725 (1978)), das
Electroporationsverfahren (EMBO J. 1, 841 (1982)) oder
dergleichen verwendet werden. Von diesen ist das DEAE-
Dextran-Verfahren bevorzugt. Wenn die Wirtszelle eine
Hefezelle ist, kann vorzugsweise das Protoplast-Verfahren
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1979)) angewendet
werden. Wenn die Wirtszelle E.coli ist, kann vorzugsweise
das Calciumchlorid-Verfahren (J. Mol. Biol., 53, 154
(1970)) angewendet werden.
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Durch Einführen jeder rekombinanten Vektor-DNA in die
Wirtszellen können neue rekombinante Vektor-DNA, bei denen
die DNA, die das Gen enthält, das die Luciferase von
Cypridina hilgendorfii codiert, als auch Transformanten mit
der Fähigkeit zur Produktion von Luciferase erhalten
werden.
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Jede Transformante wird in einem Kulturmedium gezüchtet,
und aus dieser Kultur kann die Luciferase erhalten werden.
Es kann jedes Kulturmedium verwendet werden, sofern die
Wirtszelle darin wachsen kann. Bei Tierzellen können z.B.
mit Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium oder dergleichen
verwendet werden. Bei Hefe können YEPD-Medium (20 g/l
Trypton, 10 g/l Hefeexktrat und 20 g/ml Glucose) oder
dergleichen verwendet werden. Bei E.coli können L-Bouillon
(10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeexktrat und 10 g/l
Natriumchlorid) oder dergleichen verwendet werden.
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Es kann jede Züchtungstemperatur angewendet werden, sofern
die Zelle wachsen kann, und 15 bis 45ºC können gewöhnlich
bevorzugt sein. Bei Tierzellen und E.coli-Zellen sind 25
bis 40ºC bevorzugt und 30 bis 37ºC stärker bevorzugt. Bei
Hefe sind 15 bis 45ºC bevorzugt und 20 bis 30ºC noch
bevorzugter. Der Zeitraum für die Kultur ist nicht begrenzt
und beträgt gewöhnlich 1 bis 10 Tage, vorzugsweise 3 bis 7
Tage bei Tierzellen und Hefe und 1 bis 3 Tage bei E.coli.
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Wenn der Promotor eine angemessene Induktion erfordert,
z.B. in Fällen, bei denen der Promotor der Promotor
des Metallothionein-Gens für Tierzellen, der Promotor
des reprimierbaren Säurephosphatase-Gens für Hefe oder der
trp-Promotor für E.coli oder dergleichen ist, kann die
Expression des Promotors durch die für den entsprechenden
Promotor erforderliche Art und Weise eingeleitet werden,
z.B. den Zusatz eines geeigneten Induktors, die Entfernung
einer geeigneten Substanz, die Änderung der Temperatur der
Kultur, Bestrahlung mit UV-Licht und dergleichen.
Insbesondere in Fällen, bei denen der trp-Promotor für E.coli
verwendet wird, kann der Promotor durch Zusatz von IAA
(Indolacrylsäure) induziert werden, die ein Induktor des
trp-Operons ist.
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Wenn eine Spurenmenge des im nicht induzierten Stadium produzierten
Proteins das Wachstum der Zellen nachteilig beeinflußt, ist
es bevorzugt, daß die Expression des Promotors im nicht
induzierten Zustand auf den niedrigsten möglichen Wert
unterdrückt wird. Es kann z.B. ein Promotor verwendet werden,
dessen Expression im nicht induzierten Zustand vollständig
unterdrückt ist, oder es kann gleichzeitig ein Repressor-
Gen dieses Promotors angewendet werden. Im Falle des trp-
Promotors kann z.B. vorzugsweise ein rekombinantes Plasmid
verwendet werden, das ein Repressorgen des trp-Operons
aufweist. In diesem Fall kann das Tryptonphan-Repressorgen
(trpr) (Nucleic Acids Res. 8, 1552 (1980)) angewendet
werden. Alternativ kann das oben beschriebene Verfahren zur
Ausscheidung des erzeugten Proteins aus den Zellen
angewendet werden.
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Die Kultur wird durch ein geeignetes Verfahren in
Überstand und Zellen getrennt, z.B. durch Zentrifugieren, und
die Luciferase-Aktivität im Kulturüberstand oder im
Zellextrakt wird mit einem Lumineszenzmeßgerät oder
dgl. gemessen. Obwohl der Kulturüberstand oder der
Zellextrakt bei Bedarf direkt als rohe Enzymlösung verwendet
kann, kann die Luciferase z.B. nach dem Verfahren von F.
I. Tsuji (Methods in Enzymol., 57, 364 (1978)) gereinigt
werden.
Beispiele
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Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand von
Beispielen detaillierter beschrieben.
Beispiel 1
Konstruktion der cDNA-Bank
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5 g Cypridina hilgendorfii, in der Tateyama Bay in der
Präfektur Chiba gesammelt, im gefrorenem Zustand
aufbewahrt, wurden in 75 ml einer Lösung suspendiert, die 6 m
Guanidinthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat (pH = 7,0) und 0,5%
Natriumlaurylsarkosinat enthält, und die Suspension wurde
mit dem Polytron-Homogenisierapparat (im Handel von
Chimanetica
erhältlich) homogenisiert, wodurch die Zellen
aufgebrochen wurden. Es wurde eine Lithiumchloridlösung (zur
von Amersham handelsüblichen Ausstattung gehörig)
zugesetzt, und ca. 600 µg RNA wurden durch das Lithiumchlorid-
Cosedimentationsverfahren erhalten. 300 µm einer aliquoten
Menge der so erhaltenen RNA wurden durch
Säulenchromatographie mit Oligo-(dT)-Cellulose (im Handel von
Colaborative Research erhältlich) gereinigt, wodurch etwa 15 µg
Poly(A)&spplus;-RNA erhalten wurden. Von 2 µg der so erhaltenen
Poly(A)&spplus;-RNA wurde mit dem cDNA-Synthesegerät (im Handel
von Life Technologies, Inc. erhältlich) 1 µm
doppelsträngige DNA erhalten. Die interne EcoRI-Stelle von 0,15 µg
der so erhaltenen doppelsträngigen DNA wurde durch EcoRI
Methylase geschützt, und ein EcoRI-Linker wurde mit T4-
DNA-Ligase ligiert. Das entstandene Produkt wurde mit
Eco-RI digeriert, wodurch beide Enden in EcoRI-Orte bzw.
-Stellen überführt wurden. Die entstehende DNA wurde in
die EcoRI-Stelle von λgt10 eingeschoben, wobei T4-DNA-
Ligase verwendet wurde, und das entstandene Produkt wurde
durch das in vitro-Verpackungsverfahren in Phagenpartikel
eingeführt. Es erfolgte eine Transduktion von E.coli NM514
mit dem entstehenden Phagen, wodurch eine cDNA-Bank mit 1
x 10&sup6; pfu (Plaque bildende Einheiten) erhalten wurde.
Beispiel 2
Herstellung der Oligonucleotid-Sonde
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100 µg Luciferase von Cypridina hilgendorfii wurden nach
dem Gefiertrocknen nach dem Verfahren von F. 1. Tsuji
(Methods in Enzymol., 57, 364 (1978)) gereinigt, das
entstandene Produkt wurde in 100 µl 0,1 m Tris-HCl (pH = 7,6)
gelöst, der 8 m Harnstoff und 0,14 m 2-Mercaptoethanol
enthielt, und die Lösung wurde 3 Stunden bei 37ºC
inkubiert, wodurch die -SH-Gruppen pyridylethyliert wurden.
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Dem Produkt wurden 200 µl 0,11 m Tris-HCl (pH = 9,0), 1
µl 2-Methylmercaptoethanol und 1 µl 2 µg/µl
Lysylendopeptidase (im Handel von Wako Pure Chemicals erhältlich)
zugesetzt, und die entstandene Mischung wurde 1 Stunde bei
37ºC inkubiert, wodurch der Aufschluß möglich wurde. Das
entstandene Produkt wurde der HPLC unterzogen, wobei VYDAC
218 TP54 (C&sub1;&sub8;) (im Handel von VYDAC erhältlich) verwendet
wurde, um die Oligopeptide abzutrennen. Von den
so erhaltenen Oligopeptiden wurden 13 Oligopeptide mit dem
Aminosäuresequenzanalysegerät 470 A (im Handel von Applied
Biosystem erhältlich) auf N-Termini untersucht, wodurch
die folgenden 13 Aminosäuresequenzen erhalten wurden:
Fragment 7-1
Fragment 7-2
Fragment 12-1
Fragment 12-24
Fragment 13
Fragment 18
Fragment 21
Fragment 23
Fragment 27
Fragment 38
Fragment 40
Fragment 47
Fragment 50
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Mit dem DNA-Synthesegerät (im Handel von Applied
Biosystems erhältlich) wurden Oligonucleotide hergestellt,
die den folgenden 5 Oligopeptiden in den oben
beschriebenen 13 Oligopeptiden entsprechen. In dieser
Nucleotidsequenz entspricht "I" Deoxymosin.
Sonde 1 (entspricht der Sequenz der ersten bis sechsten
Aminosäure von Fragment 27)
Sonde II (entspricht der Sequenz der sechsten bis zehnten
Aminosäure von Fragment 23)
Sonde III (entspricht der Sequenz der vierten bis neunten
Aminosäure von Fragment 47)
Sonde IV (enspricht der Sequenz der dritten bis siebenten
Aminosäure von Fragment 50)
Sonde V (entspricht der Sequenz der ersten bis zehnten
Aminosäure von Fragment 13)
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Ein Mikrogramm jedes der oben beschriebenen 5
Oligonucleotide wurde in 10 µl 50 mM Tris-HCl (pH = 7,6) gelöst, der
10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM Dithiothreitol, 1 mM
Spermidin und 100 mM Kaliumchlorid enthielt, und danach wurden 5
µl [γ-³²P]ATP (3000 Ci/mmol, im Handel von Amersham
erhältlich), 85 µl destilliertes Wasser und 2 µl
T&sub4;-Polynucleotid-Kinase (im Handel von Takara Shuzo erhältlich)
zugegeben, anschließend wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert,
wodurch die Markierung mit ³²P erfolgte.
Beispiel 3
Überprüfung der cDNA-Bank durch das Plaque
Hybridisierungsverfahren
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Auf 50 Agarplatten wurden mit der in Beispiel 1
hergestellten cDNA-Bank etwa 10000 Plaques pro Platte gebildet
Die Plaques wurden auf Nylonmembranen übertragen und mit
einer Lösung von 0,5 m Natriumhydroxid/1,5 m
Natriumchlorid denaturiert, anschließend wurde in 0,5 m Tris-HCl (pH
= 7,0)/1,5 m Natriumchlorid neutralisiert. Nachdem die
Membranen 2 Stunden bei 80ºC inkubiert worden waren, damit
die Phagen-DNA an die Membranen fixiert werden, erfolgte
eine Vorhybridisierung, indem die entstehenden Membranen 2
Stunden bei 45ºC in 50 mM Natriumphosphat (pH = 7,4)
inkubiert wurden, das 0,75 m Natriumchlorid, 5 x Denhaldts-
Lösung (0,1% Rinderserum-Albumin, 0,1% Ficoll und 0,1%
Polyvinylpyrrolidon), 5 mM EDTA, 0,1% SDS und 100 µg/ml
denaturierte DNA vom Lachssperma enthielt.
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Die entstehenden Membranen wurden dann in eine frische
Oösung mit der gleichen Zusammensetzung übertragen und die
in Beispiel 2 markierte Oligonucleotid-Sonde IV wurde bis
zu einer Menge von 5 µCi/ml zugegeben, danach wurde über
Nacht bei 45ºC inkubiert, wodurch die Hybridisierung
erfolgte. Etwa 16 Stunden später wurden die Membranen zwei
mal 30 Minuten jeweils bei Raumtemperatur und anschließend
zwei mal 30 Minuten jeweils bei 45ºC mit 6 x SSC (90mM
Natriumcitrat (pH = 7,0)/0,9 m Natriumchlorid) gewaschen.
Nach dem Trocknen in Luft wurden die Membranen 48 Stunden
bei -70ºC der Autoradiographie mit X-OMAT AR
(Warenzeichen, von Kodak im Handel erhältlich) unterzogen.
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Die Filme wurden entwickelt und es wurden 32 positive
Klone erhalten. Von diesen positiven Klonen wurden auf
Agarplatten Phagen gezüchtet, und die Phagen-DNA wurden
gereinigt. Die erhaltenen DNA wurden bei -20ºC aufbewahrt.
Beispiel 4
Vergleich des Luciferase-Proteins und der primären
Struktur ihres Gens
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Vom Klon λCL07, der von den erhaltenen 32 positiven Klonen
das größte eingeschobene Fragment mit etwa 1900
Basenpaaren enthielt, wurde das eingeschobene Fragment mit dem
Restriktionsenzym EcoRI herausgetrennt, und das Fragment
wurde in das Plasmid pUC18 subkioniert, wodurch das
rekombinante Plasmid pCL07 konstruiert wurde (Fig. 2). Die
Nucleotidsequenz des EcoRI-Fragmentes mit 1,9 kb wurde
durch das übliche Didesoxyverfahren bestimmt. Die
bestimmte Nucleotidsequenz ist in Fig. 1 gezeigt.
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Beim Vergleich der Information des erhaltenen Gens und des
in Beispiel 2 erhaltenen Proteins stimmte das Protein mit
der primären Struktur des Gens überein, wie es in Tabelle
1 gezeigt ist. Somit wurden die Nucleotidsequenz des
Luciferase-Gens von Cypridina hilgendorfii als auch die
Aminosäuresequenz des Proteins bestimmt, wie es in Fig. 1
gezeigt ist.
Tabelle 1
Übereinstimmung zwischen der Aminosäuresequenz und der
primären Struktur des Gens
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Übereinstimmung zwischen der Aminosäuresequenz und der
primären Struktur des Gens
Beispiel 5
Einschub der Luciferase-cDNA in den Expressionsvektor
pSVL, der den späten Promotor von SV40 enthält
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Ein Mikrogramm des oben genannten EcoRI-Fragmentes mit
1,9 kb, das in Beispiel 4 erhalten worden war und
Luciferase von Cypridina hilgendorfii codiert, wurde in
Gegenwart von jeweils 1,5 mM dATP, dTTP, dCTP und dGTP mit 5
Einheiten des großen Fragmentes von E.coli-DNA-Polymerase
I (im Handel von Takara Shuzo erhältlich) behandelt, um
die Enden des Fragmentes zu reparieren. Andererseits wurde
der Vektor pSV1 (ein Expressionsvektor, der den späten
Promotor von SV40 enthält, im Handel von Pharmacia erhält-
lich) mit dem Restriktionsenzym SmaI behandelt.
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Danach wurden das Fragment mit 1,9 kb (0,3 µg), dessen
Enden repariert worden waren, und der SmaI-Aufschluß von
pSV1 (0,1 µg) durch T4-DNA-Ligase ligiert, und die
kompetenten Zellen von E. coli HB101 (im Handel von Takara Shuzo
erhältlich) wurden mit der entstandenen Reaktionsmischung
transformiert, wodurch ein rekombinantes Plasmid erhalten
wurde, in das das Fragment mit 1,9 kb eingeschoben ist.
Das erhaltene rekombinante Plasmid wird als pSVLCL5
bezeichnet (Fig. 3).
Beispiel 6
Produktion von Luciferase von Cypridina hilgendorfii durch
eine COS-1-Zelle
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Der im Beispiel 5 konstruierte Expressionsvektor pSVLCL5
(10 µg) wurde durch das DEAE-Dextranverfahren in COS-1-
Zellen eingeführt (Mol. Cell. Biol. 5, 1188 (1985)).
Andererseits wurde als Kontrolle pSVL (10 µg)
in der gleichen
Weise in COS-1-Zellen eingeführt.
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Diese Zellen wurden 5 Tage bei 37ºC in Gegenwart von 5%
CO&sub2; in einem Kulturkolben mit 25 cm² in 10 ml nach
Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (im Handel von Nissui
Pharmaceuticals erhältlich) gezüchtet, das 10% fötales
Rinderserum enthält. Während der Kultur und danach wurde 1
ml jeder Kulturlösung gewonnen und 10 min bei 4ºC mit 3000
U/min zentrifugiert. Jeder Überstand wurde aufgefangen,
wodurch der Kulturüberstand erhalten wurde.
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Nach der Züchtung wurden die Zellen durch
Trypsin-Behandlung vom Kolben abgezogen und mit 1 ml PBS(-)
gewaschen (im Handel von Nissul Pharmaceuticals erhältlich.
Die Waschungen wurden 10 min bei 4ºC mit 3000 U/min
zentrifugiert, und der Überstand wurde weggegossen. Dieses
Verfahren wurde noch zwei Mal wiederholt, und die Zellen
wurden in 200 µl PBS(-) suspendiert. Der Zyklus aus
Gefrieren-Auftauen wurde dreimal wiederholt, wodurch der
Zellextrakt erhalten wurde.
Beispiel 7
Untersuchung der Luciferase-Aktivität, die durch
Tierzellen erzeugt wird
-
Die Luciferase-Aktivitäten in den in Beispiel 6
beschriebenen Kulturüberständen wurden durch folgendes Verfahren
gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt:
-
30 µl des Kulturüberstandes und 270 µl eines Meßpuffers
(100 mM Natriumphosphat (pH = 7,0)/200 mM Natriumchlorid)
wurden gemischt. Der Mischung wurden 2 µl 33 µM Luciferin
von Cypridina hilgendorfii zugesetzt, und die Anzahl der
erzeugten Photonen wurde sofort 30 s lang mit einem
Lumineszenzmeßgerät (Lumac L2010) gezählt. Die
Lumineszenzintensität ist als durchschnittliche Anzahl der Photonen pro
eine Sekunde angegeben. Die Zahl der erzeugten Photonen
wurde in der gleichen Weise beim Kulturüberstand der COS-
1-Zelle gemessen, in die pSLV als Kontrolle eingeführt
worden war.
-
Die Luciferase-Aktivität im Beispiel 6 beschriebenen
Zellextrakt wurde durch folgendes Verfahren gemessen, und die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt:
-
10 µl der in Beispiel 6 hergestellten Zellfraktion und 290
µl des oben beschriebenen Meßpuffers wurden gemischt, und
2 µl 33 µM Luciferin von Cypridina hilgendorfii wurden
zugesetzt, anschließend wurde die Luciferase-Aktivität in
der gleichen Weise wie bei der Messung der
Kulturüberstände gemessen.
Tabelle 2
Aktivität von Luciferase (x10&sup5; cps/ml)
Beispiel 8
Synthese von Oligonucleotiden für den Hefe-
Expressionsvektor und Vereinigung
-
Luciferase-Proteine mit der Aminosäuresequenz, die bei der
29. Aminosäure Prolin der in Fig. 1 gezeigten
Aminosäuresequenz (YP-Typ), bei der 30. Aminosäure
Serin (YN-Typ), bei der 31. Aminosäure Serin (YS-Typ)
bzw. bei der 32. Aminosäure Threonin (YT-Typ)
beginnen, wurden hergestellt, da (1) die von Cypridina
hilgendorfii gereinigten Luciferase vom natürlichen Typ eine
Mischung aus zwei Proteinen ist, deren N-Terminus die
31. Aminosäure Serin in der in Fig. 1 gezeigten
Aminosäuresequenz und die 32. Aminosäure Threonin ist;
(2) eine Aminosäuresequenz mit den Eigenschaften der
Signalsequenz für die Sekretion von Proteinen am N-Terminus
der Aminosäuresequenz von Luciferase vorhanden ist, die
von der Nucleotidsequenz von cDNA abgeleitet ist; und (3)
die Signalsequenz bei den meisten Eukaryoten stromabwärts
der Sequenz Alanin-X-Alanin abgespalten wird und
Luciferase von Cypridina hilgendorfii die Sequenz
Alanin-Glutaminsäure-Alanin-Prolin hat. Für die Ligation der Proteine
stromabwärts der Signalsequenz von α-Pheromon wurden
folgende 10 Oligonucleotide synthetisiert:
-
Die 5'-Enden der synthetischen Oligonucleotide YP-2, YS-2,
YT-2, YN-2 und U-2 wurden mit T4-DNA-Kinase
phosphoryliert. Dabei wurden jeweils 300 pmol dieser
Oligonucleotide 1 Stunden bei 37ºC in 20 µl einer Reaktionsmischung (50
mM Tris-HCl (pH = 7,6), die 10 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM
Spermidin, 5 mM Dithiothreitol und 0,1 mM EDTA enthielt)
in Gegenwart von 10 Einheiten T4-DNA-Kinase (im Handel von
Takara Shuzo erhältlich) umgesetzt, und danach wurde die
Reaktionsmischung 5 min auf 70ºC erwärmt und anschließend
bei -20ºC aufbewahrt.
-
Die Vereinigung jedes Oligonucleotids wurde wie folgt
vorgenommen:
-
Beim YP-Typ wurden jeweils 50 pmol von YP-1,
phosphoryliertem YP-2, U-1 und phosphoryliertem U-2 gemischt. Beim
YS-Typ wurden jeweils 50 pmol von YS-1, phosphoryliertem
YS-2, U-1 und phosphoryliertem U-2 gemischt. Beim YT-Typ
wurden jeweils 50 pmol von YT-1, phosphoryliertem YT-2, U-
1 und phosphoryliertem U-2 gemischt. Beim YN-Typ wurden
jeweils 50 pmol von YN-1, phosphoryliertem YN-2, U-1 und
phosphoryliertem U-2 gemischt. Jede Mischung wurde 5 min
auf 70ºC erwärmt, und danach wurde die Leistung des
Inkubators abgeschaltet, wodurch die Mischung ruhen
konnte, bis die Temperatur auf 42ºC gesunken war.
Beispiel 9
Einschub von Luciferase-cDNA in den Expressionsvektor
pMFα8, der den Promotor des α-Pheromon-Gens von Hefe
enthält
-
Die in Beispiel 8 beschriebenen synthetischen Oligomere
wurden an der dal-Stelle entsprechend in die Luciferase-
cDNA von Cypridina hilgendorfii eingeschoben, wodurch
Luciferase-cDNA konstruiert wurden, die am 5'-Ende die
Stul-Stelle aufweisen, davon wurden 28, 29, 30 bzw. 31
Aminosäuren vom N-Terminus abgetrennt.
-
Der Expressionsvektor pMFα8 für Hefe (Gene, 3, 155 (1985):
ATCC 37413) wurde unmittelbar stromaufwärts der Region mit
dem Restriktionsenzym StuI digeriert, die für die Leader-
Sequenz des α-Pheromon-Gens codiert, und darin wurde die
oben genannte Luciferase-cDNA eingeschoben. Die so
konstruierten Expressionsvektoren wurden als pMEF3A (YP-Typ),
pMEF3B (YS-Typ), pMEF3C (YT-Typ) bzw. pMEF3D (YN-Typ)
bezeichnet (Fig.4a).
-
Die Nucleotidsequenz in der Nähe der Verbindungsregion
zwischen dem α-Pheromon-Gen und der Luciferase-cDNA jedes
Expressionsvektors wurde durch das übliche
Didesoxyverfahren geprüft, wobei die Sequenz 5'-TATAAATGGTCCAAGGA-3' in
der Luciferase-cDNA als Prirner verwendet wurde, wodurch
bestätigt wurde, daß die cDNA korrekt eingeschoben sind.
Die Nucleotidsequenzen in der Nähe der Verbindungsregion
zwischen dem α-Pheromon-Gen und der Luciferase-cDNA von
pMFE 3A, pMFE3B, pMFE3C und pMFE3D sind in Fig. 4b
gezeigt.
Beispiel 10
Einschub der Luciferase-cDNA in den Expressionsvektor
p103, der den Promotor des GAL1-Gens von Hefe enthält
-
Aus dem in Beispiel 3 erhaltenen λCL07 wurden die beiden
EcoRI-Fragmente mit einer Größe von 1,3 kb und 0,6 kb
ausgeschnitten und entsprechend in das Plasmid pUC18
subkloniert, wodurch die Plasmide pCL0712 bzw. pCL0742
konstruiert wurden. pCL07 (1 µg) und pCL0712 (1 µg) wurden mit
HindIII und BglII getrennt, und ein DNA-Fragment, das den
N-Terminus von Luciferase enthält, wurde aus pCL07
gereinigt, und ein DNA-Fragment, das den C-Terminus von
Luciferase enthält, wurde aus pCL0712 gereinigt. Diese beiden
Fragmente wurden an die HindIII-Stelle des Plasmids pSPT18
(im Handel von Boehringer-Mannheim erhältlich)
subkloniert, wodurch ein Plasmid erhalten wurde, das als pSTCL81
bezeichnet wurde.
-
pSTCL81 (1 µg) wurde mit BamHI digeriert, und die gesamte
geklonte cDNA-Sequenz wurde als BamHI-Fragment erhalten.
-
Andererseits wurden etwa 1 µg des Expressionsvektors p103
(der einen Polylinker enthält, der die BamHI-Stelle
stromabwärts zum GAL1-Promotor von Saccharomyces cerevisiae
aufweist (Mol. Cell. Biol., 41 1440 (1984)), vorgelegt vom
Assistenzprofessor Shun Harajima der Universität von
Osaka) mit BamHI digeriert, und das entstandene Produkt wurde
mit etwa 1 µg des oben genannten cDNA-Fragmentes
digeriert, wodurch der Expressionsvektor pGL1 konstruiert
wurde, bei dem die Luciferase-cDNA stromabwärts vom GAL1-
Promotor eingeschoben ist (Fig. 5).
Beispiel 11
Produktion von Luciferase aus Cypridina hilgendorfii durch
Hefe
-
Jeweils 10 µg der im Beispiel 9 hergestellten
Expressionsvektoren pMFE3A, pMFE3B, pMFE3C und pMFE3D wurden nach
dem Protoplast-Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,
1929 (1978)) in den Stamm 20B-12 von Saccharomyces
cerevisiae eingeführt.
-
Diese Transformanten wurden 3 Tage bei 30ºC in 100 ml
YEPD-Medium gezüchtet, das in einem 1 l Kulturkolben
enthalten war. Während der Kultur und danach wurden jeweils 5
ml der Kultur aufgefangen und 10 min bei 4ºC mit 3000
U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden aufgefangen,
wodurch die Kulturüberstände erhalten wurden.
-
Die aus 1 ml jeder Kultur gewonnenen Zellen wurden mit 5
ml sterilisiertem, destilliertem Wasser gewaschen, und die
Zellen wurden in 1 ml 50 mM Natriumphosphat (pH = 7,5)
suspendiert, das 0,1% Triton X-100 enthielt. Dieser
Suspension wurde 1 ml einer Suspension von Glaskügelchen
(0,45 ml Durchmesser) zugegeben, und die Mischung wurde 5
min bei 0ºC stehengelassen, wobei die Mischung
gelegentlich mit kräftig mit einem Mischer gerührt wurde. Die
Glaskügelchen wurden durch sanftes Zentrifugieren
abgetrennt, und der Überstand wurde in eine 1,5 ml Eppendorf-
Röhre gegeben, danach wurde 5 min mit 15000 U/min
zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde als Zellextrakt
verwendet.
Beispiel 12
Produktion von Luciferase von Cypridina hilgendorfii durch
Hefe
-
Der Expressionsvektor pGL1 (10 µg) wurde wie in Beispiel
11 nach dem Protoplast-Verfahren in den Stamm YSH2676 von
Saccharomyces cerevisiae ((a) ura3-52 leu2-3 leu2-112
trp1 pho3 pho5 his1-29) eingeführt.
-
Die Transformante wurde 2 Tage bei 30ºC in einem 1 l
Kulturkolben in 100 ml Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und
2% Galactose) gezüchtet. Während der Kultur und danach
wurden jeweils 5 ml der Kultur aufgefangen und 10 min bei
4ºC mit 3000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden
gewonnen und als Kulturüberstand verwendet.
-
Außerdem wurde der Zellextrakt in der gleichen Weise wie
in Beispiel 11 hergestellt.
Beispiel 13
Untersuchung der Aktivität der von Hefe produzierten
Luciferase
-
Die Luciferase-Aktivitäten in den in Beispiel 11
beschriebenen Kulturüberständen wurden in der gleichen Weise
gemessen&sub1; wie es bei der in Beispiel 7 beschriebenen Messung
der Kulturüberstände der Tierzellen erfolgt ist. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Als Kontrolle wurde
in der gleichen Weise die Zahl der erzeugten Photonen
des Kulturüberstands des Stamms 208-12 von S. cerevisiae
gezählt, in den pMFα8 eingeführt worden war.
-
Die Luciferase-Aktivitäten in den in Beispiel 11
beschriebenen Hefezellen erfolgten nach dem nachstehend
beschriebenen Verfahren, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3
gezeigt. Dabei wurden 10 µl des in Beispiel 11 hergestellten
Zellextrakts und 290 µl des oben beschriebenen Meßpuffers
gemischt, und es wurden 2 µl 33 µM Luciferin von Cypridina
hilgendorfii zugesetzt, danach wurde die Luciferase-
Aktivität in der gleichen Weise gemessen, wie es bei der
Messung der Kulturüberstände der Fall war.
Tabelle 3
Aktivität von Luciferase (x10&sup5; cps/ml)
Beispiel 14
Überprüfung der Aktivität der durch Hefe produzierten
Luciferase
-
Die Luciferase-Aktivitäten in den Kulturüberständen wurden
in der gleichen Weise bestimmt, wie es bei der in Beispiel
7 beschriebenen Messung des Kulturüberstandes der
Tierzellen erfolgte, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4
gezeigt. Als Kontrolle wurde in der gleichen Weise die
Zahl der erzeugten Photonen des Kulturüberstandes des
Stamms YSH2676 von S. cerevisiae gezählt, in den p103
eingeführt worden war.
-
Die Luciferase-Aktivitäten in den in Beispiel 12
beschriebenen Hefezellen wurden in der gleichen Weise wie in
Beispiel 13 gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4
gezeigt.
Tabelle 4
Aktivität von Luciferase (x10&sup5; cps/ml)
Beispiel 15
Synthese von Oligonucleotiden für den Expressionvektor von
E.coli und Vereinigung
-
Für die Konstruktion von Expressionsvektoren, die ein Gen,
das für Luciferase codiert, dessen Aminosäuresequenz von
der Sequenz Methionin-Prolin (EP-Typ), Methionin-Serin
(ES-Typ) oder Methionin-Threonin (ET-Typ) beginnt, an der
Stelle stromabwärts vom Promotor und die SD-Sequenz des
Operons des Tryptophansynthese-Gens (trp) von E.coli
enthält, wurden folgende sechs Oligonucleotide synthetisiert:
-
Die N-Termini von jeweils 300 pmol der synthetischen
Oligonucleotide EP-2, ES-2 und ET-2, als auch des in Beispiel
8 hergestellten U-2 wurden wie in Beispiel 8 mit T4-DNA-
Kinase phosphoryliert, und die phosphorylierten
Oligonucleotide wurden bei -20ºC aufbewahrt.
-
Beim EP-Typ wurden jeweils 50 pmol von EP-1,
phosphoryliertem EP-2, U-1 und phosphoryliertem U-2 gemischt. Beim
ES-Typ wurden jeweils 50 pmol von ES-1, phosphoryliertem
ES-2, U-1 und phosphoryliertem U-2 gemischt. Beim EP-Typ
wurden jeweils 50 pmol von ET-1, phosphoryliertem ET-2, U-
1 und phosphoryliertem U-2 gemischt. Jede Mischung wurde
wie in Beispiel 8 vereinigt.
Beispiel 16
Einschub der Luciferase-cDNA in den Expressionsvektor
pMT1, der den trp-Promotor von E. coli enthält
-
Der Expressionsvektor PMT-1 (der von pKM6 (Japanische
Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 61-247387) stammt) mit dem
Promotor und der SD-Sequenz des Tryptophan-Operons (trp)
von E.coli wurden mit den Restriktionsenzymen SmaI , ClaI
und PvuII digeriert.
-
Andererseits wurde der in Beispiel 3 hergestellte
Expressionsvektor pCL07 mit SmaI und ClaI digeriert, und das
DNA-Fragment, das die Luciferase-cDNA stromabwärts von der
ClaI-Stelle enthält, wurde durch das
Agarose-Gelelektrophoreseverfahren abgetrennt und gereinigt.
-
Mit T4-DNA-Ligase (im Handel von Takara Shuzo erhältlich)
wurden jeweils 0,1 µg des digerierten PMT-1 und des
gereinigten Fragmentes von pCL07 ligiert, und das entstandene
Produkt wurde erneut durch das Restriktionsenzym SmaI
digeriert. Kompetente Zellen von E.coli HB101 (im Handel von
Takara Shuzo erhältlich) wurden mit dem entstandenen
Produkt transformiert, wodurch das Plasmid pMT-CL07
konstruiert wurde. Dieses Plasmid wies einen Teil der
LuciferasecDNA der Region stromabwärts von der ClaI-Stelle an einer
Stelle stromabwärts von trp-Promotor-SD-Sequenz auf.
-
Das Plasmid pMT-CL07 wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI
digeriert, und 0,1 µg des erhaltenen digerierten Produktes
und 5 µl der in Beispiel 15 konstruierten synthetischen
DNA wurden durch T4-DNA-Ligase ligiert, wodurch
Expressionsvektoren konstruiert wurden, die das Luciferase-Gen,
das von den Codonen von Methionin-Prolin (EP-Typ),
Methionin-Serin (ES-Typ) oder Methionin-Threonin (ET-Typ)
beginnt, an einer Stelle stromabwärts von trp-Promotor/SD-
Sequenz enthalten. Die so erhaltenen Plasmide wurden als
pMT-CLP, pMT-CLS bzw. pMT-CLT bezeichnet.
-
Die Nucleotidsequenz in der Nähe der Bindungsregion
zwischen der SD-Sequenz und dem Luciferase-Gen jedes
Expressionsvektors wurde durch das übliche Didesoxyverfahren
geprüft, wobei die Sequenz 5'-TATAAATGGTCCAAGGA-3' in der
Luciferase-cDNA als Primer verwendet wurde, wodurch
bestätigt wurde, das die cDNA korrekt eingeschoben ist.
-
Die Restriktionskarten von pMT-CLP, pMT-CLS und pMT-CLT
und die bestätigten Nucleotidsequenzen sind in Fig. 6
gezeigt.
Beispiel 17
Produktion von Luciferase von Cypridina hilgendorfii durch
E. coli
-
E.coli HB101wurde mit jedem in Beispiel 16 hergestellten
Expressionsvektor transformiert, und jede erhaltene
Transformante wurde statisch über Nacht bei 37ºC in 5 ml L-
Nährlösung (die 100 mg/l Ampicillin enthält) gezüchtet. Am
nächsten Tag wurde 1 ml der Kulturlösung aufgefangen und
in 50 ml synthetischem Medium (2 x M9-Casaminsäuren-Medium
(6 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 12 g/l
Dinatriumhydrogenphosphat, 10 g/l Casaminosäuren, 10 g/l Natriumchlorid, 1
g/l Ammoniumchlorid), 1 mg/l Thiamin-HCl, 250 mg/l
Magnesiumsulfat, 1% Glucose und 10 mg/l Ampicillin suspendiert,
und das entstandene Produkt wurde über Nacht mit Schütteln
bei 25ºC gezüchtet. Am Morgen des nächsten Tages wurden
IAA (Endkonzentration 20 mg/l) und Glucose
(Endkonzentration 1%) zugegeben, und der pH-Wert wurde mit 12,5%
Ammoniakwasser auf 7,5 eingestellt. Die Kultur wurde 3
Stunden bei 25ºC fortgesetzt. Nach 3 Stunden wurden in der
gleichen Weise IAA, Glucose und Ammoniakwasser zugesetzt,
und die Kultur wurde weitere 3 Stunden fortgesetzt. Nach
der Züchtung wurden 8 ml der Kulturlösung zentrifugiert,
wodurch die Zellen aufgefangen wurden, und die Zellen
wurden in 0,5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH = 8,0)/ 1 mM
EDTA) suspendiert. Der Zyklus aus Gefrieren/Auftauen wurde
3 mal mit warmen Wasser bei 42ºC und Trockeneis/Aceton
wiederholt, wodurch die Zellen aufgebrochen wurden, und
das entstandene Produkt wurde 10 min mit 10000 U/min
zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde als rohe
Enzymlösung verwendet.
Beispiel 18
Überprüfung der Aktivität der durch E.coli produzierten
Luciferase
-
Die Luciferase-Aktivität in der in Beispiel 17
hergestellten rohen Enzymlösung wurde nach dem nachstehend
beschriebenen Verfahren gemessen, und die Ergebnisse sind in
Tabelle 5 gezeigt. Dabei wurden 150 µl der rohen Enzymlösung
und 150 µl Meßpuffer und 2 µl 33 µm Luciferin von
Cypridina hilgendorfii gemischt, und die Zahl der erzeugten
Photonen wurde 30 s lang gezählt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 5 gezeigt. Als Kontrolle wurde die Zahl der
erzeugten Photonen bei E.coli HB101 gezählt, worin pMT-CLR (ein
Plasmid, in das die synthetische DNA mit der falschen
Orientierung eingeschoben ist).
Tabelle 5
Industrielle Anwendbarkeit
-
Luciferase von Cypridina hilgendorfii bietet ein
Lumineszenzsystem mit sehr starker Lumineszenzintensität. Deshalb
kann das Enzym an ein Antikörper-Molekül angefügt und zum
EIA (Enzymimmunoassay) verwendet werden. Alternativ kann
das Enzym an ein DNA/RNA-Molekül gebunden werden, das beim
DNA-Sonden-Verfahren verwendet werden kann. Somit wird
eine umfangreiche Verwendung dieses Enzyms für verschiedene
Untersuchungen erwartet.
-
Durch die vorliegende Erfindung wurde die primäre Struktur
der cDNA bestimmt, die für Luciferase von Cypridina
hilgendorfii codiert, und es wurde auch die primäre Struktur
der Luciferase identifiziert. Durch umfangreiche Züchtung
von Tierzellen, Hefe oder E.coli, die den
erfindungsgemäßen Expressionsvektor von Luciferase enthalten, kann
Luciferase
konstant kostengünstig in großer Menge
bereitgestellt werden.
-
Außerdem wurden die Methodenlehre für die Verbesserung der
Stabilität von Luciferase, eine Verbesserung der
Mengenausbeute von Lumineszenz-Photonen, eine Verbesserung
der Lumineszenzbedingungen und die Veränderung der
Lumineszenz-Wellenlänge durch Anwendung eines technischen
Protein-Verfahrens entwickelt.