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Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung eines Liganden
mit einer Bindungsspezifität für mindestens einen Teil der extrazellulären Domäne des
CD28-T-Zell-Oberflächenmoleküls zur Herstellung eines Arzneimittels.
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Vom Thymus stammende, als T-Zellen bezeichnete Lymphocyten sind wichtige
Regulatoren von in vivo-Immunantworten. T-Zellen sind an der Cytotoxizität und der T-
zellvermittelten Überempfindlichkeit (DTH) beteiligt und stellen Helferfunktionen für die
Antikörperproduktion von B-Lymphocyten bereit. Ferner produzieren T-Zellen eine Reihe
von Lymphokinen, die als immunmodulierende Moleküle wirken, wie Interleukin-2 (IL-
2), das das Fortschreiten des Zellzyklus von T-Zellen erleichtern kann;
Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und Lymphotoxin (LT), die Cytokine sind, deren Beteiligung an der
Lyse von Tumorzellen nachgewiesen ist; Interferon-gamma (IFN-γ), das ein breites
Spektrum von anti-Virus- und anti-Tumor-Wirkungen zeigt; und Granulocyten-
Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), der als hämatopoetischer Faktor
auf ein breites Spektrum von Zellinien wirkt.
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Bisherige immuntherapeutische Behandlungen von Erkrankungen, wie Krebs,
erworbene Immunmangelkrankheit (AaS) und begleitende Infektionen, schließen die
systemische Verabreichung von Lymphokinen, wie IL-2 und IFN-γ, ein, um zu versuchen,
die Immunantwort durch T-Zell-Proliferation zu stärken. Eine solche Behandlung bewirkt
jedoch eine nicht-spezifische Erhöhung der T-Zell-vermittelten Immunantwort, da die
verabreichten Lymphokine nicht spezifisch auf aktivierte T-Zellen im Bereich der
Infektion oder des Tumors einwirken. Ferner sind systemische Infüsionen dieser Moleküle
in pharmakologischen Dosen signifikant toxisch. Bisherige Therapien für
immundefiziente oder immundeprimierte Patienten schließen auch eine nicht-spezifische
Stärkung des Immunsystems unter Verwendung von konzentrierten Gammaglobulin-
Präparationen oder die systemische Infusion von T-Zell-Lymphokinen mit schädlichen
systemischen Nebenwirkungen ein. Die Stimulation der in vivo-Sekretion von
immunmodulierenden Faktoren wurde bisher aufgrund der fehlenden Schätzung der
Wirkung und/oder des Mechanismus und der damit zusammenhängenden Vorteile dieser
Therapie nicht als eine durchführbare Alternative angesehen.
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Es ist daher die Stärkung der T-Zell-vermittelten Immunantwort
wünschenswert, so daß sie spezifisch auf Zielzellenantigen-aktivierte T-Zellen gerichtet
ist. Es ist ferner die Ausnutzung der natürlichen Immunspezifität des Patienten
wünschenswert. Es ist ferner wünschenswert, diese Wirkungen in immundeprimierten
Patienten sicherstellen zu können. Es ist ferner wünschenswert, diese Wirkungen durch
Verfahren sicherzustellen, die nicht primär auf der Verabreichung von
immunmodulierenden Molekülen in Mengen mit signifikanten toxischen Wirkungen beruhen.
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Es ist ferner wünschenswert, die Entfernung und erneute Einführung von T-
Zell-Populationen zu vermeiden. Es ist ferner nicht nur die Bereitstellung eines
Verfahrens zur Erhöhung, sondern auch zur Unterdrückung von T-Zell-vermittelten
Immunantworten, wenn eine solche Immunsuppression vorteilhaft ist, beispielsweise bei
Transplantationspatienten und bei Schocksyndrome zeigenden Patienten, wünschenswert.
Zusammenfassung der Erfindung
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Das erfindungsgemäße immuntherapeutische Verfahren umfaßt den Schritt der
selektiven Regulation des in vivo-Spiegels eines menschlichen T-Zell-Lymphokins durch
Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Liganden an einen Patienten,
der eine Population von aktivierten T-Zellen aufweist, wobei der Ligand eine
Bindungsspezifität für mindestens einen Teil der extrazellulären Domäne des CD28-T-
Zell-Oberflächenmoleküls aufweist.
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Die vorliegende Erfindung nutzt die überraschende und bisher nicht geschätzte
Wirkung der Stimulation des CD28-Moleküls von aktivierten T-Zellen aus. Mit
aktivierten T-Zellen sind Zellen gemeint, bei denen die Immunantwort initiiert oder
"aktiviert" wurde, üblicherweise durch Interaktion des T-Zell-Rezeptor TCR/CD3-T-Zell-
Oberflächenkomplexes mit einem Fremdantigen oder seinem Äquivalent. Diese
Aktivierung führt zu einer T-Zell-Proliferation und der Induktion der T-Zell-
Effektorfunktionen, wie der Lymphokin-Produktion. Dazu siehe über den Stand der
Technik "Journal of Immunology Bd. 136, Nr. 9, May 1983, 3282-3286 und "Molecular
and Cellular Biology", Bd. 7, Nr. 12 (Dezember 1987), 4472-4481.
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Die Stimulation des CD28-Zelloberflächenmoleküls mit einem anti-CD28-
Antikörper bewirkt eine deutliche Erhöhung der T-Zell-Proliferation und IL-2-
Lymphokin-Spiegel bei einer Aktivierung der T-Zelle durch submaximale Stimulation
ihres TCR/CD3-Komplexes. Bei einer maximalen Stimulation des TCR/CD3-Komplexes
gibt es bei einer gleichzeitigen Stimulation mit anti-CD28 eine wesentliche Erhöhung der
IL-2-Lymphokin-Spiegel, obwohl überraschenderweise keine signifikant höhere T-Zell-
Proliferation als durch anti-CD3 allein induziert wird. Es sind nicht nur die LL-2-Spiegel
signifikant erhöht, sondern es sind noch überraschender auch die Spiegel eines
vollständigen Lymphokinsatzes, der zuvor nicht mit der CD28-Stimulation erhalten
wurde, erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt sowohl die T-Zell-Proliferation als auch die
erhöhte Lymphokin-Produktion aufgrund der CD28-Stimulation ferner eine Resistenz
gegen die Immunsuppression durch Cyclosporin und Glucocorticoide.
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Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren bereit, mit dem die
T-Zellvermittelte Immunantwort durch Stimulation des CD28-T-Zell-Oberflächenmoleküls zur
Unterstützung des Körpers bei der Bekämpfung einer Infektion oder von Krebs reguliert
werden kann. Die vorliegende Erfindung kann ferner nicht nur zur Erhöhung der T-Zell-
Proliferation, falls gewünscht, sondern auch zur Stärkung der Immunantwort durch
Erhöhung der Spiegel und der Produktion eines vollständigen T-Zell-Lymphokin-Satzes,
der nach heutiger Kenntnis durch eine CD28-Stimulation reguliert wird, verwendet
werden.
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Da für eine wirksame CD28-Stimulierung zur Förderung der T-Zell-
Immunantwort anscheinend eine T-Zell-Aktivierung oder irgendeine Stimulierung des
TCR/CD3-Komplexes erforderlich ist, kann die vorliegende Erfindung ferner zur
selektiven Stimulierung von voraktivierten T-Zellen verwendet werden, die den Körper
gegen eine bestimmte Infektion oder Krebs schützen können, wodurch die
nichtspezifische Toxizität der gegenwärtig zur Stärkung der Immunfunktion verwendeten
Verfahren vermieden wird. Ferner erhöht die vorliegende Erfindung die
T-Zellvermittelten Immunfunktionen selbst unter immunsupprimierten Bedingungen, wodurch
sie von besonderem Vorteil für an Immunmangelkrankheiten, wie AIDS, leidenden
Individuen ist.
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Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer Vorteile wird
durch eine Lektüre der genauen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
zusammen mit den Figuren und dem spezifischen nachstehend beschriebenen Beispiel
erhalten.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Fig. 1 ist eine Balkengraphik, die die ausbleibende Erhöhung der Thymidin-
Aufnahme durch CD28-stimulierte T-Zellen erläutert.
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Fig. 2 ist eine Balkengraphik, die die Erhöhung des Uridin-Einschlußes durch
eine CD28-Stimulation von anti-CD3-stimulierten T-Zellen erläutert.
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Fig. 3 ist eine Graphik, die die erhöhte Cyclosporinresistenz der durch eine
CD28-Stimulation induzierten T-Zellproliferation erläutert.
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Fig. 4 ist ein Northern-Blot, der die Wirkung von Cyclosporin auf PMA oder
die durch anti-CD28 induzierte Lymphokin-Expression von anti-CD3-aktivierten T-Zellen
erläutert.
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Fig. 5 ist ein Graph der in vivo-Aktivierung von T-Zellen in Affen durch eine
CD28-Stimulation.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausflährungsform wird das CD28-
Molekül stimuliert, um die T-Zell-vermittelte Immunantwort von Antigen-aktivierten T-
Zellen zu fördern. CD28 ist ein 44 Kilodalton-Protein, das auf der Oberfläche von etwa
80% der reifen T-Zellen exprimiert wird und zu Immunglobulingenen im wesentlichen
homolog ist. Vgl. A. Poggi et al., Eur. J. Immunol. 17 (1987), 1065-1068, und A. Aruffo
et al., PNAS (USA) (1987), 8573-8577. Die Bindung der extrazellulären Domäne des
CD28-Moleküls mit anti-CD28-Antikörpern in der vorliegenden Erfindung bewirkt eine
Erhöhung der T-Zell-Proliferation und erhöhte Lymphokin-Spiegel.
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In den spezifischen Beispielen III-IV und VI-VIII wurde die T-Zell-
Aktivierung durch Stimulation des T-Zell-TCR/CD3-Komplexes (der die Spezifität der T-
Zell-Immunantwort vermittelt) mit immobilisierten monoclonalen anti-CD3-Antikörpern,
wie mAb G19-4, oder durch chemische Stimulation mit PMA und Ionomycin erreicht.
Man sollte sich jedoch ferner bewußt sein, daß die Aktivierung der T-Zelle stattdessen
durch Wege erreicht werden kann, die keine direkte CD3-Stimulation einschließt,
beispielsweise durch Stimulation des CD2-Oberflächenproteins.
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In der Praxis wird jedoch eine aktivierte T-Zellpopulation durch das
Immunsystem des Patienten bereitgestellt, das, außer bei einer vollständigen
Immunsuppression, aktivierte T-Zellen als Antwort auf jegliches Fremdantigen oder einen
wesentlich erhöhten Antigenspiegel aufgrund einer Erkrankung oder Infektion aufweist.
Der Begriff "Fremdantigen" wird hier in einem weiten Sinn verwendet, wobei ein Antigen
gemeint ist, das entweder durch den Organismus normalerweise nicht produziert wird oder
wie in Carcinomen ein Antigen, das durch die sie produzierende Zelle normalerweise
nicht produziert wird. "Wesentlich erhöhte" Menge von Antigen meint einen
Antigenspiegel, der über dem normalen Bereich liegt und potentiell schädliche Wirkungen
für den Organismus aufgrund dieser Erhöhung aufweist.
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Erfindungsgemäß wird die Stimulation des CD28-Moleküls durch
Verabreichung eines Liganden, wie ein monoclonaler Antikörper oder ein Teil davon, mit einer
Bindungsspezifität für CD28 erreicht. Geeignete Antikörper schließen mAb 9.3, einen
IgG2a-Antikörper, der weit vertrieben wurde und erhältlich ist (für nicht-kommerzielle
Zwecke) auf Nachfrage von Dr. Jeffrey A. Ledbetter der Oncogen Corporation, Seattle,
WA, oder mAb Kolt-2 ein. Es wurde gezeigt, daß beide monoclonale Antikörper, wie in
Leukocyte Typing II. Kap. 12, (1986), 147-156 Hrg. E. L. Reinhertz et al., beschrieben,
eine Bindungsspezifität für die extrazelluläre Domäne von CD28 aufweisen. Das F(ab')&sub2;-
Fragment von mAb 9.3 ist gegenwärtig bevorzugt, da nach einem in vivo-Test keine
nachteiligen Wirkungen zu berichten waren. Selbstverständlich betrifft die vorliegende
Erfindung auch die Verwendung von an das CD28-Oberflächenmolekül bindenden
chimären Antikörpern sowie Nicht-Immunglobulin-Liganden.
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Die extrazelluläre Domäne von CD28, die von A. Aruffo et al., PNAS (USA)
84 (1987), 8573-8577, sequenziert wurde, umfaßt üblicherweise die nachstehende
Aminosäuresequenz:
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Mit dem Begriff "extrazelluläre Domäne", wie hier nachstehend in der
Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, ist die vorstehend beschriebene
Aminosäuresequenz, jeder beliebige wesentliche Teil davon, oder jede beliebige Sequenz
mit einer wesentlichen Homologie dazu gemeint.
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Wie durch die Daten der spezifischen Beispiele III-V dargestellt, scheint eine
wesentliche Erhöhung der T-Zell-vermittelten Immunantwort durch eine CD28-
Stimulation für aktivierte T-Zellen spezifisch zu sein. Diese Spezifität ist von einer
besonderen klinischen Bedeutung und ist eine der signifikanten Vorteile der Erfindung.
Die Verabreichung der anti-CD28-Antikörper, wie mAb 9.3, erhöht spezifisch die
Antwort von T-Zellen, die bereits aktiviert und an der Immunantwort beteiligt sind oder
gerade aktiviert werden. Man muß sich jedoch auch bewußt sein, daß die CD28-
Stimulation wirksam sein kann, selbst wenn die T-Zellen erst nach der Bindung des
erfindungsgemäßen CD28-spezifischen Liganden an den CD28-Rezeptor aktiviert werden.
Daher "kommt" es bei den T-Zellen an oder in der Nähe der Tumor- oder Infektionsstelle,
die durch die an diesen Stellen produzierten oder vorhandenen Antigene aktiviert wurden,
durch die CD28-Stimulation selektiv "zu einer Verstärkungsreaktion".
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Wie zuvor diskutiert und durch spezifische Beispiele weiter erläutert, führt die
Synergiewirkung der CD28-Stimulation auf aktivierte T-Zellen zu einer erhöhten T-Zell-
Proliferation und zu erhöhten IL-2-Lymphokin-Spiegeln, wenn der TCR/CD3-Komplex
nicht maximal stimuliert wird. Wenn jedoch die TCR/CD3-Stimulation maximal ist,
obwohl die T-Zellproliferation nicht deutlich erhöht ist, sind die Spiegel von bestimmten
Lymphokinen wesentlich erhöht, was eine Erhöhung der zellulären Produktion dieser
Lymphokine anzeigt. Daher führt in Patienten, die eine natürliche maximale TCR/CD3-
Stimulation oder Entsprechendes und eine T-Zell-Aktivierung in vivo aufgrund einer
Erkrankung oder Infektion erfahren haben, die Verabreichung eines anti-CD28-
Antikörpers zur Stimulation von CD28 gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zu einer
wesentlich erhöhten Lymphokinproduktion.
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Die Erhöhung der Lymphokinproduktion, die durch Verabreichung des CD28-
Stimulators gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht wurde, wie es besonders
im spezifischen Beispiel III gezeigt wurde, führt überraschenderweise zu einer erhöhten
Produktion eines vollständigen Lymphokin-Satzes, was anzeigt, daß diese Lymphokine
von einer CD28-Regulation kontrolliert werden. Dieser Satz von Lymphokinen, der IL-2,
TNF-α, LT, IFN-γ und GM-CSF einschließt, ist geringfügig analog zu den in Mäusen
vorhandenen Tgl-Zell-Lymphokinen, die von T. R. Mosmann et al., Immunol. Today 8
(1987), 223-227, beschrieben wurden. Dieser Befund wird auch durch die ausbleibende
Erhöhung der menschlichen IL-4-Produktion (Daten nicht dargestellt) durch eine CD28-
Stimulation, ein Lymphokin, das auch nicht durch TH1-Zellen der Maus produziert
wurde, gestützt. Daher wird zur Vereinfachung der Bezugnahme die Gruppe menschlicher
durch eine CD28-Stimulation beeinflußter Lymphokine hier nachstehend als menschliche
TH1-Lymphokine bezeichnet. Man muß sich jedoch bewußt sein, daß der Begriff
"menschliche TH1-Lymphokine" nicht auf die vorstehend aufgeführten Lymphokine
beschränkt ist, sondern alle menschlichen Lymphokine einschließen soll, deren Produktion
durch die Bindung oder Stimulation des CD28-T-Zell-Oberflächenmoleküls beeinflußt
oder reguliert wird. Daher können durch Verabreichung von anti-CD28-Antikörpern
gemäß der vorliegenden Erfindung die Produktion und die Spiegel eines vollständigen
menschlichen Lymphokin-Satzes signifikant erhöht werden.
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Die vorliegende Erfindung kann ferner verwendet werden, um die
T-Zellvermittelte Immunantwort in immundeprimierten Patienten, wie AaS-Kranke, zu
erleichtern. Wie in den spezifischen Beispielen VI-VIII dargestellt, bleiben die T-Zell-
Proliferation und die erhöhten Spiegel oder die erhöhte Produktion von CD28-regulierten
Lymphokinen selbst bei einer Immunsuppression, beispielsweise durch die Wirkung von
Cyclosporin oder Dexamethason, erhalten. Daher kann die Verabreichung von CD28-
Stimulatoren, wie mAb 9.3, zur Behandlung von immundeprimierten Patienten zur
Erhöhung ihrer in vivo-Lymphokin-Spiegel verwendet werden.
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Ferner kann eine Reihe von Syndromen einschließlich septischer Schock und
Tumorinduzierte Kachexie eine Aktivierung des CD28-Weges und eine vermehrte
Produktion von potentiell toxischen Lymphokin-Spiegeln einschließen. Daher kann die
Herrunterreguliergung des CD28-Weges beispielsweise durch Bindung von CD28 an ein
F(ab')&sub2;-Fragment oder einen natürlich vorkommenden Liganden des CD28-Moleküls auch
für diese klinischen Zustände verwendet werden.
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Man muß sich bewußt sein, daß die Verwendung eines anti-CD28-Antikörpers
bisher nicht ernsthaft als ein potentielles immuntherapeutisches Verfahren zur
wesentlichen Erhöhung der Lymphokin-Spiegel an den Stellen von aktivierten T-Zellen in
Betracht gezogen wurde. Es wurde beispielsweise angenommen, daß die Zugabe des mAb
9.3 die T-Zell-Proliferation nur etwas erhöht, signifikante Erhöhungen der menschlichen
TH1-Lymphokin-Produktion jedoch nicht induziert.
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Obwohl hier keine Festlegung auf irgendeinen bestimmten Mechanismus der
Regulation der T-Zell-vermittelten Immunantwort durch die CD28-Bindung beabsichtigt
ist, wurde ein Modell für den Mechanismus der Stimulierung postuliert und mit
experimentellen Daten gestützt, von denen einige im spezifischen Beispiel VIII dargestellt
sind.
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Es wurde kürzlich gezeigt, daß eine Reihe von Lymphokingenen im
Cytoplasma schneller als mRNAs von konstitutiv exprimierten Haushalts-Genen abgebaut
werden, was zur Hypothese führte, daß die Instabilität dieser induzierbaren mRNAs eine
schnelle Regulation der Genexpression ermöglichen soll. Es wird angenommen, daß der
hier beschriebene Mechanismus der CD28-Regulation mit der Stabilisierung von schnell
abbaubaren mRNAs für den vorstehend beschriebenen menschlichen TH1-Lymphokin-
Satz zusammenhängt. Bisher wurde anscheinend kein anderer Mechanismus in
irgendeinem eukaryontischen Zellsystem beschrieben, um zu zeigen, daß ein
Zelloberflächenaktivierungsweg die Genexpression durch Induktion der spezifischen
Änderung des mRNA-Abbaus verändert.
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Wie im spezifischen Beispiel IV dagestellt, bewirkte die gemeinsame
Stimulation von CD28 und CD3 eine Zunahme an mRNA der menschlichen TH1-
Lymphokine, die nicht durch eine allgemeine Erhöhung der stationären mRNA-
Expression von allen T-Zell-Aktivierungs-assoziierten Genen bewirkt wurde. Die
Erhöhung war disproportional und konnte daher nicht für die Erhöhung des Prozentsatzes
der proliferierenden Zellen in Kultur verantwortlich gemacht werden. Diese Daten, neben
den weiteren hier nicht näher beschriebenen Untersuchungen, zeigen, daß die Aktivierung
des CD28-Oberflächenmoleküls von aktivierten T-Zellen die spezifische Stabilisierung
von Lymphokin-mRNAs bewirkt. Eine erhöhte mRNA-Stabilität, d. h. ihr langsamer
Abbau, bewirkt eine erhöhte Translation der mRNA, was wiederum zu einer erhöhten
Lymphokinproduktion pro Zelle führt.
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Daher werden gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung Liganden,
wie mAb 9.3, mit einer Bindungsspezifität für das CD28-Molekül in einer zur in vivo-
Verabreichung geeigneten, biologisch verträglichen Form zur Stimulierung des CD28-
Weges verabreicht. "Stimulation des CD28-Weges" meint die Stimulation des CD28-
Moleküls, die eine erhöhte T-Zell-Proliferation oder Produktion von menschlichen TH1-
Lymphokinen oder beides bewirkt. "Zur in vivo-Verabreichung geeignete, biologisch
verträgliche Form" meint eine Form des zu verabreichenden Liganden, in der die eventuell
vorhandenen toxischen Wirkungen durch die therapeutischen Wirkungen des Liganden
übertroffen werden. Die Verabreichung des CD28-Liganden kann in jeder geeigneten
pharmakologischen Form, die eine intravenöse Injektion des Liganden in Lösung
einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist, erfolgen.
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Es ist selbstverständlich, daß, obwohl die Modelle für die CD28-Regulation der
Lymphokinproduktion im Hinblick auf die Stimulation und Erhöhung der
Lymphokinspiegel beschrieben werden, eine Herrunterregulierung oder Hemmung des
CD28-Weges auch durch Wahl des geeigneten Liganden für eine CD28-Bindung möglich
ist: der verwendete Ligand hat dann eine hemmende Wirkung auf den CD28-Weg.
Spezifisches Beispiel I
Herstellung des monoclonalen CD28-Stimulator-Antikörpers 9.3
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Der monoclonale Antikörper (mAb) 9.3, ein monoclonaler IgG2a-Antikörper,
der an die extrazelluläre Domäne des CD28-Moleküls bindet, wurde durch eine
Hybridzellinie produziert, die ursprünglich von Hansen et al., vgl. Immunogenetics 10
(1980), 247-260, stammte. Ascitesflüssigkeit, die hohe Titer des monoclonalen
Antikörpers 9.3 enthielt, wurde durch intraperitoneale Inokulation von 5 bis 10 · 10&sup6;
Hybridzellen in BALB/c x C57BL/6-F&sub1;-Mäuse, die intraperitoneal mit 0,5 ml Pristan
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) sensibilisert worden waren, hergestellt. Der
monoclonale Antikörper 9.3 wurde aus der Ascitesflüssigkeit auf einer Staphylokokken-
Protein A-Sepharosesäule, wie von Hardy, R., Handbook of Experimental Immunology
Kap. 13 (1986), beschrieben, gereinigt. "Pristan" und "Sepharose" sind Handelsnamen.
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Vor der Verwendung in funktionellen Tests wurde der gereinigte mAb 9.3
ausgiebig gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (KCl 0,2 Gramm/Liter dH&sub2;O;
KH&sub2;PO&sub4;
0,2 Gramm/Liter dH&sub2;O; NaCl 8,0 Gramm/Liter dH&sub2;O; Na&sub2;HPO&sub4; · 7H&sub2;O 2,16
Gramm/Liter dH&sub2;O) dialysiert und anschließend durch ein steriles 0,22 Kubikmikron-
Filter (Acrodisc, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) filtriert. Die mAb 9.3-Präparation
wurde von Aggregaten durch Zentrifugation bei 100000 · g 45 Minuten bei 20ºC befreit.
Der erhaltene gereinigte mAb 9.3 wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu einer
Endkonzentration von 200 ug/ml resuspendiert, wie durch OD&sub2;&sub8;&sub0;-Analyse ermittelt
wurde, und vor der Verwendung bei 4ºC aufbewahrt.
Spezifisches Beispiel II
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Isolation von CD28&spplus;-T-Zellen
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"Buffy coat"-Zellen wurden durch Leukopherese von gesunden Spendern in
einem Alter von 21 bis 31 Jahren erhalten. Periphere Blutlymphocyten (PBL), etwa 2,5 ·
10&sup9;, wurden aus den "Buffy coat"-Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation unter
Verwendung von Lymphocyten-Trennmedium (Litton Bionetics, Kensington, MD)
isoliert. Der CD28+-Untersatz von T-Zellen wurde anschließend aus den PBL durch
negative Selektion unter Verwendung der Immunabsorption isoliert, wobei die reziproke
und nicht-überlappende Verteilung der CD11- und CD28-Oberflächenantigene, wie von
Yamada et al., Eur. J. Immunol. 15 (1985), 1164-1688, beschrieben, ausgenutzt wurde.
PBL wurden zu etwa 20 · 10&sup6;/ml in RPMI 1640-Medium (GIBCO Laboratories, Grand
Island, NY), das 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) (GIBCO Laboratories, Grand Island,
NY), 5 mM EDTA (SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO) und 5% hitzeaktiviertes
menschliches AB-Serum (Pel-Freez, Brown Deer, WI) enthielt, suspendiert. Die Zellen
wurden bei 4ºC auf einem Rotationsgerät mit sättigenden Mengen der monoclonalen
Antikörper 60.1 (anti-CD 11a) (vgl. I. D. Bernstein et al., Leukocyte Typing II Bd. 3, S. 1-
25, Hrsg. E. L. Reinherz et al., (1986)); IFS (anti-CD20) (vgl. E. A. Clark et al., PNAS
(USA) 82 (1985), 1766-1770); FC-2 (anti-CD16) (vgl. C. H. June et al., J. Clin. Invest. 77
(1986), 1224-1232; und anti-CD14 20 Minuten inkubiert. Dieses Gemisch von
Antikörpern überzog alle B-Zellen, Monocyten, großen granulären Lymphocyten und
CD28-T-Zellen mit Mausimmunglobulin. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen,
um ungebundenen Antikörper zu entfernen, und anschließend 1 Stunde bei 4ºC mit
Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin-beschichteten magnetischen Partikeln (Dynal, Inc., Fort
Lee, NJ) in einem Verhältnis von 3 magnetischen Partikeln pro Zelle inkubiert. Die an
magnetische Partikel gebundenen Antikörper-beschichteten Zellen wurden anschließend
durch magnetische Trennung, wie von T. Lea et al., Scan. J. Immunol. 22 (1985), 207-
216, beschrieben, entfernt. Typischerweise wurden etwa 700 · 10&sup6; CD28&spplus;-T-Zellen
gewonnen.
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Die Zellreinigung wurde routinemäßig durch Durchflußcytometrie und
Histochemie überwacht. Die Durchflußcytometrie wurde, wie von J. A. Ledbetter et al.,
Lymphocyte Surface Antigens, S. 119-129 (Hrsg. Heise, E., 1984) beschrieben,
durchgeführt. Kurz gesagt wurden CD28&spplus;-T-Zellen mit Fluorescein-Isothiocyanat
(FITC)-konjugiertem anti-CD2-mAbOKT11 (Coulter, Hialeah, FL) und mit
FITCkonjugiertem anti-CD28-mAb 9.3, wie von Goding, J. W., Monoclonal Antibodies
Principles and Practice, S. 230 (Hrsg. Goding, J. W., 1983) beschrieben, gefärbt. CD28&spplus;-
T-Zellen waren über 99% positiv beim FITC-konjugierten monoclonalen Antikörper
OKT11 und über 98% positiv beim FITC-konjugierten monoclonalen Antikörper 9.3 bei
einem Vergleich mit einem nicht-bindenden, isotypisch übereinstimmenden,
FITCmarkierten Kontrollantikörper (Coulter, Hialeah, FL). Die restlichen Monocyten wurden
durch Färbung auf die nicht-spezifische Esterase unter Verwendung eines im Handel von
der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältlichen Kits quantitativ bestimmt und waren
zu weniger als 0,1% in allen Zellpopulationen dieser Untersuchung vorhanden. Die
Lebensfähigkeit war etwa 98%, wie durch Trypanblau-Ausschluß, wie von B. B. Mishell
et al., Selected Methods Cell. Immunol., S. 16-17 (1980), beschrieben, gemessen wurde.
Spezifisches Beispiel III
Erhöhte zelluläre Produktion von menschlichen TH1-Lymphokinen durch CD28-
Stimulation mit dem monoclonalen Antikörper 9.3
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CD28&spplus;-T-Zellen wurden zu etwa 1 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung in Gegenwart von
verschiedenen Kombinationen von Stimulatoren gezüchtet. Die Stimulatoren schlossen
eine Konzentration von 3 ng/ml Phorbolmyristatacetat (PMA) (LC Services Corporation,
Woburn, MA); 100 ng/ml anti-CD28-mAb 9.3; 200 ng/ml anti-CD3-mAb G19-4, der
durch Adsorption an die Oberfläche von Plastikgewebekulturplatten, wie zuvor von
Geppert et al., J. Immunol. 138 (1987), 1660-1666, und auch von Ledbetter et al., J.
Immunol. 135 (1985), 2331-2336, beschrieben, immobilisiert wurde; und 100 ng/ml
Ionomycin (Iono) (Molecular Probes, Calbiochem, CA) ein. Die Kulturüberstände wurden
nach 24 Stunden geerntet und Reihenverdünnungen auf menschliche TH1-Lymphokine
getestet.
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Insbesondere wurde IL-2 unter Verwendung eines Biotests, wie zuvor von
Gillis et al., Nature 268 (1977), 154-156, beschrieben, getestet. Eine Einheit (E) wurde als
die Menge von IL-2 definiert, die zur Induktion der halben maximalen Proliferation von 7
· 10³
CTLL-2 (eine menschliche cytotoxische T-Zellinie)-Zellen nach 24 Stunden
Züchtung erforderlich war. In getrennten Experimenten wurden die relativen Spiegel von
IL-2 für alle vorstehenden Kulturbedingungen unter Verwendung eines im Handel
erhältlichen ELISA-Tests (Genzyme Corp., Boston, MA) unabhängig voneinander
bestätigt. TNF-α/LT-Spiegel wurden unter Verwendung eines halbautomatischen L929-
Fibroblasten-Lyse-Tests, wie zuvor von Kunkel et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 5380-
5384, beschrieben, gemessen. Einheiten von TNF-α/LT wurden unter Verwendung eines
internen Standards für TNF-α (Genzyme Corp., Boston, MA) definiert. Die unabhängige
Gegenwart sowohl von TNF-α als auch von LT wurde durch die Fähigkeit eines für jedes
Cytokin spezifischen monoclonalen Antikörpers zur partiellen Hemmung der durch den
Überstand vermittelten Zellyse von Zellen, die mit immobilisiertem anti-CD3-mAb G19-4
und anti-CD28-mAb 9.3 gemeinsam stimuliert wurden, bestätigt. IFN-γ wurde durch
einen Radioimmuntest unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Centocor,
Malvern, PA) gemessen. Einheiten für IFN-γ wurden aus einer Standardkurve unter
Verwendung eines im Testkit bereitgestellten 12Sbmarkierten menschlichen IFN-γ
ermittelt. GM-CSF wurde durch Stimulation der Proliferation der menschlichen GM-CSF-
abhängigen Zellinie AML-193, wie von Lange et al., Blood 70 (1987), 192-199,
beschrieben, in Gegenwart von neutralisierenden monoclonalen Antikörpern gegen TNF-
α und LT nachgewiesen. Die 3H-Thymidinaufnahme, die von 10 ng/ml gereinigtem GM-
CSF (Genetics Institute, Cambridge, MA) induziert wurde, wurde als 100 E definiert.
Getrennte Aliquots von Zellen wurden 48 Stunden nach der Stimulation gewonnen und
auf den Prozentsatz von Zellen in späten Stadien des Zellcyclus (S + G2 + M) durch Färbung
von Zellen mit Propidiumiodid und eine Analyse durch Durchflußcytometrie, wie zuvor
von Thompson et al., Nature 314 (1985), 363-366, beschrieben, getestet.
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Wie in Tabelle 1 dargestellt, führte die CD28-Stimulation von CD3-stimulierten
T-Zellen zu deutlichen Erhöhungen der zellulären Produktion von IL-2, TNF-α, IFN-γ
und GM-CSF, hier nachstehend als menschliche TH1-Lymphokine bezeichnet.
Tabelle 1 Erhöhte zelluläre Produktion von menschlichen TH1-Lymphokinen durch eine CD28-
Stimulation
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i = immobilisiert
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NT = nicht getestet
Spezifisches Beispiel IV
Vergleich der CD28-Stimulation mit der Stimulation anderer T-Zell-Oberflächenmoleküle
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CD28&spplus;-T-Zellen wurden zu etwa 1 · 105 Zellen/Vertiefung in RPMI-Medien
gezüchtet, die 5% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), 10 ug/ml PHA, 3 ng/ml
PMA, 100 ng/ml Ionomycin, 100 ng/ml anti-CD28-mAb 9.3 oder 1 ug/ml CD45-
spezifischen mAb 9.4 oder 1 ug/ml CD2-spezifischen mAb 9.6 oder 200 ng/Vertiefung
immobilisierten, CD3-spezifischen mAb G19-4 enthielten.
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CD28+-T-Zellen wurden in vierfachen Proben in Mikrotiterplatten mit 96
flachbödigen Vertiefungen in 5% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum enthaltenden
RPMI-Medien gezüchtet. Gleiche Aliquots von Zellen wurden 18 Stunden gezüchtet und
anschließend 6 Stunden mit 1 uCi ³H-Uridin/Vertiefung oder 72 Stunden und
anschließend 6 Stunden mit 1 uCi ³H-Thymidin/Vertiefung gepulst. Die
Durchschnittswerte und Standardabweichungen (in CpM) wurden durch
Flüssigscintillationszählung nach der Sammlung der Zellen auf Glasfaserfiltern ermittelt.
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Alle Kulturen, die durch monoclonale anti-CD3-Antikörper an Plastik
immobilisierte Zellen enthielten, wurden visuell untersucht, um eine vollständige Zellernte
sicherzustellen. Das Ausbleiben der Proliferation als Antwort auf PHA bei den Zellen in
diesen Kulturen ist das Ergebnis der rigorosen Beseitigung von Helferzellen, in
vivoaktivierten T-Zellen, B-Zellen und CD11&spplus; (CD28-)-T-Zellen durch negative
Immunabsorption, wie vorstehend im spezifischen Beispiel II beschrieben. In jedem
Experiment wurden die Zellen mit Fluorescein-konjugiertem anti-CD2-rnAb OKT11 und
Fluorescein-konjugiertem anti-CD28-mAb 9.3 gefärbt, und es wurde gezeigt, daß sie über
99% bzw. über 98% an der Oberfläche positiv waren.
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Ein repräsentatives Experiment wird in den Fig. 1 und 2 erläutert. Wie in
den Fig. 1 und 2 hatte anti-CD28 selber keine signifikante Wirkung auf den Uridin-
oder Thymidin-Einschluß noch diente es der Erhöhung der Proliferation, die entweder
durch den immobilisierten anti-CD3-mAb G19-4 oder chemisch-induzierte T-Zell-
Proliferation, die Phorbolmyristatacetat (PMA) und Ionomycin (Iono) einschloß, induziert
wurde. Wie in Fig. 2 dargestellt, erhöhte jedoch anti-CD28 signifikant den Uridin-
Einschluß von beiden Zellsätzen. Im Gegensatz dazu hatten jedoch andere monoclonale
Antikörper, die anti-CD2-mAb OKT11 und anti-CD45-mAb 9.4 einschlossen, keine
signifikante Wirkung auf den Uridin-Einschluß von anti-CD3-stimulierten Zellen. Dies
lag nicht an der fehlenden Wirkung dieser Antikörper auf die Zellen, da sowohl
monoclonale anti-CD2- als auch anti-CD7-Antikörper die Proliferation von anti-CD3-
stimulierten Zellen erhöhten. In getrennten Experimenten bewirkte die Bindung von
isotypisch übereinstimmenden mAbs an andere T-Zell-Oberflächenantigene (CD4, CD6,
CD7 oder CD8) nicht die bei anti-CD28 beobachtete Wirkung.
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Diese Daten bestätigen, daß die Stimulation von aktivierten T-Zellen durch
CD28 einen einzigartigen Phänotyp aufweist, was anscheinend die Geschwindigkeit des
Einschlußes eines radioaktiven Markers in die stationäre RNA von T-Zellen ohne direkte
Erhöhung der T-Zell-Proliferation direkt erhöht.
Spezifisches Beispiel V
Erhöhte zelluläre Produktion von menschlichen TH1-Lymphokinen durch CD28-
Stimulation ex vivo
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Auf der Basis der Befunde aus den in vitro-Systemen scheint es, daß CD28
keine signifikante Wirkung auf die zelluläre Produktion von Lymphokinen aufweist,
sofern nicht zuvor eine Antigenaktivierung oder entsprechendes durchgeführt wurde. Die
CD28-Bindung durch den 9.3-mAb erhöhte jedoch signifikant die Fähigkeit der anti-
TCR/CD3-aktivierten T-Zellen zur Aufrechterhaltung der Produktion von menschlichen
TH1-Typ-Lymphokinen. Zum Testen dieser Wirkung in einem physiologischen Rahmen
wurde die Aktivierung von T-Lymphocyten in einem ex vivo Gesamtblutmodell
untersucht.
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50 bis 100 ml Venenblut wurden durch sterile Standardverfahren von normalen
Freiwilligen erhalten, nachdem diese nach einer Beratung zugestimmt hatten. Dem Blut
wurden 25 E/ml Konservierungsstoff-freies Heparin (Spectrum, Gardenia, CA) zur
Verhinderung der Gerinnung zugesetzt. Einzelne 10 ml-Aliquots wurden anschließend auf
einer Schüttelplattform in ein 15 ml Polypropylenröhrchen zur Aufrechterhaltung des
Flusses und der Belüftung der Probe gegeben.
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Zum Testen der Wirksamkeit der CD28-Stimulation auf die Induktion der
Lymphokingenexpression wurde die Produktion des TNF-α-Moleküls aufgrund der
extrem kurzen Halbwertszeit (etwa 15 Minuten) des Proteins im Gesamtblut als Modell
gewählt. 10 ml des wie vorstehend beschrieben isolierten Gesamtbluts wurden mit dem
löslichen anti-CD3-mAb G19-4 in einer Konzentration von 1 ug/ml oder dem anti-CD28-
mAb 9.3 in einer Konzentration von 1 ug/ml oder einer Kombination der beiden
Antikörper inkubiert. Das Plasma wurde auf TNF-α, wie im spezifischen Beispiel III
beschrieben, nach einer und vier Stunden getestet. Ein Beispiel eines solchen Experiments
ist in Tabelle 1 dargestellt, die die signifikante Erhöhung der Produktion von TNF-α durch
maximale Stimulation von CD3 und gleichzeitige Stimulation von CD28 erläutert.
Tabelle 2
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a Vor der Zugabe des monoclonalen Antikörpers zu Aliquots der Venenprobe
ermittelter Wert.
Spezifisches Beispiel VI
Resistenz der CD28-induzierten T-Zell-Proliferation gegen Cyclosporin
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Das verwendete Protokoll und die hier beschriebenen Ergebnisse werden genau
von C. H. June et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 4472-4481, beschrieben.
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T-Zellen, die durch Nylonwollfiltration gemäß der Beschreibung von Julius et
al., Euro. J. Immunol. 3 (1973), 645-649, angereichert worden waren, wurden bei etwa 5 ·
10&sup4;/Vertiefung in Gegenwart von Stimulatoren in den folgenden Kombinationen
gezüchtet: anti-CD28-mAb 9.3 (100 ng/ml) und PMA (1 ng/ml); immobilisierte anti-CD3-
mAb G19-4 (200 ng/Vertiefung); oder PMA (100 ng/ml). Die vorstehenden
Kombinationen schließen ferner vierfache Titrationen (von 25 ng/ml bis 1,6 ug/ml) von
Cyclosporin (CSP) (Sandoz, Hanover, NJ), das in Ethanol-Tween 80 gelöst war, wie von
Wiesinger et al., Immunobiology 156 (1979), 454-463, beschrieben, ein. "Tween" ist eine
Handelsmarke.
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Der ³H-Thymidin-Einschluß wurde am Tag 3 der Züchtung gemessen, und die
Ergebnisse von acht voneinander unabhängigen Experimenten sind in Fig. 3 dargestellt.
Der arithmetische Durchschnitt + 1 Standardabweichung ist dargestellt, wo der Balken die
Größe des Symbols übersteigt. Die Proliferation von Zellen, die im Medium allein
gezüchtet wurden, war 185 ± 40 CpM. Das Cyclosporin-Verdünnungsmittel allein
beeinflußte die zelluläre Proliferation nicht (Daten nicht dargestellt). Wie in Fig. 3
dargestellt, zeigt die CD28-induzierte T-Zell-Proliferation eine fast vollständige
Cyclosporin-Resistenz bei einer gleichzeitigen Verabreichung von PMA.
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Die nachstehende Tabelle 3 erläutert die Wirkungen von Cyclosporin auf die
CD3-induzierte Proliferation von CD28+-T-Zellen, die zu etwa 5 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung
in Mikrotiterplatten mit 96 flachbödigen Vertiefungen (CoStar, Cambridge, MA) unter
den nachstehenden Bedingungen gezüchtet wurden: immobilisierter mAb G19-4; oder
immobilisierter mAb G19-4 und mAb 9.3 (100 ng/ml); oder immobilisierter mAb G19-4
und PMA (1 ng/ml); oder mAb 9.3 (100 ng/ml) und PMA (1 ng/ml). Cyclosporin wurde,
wie vorstehend beschrieben, hergestellt und den Kulturen zu 0, 0,2, 0,4, 0,8 und 1,2 ug/ml
zugesetzt. Der ³H-Thymidin-Einschluß wurde am Tag 3 der Züchtung, wie vorstehend
beschrieben, ermittelt. Die prozentuale Hemmung der Proliferation wurde bei CD28&spplus;-T-
Zellen, die nur in Medium oder in Cyclosporin mit Cyclosporin bei 1,2 ug/ml gezüchtet
wurden, berechnet. In Abwesenheit von Cyclosporin gezüchteten CD28&spplus;-T-Zellen wurde
Cyclosporin-Verdünnungsmittel zugesetzt. Der 3H-Thymidin-Einschluß von Zellen, die in
Medium, PMA oder dem monoclonalen Antikörper 9.3 allein gezüchtet wurden, war
weniger als 150 CpM. Wie in Tabelle 3 dargestellt, führte die gemeinsame Stimulation
von CD3 und CD28 zu einer deutlichen Erhöhung der Resistenz der T-Zell-Proliferation
gegen Cyclosporin und die Stimulation von CD28 in Gegenwart von PMA zu einer
vollständig fehlenden Cyclosporin-Suppression der T-Zell-Proliferation. Die Stimulation
von CD28 zusammen mit immobilisiertem anti-CD3 führte ebenfalls zu einer Resistenz
gegen die Suppression der T-Zell-Proliferation durch immunsuppressives Dexamethason.
Tabelle 3 Wirkung der CD28-Stimulation auf die Cyclosporin-Resistenz der T-Zell-Proliferation
Spezifisches Beispiel VII
Menschliche Tgl-Lymphokin-Sekretion in Gegenwart von Cyclosporin
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Wie im spezifischen Beispiel III beschrieben, wurden CD28&spplus;-T-Zellen in
Gegenwart von verschiedenen Stimulatoren gezüchtet. Die Kulturüberstände wurden nach
24 Stunden geerntet und Reihenverdünnungen auf IL-2, TNF-α/LT, IFN-γ und GM-CSF,
wie vorstehend beschrieben, getestet. Getrennte Aliquots von Zellen wurden 48 Stunden
nach der Stimulation gewonnen und auf den Prozentsatz von Zellen in den späten Stadien
des Zellzyklus (S + G&sub2; - M) getestet.
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Bei einem Einschluß von Cyclosporin zu 0,6 ug/ml in das Testprotokoll, wie in
Tabelle 4 dargestellt (die ferner die Daten des spezifischen Beispiels III zum Vergleich
einschließt), wurde festgestellt, daß CD28+-T-Zellen die menschlichen TH1-Lymphokine
in Gegenwart von Cyclosporin in Kulturen sezernierten, die mit mAb 9.3 und PMA;
immobilisierten mAb G19-4 und mAb 9.3; oder PMA und Ionomycin und mAb 9.3
stimuliert wurden. Die Produktion von menschlichem TH1-Lymphokin, die durch
immobilisierte mAb G19-4 oder durch PMA mit Ionomycin induziert wurde, wurde
jedoch in Gegenwart von Cyclosporin vollständig supprimiert.
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Tabelle 4
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Erhöhte zelluläre Produktion von menschlichen TH1-Lymphokinen durch TNF-U/LT
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i = immobilisiert
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NT = nicht getestet
Spezifisches Beispiel VIII
Menschliche TH1-Lymphokin-mRNA-Expression in Gegenwart von Cyclosporin
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Zur weiteren Untersuchung, ob die CD28-Stimulation zu einer
Cyclosporinresistenten menschlichen TH1-Lymphokin-Genexpression sowie -Sekretion führte, wurde
die Fähigkeit von Cyclosporin zur Unterdrückung der Induktion von IL-2, TNF-α, LT,
IFN-γ und GM-CSF nach der Stimulation durch verschiedene Stimulatoren getestet.
Insbesondere wurden CD28&spplus;-T-Zellen zu 2 · 10&sup6;/ml in komplettem RPMI-Medium
(GIBCO, Grand Island, NY) mit S% FCS (MED) gezüchtet. Einzelne Aliquots von
CD28+-T-Zellen wurden 6 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von 1,0 ug/ml
Cyclosporin mit 3 ng/ml PMA und anti-CD28-mAb 9.3 (1 mg/ml); mit immobilisiertem
anti-CD3-mAb G19-4 (1 ug/Vertiefung); oder mit immobilisiertem mAb G19-4 (1
ug/Vertiefung) und mAb 9.3 (1 ng/ml) inkubiert. CD28&spplus;-T-Zellen wurden geerntet,
Gesamtzell-RNA isoliert und bezüglich der ribosomalen RNA angeglichen, wie zuvor von
Thompson et al., Nature 314 (1985), 363-366, beschrieben.
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Northern-Blots wurden hergestellt und sequentiell mit ³²P-markierten
nicktranslatierten genspezifischen Sonden hybridisiert, wie von C. H. June et al., Mol. Cell.
Biol. 7 (1987), 4472-4481, beschrieben. Die IL-2-Sonde war ein 1,0 kb-PstI-cDNA-
Fragment, wie von C. H. June et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 4472-4481, beschrieben;
die IFN-γ-Sonde war ein 1,0 kb-PstI-cDNA-Fragment, wie von Young et al., J. Immunol.
136 (1986), 4700-4703, beschrieben. Die GM-CSF-Sonde war ein 700 Basenpaar-EcoRI-
HindIII-cDNA-Fragment, wie von Wong et al., Science 228 (1985), 810-815, beschrieben;
die 4F2-Sonde war ein 1,85 kb-EcoRI-cDNA-Fragment, wie von Lindsten et al., Mol.
Cell. Biol. 8 (1988), 3820-3826, beschrieben; die IL4-Sonde war ein 0,9 kb-XhoI-cDNA-
Fragment, wie von Yokota et al., PNAS (USA) 83 (1986), 5894-5898, beschrieben, und
die menschliche Leukocyten-Antigen (HLA)-Sonde war ein 1,4 kb-PstI-Fragment des
HLA-B7-Gens, wie von Lindsten et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 3820-3826,
beschrieben. TNF-α- und LT-spezifische Sonden wurden als genspezifische 30
Nucleotidoligomere synthetisiert, wie von Steffen et al., J. Immunol. 140 (1988), 2621-
2624, und Wang et al., Science 228 (1985), 149-154, beschrieben. Nach der
Hybridisierung wurden die Blots gewaschen und einer Autoradiographie bei -70ºC
exponiert. Die Quantifizierung der Banddichten wurde durch Densitometrie, wie von
Lindsten et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 3820-3826, beschrieben, durchgeführt.
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Wie durch den Northern-Blot von Fig. 4 dargestellt, führte eine Stimulation
durch den mAb 9.3 mit PMA und durch den mAb 9.3 mit dem mAb G19-4 zu einer
menschlichen TH1-Lymphokin-Genexpression, die eine Resistenz gegen Cyclosporin
zeigte. Im Gegensatz dazu war die Stimulation durch mAb G19-4 allein in Gegenwart von
Cyclosporin vollständig unterdrückt.
Spezifisches Beispiel IX
In vivo-Aktivierung von T-Zellen durch CD28-Stimulation
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F(ab')&sub2;-Fragmente von mAb 9.3 wurden, wie von J. A. Ledbetter et al., J.
Immunol. 135 (1985), 2331-2336, beschrieben, hergestellt. Gereinigte und
Endotoxinfreie F(ab')&sub2;-Fragmente wurden intravenös bei 1 mg/kg Körpergewicht über einen
Zeitraum von 30 Minuten in einen gesunden Makaken (M. nemestrina)-Affen injiziert. An
den Tagen 2 und 7 nach der Injektion wurden 5 ml Blut entnommen und getestet.
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Periphere Blutlymphocyten aus dem Affenblut wurden durch
Dichtegradientenzentrifugation isoliert, wie im spezifischen Beispiel II beschrieben. Die Proliferation von
mononucleären Zellen des periphären Bluts als Antwort auf PMA (1 ng/ml) wurde im
behandelten Affen und in einem Kontrolltier (keine F(ab')&sub2;-Fragment-Behandlung) in
dreifacher Ausführungsform, wie im spezifischen Beispiel IV beschrieben, getestet. Die
Proliferation wurde als Aufnahme von 3H-Thymidin während der letzten 6 Stunden eines
dreitägigen Experiments gemessen, und die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Die
Durchschnittswerte von dreifachen Kulturen sind dargestellt, und Standardabweichungen
von den Durchschnittswerten waren weniger als 20% an jedem Punkt. Wie in Fig. 5
dargestellt, erhöhte die Stimulation von CD28 durch das F(ab')&sub2;-mAb 9.3-Fragment die T-
Zell-Proliferation in vivo.