DE69431454T2

DE69431454T2 - Amylase Inhibitoren

Info

Publication number: DE69431454T2
Application number: DE69431454T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Matsubara; Toshiyuki Miyazaki; Toshihisa Morimoto; Ryuji Murayama
Original assignee: Nagata Sangyo Co Ltd; Nisshin Pharma Inc
Current assignee: Nagata Sangyo Co Ltd; Nisshin Pharma Inc
Priority date: 1993-03-29
Filing date: 1994-03-24
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2014-03-25
Also published as: EP0618229B1; CA2119660A1; EP0618229A1; CA2119660C; DE69431454D1; US5444046A

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Amylase-Inhibitor, der spezielle Proteine enthält, ein Verfahren zur Herstellung desselben aus einem Weizen-Ausgangsmaterial und die Anwendung eines solchen Amylase-Inhibitors als Arznei- oder Nahrungsmittel.
Die Aufnahme von zu viel Nährstoffen löst die Sekretion einer großeren Menge von Insulin aus und bewirkt indirekt einen Zusammenbruch des metabolischen Gleichgewichts und somit eine Verminderung der Glucosetoleranzfunktion (Hyperglykämie), Diabetes, Hyperlipidämie, Arteriosklerose etc. Insbesondere bei Diabetes-Patienten ist die Insulinfunktion unzureichend und die Glucosetoleranz vermindert. Folglich ist der Blut-Glucosespiegel nach den Mahlzeiten bemerkenswert erhöht und führt zu Komplikationen, wie Schädigungen der Blutkapillaren und Arteriosklerose. Es wird gesagt, daß zur Prävention und Behandlung solcher Krankheiten die Aufnahme von Nahrungsmitteln oder Materialien, die schwerlich eine Erhöhung des Blut-Glucosespiegels auslosen können, wirksam ist. In dieser Hinsicht sind Materialien erwünscht, die die Hydrolyse von Stärke zu Glucose zu hemmen oder zu verhindern vermögen. Außerdem begünstigt übermäßiges Essen bei Erwachsenen Krankheiten, wie Adiposie, Bluthochdruck, Diabetes und Herzerkrankungen.
Aufgrund der obigen Aspekte wurden verschiedene Studien über sogenannte Amylase-Inhibitoren durchgeführt, die zur Hemmung der Aktivität von Amylase auf die Hydrolyse von Stärke wirksam sind. Es wird berichtet, daß Amyalse- Inhibitoren auch in Weizen enthalten sind. Bisher wurden Amylase-Inhibitoren aus Weizen untersucht [siehe beispielsweise die U.S.-Patentschrift Nr. 3 950 319, die japanische Patentschrift Kokai Nr. 61-171431, Phytochemistry, Bd. 20, Nr. 8, S. 1781-1784, 1981; Eur. J. Biochem. 183, 37-40 (1989)].
Allerdings wird berichtet, daß bisherige Amylase-Inhibitoren aus Weizen, wie vorstehend erwähnt, eine äußerst geringe oder keine inhibitorische Aktivität gegenüber menschlicher Pankreas-α-Amylase zeigen, die bei oraler Einnahme bei Menschen wie erwartet keine Wirkung ausüben, obwohl sie gegenüber den Amylasen von Tieren, anders als beim Menschen, etwas inhibitorische Aktivität zeigen. Darum besteht Bedarf an einem hochwirksamen Amylase-Inhibitor mit hoher inhibitorischer Aktivität gegenüber menschlicher Pankreas-α-Amylase, der bei oraler Verabreichung in geringer Konzentration eine Erhöhung des Blut-Glucosespiegels und eine Insulinsekretion und insbesondere die Hydrolyse von erhitzter oder gekochter Stärke wirksam zu hemmen vermag.
Es wird ferner berichtet, daß ein Mittel zur Hemmung einer Erhöhung des Blut-Glucosespiegels oder einer Insulinsekre tion zu einer erhöhten Konzentration an freien Fettsäuren im Blut führt [Puls und Keup, "Diabetologia" 9, 97-101 (1973)]. In der Regel erzeugt eine solche erhöhte Konzentration das Gefühl von Hunger, das dazu führt, daß zu viel gegesssen wird. Dies bewirkt eine Verschiebung der inhibitorischen Aktivität auf die Erhöhung des Blut- Glucosespiegels und der inhibitorischen Aktivität auf die Insulinsekretion, was die wirksame Behandlung oder Prävention der Krankheiten, wie Diabetes, erschwert.
Wir haben festgestellt, daß ein neuer hochwirksamer Amylase-Inhibitor durch Behandeln einer Amylase-Inhibitorhaltigen Lösung, die aus Weizen-Ausgangsmaterial mit Wasser oder dergleichen unter Anwendung eines speziellen, sich von den Stand-der-Technik-Verfahren unterscheidenden Verfahrens extrahiert wird, erzeugt werden kann. Insbesondere umfaßt das spezielle Verfahren das Behandeln eines Extrakts, der den Amylase-Inhibitor enthält, mit einem Kationenaustauscher unter Adsorption des Amylase-Inhibitors daran und das anschließende Behandeln des Kationenaustauschers mit einer alkalischen Lösung von speziellem pH-Wert unter Elution des Amylase-Inhibitors und das sofortige Ansäuern oder Neutralisieren des Amylase-Inhibitor-haltigen Eluats mit einer Säure. Dieses Verfahren liefert das Eluat, das ein Material mit höherer Amylase-inhibitorische Aktivität als diejenige bekannter Amylase-Inhibitoren aus Weizen enthält, insbesondere ein Material, das zu einer starken Hemmung der Aktivität menschlicher Pankreas-α-Amylase in der Lage ist. Unse re weitere Studie des aus dem Eluat gewonnenen Materials mit hoher Amylase-inhibitorischer Aktivität im Hinblick auf Molekulargewicht und Primär Struktur ergaben, daß es ein neues Protein mit einer spezifischen Aminosäuresequenz ist.
Somit betrifft die Erfindung einen neuen Amylase-Inhibitor, bestehend im wesentlichen aus einem Protein, das aus zwei Untereinheiten mit jeweils der folgenden Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist:
Diese Sequenz wird in der Sequenzliste als SEQ ID Nr. 1 bezeichnet.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors, der überwiegend ein Protein enthält, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, umfassend die Schritte:
Extrahieren eines Weizen-Ausgangsmaterials mit einer Extraktionslösung unter Herstellung einer Lösung, die den Amylase-Inhibitor enthält;
b) gegebenenfalls Unterwerfen der Lösung gegenüber einer Reinigungsbehandlung unter Entfernung von Verunreinigungen, Behandeln der Lösung mit einem Kationenaustauscher unter Adsorption des Amylase-Inhibitors daran;
c) Behandeln des Kationenaustauschers mit einer alkalischen Lösung bei pH 9-13 unter Elution des Amylase- Inhibitors von dem Kationenaustauscher;
d) sofortiges Einstellen des pH-Werts des Eluats, das den Amylase-Inhibitor enthält, im neutralen oder sauren Bereich; und
e) Gewinnen eines gewünschten Amylase-Inhibitors, wie vorstehend definiert, aus der pH-eingestellten Lösung.
Der neue erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor besitzt ein Molekulargewicht von etwa 25000, gemäß Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-75, die später beschrieben wird. Außerdem wurde bei der Durchführung einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach dem Verrah ren von Davis, das in "Annals New York Academy of Sciences", 121, S. 404-427 (1964) beschrieben ist, mit dem neuen erfindungsgemäßen Amylase-Inhibitor eine einzige Bande mit einer Mobilität von 0,26 beobachtet. Durch SDS- Polyacrylamid-Elektrophorese nach dem Verfahren von Orth et al., das in "Cereal Chem.", Bd. 50, S. 190-197 (1973) beschrieben ist, wurde an der Position, entsprechend einem Molekulargewicht von 12500, eine einzige Bande beobachtet. Diese Daten zeigen, daß der neue erfindungsgemäße Amylase- Inhibitor ein Protein ist, das aus zwei Untereinheiten mit jeweils einem Molekulargewicht von 12500 zusammengesetzt ist.
Die Aminosäuresequenz jeder Untereinheit wurde unter Anwendung eines Peptidsequenziergeräts PSQ-1 (hergestellt von der Firma Shimazo Co., Ltd.) bestimmt, wobei festgestellt wurde, daß die Untereinheit eine Struktur mit 124 Aminosäureresten aufweist, die als SEQ ID Nr. 1 bezeichnet wird. Demnach ist der erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor ein Protein, das aus 248 Aminosäureresten mit zwei Untereinheiten aufgebaut ist, die jeweils als SEQ ID Nr. 1 bezeichnet werden. Das erfindungsgemäße Protein weist S-S-Bindungen auf.
Der neue erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor wird aus Gründen der Zweckmäßigkeit, im Folgenden "0,26 AI" genannt, der gegenüber einer Amylase, insbesondere einer menschlichen Pankreas-α-Amylase, eine sehr hohe inhibitorische Aktivität aufweist. Die inhibitorische Aktivität von 0,26 AI ist etwa 5 bis 30 Mal höher als diejenige von anderen Amylase- Inhibitoren aus Weizen, wie 0,53 AI, der aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist, die in der Sequenzliste jeweils als SEQ ID Mr. 3 bezeichnet werden (Biochem. Biophys. Acta. 743, 52-57 (1983)), und 0,28 AI, der in der Sequenzliste als SEQ ID Nr. 4 bezeichnet wird [Phytochemistry, Bd. 20, Nr. 8, S. 1781-1784 (1981)].
Der erfindungsgemäße 0,26 AI enthält ein Protein mit Amylase-inhibitorische Aktivität, das aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist, die ohne Rücksicht auf das Herstellungsverfahren, einschließlich derjenigen durch chemische Synthese, jeweils als SEQ ID Nr. 1 bezeichnet werden. Allerdings kann der erfindungsgemäße 0,26 AI mit Sicherheit durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden, das das Extrahieren eines Weizen-Ausgangsmaterials mit Wasser etc. und das Durchführen einer Kationenaustauscher- Behandlung mit dem Extrakt umfaßt, wobei das Verfahren nachstehend ausführlich beschrieben wird.

Verfahrensschritt (a)

Ein Weizen-Ausgangsmaterial wird unter Herstellung einer Lösung, die den Amylase-Inhibitor enthält, mit einer Extraktionslösung extrahiert.
Das Weizen-Ausgangsmaterial umfaßt z. B. Weizen, Weizenmehl und Weizengluten, die jeweils unabhängig von Spezies, Herstellungsort, Erntezeitpunkt, Anbaujahr, Größe der Teil chen etc. verwendet werden können. Von ihnen wird aufgrund seines guten Extraktionswirkungsgrades vorzugsweise Weizenmehl (einschließlich Semolina-Weizen) oder Weizengluten eingesetzt. 0,26 AI kann, unter verschiedenen Weizenspezies, in hoher Ausbeute aus Durum-Weizen erhalten werden. Darum ist Durum-Weizen oder daraus hergestelltes Gluten als Weizen-Ausgangsmaterial besonders bevorzugt.
Die in Schritt (a) verwendete Extraktionslösung umfaßt Wasser, eine Säure, ein wäßrige Säurelösung, verdünntes Alkali, einen wäßrigen Alkohol, eine verdünnte Salzlösung, eine Pufferlösung und die Kombination hiervon.
Für die Extraktionslösung ist die wäßrige Säurelosung mit einem pH von 2-5, Wasser oder eine verdünnte wäßrige alkalische Lösung bevorzugt. Ein wäßriger Alkohol kann verwendet werden. Als wäßrige Säurelösung wird vorzugsweise eine wäßrige Lösung eingesetzt, die mit einer anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoff säure oder Phosphorsäure, oder einer organischen Säure, wie Essigsäure, auf pH 2-5 eingestellt ist. Als verdünnte wäßrige alkalische Lösung wird vorzugsweise eine wäßrige, alkalische Losung eingesetzt, die mit Ammoniak, Natriumhydroxid oder dergleichen auf pH 8-10 eingestellt ist. Als wäßriger Alkohol wird vorzugsweise eine wäßrige Lösung eines Alkohols, wie Methanol, Ethanol oder Isopropylalkohol, in einer Alkoholkonzentration von ungefähr 1-50% eingesetzt. Die verdünnte Salzlosung umfaßt z. B. die Lösung eines neutralen Salzes, wie Natriumchlorid und Kaliumchlorid. Als Pufferlosung werden vorzugs weise ein Phosphatpuffer, ein Acetatpuffer und ein Trispuffer, die auf pH 4-8,5 eingestellt sind, eingesetzt. Es ist bevorzugt, daß die Extraktionslösung mit einem Trispuffer oder einem Acetatpuffer bei konstantem pH gehalten wird.
In Schritt (a) kann ein Verfahren eingesetzt werden, wobei dem Weizen-Ausgangsmaterial eine ausreichende Menge der Extraktionslosung (in der Regel etwa eine 3- bis 50-fache Menge) zugesetzt wird, und die Extraktionsbehandlung wird durch Rühren des Gemisches in der Regel bei einer Temperatur von etwa 10-40ºC und anschließende Entfernung der Feststoffe durch ein beliebiges der Mittel, wie zentrifugale Abtrennung, Filtration oder Absetzen, unter Erhalt einer Extraktlosung, die den Amylase-Inhibitor enthält, erreicht. Allerdings ist das Verfahren nicht auf das Obige begrenzt, und als Extraktlosung können gegebenenfalls eine Abfallflüssigkeit oder die bei der Gewinnung von Stärke oder Gluten aus Weizenmehl anfallenden Waschwässer des Teigs oder der Knetmasse verwenden werden. In diesem Fall können die durch die Handhabung getrübten Waschwässer des Teigs oder der Knetmasse wirksam verwendet werden.

Verfahrensschritt (b)

Die in Schritt (a) extrahierte Amylase-Inhibitor-haltige Losung kann mit einem Kationenaustauscher behandelt werden. Vor der obigen Behandlung kann die Lösung gegebenenfalls einer Reinigungsbehandlung unter Entfernung von Verunreinigungen unterzogen werden. In jedem Fall kann der erfin dungsgemäße 0,26 AI hergestellt werden, zur Herstellung des 0,26 AI in höherer Reinheit mit besserer Effizienz ist allerdings vorzugsweise die Reinigung wirksam.
Die Reinigung vor der Behandlung mit einem Kationenaustauscher, falls angewandt, kann durch ein beliebiges, bei der Produktion von Amylase-Inhibitoren aus Weizen angewandtes Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Beispiele für die Reinigungsverfahren umfassen:
Verfahren (1), das das Zugeben zu der in Schritt (a) erhaltenen Amylase-Inhibitor-haltigen Extraktlösung eines Mittels, wie Ammoniumsulfat oder Ethanol, unter Bildung von Niederschlägen, die den Amylase-Inhibitor enthalten, das Sammeln der Niederschläge und ihr Suspendieren in einer kleinen Wassermenge, die Durchführung einer Entsalzungsbehandlung mit der Suspension unter Verwendung einer Dialysemembran, die Zugabe eines Phosphatpuffers zu einer entsalzten Lösung unter Entfernung des Niederschlags, die Behandlung des resultierenden Überstands mit einem Anionenaustauscher, wie DEAE-Cellulose, unter Verwendung einer auf den Austauscher aufgegebenen Lösung als Amylase-Inhibitorhaltige Lösung entweder direkt ohne weitere Behandlung oder nach dem Trocknen zu Pulvern und Auflösen der Pulver in einem Puffer, oder weiterhin hydrophobe Chromatographie unter Sammeln einer Fraktion mit Amylase-inhibitorischer Aktivität umfaßt;
Verfahren (2), das das Erhitzen der in Schritt (a) erhaltenen Amylase-Inhibitor-haltigen Extraktlösung beispielsweise auf 70-90ºC unter Denaturierung von noch in der Lösung verbliebenem Hitze-instabilem Protein, das Abtrennen und Entfernen der denaturierten Produkte unter Verwendung der resultierenden Lösung als Amylaseinhibitor-haltige Lösung umfaßt;
Verfahren (3), das außerdem die Behandlung der durch Verfahren (2) erhaltenen Lösung mittels einer Ultrafiltrationsmembran (es ist bevorzugt, daß sie eine Molekulargewicht-Ausschlußgrenze von 20000 aufweist) oder Gelfiltrationschromatographie unter Entfernung überschüssiger Salze oder anderer niedermolekularer Verunreinigungen, und, falls notwendig, die Durchführung einer Konzentrierung zur Verwendung als Amylase-Inhibitor-haltige Lösung umfaßt; und Verfahren (4), das das Einstellen der in Schritt (a) erhaltenen Amylase-Inhibitor-haltigen Extraktlösung auf den pH- Wert von etwa 3 und das erneute Einstellen des pH-Wertes auf neutral unter Abtrennung und Entfernung der aufgetretenen Niederschläge und das Verwenden der Losung als Amylase- Inhibitor-haltige Lösung umfaßt. Besonders bevorzugt ist das obige Verfahren (1).
Als Kationenaustauscher können Kationenaustauscher, wie polymeres Kationenaustauscherharz, Kieselsäure und Aluminiumsilicat, eingesetzt werden. Insbesondere werden polymere Kationenaustauscherharze, wie CM-Toyopal (Warenname Toso Co., Ltd.) und Diaon HPK-55 (Handelsbezeichnung Mitsubishi Kasei Kogyo), bevorzugt verwendet. Die Behandlung mit dem Kationenaustauscher kann entweder durch ein diskontinuierliches Verfahren, wobei ein Kationenaustauscher einer Amylase-Inhibitor-haltige Losung zugesetzt und das Gemisch zur Bewirkung eines Ionenaustausches gerührt wird, oder durch ein kontinuierliches Verfahren, wobei eine Amylase- Inhibitor-haltige Lösung über mit einem Kationenaustauscher gefüllte Säule gegeben wird, durchgeführt werden. Das kontinuierliche Verfahren ist bevorzugt. Bei dem Verfahren ist die Behandlung der Amylase-Inhibitor-haltigen Lösung, die mit einem Kationenaustauscher auf pH 3-5 eingestellt wurde, der mit einem Puffer bei pH 3-5 äquilibriert wurde, bevorzugt. Der Amylase-Inhibitor in der Lösung wird an den Kationenaustauscher adsorbiert.

Verfahrensschritt (c)

Der Kationenaustauscher wird mit einer alkalischen Lösung bei pH 9-13 oder mit einem alkalischen Puffer bei pH 9-10 unter Elution des an den Kationenaustauscher adsorbierten 0,26 AI behandelt.
Vor der obigen Behandlung kann der Kationenaustauscher gegebenenfalls mit einer neutralen Lösung, die Natriumchlorid oder dergleichen enthält, unter Entfernung der Verunreinigungen von dem Kationenaustauscher durch Elution behandelt werden. Die bei diesem Schritt angewandte alkalische Lösung kann eine wäßrige Lösung beliebiger alkalischer Verbindungen, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Ammoniumhydroxid, ohne bestimmte Einschränkung hinsichtlich der Spezies der Alkaliverbindung umfassen, mit der Maßgabe, daß der pH-Wert 9-13 beträgt. Eine wäßrige Natriumhydroxid- Lösung ist bevorzugt. Bei Verwendung einer wäßrigen Natri umhydroxid-Lösung beträgt die Konzentration vorzugsweise 0,05-1,0 N. Mit einem alkalischen Puffer beträgt die Konzentration vorzugsweise 20 mM - 1 M. Liegt der pH-Wert der alkalischen Lösung unter 9, kann keine glatte Elution des Amylase-Inhibitors 0,26 AI von dem Kationenaustauscher erreicht werden. Liegt der pH-Wert der alkalischen Lösung über 13, wird der 0,26 AI während der Elution denaturiert, so daß kein gewünschter Amylase-Inhibitor erhalten werden kann.

Verfahrensschritt (d)

Der in Schritt (c) erhaltenen 0,26 AI-haltigen Lösung wird sofort eine Säure zugesetzt, wodurch der pH-Wert der Lösung auf 2-5 eingestellt wird, um eine Veränderung des in dem alkalischen Eluat enthaltenen Amylase-Inhibitors zu verhindern. Die pH-Einstellung des alkalischen Eluats mit einer Säure kann durch Zugabe einer Säure zu dem alkalischen Eluat, das zuvor in einem Behälter, wie einem Gefäß, bereitgestellt worden ist,
oder durch kontinuierliche Zugabe einer Säure zu einem Gefäß, während das alkalische Eluat in das Gefäß eingeleitet wird, oder durch Einbringen der alkalischen Lösung in ein Gefäß, das eine Säure-Lösung enthält, durchgeführt werden. Es ist in jedem Fall erforderlich, daß der pH-Wert der 0,26 AI-haltigen alkalischen Losung möglichst bald mit einer Säure auf 2-5 eingestellt werden sollte. Die zur pH- Einstellung verwendete Säure umfaßt eine anorganische Säure, wie Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure oder Phosphor säure, und eine organische Säure, wie Essigsäure. Chlorwasserstoffsäure ist bevorzugt.

Verfahrensschritt (e)

Die in Schritt (d) erhaltene 0/26 AI-haltige pH-eingestellte Lösung wird durch ein Mittel, wie Lyophilisation, Trocknung unter vermindertem Druck, Sprühtrocknung und Kugeltrocknung, unter Erhalt des gewünschten 0,26 AI getrocknet. Vor der obigen Behandlung kann mit der pHeingestellten Lösung gegebenenfalls eine Dialyse oder eine andere Reinigungsbehandlung durchgeführt werden. Der 0,26 AI besitzt eine sehr hohe inhibitorische Aktivität gegenüber menschlicher Pankreas-α-Amylase und kann den Verdau von erhitzter oder gekochter Stärke, wie gekochtem Reis, d. h. die Hydrolyse von erhitzter oder gekochter Stärke, auch bei Verwendung in kleiner Menge, wirksam hemmen.
In der Regel sind physiologisch funktionelle Proteine unter stark alkalischen Bedingungen bei einem pH-Wert über 9 für eine Denaturierung anfällig. Darum wurde in der bisherigen Technik keine alkalische Losung mit einem pH-Wert von 9 oder höher zur Herstellung der Amylase-Inhibitoren aus Weizen-Ausgangsmaterial eingesetzt. Erfindungsgemäß läßt sich im Gegensatz dazu die bisher in der Technik noch nicht eingesetzte alkalische Lösung bei pH 9-13 bei der Behandlung des Kationenaustauschers verwenden, wodurch der neue, erfindungsgemäße 0,26 AI mit viel höherer Amylaseinhibitorischer Aktivität als die bisherigen Amylase- Inhibitoren aus Weizen erzeugt werden kann. Recht unerwartet kann ein solcher erfindungsgemäßer Behandlungsvorgang den neuen 0,26 AI mit überragenden Eigenschaften erzeugen.
Ferner umfaßt die Erfindung einen Amylase-Inhibitor, der im wesentlichen aus einem Material besteht, das ein Protein, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 1 (0,26 AI) bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 2 (0,19 AI) bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält, wobei der Gesamtgehalt beider Proteine in dem Material nicht kleiner ist als 20 Gew.-%.
Wenn der Gesamtgehalt des 0,26 AI und des 0,19 AI in dem Material kleiner ist als 20%, stellt der Amylase-Inhibitor auch bei Verabreichung in hoher Konzentration eine schwächere Amylase-inhibitorische Aktivität bereit, was zu einer verminderten Aktivität auf die Hemmung einer Erhöhung des Blut-Glucosespiegels und auf die Kontrolle der Insulinsekretion führt und somit eine wirksame Verwendung als Appetitzügler unmöglich macht.
Für den Gesamtgehalt an 0,26 AI und 0,19 AI in dem Material besteht keine Obergrenze. Ein höherer Gehalt beider Proteine in dem Material stellt eine höhere Amylaseinhibitorische Aktivität und eine höhere Aktivität auf die Hemmung der Erhöhung des Blut-Glucosespiegels, der Kontrolle der Insulinsekretion und auf die Appetitzügelung bereit. Die Obergrenze für den Gesamtgehalt von 0,26 AI und 0,19 AI in dem Material beträgt hinsichtlich Produktivität und Wirtschaftlichkeit vorzugsweise allerdings etwa 80 Gew.-%.
Das erfindungsgemäß verwendete Material kann zusätzlich zu 0,26 AI und 0,19 AI weniger als 80 Gew.-% Proteine aus Weizen, Peptide und weitere Materialien (z. B. Stärke, Ballaststoffe, Vitamine, Mineralien etc.) enthalten. In der Regel ist es bevorzugt, daß das Material, das 0,26 AI und 0,19 AI enthält, nicht weniger als 70 Gew.-% des Gesamtgewichts der erfindungsgemäß verwendeten Weizenproteinen ausmacht.
0,19 AI, der in Kombination mit dem erfindungsgemäßen 0,26 AI verwendet wird, ist bekannt und im Handel erhältlich. 0,19 AI kann durch jedes Verfahren, beispielsweise das in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 567 088 A2 offenbarte Verfahren, hergestellt werden.
Der neue erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor (0,26 AI) und das Weizenprotein, das 0,26 AI und 0,19 AI enthält, können allein oder in Kombination mit herkömmlichen Träger- oder Hilfsstoffen zur pharmazeutischen Herstellung in Form eines flüssigen oder festen Präparats, wie Granalien und Tabletten, als Mittel zur Hemmung eines erhöhten Blut- Glucosespiegels oder als Mittel zur Kontrolle der Insulinsekretion und/oder als Mittel zur Appetitzügelung verwendet werden. Zusätzlich können sie als Nahrungsergänzungsmittel, insbesondere für Kohlehydrat-Nahrungsmittel, die reich an Stärke sind, wie Brot und Kekse, oder als Zusatz zu Tee, Suppen, gewürzten Fischmahlzeiten und Brotaufstrichen, wie Butter und Marmelade, verwendet werden.
Somit betrifft die Erfindung ein Mittel zur Hemmung der Erhöhung des Blut-Glucosespiegels oder zur Kontrolle der Insulinsekretion oder zur Appetit Zügelung, das als Wirkstoff einen Amylase-Inhibitor, der im wesentlichen aus einem Protein besteht, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, oder ein Material, das ein Protein enthält, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, wobei der Gesamtgehalt beider Proteine in dem Material nicht geringer ist als 20 Gew.-%, enthält.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Nahrungsergänzungsmittel, das ein Protein, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, oder ein Material, das ein Protein enthält, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ ID Nr. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält.
Die an Menschen verabreichte und Lebensmitteln zugesetzte Menge an 0,26 AI oder des Materials, das den 0,26 AI und den 0,19 AI enthält, kann in Abhängigkeit von den Zuständen und Symptomen der Testperson, an die verabreicht werden soll, oder in Abhängigkeit von der Natur und Menge der aufzunehmenden Lebensmittel entsprechend gesteuert werden. Mit den erfindungsgemäßen Mitteln kann eine Verabreichung in geringer Konzentration eine hohe Amylase-inhibitorische Aktivität, eine hohe Aktivität auf die Hemmung einer Erhöhung des Blut-Glucosespiegels und eine hohe Aktivität auf die Kontrolle einer Insulinsekretion sowie auf die Dauer des Sättigungsgefühls erzielen.
Das Mittel zur Hemmung einer Erhöhung des Blut-Glucosespiegels, beispielsweise mit einem Gehalt von 0,26 AI oder einem Gesamtgehalt von 0,26 AI und 0,19 AI von 30 Gew.-%, zeigt auch bei Verabreichung an eine gesunde Person in einer Dosis von 100 mg einmal täglich eine Aktivität auf die Hemmung der Erhöhung des Blut-Glucosespiegels. Die Verabreichung in einer Dosierungseinheit von 500 bis 2500 mg dreimal täglich kann eine Erhöhung des Blut-Glucosespiegels sehr gut hemmen. Bei Diabetikern kann die Verabreichung in einer kleinen Dosis (in der Regel etwa 300 bis 1500 mg/Tag) eine Erhöhung des Blut-Glucosespiegels wirksam hemmen.
Beispielsweise zeigt der erfindungsgemäße Appetitzügler, wobei der Gehalt an 0,26 AI oder der Gesamtgehalt an 0,26 AI und 0,19 AI 30 Gew.-% beträgt, eine Aktivität auf die Hemmung der Erhöhung des Blut-Glucosespiegels auch bei Verabreichung an eine gesunde Person in einer Dosis von 100 mg einmal täglich. Die Verabreichung in einer Dosierungseinheit von 500 bis 2500 mg dreimal täglich kann einen erhöhten Blut-Glucosespiegel sehr gut hemmen. Bei Diabetikern kann die Verabreichung in einer kleinen Dosis (in der Regel etwa 300 bis 1500 mg/Tag) einen erhöhten Blut- Glucosespiegel wirksam hemmen.
Beispielsweise kann der erfindungsgemäße Appetitzügler, wobei der Gehalt an 0,26 AI oder der Gesamtgehalt an 0,26 AI und 0,19 AI 30 Gew.-% beträgt, den Appetit durch Unterdrückung des Hungergefühls ohne Zunahme im Gehalt an freier Fettsäure im Blut bei Verabreichung mit einer Mahlzeit in einer Dosis von einmal 1000 bis 5000 mg hemmen.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Mittel zu Präparaten (z. B. Kapsel, Tabletten, Granalien, Pulver, Lösungen etc.) formuliert, so daß in den Mitteln bei einmaliger Verabreichung 100 bis 5000 mg, vorzugsweise 500 bis 2500 mg des Wirkstoffs enthalten sind. Beispielsweise kann mit einer Dosierungseinheit von 100 bis 5000 mg eine ausreichende und sichere Aufnahme erreicht werden.
Die Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden Beispiele erläutert, wobei die Amylase-Inhibitoren durch das folgende Verfahren bestimmt wurden.

Bestimmung des Molekulargewichts durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-75

Eine Probelösung wurde durch Zugabe von 4 ml eines Puffers (20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) zu dem Amylase- Inhibitor hergestellt. Mit der Losung wurde zur Bestimmung des Molekulargewichts eine Gelfiltrationschromatographie bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/h auf einer mit dem gleichen Puffer äquilibrierten Sephadex G-75- Gelfiltrationssäule (1,6 cm · 90 cm) durchgeführt.

Bestimmung der Aminosäuresequenz

Der Amylase-Inhibitor wurde pyridylethyliert und anschließend mit V8-Protease und Lysylendopeptidase (hergestellt von der Firma Wako Jun-yaku) hydrolysiert. Mit der hydrolysierten Probe wurde zur Abtrennung eines hydrolysierten Peptidfragments eine HPLC durchgeführt. Die abgetrennten Peptidfragmente wurden unter Verwendung eines Peptidsequenziergeräts PSQ-1 (hergestellt von Shimazu), ausgehend von dem Peptid-N-Terminus unter Bestimmung der gesamten Primärstruktur strukturell analysiert. Der C-Terminus wurde durch Analyse der durch Hydrolyse mit Carboxypeptidase freigesetzten Aminosäure bestimmt.

Bestimmung der inhibitorischen Aktivität gegenüber menschlicher Pankreas-α-Amylase

Eine wäßrige Probelösung und menschliche Pankreas-α- Amylase wurden zu 20 mM Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonat)-Puffer (pH 6,9), der 50. mM NaCl, 5 mM CaCl&sub2; und 0,02% Eiweiß-Albumin enthielt, zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 37ºC 30 min stehen gelassen und anschließend mit 0,5 ml einer 1,5%igen löslichen Stärkelösung bei pH 6,9 vermischt.
Die resultierende Losung wurde unter Halten bei 37ºC 10 min reagieren gelassen, und anschließend wurden 2,5 ml einer Reaktionsstopperlösung (0,08 M HCl und 0,4 M Essigsäure) zugesetzt. Zu 0,2 ml des Reaktionsgemisches wurden 2,5 ml einer Jodlösung (0,05% KI und 0,005% Jod) zugesetzt, und das Gemisch wurde auf die Extinktion bei 660 nm gemessen. Die Amylase wurde in einer Menge verwendet, die zur Verminderung des Absorptionsvermögens um 80% ausreichte, wenn keine Probelösung enthalten war, und die Menge des Amylase-Inhibitors, die zur Hemmung der Amylase-Aktivität um 50% ausreichte, wurde als 1 Amylase-inhibitorischen Einheit (U) herangezogen.

Bestimmung des Protein-Gesamtgehalts

Dieser wurde durch das Kjeldahl-Verfahren unter Verwendung eines KJELTEC AUTO 1030-Analysegeräts (hergestellt von Tecator, Schweden) bestimmt. Es wurde ein Stickstoff-Protein- Umwandlungsfaktor von 5,70 eingesetzt.

Bestimmung des 0,26 AI- oder des 0,19 AI-Gehalts

Eine Testprobe wurde in einer wäßrigen 0,1%igen Trifluoressigsäure-Lösung gelöst, und mit der Lösung wurde unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zur Bestimmung der Peakfläche für 0,26 AI oder 0,19 AI in dem Chromatogramm durchgeführt. Mit einer authentischen Probe von 0,26 AI oder 0,19 AI (100% Reinheit) wurde separat unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend zur Messung der Peakfläche für 0,26 AI oder 0,19 AI in dem Chromatogramm eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt. Der 0,19 AI- oder 0,26 AI-Gehalt in derselben wurde nach der folgenden Gleichung berechnet:
0,26 AI- oder 0,19 AI-Gehalt in der Testprobe (%) = (Sa/St) · 100, wobei
Sa = Peakfläche für 0,26 AI oder 0,19 AI in der Testprobe
St = Peakfläche für 0,26 AI oder 0,19 AI in der authentischen Probe.

Säule

Packmaterial: CAPCELL PAK C18 SG120A (Teilchengröße 5 um) (hergestellt von Shiseido)
Große: 4,6 mm 0 · 250 mm
Temperatur: 50ºC
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: Extinktion bei 280 nm
mobile Phase:
lineare Hochdruckgradientenelution mit einem nachstehend gezeigten Zeit/Konzentrationsgradienten, bestehend aus
Lösung A: wäßrige 0,1%ige Trifluoressigsäure-Lösung; und
Lösung B: wäßrige Lösung von 80% Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure

Bestimmung der Zunahme im Blut-Glucosespiegel

Der Blut-Glucosespiegel wurde unmittelbar nach der Blutentnahme aus der Unterarmvene eines Testsubjektes durch das Glucoseoxidaseverfahren bestimmt. Die Zunahme im Blut- Glucosespiegel wurde durch Subtraktion des Nüchtern-Werts vom gefundenen Wert bestimmt. Bei der Messung durch das Glucoseoxidaseverfahren wurde der Wako-Glucose-B-Test (hergestellt von der Firma Wako Jun-yaku Kogyo) angewandt.

Bestimmung des Insulinspiegels

Aus der Unterarmvene einer Testperson wurde Blut entnommen und zur Herstellung von Serum sofort zentrifugiert. Der Insulinspiegel im Serum wurde durch einen Enzymimmuntest gemessen. Für den Enzymimmuntest wurde der Glazyme-Insulin- EIA-Test (hergestellt von der Firma Wako Jun-yaku Kogyo) angewandt.

Bewertung der Dauer des Sättigungsgefühls

Man ließ die Testpersonen eines der sieben Gefühle, die in den Bewertungen nachstehend gezeigt sind, auswählen:
1. hungrig und angespannt
2. hungrig
3. etwas hungrig
4. weder Hunger- noch Sättigungsgefühl
5. angenehmes Sättigungsgefühl
6. leichtes Völlegefühl im Magen
7. Völlegefühl und Anspannung im Magen

BEISPIEL 1

500 g Durum-Weizenmehl wurden in 2 l Wasser gegeben, und das Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die Niederschläge durch Zentrifugation entfernt, und zur Einstellung auf pH 3 wurde dem Überstand Chlorwasserstoff säure zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 h stehen gelassen. Zur Einstellung des pH-Werts auf 6 wurde dem Überstand eine wäßrige Natriumhydroxidlösung zugesetzt. Nach dem Stehenlassen für 1 h wurden die Niederschläge durch Zentrifugation entfernt. Dem Überstand wurde unter Rühren Ammoniumsulfat bis zum Erreichen einer Sättigung von 45% zugesetzt. Nach dem Stehenlassen für 2 h wurde die Lösung zur Gewinnung der Niederschläge zentrifugiert.
Zu den Niederschlägen wurden zur Herstellung einer Suspension 50 ml Wasser gegeben, und mit der Suspension wurde über Nacht eine Entsalzung unter Verwendung einer Dialysemembran (hergestellt von der Firma Visking Co., Ltd.) durchgeführt. Der entsalzten Lösung wurde ein Phosphatpuffer (pH 7,6) zugesetzt, so daß sich eine Konzentration von 20 mM ergab. Das Gemisch wurde sorgfältig gerührt und anschließend unter Entfernung der Niederschläge zentrifugiert. Der Überstand wurde über eine mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung äquilibrierten Anionenaustauscherharzsäule ("DEAE-Toyopal-Säule", hergestellt von Toso Co., Ltd.) ge geben. Die Säule wurde sorgfältig mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, und die Fraktionen, die die Säule passiert hatten/wurden gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden gegen Wasser und anschließend gegen eine 20 mM Trispufferlösung, die 200 mM NaCl enthielt, dialysiert. Nach Abschluß der Dialyse wurde die resultierende Lösung unter Verwendung eines Miniaturmoduls (hergestellt von Asahi Kasei) auf 4 ml konzentriert. Zum Sammeln der Fraktionen mit Amylase-inhibitorischer Aktivität wurde das Konzentrat mit einer mit der gleichen Pufferlösung äquilibrierten Gelfiltrationssäule ("Sephacryl S-200", hergestellt von Pharmacia) behandelt. Die gesammelten Fraktionen wurden gegen Wasser dialysiert, und Acetatpuffer (pH 4,0) wurde in einer Konzentration von 20 mM zugesetzt. Das Gemisch wurde mit einer mit dem gleichen Acetatpuffer äquilibrierten Kationenaustauscherharzsäule ("CM-Toyopal-Säule", hergestellt von Toso) behandelt.
Zur Elution von Verunreinigungen wurde die Acetatpufferlösung, die 100 mM NaCl enthielt, sodann über eine Kationenaustauscherharzsäule gegeben. Zur Elution des 0,26 AI von der Säule wurde anschließend eine wäßrige 0,1 N Natriumhydroxidlösung über die Säule gegeben. Zur Einstellung des pH-Wertes auf 3,0 wurde dem Eluat sofort Chlorwasserstoff säure zugesetzt. Die Lösung wurde gegen Wasser dialysiert und unter Erhalt von 60 mg eines weißen Produkts lyophilisiert.
Das Molekulargewicht des vorstehend erhaltenen Produkts wurde unter Verwendung von Sephadex G-75 durch Gelfiltrationschromatographie gemessen. Es wurde als ungefähr 25000 festgestellt. Bei Durchführung einer SDS-Polyacrylamid- Elektrophorese, die vorstehend erwähnt worden ist, ergab das Produkt eine einzige Bande an einer Position, entsprechend einem Molekulargewicht von 12500. Demnach wurde festgestellt, daß das obige Produkt aus zwei Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 12500 aufgebaut war. Die Aminosäuresequenz jeder Untereinheit wurde durch das oben erwähnte Verfahren bestimmt, um nachzuweisen, daß sie eine Struktur von 124 Aminosäureresten aufwies, die mit der Sequenz Nr. 1 bezeichnet wurde.
Der Protein-Gesamtgehalt und der 0,26 AI-Gehalt in dem Produkt wurden durch das Verfahren, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Er wurde als 95 bzw. 91% festgestellt. Zusätzlich zu dem 0,26 AI-Protein enthielt das Produkt 4% Proteinverunreinigung und 5% Feuchtigkeit. Mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt wurde durch das Verfahren, wie vorstehend beschrieben, die menschliche Pankreas-α- Amylase-inhibitorische Aktivität bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 nachstehend gezeigt.

REFERENZBEISPIEL 1

Dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt, bei dem die menschliche Pankreas-α-Amylase-inhibitorische Aktivität bestimmt worden ist, wurde zur Herstellung eines Proteins, das 15% 0,26 AI enthielt. Gluten zugesetzt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 nachstehend gezeigt.

REFERENZBEISPIEL 2

Zu 800 kg Weizenmehl wurden 410 l Wasser gegeben, und das Gemisch wurde unter Bildung eines Teigs verknetet. Der Teig wurde zur Gewinnung von 410 kg Gluten und 505 kg Weizenstärke mit 7600 l Wasser gewaschen. In diesem Stadium wurden 6200 l an Abfallflüssigkeit erzeugt. Der pH-Wert der Abfallflüssigkeit (wäßriger Extrakt) wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf 3 eingestellt und nach Stehenlassen für 30 min mit Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt, wodurch die unlöslichen Substanzen ausgefällt wurden. Die Niederschläge wurden unter Gewinnung von 5200 l Überstand (I) entfernt.
Dem Überstand (I) wurde Natriumalginat zugesetzt, so daß sich eine Konzentration von 300 ppm ergab. Das Gemisch wurde auf pH 4,2 eingestellt und 30 min gerührt, wodurch wasserunlösliche Substanzen gebildet wurden. Sie wurden mittels einer De Laval-Zentrifuge gewonnen. Die gewonnene Masse wurde in der 10-fachen Menge Wasser dispergiert. Die Dispersion wurde mit 4,7 kg Calciumchlorid vermischt, sorgfältig gerührt, mit Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und 1 h stehen gelassen. Die festen Substanzen wurden mittels einer De Laval-Zentrifuge unter Gewinnung von 600 l Überstands abgetrennt.
Der vorstehend gewonnene Überstand wurde mit Chlorwasserstoff säure neutralisiert, und die neutralisierte Lösung wurde 30 min bei 80ºC erhitzt. Die so gebildeten unlöslichen Substanzen wurden unter Gewinnung eines Überstands mittels einer De Laval-Zentrifuge abgetrennt. Der Überstand wurde zur Entfernung von überschüssigem Calciumsalz mittels einer Ultrafiltrationsmembran [hergestellt von der Fa. Nitto Denko K. K.; NTU-3250CIR (Ausschlußgrenze 20000 Dalton)] unter Erhalt einer Konzentratlösung (II) konzentriert.
140 l der Konzentrat lösung (II) wurden mit Ammoniak auf pH 7,5 eingestellt und über eine Säule (900 mm Länge, 200 mm Innendurchmesser), in die 281 eines Kationenaustauscherharzes (Diaion HPK-55, hergestellt von der Firma Mitsubishi Kasei K. K.) gepackt waren, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 l/min gegeben. Die nicht daran absorbierten und von dem Kationenaustauscherharz eluierten Fraktionen wurden gesammelt. Die eluierten Fraktionen wurden zur Beseitigung von Mikroben über ein Keramikfilter filtriert und anschließend unter Erhalt von 1400 g eines Trockenpulverprodukts lyophilisiert.
In dem Trockenpulverprodukt wurden, der Protein-Gesamtgehalt und der 0,19 AI-Gehalt bestimmt. Festgestellt wurden 84% bzw. 21%. Die menschliche Pankreas-α-Amylaseinhibitorische Aktivität ist in Tabelle 1 nachstehend gezeigt.

REFERENZBEISPIEL 3

Die in Referenzbeispiel 2 erhaltene Konzentratlösung (II) wurde zu einem Pulver getrocknet. Der Protein-Gesamtgehalt und der 0,19 AI-Gehalt in dem Pulver wurde gemessen. Es wurden 60 bzw. 15% festgestellt. Die menschliche Pankreas- α-Amylase-inhibitorische Aktivität ist in Tabelle 1 nachstehend gezeigt.

VERGLEICHSBEISPIELE 1 & 2

Zum Vergleich wurde die menschliche α-Amylase-inhibitorische Aktivität in bekannten Amylase-Inhibitoren, 0,53 AI, dargestellt durch die Sequenz Nr. 3, und 0,28 AI, dargestellt durch die Sequenz Nr. 4, gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 nachstehend gezeigt. Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt, daß der erfindungsgemäße 0,26 AI im Vergleich zu den bekannten Amylase-Inhibitoren 0,53 AI und 0,28 AI eine sehr hohe α-Amylase-inhibitorische Aktivität aufweist.

BEISPIEL 2

Zwei nicht diabetischen gesunden Männern und einer Frau wurden jeweils 250 g gekochter Reis und 200 ml zuckerfreier Tee verabreicht. In 30-minütigen Intervallen nach der Mahlzeit wurde Blut entnommen, und durch das oben erwähnte Verfahren unter Verwendung eines Kit ("Glucose-B-Test Wako", hergestellt von Wako Jun-yaku) wurde eine Zunahme im Blut- Glucosespiegel gemessen. Eine Woche später wurde der Test mit den gleichen Personen auf die gleiche Weise wie vorstehend durchgeführt, mit der Ausnahme, daß der gekochte Reis 350 mg des erfindungsgemäßen 0,26 AI enthielt. Die Ergebnisse sind in Tabelle. 2 gezeigt. Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt, daß der erfindungsgemäße 0,26 AI bei der Hemmung des Verdaus von erhitzter oder gekochter Stärke genauso wirksam ist und die Hydrolyse der Stärke durch Hemmung der menschlichen Pankreas-α-Amylase und somit die Erhöhung des Blut-Glucosespiegels hemmt.

BEISPIEL 3

Das in Beispiel 1 erhaltene weiße Produkt wurde durch ein herkömmliches Mittel zur Herstellung eines gereinigten 0,26 AI gereinigt. Das in Referenzbeispiel 2 erhaltene Trockenpulver-Produkt wurde unter Herstellung eines gereinigten 0,19 AI-Amylase-Inhibitors durch ein herkömmliches Mittel gereinigt. Der Protein-Gesamtgehalt (A), der Gehalt des A- mylase-Inhibitors im Protein (B) und die Amylaseinhibitorische Aktivität (C) des gereinigten Produkts wurden mit folgendem Ergebnis bestimmt.
Zur Bewertung der Amylase-inhibitorische Aktivität des Gemisches wurden die gereinigten 0,26 AI und 0,19 AI in dem in Tabelle 3 angegebenen Verhältnis vermischt. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 nachstehend gezeigt. Tabelle 3

BEISPIEL 4

Zwei nicht diabetischen gesunden Männern und einer Frau wurden nach 10-stündigem Fasten jeweils 300 g gekochter Reis und 200 ml zuckerfreier Tee verabreicht. In 30- minütigen Intervallen nach der Mahlzeit wurde zur Bestimmung des Blut-Glucosespiegels und des Insulinspiegels und zur Bewertung der Dauer des Sättigungsgefühls Blut entnommen. Der Test wurde für jede Person insgesamt fünf Mal in einem einwöchigen Intervall durchgeführt, wobei der Testperson zuckerfreier Tee verabreicht wurde, der jeweils 350 mg des Produkts von Beispiel 1 im ersten Durchgang, des Produkts von Referenzbeispiel 1 im zweiten Durchgang und des Produkts von Beispiel 2 (20/20-Gemisch von 0,26 AI/0,19 AI) im dritten Durchgang und des Produkts von Referenzbeispiel 3 im vierten Durchgang enthielt.
Im fünften Durchgang erhielt die Testperson den gekochten Reis und den zuckerfreien Tee ohne das Produkt (Kontrolle). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 nachstehend gezeigt. Tabelle 4
Tabelle 4 zeigt, daß der erfindungsgemäße Amylase- Inhibitor, der in den Beispielen 1 und 2 erhalten wurde und mindestens 20% entweder 0,26 AI oder 0,19 AI enthielt, zur Hemmung der Erhöhung des Blut-Glucosespiegels und zur Hemmung der Insulinsekretion wirksam ist und ein dauerhaftes Sättigungsgefühl bewirken kann.

BEISPIEL 5

Zu 6,2 t einer Abfallflüssigkeit von Waschwässern aus dem bei der Gewinnung von Stärke und Gluten aus Weizenmehl anfallenden Teig wurde zur Einstellung des pH-Werts auf 3,0 Chlorwasserstoff säure gegeben. Das Gemisch wurde 30 min stehen gelassen und unter Ausfällung unlöslicher Substanzen mit Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt. Der Niederschlag wurde unter Gewinnung von 5,2 t eines Überstands entfernt. Dem Überstand wurden 300 ppm Natriumalginat zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Chlorwasserstoff säure auf pH 4,2 eingestellt, 30 min gerührt und zur Gewinnung der Nieder schlage (65 kg) zentrifugiert. Den Niederschlägen wurden 650 l Wasser unter Bildung einer Dispersion zugesetzt, der 4,7 kg Calciumchlorid zugesetzt wurden und die gut gerührt wurde. Das Gemisch wurde mit Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und 1 h stehen gelassen. Die Niederschläge wurden durch Zentrifugation unter Gewinnung von 600 l Überstand entfernt. Dem Überstand wurde Natriumphosphat zugesetzt, so daß sich eine Konzentration von 0,1% ergab, das Gemisch wurde mit Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt und 15 min bei 80ºC wärmebehandelt. Die wärmedenaturierten Niederschläge wurden durch Zentrifugation entfernt, entsalzt und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (hergestellt von Nitto Denko K. K., NTU-3250 CIR, 200 Dalton Ausschlußgrenze) konzentriert und unter Erhalt von 1,4 kg Trockenpulver lyophilisiert.
Das Trockenpulver (500 mg) wurde in einer 20 mM Acetatpufferlösung (pH 4,0), die 5 ml 100 mM NaCl enthielt, gelost. Die unlöslichen Substanzen wurden durch Zentrifugation entfernt. Mit der resultierenden Lösung wurde unter Verwendung von Sephadex G-100 eine Gelfiltrationschromatographie durchgeführt. Der aktive Peak wurde abgetrennt und unter Verwendung eines Dialyseschlauchs über Nacht bei 4ºC gegen 20 mM Acetatpuffer (pH 4,0) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde über mit dem gleichen Puffer äquilibriertes cm- Toyopal unter Adsorption eines Zielmaterials daran gegeben. Über das adsorbierte Material wurde zur Elution der Verunreinigungen 20 mM Acetatpuffer (pH 4,0) gegeben, der 300 mM Natriumchlorid enthielt. Anschließend wurde das Zielmaterial mit einer 0,05 N Natriumhydroxidlösung (pH 12,2) eluiert. Das Eluat wurde sofort mit HCl auf pH 3,0 eingestellt, unter Verwendung eines Dialyseschlauchs sorgfältig entsalzt und unter Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert. In dem resultierenden weißen Pulver wurde der Protein-Gesamtgehalt und der 0,26 AI-Gehalt bestimmt, die als 94% bzw. 88% festgestellt wurden. Die menschliche Pankreasα-Amylase-inhibitorische Aktivität wurde als 22030 U/mg bestimmt.

BEISPIEL 6

Zu 100 g Weizenmehl wurde 1 l 1% NaCl-Lösung gegeben, das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und unter Abtrennung eines Überstands zentrifugiert. Zum Überstand wurde bis zum Erreichen einer 50%igen Sättigung Ammoniumsulfat gegeben. Das Gemisch wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und 1 h stehen gelassen.
Die Abtrennung durch Zentrifugation ergab Niederschläge, denen zu ihrer Dispersion 200 ml destilliertes Wasser zugesetzt wurden. Die Dispersion wurde über Nacht gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Der dialysierten Lösung wurde zur Einstellung des pH-Werts auf 4,0 Chlorwasserstoff säure zugesetzt, und anschließend wurden die verbleibenden Niederschläge durch Zentrifugation entfernt. Zur Adsorption eines Zielmaterials an ein Harz wurde die resultierende Lösung über eine mit einem Acetatpuffer (20 mM, pH 4,0) äquilibrierte CM-Sepharose-Säule gegeben. Das Harz wurde sorgfältig mit dem gleichen Puffer gewaschen, und die Verunreinigungen wurden mit 20 mM Acetatpuffer (pH 4,0), der 400 mM NaCl enthielt, eluiert. Das Zielmaterial wurde mit 0,05 N NaOH (pH 12,2) eluiert, mit HCl auf pH 3,0 eingestellt und sorgfältig gegen 50 mM Acetatpufferlösung (pH 4,0), die 100 mM NaCl enthielt, dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde durch Passieren einer Ultrafiltrationsmembran (M. W. 20000) konzentriert und zur weiteren Reinigung einer Gelfiltrationschromatographie (20 mM Acetatpuffer, pH 4,0, 100 mM Nat riumchlorid) unter Verwendung von Sephadex G-75 unterzogen. Das gereinigte Produkt wurde unter Verwendung eines Dialyseschlauchs sorgfältig gegen deionisiertes Wasser dialysiert und unter Erhalt eines weißen Pulvers lyophilisiert. Von dem resultierenden weißen Pulver wurden der Protein- Gesamtgehalt und der 0,26 AI-Gehalt bestimmt, die als 96 bzw. 93% festgestellt wurden. Die menschliche Pankreas-α- Amylase-inhibitorische Aktivität wurde als 23500 uU/mg bestimmt.

SEQUENZLISTE

(1) INFORMATIONEN ZU SEQ ID Nr. 1

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 124
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID Nr. 2

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 124
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGY: linear
(i i) MOLEKÜLTYP: Protein
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG:

(3) INFORMATIONEN ZU SEQ ID Nr. 3

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 124
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG:

(4) INFORMATIONEN ZU SEQ ID Nr. 4

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 123
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG:

Claims

1. Amylase-Inhibitor, der im wesentlichen aus einem Protein besteht, das aus zwei Untereinheiten mit jeweils der folgenden Aminosäuresequenz zusammengesetzt ist:

2. Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors, der überwiegend ein Protein enthält, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, umfassend die Schritte;

a) Extrahieren eines Weizen-Ausgangsmaterials mit einer Extraktionslösung unter Herstellung einer Lösung, die den Amylase-Inhibitor enthält;

b) gegebenenfalls Unterwerfen der Lösung gegenüber einer Reinigungsbehandlung unter Entfernung von Verunreinigungen, Behandeln der Lösung mit einem Kationenaustauscher unter Adsorption des Amylase-Inhibitors;

c) Behandeln des Kationenaustauschers mit einer alkalischen Lösung bei pH 9-13 unter Elution des Amylase-Inhibitors von dem Kationenaustauscher;

d) sofortiges Einstellen des pH-Werts des Eluats, das den Amylase-Inhibitor enthält, im neutralen oder sauren Bereich; und

e) Gewinnen aus der pH-eingestellten Lösung eines gewünschten Amylase-Inhibitors, wie vorstehend definiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Weizen- Ausgangsmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Weizen, Weizenmehl und Weizengluten.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Extraktionslösung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Wasser, einer Säure, einer wäßrigen Säurelösung, einem verdünnten Alkali, einem wäßrigen Alkohol, einer verdünnten Salzlösung und einer Pufferlösung.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die in Schritt (a) erhaltene Lösung eine wäßrige Flüssigkeit oder Waschwässer der Knetmasse oder des Teigs sind, die bei der Gewinnung der Stärke oder des Gluten aus Weizenmehl anfallen.

6. Amylase-Inhibitor, bestehend im wesentlichen aus einem Material, das ein Protein, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält, wobei der Gesamtgehalt beider Proteine in dem Material nicht weniger als 20 Gew.-% beträgt.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein Material, das ein aus zwei jeweils als SEQ-ID- NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält, wobei der Gesamtgehalt beider Proteine in dem Material nicht weniger als 20 Gew.-% beträgt.

9. Protein, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, zur Anwendung in der Therapie.

10. Material, das ein aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein in Kombination mit einem Protein, das aus jeweils zwei als SEQ-ID-NR. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält, wobei der Gesamtgehalt beider Proteine in dem Material nicht weniger als 20 Gew.-% beträgt, zur Verwendung in der Therapie.

11. Protein nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Hemmung der Zunahme des Blut-Glucosespiegels, zur Verwendung bei der Kontrolle der Insulinsekretion oder zur Verwendung bei der Appetitzügelung.

12. Material nach Anspruch 10 zur Verwendung bei der Hemmung der Erhöhung des Blut-Glucosespiegels, zur Verwendung bei der Kontrolle der Insulinsekretion oder zur Verwendung bei der Appetitzügelung.

13. Verwendung eines Proteins, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Erhöhung des Blut- Glucosespiegels, zur Kontrolle der Insulinsekretion oder zur Appetit Zügelung.

14. Verwendung eines Materials, das ein aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält, wobei der Gesamtgehalt beider Proteine in dem Material nicht weniger als 20 Gew.-% beträgt, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Erhöhung des Blut-Glucosespiegels, zur Kontrolle der Insulinsekretion oder zur Appetit Zügelung.

15. Mittel zur Appetitzügelung, das als Wirkstoff ein aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein enthält.

16. Mittel zur Appetit Zügelung, das als Wirkstoff ein Material, das ein aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält, wobei der Gesamtgehalt beider Proteine in dem Material nicht weniger als 20 Gew.-% beträgt.

17. Nahrungsergänzungsmittel, das ein aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein oder ein Material, das ein aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 1 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetztes Protein enthält, in Kombination mit einem Protein, das aus zwei jeweils als SEQ-ID-NR. 2 bezeichneten Untereinheiten zusammengesetzt ist, enthält.