DE69432073T2

DE69432073T2 - Ein enzym mit pektin methylesteraseaktivität

Info

Publication number: DE69432073T2
Application number: DE69432073T
Authority: DE
Inventors: Stephan Christgau; Lene Venke Kofod; Lene Nonboe Andersen; Sakari Kauppinen; Hans Peter Heldt-Hansen; Gitte Budolfsen; Henrik Dalboege
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-28
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2014-04-29
Also published as: PT696319E; AU6676794A; ES2191030T3; US5707847A; AU679746B2; EP0696319B1; EP0696319A1; DK0696319T3; DE69432073D1; ATE231914T1; WO1994025575A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym mit Pektinmethylesterase-(PME)-Aktivität, ein DNA-Konstrukt, das das Enzym kodiert, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms, eine Enzymzubereitung, die das Enzym enthält, und verschiedene Verwendungen des Enzyms.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pektinpolymere sind wichtige Bestandteile pflanzlicher primärer Zellwände. Sie bestehen hauptsächlich aus Ketten von 1,4-verbundener α-D-Galakturonsäure und deren methylierten sowie acetylierten Derivaten. Die Verwendung von Pektin abbauenden Enzymen ist von Bedeutung in der Lebensmittelindustrie, in erster Linie für die Verarbeitung von Frucht und Gemüse, wie Fruchtsaftproduktion oder Weinherstellung, wobei ihre Fähigkeit genutzt wird, den Abbau des Rückgrats des Pektinpolymers zu katalysieren.
Bekanntlich ist in verschiedenen Mikroorganismen, wie Aspergillus niger, ein Gemisch unterschiedlicher Pektin abbauender Enzyme vorhanden. Von diesen katalysiert die Pektinmethylesterase die Entfernung von Methanol aus Pektin, wobei Pektinsäure (Polygalakturonsäure) gebildet wird. Die Pektatlyase spaltet glykosidische Bindungen in Polygalakturonsäure mittels β-Eliminierung, die Pektinlyase spaltet die glykosidischen Bindungen stark methylierter Pektine mittels β-Eliminierung, und die Polygalakturonase hydrolysiert die glykosidischen Bindungen in der Polygalakturonsäurekette.
Die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz einer Pektinesterase-cDNA-Sequenz aus A. niger ist von Khanh et al. (1990) offenbart. EP 388 593 offenbart die rekombinante Produktion einer Pektinesterase aus A. niger in A. awamori oder A. niger. Khanh et al. (1992) offenbaren die Auswirkung auf die Enzymausbeute bei der Verwendung verschiedener Promotoren bei der Expression einer Pektinmethylesterase aus A. niger in A. niger.
Markovic und Jörnvall (1992) haben Disulfidbrücken in einer Pektinesterase aus Tomate analysiert und schlagen die Anzahl und Lage von Disulfidbrücken in anderen bekannten und entfernt verwandten Pektinesterasen aus A. niger, Erwinia chrysanthemi und Pseudomonas solanacearum vor. Außerdem werden verschiedene Aminosäurereste, die zwischen den verschiedenen Enzymen konserviert sind, identifiziert, und eine mögliche Lage des aktiven Zentrums der Enzyme wird vorgeschlagen.
Van Rijssel et al. (1993) offenbaren einen Proteinkomplex, der aus Clostridium thermosaccharolyticum isoliert wurde, der Pektinmethylesterase-Aktivität aufweist. WO 93/13212 offenbart eine cDNA-Sequenz einer Pektinesterase aus Tomate.
WO 93/09683 offenbart die Verwendung einer gereinigten Pektinesterase aus A. niger bei der Produktion von Saft aus Früchten und Gemüsen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Pektinmethylesterase (PME) als Einzelbestandteil herzustellen.
Dem gemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Enzym, das PME-Aktivität aufweist, das

a) von dem kodierenden Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder einer dazu homologen Sequenz kodiert wird, die ein Enzym kodiert, das PME-Aktivität aufweist, und/oder
b) die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat oder wenigstens zu 80% homolog zu der besagten Sequenz ist.

Bei einer weiteren Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein Enzym, das PME-Aktivität aufweist, das von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die die folgende Teilsequenz umfasst

oder eine dazu homologe Sequenz, die ein Polypeptid mit PME-Aktivität kodiert.
In dem vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck „homolog" eine DNA bezeichnen, die unter bestimmten angegebenen Bedingungen (wie Benetzen in 5xSSC und Prähybridisieren für 1 h bei ~40°C in einer Lösung von 5xSSC, 5xDenhardts Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8 und 50 μg denaturierter, mit Ultraschall behandelter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisieren in der gleichen Lösung, der 50 μCi mit 32-P-dCTP markierte Sonde zugegeben wurde, für 18 h bei ~40°C gefolgt von dreimaligem Waschen in 2xSSC, 0,2% SDS bei 40°C für 30 Minuten) mit der gleichen Sonde hybridisiert wie die DNA, die für das PME-Enzym kodiert. In noch spezifischerer Weise soll der Ausdruck sich auf eine DNA-Sequenz beziehen, die wenigstens zu 80% homolog zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz ist, wie wenigstens zu 85% und vorzugsweise wenigstens zu 90% oder zu 95% homolog zu dieser Sequenz. Der Ausdruck soll Modifikationen der DNA-Sequenz einschließen, wie Nukleotidaustausche, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz der PME führen, sondern die dem Codon-Gebrauch des Wirtsorganismus entsprechen, in den das DNA-Konstrukt eingeführt wird, oder Nukleotidaustausche, die zu einer anderen Aminosäuresequenz führen, und deshalb, möglicherweise, zu einer anderen Proteinstruktur, die zu ei ner PME-Mutante mit unterschiedlichen Eigenschaften gegenüber nativem Enzym führen könnte. Andere Beispiele möglicher Modifikationen sind Insertion eines oder mehrerer Nukleotide in die Sequenz, Addition eines oder mehrerer Nukleotide an einem beliebigen oder beiden Enden der Sequenz, oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide an einem beliebigen oder beiden Enden oder innerhalb der Sequenz.
Der Ausdruck „homolog", wie im Zusammenhang mit einem Polypeptid oder Protein verwendet, soll den Grad der Identität mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz angeben, der mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren bestimmt werden kann. Außerdem wird das homologe Polypeptid vorzugsweise von einem (wie oben definierten) Analog der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz kodiert.
Bei einer weiteren Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Enzym kodiert, das Pektinmethylesterase-Aktivität aufweist, wobei die DNA-Sequenz den kodierenden Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz umfasst oder ein Analog der besagten Sequenz, das

i) mit einer Oligonukleotidsonde hybridisiert, die auf der Grundlage der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz oder der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz hergestellt wurde,
ii) ein Enzym kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens zu 80 % homolog zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ist, wie zu wenigstens 85%, 90 % oder 95% homolog zu besagter Sequenz, und/oder

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Enzym kann nach einem allgemeinen Verfahren isoliert werden, das umfasst

– Klonieren einer DNA-Bibliothek aus Aspergillus aculeatus in geeignete Vektoren,
– Transformieren geeigneter Hefewirtszellen mit besagten Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um ein beliebiges Enzym von Interesse zu exprimieren, das von einem Klon in der DNA-Bibliothek kodiert wird, und
– Durchsuchen ("screening") nach positiven Klonen mittels Bestimmung einer PME-Aktivität des von solchen Klonen produzierten Enzyms.

Eine detailliertere Beschreibung dieses Durchsuchungsverfahren wird unten in Beispiel 1 angegeben.
Die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, kann beispielsweise isoliert werden, indem eine cDNA-Bibliothek von Aspergillus aculeatus, z. B. Stamm CBS 101.43, durchsucht wird, die von dem Centraalbureau voor Schimmelcultures, Delft, NL, allgemein erhältlich ist, und Klone selektioniert werden, die die entsprechende Enzymaktivität exprimieren (d. h. PME-Aktivität, definiert als die Fähigkeit des Enzyms, Methylesterbindungen in Pektin zu hydrolysieren). Die geeignete DNA-Sequenz kann dann aus dem Klon mittels Standardverfahren isoliert werden, z. B. wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wird erwartet, dass DNA, die ein homologes Enzym kodiert, isoliert werden kann, indem in ähnlicher Weise eine cDNA-Bibiliothek eines anderen Mikroorganismus durchsucht wird, insbesondere eines Pilzes, wie eines Stammes einer Aspergillus sp., insbesondere eines Stammes von A. aculeatus, A. oryzae oder A. niger, eines Stammes einer Trichoderma sp., insbesondere eines Stammes von T. harzianum oder T. reesie, eines Stammes einer Fusarium sp., insbesondere eines Stammes von F. oxysporum, eines Stammes einer Humicola sp., oder eines Stammes von Geotricum sp.
Als Alternative kann die DNA, die eine erfindungsgemäße PME kodiert, nach gut bekannten Verfahren vorteilhafter Weise aus DNA aus einem beliebigen der vorstehend genannten Organismen, mittels synthetischer Oligonukleotidsonden, die auf der Grundlage einer hierin offenbarten DNA-Sequenz hergestellt werden, isoliert werden.
Die DNA-Sequenz kann nachfolgend in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden. Dies kann ein beliebiger Vektor sein, der in günstiger Weise rekombinanten DNA-Methoden unterzogen werden kann, und die Auswahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in die er eingeführt werden soll. Dabei kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, deren Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Als Alternative kann der Vektor ein Vektor sein, der nach dem Einführen in die Wirtszelle in das Wirtszell-Genom integriert wird und gemeinsam mit dem oder den Chromosomen) repliziert wird, in das/die er integriert wurde.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, die die PME kodiert, wirksam mit einer geeigneten Promotor- und Terminator-Sequenz verbunden sein. Der Promotor kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die in der ausgewählten Wirtszelle Transkriptionsaktivität zeigt, und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Die Verfahren, die verwendet werden, um die DNA-Sequenzen zu ligieren, die die PME, den Promotor bzw. den Terminator kodieren, und um sie in geeignete Vektoren einzufügen, sind dem Fachmann bekannt (vgl., z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Die Wirtszelle, die mit der DNA-Sequenz transformiert wird, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, ist vorzugsweise eine eukaryontische Zelle, insbesondere eine Pilzzelle, wie eine Hefe oder eine filamentöse Pilzzelle. Insbesondere kann die Zelle zu einer Spezies von Aspergillus gehören, in am meisten bevorzugter Weise Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. Pilzzellen können mittels eines Verfahrens transformiert werden, wobei in einer per se bekannten Weise ein Protoplast erzeugt wird, der Protoplast transformiert wird und anschließend die Zellwand regeneriert wird. Die Verwendung von Aspergillus oryzae als Wirts-Mikroorganismus ist in EP 238 023 beschrieben (von Novo Industri A/S), deren Inhalt mittels Verweis hierin integriert wird. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle sein, z. B. ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae.
Bei einer noch weiteren Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms, wobei eine geeignete Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die das Enzym kodiert, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Produktion des Enzyms erlauben, und das gebildete Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
Das Medium, das zur Kultivierung der transformierten Wirtszellen verwendet wird, kann ein beliebiges bekanntes Medium sein, das für eine Anzucht der besagten Wirtszellen geeignet ist. Die exprimierte PME kann vorteilhafter Weise in das Kulturmedium ausgeschieden werden und kann daraus mittels bekannter Verfahren gewonnen werden, einschließlich Abtrennen der Zellen von dem Medium mittels Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen von Proteinbestandteilen des Mediums mit einem Salz, wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen.
Die auf diese Weise gereinigte PME kann für eine Immunisierung von Tieren zur Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. In spezifischer Weise kann Anti-serum gegen die erfindungsgemäße PME erzeugt werden, indem Kaninchen (oder andere Nagetiere) nach dem von N. Axelsen et al. in: „Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23" oder in „A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982" (insbesondere Seiten 27–31) beschriebenen Verfahren immunisiert werden. Gereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren beispielsweise mittels Salzfällung ((NH₄)₂SO₄) mit nachfolgender Dialyse und Ionenaustausch-Chromatographie, z. B. über DEAE-Sephadex, erhalten werden. Eine immunchemische Charakterisierung der Proteine kann entweder mittels Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Outcherlony in: „Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967", S. 655–706), mittels Kreuz-Immunelektrophorese („crossed immunoelectrophoresis") (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4) oder mittels Raketen-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Bei einer noch weiteren Ausführung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Enzymzubereitung, die für den Abbau pflanzlicher Zellwandkomponenten geeignet ist, wobei die Zubereitung mit einem Enzym angereichert ist, das eine vorstehend beschriebene PME-Aktivität aufweist.
Die Enzymzubereitung, die mit einem erfindungsgemäßen Enzym angereichert wurde, kann z. B. eine Enzymzubereitung sein, die mehrere Enzymaktivitäten umfasst, insbesondere eine Enzymzubereitung, die mehrere pflanzliche Zellwand abbauende Enzyme enthält, wie Pectinex® oder Pectinex Ultra SP® (Novo Nordisk A/S). In dem vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck „angereichert" angeben, dass die PME-Aktivität der Enzymzubereitung erhöht wurde, z. B. mit einem Anreicherungsfaktor von wenigstens 1,1, vorteilhafter Weise mittels Zugabe eines erfindungsgemäßen Enzyms, das mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
Als Alternative kann die Enzymzubereitung, die mit einem Enzym angereichert ist, das PME-Aktivität aufweist, ein erfindungsgemäßes Enzym als hauptsächlichen Enzymbestandteil umfassen, z. B. eine Enzymzubereitung mit einem einzelnen Enzymbestandteil.
Die Enzymzubereitung kann nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden und kann die Form einer flüssigen oder trockenen Zubereitung aufweisen. Beispielsweise kann die Enzymzubereitung die Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats aufweisen. Das Enzym, das zu der Zubereitung zugegeben werden soll, kann mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren stabilisiert werden.
Aufgrund seiner hohen Aktivität gegenüber Pektin enthaltendem Material, das typischer Weise von pflanzlichen Zellwänden abstammt, wird die erfindungsgemäße Enzymzubereitung vorzugsweise als Mittel für den Abbau oder zur Modifi kation von pflanzlichem Zellwandmaterial oder von anderem Pektin enthaltendem Material verwendet.
Das erfindungsgemäße Enzym kann vorteilhafter Weise gemeinsam mit anderen Enzymen, besonders anderen Pektin abbauenden Enzymen, verwendet werden, wenn das Enzym bei der Verarbeitung von Früchten, Gemüsen oder anderen pflanzlichen Materialien verwendet werden soll. Dem entsprechend kann die erfindungsgemäße Enzymzubereitung zusätzlich zu der PME ein oder mehrere andere pflanzliche Zellwand abbauende Enzyme umfassen, wie eine Polygalakturonase, Pektinlyase, Pektatlyase, Arabinanase, Xylanase, Glukanase, Galaktanase, Mannanase, Rhamnogalakturonase, Rhamnogalakturonan-Acetylesterase oder Pektinacetylesterase. Die Zubereitung kann außerdem ein oder mehrere Enzyme enthalten, die eine Exo-Aktivität gegenüber den gleichen Substraten aufweisen wie die oben genannten Endo-Enzyme. Insbesondere kann das Enzym in Kombination mit Polygalakturonase, Pektatlyase oder Pektinlyase beim Pektinabbau verwendet werden.
Im Folgenden werden Beispiele für bevorzugte Verwendungen einer erfindungsgemäßen Enzymzubereitung gegeben, die ein Enzym umfasst, das Pektinmethylesterase-Aktivität zeigt, wahlweise in Kombination mit einem oder mehreren anderen Enzymen. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung und andere Bedingungen, unter denen die Zubereitung verwendet wird, können auf der Grundlage von im Stand der Technik bekannten Methoden ermittelt werden.
Die Enzymzubereitung kann vorteilhafter Weise für die Behandlung von Pektin enthaltendem Pflanzenmaterial verwendet werden, das z. B. aus Gemüse oder Früchten stammt, wie Material, das aus Sojabohnen, Zuckerrüben oder Äpfeln erhalten wird, um die Viskosität zu verringern und so die Verarbeitung oder das Aussehen des besagten Pflanzenmaterials zu verbessern. Die Viskositätsverringerung kann auch erreicht werden, indem das Pektin enthaltende Pflanzenmaterial mit einer erfindungsgemäßen Enzymzubereitung unter geeigneten Bedingungen für einen vollständigen oder teilweisen Abbau des Pektin enthaltenden Materials i behandelt wird.
Die Enzymzubereitung kann für eine Entpektinierung und Viskositätsverringerung bei Gemüse- oder Fruchtsaft verwendet werden, insbesondere bei Apfeloder Birnensaft.
Die Enzymzubereitung kann bei der Behandlung von Frucht- und Gemüsebrei verwendet werden, beispielsweise bei der Behandlung von Brei aus Äpfeln und Birnen zur Saftproduktion und bei der Behandlung von Brei aus Trauben für die Weinproduktion.
Die Enzymzubereitung kann bei der Produktion von Zitrusfruchtsaft verwendet werden, z. B. für einen teilweisen oder vollständigen Abbau des Fruchtfleisches, das nach dem Pressen in dem Saft enthalten ist.
Bei den vorstehenden Verwendungen umfasst die Enzymzubereitung vorzugsweise zusätzlich zu PME eine Polygalakturonase enthaltende Enzymzubereitung.
Bei einer Verwendung einer erfindungsgemäßen Enzymzubereitung ist es möglich, die Konsistenz und die Erscheinung der verarbeiteten Früchte oder Gemüse zu regulieren. So wurde gefunden, dass die Konsistenz und die Erscheinung von der jeweils für die Verarbeitung verwendeten Enzymkombination abhängen, d.h. der Art der Enzyme (insbesondere Pektin abbauenden Enzym(e)) mit denen die erfindungsgemäße Pektinmethylesterase kombiniert wird.
Beispiele von Produkten mit spezifischen Eigenschaften, die hergestellt werden können, indem eine erfindungsgemäße Enzymzubereitung verwendet wird, beinhalten klaren Saft von Äpfeln, Birnen oder Beeren, trübungsstabilen („cloud stable") Saft von Äpfeln, Birnen, Beeren, Zitrusfrüchten oder Tomaten und Pürees von Karotten und Tomaten.
Aus der vorstehenden Offenbarung wird deutlich, dass die erfindungsgemäße PME als Einzelbestandteil produziert werden kann, der im Wesentlichen frei von anderen Enzymaktivitäten ist, wie Polygalakturonase- und/oder Pektinlyase-Aktivität, die normalerweise in kommerziell erhältlichen, Pektinesterase enthaltenden, pektinolytischen Zubereitungen gefunden wird.
Auf dieser Grundlage ist die Verwendung der erfindungsgemäßen PME in besonderem Maße für Zwecke vorteilhaft, bei denen die Wirkung solcher anderer Enzymaktivitäten unerwünscht ist.
Beispiele solcher Zwecke beinhalten die Verwendung der Pektinmethylesterase für die vollständige oder teilweise Demethylierung von Pektin in verarbeiteten oder nicht verarbeiteten Früchten und Gemüsen.
Die teilweise Demethylierung ist z. B. von Bedeutung, wenn eine verbessern Festigkeit von Früchten oder Gemüsen wünschenswert ist. So wird die Festigkeit häufig während der Verarbeitung (z. B. Abfüllen in Dosen und Pasteurisierung) verringert. Bei der Verwendung einer kontrollierten Menge einer erfindungsgemäßen PME kann eine teilweise Demethylierung des an der Oberfläche von Früchten und Gemüsen vorhandenen Pektins erreicht werden und das erhaltene teilweise demethylierte Pektin kann, z. B. mit divalenten Ionen wie Kalzium, Quervernetzungen ausbilden, wobei eine festere Oberfläche der Früchte oder Gemüse ausgebildet werden kann. In entsprechender Weise kann die erfindungsgemäße PME verwendet werden, um die Festigkeit von z. B. Bohnen, Erbsen und geschnittenen Früchten wie Birnen und Äpfeln zu verbessern.
Ein anderes Beispiel dieser Zwecke ist die Demethylierung von Pektin, z. B. von Zitrusfrucht, Apfel, Sonnenblume und/oder Zuckerrübe. Das PME kann verwendet werden, um gering methyliertes Pektin (definiert als Pektine, bei denen unter 50% der Galakturonsäuren methyliert sind) aus stark methyliertem Pektin (definiert als Pektin, bei dem über 50% der Galakturonsäuren methyliert sind) herzustellen. Herkömmlicher Weise wird eine solche Demethylierung mittels alkalischer oder saurer Demethylierung durchgeführt, wobei unter anderem der Nachteil besteht, dass die Demethylierung sorgfältig kontrolliert werden muss, um eine Depolymerisierung des Pektinrückgrats und dadurch eine schwerwiegende Verschlechterung der funktionellen Eigenschaften der demethylierten Pektine zu verhindern.
Bei einer Verwendung einer erfindungsgemäßen PME wird die oben beschriebene Depolymerisierung verhindert, und die Demethylierung wird unter milderen Bedingungen und bei einer vertretbaren Temperatur (15–50°C) und Zeitspanne (10 min.–2 Stunden) durchgeführt.
Außerdem kann die Pektinesterase verwendet werden, um in situ eine Erhöhung der Viskosität oder eine Gelbildung bei verschiedenen Produkten auf Gemüse- oder Fruchtbasis zu erreichen, wenn sie gemeinsam (gleichzeitig oder nicht gleichzeitig) mit mittelstark oder stark methyliertem Pektin zugegeben wird. Das erhaltene, gering methylierte Pektin wird in Gegenwart von z. B. divalenten Ionen eine Flüssigkeit mit erhöhter Viskosität oder ein Gel bilden. Alternativ kann der natürliche Gehalt an Pektin mittels des Enzyms demethyliert werden, wodurch die Zugabe von Pektin verringert oder sogar vermieden werden kann.
Durch die Verwendung dieses Prozesses ist es möglich, den Zusatz von Pektin zu vermeiden, oder die Menge des zuzusetzenden Pektins zu verringern. Dies ist vorteilhaft, weil der Zusatz von z. B. gering methyliertem Pektin zu einer Gelierung während des Mischens führen kann, die wiederum zu einem unvollständigen Mischen führen kann. Außerdem kann gering methyliertes Pektin in Wasser schwer löslich sein.
Die Verwendung von PME für eine Erhöhung der Viskosität oder eine Gelbildung vermeidet oder verringert den Zusatz anderer stabilisierender oder gelbildender Mittel zu z. B. Marmelade und Ketchup. Auf diese Weise kann die durch das Enzym vermittelte Demethoxylierung des natürlichen Gehalts an Pektin bei einer Reaktion mit dem natürlichen Gehalt an Metallionen ausreichen, um zu einer zufriedenstellenden Erhöhung der Viskosität oder Gelbildung zu führen.
Die Menge an Pektinmethylesterase, die für die Viskositätserhöhung zugesetzt werden muss, beträgt typischer Weise in dem Bereich von 0,1–100 PMEU pro g Pektin, insbesondere 1–10 PMEU pro g. Die PME-Aktivität (PMEU) ist unten in dem Abschnitt Material und Methoden definiert.
Die erfindungsgemäße PME kann alleine oder gemeinsam mit anderen Enzymen verwendet werden, um die Verdaubarkeit von Pektin enthaltendem Tierfutter zu verbessern, z. B. von Futter, das aus Sojabohnen, Zuckerrüben oder Rapssamen hergestellt wird. Zu diesem Zweck wird eine erfindungsgemäße Enzymzubereitung dem Futter zugesetzt.
Die Pektinesterase-Aktivität kann gemeinsam mit anderen Enzymen verwendet werden, um Monogalakturonsäure oder Galakturonsäure enthaltende Oligosaccharide aus Pektin enthaltendem Material, wie Zuckerrübenbrei, mittels bekannter Verfahren herzustellen. Monogalakturonsäure kann für die Produktion von Galaktarsäure oder für die Produktion von Fettsäure und Estern von Fettalkohol und/oder Galakturonsäureäthern verwendet werden. Galakturon enthaltende Oligosaccharide können als Zusätze für menschliche Nahrung oder Tierfutter verwendet werden.
Außerdem kann die PME in Kombination mit anderen Enzymen für das Entfernen von Pektinsubstanzen aus Pflanzenfasern verwendet werden, das z. B. bei der Produktion von Textilfasern oder anderen Zellulosematerialien unbedingt erforderlich ist. Zu diesem Zweck wird Pflanzenfasermaterial mit einer geeigneten Menge der erfindungsgemäßen PME unter geeigneten Bedingungen behandelt, um einen vollständigen oder teilweisen Abbau von Pektinsubstanzen zu erreichen, die mit dem Pflanzenfasermaterial verbunden sind.
Die Erfindung wird weiter in der beigefügten Zeichnung beschrieben, in der
1 eine Restriktionskarte des Plasmids pYHD17 ist,
2 eine Restriktionskarte des Plasmids pHD414 ist,
3 eine pH-Optimumkurve ist,
4 eine Temperaturoptimumkurve ist,
5 eine pH-Stabilitätskurve ist,
6 eine Temperaturstabilitätskurve ist, und
7 die [S]/V-gegen-[S]-Kurve ist, die für eine Bestimmung von Km und spez. Akt. verwendet wird.
Die Erfindung wird in weiteren Einzelheiten in den folgenden Beispielen beschrieben, die in keiner Weise den Umfang der beanspruchten Erfindung einschränken sollen.
BEISPIELE Material und Methoden
Herkunftsorganismus: mRNA wurde aus Aspergillus aculeatus CBS 101.43 isoliert, der in einem Soja-haltigen Fermentationsmedium unter Schütteln, um ausreichende Belüftung zu gewährleisten, kultiviert wurde. Mycelien wurden nach 3–5 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Hefestämme: Der verwendete Stamm von Saccharomyces cerevisiae war yNG231 (MAT alpha, leu2, ura3-52, his4-539, pep4-delta 1, cir+) oder JG169 (MATα ura 3-52; leu 2-3, 112; his 3-D200; pep 4-113; prc1::HIS3; prbl:: LEU2; cir+).
Herstellung eines Expressionsplasmids: Das kommerziell erhältliche Plasmid pYES II (Invitrogen) wurde mit SpeI geschnitten, mit Klenow-DNA-Polymerase + dNTP aufgefüllt und mit ClaI geschnitten. Die DNA wurde in einem Agarosegel nach der Größe fraktioniert, und ein Fragment von in etwa 2000 bp wurde mittels Elektroelution gereinigt. Das gleiche Plasmid wurde mit ClaI-PvuII geschnitten, und ein Fragment von in etwa 3400 bp wurde mittels Elektroelution gereinigt. Die beiden Fragmente wurden mit einem SphI-EcoRI-Fragment mit stumpfen Enden legiert, das den Hefe-TPI-Promotor enthielt. Dieses Fragment wurde aus einem Plasmid isoliert, in dem der TPI-Promotor von S. cerevisiae (vgl. T. Albers und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 419–434) geringfügig modifiziert war: eine interne SphI-Stelle wurde entfernt, indem die vier by deletiert wurden, die das Zentrum dieser Stelle bilden. Außerdem wurden redundante Sequenzen stromaufwärts des Promotors mittels Behandlung mit Ball-Exonuklease entfernt und nachfolgend ein SphI-Linker angehängt. Schließlich wurde an Position –10 ein EcoRI-Linker angehängt. Nach diesen Modifikationen ist der Promotor in einem SphI-EcoRI-Fragment enthalten. Seine Wirksamkeit im Vergleich zu dem ursprünglichen Promotor scheint durch die Modifikationen unverändert. Das so erhaltene Plasmid pYHD 17 ist in 1 gezeigt.
Herstellung RNase-freier Glaswaren, Spitzen und Lösungen: Alle Glaswaren, die bei RNA-Isolierungen verwendet wurden, wurden bei +220°C für wenigstens 12 h erhitzt. Eppendorf-Röhrchen, Pipettenspitzen und Kunststoffsäulen wurden mit 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) in EtOH für 12 h behandelt und autoklaviert. Alle Puffer und Wasser (mit Ausnahme von Tris-enthaltenden Puffern) wurden mit 0,1% DEPC für 12 h bei 37°C behandelt und autoklaviert.
Extraktion von Gesamt-RNA: Die Gesamt-RNA wurde mittels Extraktion mit Guanidinium-Thiozyanat und nachfolgender Ultrazentrifugation durch ein Kissen von 5,7 M CsCl (Chirgwin et al., 1979) mit den folgenden Änderungen isoliert. Die gefrorenen Mycelien wurden mittels eines Mörsers und eines Pistils in flüssigem N₂ zu feinem Pulver zerrieben und nachfolgend in einer vorgekühlten Kaffeemühle zerrieben und sofort in 5 vol RNA-Extraktionspuffer (4 M GuSCN, 0,5 %Na-Laurylsarcosin, 25 mM Na-Citrat, pH 7,0, 0,1 M β-Mercaptoethanol) suspendiert. Die Mischung wurde für 30 min bei RT gerührt und zentrifugiert (30 min, 5000 upm, RT, Heraeus Megafuge 1.0 R), um die Zelltrümmer zu sedimentieren. Der Überstand wurde gesammelt, sorgfältig über ein Kissen mit 5,7 M CsCl (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA, pH 7,5, 0,1% DEPC; vor der Verwendung autoklaviert) überschichtet, wobei 26,5 ml Überstand für jeweils 12,0 ml des CsCl-Kissens verwendet wurden, und zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu erhalten (Beckmann, SW 28 Rotor, 25.000 upm, RT, 24 h). Nach der Zentrifugation wurde der Überstand sorgfältig entfernt, und der Boden des Röhrchens, der das RNA- Sediment enthielt, wurde abgeschnitten und mit 70% EtOH gespült. Das Gesamt-RNA-Sediment wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, in 500 μl TE, pH 7,6 suspendiert (falls schwierig, gegebenenfalls für 5 min bei 65°C erhitzen), mit Phenol extrahiert und mit Ethanol für 12 h bei –20°C gefällt (2,5 vol EtOH, 0,1 vol 3M NaAc, pH 5,2). Die RNA wurde mittels Zentrifugation gesammelt, in 70 % EtOH gewaschen und in einem möglichst geringen Volumen DEPC-DIW resuspendiert. Die RNA-Konzentration wurde mittels Messung bei OD_260/280 bestimmt.
Isolierung von Poly(A)⁺-RNA: Die Poly(A)⁺-RNAs wurden mittels Oligo(dT)-Zellulose-Affinitätschromatographie (Aviv & Leder, 1972) isoliert. Typischerweise wurden 0,2 g Oligo(dT)-Zellulose (Boehringer Mannheim) in 10 ml 1x-Säulen-Ladepuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) vorgequollen, in eine DEPC-behandelte, mit einem Stöpsel verschlossene Kunststoffsäule (Poly Prep Chromatographiesäule, Bio Rad) eingefüllt und mit 20 ml 1x-Säulenauftragspuffer äquilibriert. Die Gesamt-RNA wurde bei 65°C für 8 min erwärmt, für 5 min auf Eis abgekühlt und nach einem Zusatz von 1 vol 2x-Säulen-Auftragspuffer zu der RNA-Probe auf die Säule aufgetragen. Das Eluat wurde gesammelt und 2-3 mal wieder aufgetragen, wobei die Probe vor jedem Auftrag, wie vorstehend beschrieben, erhitzt und auf Eis abgekühlt wurde. Die Oligo(dT)Säule wurde mit 10 vol 1x-Auftragspuffer und nachfolgend mit 3 vol mittlerem Salzpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) gewaschen. Anschließend wurde die Poly(A)⁺-RNA mit 3 vol auf +65°C vorerhitztem Eluierungspuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,05% SDS) eluiert, wobei Fraktionen von 500 μl gesammelt wurden. Die OD₂₆₀ wurde für jede gesammelte Fraktion bestimmt, und die mRNA enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit Ethanol bei –20°C für 12 h gefällt. Die Poly(A)⁺-RNA wurde mittels Zentrifugation gesammelt, in DEPC-DIW resuspendiert und in Aliquots je 5–10 μg bei –80°C gelagert.
cDNA-Synthese:
Erststrang-Synthese: Doppelsträngige cDNA wurde ausgehend von 5 μg A. αculeatus Poly(A)⁺-RNA mit der RNaseH-Methode (Gubler & Hoffman 1983, Sambrook et al., 1989) unter Verwendung der Haarnadel-Modifikation synthetisiert. Die Poly(A)⁺-RNA (5 μg in 5 μl DEPC-behandeltem Wasser) wurde für 8 min bei 70°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und in einem Endvolumen von 50 μl vereinigt mit Reverse-Transkriptase-Puffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories) mit 1 mM jedes dNTPs (Pharmacia), 40 units menschlicher placentaler Ribonuklease-Inhibitor (RNasin, Promega), 10 μg Oligo(dT)_12–18-Primer (Pharmacia) und 1000 units SuperScript II RNase H-Reverse-Transkriptase (Bethesda Research Laboratories). Die Erststrang-cDNA wurde mittels Inkubation des Reaktionsgemisches bei 45°C für 1 h synthetisiert.
Zweitstrang-Synthese: Nach der Synthese wurden 30 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA zugesetzt und die mRNA:cDNA-Hybride wurden mit Ethanol für 12 h bei –20°C unter Zusatz von 40 μg Glykogen-Träger (Boehringer Mannheim), 0,2 vol 10 M NH₄Ac und 2,5 vol 96% EtOH gefällt. Die Hybride wurden mittels Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen, an der Luft getrocknet und in 250 μl Zweitstrang-Puffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 16 μM βNAD⁺) resuspendiert, der 100 μM jedes dNTPs, 44 units E. coli-DNA-Polymerase I (Amersham), 6,25 units RNase H (Bethesda Research Laboratories) und 10,5 units E. coli-DNA-Ligase (New England Biolabs) enthielt. Die Zweitstrang-cDNA-Synthese wurde mittels Inkubation des Reaktionsröhrchens bei 16°C für 3 h durchgeführt, und die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM und nachfolgender Phenol-Extraktion gestoppt.
Mungbohnennuklease-Behandlung: Die doppelsträngige (ds) cDNA wurde unter Zugabe von 2 vol 96% EtOH, 0,1 vol 3 M NaAc, pH 5,2 einer Ethanol- Fällung bei –20°C für 12 h unterzogen. Sie wurde durch Zentrifugation gewonnen, mit 70% EtOH gewaschen, getrocknet (SpeedVac) und in 30 μl Mungbohnennuklease-Puffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 0,35 mM DTT, 2% Glycerin) mit 36 units Mungbohnennuklease (Bethesda Research Laboratories) resuspendiert. Die einzelsträngige Haarnadel-DNA wurde geschnitten, indem die Reaktion bei 30°C für 30 min inkubiert wurde, mit nachfolgender Zugabe von 70 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung mit 2 vol 96% EtOH und 0,1 vol 3M NaAc, pH 5,2 bei –20°C für 12 h.
Stumpf machen der Enden („blunt-ending") mit T4-DNA-Polymerase: Die Enden der ds-cDNA wurden mit T4-DNA-Polymerase in 50 μl T4-DNA-Polymerase-Puffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT) mit 0,5 mM jedes dNTPs und 7,5 units T4-DNA-Polymerase (Invitrogen) mittels Inkubation des Reaktionsgemisches bei +37 °C für 15 min stumpf gemacht. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 20 mM abgestoppt, mit einer nachfolgenden Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung.
Ligation von Adaptoren und Größenauswahl: Nach der Auffüllreaktion wurde die cDNA mit nicht-palindromischen BstX I-Adaptoren (1 μg/μl, Invitrogen) in 30 μl Ligationspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgC1₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml Rinderserum-Albumin) ligiert, der 600 pmol BstX I-Adaptoren und 5 units T4-Ligase (Invitrogen) enthielt, indem das Reaktionsgemisch bei +16°C für 12 h inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf +70 °C für 5 min abgestoppt, und die mit Adaptoren versehene cDNA wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese (0,8% HSB-Agarose, FMC) nach der Größe aufgetrennt, um nicht-legierte Adaptoren und kleine cDNAs zu trennen. Die cDNA wurde mit einer Ausschlussgröße von 0,7 kb nach ihrer Größe ausgewählt, und die cDNA wurde mittels Elektroelution in 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, bei 100 Volt während einer Stunde aus dem Agarosegel isoliert und mit Phenol extrahiert und mit Ethanol bei –20°C für 12 h gefällt, wie vorstehend beschrieben.
Herstellung von cDNA-Bibliotheken: Die mit Adaptoren versehene ds-cDNA wurde mittels Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen und in 25 ml DIW resuspendiert. Vor der Durchführung eines großen Ansatzes zur Ligation einer Bibliothek wurden vier Testligationen in 10 μl Ligationspuffer (der gleiche wie oben) durchgeführt, der jeweils 1 μl ds-cDNA (Reaktionsröhrchen Nr. 1 bis Nr. 3), 2 units T4-Ligase (Invitrogen) und 50 ng (Röhrchen Nr. 1), 100 ng (Röhrchen Nr. 2) und 200 ng (Röhrchen Nr. 3 und Nr. 4) mit Bst XI geschnittenen Hefe-Expressionsvektor entweder pYES 2.0 Vektor, Invitrogen, oder yHD13) enthielt. Die Ligations-Reaktionen wurden mittels Inkubation bei +16°C für 12 h durchgeführt, bei 70°C für 5 min erhitzt, und 1 μl jeder Ligation wurde in 40 μl kompetente E. coli-1061-Zellen (OD600 = 0,9 in 1 Liter LB-Bouillon; zweimal in kaltem DIW, einmal in 20 ml 10% Glycerin gewaschen, in 2 ml 10 % Glycerin resuspendiert) elektroporiert (200 Ω, 2,5 kV, 25 μF). Nach Zugabe von 1 ml SOC zu jedem Transformationsgemisch wurden die Zellen bei +37°C für 1 h kultiviert, 50 μl wurden auf LB+Ampicillin-Platten (100 μg/ml) plattiert und bei +37°C für 12 h kultiviert.
Bei den optimalen Bedingungen wurde ein großer Ligationsansatz durchführt, in 40 μl Ligations-Puffer, der 9 units T4-Ligase enthielt, und die Reaktion wurde bei +16°C für 12 h inkubiert. Die Ligations-Reaktion wurde durch Erhitzen bei 70°C für 5 min abgestoppt, bei –20°C für 12 h mit Ethanol gefällt, mittels Zentrifugation gewonnen und in 10 μl DIW resuspendiert. 1-μl-Aliquots wurden in elektrokompetente E. coli-1061-Zellen transformiert, wobei die gleichen Elektroporationsbedingungen wie vorstehend beschrieben, verwendet wurden, und die transformierten Zellen wurden titriert, und die Bibliothek wurde mit 5.000–7.000 cfu/Platte auf LB+Ampicillin-Platten plattiert. Zu jeder Platte wurden 3 ml Medium zugegeben. Die Bakterien wurden abgeschabt, 1 ml Glycerin zugegeben und bei –80°C als Mischungen gelagert. Die verbleibenden 2 ml wurden zur DNA-Isolierung eingesetzt. Wenn die Menge der DNA nicht ausreichte, um die erforderliche Anzahl von Hefe-Transformanten zu erhalten, wurde ein großer DNA-Ansatz aus 500 ml Medium (TB) hergestellt, die mit 50 μl des bakteriellen –80°C-Vorrats angeimpft und über Nacht vermehrt wurden.
Herstellung von Hefe-Bibliotheken: Um sicherzustellen, dass alle bakteriellen Klone in Hefe getestet wurden, wurde als Grenze von einer Anzahl von Hefe-Transformanten ausgegangen, die 5 mal größer war als die Anzahl der bakteriellen Klone in den ursprünglichen Mischungen.
1-μl-Aliquots der gereinigten Plasmid-DNA (100 ng/μl) von einzelnen Mischungen wurden in 40 μl kompetente S. cerevisiae-JG-169-Zellen (OD600 = 1,5 in 500 ml YPD, zweimal in kaltem DIW, einmal in kaltem 1 M Sorbit gewaschen, in 0,5 ml 1 M Sorbit resuspendiert, Becker & Guarante, 1991) elektroporiert (200 Ω, 1,5 kV, 25 μF). Nach Zugabe von 1 ml 1M kaltem Sorbit wurden 80 μl-Aliquots auf SC+Glucose-Uracil plattiert, um 250–400 cfu/Platte zu erhalten und bei 30 °C für 3–5 Tage inkubiert.
Herstellung eines Aspergillus-Expressionsvektors: Der Vektor pHD414 ist von dem Plasmid P775 (beschrieben in EP 238 023 ) abgeleitet. Im Gegensatz zu diesem Plasmid besitzt pHD414 einen Abschnitt mit nur einmal vorkommenden Restriktions-Schnittstellen zwischen dem Promotor und dem Terminator. Das Plasmid wurde hergestellt, indem ein in etwa 200 by langes Fragment (mit unerwünschten RE-Stellen) an dem 3'-Ende des Terminators entfernt wurde und anschließend ein in etwa 250 by langes Fragment an dem 5'-Ende des Promotors entfernt wurde, das ebenfalls unerwünschte Stellen enthielt. Die 200-bp-Region wurde mittels Schneiden mit NarI (innerhalb des pUC-Vektors angeordnet) und mit XbaI (unmittelbar 3' zu dem Terminator), anschließendem Auffüllen der erzeugten Enden mit Klenow-DNA-Polymerase + dNTP, Reinigung des Vektorfragments in einem Gel und Religation des Vektorfragments entfernt. Dieses Plasmid wurde pHD413 genannt. pHD413 wurde mit StuI (innerhalb des 5'-Endes des Promotors angeordnet) und PvuII (innerhalb des pUC-Vektors) geschnitten, in einem Gel aufgetrennt und religiert. Das Plasmid pHD414 ist in 2 gezeigt.
Medien:
YPD: 10 g Hefe-Extrakt, 20 g Pepton, H₂O bis auf 810 ml. Autoklaviert, 90 ml 20% Glucose (steril filtriert) zugegeben.
10x Basalsalz: 66,8 g Hefe-Stickstoffbasis, 100 g Bernsteinsäure, 60 g NaOH, H₂O bis auf 1.000 ml, steril filtriert.
SC-URA: 90 ml 10x Basalsalz, 22,5 ml 20% Casamino Acids, 9 ml 1% Tryptophan, H₂O bis auf 806 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 90 ml 20% Glucose oder 20% Galaktose zugegeben.
SC-H-Boullion: 7,5 g/l Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casamino Acids ohne Vitamine, 0,1 g/l Trypto- phan. Autoklaviert für 20 min bei 121°C. Nach dem Autoklavieren wurden 10 ml einer 30% Galaktose-Lösung, 5 ml einer 30% Glucose-Lösung und 0,4 ml einer 5% Threonin-Lösung je 100 ml Medium zugegeben.
SC-H-Agar: 7,5 g/l Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casamino Acids ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan und 20 g/l Agar (Bacto). Autoklaviert für 20 min bei 121°C. Nach dem Autoklavieren wurden 55 ml einer 22% Galaktose-Lösung und 1,8 ml einer 5% Threonin-Lösung je 450 ml Agar zugegeben.
YNB-1-Agar: 3,3 g/l KH₂PO₄, 16,7 g/l Agar, pH auf 7 eingestellt. Autoklaviert für 20 min bei 121°C. Nach dem Autoklavieren wurden 25 ml einer 13,6% Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 25 ml einer 40% Glucose-Lösung, 1,5 ml ei ner 1% L-Leucin-Lösung und 1,5 ml einer 1% Histidin-Lösung je 450 ml Agar zugegeben.
YNB-1-Bouillon: Zusammensetzung wie YNB-1-Agar, jedoch ohne Agar.
FG-4-Agar: 35 g/l Agar, 30 g/l Sojabohnenschrotmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bactopepton, pH 7. Autoklaviert 40 min bei 121°C.
FG-4-Medium: 30 g/l Sojabohnenmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bactopepton. Autoklaviert 40 min bei 121°C.
MDU-2-Medium: 45 g/l Maltose, 1 g/l MgSO₄–7 H₂O, 1 g/l NaCl, 2 g/l K₂SO₄, 12 g/l KH₂PO₄, 0,1 ml/l Pluronic 61 L, 0,5 ml/l Spurenmetalllösung, pH 5,0. Autoklaviert 20 min bei 121°C. 15 ml/l 50% steril filtrierter Harnstoff werden nach dem Autoklavieren zugegeben.
Pektin-Überschichtungsgel („overlayer gel"): 1% HSB-Agarose, 1% Pektin (DE 75%) in einem Puffer mit einem geeignetem pH. Das Gel wurde gekocht und dann auf 55°C abgekühlt, bevor die Überschichtung auf die Agar-Platten gegossen wurde.
Transformation von Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger (allgemeines Verfahren
100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, 1981) werden mit Sporen von A. oryzae oder A. niger beimpft und unter Schütteln bei 37 °C für in etwa 2 Tage inkubiert. Das Mycel wird mittels Filtration durch Miracloth geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO₄ gewaschen. Das Mycel wird in 15 ml 1,2 M MgSO₄, 10 mM NaHP₂O₄, pH 5,8 suspendiert. Die Suspension wird auf Eis gekühlt und 1 ml eines Puffers werden zugegeben, der 120 mg Novozym^® 234, Charge 1687 enthält. Nach 5 Minuten wird 1 ml 12 mg/ml BSA (Sigma Typ H25) zugegeben, und die Inkubation wird unter sanftem Schütteln für 1,5–2,5 Stunden bei 37°C fortgesetzt, bis eine große Anzahl von Protoplasten in einer unter dem Mikroskop untersuchten Probe sichtbar ist.
Die Suspension wird durch Miracloth gefiltert, das Filtrat wird in ein steriles Röhrchen überführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbit, 100 mM Tris HCl, pH 7,0 überschichtet. Die Zentrifugation wird für 15 Minuten bei 100 g durchgeführt, und die Protoplasten werden von der Oberfläche des MgSO₄-Kissens gesammelt. Zwei Volumina STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂) werden zu der Protoplasten-Suspension gegeben, und die Mischung wird für 5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Protoplasten-Sediment wird in 3 ml STC resuspendiert und erneut sedimentiert. Dies wird wiederholt. Schließlich werden die Protoplasten in 0,2–1 ml STC resuspendiert.
100 μl der Protoplasten-Suspension werden mit 5–25 μg der geeigneten DNA in 10 μl STC gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (einem Plasmid, das das amdS-Gen aus A. nidulans trägt) gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 25 Minuten belassen. 0,2 ml 60 % PEG 4000 (BDH 29576). 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 werden zugegeben und sorgfältig gemischt (zweimal), und schließlich werden 0,85 ml der gleichen Lösung zugegeben und sorgfältig gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 25 Minuten belassen, bei 2500 g für 15 Minuten zentrifugiert, und das Sediment wird in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf geeigneten Platten verteilt. Protoplasten werden auf Minimal-Platten (Cove Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56) mit 1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl, um Hintergrundwachstum zu hemmen, verteilt. Nach Inkubation für 4–7 Tage bei 37°C werden Sporen aufgenommen und für Einzelkolonien verteilt. Dieses Verfahren wird wiederholt und nach der zweiten Verteilung werden Sporen einer Einzelkolonie als definierte Transformante gelagert.
Kontinuierliche Fermentation („Fed batch")
Eine kontinuierliche Fermentation wurde in einem Medium durchgeführt, das Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle und Hefeextrakt enthielt. Die kontinuierliche Fermentation wurde durchgeführt, indem eine Schüttelflaschenkultur der besagten A. oryzae Wirtszellen in ein Medium eingeimpft wurde, das 3,5% der Kohlenstoffquelle und 0,5% der Stickstoffquelle enthielt. Nach 24 Stunden der Kultur bei pH 5,0 und 34°C wurde mit der kontinuierlichen Zufuhr der zusätzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen begonnen. Die Kohlenstoffquelle wurde als limitierender Faktor eingesetzt, und es wurde sichergestellt, dass Sauerstoff im Überschuss vorhanden war. Die kontinuierliche Kultivierung wurde für 4 Tage fortgesetzt, wonach die Enzyme mittels Zentrifugation, Ultrafiltration, Klärungsfiltration und Keimfiltration gewonnen werden konnten.
Reinigung des Enzyms
Das rekombinante Enzym aus A. oryzae wurde wie folgt gereinigt: Nach 5 Tagen der Kultur wurde ein Kulturüberstand geerntet und zentrifugiert, steril filtriert und mit einer 20-kDa-Ultrafiltrationsvorrichtung bis zu in etwa 20% Trockensubstanz konzentriert. 40 ml dieses Konzentrats (enthaltend 80–120 mg rPME) wurden 10-fach in 20 mM Tris pH 8,0 verdünnt und auf eine HR 16/20 Q-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia, Schweden) mit 1,5 ml/min aufgetragen und mit einem linearen NaCl-Gradienten (von 0–0,6 M NaCl) bei in etwa 0,4 M NaCl eluiert. Die Pektinmethylesterase-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in 20 mM Citrat pH 3,0 ultrafiltriert und auf einer HR 16/20 S-Sepharose-Fast-FlowSäule (Pharmacia, Schweden) mit 1,5 ml/min aufgetragen und mit einem linearen NaCl-Gradienten bei in etwa 0,2 M NaCl eluiert. Die PME-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden in Wasser ultrafiltriert und für die Charakterisierung, wie unten beschrieben, eingesetzt. Proteinkonzentrationen in den Fraktionen wurden mittels des Bio-Rad-Protein-Assays (Bio Rad, USA) bestimmt.
Charakterisierung eines Enzyms der Erfindung:
Elektrophorese
SDS-PAGE-Elektrophorese wurde in einer Mini-Leak-4-Elektrophoreseeinheit (Kem-En-Tec, Dänemark) als modifizierte Version des Laemmli-Verfahrens (Laemmli 1970) durchgeführt. Die isoelektrische Fokussierung wurde auf Ampholine-PAG-Platten pH 3,5–9,5 (Pharmacia, Schweden) auf einer Multiphor-Elektrophoreseeinheit nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Gele wurden entweder mit Silber gefärbt, im Wesentlichen wie beschrieben in (Merrild, Switzer et al. 1979) oder mit Coomassie gefärbt, gemäß (Matsudaira 1989).
pH-Stat-Messungen
Die verwendeten Geräte waren ein Titrator TTT80, eine Autobürette ABU80, ein Titrigraph-Modul REA 160, eine pH-Stat-Einheit REA 270, die alle von Radiometer, Kopenhagen, Dänemark, hergestellt waren. Die Inkubationen wurden in einer 15-ml-Reaktionszelle durchgeführt, die mit einem Thermostat und einem Magnetrührer verbunden war. Der Reaktor wurde mit einer 15 ml 0,2% Substratlösung in Wasser gefüllt, wobei das Substrat Apfelpektin mit einer 75% Veresterung war, das aus Apfelpektin hergestellt wurde, das von der Obipektin AG hergestellt war. Der pH wurde mit NaOH oder HCl auf 4,5 eingestellt (für die Bestimmung des pH-Optimums wurde der pH wie unten beschrieben auf andere Werte eingestellt), und die Temperatur der Reaktionszelle wurde auf 30°C gehalten (mit Ausnahme der Bestimmung des Temperaturoptimums, wie unten beschrieben). Nachdem die Enzymprobe in den Reaktor eingespritzt worden war, wurde in der Zelle für 1 Minute gerührt, wonach die Reaktion während 1,5 Minuten gemessen wurde. Der pH-Stat injizierte 10 mM NaOH in die Reaktorzelle, um den pH konstant zu halten, und die Anzahl hydrolisierter Methylesterbindungen (hmel) ist nach der folgenden Gleichung direkt proportional zu der in den Reaktor injizierten NaOH-Menge:
n(hmel) = n(NaOH)(1 + [H+]/Ka*))
*) Der pK_s von Galakturonsäure beträgt in etwa 3,5 bei 30°C.
Bestimmung des pH-Optimums
Die Experimente wurden bei pH-Werten von 2,5–6,0 durchgeführt. 1,5 μg gereinigten Enzyms in einem Volumen von 50 ml wurden zu der Lösung zugegeben, und Messungen wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Aktivität wurde als Prozentanteil der maximalen Aktivität (pH 4,55) ausgedrückt.
Bestimmung der pH-Stabilität
Zur Bestimmung der pH-Stabilität wurden 1,5 μg Enzym in einem Volumen von 50 ml zu 10 ml 0,1% Substratlösung in der Reaktorzelle zugegeben, und der pH wurde auf einen Wert zwischen 2,5 und 8 eingestellt. Nach 1 Stunde Inkubation bei 30°C wurde 5 ml 0,4% Substratlösung zugegeben und der pH auf 4,5 eingestellt. Anschließend wurden Aktivitätsmessungen, wie oben beschrieben, durchgeführt.
Bestimmung des Temperaturoptimums
Die Experimente wurden bei Temperaturwerten durchgeführt, die von 25–62°C variierten. 1,5 μg gereinigtes Enzym in einem Volumen von 50 ml wurden zu der Lösung zugegeben, und Messungen wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Aktivität wurde als Prozentanteil der maximalen Aktivität (43°C) ausgedrückt.
Bestimmung der Temperaturstabilität
Die Enzymproben wurden bei verschiedenen Temperaturen zwischen 30 °C und 80°C für 0,1 und 2 Stunden inkubiert, wonach die Aktivität, wie oben beschrieben, gemessen wurde.
Bestimmung der Pektinmethylesterase-Aktivität
1 Unit Pektinmethylesterase-Aktivität (PMEU) ist als die Menge von Pektinmethylesterase definiert, die 1 μmol Pektin-Methylester pro Minute mit Zitrusfruchtpektin (72% Methylierung) als Substrat bei einer Substratkonzentration von 0,5 Gewichtsprozent bei pH 4,8 und 22°C hydrolysiert.
BEISPIEL 1
Eine Bibliothek von A. aculeatus wurde hergestellt, die aus in etwa 1,5 × 10⁶ Einzelklonen in 150 Mischungen („pools") bestand.
DNA wurde aus 20 Einzelklonen der Bibliothek isoliert und einer Analyse nach einer cDNA-Insertion unterzogen. Die Insertionsfrequenz wurde als >90% bestimmt, und die durchschnittliche Insertgröße betrug in etwa 1400 bp.
DNA aus einigen der Mischungen wurde in Hefe transformiert, und 50 – 100 Platten, die 200–500 Hefekolonien enthielten, wurden aus jeder Mischung erhalten. Nach 3–5 Tagen Wachstum wurden Replikplattierungen der Agar-Platten auf mehrere Gruppen von Agar-Platten durchgeführt. Eine Gruppe der Platten wurde dann für 2–4 Tage bei 30°C inkubiert und für den Nachweis pektinolytischer Aktivität mit einem Pektin-Überschichtungsgel überschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 30°C wurden 10–15 ml einer 1% Lösung von MTAB (gemischtes Alkyltrimethylammoniumbromid) auf die Überschichtung gegossen und nach 1 Stunde entfernt. PME-positive Kolonien wurden als Kolonien identifiziert, die von einem weißen Hof umgeben waren.
Zellen Enzym-positiver Kolonien wurden zur Isolierung von Einzelkolonien auf Agar verteilt, und für jede der identifizierten, PME-produzierenden Kolonien wurde eine Enzym-produzierende Einzelkolonie ausgewählt.
Charakterisierung positiver Klone: Die positiven Klone wurden als Einzelkolonien erhalten, die cDNA-Insertionen wurden direkt aus der Hefekolonie mittels biotinylierter Polylinker-Primer amplifiziert, mittels eines Magnetkugelsystems (Dynabead M-280, Dynal) gereinigt und einzeln charakterisiert, indem das 5'-Ende jedes cDNA-Klons mit der Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977) und dem Sequenase-System (United Systems Biochemical) sequenziert wurde. Die das Enzym kodierende cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt.
Isolierung eines cDNA-Gens für die Expression in Aspergillus: Eine oder mehrere der PME-produzierenden Kolonien wurden in 20 ml YNB-1-Bouillon in einem 50-ml-Glasreagenzröhrchen angeimpft. Das Röhrchen wurde für 2 Tage bei 30 °C geschüttelt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation für 10 min bei 3000 upm geerntet.
Die Zellen wurden in 1 ml 0,9 M Sorbit, 0,1 M EDTA, pH 7,5 resuspendiert. Das Sediment wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und für 30 Sekunden bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,4 ml 0,9 M Sorbit, 0,1 M EDTA, 14 mM β-Mercaptoethanol resuspendiert. 100 μl 2 mg/ml Zymolase wurden zugegeben, und die Suspension wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und für 30 Sekunden zentrifugiert. Das Sediment (Sphäroplasten) wurde in 0,4 ml TE resuspendiert. 90 μl von (1,5 ml 0,5 M EDTA pH 8,0, 0,6 ml 2 M Tris-Cl pH 8,0, 0,6 ml 10% SDS) wurden zugegeben, und die Suspension wurde bei 65°C für 30 Minuten inkubiert. 80 μl 5 M KOAc wurden zugegeben, und die Suspension wurde auf Eis für wenigstens 60 Minuten inkubiert und für 15 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt, das mit EtOH (Zimmertemperatur) gefüllt war. Nachfolgend wurde gründlich aber sanft gemischt und für 30 Sekunden zentrifugiert. Das Sediment wurde mit kaltem 70% EtOH gewaschen, für 30 Sekunden zentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Das Sediment wurde in 50 μl TE resuspendiert und für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt. 2,5 μl 10 mg/ml RNase wurden zugegeben, nachfolgend wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, und 500 μl Isopropanol wurden unter sanftem Mischen zugegeben. Die Mischung wurde für 30 Sekunden zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Das Sediment wurde mit kaltem 96% EtOH gespült und bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde in 50 μl Wasser bis zu einer Endkonzentration von in etwa 100 μl/ml gelöst.
Die DNA wurde mittels Standardverfahren in E. coli transformiert. Zwei E. coli-Kolonien wurden von jeder Transformation isoliert und mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI analysiert, die das DNA-Insert ausschnitten. DNA aus einem dieser Klone wurde in den Hefestamm JG169 rücktransformiert.
Die DNA-Sequenzen von mehreren der positiven Klone wurden bestimmt. Die gesamte DNA-Sequenz von PME ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt, eine teilweise DNA-Teilsequenz ist in SEQ ID NO: 3 gezeigt.
BEISPIEL 2
Um die Gene in Aspergillus zu exprimieren, wird cDNA aus einem oder mehreren Vertretern jeder Familie mittels Spaltung mit HindIII-XbaI oder anderen geeigneten Restriktionsenzymen, Fraktionierung auf einem Gel nach der Größe und Reinigung isoliert und anschließend mit pHD414 ligiert, wobei das Plasmid pA1PE1.2 entsteht. Nach Vermehrung in E. coli werden die Plasmide nach dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren in A. oryzae oder A. niger transformiert.
Test von A. oryzae-Trausformanten
Jede der Transformanten wurde in der Mitte einer Petrischale mit FG-4-Agar inokuliert. Nach 5-tägiger Inkubation bei 30°C wurden Pfropfen mit 4 mm Durchmesser mit einem Korkenbohrer aus der Mitte der Kolonie entfernt. Die Pfropfen wurden in ein Pektin-Überschichtungsgel eingebettet und über Nacht bei 40°C inkubiert. Die PME-Aktivität wurde, wie oben beschrieben, identifiziert. Einige der Transformanten hatten Höfe, die signifikant größer waren als der Hintergrund von A. oryzae. Dies deutet auf eine effiziente Expression von PME in A. oryzae hin. Die 8 Transformanten mit der höchsten PME-Aktivität wurden ausgewählt und auf YPG-Agar inokuliert und am Leben erhalten.
Jede der 8 ausgewählten Transformanten wurde von YPG-Schrägagar in 500-ml-Schüttelflaschen mit FG-4- und MDU-2-Medien inokuliert. Nach 3–5-tägiger Fermentation mit ausreichendem Schütteln, um eine gute Belüftung zu gewährleisten, wurden die Kultur-Bouillons für 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert, und die Überstände wurden analysiert.
Ein Volumen von 15 μl jedes Überstandes wurde in Löcher mit 4 mm Durchmesser gegeben, die aus einem Pektin-Überschichtungsgel (25 ml in einer Petrischale mit 13 cm Durchmesser) ausgestanzt wurden. Die PME-Aktivität wurde als Bildung eines weißen Hofes während der Inkubation identifiziert.
Anschließend wurde die PME mittels einer kontinuierlichen Fermentation von A. oryzae, der das Enzym exprimierte, wie oben in Material und Methoden beschrieben, produziert.
BEISPIEL 3
Reinigung und Charakterisierung einer erfindungsgemäßen klonierten, rekombinanten PME
PME hydrolysiert die Esterbindung zwischen Methanol und Galakturonsäure in verestertem Pektin. Deshalb kann die Aktivität des Enzyms als Abnahme des pH gemessen werden, die gleichzeitig mit der Bildung von freien Säuregruppen erfolgt. Dieses Analyseverfahren wurde für die Bestimmung von Km, Vmax, pHund Temperaturoptimum einer erfindungsgemäßen PME angewendet, sowie zu einer Bestimmung, wie Temperatur, pH und Substratkonzentrat die Aktivität des Enzyms beeinflussen.
Reinigung des Enzyms
Die Reinigung eines rekombinanten Enzyms aus A. oryzae, das wie oben beschrieben, produziert wurde, wurde mittels der oben in dem Material- und Methoden-Abschnitt beschriebenen Methoden gereinigt und charakterisiert. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Das Molekulargewicht des Enzyms wurde mittels SDS-PAGE als 43 kD bestimmt. Das ist höher als das berechnete Molekulargewicht des Enzyms (in etwa 35 kD), was darauf hindeutet, dass das Enzym in signifikantem Umfang glykosyliert sein kann. Der isoelektrische Punkt wurde mittels isoelektrischer Fokussierung als 3,8 bestimmt, was geringfügig niedriger ist als der berechnete Wert (4,1). Das kann ebenfalls darauf hindeuten, dass das Enzym in signifikantem Umfang eine post-translationale Prozessierung erfährt (z. B. Glykosylierung).
Das pH-Optimum wurde als in etwa pH 4,5 gemessen (3) und das Temperaturoptimum als 45°C (4). Die Aktivität nimmt abrupt bei einem pH über 4,5 und einer Temperatur über 50°C ab, wogegen die Abnahme der Aktivität bei niedrigeren Temperaturen und pH weniger ausgeprägt war. Das besondere Verfahren zur Messung der pH-Stabilität schließt eine exakte Messung der pH-Sensitivität des Enzyms aus, aber die erfindungsgemäße PME scheint bei neutralem pH, d. h. über 5,5–6 wie innerhalb pH 6–8 am stabilsten zu sein (5). Das Enzym war vergleichsweise empfindlich gegenüber erhöhten Temperaturen, d.h.
Temperaturen über 50°C. Bereits nach 1 Stunde bei 50°C waren fast 80% der Aktivität verloren (6).
Schließlich wurden die Reaktionsgeschwindigkeit, V_max und die K_M des Enzyms bestimmt, indem die Substratkonzentration während der Inkubation variiert wurde und die Ergebnisse in einem Hanes-Diagramm dargestellt wurden, worin [S]/V = [S] 1/V_max + K_m/V_max (7). Km wurde auf zu 75% verestertem Apfelpektin (Apfelpektin mit einem 75 % Grad einer Veresterung) als 2,8% gemessen. Dies ist ein vergleichsweise hoher Wert, der eine vergleichsweise geringe Affinität zu dem Substrat anzeigt. Die maximale Geschwindigkeit des Enzyms, V_max, wurde als 8,6 μmol/min bestimmt, und die spezifische Aktivität wurde als 5,5 mmol/(min/mg) bestimmt.
Bei einer Verwendung von Zitrusfruchtpektin (DE = 70–72%) als Substrat und Durchführung des Tests bei einer Temperatur von 22°C wurde die K_m als 0,5 bestimmt, die V_max als 6,0 μmol/min, und die spezifische Aktivität wurde als 239 μmol/(min/mg) bestimmt. Außerdem wurde unter diesen Bedingungen das pH-Optimum als in etwa 4,8 bestimmt.
Das Enzym konnte Acetylestergruppen weder von acetylierten Polysacchariden, noch von dem synthetischen Acetylesterase-Substrat p-Nitrophenolacetat hydrolysieren, wodurch seine Substratspezifität gezeigt wurde. Die spezifische Aktivität auf Apfelpektin von 5,5 mmol/(min/mg) zeigt, dass das Enzym eine sehr hohe katalytische Kapazität aufweist.
Wie erwartet, hat das Enzym eine signifikante synergistische Wirkung auf den Abbau von Pektin, wenn es in Kombination mit Polygalakturonasen verwendet wird. Bei einer Inkubation mit einer A. aculeatus-Polygalakturonase (PCT/DK93/00445) mit oder ohne PME der Erfindung wurde beobachtet, dass Polygalakturonase alleine nur eine begrenzte Aktivität gegenüber dem Pektin besitzt, PME alleine keine Wirkung auf den Abbau des Pektins hat, aber die Verwendung von PME in Kombination mit Polygalakturonase die Substratabbaufähigkeit der Polygalakturonase signifikant erhöht, wobei ein oligomeres Material gebildet wird.
Das saure pH-Optimum des Enzyms deutet darauf hin, dass es von hohem Wert bei der Fruchtsaftverarbeitung sein kann, wo der pH häufig unter pH 5,0 liegt, aber es kann auch von Wert in der Wein-, Futter- und Lebensmittelindustrie sein, wo Pektin enthaltendes Pflanzenmaterial verarbeitet wird.
BEISPIEL 4
Demethylierung von Pektin
40,0 g Pektin, das einen Veresterungsgrad von 72% hat, wurden in 2000 ml entmineralisiertem Wasser mit 80°C verdünnt. Die Temperatur der Pektinlösung wurde auf 30°C temperiert, der pH wurde mit 0,25 M NaHCO₃ auf 4,5 eingestellt.
34 PMEU/g Pektin der, wie oben beschrieben, hergestellten PME wurden zu 2000 ml Pektinlösung zugegeben. Zu der Zeit 10, 30, 60, 120, 180 min wurden 50-ml-Proben entnommen und mit Hitze behandelt, um das Enzym zu inaktivieren (100 °C, 10 min). Danach wurden die Proben entsprechend der folgenden Methode analysiert:
6,25 g der mit 2% Enzym behandelten Lösungen wurden zu 1,25 ml Ethanol und 25 ml CO₂-freiem, entmineralisiertem Wasser zugegeben und aufgelöst. Die Menge freier Carboxylgruppen wird mittels Titrierung mit 0,2 M NaOH bis zu dem Äquivalenzpunkt (pH 7,0) bestimmt, um die nicht veresterten Galakturonsäure-Einheiten zu bestimmen. Ein bekannter Überschuss an wässerigem NaOH wurde zugegeben, und die Verseifung wurde für 1 Stunde zugelassen. Dann wurde eine äquivalente Menge HCl zugegeben, und die Probe wurde nochmals auf pH 7,0 titriert, um die Menge der veresterten Galakturonsäure-Einheiten zu bestimmen. Der Umfang der Veresterung, DE%, wurde anschließend berechnet.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt:
BEISPIEL 5
Orangenmarmelade
Orangen wurden gewaschen und mit einem Fleischwolf zerkleinert. Den Früchten wurde Zucker in dem Verhältnis Frucht/Zucker: 5/1, bezogen auf das Gewicht, zugesetzt. Anschließend wurde die Fruchtmasse für etwa 15 min gekocht und auf –18°C abgekühlt.
Die Fruchtmasse wurde später 1 : 1 mit entmineralisiertem Wasser verdünnt, auf 40°C temperiert, und Pektinmethylesterase, die, wie oben beschrieben, hergestellt wurde, wurde zu 50-g-Proben in Mengen von 17, 1,7 und 0,17 PMEU/g Pektin zugegeben. Der pH der Proben blieb ohne Einstellen bei 3,5. Es wurde geschätzt, dass das Pektin 30% w/w der Früchte betrug. Eine Kontrolle wurde ebenfalls zubereitet, die aus 17 PMEU/g Pektin (Inaktivierung: 85°C für 3 Minuten) bestand. Die Reaktionsdauer betrug 1 Stunde.
Die Proben wurden dann über Nacht auf 4°C abgekühlt, und am folgenden Tag wurde die Festigkeit der Gele bei 4°C vor und nach einer Hitzebehandlung (85°C für 3 min) der Proben bestimmt.
Die Messung der Festigkeit der Gele wurde mittels eines SMS-Konsistenz-Analysators („SMS Texture Analyser") durchgeführt. Die Bedingungen der Konsistenzanalyse waren wie folgt:
Sonde, Durchmesser mm: 20
Durchdringung: 20
Rate: 2 mm/sek Die Festigkeit, N, ergibt sich wie folgt:
BEISPIEL 6
Tomatenpaste
In Dosen abgefüllte, geschälte Pflaumentomaten mit zugesetztem Tomatensaft und Zitronensäure, die im Lebensmittelgeschäft gekauft wurden, wurden als Substrat für die folgenden PME-Versuche verwendet.
Pektinmethylesterase, die, wie oben beschrieben, hergestellt wurde, wurde zu einer Teilmenge von 100 g in einer Menge von 5 PMEU/g Tomatenprodukt zugegeben, zu einer Kontrolle wurden 5 PMEU von inaktivierter PME/g Tomatenprodukt zugegeben. Die Proben wurden gemischt und bei 40°C für 30 Minuten belassen. Die Proben wurden anschließend bis zum nächsten Tag auf 4°C überführt und mittels eines SMS-Konsistenz-Analysators bei 17°C gemessen. Die Proben wurde bei 85°C während 3 min mit Hitze behandelt, um das Enzym zu inaktivieren, und, nachdem die Temperatur auf 17°C eingestellt worden war, wurden die Problem nochmals mittels des SMS-Konsistenz-Analysators gemessen.
Der Konsistenzanalysator misst die Festigkeit N. Die Sonde ist eine 20-mm-Sonde, die Durchdringung der Probe betrug 20%, die Geschwindigkeit betrug 2 mm/sek.
Der pH sowohl der Kontrolle als auch der Probe betrug 4,4. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
BEISPIEL 7
Pudding-artiges Milchdessert
198 g Milch wurden in einem Mikrowellenofen auf 80°C erhitzt. 2 g schnell erstarrenden („rapid set") HM-Pektins wurden bei 80°C unter kräftigem Mischen zugegeben. Anschließend wurde die Milch auf 30°C temperiert und Pektinmethylesterase, die, wie oben beschrieben, zubereitet wurde, wurde zu 100 ml der Mischung in einer Menge von 5 PMEU/ml zugegeben. Eine 100-ml-Kontrolle wurde ebenfalls zubereitet, die die gleiche Menge inaktiviertes Enzym (85°C in 3 min) enthielt. Der pH der beiden Proben betrug 6,3.
Die Testprobe, die das aktive Enzym enthielt, gelierte innerhalb 10 min, während die Kontrolle flüssig blieb.
LITERATUR
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SEQUENZEN
SEQ ID NO: 1
DNA-Sequenz von Pektinmethylesterase aus A. aculeatus. Die Start- und Stopp-Codons (die den kodierenden Teil der DNA-Sequenz angeben) sind in Fettdruck hervorgehoben.
SEQ ID NO: 2
Die Sequenz der Pektinmethylesterase aus A. aculeatus.

Claims

Enzym, das Pektinmethylesterase-Aktivität aufweist, das a) von dem kodierenden Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz kodiert wird, und/oder b) die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat oder eine Sequenz, die wenigstens zu 80% homolog dazu ist.
Enzym, das Pektinmethylesterase-Aktivität aufweist, das von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die die folgende Teilsequenz umfasst:
Enzym nach einem beliebigen der Ansprüche 1 oder 2, das eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften hat: – ein pH-Optimum von 4,5, wie bei 30°C bestimmt, wobei zu 75% verestertes Pektin als Substrat verwendet wird; – ein Temperaturoptimum von 45°C, wobei zu 75% verestertes Pektin als Substrat verwendet wird, - ein Molekulargewicht von 43 kD, das mittels SDS-PAGE bestimmt wird.
Enzym nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, das von einem Mikroorganismus ableitbar ist.
Enzym nach Anspruch 4, das von einem filamentösen Pilz oder einer Hefe ableitbar ist.
Enzym nach Anspruch 5, das von einem Stamm von Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium oder Humicola ableitbar ist.
Enzym nach Anspruch 6, wobei das Enzym von einem Aspergillus-Stamm ableitbar ist, insbesondere einem Stamm von Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae.
Enzym nach Anspruch 7, das von der aus einer DNA-Bibliothek von Aspergillus aculeatus CBS 101.43 isolierten DNA-Sequenz kodiert wird.
DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Enzym kodiert, das Pektinmethylesterase-Aktivität aufweist, das i) mit einer auf der Grundlage der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz hergestellten Oligonukleotidsonde unter den folgenden Bedingungen hybridisiert: Benetzen in 5xSSC und Prähybridisieren für 1 h bei 40°C in einer Lösung von 5xSSC, 5xDenhardts Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8 und 50 μg denaturierter mit Ultraschall behandelter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisieren in der gleichen Lösung, der 50 μCi mit 32-P-dCTP-markierte Sonde zugesetzt wurden, für 18 h bei ~40°C, gefolgt von dreimaligem Waschen in 2xSSC, 0,2% SDS bei 40°C für 30 Minuten, und/oder ii) ein Enzym kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens zu 80% homolog zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, der das DNA-Konstrukt nach Anspruch 9 umfasst oder eine DNA-Sequenz, die ein Enzym nach einem beliebigen der Ansprüche 1–8 kodiert.
Zelle, die einen rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 10 umfasst.
Zelle nach Anspruch 11, die eine eukaryontische Zelle ist, insbesondere eine Pilzzelle, wie eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle.
Zelle nach Anspruch 12, die zu einem Stamm von Aspergillus gehört, insbesondere von Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae.
Verfahren zur Produktion eines Enzyms, das Pektinmethylesterase-Aktivität aufweist, wobei das Verfahren Kultivieren einer Zelle nach einem beliebigen der Ansprüche 1–13 unter Bedingungen, die die Produktion des Enzyms erlauben, und Gewinnen des Enzyms von der Kultur umfasst.
Enzymzubereitung, die für die Modifikation von pflanzlichen Zellwandkomponenten geeignet ist, in der ein Enzym angereichert ist, das Pektinmethylesterase-Aktivität nach einem beliebigen der Ansprüche 1–8 aufweist.
Zubereitung nach Anspruch 15, die zusätzlich ein oder mehrere pflanzliche Zellwand abbauende Enzyme umfasst, wie Pektinlyase, Pektatlyase, Arabinanase, Xylanase, Glucanase, Galaktanase, Mannanase, Rhamnogalakturonase, Rhamnogalakturonan-Acetylesterase, Pektinacetylesterase, Polygalakturonase oder Pektinmethylesterase.
Verwendung einer Pektinmethylesterase nach einem beliebigen der Ansprüche 1–8 zur Verbesserung der Festigkeit eines Pektin enthaltenden Materials.
Verwendung einer Pektinmethylesterase nach einem beliebigen der Ansprüche 1–8 für die Demethylierung von Pektin.
Verwendung einer Pektinmethylesterase nach einem beliebigen der Ansprüche 1–8 zur Erhöhung der Viskosität eines Pektin enthaltenden Materials.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Pektin enthaltende Material ein Frucht- oder Gemüsematerial ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Pektin enthaltende Material Milch ist, die zugesetztes Pektin umfasst.