DE69432231T2

DE69432231T2 - Peptide mit antithrombotischer aktivität und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69432231T2
Application number: DE69432231T
Authority: DE
Inventors: Naoyuki Kawasaki-ku FUKUCHI; Hiroshi Kawasaki-ku YAMAMOTO; Mitsuyo Kawasaki-ku NAGANO; Morikazu Kawasaki-ku KITO; Akiko Kawasaki-ku TANAKA; Koichi Kawasaki-ku ISHII; Tsuyoshi Kawasaki-ku KOBAYASHI; Ryota Kawasaki-ku YOSHIMOTO
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 1994-09-21
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2014-09-22
Also published as: WO1995008573A1; US5856126A; TW494104B; DE69432231D1; CN1057775C; EP0775711A1; EP0775711B1; CN1135760A; EP0775711A4; KR960704934A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid mit Anti-Thrombus-Aktivität, ein Verfahren zur Herstellung des Peptids und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Peptid enthält. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid, das von einem Schlangengift stammt, wobei das Peptid in vivo keine Verringerung der Blutplättchen oder Thrombozyten (Thrombozytopenie) bewirkt.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Es ist allgemein bekannt, dass Blutplättchen stark an einer Krise einer sogenannten Thrombose beteiligt sind, die sich durch einen Herzinfarkt und zerebrale Thrombose zeigt ("Platelets", herausgegeben von Yamanaka und Yamazaki, Igaku-Syoin, S. 158–163 (1991)). Vor kurzem wurde berichtet, dass die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor als eines der Blutproteine und Glycoprotein Ib, das an Blutplättchenoberflächen angeordnet ist, wichtig ist, damit Blutplättchen an intravaskulärem subendotherialem Gewebe haften, was als frühe Reaktion angesehen wird, die Thrombose verursacht (J.P. Cean et al., J. Lab. Clin. Med., 87, 586–596 (1976)).
Es ist bekannt, dass die Bindung zwischen den zwei Arten von Proteinen nicht in einem normalen Zustand erfolgt, sondern nur eintritt, wenn in vivo eine hohe Scherbelastung ausgeübt wird (T.T. Vincent et al., Blood, 65, 823–831 (1985)). Die Methodologie zur Beobachtung der exo-vivo Bindung umfasst ein weit verbreitetes Verfahren, das bestimmte Substanzen, wie Ristocetin als Antibiotikum (M.A. Howard, B.G. Firkin, Thromb. Haemostatis, 26, 362–369 (1971)) und Botrocetin als Protein, das von einem Schlangengift stammt (M.A. Read et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 4514– 4518 (1978)) verwendet. Eine Blutplättchenaggregation tritt ein, wenn diese Substanzen einer Blutplättchensuspension zugesetzt werden. Diese Aggregation hängt von der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Glycoprotein Ib ab (M.A. Howard, B.G. Firkin, M.S. Read et al., supra).
Es wurden bereits mehrere Verbindungen berichtet, die eine Hemmwirkung auf die Blutplättchenaggregation aufweisen, die durch Ristocetin oder Botrocetin vermittelt wird. Zu solchen bekannten Verbindungen zählen zum Beispiel Aurintricarbonsäure (M.D. Phillips et al., Blood, 72, 1989–1903 (1988)) und Farbstoffsubstanzen, wie aromatische Amidinoverbindungen (J.D. Geratz et al., Thromb. Haemostasis, 39, 411–425 (1978)), wie auch Teilfragmentpeptide des von Willebrand-Faktors und Glycoproteins Ib (Y. Fujimura et al., J. Biol. Chem., 261, 381–385 (1986); K. Titani et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 84 5610–5614 (1987)).
Es wurde auch berichtet, dass Peptide mit ähnlichen Blutplättchenaggregation-Hemmaktivitäten in Schlangengiften vorhanden sind. Eine internationale Veröffentlichungsdruckschrift von W09208472 beschreibt solche Peptide von Crotalus horridus horridus und Cerastes Cerastes, wobei jedes Peptid zwei verschiedene Stränge mit einem Molekulargewicht von etwa 25 Kilodalton umfasst, in welchen die Homologie zumindest in Aminosäuresequenzen an der N-terminalen Seite hoch ist. Ein Blutplättchenaggregation hemmendes Peptid, das von Peng et al. (M. Peng et al., Blood, 81, 2321–2328 (1993)) berichtet wurde, das von Echis carinatus erhalten wird, ist auch den zuvor beschriebenen Peptiden in seiner in vitro Aktivität, seinem Molekulargewicht usw., äußerst ähnlich. Jedes der Blutplättchenaggregation hemmenden Peptide, die von Schlangengiften stammen, hemmt die durch Ristocetin oder Botrocetin vermittelte Blut plättchenaggregation bei einer geringen Konzentration von 2 bis 5 μg/ml oder weniger in vitro.
Die internationale Veröffentlichungsdruckschrift von W09208472 beschreibt keine Anti-Thrombus-Aktivität bei der Verabreichung an Tiere. Wie in Beispiel 1 in dieser Beschreibung beschrieben ist, haben daher die gegenwärtigen Erfinder ein Peptid mit äquivalenten Eigenschaften zu dem in der Druckschrift beschriebenen Peptid gereinigt, wobei eine Reinigungsmethode für das Peptid, das von Crotalus horridus horriudus stammt und in der Druckschrift beschrieben ist, überlegt wurde, um die Wirkung bei Verabreichung an Tiere zu untersuchen. Als Ergebnis haben die gegenwärtigen Erfinder ein nahezu vollständiges Verschwinden von Blutplättchen im Blut bei Verabreichung einer geringen Menge von 100 μg/kg beobachtet. Die internationale Veröffentlichungsdruckschrift von WO9208472 beschreibt jedoch weder einen Vorschlag noch eine Lösung für ein solches Problem bei einer Verabreichung an Tiere.
Ferner hat das Peptid von Echis carinatus, das von Peng et al. erhalten wird, sein Molekulargewicht von etwa 26 Kilodalton unter einer nicht reduzierten Bedingungen, wie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemessen wurde, während das Peptid zwei Peptide mit etwa 14 Kilodalton und etwa 16 Kilodalton unter einer verringerten Bedingung bereitstellt. Daher wird behauptet, dass dieses Peptid auch zu dem Peptid homolog ist, das von Crotalus horridus Kilodalton und etwa 16 Kilodalton unter einer verringerten Bedingung bereitstellt. Daher wird behauptet, dass dieses Peptid auch zu dem Peptid homolog ist, das von Crotalus horridus horridus stammt. Es wurde auch berichtet, dass bei diesem Peptid eine beachtliche Verringerung der Blutplättchen bei Verabreichung an Tiere beobachtet wird (M. Peng et al., Blood, 81, 2321–2328 (1993)).
Die entsprechenden Peptide, die von Schlangengiften stammen, welche die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen hemmen, haben eine hohe Homologie in ihren Aminosäuresequenzen und sind auch in ihren Molekulargewichten ziemlich ähnlich. Zusätzlich wird entsprechend dem zuvor beschriebenen Ergebnis angenommen, dass diese Peptide auch eine Aktivität aufweisen, um eine Verringerung der Blutplättchen in vivo herbeizuführen. Das heißt, diese Peptide hemmen die Bindung des von Willebrand-Faktors mit Blutplättchen in vitro bei einer geringen Konzentration, sind aber schwierig als Anti-Thrombose-Arzneimittel für die in vivo Verabreichung zu verwenden. Die gegenwärtigen Erfinder haben den Mechanismus, der die Verringerung der Blutplättchen verursacht, wie folgt betrachtet.
Die Peptide von Schlangengiften, welche die Blutplättchenaggregation, die durch Ristocetin oder Botrocetin vermittelt wird, bei geringer Konzentration hemmen, haben zum Beispiel eine Aminosäuresequenz, die in der internationalen Veröffentlichungsdruckschrift von WO9208471 beschrieben ist. Gemäß der Aminosäuresequenz konserviert das Peptid von Schlangengift ungefähre Positionen von Cysteinresten und einen Teil einer Sequenz, die als notwendig für die Lectinaktivität erachtet wird (W.I. Weis et al., Science, 254, 1608– 1615 (1991)), im Vergleich zu einem Peptid mit einer calciumabhängigen Lectinaktivität, das von Drickamer et al. berichtet wird und als "C-Typ Lectin" bezeichnet wird (K. Drickamer, J. Biol. Chem., 263, 9557–9560 (1988)).
Anders als die obengenannten wurden Peptide von Schlangengiften mit hoher Homologie zu dem C-Typ Lectin in ihren Aminosäuresequenzen erhalten, einschließlich zum Beispiel Botrocetin, das von Botrops jararaca erhalten wurde (Y. Usami et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 928–932 (1993)), Klapperschlangen-Lectin, das von Crotalus atrox erhalten wurde (J. Hirabayashi et al., J. Biol. Chem., 266, 2320–2326 (1991)), und Alboaggregin, das von Trimeresurus albolabris erhalten wurde (E. Yoshida et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 191, 1386–1392 (1993)).
Diese Peptide konservieren auch die ungefähren Positionen von Cysteinresten und einen Teil der Sequenz, die als notwendig für die Lectinaktivität erachtet wird, im Vergleich zum C-Typ Lectin. Es ist auch bekannt, dass C-Typ Lectin eine Aktivität zum Agglutinieren von Zellen, Bakterien und so weiter, durch Glycoproteine (Zuckerketten) an ihren Zellmembranen aufweist (K. Drickamer, J. Hirabayashi et al., supra).
Wenn die Blutplättchenaggregation in vitro gemessen wird, wird gesammelten Blutproben häufig Zitronensäure, Natriumcitrat und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Antikoagulans zugesetzt und somit wird Calcium in einem solchen Blutplättchenaggregation-Messsystem chelatgebunden. Daher werden calciumabhängige Reaktionen gehemmt. Aus diesem Grund ist es schwierig, in vitro zu erfassen, ob die Peptide von Schlangengiften, welche die Blutplättchenaggregation-Hemmaktivität aufweisen, die Lectin-Aktivität haben.
Daher wird angenommen, dass die Peptide von Schlangengiften die C-Typ Lectin-Aktivität in Gegenwart von Calcium in vivo bei Verabreichung an Tiere aufweisen und die Aggregation von Blutplättchen verursachen. Es wird vermutet, dass eine solche Wirkung einer der Faktoren ist, die das beobachtete Phänomen, wie ein Ansammeln von Blutplättchenaggregaten in Mikrogefäßen und die folgende Verringerung der Blutplättchen oder Thrombozyten (Thrombozytopenie), verursachen.
Damit das Peptid von Schlangengift, das die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen hemmt, als Anti-Thrombose-Arzneimittel wirkt, das in vivo, wie in Versuchen an Tieren, wirksam ist, ist es daher notwendig, ein neues aktives Peptid zu erhalten, das durch Umwandlung in ein Molekül hergestellt wird, das keine Verringerung der Blutplättchen verursacht.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde vom zuvor beschriebenen Standpunkt aus gemacht, wobei eine ihrer Aufgaben die Bereitstellung eines Peptids ist, das die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen hemmt, ohne eine Verringerung der Blutplättchen zu verursachen, sowie eines Verfahrens zur Herstellung des Peptids, um ein Arzneimittel zu erhalten, das als Anti-Thrombose-Arzneimittel wirksam ist.
Als Ergebnis sorgfältiger Studien zur Lösung der zuvor beschriebenen Aufgabe haben die gegenwärtigen Erfinder festgestellt, dass ein einstrangiges Peptid, das durch Abtrennen eines multimeren Peptids von einem Schlangengift unter einer bestimmten Bedingung erhalten wird, eine Anti-Thrombus-Aktivität aufweist, ohne eine Verringerung von Blutplättchen bei in vivo Verabreichung zu verursachen. Somit war die vorliegende Erfindung vollendet.
Das heißt, die vorliegende Erfindung liegt in einem einstrangigen Peptid, das von einem multimeren Peptid von einem Schlangengift erhalten wird, das eine Aktivität besitzt, die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu hemmen, wobei das einstrangige Peptid (in der Folge als "Peptid der vorliegenden Erfindung" oder, falls erforderlich, als "aktives Peptid" bezeichnet) in einer zum Aufweisen der Aktivität in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines einstrangigen Peptids bereit, das von einem multimeren Peptid aus einem Schlangengift erhältlich ist, das eine Aktivität besitzt, die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu hemmen, wobei das einstrangige Peptid in einer zum Aufweisen der Aktivität in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, wobei das Verfahren das Vorlegen des multimeren Peptids aus dem Schlangengift gemeinsam mit einem Protein-Denaturierungsmittel und Glutathion und/oder Cystein umfasst, um dadurch Disulfidbindungen zwischen Peptidketten zu trennen, um das einstrangige Peptid zu bilden, während Disulfidbindungen innerhalb der Peptidketten im Wesentlichen beibehalten werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids bereit, das in einer zum Aufweisen der Aktivität der Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, wobei das Verfahren die Schritte des Kultivierens, in einem geeigneten Medium, von Escherichia coli, transformiert mit einem Vektor, der ein insertiertes DNA-Fragment enthält, das für das Peptid oder einen Teil davon, der das Peptid exprimiert, codiert, des Vorlegens des in Escherichia coli-Zellen angesammelten Peptids gemeinsam mit einem Protein-Denaturierungsmittel, und des anschließenden Erzeugens von Disulfidbindungen innerhalb von Ketten des Peptids durch Entfernung des Protein-Denaturierungsmittels oder Senkung der Konzentration des Protein-Denaturierungsmittels umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids bereit, das in einer zum Aufweisen der Aktivität der Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, wobei das Verfahren die Schritte des Kultivierens, in einem geeigneten Medium, von kultivierten Insektenzellen oder kultivierten Tierzellen, transformiert mit einem Vektor, der ein insertiertes DNA-Fragment enthält, das für das Peptid oder einen Teil davon, der das Peptid exprimiert, codiert, und des Gewinnens des in den Zellen oder in dem Medium angesammelten Peptids umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen Wirkbestandteil aus dem Peptid und/oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon enthält.
Es wird festgehalten, dass der Begriff "Peptid" auf den einfach in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, in einigen Fällen das einstrangige Peptid angibt, während der Begriff in anderen Fällen das multimere Peptid angibt.
In der Folge wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
<1> Das Peptid der vorliegenden Erfindung
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist ein einstrangiges Peptid, das von dem multimeren Peptid von einem Schlangengift erhalten wird, das die Aktivität aufweist, die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu hemmen. Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass es in einer zum Aufweisen der Aktivität in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen oder Thrombozyten (Thrombozytopenie) aufweist.
Die vorliegende Erfindung ist bei jedem multimeren Peptid von dem Schlangengift anwendbar, vorausgesetzt, das multimere Peptid hat die Aktivität, die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu hemmen. Das multimere Peptid enthält zum Beispiel Peptide, die von Schlangengiften stammen, die von Crotalus horridus horridus, Cerastes Gerastes, Echis carinatus, Trimeresurus albolabris und Vipera palaestina erzeugt werden. Von diesen ist ein Peptid von einem Schlangengift, das von Crotalus horridus horridus erzeugt wird, bevorzugt.
Insbesondere wird das Peptid der vorliegenden Erfindung durch ein einstrangiges Peptid repräsentiert, das von dem Schlangengiftpeptid erhalten wird, das von Crotalus horridus horridus stammt, einschließlich jener mit einer Aminosäuresequenz, die unter Seq.-ID Nr. 1 in der Sequenzliste dargestellt ist, an ihren N-Termini. Das Peptid der vorliegenden Erfindung enthält auch Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die sind Seq.-ID Nr. 2 in der Sequenzliste dargestellt ist, und Disulfidbindungen zwischen dem 4. und 15. Cysteinrest, zwischen dem 32. und 120. Cysteinrest und zwischen dem 95. und 112. Cysteinrest, gezählt vom N-Terminus in Seq.-ID Nr. 2, umfassen. Das Peptid kann auch unter Verwendung genetischer Manipulationstechniken erzeugt werden. Bei einer solchen Erzeugung wird gelegentlich ein Methioninrest, der einem Translationsinitiationscodon entspricht, dem N-Terminus der Aminosäuresequenz hinzu gefügt, die in Seq.-ID Nr. 1 oder 2 in der Sequenzliste dargestellt ist. Das Peptid der vorliegenden Erfindung umfasst auch Peptide, bei welchen der Methioninrest wie zuvor beschrieben am N-Terminus hinzugefügt ist.
Es ist auch möglich, nach bekannten genetischen Manipulationstechniken unter Verwendung von zum Beispiel Escherichia coli, kultivierten Insektenzellen oder kultivierten Tierzellen, Peptide zu erzeugen, welche die zuvor beschriebene Aktivität aufweisen und die in Seq.-ID Nr. 2 in der Sequenzliste dargestellte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon haben. Wenn das Peptid der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Escherichia coli als Wirt exprimiert wird, werden in Zellen Einschlusskörper gebildet. Ein Peptid mit der Aktivität wird jedoch durch Löslichmachen der Einschlusskörper und korrekte Bildung von Disulfidbindungen erhalten. In einer solchen Prozedur kann jeder Cysteinrest, der nicht an der Bildung der Disulfidbindung beteiligt ist, durch eine Aminosäure, die nicht Cystein ist, wie Alanin oder Serin, ersetzt werden. Daher wird erwartet, dass ein Auftreten einer fehlerhaften Disulfidbindungsbildung vermieden und die Stabilität eines erhältlichen Peptids verbessert wird. Die Aminosäuresequenz, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist, enthält Aminosäuren oder Regionen, die für die Aktivität nicht notwendig sind. Es ist auch möglich, Peptide mit Substitution, Deletion oder Insertion an einer oder mehreren solchen Aminosäuren zu konstruieren. Zum Beispiel wird die Aktivität beibehalten, selbst wenn 15 Aminosäurereste oder 65 Aminosäurereste am N-Terminus und/oder 11 Aminosäurereste am C-Terminus aus dem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist, deletiert werden, wie in dem in der Folge beschriebenen Beispiel 6 gezeigt wird.
Ortsgerichtete Nucleotidsequenzmutanten können unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (zum Beispiel Mutan-G und Mutan-K, hergestellt von Takara Shuzo) hergestellt werden. Als Alternative können Mutanten auch unter Verwendung des PCR-Verfahrens erhalten werden, wie in "PCR Protocols" (veröffentlicht von Academic Press) beschrieben ist.
Das einstrangige Peptid der vorliegenden Erfindung, wie zuvor beschrieben, bewirkt im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen, die das multimere Peptid verursachen würde, während die Aktivität, die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu hemmen, beibehalten wird. Das Peptid der vorliegenden Erfindung mit solchen Eigenschaften weist die Anti-Thrombus-Aktivität in vivo auf und ist als Anti-Thrombose-Arzneimittel nützlich.
<2> Verfahren zur Herstellung des Peptids der vorliegenden Erfindung
Die folgende Methode ist zum Beispiel als ein Mittel zum Erhalten des Peptids aus dem Schlangengiftpeptid denkbar, das keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, während die Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen beibehalten wird.
Unter der Annahme, dass die Verringerung der Blutplättchen bei Verabreichung des Schlangengiftpeptids, die in vivo erfolgt, sich unter anderen aus der Wirkung der Lectin-Aktivität des Schlangengiftpeptids ergibt, die in der Gegenwart von Calcium auftreten kann, wird angenommen, dass die Aktivität zur Vernetzung von Blutplättchen durch Trennung von Stellen verschwindet, die Zuckerbindungsstellen entsprechen, die in dem Lectin-Molekül vorhanden sind. Zur Trennung solcher Zuckerbindungsstellen kann das multimere Peptid zum Beispiel in einzelne einstrangige Ketten aufgetrennt werden.
Zur Teilung des multimeren Peptids in einzelstrangige Ketten gibt es allgemein bekannte Methoden, umfassend zum Beispiel die Reduktion multimerer Peptide, oder die Reduktion multimerer Peptide, gefolgt von einem Schutz und einer Stabilisierung freier Thiolgruppen von Cysteinresten durch Carboxymethylierung, Carboxyamidomethylierung oder Pyridylethylierung. Wasserlösliche Proteine haben jedoch im Allgemeinen eine Struktur höherer Ordnung, in welcher Seitenketten von hydrophilen Haupt-Aminosäureresten zu der Außenseite gerichtet sind. Eine solche tertiäre Struktur wird durch einen starken Denaturierungszustand zerstört, und eine sekundäre Struktur wird durch Reduktion zur Spaltung von Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten oder durch einen Schutz freier Thiolgruppen von Cysteinresten nach der Reduktion zerstört, was manchmal zu einer Unlöslichkeit in Wasser führt. Wie in Beispiel 1 gezeigt wird, das in der Folge beschrieben ist, wurde ein doppelstrangiges Peptid, das von Crotalus horridus horridus erhalten wurde, zu einem Peptid geändert, das auf Grund einer reduzierenden Carboxyamidomethylierung, reduzierenden Pyridylmethylierung, Reduktion mit Mercaptoethanol usw., in Wasser begrenzt löslich ist.
Peng et al. (M. Peng et al., Blood, 81, 2321–2328 (1993)) berichtete, dass eine Reaktionsmischung, die durch Reduktion eines doppelstrangigen Peptids, das von Echis carinatus erhalten wurde, gefolgt von einer Carboxyamidomethylierung hergestellt wurde, ebenso eine Blutplättchenaggregation hemmende Aktivität aufwies, ähnlich jener des doppelstrangigen Peptids. Es wird jedoch in keiner Weise berichtet, ob die Hemmung der Aggregation spezifisch ist oder nicht oder welches erzeugte Molekül die Aktivität aufweist.
Daher wird in der vorliegenden Erfindung das Peptid aus einem Schlangengift schonend unter milden Denaturierungsbedingungen reduziert, ohne eine ernsthafte Zerstörung seiner Struktur höherer Ordnung zu verursachen. Somit werden Disulfidbindungen in der einstrangigen Kette des doppelstrangigen Peptids, d.h., intramolekulare Disulfidbindungen, im Wesentlichen erhalten, während Disulfidbindungen zwischen den Ketten, d.h., intermolekulare Disulfidbindungen, getrennt werden. Folglich wird das einstrangige Peptid erhalten, das hoch wasserlöslich ist und die ursprüngliche Struktur höherer Ordnung zumindest in einem Ausmaß beibehält, dass das Peptid die Aktivität nicht verliert.
In der vorliegenden Erfindung kann das aktive Peptid unter Verwendung des multimeren Peptids hergestellt werden, das in einem Schlangengift enthalten ist, das die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen hemmt. Zum Beispiel wird das aktive Peptid aus einem Gift von Crotalus horridus horridus erzeugt oder von einem Peptid, das von einem lyophilisierten Produkt des Giftes erhalten wird. Es wird festgehalten, dass die Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen auf der Basis der Hemmung der Blutplättchenaggregation bestimmt werden kann, die durch Ristocetin oder Botrocetin induziert wird (in der Folge einfach als "Ristocetin induzierte Aggregation" oder "Botrocetin induzierte Aggregation", falls erforderlich, bezeichnet).
Mittel zum Trennen der Disulfidbindungen zwischen Peptidketten zur Bereitstellung einstrangiger Ketten unter gleichzeitiger Beibehaltung von Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten innerhalb der Peptidkette beinhalten eine Methode, in welcher das multimere Peptid zur Reaktion gebracht wird, während es gemeinsam mit einem Protein-Denaturierungsmittel, Glutathion und/oder Cystein vorgelegt wird. Guanidinhydrochlorid, Harnstoff usw. werden als Protein-Denaturierungsmittel verwendet. Die Endkonzentration von Guanidinhydrochlorid reicht von 0,01 M bis zu einer gesättigten Konzentration. Vorzugsweise wird Guanidinhydrochlorid in einem Konzentrationsbereich von 1 M bis 6 M verwendet. Glutathion und/oder Cystein wird zur Durchführung einer Reduktion unter milden Bedingungen verwendet. Wenn sie verwendet werden, werden sie zweckdienlich in einem Konzentrationsbereich von 0,1 mM bis 100 mM, vorzugsweise 1 mM bis 50 mM, zugesetzt.
Die Reaktion wird in einem Puffer ausgeführt, der Tris-Salz, Phosphatsalz, Acetatsalz usw. in destilliertem Wasser enthält, oder in einer Lösung, die durch Zugabe eines organischen Lösemittels, wie Alkohol, zu einem dieser hergestellt wird. Die Reaktion wird in einem Lösungszustand in einem Temperaturbereich von -10°C bis 100°C, vorzugsweise 10°C bis 40°C, ausgeführt. Somit kann das gegenständliche einstrangige Peptid erhalten werden. Das einstrangige Peptid kann auch durch Ausführen einer Gefrier- und Auftaubehandlung erhalten werden.
Das aktive Peptid, das wie zuvor beschrieben hergestellt wird, kann durch Kombinieren verschiedener Methoden, wie Gelfiltration, Innenaustausch, Adsorption und Umkehrphasensäulenchromatographie, Affinitätssäulenchromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese und Gegenstromverteilung isoliert werden.
Als Alternative kann das Peptid der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Mikroorganismen oder kultivierten Zellen unter Verwendung genetischer Rekombinationstechniken für die Bearbeitung von Genen, die für das Peptid codieren, hergestellt werden. Das Gen, das für das Peptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird durch Screening auf der Basis der Hybridisierung mit einem DNA-Fragment erhalten, das von einem Teil der Aminosäuresequenz deduziert ist, zum Durchsuchen einer cDNA-Bibliothek, die von einer Giftdrüse von Crotalus horridus horridus erhalten wurde, oder einer genomischen DNA-Bibliothek, die von einem Gewebe erhalten wird, oder durch Screening auf der Basis exprimierter Proteine, die von transformierten Zellen erhalten werden, die DNA exprimieren, die in der Bibliothek enthalten ist, wobei die transformierten Zellen zum Beispiel Prokaryoten enthalten, die durch Escherichia coli, Pilze, wie Hefe, und kultivierte Zellen, wie jene von Insekten und Tieren, dargestellt sind. Es ist auch möglich, DNA-Sequenzen, die unter Verwendung von Codons konstruiert wurden, die den jeweiligen Aminosäuren entsprechen, und geeignete Regulatorsequenzen in Bezug auf die Aminosäuresequenz des Peptids der vorliegenden Erfindung zu kombinieren und zu synthetisieren.
Ein Klon mit cDNA, die für das Peptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann zum Beispiel gewählt werden durch Extrahieren der Gesamt-RNA aus einer Giftdrüse von Crotalus horridus horridus, Reinigen einer mRNA-Fraktion, Synthetisieren von cDNA unter Verwendung der mRNA als Matrize, Erstellen einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Phage oder dergleichen und Durchführen einer Hybridisierung unter Verwendung der cDNA-Bibliothek mit einer Oligonucleotidsonde, die auf der Basis der Aminosäuresequenz des Peptids der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. Als Alternative ist es auch möglich, als Sonde für die Hybridisierung ein DNA-Fragment zu verwenden, das von mRNA nach der RT-PCR- Methode unter Verwendung von Oligonucleotidprimern amplifiziert wurde, die auf der Basis der Aminosäuresequenz des Peptids der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
E. Coli HB101/pCHA1 (E. Coli AJ13023), das ein Plasmid pCHA1 beherbergt, das ein Gen enthält, das für das Peptid der vorliegenden Erfindung codiert, das in dem in der Folge beschriebenen Beispiel erhalten wird, wurde international unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4781 gemäß dem Budapester Vertrag seit 12. August 1994 im National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministry of International Trade and Industry (Postleitzahl: 305, 1-3 Higashi-Icchome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt.
Das gegenständliche Peptid kann unter geeigneten Bedingungen exprimiert und erzeugt werden, indem das erhaltene Gen in eine Plasmid- oder Virusvektor-DNA insertiert wird, die einen Promotor, ein Translationsinitiationssignal und so weiter enthält, die in einem Wirt expimierbar ist, und Durchführen der Einführung des Plasmids oder einer Infektion mit dem Virus in Bezug auf Prokaroyten, die durch Escherichia coli, Pilze, wie Hefe, und kultivierte Zellen, wie jene von Insekten und Tieren, dargestellt sind. In dieser Ausführungsform kann das gegenständliche Peptid in mikrobiellen Zellen oder kultivierten Zellen gesammelt werden oder kann erzeugt und in eine Kulturflüssigkeit sezerniert werden. Das gegenständliche Peptid kann direkt in einer Form exprimiert werden, in welcher Methionin als Translationsinitiationscodon hinzugefügt ist. Als Alternative kann das gegenständliche Peptid in einer Form exprimiert werden, in welcher eine Sekrektionssignalsequenz hinzugefügt ist. Das gegenständliche Peptid kann durch Spalten und Entfernen der Signalsequenz während des Sekretionsprozesses hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das gegenständliche Peptid als chimäres Protein exprimiert werden, das mit einem anderen geeigneten Protein verschmolzen ist (zum Beispiel Escherichia coli-Maltose-Bindungsprotein). In einer solchen Ausführungsform kann das gegenständliche Protein durch Spalten mit einer geeigneten Protease oder mit einer chemischen Methode nach dem Exprimieren des chimären Proteins erhalten werden. Wenn das derart exprimierte und erzeugte Protein die gegenständliche Aktivität auf Grund eines Zustandes seiner Struktur höherer Ordnung nicht aufweist, oder wenn das Protein nur eine schwache Aktivität hat, kann es zur Bildung einer Struktur höherer Ordnung mit ausreichender Aktivität mit Hilfe einer Behandlung unter geeigneten Denaturierungsbedingungen oder unter einer geeigneten Oxidations/Reduktions-Bedingung geändert werden.
Wenn das Peptid der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Escherichia coli als Wirt erzeugt wird, bildet das erzeugte Peptid Einschlusskörper in Zellen, wie zuvor beschrieben. Das Peptid mit der Aktivität kann jedoch durch Löslichmachen der Einschlusskörper und korrektes Bilden der Disulfidbindungen erhalten werden. Insbesondere wird das Peptid der vorliegenden Erfindung durch Kultivieren von Escherichia coli, transformiert mit einem Vektor, der ein insertiertes DNA-Fragment enthält, das für das Peptid der vorliegenden Erfindung oder einen Teil davon codiert, in einem geeigneten Medium, Exprimieren des Peptids, Vorlegen des Peptids, das in Zellen von Escherichia coli angesammelt ist, gemeinsam mit einem Protein-Denaturierungsmittel, und dann Generieren von Disulfidbindungen innerhalb von Ketten des Peptids durch Entfernen des Protein-Denaturierungsmittels oder durch Senken der Konzentration des Protein-Denaturierungsmittels er halten. Die Disulfidbindungen werden zum Beispiel zwischen dem 4. und 15. Cysteinrest, zwischen dem 32. und 120. Cysteinrest und zwischen dem 95. und 112. Cysteinrest in Seq.-ID Nr. 2 gebildet, wenn das Peptid die Aminosäuresequenz hat, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist.
Als Alternative wird das Peptid der vorliegenden Erfindung durch Kultivieren kultivierter Insektenzellen oder kultivierter Tierzellen, transformiert mit einem Vektor, der ein insertiertes DNA-Fragment enthält, das für das Peptid oder einen Teil davon codiert, in einem geeigneten Medium, Exprimieren des Peptids und Gewinnen des Peptids, das in den Zellen oder im Medium angesammelt ist, erhalten.
<3> Pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
Das Peptid, das wie zuvor beschrieben erhalten wird, verursacht keine Verringerung der Blutplättchen, selbst nach einer Verabreichung an Tiere. Tatsächlich hat es die Thrombusbildung nach Verabreichung an Thrombose-Versuchstiere deutlich gehemmt.
Mit Ausnahme der Farbstoffsubstanz, wie Aurin-Tricarboncäure, welche die Eigenschaft zur nichtspezifischen Adsorption an Proteine hat, hat die vorliegende Erfindung die Substanz das erste Mal offenbart, welche die Anti-Thrombus-Aktivität in vivo aufweist, basierend auf dem Merkmal, dass die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen gehemmt wird. Das heißt, die vorliegende Erfindung hat das erste Mal die Tatsache enthüllt, dass die Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen in dem einstrangigen Peptid enthalten ist, das von dem Peptid, das von einem Schlangengift stammt, unter Verwendung der Methode wie einer Reduktion erhalten wird. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die als Anti-Thrombose-Arzneimittel, das keine Verringerung der Blutplättchen bei in vivo Verabreichung bewirkt, äußerst vielversprechend ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält das Peptid der vorliegenden Erfindung und/oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als Wirkstoff. Es kann eine Mischung aus einer oder mehreren Spezies der Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einer Ausführungsform kann die Zusammensetzung Substanzen mit einer Anti-Thrombose-Funktion enthalten, die nicht das Peptid der vorliegenden Erfindung sind. In einer solchen Ausführungsform ist das Peptid der vorliegenden Erfindung nicht unbedingt eine Hauptkomponente der pharmazeutischen Zusammensetzung. Die Zusammensetzung kann mit anderen Materialien vermischt werden, die für gewöhnlich als Komponenten in der Arzneimittelherstellung verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Proteine, wie Serumalbumin, Salze für eine Pufferwirkung oder Einstellung des osmotischen Drucks, Träger und Vehikel.
Die Art von Arzneimittel enthält zum Beispiel Tablette, Kapsel, Granulum, Sirup, Zäpfchen, Salbe, Injektion und Instillation. Von diesen sind Injektionsarzneimittel bevorzugt. Die Verabreichungsmethode kann eine intravenöse, subkutane, orale, ophthalmische, transintestinale Verabreichung usw. sein. Von diesen ist die intravenöse Verabreichung bevorzugt.
In Bezug auf die Dosis bei Verabreichung an Tiere oder Menschen kann eine beabsichtigte Wirkung für gewöhnlich in einem Bereich von 0,1 μg/kg bis 100 mg/kg als Menge des Peptids der vorliegenden Erfindung und/oder. dessen pharmazeutisch annehmbaren Salzes erwartet werden. Innerhalb dieses Bereichs, ist es möglich, eine Menge zu wählen, mit welcher die beste medizinische Wirkung erzielt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Umkehrphasenchromatogramm von CH-1.
2 zeigt ein Umkehrphasenchromatogramm von CH-2.
3 zeigt ein Umkehrphasenchromatogramm von CH-1 vor der Zugabe von Glutathion.
4 zeigt ein Umkehrphasenchromatogramm von Substanzen, die aus CH-1 erzeugt werden, 5 Tage nach Zugabe von Glutathion.
5 zeigt ein Umkehrphasenchromatogramm von Substanzen, die aus CH-1 erzeugt werden.
6 zeigt Produktionsmengen (μg/Glas) von (a) Peak 1 und (b) Peak 2 unter entsprechenden Bedingungen, abhängig vom Zeitverlauf.
7 zeigt eine Aminosäuresequenz von AS1051. Fragmente A, B, C wurden als ein Fragment erhalten, das durch Disulfidbindungen durch Lysylendopeptidaseaufschluss verbunden ist.
8 zeigt Hemmaktivitäten (Hemmungsverhältnis in bezug auf eine Kontrolle) von (a) CH-1 und (b) AS1051 bei Ristocetin vermittelter Aggregation und Botrocetin vermittelter Aggregation.
9 zeigt Hemmaktivitäten von AS1051 bei Ristocetin vermittelter Aggregation und Botrocetin vermittelter Aggregation von Meerschweinchen-Blutplättchen.
10 zeigt Aggregationsaktivitäten von (a) Ristocetin und (b) Botrocetin bei Meerschweinchen-Blutplättchen nach Verabreichung von A51051 (200 μg/kg).
11 zeigt eine Anti-Thrombus-Aktivität von AS1051 (Verabreichungsmenge: 200 μg/kg) auf optisch stimulierte Thrombus-Modell-Meeerschweinchen.
12 zeigt Konstruktionsschritte für ein AS1051-Expressionsplasmid pCAHT7 für Escherichia coli.
13 zeigt Konstruktionsschritte für ein AS1051-Expressionsplasmid pCHAbac für kultivierte Insektenzellen.
14 zeigt eine Hemmaktivität von AS1051 in einer Lösung aufgebrochener Zellen, exprimiert durch kultivierte Insektenzellen, auf die Bindung des von Willebrand-Faktors mit fixierten Blutplättchen, herbeigeführt durch Botrocetin.
15 zeigt eine Hemmaktivität von AS1051 in einem Kulturüberstand, exprimiert durch kultivierte Insektenzellen, auf die Bindung des von Willebrand-Faktors mit fixierten Blutplättchen, herbeigeführt durch Botrocetin.
16 zeigt Konstruktionsschritte für ein AS1051-Expressionsplasmid pCHASDX für kultivierte Tierzellen (CHO-Zellen).
17 zeigt eine Hemmaktivität von AS1051 in einem Kulturüberstand, exprimiert durch CHO-Zellen, auf die Bindung des von Willebrand-Faktors mit fixierten Blutplättchen, herbeigeführt durch Ristocetin.
18 zeigt eine Hemmaktivität von AS1051 in einem Kulturüberstand, exprimiert durch CHO-Zellen, auf die Bindung des von Willebrand-Faktors mit fixierten Blutplättchen, herbeigeführt durch Botrocetin.
19 zeigt Konstruktionsschritte für ein Plasmid pCHAT7Ala zum Exprimieren von AS1051 in Escherichia coli, mit einer Mutation zur Substitution eines 81. Cysteinrestes durch einen Alaninrest, gezählt vom N-Terminus (mit Ausnahme des Methioninrestes für die Translationsinitiation).
20 zeigt Hemmaktivitäten von AS1051, das aus einem Schlangengift hergestellt wurde, AS1051, das durch Escherichia coli hergestellt wurde, und AS1051 (Cys8lAla mutantes AS1051) mit einem Alaninrest, der für einen 81. Cysteinrest substituiert ist, gezählt vom N-Terminus, auf die Bindung des von Willebrand-Faktors mit fixierten Blutplättchen, herbeigeführt durch Ristocetin oder Botrocetin.
21 zeigt schematisch die Strukturen verschiedener verkürzter AS1051-Peptide.
22 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von AS1051A-1.
23 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von ASl051A-2.
24 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von AS1051A-3.
25 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von AS1051A-4.
26 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von AS1051A-5.
27 zeigt Hemmaktivitäten verschiedener verkürzter AS1051-Peptide auf die Bindung des von Willebrand-Faktors mit fixierten Blutplättchen, herbeigeführt durch Ristocetin oder Botrocetin.
Beste Ausführungsform der Erfindung
In der Folge werden Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Beispiel 1: Herstellung eines einstrangigen Anti-Thrombus-Peptids aus Crotalus horridus horridus
<1> Herstellung eines Peptids mit einer Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen aus Crotalus horridus horridus
Ein Peptid mit einer Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen wurde aus einem Schlangengift, das von Crotalus horridus horridus stammte, unter Verwendung eines Indexes einer Aktivität zur Hemmung der Ristocetin vermittelten Aggregation nach einer in der Folge beschriebenen Methode gereinigt.
Frischblut, das von gesunden Menschen gesammelt und dem 1/10 Volumen 3,8% Natriumcitrat zugesetzt wurde, wurde bei 900 U/min 15 Stunden zentrifugiert, um Blutplättchen reiches Humanplasma zu erhalten, dem ein gleiches Volumen an physiologischer Kochsalzlösung, die 2% Paraformaldehyd enthielt, zugesetzt wurde, wonach es bei 4°C ruhig stehend über Nacht gelagert wurde. Nach der Lagerung wurden die Blutplättchen durch Zentrifugation wiedergewonnen und zweimal mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen, die 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) enthielt. Einer so hergestellten, Formalin fixierten Blutplättchenlösung wurde eine Probe zur Messung zugegeben, welcher der Reihe nach Humanplasma (Endkonzentration 0,12%) und Ristocetin-Sulfat (hergestellt von Sigma, Endkonzentration: 0,5 mg/ml) zugegeben wurden. Nach Schütteln und Rühren wurde das Vorhandensein oder Fehlen der Hemmaktivität auf die Blutplättchenaggregation makroskopisch beobachtet. Die Reaktionslösung hatte ein Volumen von 50 μl. Die Probe wurde richtig verdünnt und in einer geeigneten Menge von 2 bis 20 μl zugegeben.
Ein lyophilisiertes Schlangengiftprodukt (1 g) von Crotalus horridus horridus (hergestellt von Sigma) wurde in physiologischer Kochsalzlösung (10 ml) aufgelöst, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) enthielt. Unlösliche Stoffe wurden durch Zentrifugation bei 3000 U/min über 10 Minuten entfernt. Ein Überstand wurde einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung des selben Puffers als Lösemittel und unter Verwendung einer Sephadex G-75- (fein) (hergestellt von Pharmacia) Säule (Durchmesser: 5,0 cm, Länge: 90 cm) unterzogen, um eine Fraktionierung in Fraktionsgläser durchzuführen. Eine Fraktion, die einem Elutionsvolumen von 750 ml bis 885 ml entsprach, wurde gesammelt und in Teilmengen aufgeteilt. Drei Teilmengen mit einem Volumen von jeweils 15 ml wurden durch eine Benzamidin-Sepharose (hergestellt von Pharmacia) Säule (Durchmesser: 1,6 cm, Länge: 5 cm) geleitet, um eine nicht adsorbierte Fraktion zu sammeln.
Diese Fraktion wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (YM10, hergestellt von Amicon) mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 10 000 filtriert und konzentriert, und die konzentrierte Fraktion wurde mit einem 50 mM Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) lösemittelsubstituiert. Die Fraktion wurde an eine Ionenaustausch-Chromatographiesäule (Durchmesser: 2,6 cm, Länge: 30 cm) unter Verwendung von CM Sepharose CL6B (hergestellt von Pharmacia), äquilibiriert mit dem selben Lösemittel, adsorbiert. Die Säule wurde mit dem Ausgangslösemittel 50 Minuten gewaschen, gefolgt von einer Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten (810 Minuten) von einer Lösung, die 15% bis 50% eines 0,5 M Ammoniumacetatpuffers (pH 6,4), gemischt in dem Ausgangslösemittel enthielt. Eine eluierte Fraktion, die einem Elutionsvolumen von 610 ml bis 650 ml entsprach, wurde fraktioniert und gesammelt, wonach eine Konzentration unter Verwendung der Ultrafiltrationsmembran in der selben Weise wie zuvor beschrieben folgte. Danach wurde das Lösemittel durch eine physiologische Kochsalzlösung substituiert, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) enthielt. Eine ähnliche Blutplättchenaggregation-Hemmaktivität war auch in einer eluierten Fraktion vorhanden, die einem Elutionsvolumen von 540 ml bis 580 ml entsprach. Daher wurde diese Fraktion auf die selbe Weise behandelt, wie zuvor beschrieben wurde.
Teile der entsprechenden Blutplättchenaggregation-Hemmaktivität-Fraktionen, die durch die Ionenaustausch-Säulenchromatographie erhalten wurden, wurden einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (SSC-VP-304, hergestellt von Senshu Kagaku, Durchmesser: 4,6 mm, Länge: 250 mm) unterzogen. Eine Analyse wurde durch Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 31% zu einer Konzentration von 52%, enthaltend 0,1% Trifluoroessigsäure, durchgeführt. Als Ergebnis enthielten die beiden Fraktionen einzelne Peptide, die sich voneinander unterschieden (1, 2). Gemäß der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wiesen beide Peptide, die in den zwei aktiven Fraktionen enthalten waren, eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 25 Kilodalton unter einer nicht reduzierten Bedingung auf, und zwei Banden mit einem Molekulargewicht von etwa 14 Kilodalton und 15 Kilodalton unter einer reduzierten Bedingung, die durch Zugabe von 1% Mercaptoethanol erhalten wurde. Es zeigte sich, dass die beiden ähnliche doppelstrangige Peptide (Seq.-ID Nr.: 1 und 3) sind. Daher wurde das Peptid, das in den letzteren aktiven Fraktionen von der Ionenaustauschsäule eluiert wurde (Elutionsvolumen: 610 ml bis 650 ml) als CH-1 bezeichnet, und das Peptid, das in den früheren aktiven Fraktionen eluiert wurde (Elutionsvolumen: 540 ml bis 580 ml), wurde als CH-2 bezeichnet.
Die Aminosäuresequenzanalyse für einen Amino-Terminus von CH-1 wurde wie folgt durchgeführt. Etwa 50 μg CH-1 wurden in 100 μl einer wässerigen 7M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung, die 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA•Na2) enthielt, aufgelöst. Danach wurden 4-Vinylpyridin (1 μl) und Tri-n-butylphosphin (2 μl) zugegeben. Eine Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur ausgeführt, um eine reduzierende Pyridylethylierung durchzuführen. Die Reaktionslösung wurde einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Säule aus TSKGel-Phenyl-SPW-RP (hergestellt von Tosoh Co., Durchmesser: 4,6 mm, Länge: 75 mm) unterzogen, um jede der erzeugten Peptidketten abzutrennen. Die Elution wurde bei einer Strömungsrate von 1 ml/min mit einem linearen Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 31% bis zu einer Konzentration von 52%, enthaltend 0,1 Trifluoroessigsäure, durchgeführt. Jede der abgetrennten Peptidketten wurde lyophilisiert und dann in 30% Acetonitril aufgelöst, um eine Aminosäuresequenzanalyse von dem Amino-Terminus unter Verwendung des Protein Sequencers 470A (hergestellt von Applied Biosystems) durchzuführen. Als Ergebnis zeigte sich, dass die Aminosäuresequenzen an dem Amino- Terminus der entsprechenden Ketten jene waren, die in Seq.-ID Nr. 1 und 3 in der Sequenzliste dargestellt sind. Sie stimmten jeweils mit den Aminosäuresequenzen an den T-terminalen Seiten der α-Kette und β-Kette eines Peptids CHH-B überein, das aus dem selben Schlangengift isoliert wurde, wie in einer internationalen Veröffentlichungsdruckschrift von WO9208470 beschrieben ist. Gemäß den Rückhaltezeiten von CH-2 und Ch-1 in der Analyse unter Verwendung der Umkehrphasensäulenchromatographie, die in 1 und 2 dargestellt ist, wurde angenommen, dass CH-2 ähnlich CHH-A war und CH-1 ähnlich CHH-B war, die in der Druckschrift beschrieben sind.
<2> Aktivität von CH-1 bei Verabreichung an ein Tier
Die Anzahl von Blutplättchen wurde gemessen, als CH-1, das wie zuvor beschrieben erhalten worden war, Meerschweinchen verabreicht wurde. CH-1 wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst, um Konzentrationen von 10 bis 100 μg/ml zu erhalten, und Meerschweinchen intravenös verabreicht. Nach etwa 5 Minuten wurde arterielles Blut von der abdominalen Aorta entnommen. Zitronensäure (0,32%) wurde als Blut-Antikoagulans bei der Blutentnahme verwendet, um die Anzahl weißer Blutkörperchen ("white blood corpuscles "- WBC), die Anzahl roter Blutkörperchen ("red blood corpuscles "-RBC) und die Anzahl von Blutplättchen ("platelets"-PLT) unter Verwendung von Sysmex E-2000 (hergestellt von Toa Medical Electronics) zu messen.
Die Verabreichungsdosen und die Anzahl der jeweiligen Blutkörperchen sind in Tabelle 1 dargestellt. Nur die Verringerung von Blutplättchen, abhängig von der Verabreichungsdosis, wurde beobachtet. Ein nahezu vollständiges Verschwinden von Blutplättchen wurde bei einer Verabreichungsdosis von 100 μg/kg oder mehr beobachtet. Tabelle 1
<3> Versuch einer Umwandlung von doppelstrangigem CH-1 zu einstrangigem
(1) Reduzierende Carboxyamidomethylierunq für CH-1
Eine reduzierende Carboxyamidomethylierung für CH-1 wurde wie folgt ausgeführt. CH-1 (200 μg) wurde in 500 μl einer wässerigen 7 M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung, enthaltend 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA•Na2), der 50 μl einer wässerigen Dithiotreitol-Lösung (20 mg/ml) zugegeben wurde, aufgelöst, wonach eine Lagerung bei 37°C über 1 Stunde folgte. Eine wässerige Iodoacetoamid-Lösung (50 μl, 50 mg/ml) wurde der gelagerten Lösung zugesetzt, um eine Reaktion über 30 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, durchzuführen.
Nach der Reaktion wurde eine Dialyse bei 4°C über Nacht gegen eine wässerige 0,15 M Natriumchlorid-Lösung (5 Liter), die 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) enthielt, unter Verwendung einer Dialysemembran Spectra/porl (herge stellt von Spectra, Dialyse-Grenzmolekulargewicht: 6000 bis 8000), durchgeführt. Da nach der Dialyse weiße unlösliche Stoffe erschienen, wurde eine oberflächenaktive Substanz, Tween 20, zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2% zu erhalten. Die unlöslichen Stoffe lösten sich jedoch nicht auf. Die weiß-trübe Lösung wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centricon-10 (hergestellt von Amicon) konzentriert, und es wurde schließlich eine Suspension von 100 μl erhalten. Die Suspension wurde leicht zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Danach wurde eine Teilmenge (10 μl) des Überstandes verwendet, um die Hemmaktivität auf die Ristocetin vermittelte Aggregation nach der Methode, die unter Punkt <1> beschrieben ist, zu untersuchen. Die Hemmaktivität wurde jedoch nicht gefunden. Es wurde angenommen, dass dieses Ergebnis erhalten wurde, weil CH-1, das einer reduzierenden Carboxyamidomethylierung nach der zuvor beschriebenen Methode unterzogen wurde, keine Hemmaktivität bei der Ristocetin vermittelten Aggregation hatte, oder weil es folglich eine extrem geringe Löslichkeit in Wasser hatte.
(2) Reduzierende Pyridylethylierun für CH-1
Eine reduzierende Pyridylethylierung für CH-1 wurde wie folgt ausgeführt. CH-1 (200 μg) wurde in 200 μl einer wässerigen 7 M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung, enthaltend 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA•Na2), der 4-Vinylpyridin (1 μl) und Tri-n-butylphosphin (2 μl) zugegeben wurden, aufgelöst, um über Nacht eine Reaktion bei Raumtemperatur auszuführen. Die Reaktionslösung wurde einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (SSC-VP-304, hergestellt von Sensho Kagaku, Durchmesser: 4,6 mm, Länge: 250 mm) unterzogen. Die Elution wurde mit einem Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 10% zu einer Konzentration von 59%, enthaltend 0,1 Trifluoroessigsäure, durchgeführt. Die Produkte wurden fraktioniert und als Mischung von zwei Spezies von pyridylethylierten Peptiden gesammelt.
Die fraktionierte Fraktion wurde lyophilisiert und dann wurde die Gesamtmenge in 50 μl einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) enthielt. Eine Teilmenge (10 μl) wurde zur Beobachtung der Hemmaktivität auf die Ristocetin vermittelte Aggregation nach der Methode, die unter Punkt <1> beschrieben ist, verwendet. Die Hemmaktivität wurde jedoch nicht beobachtet. Es wurde angenommen, dass dieses Ergebnis erhalten wurde, weil CH-1, das einer reduzierenden Pyridylethylierung nach der zuvor beschriebenen Methode unterzogen wurde, keine Hemmaktivität bei der Ristocetin vermittelten Aggregation hatte, oder weil es folglich eine extrem geringe Löslichkeit in Wasser hatte.
(3) Reduktion von CH-1 mit Mercaptoethanol und Rekonstruktion von Disulfidbindungen
Prozesse zur Reduktion von CH-1 mit Mercaptoethanol und Rekonstruktion von Disulfidbindungen nach der Reduktion mit Redox- (Oxidations-Reduktions-) Puffern unter Verwendung reduzierten und oxidierten Glutathions, wurden wie folgt durchgeführt.
CH-1 (240 μg) wurde in 120 μl einer wässerigen 7M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung, die 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA•Na2) enthielt, aufgelöst und bei 37 °C 10 Minuten gelagert. Eine wässerige 10% Mercaptoethanol-Lösung (1/9 Volumen) wurde der Lösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von Mercaptoethanol von 1% zu erhalten, wonach eine Lagerung über 1 Stunde bei 37 °C folgte. Danach wurden 2 ml einer Lösung (Konzentration von Guanidin-Hydrochlorid: 2 M, in der Folge als "2 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung" abgekürzt), das durch Verdünnen der wässerigen 7M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung, die 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA•Na2) enthielt, um einen Faktor von 2/7 erhalten worden war, zugegeben, wonach eine Ultrafiltrationskonzentration unter Verwendung von Centricon-10 (hergestellt von Amicon) folgte. Die 2 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung (2 ml) wurde der erhaltenen Konzentrationslösung zugegeben, wonach wieder eine Ultrafiltrationskonzentration folgte. Dieser Konzentrationsprozess wurde mehrere Male wiederholt, um Mercaptoethanol zu entfernen. Somit wurde eine 2 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung (380 μl) erhalten, die reduzierte Produkte von CH-1 enthielt.
Die Lösung, die reduzierte Produkte von CH-1 enthielt, wurde in 5 Teilmengen (mit jeweils einem Volumen von 76 μl) geteilt, um einen Prozess zur Rekonstruktion von Disulfidbindungen mit Redox-Puffern unter Verwendung reduzierten und oxidierten Glutathions durchzuführen. Die 2 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung (374 μl) wurde jeder der Teilmenge zugegeben. Es wurden des Weiteren jeweils Lösungen (50 μl), die durch Mischen reduzierten und oxidierten Glutathions in Verhältnissen, die in Tabelle 2 dargestellt sind, erhalten wurden, zugegeben, wonach eine Substitution mit Stickstoff folgte. Danach wurden die Behälter dicht verschlossen, um die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht auszuführen. Tabelle 2
Die oben gezeigten fünf Reaktionslösungen und Lösungen unmittelbar nach der Reduktion mit Mercaptoethanol wurden einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (SSC-VP-304, hergestellt von Sensho Kagaku, Durchmesser: 4,6 m, Länge: 250 mm) unterzogen. Die Analyse wurde durch Aufzeichnen der Extinktion bei 216 nm durchgeführt, während eine Elution unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 10% zu einer Konzentration von 59%, enthaltend 0,1 Trifluoroessigsäure, durchgeführt wurde. In allen Lösungen wurde jedoch kein Peak beobachtet, der von einem erzeugten Peptid stammte.
Es wurde angenommen, dass das zuvor beschriebene Ergebnis erhalten wurde, da CH-1 zu einem reduzierten Produkt mit geringer Löslichkeit infolge der Reduktion mit Mercaptoethanol umgewandelt wurde, und da das reduzierte Produkt nicht zu einer Substanz mit hoher Löslichkeit durch die Oxidations/Reduktionsreaktion umgewandelt wurde, die mit den Redox-Puffern durchgeführt wurde.
(4) Reduktion von CH-1 mit Glutathion
Eine milde reduzierende Reaktion für CH-1 mit Glutathion wurde wie folgt durchgeführt. CH-1 (40 μg) wurde in 2 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung (450 μl), wie zuvor beschrieben, aufgelöst. Danach wurde eine Lösung (50 μl) von reduziertem Glutathion (100 mM), aufgelöst in derselben Zubereitungslösung, zugegeben, wonach sie bei 40 °C 3 Stunden stehen gelassen wurde und anschließend 5 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Die Produktmerkmale wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (SSC-VP318, hergestellt von Senshu Kagaku, Durchmesser: 4,6 mm, Länge: 250 mm) analysiert. Die Elution wurde mit einem Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 10% bis zu einer Konzentration von 80%, enthaltend 0,1% Trifluoroessigsäure, durchgeführt, um die Extinktion bei 216 nm zu beobachten.
3 und 4 zeigen Chromatogramme vor der Zugabe von Glutathion (3) und 5 Tage nach Zugabe von Glutathion (4). Die Gesamtmenge der Reaktionslösung nach der reduzierenden Reaktion mit Glutathion wurde durch dieselbe Chromatographie getrennt, um Peaks 1, 2, 3, die in 4 dargestellt sind, zu fraktionieren und zu sammeln. Jeder der Peaks wurde lyophilisiert und dann wurde die Gesamtmenge in einer wässerigen 0,15 M Natriumchlorid-Lösung (25 μl), enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) aufgelöst. Eine Teilmenge (10 μl) wurde zur Messung der Hemmaktivität auf Ristocetin vermittelte Aggregation nach der unter Punkt <1> beschriebenen Methode verwendet. Als Ergebnis hatten die Peaks 1 und 3 die Hemmaktivität. Peak 3 war jedoch ein Peak des Rohmaterials (CH-1). Laut dem zuvor beschriebenen Ergebnis wurde gezeigt, dass die neue Substanz (Peak 1) durch die zuvor beschriebene Methode erzeugt wurde, wobei die neue Substanz die Hemmaktivität auf Ristocetin vermittelte Aggregation aufwies.
Die Wirkung von Glutathion bei verschiedenen Konzentrationen wurde in Gegenwart von 6 M oder 2 M Guanidin-Hydrochlorid untersucht. CH-1 (36 μg) wurde in 234 μl einer Lösung (die in der Folge als "6 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung" bezeichnet wird) aufgelöst, die durch Verdünnen einer wässerigen 7M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung, die 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA•Na2) enthielt, um einen Faktor von 6/7 erhalten wurde, oder in einer Lösung (die in der Folge als "2 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung" bezeichnet wird) aufgelöst, die durch Verdünnen einer wässerigen 7M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung um einen Faktor von 2/7 erhalten wurde. Zu den Lösungen, die durch Auflösen von CH-1 in der 6 M und 2 M Guanidin-Hydrochlorid-Zubereitungslösung erhalten wurden, wurden Glutathionlösungen (26 μl) mit jeweils zehnfacher Konzentration zugegeben, so dass die Endkonzentration des reduzierten Glutathions 30 mM, 10 mM, 3 mM bzw. 1 mM betrug, und dass die Endkonzentration des oxidierten Glutathions 30 mM betrug. Das Merkmal erzeugter Peaks nach 1, 2, 3, 4 und 7 Tagen wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (SSC-VP318, hergestellt von Senshu Kagaku, Durchmesser: 4,6 mm, Länge: 250 mm) analysiert. Die Elution wurde mit einem Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 24% bis zu einer Konzentration von 59%, enthaltend 0,1% Trifluoroessigsäure, durchgeführt, wobei die Extinktion bei 216 nm beobachtet wurde.
5 zeigt ein Beispiel eines Chromatogramms, das durch diese Analyse erhalten wurde (2 M Guanidin-Hydrochlorid, 10 mM reduziertes Glutathion, 4 Tage). Aufgrund dieses Analysesystems zeigte sich, dass jene, die bei einer Retentionszeit entsprechend Peak 1 in 4 eluierten, zwei Spezies von Substanzen enthielten (entsprechend Peak 1, 2 in 5). Peak 4 war ein Peak des Rohmaterials (CH-1). Erzeugte Mengen der Substanzen, die in Peak 1 und Peak 2 enthalten waren, änderten sich abhängig von der Zeit unter entsprechenden Reaktionsbedingungen, wie in 6 dargestellt ist.
<4> Produktion eines einstrangigen Peptids von CH-1 unter Verwendung reduzierten Glutathions
Destilliertes Wasser (7,39 ml), eine wässerige 7M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung, die 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA•Na2) (3,57 ml) enthielt, und eine wässerige 100 mM reduzierte Glutathion-Lösung (1,25 ml) (hergestellt von Boehringer Mannheim) wurden einer physiologischen Kochsalzlösung von CH-1 (1,3 mg/ml, 290 μl) zugegeben, wonach eine Lagerung bei 28 °C über 5 Tage folgte (Endkonzentration von Guanidin-Hydrochlorid: 2 M).
Die Lösung nach der Lagerung wurde bei 3000 U/min zentrifugiert und ihr Überstand wurde unter Verwendung von Trifluoroessigsäure sauer eingestellt (pH 4 oder geringer). Danach wurde der Überstand auf eine Umkehrphasensäule (Vydac 214TP1022, hergestellt von Vydac, Durchmesser: 22 mm, Länge: 250 mm) bei einer Strömungsrate von 15 ml/min aufgebracht um erzeugte Peptide durch Elution unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 27% bis zu einer Konzentration von 45%, enthaltend 0,1% Trifluoroessigsäure, zu fraktionieren und zu sammeln.
Als Ergebnis wurden die selben Produkte wie jene, die in 5 dargestellt sind, erzeugt. Peak 1 und Peak 2 wurden als AS1051 bzw. AS1052 bezeichnet. Als Ergebnis einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für jedes wurde gezeigt, dass AS1051 ein einstrangiges Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 14 Kilodalton unter einer nicht reduzierten Bedingung und einem Molekulargewicht von etwa 15 Kilodalton unter einer reduzierten Bedingung in Gegenwart von 1% Mercaptoethanol war. Es wurde auch nahegelegt, dass AS1052 ein Homodimer war, das die selben zwei Peptide mit einem Molekulargewicht von etwa 26 oder 15 Kilodalton unter nicht reduzierter bzw. reduzierter Bedingung umfasste.
Die Aminosäuresequenz und die Art der Disulfidbindungen des erhaltenen AS1051 wurden wie folgt bestimmt. Ein 1 M Tris-HCl-Puffer (20 μl), enthaltend 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA), destilliertes Wasser (120 μl), eine wässerige Lösung (10 μl), enthaltend 5 μg Lysylendopeptidase (hergestellt von Wako Pure Chemical) wurden der Reihe nach einer wässerigen Lösung (50 μl) zugegeben, die 50 μg AS1051 enthielt, um eine enzymatische Aufschlussreaktion bei 37°C über 2 Stunden auszuführen. Die Reaktionslösung wurde einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (SSC-VP-318, hergestellt von Senshu Kagaku, Durchmesser: 4,6 mm, Länge: 250 mm) unterzogen, um aufgeschlossene Fragmente abzutrennen, zu fraktionieren und zu sammeln. Danach wurde jedes der aufgeschlossenen Fragmente einer Aminosäuresequenzanalyse unter Verwendung des Protein Sequencers 470A (hergestellt von Applied Biosystems) unterzogen. So wurde die Aminosäuresequenz von AS1051, wie in Seq.-ID Nr. 2 und 7 dargestellt, bestimmt. In dieser Sequenz war die Anzahl von Aminosäureresten um eins geringer und die 39., 85. und 86. Aminosäure waren anders, verglichen mit der α-Kette von CHH-B, die in der internationalen Veröffentlichungsdruckschrift von WO9208472 beschrieben ist.
Drei Fragmente A, B, C, die in 7 dargestellt sind, wurden als ein aufgeschlossenes Fragment erhalten, das durch Disulfidbindungen gebunden war. Daher wurde das Fragment weiter mit Proteinase Glu-C (hergestellt von Boehringer Mannheim) aufgeschlossen. Infolge der Aminosäuresequenzanalyse für erzeugte Fragmente, zeigte sich, dass die Disulfidbindungen zwischen Cys4 und Cys15, zwischen Cys32 und Cys120 und zwischen Cys95 und Cys112 gebildet waren. Diese Bindungsart ist für C-Typ Lectin üblich, einschließlich jener, die von Schlangengift stammen. Daher wird angenommen, dass AS1051 die Art und Weise der ursprünglichen Disulfidbindungen beibehält.
As Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse zeigte sich, dass doppelstrangiges AS1052 ein Homodimer war, das zwei Ketten von AS1051 umfasste.
<5> Vergleich der Blutplättchenaggregation-Hemmaktivitäten unter Verwendung eines doppelstrangigen Peptids (CH-1) und eines einstrangigen Peptids (AS1051)
Die Hemmaktivität des doppelstrangigen CH-1 auf die Blutplättchenaggregation wurde mit jener des einstrangigen Peptids AS1051 verglichen. Frischblut, das von gesunden Menschen gesammelt wurde, dem ein 1/10 Volumen 3,8% Natriumcitrat zugesetzt worden war, wurde bei 900 U/min 15 Minuten zentrifugiert, um ein an Blutplättchen reiches Humanplasma (PRP) zu erhalten, dem diese Peptide zugegeben wurden, um die erhaltene Blutplättchenaggregation-Hemmaktivitäten unter Verwendung des Hematracer-801 (hergestellt von Niko Bioscience) zu messen. Die Messung wurde durch Zugabe von 100 μl Blutplättchen reichem Plasma in eine Küvette, die 12,5 μl einer Peptidlösung enthielt, Rühren derselben bei 37°C über 3 Minuten unter Verwendung eines Rührstabes, und anschließende Zugabe von 12 μl eines Agglutinogens zur Beobachtung durchgehenden Lichts durchgeführt.
Ristocetin (Endkonzentration: 1,2 mg/ml), Botrocetin (1 μg/ml), ADP (3 μM) oder Collagen (10 μg/ml) wurde als Agglutinogen verwendet, um das Aggregations-Hemmverhältnis in Bezug auf eine Kontrollgruppe zu berechnen, der keine Peptidprobe zugegeben wurde. 8 zeigt Hemmaktivitäten von CH-1 und AS1051 auf die Ristocetin induzierte Aggregation und Botrocetin induzierte Aggregation. Für die beiden Peptide (doppelstrangiges Peptid (CH-1) und einstrangiges Peptid (AS1051)) wurde nahezu die selbe Hemmaktivität gegen Ristocetin induzierte Aggregation und Botrocetin induzierte Aggregation beobachtet. Die beiden Peptide zeigten keine Hemmung der Aggregation, die durch ADP und Collagen induziert wurde, selbst bei einer Konzentration von 20 μg/ml, was zeigt, dass sie spezifisch die Aggregation abhängig von der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Glycoprotein Ib hemmten, wie die Ristocetin induzierte Aggregation und Botrocetin induzierte Aggregation.
Es wurde auch gezeigt, dass das doppelstrangige AS1052 etwa die selbe Hemmaktivität hatte wie jene von AS1051.
<6> Vergleich der Anzahl von Bluttlättchen bei Verabreichung eines doppelstrangigen Peptids (CH-1) und eines einstrangigen Peptids (AS1051) an Mäuse
Physiologische Kochsalzlösungen von GH-1 und AS1051 (jeweils 100 μg/kg) und nur eine physiologische Kochsalzlösung als Kontrolle wurden intravenös an Mäuse verabreicht. Blut wurde vom Herzen nach 5 Minuten entnommen, um die Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC), die Anzahl roter Blutkörperchen (RBC) und die Anzahl von Blutplättchen (PLT) in der selben Weise wie unter Punkt <2> zu messen.
Wie in Tabelle 3 dargestellt, verschwanden Blutplättchen nahezu vollständig in der Gruppe der CH-1-Verabreichung (100 μg/kg). Im Gegensatz dazu wurde keine Verringerung der Blutplättchen in der Gruppe der AS1051-Verabreichung (100 μg/kg) beobachtet. Keine Veränderung wurde in der Anzahl von weißen Blutkörperchen (WBC) und in der Anzahl von roten Blutkörperchen (RBC) in beiden Gruppen der CH-1- und AS1051-Verabreichung im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet. In Übereinstimmung mit der zuvor beschriebenen Tatsache wurde bestätigt, dass das einstrangige AS1051 die Verringerung der Blutplättchen nicht verursachte, die bei Verabreichung des doppelstrangigen Peptids CH-1 beobachtet wurde. Tabelle 3
<7> Messung der Anti-Thrombus-Aktvität des einstrangigen Peptids unter Verwendung von Meerschweinchen
Zuerst wurde die Messung der Hemmaktivitäten des einstrangigen Peptids AS1051 auf die Ristocetin induzierte Aggregation und Botrocetin induzierte Aggregation von Blutplättchen reichem Plasma, das von Meerschweinchen erhalten wurde, durchgeführt. Wie in 9 dargestellt, war die Hemmaktivität von AS1051 auf die Ristocetin induzierte Aggregation und Botrocetin induzierte Aggregation von annähernd dem selben Grad wie jene der Werte, die für das Blutplättchen reiche Plasma vom Menschen (8) erhalten wurden.
Danach wurde die Anzahl von Körperchen, wie Blutplättchen, nach der Verabreichung von AS1051 an Meerschweinchen gemessen. Ferner wurde ein exo-vivo Test unter Verwendung Blutplättchen reichen Plasmas durchgeführt, das von Blut hergestellt wurde, das nach der Verabreichung von AS1051 gesammelt wurde, um zu messen, ob die Aggregation gehemmt war oder nicht. AS1051 (200 μg/kg) wurde Meerschweinchen intravenös verabreicht. 5 Minuten nach der Verabreichung wurde arterielles Blut gesammelt, um die Anzahl an weißen Blutkörperchen (WBC), die Anzahl an roten Blutkörperchen (RBC) und die Anzahl an Blutplättchen (PLT) (Tabelle 4) in der selben Weise wie unter Punkt <2> zu messen. Tabelle 4
Die selbe Menge an Rinderserumalbumin (BSA) wurde den verabreichten Zubereitungen von AS1051 zugegeben und jene, denen nur BSA verabreicht wurde, dienten als Kontrollgruppe. In der Anzahl von Blutplättchen usw. wurde im Vergleich zu der Kontrollgruppe keine Veränderung in der Gruppe beobachtet, der AS1051 verabreicht wurde. Blutplättchen reiches Plasma wurde aus dem Blut hergestellt, um die Merkmale der Ristocetin induzierten Aggregation und Botrocetin induzierten Aggregation unter Verwendung der selben Methode wie zuvor beschrieben (10) zu messen. Die Beobachtung erfolgte durch Änderung der Menge an zugesetztem Ristocetin. Es wurde gezeigt, dass die Aggregation in der Gruppe mit AS1051-Verabreichung selbst bei einer Ristocetin-Konzentration, bei welcher die Kontrollgruppe vollständig die Aggregation verursachte, nahezu vollständig gehemmt war. In Bezug auf die Beotrocetin induzierte Aggregation wurde das selbe Ergebnis erhalten.
Gemäß den zuvor beschriebenen Ergebnissen wurde gezeigt, dass AS1051 die Anzahl von Blutplättchen bei intravenöser Verabreichung an Meerschweinchen in einer Menge von 200 μg/kg in der selben Weise wie zuvor unter Punkt <5> beschrieben (Verabreichung an Mäuse) nicht beeinflusste, und dass eine ausreichende Konzentration von AS1051 im Blut beibehalten wurde, um die Ristocetin induzierte Aggregation und Botrocetin induzierte Aggregation zu hemmen.
Danach wurde die Anti-Thrombus-Aktivität von AS1051 in vivo unter Verwendung eines Tier-Thrombose-Modells bewertet. Ein optisch stimuliertes Thrombus-Modell, das von Matsuno et al. (Matsuno et al., Blood and Circulation (Ketsueki-to-Jyunkan), 4, S. 20–33 (1990)) berichtet wurde, wurde als Thrombose-Modell verwendet.
Die Halsschlagader jedes der Meerschweinchen wurde abgeschält, um eine Doppler-Blutflusssonde einzuführen. Eine Xenonlampen-Lichtquelle wurde an einer Position bereitgestellt, die etwa 5 mm stromaufwärts des mit der Sonde versehenen Blutgefäßes lag. Eine Probe von AS1051 mit BSR (die BSA-Menge war die selbe wie die Menge an AS1051) oder eine Probe, die nur BSA als Kontrolle enthielt, wurde Meerschweinchen intravenös verabreicht. Nach 5 Minuten wurde eine Rose-Bengal-Lösung (10 mg/kg) intravenös verabreicht. Gleichzeitig wurde ein Lichtstrahl von 540 nm ausgestrahlt, um die Blutgefäßwände zu beschädigen. Somit wurde die Zeit bis zum Anhalten des Blutflusses unter Verwendung eines Puls-Doppler-Blutflussmessers gemessen. Wie in 11 dargestellt, war die Zeit bis zum Anhalten des Blutflusses in der Gruppe mit verabreichtem AS1051 (200 μg/kg) im Vergleich zu der Kontrollgruppe deutlich länger, was zeigt, dass AS1051 die Anti-Thrombus-Aktivität hatte (p <0,01).
Beispiel 2: Herstellung von einstrangiem Anti-Thrombus-Peptid durch Escherichia coli
Zur Herstellung des Peptids der vorliegenden Erfindung unter Verwendung genetischer Manipulationstechniken wurde ein Gen, das für das Peptid mit der Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen codiert, von Crotalus horridus horridus isoliert und in Escherichia coli exprimiert.
<1> Herstellung einer cDNA-Bibliothek von Crotalus horridus horridus
(1) Extraktion der mRNA von Crotalus horridus horridus
Eine Giftdrüse von Crotalus horridus horridus wurde exzidiert. Sie wurde sofort mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung gelagert. Die Giftdrüse (1,7 g) wurde mit dem Polytron Homogenizer (hergestellt von Kinematica) in 20 ml einer RNA-Extraktionslösung (4 M Guanidium-isothiocyanat-hydrochlorid, 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1% β-Mercaptoethanol, 0,1 Laurylsarcosyl-Natriumsalz) aufgebrochen. Die aufgebrochene Suspension wurde bei 10 000 × G 10 Minuten zentrifugiert, um unlösliche Stoffe zu entfernen. Danach wurde ein Überstand auf eine gleiche Menge eines Dichte-Äquilibrierungspuffers (4 M Cäsiumchlorid, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz, pH 7,5) in einem Ultrazentrifugationsglas gelegt und bei 30 000 U/min bei 20°C für 18 Stunden zentrifugiert, um 600 μg der Gesamt-RNA abzutrennen.
mRNA wurde von der Gesamt-RNA unter Verwendung eines POLY(A)-QUICK mRNA Extraktionskits (hergestellt von Stratagene) nach einem Protokoll des Kits hergestellt. Das heißt, ein Teil der erhaltenen Gesamt-RNA (500 μg) wurde an einer Oligo-dT-Säule adsorbiert. Die Säule wurde zweimal mit einem höheren Salzpuffer (200 μl) und dreimal mit einem niedereren Salzpuffer (200 μl) gewaschen. Danach wurde ein Elutionspuffer (200 μl) viermal durch die Säule bei 65 °C geleitet, um mRNA (10 μg) abzutrennen und zu reinigen.
(2) Synthese von cDNA
cDNA wurde unter Verwendung eines Time Savor DNA-Synthesekits (hergestellt von Pharmacia) nach dem Protokoll des Kits synthetisiert. Das heißt, die gereinigte mRNA (3 μg) wurde mit einer Erststrang-Reaktionslösung gemischt, die Zufalls-Hexamer-Primer (0,3 μg), 1 mM Dithiothreitol und reverse Transcriptase enthielt, gefolgt von einer Reaktion bei 37°C über 1 Stunde zum Synthetisieren eines ersten Strangs.
Die Reaktionslösung wurde mit einer Zweitstrang-Reaktionslösung gemischt, die Escherichia coli RNase H und und Escherichia coli DNA Polymerase enthielt, gefolgt von Reaktionen bei 12°C über 30 Minuten und bei 22°C über 1 Stunde zur Synthetisierung von cDNA. Die Inkubation wurde des Weiteren bei 65°C über 10 Minuten durchgeführt. Danach wurde die Reaktionslösung mit Phenol/Chloroform zur Inaktivierung der Enzymaktivität behandelt. Danach wurde eine Gelfiltrationsspannensäule, die an dem Kit befestigt war, zur Durchführung einer Zentrifugation bei 400 × G über 2 Minuten verwendet. Somit wurden unreagierte Primer entfernt, um doppelstrangige cDNA (3 μg) zu erhalten.
(3) Herstellung einer cDNA-Bibliothek
Ein EcoRI/NotI-Adapter, der an dem Time Savor DNA-Kit befestigt war, wurde an beide Enden der doppelstrangigen cDNA, die wie zuvor beschrieben erhalten worden war, nach einem Protokoll des Kits ligiert. Das heißt, cDNA (3μg), der EcoRI/NotI-Adapter (3 μl), ein Polyethylenglycolpuffer (30 μl), eine ATP-Lösung (1 μl) und T4 DNA-Ligase (1 μl) wurden gemischt, um eine Ligationsreaktion bei 16°C über 1 Stunde durchzuführen. Die Reaktionslösung wurde des Weiteren bei 65°C 10 Minuten zur Inaktivierung der Enzymaktivität inkubiert. Danach wurden eine ATP-Lösung (1,5 μl) und T4-Polynucleotidkinase (1 μl) zugegeben und bei 37 °C 30 Minuten zur Reaktion gebracht, um das 5'-Ende des Adapters zu phosphatisieren. Danach wurde die Reaktionslösung bei 65 °C 10 Minuten inkubiert und mit Phenol/Chloroform zur Inaktivierung der Enzymaktivität behandelt. Danach wurde eine Gelfiltrationsspannensäule, die an dem Kit befestigt war, zur Durchführung einer Zentrifugation bei 400 × G über 2 Minuten verwendet. Somit wurde der unreagierte Adapter entfernt.
cDNA mit den an beiden Enden ligierten Adaptern wurde mit einer EcoRI-Stelle eines Lambda-Phage-Vektors λZAPII (hergestellt von Stratagene) ligiert, um rekombinante Phage-DNA herzustellen. Das heißt, λZAPII/EcoRI/CIAP-Arm (1 μg) und ein Ligationspuffer (100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM Magnesiumchlorid, 300 mM Natriumchlorid) wurden zu 400 ng cDNA mit den ligierten Adaptern zugegeben, zu dem eine Enzymlösung (B-Lösung, hergestellt von Takara Shuzo, Ligation Kit), die T4 DNA Ligase enthielt, in gleicher Menge zugegeben wurde, um ein Ligationsreaktion bei 26 °C über 10 Minuten durchzuführen.
Rekombinante Phage-DNA, die wie zuvor beschrieben erhalten worden war, wurde unter Verwendung eines Verpackungskits GIGAPACKII GOLD (hergestellt von Stratagene) nach einem Protokoll des Kits verpackt. D.h., λZAPII-Arm-DNA (3 μg), ligiert mit der zuvor beschriebenen cDNA wurde mit einer Verpackungsextraktionslösung des Kits gemischt, um die Verpackung durch Ausführen einer Reaktion bei 22 °C über 2 Stunden durchzuführen. Diese Reaktionslösung wurde mit 500 μl einer Phage-Verdünnungslösung (0,58% Natriumchlorid, 0,2% Magnesiumsulfat, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,01 Gelatine) zugegeben.
Der Titer des erhaltenen rekombinanten Phage wurde geprüft. Danach wurde eine Phage-Bibliothek unter Verwendung einer halben Menge der Phage-Verpackungsreaktionslösung und unter Verwendung von Escherichia coli XL-1 Blue (hergestellt von Stratagene) als Rezipient hergestellt. Das heißt, 10 Platten mit einem Durchmesser von jeweils 150 mm, die ein Plaque-Bildungsmedium (Bactotryptone 1%, Hefeextrakt 0,5%, Natriumchlorid 0,5%, Magnesiumsulfat 1 mM, Maltose 0,2%) enthielten, wurden hergestellt. Der mit der Phage-Verdünnungslösung verdünnte Phage und der Rezipient wurden auf die 10 Platten ausgestrichen, so dass 20 000 Plaques pro einer Platte gebildet wurden, wonach eine Kultivierung bei 37°C über 12 Stunden folgte, um die Bibliothek des rekombinanten Phage zu erhalten.
<2> Herstellung einer Sonden-DNA zur Isolierung des gegenständlichen Gens
(1) Amplifizierung eines Teilfragments des egenständlichen Gens durch die RT-PCR-Methode
Die Gesamt-RNA von Crotalus horridus horridus wurde als Material zum Amplifizieren von DNA, die für das Peptid codiert, das zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen imstande ist, nach der RT-PCR-Methode verwendet.
Basierend auf der Aminosäuresequenz des in Seq.-ID Nr. 2 dargestellten Peptids wurden seine Abschnitte mit einer geringeren Degeneriertheit der Codons zur Herstellung von Primern für die RT-PCR- ("reverse transcription polymerase chain reaction") verwendet. Die Primer wurden chemisch von einer damit betrauten Firma, Biologica, chemisch synthetisiert. Seq.-ID Nr. 4 und 5 zeigen Nucleotidsequenzen dieser Primer. In Seq.-ID Nr. 4 jedoch sind das 3. und 6. Nucleotid Mischungen von A und G und das 12. Nucleotid ist eine Mischung von T, C, A und G. In Seq.-ID Nr. 5 ist das 3. Nucleotid eine Mischung aus T, C, A und G, das 6. und 15. Nucleotid sind Mischungen aus T und C und das 9. Nucleotid ist eine Mischung aus A und G.
Die RT-PCR wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen Primer für die Gesamt-RNA von Crotalus horridus horridus durchgeführt, die auf die selbe Weise wie zuvor beschrieben hergestellt wurde. Zur Synthetisierung eines ersten Strangs wurde die Gesamt-RNA (5 μg) mit reverser Transcriptase SUPERSCRIPT II (hergestellt von GIBCO) (2,5 μl), einem Erststrangpuffer (20 μl), der an die Enzymlösung angelagert war, 0,1 M Dithiotreitol (10 μl) und 10 mM dNTP (5 μl) gemischt. Eine Reaktion wurde bei 42 °C über 1 Stunde zur Synthetisierung des ersten Strangs ausgeführt. Die Reaktionslösung wurde bei 95 °C 5 Minuten zur Inaktivierung der reversen Transcriptase inkubiert. Danach wurde der erste Strang als Matrize zur Durchführung des PCR-Prozesses verwendet. Das heißt, die Erststrang-Reaktionslösung (5 μl), ein PCR-Reaktionspuffer (10 μl), 10 mm dNTP (5 μl), die Primer (jeweils 800 pmol), Taq-Polymerase (10u) wurden gemischt, um eine Reaktion über 25 Zyklen unter Verwendung des DNA Thermal Cycler (hergestellt von Perkin-Elmer) durchzuführen, wobei ein Zyklus Perioden von 0,5 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 52 °C und 2 Minuten bei 72 °C umfasste.
Die PCR-Reaktionslösung wurde einer 2 Agarose-Gelelektrophorese zur Analyse der amplifizierten DNA unterzogen. Als Ergebnis wurde eine DNA-Bande an einer Position von etwa 300 Basenpaaren beobachtet.
(2) Bestimmung der Nucleotidsequenz des am lifizierten Fragments
Das wie zuvor beschrieben amplifizierte DNA-Fragment wurde in ein Plasmid unter Verwendung eines pCR-ScriptSK(+)-Clonierungskits (hergestellt von Stratagene) nach einem Protokoll des Kits subcloniert. Das heißt, die PCR-Reaktionslösung wurde zugegeben und mit einem Ligationspuffer, 1 mM ATP, pCRscript (hergestellt von Stratagene) als Vektor (10 ng), Restriktionsenzym SrfI (5 Einheiten) und T4 DNA-Ligase gemischt, um eine Ligationsreaktion bei 25 °C über 1 Stunde auszuführen. Danach wurde die Reaktionslösung bei 65 °C über 10 Minuten zur Inaktivierung der Ligase inkubiert. Dieses Reaktionsprodukt wurde zur Transformation von E. coli DH5α durch die kompetente Zellmethode verwendet, gefolgt von einem Ausstreichen auf einer L-Ap-Platte (Bactrotryptone 1%, Hefeextrakt 0,5%, Natriumchlorid 0,5%, Natriumampicillin 100 μg/ml) zur Durchführung einer Kultivierung bei 37°C über 18 Stunden. Bakterielle Zellen, die Kolonien bildeten, wurden von der Platte abgetrennt und ein Teil davon in einem flüssigen Medium zur Herstellung eines Plasmids nach der alkalischen Methode ("Molecular Cloning", 2. Ausgabe, Band 1, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Press) kultiviert. Dieses Plasmid wurde als pCHASonde bezeichnet.
Die Nucleotidsequenz des geclonten Fragments der pCHASonde wurde durch die Farbstoff-Terminatormethode unter Verwendung von M13M4 oder M13 revers (hergestellt von Takara Shuzo) als Primer und unter Verwendung des DNA Sequencers A373 (hergestellt von Applied Biosystems) nach der Gebrauchsmethode des Sequencers analysiert. Als Ergebnis umfasste das geclonte DNA-Fragment 272 Basenpaare und hatte eine Nucleotidsequenz, die in Seq.-ID Nr. 6. dargestellt ist. Als die Sequenz in Aminosäuren translatiert wurde, entsprachen die Aminosäuren jenen eines Teils des gegenständlichen Peptids. Daher war es möglich zu zeigen, dass das erhaltene geclonte Fragment ein Teil des gegenständlichen Gens des Peptids AS1051 war.
(3) Markierung der Sonde
Die pCHASonde wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und BamHI an entsprechenden Stellen aufgeschlossen, die an beiden Enden des geclonten Insertfragments vorlagen. Ein DNA-Fragment mit einer Größe von 340 Basenpaaren wurde durch 2% Agarose-Gelektrophorese abgetrennt. DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Gewinnungskits (Takara EASYTRAP, hergestellt von Takara Shuzo) nach einem Protokoll des Kits gewonnen. Diese DNA (25 ng) wurde mit Radioisotop unter Verwendung von [α-³²P]dCTP und einem Zufallsprimermarkierungskit (hergestellt von Takara Shuzo) markiert. Unreagiertes [α-³²P]dCTP wurde von der Markierungsreaktionslösung unter Verwendung einer Nick-Säule zur Gelfiltration (hergestellt von Pharmacia) entfernt, um eine markierte Sonde zu erhalten.
<3> Herstellung des gegenständlichen Gens durch Plaque-Hybridisierung
Ein Gen, das für eine gesamte Länge des AS1051-Peptids codiert, wurde in der cDNA-Phage-Bibliothek nach der Plaque-Hybridisierung unter Verwendung der zuvor beschriebenen Sonde gescreent.
Plaques der αZAPII cDNA-Phage-Bibliothek wurden auf einer Platte wie zuvor beschrieben gebildet. Die Plaques wurden von der Platte auf ein Nylonfilter Highbond-N (hergestellt von Amersham) nach einer an dem Filter angebrachten Anleitung übertragen. Das Filter wird alkalisch behandelt, um eine Lyse des Phagen zu erreichen. Danach wurde die Phage-DNA an dem Filter durch Backen bei 80 °C über 2 Stunden immobilisiert.
Das Filter wurde mit der ³²P-markierten Sonde (1 × 10⁶ cpm/ml) bei 37 °C 16 Stunden in einer Lösung hybridisiert, die 5 × SSPE-Puffer (20 × SSPC: 3,6 M Natriumchlorid, 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,7, 20 mM EDTA-Dinatriumsalz), 30% Formamid, 5 × Denhardt-Lösung (100 × Denhardt Lösung: 2% Rinderserumalbumin, 2 Ficoll 400, 2% Polyvinylpyrrolidon) und 0,5% SDS enthielt. Danach wurde das Filter zweimal bei Raumtemperatur in 6 × SSC (20 × SSC: 3 M Natriumchlorid, 0,3 M Trinatriumcitrat) und 0,1% SDS gewaschen und wurde des Weiteren zweimal bei 50 °C in 2 × SSC und 0,1% SDS gewaschen, um die Sonde zu entfernen, die nicht-spezifisch an das Filter gebunden war. Ein Röntgenfilm HP20 (hergestellt von Fuji Photo Film) wurde mit dem Filter bei -80°C über 24 Stunden bestrahlt. Clone, die positiven Flecken auf dem Film entsprachen, wurden von der Phage-Platte isoliert, um positive Clone im primären Screening bereitzustellen. Ein ähnlicher Screeningvorgang wurde wiederholt, um positive Clone zu erhalten, die einzelne Plaques bildeten.
Die λZAPII-cDNA-Phagen der erhaltenen positiven Clone wurden mit einem Helfer-Phage ExAssist (hergestellt von Stratagene) infiziert. SOLR-Zellen (hergestellt von Stratagene), die als Nicht-Amber-Suppressor Escherichia coli bereitgestellt wurden, wurden damit infiziert. Somit wurden Stränge von Escherichia coli erhalten, die Plasmide beherbergten, die das cDNA-Fragment enthielten, das in eine EcoRI-Stelle eines Plasmids pBluescriptSK(-) (hergestellt von Stratagene) insertiert war. Die Plasmide wurden aus Zellen dieser Stränge nach der alkalischen SDS-Methode hergestellt. Die Nucleotidsequenz des insertierten Fragments wurde unter Verwendung des DNA Sequencers A373 (hergestellt von Applied Biosystems) bestimmt.
Als Ergebnis hatten vier positive Clone Nucleotidsequenzen, die für das gegenständliche Peptid codierten. Die beherbergten Plasmide wurden als pCHA1, pCHA2, pCHA3 bzw. pCHA4 bezeichnet. E. Coli, die pCHA1 (HB101/pCHA1, E. Coli AJ13023) enthielt, wurde international unter einer Hinterlegungsnummer FERM BO-4781 gemäß dem Budapester Vertrag seit 12. August 1994 im National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministry of International Trade and Industry (Postleitzahl: 305, 1-3 Higashi-Icchome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) hinterlegt. Seq.-ID Nr. 7 in der Sequenzliste zeigt eine Nucleotidsequenz des Gens, das für das AS1051-Peptid codiert, das wie zuvor beschrieben geclont wurde. Seq.-ID Nr. 8 zeigt eine Aminosäuresequenz des Peptids, das von dem Gen codiert wird. Dieses Gen hatte ein typisches Sezernierungssignal, das 22 Aminosäuren einschließlich Methionin als eine Aminosäure zur Auslösung einer Translation und folgende Aminosäuren enthielt.
<4> Expression und Produktion des AS1051-Peptids unter Verwendung von Escherichia coli als Wirt und Herstellung des aktiven Pe tids
(1) Konstruktion des Escherichia coli Expressions lasmids pCHAT7
Das DNA-Fragment, das für das AS1051-Peptid codiert, das wie zuvor beschrieben erhalten wurde, wurde in ein Plasmid pGEMEX-1 (hergestellt von Promega) eingeführt, das den T7-Promotor enthielt, um ein Expressionsplasmid für Escherichia coli zu konstruierten (siehe 12).
Zunächst wurde zur Erleichterung der folgenden Operationen eine NdeI-Spaltungsstelle weit weg vom T7-Promotor aus zwei Restriktionsenzym-NdeI-Spaltungsstellen gewählt, die in pGEMEX-1 vorhanden sind, und wurde delektiert, um ein Plasmid herzustellen. Das heißt, pGEMES-1 wurde mit NdeI teilweise aufgeschlossen. Die aufgeschlossenen Enden wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kits (hergestellt von Takara Shuzo) an den Enden abgestumpft. Kreisförmige Plasmide wurden wieder unter Verwendung des Ligation Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gebildet. Die erhaltenen Plasmide wurden zur Transformation von Escherichia coli verwendet. Ein Plasmid mit nur einer NdeI-Spaltungsstelle, die an der konkreten Position vorlag, wurde von den Transformanten erhalten, die als pGEMEX (Nde1) bezeichnet wurde.
Das zuvor beschriebene pCHA1 und pGEMEX(Ndel) wurden mit Restriktionsenzymen NdeI und SacI aufgeschlossen, um DNA-Fragmente von 100 Basenpaaren bzw. 3,2 Kilobasenpaare durch Agarose-Gelelektrophorese zu extrahieren. Das DNA-Fragment mit 100 Basenpaaren, das von pCHA1 stammte, enthielt eine 3'-Endregion (entsprechend den Nucleotiden Nummer 490 bis 558 in Seq.-ID Nr. 7) des Gens, das für das AS1051-Peptid codiert.
Eine Ligationsreaktion für dieses DNA-Fragment wurde unter Verwendung des Ligation Kits (hergestellt von Takara Shuzo) durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 verwendet. Ein rekombinantes Plasmid pCHA(NS) wurde von Transformanten erhalten, die auf einer ampicillinhaltigen Platte abgetrennt wurden.
Danach wurde eine 5'-Endregion (entsprechend den Nucleotiden Nummer 135 bis 489 in Seq.-ID Nr. 7) des Gens, das für das AS1051-Peptid codiert, in das erhaltene Plasmid pCHA(NS) eingesetzt, um ein Plasmid zur Expression und Produktion des AS1051-Peptids in Escherichia coli zu konstruieren.
Zur Eingliederung der 5'Endregion des Gens, das für das AS1051-Peptid codiert, in pCHA(NS), wurden DNR-Primer zum Amplifizieren der Region nach der PCR-Methode synthetisiert. In dieser Prozedur, wie für den Primer für die 5'-Endseite, wurde ein Primer, der eine NdeI-Erkennungssequenz (CHANdeI-Primer: Seq.-ID Nr. 9) enthielt, verwendet, so dass das 5'-Ende eines amplifizierten Fragments eine NdeI-Stelle hatte. Dieser Primer hatte auch eine Nucleotidsequenz ATG als Translationsinitiationssignal (Nucleotide Nummer 9 bis 11 in Seq.-ID Nr. 9) vor einem Codon der Asparaginsäure als Nterminale Aminosäure des AS1051-Peptids an der 5'-Endseite. Es wird festgehalten, dass das Initiationscodon die NdeI-Erkennungssequenz (Nucleotide Nummer 6 bis 11 in Seq.-ID Nr. 9) überlappt.
In Bezug auf den Primer für die 3'-Endseite wurde ein Primer, der eine HindIII-Erkennungssequenz (CHAHindIII: Seq.-ID Nr. 10, die HindIII-Erkennungssequenz entspricht den Nucleotiden Nummer 10 bis 15) hinsichtlich der Konstruktion eines Expressionsplasmids verwendet, das für ein Expressionssystem für kultivierte Insektenzellen, wie in der Folge beschrieben, verwendet wurde.
Das Gen, das für das AS1051-Peptid codiert, wurde nach dem PCR-Prozess unter Verwendung der zuvor beschriebenen Primer amplifiziert. Der PCR-Prozess wurde über 25 Zyklen wiederholt, wobei ein Zyklus Perioden von 15 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 50 °C und 2 Minuten bei 72°C umfasste. Die PCR-Reaktionslösung wurde mit Phenol/Chloroform zur Inaktivierung der Tag-Polymerase behandelt. Das amplifizierte DNA-Fragment, das 400 Basenpaare umfasste, wurde nach der Ethanolausfällungsmethode gereinigt und dann mit dem Restriktionsenzym NdeI aufgeschlossen. Dieses DNA-Fragment wurde mit pCHA(NS) ligiert, das mit dem Restriktionsenzym NdeI unter Verwendung des Ligation Kits (hergestellt von Takara Shuzo) aufgeschlossen worden war. Ein erhaltenes Plasmid wurde zur Transformation des E. coli HB101 Strangs nach der kompetenten Zellmethode verwendet. Ein Transformant wurde 16 Stunden auf einer ampicillinhaltigen Platte kultiviert.
Aus dem gezüchteten Transformanten wurde ein Plasmid nach der alkalischen SDS-Methode hergestellt. Die Nucleotidsequenz wurde unter Verwendung eine T7-Primers und eines SP6-Primers {hergestellt von Stratagene) und unter Verwendung des DNA Sequencers A373 (hergestellt von Applied Biosystems) bestimmt. So wurde bestätigt, dass der gegenständliche AS1051-Peptid-Expressionsvektor konstruiert war. Der konstruierte Expressionsvektor wurde als pCHAT7 bezeichnet. Der zuvor beschriebene Plasmidkonstruktionsprozess ist in 12 dargestellt.
(2) Herstellung eines Peptids durch Escherichia coli
Zur Herstellung des A51051-Peptids durch Escherichia coli unter Verwendung des AS1051-Peptid-Expressionsvektors pCHAT7 wurde E. coli JM109(DE3) (hergestellt von Promega) mit pCHAT7 nach der kompetenten Zellmethode transformiert und bei 25°C 2 Tage auf einer ampicillinhaltigen Platte kultiviert, um einen das Plasmid beherbergenden Strang zu selektieren. Es wird festgehalten, dass E. coli JM109(DE3) ein Strang mit einem RNA-Polymerasegen von T7 Phage ist, der stromabwärts des lacUV5-Promoters gebunden ist, der zur effizienten Expression nur des T7-Promoters konstruiert ist, so dass die Transcription durch den lacUV5-Promotor bei Zugabe von IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid) induziert wird, um RNA-Polymerase von T7-Phage zu erzeugen. Daher exprimiert der das Plasmid beherbergende Strang das AS1051-Peptid effizient.
E. coli JM109(DE3)/pCHAT7, der das Expressionsplasmid beherbergt, wurde auf 10 Sakaguchi-Kolben mit jeweils einem Volumen von 500 ml, die 100 ml eines LB-AP-Mediums (1% Bactotryptone, 0,5% Hefeextrakt, 0,5 Natriumchlorid, 100 μg/ml Ampicillin) geimpft und bei 30°C 16 Stunden unter Schütteln inkubiert. Das induzierende Agens IPTG wurde dem Medium zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erhalten, um die Kultivierung bei 37 °C 4 Stunden unter Schütteln weiter fortzusetzen. Nach der Kultivierung wurden bakterielle Zellen durch Zentrifugation gesammelt und dann in 100 ml eines Puffers (30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz), 30 mM Natriumchlorid) suspendiert, um die bakteriellen Zellen zu waschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugation gesammelt und in 20 ml eines Zellaufbruchpuffers (0,5 M EDTA, pH 8) suspendiert. Eiweiß- Lysozym (20 mg) wurde dieser Suspension zugegeben, um sie bei 0°C 1 Stunde zu behandeln, um die Zellwände der Zellen aufzubrechen. Die Suspension wurde weiter aufgebrochen und mit einem Ultraschall-Rufbrecher Insonator 200M (hergestellt von Kubota) bei 180 W 10 Minuten behandelt. Eine unlösliche Fraktion der Zellen (Einschlusskörper) wurde durch Zentrifugieren der aufgebrochenen Suspension bei 6000 U/min über 20 Minuten erhalten.
(3) Löslichmachen und Aktivieren der Einschlusskörper
Einschlusskörper, die von 1 Liter Kulturflüssigkeit erhalten wurden, wurden in 7 M Guanidin-Hydrochloridlösung (28,6 ml), enthaltend 10 mM EDTA und 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5), aufgelöst, und 71,4 ml destilliertes Wasser wurde zugegeben, wonach eine Lagerung bei 4 °C über 2 Tage folgte, um eine Oxidation mit Luft durchzuführen. Danach wurde diese Lösung durch Zugabe von 0,5 ml Trifluoroessigsäure angesäuert und dann wurden unlösliche Stoffe durch Zentrifugation entfernt. Ein Überstand wurde fraktioniert und durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule (Vydac 214TP1022, hergestellt von Vydac) gesammelt, um rekombinantes AS1051 (9,0 mg) zu erhalten. Das erhaltene gereinigte Peptid wies bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese das selbe Molekulargewicht auf wie jenes von AS1051, das in Beispiel 1 <4> beschrieben ist. Die Hemmaktivität auf die Blutplättchenaggregation wurde für das erhaltene rekombinante AS1051 unter Verwendung der selben Methode wie in Beispiel 1 <5> beschrieben ungefähr gemessen. Als Ergebnis war die ADP induzierte Aggregation und die Collagen induzierte Aggregation nicht gehemmt, während sich im Vergleich zu AS1051, das in Beispiel 1 <4> erhalten wurde, äquivalente Hemmakti vitäten bei der Ristocetin induzierten Aggregation und Botrocetin induzierten Aggregation zeigten.
Die Aminosäuresequenz des rekombinanten AS1051, das wie zuvor beschrieben erhalten wurde, wurde wie folgt bestimmt. Einer Lösung (450 ml) aus 2 mM EDTA und 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), enthaltend 500 μg des rekombinanten AS1051, wurde 1 μl 4-Vinylpyridin zugesetzt und des Weiteren 15 μg Lysylendopeptidase (hergestellt von Wako Pure Chemical) zugesetzt, um einen enzymatischen Aufschluss bei 37 °C über 3 Stunden durchzuführen. Das aufgeschlossene Produkt wurde auf die selbe Weise, wie in Beispiel 1 <4> beschrieben, einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen, um aufgeschlossene Fragmentpeptide zu fraktionieren. Als Ergebnis der Aminosäuresequenzanalyse für jedes der aufgeschlossenen Fragmentpeptide wurde bestätigt, dass das rekombinante AS1051 eine Aminosäuresequenz hatte, die durch die Sequenz von AS1051, dargestellt in Seq.-ID Nr. 2, und einen Methioninrest gebildet wurde, der an den Aminoterminus gebunden war. In Bezug auf die Art von Disulfidbindungen wurde das Vorhandensein einer Disulfidbindung zwischen Cys4 und Cysl5 durch Massenspektrometrie für ein Fragmentpeptid, das beide Reste enthielt, bestätigt. Ferner wurde das Vorhandensein von Disulfidbindungen zwischen Cys32 und Cys120 und zwischen Cys95 und Cys112 durch enzymatischen Aufschluss der Fragmentpeptide, welche die Fragmente A, B, C, die in 7 dargestellt sind, vernetzt durch Disulfidbindungen umfassten, unter Verwendung der V8-Protease (hergestellt von Wako Pure Chemicals) (3 μg V8-Protease in 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung) und Analysieren der Aminosäuresequenzen von Fragmentpeptiden, die durch HPLC unter Verwendung der Umkehrphasensäule auf die selbe Weise, wie in Beispiel 1 <4> beschrieben, getrennt wurden, bestätigt.
Die Verringerung der Blutplättchen wurde nicht beobachtet, wenn das erhaltene rekombinante AS1051 Mäusen in einer Menge von 1000 μg/kg intravenös verabreicht wurde.
Beispiel 3: Herstellung von einstrangigem Anti-Thrombus-Peptid durch ein Baculovirus/kultivierte Insektenzellen-Expressionssystem
Das einstrangigen Anti-Thrombus-Peptid wurde durch Exprimieren des AS1051-Gens, das in Beispiel 2 erhalten wurde, in einem kultivierten Insektenzellen-Expressionssystem hergestellt.
<1> Konstruktion des Baculovirus AS1051-Expressionsvektors
Ein Baculovirus-Expressionssystem wurde unter Verwendung eines MaxBac Baculovirus-Expressionssystems (hergestellt von Invitrogen) konstruiert (siehe 13). Das heißt, pCHA1, das in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde mit einem Restriktionsenzym EcoRI aufgeschlossen und seine Enden wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kits (hergestellt von Takara Shuzo) nach dem Protokoll des Kits stumpf gemacht. Dieses Fragment wurde des Weiteren mit einem Restriktionsenzym PstI aufgeschlossen und die aufgeschlossenen Produkte wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment mit 400 Basenpaaren zu gewinnen. Andererseits wurde ein Expressionsvektor pBlueBacIII mit einem Restriktionsenzym HindIII aufgeschlossen und seine Enden wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kits stumpf gemacht. Dieses Fragment wurde des Weiteren mit einem Restriktionsenzym PstI aufgeschlossen und die aufgeschlossenen Produkte wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment mit 10,3 Kilobasenpaaren zu gewinnen. Diese gewonnenen Fragmente wurden unter Verwendung des Ligation Kits ligiert und E. coli HB101 wurde damit nach der kompetenten Zellmethode transformiert, um einen Transformanten auf einer ampicillinhaltigen Platte zu selektieren. Das konstruierte Plasmid wurde als pCHAbac bezeichnet. Die Konstruktion des Plasmids ist in 13 dargestellt.
<2> Transformation kultivierter Insektenzellen (Sf9 Stamm) mit pCHAbac und Herstellung eines rekombinanten Virus
Kultivierte Insektenzellen wurden transformiert und ein rekombinantes Virus wurde nach dem Protokoll des MaxBac Baculovirus-Expressionssystems (hergestellt von Invitrogen) erhalten. Das heißt, DNA (1 μg) eines Wildtypnuclearen Polyhedrose-Virus (Autographa californica nuclearer Polyhedrose-Virus: AcMNPV) und pCHAbac (3 μg) wurde in kultivierte Insektenzellen (Spodoptera frugiperda 9 Stamm (Sf9 Stamm)) nach der Liposom-Methode eingeführt. Die Zellen mit eingeführtem Virus wurden in einer TNM-FH (FNS+) Kulturflüssigkeit (hergestellt von Invitrogen) bei 27 °C 48 Stunden kultiviert. Danach wurde die Kulturflüssigkeit zurückgewonnen, um eine Viruslösung zu erhalten.
Kultivierte Insektenzellen (Sf9 Stamm) wurden mit der Viruslösung infiziert und bei 27°C 7 Tage auf einem FNM-FH (FBS+) weichen Agarmedium kultiviert, das 150 μg/ml X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid) enthielt. Zellen (blaue Farbe), die mit einem Virus infiziert waren, das eine Rekombination zwischen dem Wildtyp AcMNPV und pCHAbac erfahren hatte, wurden selektiert. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Pasteur-Pipette von der Platte entfernt und die Sf9-Zellen wurden nach einer geeigneten Verdünnung wieder damit infiziert. Der Reinigungsprozess, wie zuvor beschrieben, wurde zweimal durchgeführt, um eine Viruslösung zu erhalten, in der nur das rekombinante Virus vorhanden war.
<3> Expression des AS1051-Peptids durch das Baculovirus/kultivierte Insektenzellen-Expressionssystem
Das AS1051-Peptid wurde unter Verwendung des rekombinanten Virus exprimiert. Sf9 Zellen (6 × 10⁶ Zellen) wurden auf 10 ml einer FNM-FH (FBS+) Kulturflüssigkeit in einem Kolben für Zellkultur (NUNCLON 260 ml, Bodenfläche: 75 cm², hergestellt von Nunc) geimpft und das gereinigte rekombinante Virus (3 × 10⁶ KBE) wurde hinzugefügt, um eine Kultivierung bei 27 °C über 24 Stunden auszuführen. Danach wurde die Kulturflüssigkeit aus dem Kolben entfernt, dem 10 ml einer FNM-FH (FBS-) Kulturflüssigkeit zugegeben wurde, die kein fötales Rinderserum enthielt, um eine weitere Kultivierung bei 27°C über 7 Tage auszuführen. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 4 ml der Kulturflüssigkeit gesammelt, die unter Verwendung von Centricon 10 (hergestellt von Amicon) zu 400 μl konzentriert wurde, um ein Kulturüberstandkonzentrat (zehnfach konzentrierte Lösung) zu erhalten.
Andererseits wurde ein Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 30 mM Natriumchlorid) dem Kolben zugegeben, aus dem die Kulturflüssigkeit entfernt worden war. Zellen wurden von den Kolbenwänden durch Pipettieren abgenommen. Danach wurde eine Zellsuspension gewonnen und zentrifugiert, um die Zellen einmal zu waschen. Die Zellen wurden anschließend in 2 ml des Puffers resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde mit einem Ultraschall-Aufbrecher Insonator 200M (hergestellt von Kubota) bei 180 W 5 Minuten zum Aufbrechen der Zellen behandelt. Nach dem Aufbrechen wurde eine Zentrifugation bei 10 000 × G über 30 Minuten ausge führt und ein Überstand gewonnen, um eine Lösung aus aufgebrochenen Zellen zu erhalten. Eine Kontrollprobe wurde auch durch Kultivieren von Sf9-Zellen, die mit dem Wildtyp-AcNMPV-Virus infiziert waren, und Sf9-Zellen, die ohne Virus infiziert waren, unter der selben Bedingung bereitgestellt wie zuvor für die Probenzubereitung beschrieben wurde.
Der Kulturüberstandkonzentrat (5 μl) und die Lösung aus aufgebrochenen Zellen (10 μl), die wie zuvor beschrieben hergestellt worden war, wurden jeweils einer SDS-Polacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierter Bedingung mit Zugabe von 1% Mercaptoethanol, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) unterzogen. Als Ergebnis wurde ein Protein an einer Position von 15 Kilodalton in beachtlichen Mengen sowohl im Kulturüberstandkonzentrat als auch der Lösung aus aufgebrochenen Zellen nachgewiesen, die von den Zellen erhalten worden war, die mit dem rekombinanten Virus infiziert waren. Im Gegensatz dazu konnte kein Protein an der Position von 15 Kilodalton in beiden Kontrollen nachgewiesen werden, die das Kulturüberstandkonzentrat und die Lösung aus aufgebrochenen Zellen enthielten, die nur von den Sf9-Zellen erhalten worden war, und jenen, die von den Sf9-Zellen erhalten worden waren, die mit dem Wildtyp-Virus-AcMNPV infiziert waren. Es wird festgehalten, dass der Wert des Molekulargewichts von 15 Kilodalton mit dem Molekulargewicht von AS1051, das aus dem rohen Schlangengift gereinigt wurde, übereinstimmt.
<4> Aktivität des AS1051-Peptids, das durch das Baculovirus/kultivierte Insektenzellen-Expressionssystem hergestellt wurde
Das rekombinante Protein in kultivierten Insektenzellen und das rekombinante Protein im Kulturüberstand, das wie zuvor beschrieben erhalten worden war, stellt die Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen, induziert durch Botrocetin, bereit, wie durch die folgende Methode gemessen wurde.
Formalin-fixierte Blutplättchen wurden wie folgt hergestellt. Frischblut, das von gesunden Menschen gesammelt wurde, dem 1/10 Volumen 3,8% Natriumcitrat zugesetzt wurde, wurde bei 900 U/min 15 Stunden zentrifugiert, um humanes, Blutplättchen reiches Plasma (PRP) zu erhalten, dem eine 0,15 M wässerige Natriumchloridlösung mit dem selben Volumen und enthaltend 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), aufgelöst mit 2% Paraformaldehyd, zugegeben wurde, wonach es bei 4 °C über Nacht ruhig gelagert wurde. Nach der Lagerung wurden die Blutplättchen durch Zentrifugation wiedergewonnen und zweimal mit einer 0,15 M wässerigen Natriumchloridlösung gewaschen, die 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) enthielt. Nach dem Waschen wurden die fixierten Blutplättchen in der selben Lösung suspendiert und gelagert.
Ein Test zur Messung der Hemmung der Bindung zwischen 125I-markiertem von Willebrand-Faktor und fixierten Blutplättchen wurde unter Verwendung der fixierten Blutplättchen durchgeführt, die wie zuvor beschrieben erhalten wurden, nach der Methode von Chopek et al. (M.W. Chopek et al., Biochemistry, 25, 3146–3155 (1986)). Das heißt, einer Suspension der hergestellten, fixierten Blutplättchen wurde eine Probe zur Messung, Botrocetin und ¹²⁵I-markierter von Willebrand-Faktor zugesetzt und bei Raumtemperatur 30 Minuten zur Reaktion gebracht, um mit einem γ-Zähler (Packard Multi-Prias, hergestellt von Packard) die Menge an von Willebrand-Faktor zu messen, die mit den Blutplättchen gebunden ist. In dieser Messung hatte die Reaktions lösung ein Volumen von 50 μl einschließlich 5 μl der zugesetzten Probe zur Messung.
14 zeigt ein Messergebnis der Hemmaktivität auf die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen, die durch Botrocetin induziert wird, in Bezug auf Lösungen aus aufgebrochenen Zellen, die aus den Sf9-Zellen, die mit dem AS1051 rekombinanten Virus infiziert sind, und aus Kontroll-Sf9-Zellen nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. 15 zeigt ein Messergebnis der Hemmaktivität auf die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen, die durch Botrocetin induziert wird, in Bezug auf Kulturüberstandkonzentrate (dreifach konzentrierte Lösungen), die aus den Sf9-Zellen, die mit dem AS1051 rekombinanten Virus infiziert sind, und aus Kontroll-Sf9-Zellen nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, hemmten die Lösung aus aufgebrochenen Zellen und der kultivierte Zellüberstand, die von Zellen erhalten wurden, die mit dem rekombinanten Virus infiziert sind, nahezu vollständig die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen. Entsprechend dieser Tatsache wurde gezeigt, dass das AS1051-Peptid, das durch das Baculovirus/kultivierte Insektenzellen-Expressionssystem als intrazelluläres lösliches Protein und extrazelluläres Sekretionsprotein hergestellt wird, die Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen aufweist.
Beispiel 4: Herstellung des einstrangigen Anti-Thrombus-Peptids durch ein kultiviertes Tierzellen-Expressionssystem
Das einstrangigen Anti-Thrombus-Peptid wurde durch Exprimieren des AS1051-Gens in einem kultivierten Tierzellen-Expressionssystem unter Verwendung von CHO-Zellen hergestellt.
Das AS1051-Gen wurde durch Aufschließen von pCHA1 mit einem Restriktionsenzym PstI exzidiert. Beide Enden eines erhaltenen DNA-Fragments wurden mit dem DNA Blunting Kit (hergestellt von Takara Shuzo) stumpf gemacht. Ein XhoI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) wurde an beide Enden ligiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit einem Restriktionsenzym XhoI aufgeschlossen und dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um ein DNA-Fragment mit 500 Basenpaaren zu erhalten. Das DNA-Fragment wurde in eine XhoI-Stelle eines CHO-Zellen-Expressionsvektors pSD(X) (M. Murata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 2434–2438 (1988)) insertiert. Es wird festgehalten, dass dieser Vektor pSD(X) ein fremdes Gen in CHO-Zellen exprimieren kann, wobei der Vektor Replikationsursprünge von pBR322 und SV40, ein Ampicillin-Resistenzgen und ein Methotrexat-Resistenzgen umfasst, und der Vektor des Weiteren einen SV40 Promotor, ein SV40 Spleißsignal und ein poly(A)-Additionssignal umfasst. Der Konstruktionsprozess des zuvor beschriebenen Plasmids ist in 16 dargestellt
Escherichia coli HB101 wurde mit pSD(X), das das insertierte AS1051-Gen beherbergte, transformiert, um einen Transformanten zu erhalten. Ein Expressionsplasmid, in das das AS1051-Gen in einer gewünschten Richtung in Bezug auf den Vektor insertiert war, wurde von dem Transformanten erhalten. Das Plasmid wurde als pCHASDX bezeichnet. Das Plasmid pCHASDX zur Transformation eines Dihydrofolatreduktase armen Strangs von CHO-Zellen nach der Calciumphosphatmethode ("Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates) verwendet. Die Transformanten wurden in einem Medium kultiviert, das Alpha-MEM (Nucleinsäure minus) (hergestellt von GIBCO), 10% fötales Rinder- Serum (FCS) und Methotrexat 0,05 μM enthielt. Somit wurden Transformanten, die das Expressionsplasmid beherbergten, das im Chromosom eingefügt war, selektiv gezüchtet.
Die erhaltenen Stränge wurden durch stufenweise Erhöhung der Methotrexatkonzentration im Medium auf 0,5 μM kultiviert, um Methotrexat resistente Stränge auszuwählen. Somit wurde ein Strang erhalten, in dem angenommen wurde, dass das AS1051 Gen auf dem Chromosom von CHO-Zellen amplifiziert war. Ein einzelner Klon dieses Strangs wurde proliferiert, um Zellen zu erhalten. Die Gesamt-RNA wurde von den Zellen unter Verwendung des ISOGEN Kits (hergestellt von Nippon Gene) extrahiert. Das AS1051-Gen wurde unter Verwendung der Primer CHA16Y (Seq.-ID Nr. 13) und CHAl15Q (Seq.-ID Nr. 14) nach der RT-PCR-Methode auf die selbe Weise wie in Beispiel 2 <2> beschrieben amplifiziert. Amplifizierte DNA wurde durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass ein DNA-Fragment mit einer Größe, die sich aus der Nucleotidsequenz des AS1051-Gens ergab, amplifiziert wurde. Somit wurde bestätigt, dass mRNA des AS1051-Gens in CHO-Zellen transcribiert war. Die Zellen wurden zur Untersuchung der Expression des AS1051-Peptids verwendet. Das heißt, die Zellen (2 × 10⁴ Zellen) wurden 4 Tage in 5 ml eines Mediums kultiviert, das Alpha-MEM (Nucleinsäure minus), 10% fötales Rinderserum und Methotrexat 0,05 μM enthielt. Danach wurde das Medium durch ein serumfreies Medium AS104 (hergestellt von Ajinomoto) ersetzt, das Methotrexat 0,5 μM enthielt, gefolgt von einer Kultivierung über weitere 3 Tage.
Das Medium wurde nach Beendigung der Kultivierung gewonnen und 4 ml Medium wurden unter Verwendung von Centricon-10 (hergestellt von Amicon) zu 100 μl konzentriert, um ein Konzentrat zu erhalten. Das Konzentrat wurde sukzessive verdünnt, um die Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen, die durch Ristocetin und Botrocetin hervorgerufen wird, gemäß dem in Beispiel 3 <4> beschriebenen Verfahren zu messen. 17 und 18 zeigen die Hemmaktivitäten von Lösungen, die durch Konzentrieren oder Verdünnen der Kulturüberstände von AS1051-Peptid erzeugenden Zellen und Kontrollzellen, die kein AS1051-Peptid erzeugen, zu bestimmten Konzentrationen erhalten wurden. Wie in 17 und 18 dargestellt, wurde gezeigt, dass die Hemmaktivität des Kulturüberstandes der Peptid erzeugenden Zellen von der Konzentration abhängig war, und das aktive AS1051 enthalten war.
Beispiel 5: Herstellung eines mutanten A51051-Peptids
Escherichia coli wurde zur Expression eines AS1051-Peptids mit Mutation (in der Folge als "Cys81Ala-Mutation" bezeichnet) verwendet, wobei ein Alaninrest einen 81. Cysteinrestes, gezählt vom N-Terminus (mit Ausnahme des Methioninrests zur Initiierung der Translation) substituierte, um die Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu untersuchen.
<1> Herstellung des Cys8lAla mutanten Pe tids
Die Mutation wurde in das AS1051 Gen eingeführt, so dass der Cysteinrest, der nicht an der Bildung der Disulfidbindung des AS1051-Peptids beteiligt ist (81. Cysteinrest in Seq.-ID Nr. 2), durch Alanin nach der ortsgerichteten Mutagenese für eine Nucleotidsequenz, beschrieben in "PCR Protocol" (veröffentlicht von Academic Press) ersetzt wurde. Zur Ausführung des PCR-Prozesses unter Verwendung des Primers CHANdeI (Seq.-ID Nr. 9), synthetisiert in Beispiel 2, und eines neu synthetisierten Primers CHAAlaF (Seq.-ID Nr. 11), oder unter Verwendung eines neu synthetisierten Primers CHAAlaR (Seq.-ID Nr. 12) und des Primers CHAHindIII (Seq.-ID Nr. 10), synthetisiert in Beispiel 2, wurde pCHA1 als Matrize verwendet. Die jeweiligen Reaktionsprodukte wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und amplifizierte DNA-Fragmente wurden von dem Gel extrahiert. Diese DNA-Fragmente wurden als Matrizen zur Ausführung des zweiten PCR-Prozesses unter Verwendung der Primer CHANdeI und CHAHindIII zur Herstellung eines mutanten Gens verwendet. PCR-amplifizierte DNA-Fragmente wurden mit einem Restriktionsenzym NdeI aufgeschlossen, gefolgt von einer Agarose-Gelelektrophorese zur Extraktion eines DNA-Fragments mit 360 bp von dem Gel. Dieses DNA-Fragment wurde in eine NdeI-Stelle von pCHA(NS) insertiert, das mit dem Restriktionsenzym NdeI aufgeschlossen worden war. Der oben genannte Plasmidkonstruktionsprozess ist in 19 dargestellt.
Das Plasmid, das wie zuvor beschrieben hergestellt worden war, wurde zur Transformation von Escherichia coli HB101 nach der kompetenten Zellmethode verwendet. Transformanten wurden auf einer ampicillinhaltigen Platte selektiert. Aus den Transformanten wurden Plasmide nach der alkalischen SDS-Methode hergestellt. Nucleotidsequenzen wurden nach der in Beispiel 8 beschriebenen Methode unter Verwendung des T7 Primers und SP6 Primers (hergestellt von Stratagene) bestimmt. Somit wurde ein Plasmid selektiert, in dem die gegenständliche Mutation eingeführt war. Der erhaltene Expressionsvektor wurde als pCHA7Ala bezeichnet. pCHA7Ala wurde zur Transformation von Escherichia coli JM109(DE3) verwendet, um einen Transformanten zu erhalten. Das AS1051-Peptid mit der Cys8lAla Mutation wurde durch Kultivieren des Transformanten auf die selbe Weise wie in Beispiel 2 <4> exprimiert und er zeugt. Bakterielle Proteine wurden einer SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese unterzogen. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass das rekombinante Protein erzeugt und in Form von Einschlusskörpern in Zellen von Escherichia coli in annähernd der selben Menge wie jener des genetisch rekombinierten Wildtyp-AS1051-Peptids, das in Beispiel 2 <4> hergestellt wurde, akkumuliert werden kann.
<2> Löslichmachen und Aktivieren von Einschlusskörpern von Cys8lAla mutantem AS1051-Peptid
Die Einschlusskörper wurden nach der in Beispiel 2 <4> beschriebenen Methode löslichgemacht und aktiviert. Ein erhaltenes gereinigtes Protein wies laut SDS-Elektrophorese das selbe Molekulargewicht wie das Molekulargewicht von AS1051 auf, das in Beispiel 1 <4> dargestellt ist. Es wurde auch bestätigt, dass das gereinigte Protein die selbe Art von Disulfidbindungen wie jene von AS1051 hatte. Die Aktivität, die Blutplättchenaggregation zu hemmen, wurde für das erhaltene Cys8lAla mutante Peptid nach der selben Methode gemessen, wie in Beispiel 1 <5> beschrieben. Als Ergebnis hemmte das mutante Peptid die ADP induzierte Aggregation und die Collagen induzierte Aggregation nicht, und hemmte die Ristocetin induzierte Aggregation und die Botrocetin induzierte Aggregation in etwa dem selben Maße wie AS051. Das mutante Peptid zeigte die selbe Hemmaktivität wie AS1051, das in Beispiel 1<4> erhalten wurde, und rekombinantes AS1051, das in Beispiel 2 <4> erhalten wurde, auf die Bindung des von Willebrand-Faktors mit den fixierten Blutplättchen, induziert durch Ristocetin oder Botrocetin (20). Das so erhaltene, mutante AS1051-Peptid war bei Lagerung in einer Lösung bei 30 °C und Dialyse bei 4°C stabil, während das rekombinante AS1051-Peptid bei Lagerung in einer Lösung bei 30 °C und Dialyse bei 4 °C etwas unlöslich wurde. Gemäß diesem Ergebnis wird angenommen, dass das rekombinante mutante AS1051-Peptid eine höhere Stabilität hat als das rekombinante AS1051-Peptid.
Beispiel 6: Erzeugung verkürzter AS1051-Peptide
AS1051-Peptide mit verkürzten N-terminalen Abschnitten und/oder einem verkürzten C-terminalen Abschnitt wurden in Escherichia coli exprimiert, um die Aktivitäten der verkürzten AS1051-Peptide zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu untersuchen.
<1> Herstellung verkürzter AS1051-Peptide
Expressionssysteme für Peptide wurden ausgehend von dem AS1051-Peptid mit der Cys8lAla Mutation (in der Folge als "AS1051Cys81Ala-Peptid" bezeichnet) konstruiert, wobei es den konstruierten Peptiden an 15 Aminosäureresten oder 65 Aminosäureresten mangelte, die in einer N-terminalen Region angeordnet waren, und/oder an 11 Aminosäureresten, die in einer C-terminalen Region angeordnet waren. Das heißt, die hergestellten Peptide waren fünf Spezies, einschließlich eines Peptids (AS1051A-1) mit einer Sequenz von einem 16. Tyrosinrest zu einem 126. Argininrest, eines Peptids (AS1051A-2) mit einer Sequenz von einem 67. Tyrosinrest zu einem 126. Argininrest, eines Peptids (AS1051A-3) mit einer Sequenz von einem 1. Asparaginsäurerest zu einem 115. Glutaminrest, eines Peptids (AS1051A-4) mit einer Sequenz von dem 16. Tyrosinrest zu dem 115. Glutaminrest und eines Peptids (AS1051A-5) mit einer Sequenz von dem 67. Tyrosinrest zu dem 115. Glutaminrest. Strukturen dieser Peptide sind schematisch in 21 dargestellt. Die Zahl der Aminosäuren wurde gezählt, mit Ausnahme von Methionin zur Initiation der Translation, wobei die Zahl die Aminosäurezahl in der Aminosäuresequenz angibt, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist.
Expressionsplasmide für die verkürzten AS1051-Peptide wurden wie folgt konstruiert. pCHAT7Ala wurde als Matrize zur Ausführung des PCR-Prozesses verwendet, wobei Primer CHA16Y (Seq.-ID Nr. 13) und CHAHindIII (Seq.-ID Nr. 10) für AS1051A-1, Primer CHA67Y (Seq.-ID Nr. 15) und CHAHindIII für AS1051A-2, Primer CHANdeI (Seq.-ID Nr. 9) und CHAl15Q (Seq.-ID Nr. 14) für AS1051A-3, Primer CHA16Y und CHA115Q für AS1051A-4 und Primer CHA67Y und CHAl15Q für AS1051A-5 verwendet wurden.
Wie für amplifizierte Produkte, die unter Verwendung der Primer CHA16Y und CHAHindIII und der Primer CHA67Y und CHAHindIII erhalten wurden, wurden die entsprechenden amplifizierten Produkte mit NdeI aufgeschlossen und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um DNA-Fragmente mit 310 Basenpaaren bzw. 160 Basenpaaren zu extrahieren. Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden in eine NdeI-Stelle von pCHA(NS) insertiert. Erhaltene rekombinante Plasmide wurden zur Transformation von E. coli HB101 nach der Calciumchloridmethode verwendet und Transformanten wurden auf ampicillinhaltigen Platten selektiert. Die gegenständlichen Transformanten, in welchen die entsprechenden amplifizierten DNA-Fragmente in konkrete Richtungen in bezug auf die Plasmide eingesetzt waren, wurden aus den Transformanten selektiert. Ein derart erhaltenes Expressionsplasmid mit dem insertierten Fragment von 310 Basenpaaren wurde als pCHAT7Ala(16Y126R) bezeichnet und ein derart erhaltenes Expressionsplasmid mit dem insertierten Fragment von 160 Basenpaaren wurde als pCHAT7Ala(67Y126R) bezeichnet.
In Bezug auf amplifizierte Produkte, die unter Verwendung der Primer CHANdeI und CHAl15Q, der Primer CHA16Y und CHAl15Q sowie der Primer CHA67Y und CHAl15Q erhalten worden waren, wurden die entsprechenden amplifizierten Produkte mit NdeI und HindIII aufgeschlossen und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um DNA-Fragmente mit 360 Basenpaaren, 310 Basenpaaren bzw. 160 Basenpaaren zu extrahieren. Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden mit pCHA(NS) ligiert, das mit NdeI und HindIII aufgeschlossen worden war. Erhaltene rekombinante Plasmide wurden zur Transformation von E. coli HB101 nach der Calciumchloridmethode verwendet und Transformanten wurden auf ampicillinhaltigen Platten selektiert. Ein derart erhaltenes Expressionsplasmid mit dem insertierten Fragment von 360 Basenpaaren wurde als pCHAT7Ala(1D115Q) bezeichnet, ein derart erhaltenes Expressionsplasmid mit dem insertierten Fragment von 310 Basenpaaren wurde als pCHAT7Ala(16Y115Q) bezeichnet und ein derart erhaltenes Expressionsplasmid mit dem insertierten Fragment von 160 Basenpaaren wurde als pCHAT7Ala(67Y115Q) bezeichnet.
Die fünf Spezies der Expressionsplasmide für die verkürzten AS1051-Peptide wurden zur Transformation von E. coli JM109(DE3) verwendet, um entsprechende Transformanten zu erhalten. Diese Transformanten wurden auf die selbe Weise wie in der in Beispiel 2 beschriebenen Methode kultiviert, und nach der Kultivierung wurden bakterielle Zellen mikroskopisch beobachtet. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass alle der fünf Spezies der Transformanten Einschlusskörper bildeten. Bakterielle Proteine der entsprechenden Transformanten wurden durch SDS-Poylacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Als Ergebnis wurden beachtliche Proteinmengen an Positionen von Molekulargewichten gefunden, die sich aus den entsprechenden Aminosäuresequenzen der verkürzten AS1051-Peptide ergaben.
Die Einschlusskörper wurden aus den entsprechenden Transformanten auf die selbe Weise wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die Einschlusskörper wurden in 286 μl einer 7 M Guanidin-Hydrochloridlösung, die 10 mM EDTA und 0,5 M Tris-HCl (pH 8,5) enthielt, aufgelöst und dann über Nacht bei 4°C gelagert. Danach wurde jede der Teilmengen (10 μl) einer Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer SSC-VP318-1251 Säule (Durchmesser: 4,6 mm, Länge, 250 mm, hergestellt von Senshu Kagaku) unterzogen. Die Elution wurde unter Verwendung eines Konzentrationsgradienten von einer Acetonitrilkonzentration von 31% bis zu einer Konzentration von 52%, enthaltend 0,1 Trifluoroessigsäure, durchgeführt. Als Ergebnis wurden Peaks, die von den Einschlusskörpern stammten, erhalten, wie in 22 (AS1051A-1), 23 (AS1051A-2), 24 (AS1051A-3), 25 (AS1051A-4) bzw. 26 (AS1051A-5) dargestellt ist.
Die übrigen Gesamtmengen von AS1051A-1, AS1051A-2, AS1051A-3, AS1051A-4 und AS1051A-5, die wie zuvor beschrieben in 7 M Guanidin-Hydrochloridlösung gelöst und über Nacht gelagert wurden, wurden mit Trifluoroessigsäure auf einen sauren pH gebracht. Danach wurden sie durch HPLC mit einer Umkehrphasensäule (Vydac 214TP1022, hergestellt von Vydac, Durchmesser: 22 mm, Länge: 250 mm) bei einer Flussrate von 15 ml bei einer Elution mit einem Konzentrationsgradienten (20 Minuten) von einer Acetonitrilkonzentration von 30% zu einer Konzentration von 60%, enthaltend 0,1% Trifluoroessigsäure, fraktioniert und gesammelt. Den jeweiligen erhaltenen Peptiden wurde bovines Serumalbumin in zehnfacher Menge des Peptids zugesetzt, dann wurden sie lyophilisiert und in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst. Diese Lösungen wurden als Proben zur Messung der Aktivität zur Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Formalin fixierten Blut plättchen, induziert durch Botrocetin und Ristocetin, auf die selbe Weise wie in der in Beispiel 1 <5> beschriebenen Methode verwendet. Ergebnisse sind in 27 dargestellt. Wie in 27 dargestellt, wiesen alle der verkürzten AS1051-Peptide eindeutig die Bindungs-Hemmaktivität bei den in 27 gezeigten Konzentrationen auf.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt das Peptid bereit, das die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen hemmt, ohne eine Verringerung der Blutplättchen zu verursachen, obwohl das Peptid von einem Peptid erhalten wird, das von einem Schlangengift stammt, das die Verringerung der Blutplättchen bei in vivo Verabreichung verursacht, vorausgesetzt, dass die Bindung eng an einer Krise einer Thrombose beteiligt ist. Daher ist es möglich, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die als Anti-Thrombose-Arzneimittel vielversprechend ist.
SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: AJINOMOTO Co., Inc.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: PEPTID MIT ANTITHROMBUS-AKTIVITÄT UND VERFAHREN ZU DESSEN HERSTELLUNG
iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 15
(iv) ADRESSE FÜR SCHRIFTVERKEHR:
(A) ADRESSAT:
(B) STRASSE:
(C) STADT:
(D) STAAT:
(E) LAND:
(F) POSTLEITZAHL:
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMART: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: FastSEQ Version 1.5
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) EINREICHDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) EINREICHDATUM:
(viii) INFORMATION ZU RECHTSANWALT/AGENT:
(A) NAME:
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER:
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX:
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 2
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 2
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 1
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 38 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 1
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 2
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 126 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKULART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 2
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 3
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 3
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 4
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 4 CARGARATGA CNTGGGC 17
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 5
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 5 TCNACYTTRA AACAYTC 17
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 6
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 272 Rasenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(vi) URSRRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Crotalus horridus horridus
(B) STRANG:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 6
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 7
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 690 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(vi) URSRRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Crotalus horridus horridus
(B) STRANG:
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) POSITION: 66..512
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 7
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 8
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 149 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 8
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 9
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 34 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 9
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 10
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 40 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 10
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 11
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 26 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 11
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 12
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 12
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 13
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 35 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 13
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 14
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 36 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-TD Nr. 14
(2) INFORMATION ZUR Seq.-ID Nr.: 15
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 35 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANG: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: anders ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 15

Claims

Einstrangiges Peptid, das durch Trennen von Disulfidbindungen zwischen Peptidketten erhältlich ist, die ein multimeres Peptid aus Schlangengift bilden, wobei das multimere Peptid sowohl innerhalb der als auch zwischen den Ketten Disulfidbindungen aufweist und die Aktivität besitzt, die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu hemmen und eine Verringerung der Blutplättchen bewirkt; wobei der Schritt des Trennens von Disulfidbindungen die Umsetzung des multimeren Peptids umfasst, indem es gemeinsam mit einem Protein-Denaturierungsmittel und Glutathion und/ oder Cystein vorgelegt wird, während Disulfidbindungen innerhalb der Peptidketten im Wesentlichen konserviert werden, worin das einstrangige Peptid bindungshemmende Aktivität aufweist, aber in der zum Aufweisen der Aktivität in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt.
Peptid nach Anspruch 1, worin das Schlangengift ein Schlangengift von Crotalus horridus horridus ist.
Peptid nach Anspruch 2, das in seiner N-terminalen Region eine in Seq.-ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Peptid nach Anspruch 2, das eine in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil der Aminosäuresequenz mit der in Anspruch 1 angegebenen Aktivität umfasst.
Peptid nach Anspruch 4, das die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil der Aminosäuresequenz mit der in Anspruch 1 angegebenen Aktivität umfasst, worin Disulfidbindungen zwischen dem 4. und dem 15. Cysteinrest, zwischen dem 32. und dem 120. Cysteinrest sowie zwischen dem 95. und dem 112. Cysteinrest in der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz gebildet werden.
Peptid nach Anspruch 4, worin der 81. Cysteinrest in der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.
Verfahren zur Herstellung eines einstrangigen Peptids aus einem multimeren Peptid aus einem Schlangengift, wobei das multimere Peptid sowohl innerhalb der als auch zwischen den Ketten Disulfidbindungen aufweist und die Aktivität aufweist, die Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen zu hemmen und eine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, worin das einstrangige Peptid diese Aktivität aufweist, aber in der zum Aufweisen der Aktivität in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, wobei das Verfahren folgenden Schritt umfasst: das Vorlegen des multimeren Peptids aus dem Schlangengift gemeinsam mit einem Protein-Denaturierungsmitte) und Glutathion und/oder Cystein, um dadurch Disulfidbindungen zwischen Peptidketten zu trennen, um das einstrangige Peptid zu erzeugen, während Disulfidbindungen innerhalb der Peptidketten im Wesentlichen beibehalten werden.
DNA-Fragment, das für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
DNA-Fragment, das für eine in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil der Aminosäuresequenz mit der in Anspruch 1 angegebenen Aktivität kodiert.
Rekombinanter Vektor, der ein DNA-Fragment nach Anspruch 8 oder 9 in einen Vektor insertiert umfasst, der für die Transformation einer Wirtszelle geeignet ist, die aus der aus Escherichia coli, kultivierten Insektenzellen und kultivierten Tierzellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Transformant, worin eine Wirtszelle, die aus der aus Escherichia coli, kultivierten Insektenzellen und kultivierten Tierzellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 10 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das in der zum Aufweisen der Aktivität der Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: das Kultivieren von Escherichia coli, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 10, in einem geeigneten Medium; das Exprimieren des in Anspruch 1 definierten Peptids; und das Vorlegen des in Escherichia coli-Zellen angesammelten Peptids gemeinsam mit einem Protein-Denaturierungsmittel und das anschließende Erzeugen von Disulfidbindungen innerhalb von Ketten des Peptids durch Entfernung des Protein-Denaturierungsmittels oder Senkung der Konzentration des Protein-Denaturierungsmittels.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Peptid eine in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder einen Teil der Aminosäuresequenz mit der in Anspruch 1 angegebenen Aktivität aufweist und worin die Disulfidbindungen zwischen dem 4. und dem 15. Cysteinrest, zwischen dem 32. und dem 120. Cysteinrest sowie zwischen dem 95. und dem 112. Cysteinrest in der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz gebildet werden.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das in der zum Aufweisen der Aktivität der Hemmung der Bindung zwischen von Willebrand-Faktor und Blutplättchen in vivo erforderlichen Mindestdosis im Wesentlichen keine Verringerung der Blutplättchen bewirkt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: das Kultivieren von Insektenzellen oder Tierzellen, die mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 10 transformiert sind, in einem geeigneten Medium; das Exprimieren des in Anspruch 1 definierten Peptids; und das Gewinnen des in den Zellen oder im Medium angesammelten Peptids.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Wirkbestandteil aus einem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon enthält.