DE69433519T2

DE69433519T2 - Sich selbst zusammensetzendes polynukleotid-abgabesystem, das dendrimer-polykationen enthält

Info

Publication number: DE69433519T2
Application number: DE69433519T
Authority: DE
Inventors: Jr. Francis C. Szoka; Jean Haensler
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1993-07-14
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2014-07-15
Also published as: ATE258434T1; JP3785187B2; EP0708637A4; AU1240095A; ES2211882T3; EP0708637A1; CA2163364A1; CA2163364C; WO1995002397A1; AU681735B2; JPH09500136A; DE69433519D1; EP0708637B1; AU681735C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Oligonukleotid-Beförderungssysteme und der Gentherapie. Insbesondere ist diese Erfindung auf ein sich selbst zusammensetzendes Polynukleotid-Beförderungssystem gerichtet, welches ein Polynukleotid und ein Dendrimer-Polykation und gegebenenfalls andere Mittel, die die Beförderung des Polynukleotids an eine gewünschte subzelluläre Stelle unterstützen, umfasst. Das Polynukleotid und die anderen Mittel sind im Allgemeinen über nicht kovalente Wechselwirkungen mit dem Polynukleotid assoziiert. Mittel, die zur Verwendung hierin geeignet sind, umfassen unter anderem DNA-maskierende Komponenten, Zellerkennungsmittel, Ladungsneutralisationsmittel, Membranpermeabilisierungsmittel und subzelluläre Lokalisierungsmittel.
Anerkennung der Unterstützung der Regierung
Die Regierung hat gemäß Grant Nr. GM-30163, welcher von den National Institutes of Health gewährt wurde, Rechte an dieser Erfindung.
Beschreibung des Hintergrunds
Molekularbiologen haben bei einer großen Anzahl von menschlichen Erbkrankheiten die Chromosomenfehler identifiziert, was die Aussichten für Heilungen unter Verwendung der Gentherapie erhöht. Dieser aufstrebende Zweig der Medizin strebt eine Korrektur von Gendefekten durch ein Überführen klonierter und funktional aktiver Gene in die betroffenen Zellen an. Die cystische Fibrose (CF) ist eine tödliche rezessive genetische Krankheit, welche durch Anomalien im Chloridtransport gekennzeichnet ist. Der Ursprung (locus) der Krankheit wurde auf Mutationen in dem Gen zurückgeführt, das für den cystischen Fibrose-Transmembranleitfähigkeits-Regulator (CFTR) codiert. Eine Korrektur des zugrunde liegenden Gendefekts durch eine Vervollständigung oder einen Ersatz des fehlerhaften CFTR stellt die ultimative Heilung bei CF dar.
Die Gentherapie oder die in vivo-Beförderung und Expression von Genen ist eine sich schnell entwickelnde Wissenschaft, die verwendet werden kann, um fehlerhafte Gene zu ersetzen. Mehrere Systeme und Polymere, die zur Beförderung von Polynukleotiden geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt. Darunter wurden virale Vektoren wie beispielsweise Adenovirus-Vektoren verwendet, um CFTR in vivo auf die Lunge der Baumwollratte zu übertragen. Obwohl bei Adenovirus-Vektoren hohe Werte für die in vivo-Transfektion berichtet wurden, weisen die nicht viralen Beförderungssysteme eine Anzahl von Vorteilen bei der Beförderung von Polynukleotiden auf.
Während der vergangenen Dekade wurde eine Anzahl von Methoden entwickelt, um funktionale Gene in vitro in Säugetierzellen einzuführen. Diese Techniken sind auf die Gentherapie anwendbar, unter der Voraussetzung, dass die Zielzellen aus dem Körper entnommen werden können, transfiziert werden können und die transfizierten Zellen amplifiziert und dann in den Patienten zurückgeführt werden können. Dieses ist jedoch für CF-Patienten nicht möglich.
Derzeit werden die besten in vivo-Transfektionseffizienzen mit Retroviren erhalten. Die Transfektionseffizienz ist jedoch variabel, und die auf Viren basierenden Beförderungssysteme weisen das Risiko auf, Virusinfektionen oder Krebs zu verursachen. Auch wenn beim Menschen keine akuten Komplikationen beobachtet wurden, die sich von der Verwendung retroviraler Vektoren ableiten, macht die Möglichkeit von langfristigen Komplikationen natürlich eine sorgfältige Überwachung des Patienten erforderlich.
Die potentiellen Risiken der Verwendung von auf Viren basierenden Vektoren und die konzeptionellen Vorteile der Verwendung von Plasmid-DNA-Konstrukten statt dessen zur Gentherapie haben zu der Entwicklung verschiedener physikalischer und chemischer Methoden zur Unterstützung des Gentransfers in Abwesenheit viraler Vektoren geführt. Die am intensivsten untersuchten Systeme beinhalten die Behandlung von Zellen mit Calciumphosphat oder einem kationischen Hilfsmittel (facilitator). Andere Methoden beinhalten die Injektion der DNA während einer physikalischen Punktion der Membran oder die passive Aufnahme der DNA während einer Permeabilisierung oder einer Abschürfung der Zellmembran. Jede dieser Methoden ist an sich aggressiv und ist zur Verwendung in vivo nicht bevorzugt.
Die Verwendung eines direkten Genbeförderungssystems, das keine Verwendung viraler Vehikel beinhaltet, kann die Risiken vermeiden, die durch virale Systeme hervorgerufen werden. Ein nicht viraler Träger, der zur Genbeförderung geeignet ist, muss in der Lage sein, viele Hürden zu überwinden. Er muss im Blutkreislauf überleben und in der Lage sein, die Zelle der Wahl gezielt zu binden, um die DNA in das Cytoplasma der Zelle einzuführen und die DNA in den Zellkern zu transportieren.
Derzeit sind Viren die effizientesten Vektoren für einen Gentransfer, aber die potentiellen Risiken, welche mit deren Verwendung zusammenhängen, haben die Suche nach synthetischen DNA-Beförderungssystemen gefördert. Frühe Arbeiten zeigten, dass Polykationen wie z. B. Polylysin und DEAE-Dextran die Aufnahme von Proteinen und einzel- und doppelsträngigen Polynukleotiden in tierische Zellen fördern, und seitdem wurden auf Polylysin basierende Vektoren intensiv im Hinblick auf einen Gentransfer getestet. Jedoch sind diese Polykationen relativ cytotoxisch und an sich nicht sehr effizient, was deren Nutzen zum Transfizieren von Zellen in Kultur begrenzt.
Trotz dieser Nachteile weisen Polylysine eine Anzahl von Vorteilen auf wie z. B. eine Unterstützung beim

1) Zusammensetzen von DNA zu einer kompakten Struktur,
2) Destabilisieren von Zellmembranen und
3) Bereitstellen einer Befestigungsmöglichkeit für andere Effektoren an der Nukleinsäure.

Die Neutralisation und Kondensation von DNA durch Polylysine zu kleinen (ca. 100 nm) toroid-ähnlichen Strukturen fördert die Endozytose der Nukleinsäure in die Zellen in vitro. Der Endozytoseprozess kann weiter stimuliert werden durch die kovalente Befestigung spezifischer Liganden wie Transferrin, Asialoorosomucoid oder Insulin an dem Polykation. Wenn Polykationen-Transfektionsvorgänge auf einer rezeptorvermittelten Endozytose oder einer Endozytose in flüssiger Phase basieren, wird ein großer Anteil der durch Endozytose aufgenommenen DNA in intrazellulären Vesikeln eingeschlossen und wird schließlich in den Lysosomen abgebaut. Der lysosomale Abbau kann teilweise durch die Zugabe lysosomotropher Mittel wie z. B. Chloroquin während der Transfektion oder durch die Befestigung von Endosomen-aufbrechenden Mitteln wie beispielsweise inaktivierten Viren oder viralen fusogenen Peptiden an dem Polylysin umgangen werden. Die Fähigkeit der Polylysin-DNA-Komplexe, Zellen zu transfizieren, hängt stark von dem Vorliegen dieser Effektoren ab.
Eine Form, das Polynukleotid im Blutkreislauf zu schützen, so dass es lange genug überlebt, um an dem gewünschten zellulären Ziel anzukommen, ist das „Maskieren" oder Schützen des Polynukleotids.
Mikropartikel wie z. B. Erythrozytenghosts, rekonstituierte Virenhüllen und Liposomen wurden teilweise als Schutz beim Gentransfer verwendet. Ein erfolgreiches Liposomensystem verwendet das kationische Lipid N-[1(-2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), gemischt mit Phosphatidylethanolamin (PE), um das Reagenz Lipofectin^TM zu bilden. Lipofectin^TM ist ein kationisches Liposom, welches mit der DNA gemischt werden kann und wobei die Mischung zu einer Zelle zugegeben werden kann, ohne dass die Notwendigkeit einer Einkapselung der DNA innerhalb des Liposoms mit kationischen Reagenzien besteht. Lipofectin^TM ist verwendet worden, um Reportergene in menschliche Lungenepithelzellen in Kultur zu transfizieren, um das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Gen über den intratrachealen Weg in Rattenzellen einzuführen und um das CAT-Gen über den intratrachealen und intravenösen Weg in Mäusezellen einzuführen. Im Falle des CAT-Gens exprimierten ca. 50% der Luftwegeepithel-Rattenzellen vorübergehend das β-Galactosidase-Reportergen, auch wenn das Expressionsniveau nicht quantifiziert wurde. Wenn das CAT-Gen an einem steroid-sensitiven Promotor befestigt wurde und in die Rattenlunge transfiziert wurde, wurde gezeigt, dass dessen Expression durch Dexamethason positiv reguliert wurde. Die Cytotoxizität ist jedoch ein eindeutiges Problem, wenn hohe Konzentrationen von Lipofectin^TM verwendet werden.
Ersatzstoffe für DOTMA einschließlich Lipopolyamin, lipophiler Polylysine und einem kationischen Cholesterol wurden verwendet, um einen Gentransfer in Kultur zu vermitteln. Obwohl einige von diesen eine ca. dreifache Verbesserung gegenüber den Transfektionsraten, die mit Lipofectin^TM beobachtet wurden, zeigen, bleibt ihre Toxizität ein Problem. Der Mechanismus, welcher für die Transfektion unter Verwendung kationischer Lipide verantwortlich ist, wurde noch nicht gründlich erforscht. Der letzte Ansatz war, verschiedene kationische Lipide zu synthetisieren und diese in Transfektionstests auszuprobieren, statt systematisch zu untersuchen, wie die Beförderungssysteme DNA in eine Zelle einführen. Der Fund, dass DOTMA/PE-Liposomen eine Doppelschichtverschmelzung mit anionischen Liposomen durchlaufen können, legt nahe, dass DOTMA den direkten Eintritt der DNA über die Plasmamembran erleichtern könnte. Andererseits benötigen kationische Lipidsysteme für eine hocheffiziente Transfektion PE, möglicherweise da PE Intramembranlipidintermediate bilden kann, welche ein Verschmelzen der Membran erleichtern.
Ein effizienter Gentransfer erfordert ebenfalls das gezielte Binden der DNA an der Zelle der Wahl. Verschiedene Prozeduren, die auf rezeptorvermittelter Endozytose beruhen, wurden vor kurzem zum Gentransfer beschrieben. Ein zellenspezifisches Ligand-Polylysin-Konjugat wurde durch Ladungswechselwirkungen an Nukleinsäuren gebunden, und der resultierende Komplex wurde durch die Zielzellen effizient aufgenommen, wie beispielsweise im Fall der menschlichen Hepatomazelllinie HepG2 und von Rattenhepatozyten in vivo, wobei dieses Beförderungssystem mit Asialoorosomucoid als einem Liganden verwendet wurde. Von der stabilen Expression einer enzymatischen Aktivität in HepG2-Zellen nach einem von Insulin gesteuerten Targeting wie auch von der Transferrin-Polykationen-vermittelten Beförderung eines Plasmids in die menschliche Leukämie-Zelllinie K-562 und der anschließenden Expression des codierten Luciferasegens wurde berichtet. Jedoch erfordert das beschriebene Beförderungssystem die Verknüpfung von Targetingproteinen mit hohem Molekulargewicht mit der DNA durch einen Polylysin-Linker. Diese großen Ligand-Polykation-Konjugate sind in der Größe und Zusammensetzung heterogen, chemisch schlecht definiert und schwer in einer reproduzierbaren Weise herzustellen. Darüber hinaus sind bei vielen der rezeptorvermittelten Systeme Chloroquin oder andere Mittel zur Störung des intrazellulären Ablaufs (trafficking) für hohe Transfektionsniveaus nötig. In einer Untersuchung wurde ein Adenovirus verwendet, um die Genbeförderung eines rezeptorvermittelten Systems zu erhöhen.
Somit können Gene durch rezeptorvermittelte Endozytose in das Innere von Säugetierzellen befördert werden, wobei ein Bruchteil der exogenen DNA dem Abbau entgeht, in den Zellkern eintritt und exprimiert wird. Das Expressionsniveau ist jedoch, möglicherweise aufgrund des gegrenzten Eintritts der fremden DNA in das Cytoplasma, niedrig.
Die direkte Beförderung von Genen wird ebenfalls durch Neutralisation der großen negativen Ladung auf dem Polynukleotid und die (oft gleichzeitige) Fähigkeit, die Membran der Zielzelle durchlässig zu machen, unterstützt. Die Verwendung von Polykationen, um die Polynukleotidladung zu neutralisieren, hilft dabei, die Membran durchlässig zu machen, und bei der Translokation des Polynukleotids. Kationische Lipide wurden ebenfalls zu diesem Zweck verwendet. Gewisse kationische Lipide, die Lipopolyamine und Lipointerkalationsmittel genannt werden, sind ebenfalls bekannt.
Wenn das Polynukleotid einmal in die Zielzelle eingetreten ist, kann die direkte Beförderung der Gene dadurch unterstützt werden, dass die Gene zu dem richtigen subzellulären Ort geleitet werden. Ein offensichtliches Ziel für die Beförderung von Deoxyribonukleotiden ist der Zellkern. Liganden, von denen bekannt ist, dass diese diesen Prozess unterstützen, sind kernlokalisierende Peptide oder Proteine, welche Kernlokalisierungssequenzen enthalten.
Es wurde gezeigt, dass die Transfektionseffizienz, welche mit rekonstituierten Virushüllen erhalten wurde, steigt, wenn das fremde Gen mit Kernproteinen zusammen in die Zielzellen befördert wird. Es wurde gezeigt, dass DNA gemischt mit Kernproteinen eine mäßige Zunahme bei der Transfektion gegenüber DNA gemischt mit Albumin, was als Kontrolle verwendet wurde, zeigt. Somit scheint die DNA leichter in den Kern eingebaut zu werden, wenn Proteine, welche die Kernlokalisationssequenz (NLS) Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (SEQ ID NO: 1) enthalten, mit dem Plasmid assoziiert ist, da das Vorliegen der NLS auf einem Protein dieses für den Transport durch die Kernpore bestimmt. Kernlokalisationssequenzen mit 14 Aminosäuren wurden an einer Vielzahl von Makromolekülen und selbst an Goldpartikeln (150 Å Durchmesser) befestigt und, wenn sie in das Cytoplasma eingeführt wurden, wurden diese schnell in den Zellkern eingebaut. Der Eintritt in den Kern scheint der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für eine erfolgreiche, stabile Transfektion zu sein. Dieses wird durch den Fund unterstützt, dass, wenn Plasmid-DNA in das Cytoplasma mikroinjiziert wird, diese nicht fähig ist, zu einer Zelltransfektion zu führen. Bei 1000 Injektionen ins Cytoplasma trat keine Transfektion auf, wogegen die Mikroinjektion von Plasmiden direkt in den Kern zu einer Transfektion bei mehr als 50% der mikroinjizierten Zellen führte.
Es wurde gezeigt, dass die Transfektionseffizienz ebenfalls steigt, wenn die DNA unter Verwendung verschiedener kationischer Proteine kondensiert wird. Auch wenn der Grund, warum eine DNA-Kondensation die Transfektion erhöht, nicht leicht ersichtlich ist, kann dieses auf einer Zunahme der zellulären Aufnahme von DNA oder auf einer Abnahme der Anfälligkeit der DNA gegenüber Nukleasen beruhen, was zu höheren Mengen an intakter DNA in der Zelle führen kann.
Die direkte Beförderung von Genen, die mit einem der Mittel der oben diskutierten Klassen assoziiert sind, wird weiter durch die Fähigkeit jener Mittel, mit der DNA assoziiert zu bleiben, unterstützt. Beispiele hierfür sind die Assoziation eines Rezeptorliganden mit einem Polynukleotid durch kovalente Befestigung des Liganden an dem Polykation Polylysin und gegebenenfalls durch kovalente Befestigung des Liganden an einem DNA-Interkalationsmittel, z. B. Ethidium-Homodimer (5,5'-Diazadecamethylenbis(3,8-diamino-6-phenylphenanthridium)dichlorid-dihydrochlorid), und die Assoziation von Photoaffinitätsmarkierungen an der DNA durch kovalente Befestigung an 9-Aminoacridin und gewissen Bisacridinen.
Dendrimere sind sperrige dreidimensionale Polymere, welche durch sich wiederholende Reaktionssequenzen um ein Kernmolekül herum aufgebaut werden, die mit verschiedenen Molekulargewichten und Größen hergestellt werden können (Tomalia, D. A., et al., „Starbust Cascade Polymers: Molecular-Level Control of Size, Shape, Surface Chemistry, Topology, and Flexibility from Atoms to Macroscopic Matter", Angew. Chem. Ind. Ed. Engl. 29: 138 (1990)).
Beim Streben nach der Erzielung besserer Ergebnisse auf dem Gebiet der Gentherapie besteht jedoch immer noch ein Bedarf für verbesserte Polynukleotidbeförderungssysteme mit hoher Transfektionseffizienz ohne die Nachteile früherer Systeme.
Die WO 93/19768 betrifft ein sich selbst zusammensetzendes Polynukleotidbeförderungssystem, welches Komponenten umfasst, die bei der Beförderung des Polynukleotids an die gewünschten Adressen helfen, welche über nichtkovalente Wechselwirkungen mit dem Polynukleotid assoziiert sind. Die Komponenten dieses Systems umfassen DNA, maskierende Komponenten, Zellerkennungskomponenten, ladungsneutralisierende und Membranpermeabilisierungs-Komponenten und Komponenten zur subzellulären Lokalisation.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein sich selbst zusammensetzendes Polynukleotidbeförderungssystem, welches ein Dendrimer-Polykation mit endständigen kationischen Gruppen umfasst, die nichtkovalent an ein Polynukleotid, das befördert werden soll, gekoppelt sind, wobei der Anteil der endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations zu dem Nukleotidgehalt des Polynukleotids 1 : 1 bis 223,3 : 1 beträgt, aber ausschließlich solcher Zusammensetzungen, die erhältlich sind durch: Verdünnen von 12 μg PCLuc4-Plasmid in 660 μl HBS (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,4), um eine DNA-Lösung zu bilden; und Lösen von 1 nmol hydrophiler verzweigter Polykation-Makromolekül-Starburst-Dendrimermikropartikel der fünften Generation in 340 μl HBS und Zugeben von diesem tropfenweise zu der DNA-Lösung. Wahlweise kann dieses eines oder mehrere, vorzugsweise zwei oder mehrere der folgenden Mittel enthalten.

1) DNA-Maskierungsmittel.
2) Zellerkennungsmittel.
3) Ladungsneutralisations- und Membranpermeabilisierungsmittel.
4) Subzelluläre Lokalisationsmittel.

Das Dendrimer-Polykation ist selbst in der Lage, das Polynukleotid mit hoher Transfektionseffizienz abzugeben. Jede fakultative Komponente in diesem System ist in der Lage, ihre angegebene Funktion auszuüben, und ist ebenfalls in der Lage, sich nach Bedarf mit dem Polynukleotid zusammenzusetzen oder von diesem zu trennen. Beispielsweise kann sich eine gewisse Komponente von dem Polynukleotid abtrennen müssen, um ihre gewünschte Funktion auszuüben.
Diese Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Beförderung eines Polynukleotids zu einer subzellulären Komponente einer eukaryotischen Zelle bereit, welche ein Polynukleotid und ein Dendrimer-Polykation mit endständigen kationischen Gruppen, die nichtkovalent an das Polynukleotid gekoppelt sind, umfasst, wobei der Anteil endständiger kationischer Gruppen des Dendrimer-Polykations zu dem Nukleotidgehalt des Polynukleotids 1 : 1 bis 223,3 : 1 beträgt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Zusammensetzung umfasst das Polynukleotid einen Hybridvektor mit einem Strukturgen, das funktionsfähig daran gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann mit einer eukaryotischen Zielzelle unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, die wirksam sind, um eine hocheffiziente Transfektion zu erreichen.
Unter einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung ebenfalls die Verabreichung der vorliegenden Zusammensetzung an einen Organismus, um ein Polynukleotid wie z. B. ein Strukturgen unter Bedingungen einer hocheffizienten Transfektion zu spezifischen Zielzellen zu befördern, und das Induzieren der Expression des Genprodukts in den Zellen.
Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung und viele der begleitenden Vorteile von dieser werden leicht erkannt werden, wenn dieselbe durch Bezug auf die folgenden Figuren besser verstanden wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Wirkung von pLys115, SD68, SD54 und GALA-SD54 auf die elektrophoretische Mobilität der Plasmid-DNA. Polykation-pCMV-β-Gal-Komplexe wurden mit jedem der obigen hergestellt und wie folgt in dem Gel laufen gelassen. Bahn 1: pCMV-β-Gal allein; Bahn 2: 2 μg pLys115; Bahn 3: 4 μg pLys115; Bahn 4: 4 μg SD68; Bahn 5: 6 μg SD68; Bahn 6: 4 μg SD54, bereitgestellt durch das GALA-SD54-Konjugat; Bahn 7: 160 μg SD54, bereitgestellt durch das GALA-SD54-Konjugat; und Bahn 8: 4 μg SD54, bereitgestellt durch eine äquimolare Mischung von SD54 und GALA-SD54.
2 zeigt die Auswirkung des Dendrimerdurchmnessers und der Menge beim Vermitteln der Transfektion in CV-1-Zellen (Daten erhalten aus Tabelle 2).
3 zeigt die Dosis-Antwort der Luciferaseaktivität als eine Funktion der Menge an pCLuc4-Plasmid, das zur Transfektion verwendet wurde.
4 zeigt die PAMAM-Kaskadenpolymer-vermittelte Transfektion von Säugetierzellen. 4A: Zellen wurden in Doppelversuchen mit 6 μg Plasmid, komplexiert mit SD68, transfiziert. Die Transfektionseffizienz des optimierten Komolexes (25 μg SD68/6 μg Plasmid;
) wurde mit der verglichen, die mit Komplexen erhalten wurde, die mit 4 μg SD68/6 μg Plasmid gebildet wurden ([endständige Amine] = [Nukleotide]; ☐). Die Luciferaseaktivität in den pCLuc4-transfizierten Zellen wurde 48 Std. nach der Transfektion gemessen wie in Tabelle 2 beschrieben wird oder 24 Std. nach der Transfektion im Fall von primären Hepatozyten. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Bereich von doppelten Bestimmungen. Der Prozentsatz transfizierter Zellen bei den optimierten Bedingungen wurde mit dem pCMV-β-Gal-Plasmid abgeschätzt. Transfizierte Zellen wurden durch histochemisches Anfärben unter Verwendung von X-Gal 24 Std. nach der Transfektion nachgewiesen (Lim, K. und Chae, C-B, „A Simple Assay for DNA Transfection by Incubation of the Cells in Culture Dishes with Substrate for β-Galactosydase", Biotech. 7: 576 (1989)). Die Ergebnisse sind als Prozentsätze in dem Histogramm gezeigt. 4B: Die Zellen wurden wie oben mit 6 μg pCLuc4, komplexiert mit 4 μg Dendrimer, das durch unmodifiziertes SD54 (☐) oder durch eine äquimolare Mischung von unmodifiziertem SD54 und GALA-SD54 (
) bereitgestellt wurde, transfiziert.
5 zeigt einen Vergleich der Toxizität von pLys115 und SD68 an CV-1-Zellen. CV-1-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden für 5 Std. in serumfreiem DME H-21 mit steigenden Mengen an Polykation (pLys115,
oder SD68 O), komplexiert (- - -) oder nicht (–) mit Plasmid-DNA, behandelt und für einen weiteren 48 Std.-Zeitraum in DME H-21, das 10% FCS enthielt, kultiviert. Nach diesem Zeitraum wurde die Toxizität der Behandlungen über den MTT-Farbstoffreduktionstest abgeschätzt. Formazan wurde nach der Lyse der Zellen durch seine Extinktion bei 570 nm quantifiziert. Die Hintergrundextinktion wurde erhalten, indem der Test mit Zellen durchgeführt wurde, die mit 6 M Guanidinhydrochlorid behandelt wurden. Die prozentuale Verringerung bei der Lebensfähigkeit der Zellen = {1 – [OD₅₇₀(behandelte Zellen – Hintergrund]/[OD₅₇₀(unbehandelte Zellen – Hintergrund]} × 100. Jeder Wert ist der Mittelwert ± SD von dreifachen Bestimmungen.
6 zeigt ein Diagramm, welches die kompetitive Verdrängung von Ethidiumbromid aus Kalbsthymus-DNA durch die Bisacridin-Derivate aus Beispiel 20 zeigt. (
): Spermidin-Bisacridintrihydrochlorid, Kd = 4,3 × 10^–8 M; (O): WTCysMPB-bA, Kd = 2,1 × 10^–7 M; (☐): cTCysMPB-bA, Kd = 7,9 × 10^–7 M; (Δ): MPB-bA, Kd = 1,0 × 10^–6 M.
7 zeigt die dosisabhängige Wirkung des SD68-Dendrimer-Polykations auf die Beförderung von Oligonukleotiden zu dem Zellkern.
8 zeigt die Zeitabhängigkeit, mit welcher das SD68-Dendrimer-Polykation die Akkumulation von Oligonukleotiden im Kern der Zelle erleichtert (25% Glucosepuffer-Substitution).
9 zeigt die Auswirkung der Generation des Dendrimer-Polykations auf die Kernaufnahme von Fitc-markierten 16mer-Oligonukleotiden.
10 zeigt die Kernfluoreszenz, welche als eine Funktion der Verdünnung der Beförderungszusammensetzung mit Kohlenhydratlösungen beobachtet wird.
11 zeigt die Auswirkung auf die Transfektion der Befestigung eines gezielt bindenden Liganden und Membrandestabilisators an der DNA über Bisacridin.
12 zeigt die Auswirkung auf die Transfektion der Befestigung eines gezielt bindenden Liganden und Membrandestabilisators an dem Dendrimer-Polykation.
Andere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten anhand der folgenden Diskussion klar werden.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
GLOSSAR
„Polynukleotid" wie hierin verwendet umfasst RNA- oder DNA-Sequenzen mit mehr als einem Nukleotid, entweder in Form einer einzelnen Kette, eines Duplex oder mehrerer Ketten. Das Polynukleotid umfasst Polydeoxyribonukleotide, welche 2'-Deoxy-D-ribose oder modifizierte Formen davon enthalten, d. h. DNA, Polyribonukleotide, welche D-Ribose oder modifizierte Formen davon enthalten, RNA, und jeden anderen Typ von Polynukleotid, welcher ein N-Glycosid oder C-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder einer modifizierten Purin- oder Pyrimidinbase oder eines basischen Nukleotids ist. Das Polynukleotid kann Promotorregionen, Operatorregionen, strukturelle Bereiche, Terminationsregionen, Kombinationen von diesen oder irgendein anderes genetisch relevantes Material codieren.
„Ersatz"-Verknüpfungen sind hierin definiert als herkömmliche alternative Verknüpfungen wie z. B. Phorphorothioat oder Phosphoramidat, die wie in der allgemein verfügbaren Literatur beschrieben synthetisiert werden. Nicht alle Verknüpfungen in einem Polynukleotid müssen identisch sein. Die Polynukleotide der Erfindung können eine oder mehrere „Ersatz"-Verknüpfungen enthalten, wie im Stand der Technik allgemein anerkannt wird. Einige dieser Ersatzverknüpfungen sind nichtpolar und tragen zu der gewünschten Fähigkeit des Polynukleotids bei, durch die Membran zu diffundieren. Andere Ersatzverknüpfungen tragen zu der erhöhten oder verminderten biologischen Abbaubarkeit des Polynukleotids bei. Die biologische Abbaubarkeit wird beispielsweise durch eine erhöhte oder verminderte Nucleaseempfindlichkeit beeinflusst.
„Analoge Purine" und „analoge Pyrimidine" sind jene, die allgemein im Stand der Technik bekannt sind, von welchen viele als chemotherapeutische Mittel verwendet werden, welche Modifikationen in dem Zuckeranteil des Polynukleotids enthalten. Beispiele für die analogen Purine und Pyrimidine sind solche, bei welchen eine oder mehrere der Hydroxylgruppen mit Halogen- oder aliphatischen Gruppen ersetzt sind oder als Ether, Amine und dergleichen funktionalisiert sind, oder wobei die Ribose oder Deoxyribose durch andere funktional äquivalente Strukturen ersetzt ist. Modifikationen in dem Basenanteil umfassen alkylierte Purine oder Pyrimidine, acylierte Purine oder Pyrimidine, oder andere Heterocyclen. Insbesondere kann das Zucker-Phosphat-Gerüst des Polynukleotids durch ein Nichtkohlenhydrat-Gerüst wie z. B. ein Peptid- oder einen anderen Typ von Polymergerüst ersetzt sein (Nielsen, P. E., et al., Science 254: 1497 (1991)).
Das berechnete Molekulargewicht für ein ideales Dendrimer, das keine unvollständigen Reaktionsprodukte oder Nebenreaktionsprodukte enthält, ist das Molekulargewicht. Jedoch entstehen gewöhnlich im Verlauf einer Synthese einige unvollständige Produkte oder Nebenprodukte. „Durchschnittliches Molekulargewicht" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein hypothetisches Molekulargewicht eines idealen Dendrimers, es sollte aber beachtet werden, dass in der Praxis Abweichungen von diesem durchschnittlichen Molekulargewicht auftreten können, und Moleküle mit verschiedenen Molekulargewichten, die niedriger und höher als diese Werte sind, in einem gewissen Anteil vorliegen. Der „hydrodynamische Radius" wie hierin verwendet bezieht sich auf den apparenten Radius eines einzelnen Dendrimers in wässrigen Lösungen. Dieser kann von den Fachleuten unter Verwendung von Gelpermeationschromatographie oder Laserlichtbeugung abgeschätzt werden.
„Funktionale Komponente" wie hierin verwendet umfasst DNA-maskierende Komponenten, Zellerkennungskomponenten, Ladungsneutralisations- und Membranpermeabilisierungs-Komponenten und subzelluläre Lokalisierungskomponenten.
„DNA-maskierende Komponente" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Molekül, das in der Lage ist, das ganze oder einen Teil des Polynukleotids zu maskieren, um seine zirkulatorische Halbwertszeit zu erhöhen, indem der Angriff durch abbauende Reagenzien wie z. B. Nucleasen, die im Blutkreislauf vorliegen, gehemmt wird und/oder die Aufnahme durch das retikuloendotheliale System gestört wird.
„Membranpermeabilisierungs-Komponente" wie hierin verwendet bezieht sich auf irgendeine Komponente, die den Durchgang eines Polynukleotids durch eine Membran unterstützt. Somit umfasst dieser Begriff teilweise ladungsneutralisierende Komponenten, gewöhnlich Polykationen, welche die große negative Ladung auf Polynukleotiden neutralisieren und dem Polynukleotid ermöglichen, das hydrophobe Innere einer Membran zu überqueren. Viele ladungsneutralisierende Komponenten können als Membranpermeabilisatoren wirken. Eine Membranpermeabilisierung kann ebenfalls durch amphipathische Moleküle entstehen. Ein Membranpermeabilisator ist ein Molekül, das ein normalerweise nicht permeables Molekül dabei unterstützen kann, die Zellmembranen zu überqueren und Eintritt in das Cytoplasma der Zelle zu erlangen. Ein Membranpermeabilisator kann ein Peptid, Gallensalz, Glycolipid, Phospholipid oder Detergensmolekül sein. Membranpermeabilisatoren weisen oft amphipathische Eigenschaften auf, so dass ein Teil hydrophob ist und ein anderer hydrophil ist, was diesen ermöglicht, mit Membranen wechselzuwirken.
„Fusogenes Peptid" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Peptid, welches, wenn es zu zwei getrennten Doppelschichtmembranen zugegeben wird, dazu führen kann, dass diese zu einer einzigen Membran verschmelzen.
„Liposom" wie hierin verwendet bezieht sich auf kleine Vesikel, welche aus amphipathischen Lipiden zusammengesetzt sind, welche in kugelförmigen Doppelschichten angeordnet sind. Liposomen werden gewöhnlich klassifiziert als kleine unilamellare Vesikel (SUV), große unilamellare Vesikel (LUV) oder multilamellare Vesikel (MLV). SUVs und LUVs haben per Definition nur eine Doppelschicht, wogegen MLVs viele konzentrische Doppelschichten enthalten. Liposomen können verwendet werden, um verschiedene Materialien einzukapseln, indem hydrophile Moleküle in dem wässrigen Inneren oder zwischen Doppelschichten eingeschlossen werden, oder indem hydrophobe Moleküle innerhalb der Doppelschicht eingeschlossen werden. Liposomen zeigen, abhängig von deren Größe, Zusammensetzung und Ladung, eine große Vielfalt von Eigenschaften. Beispielsweise neigen Liposomen mit einem kleinen Prozentsatz an ungesättigten Lipiden dazu, etwas permeabler zu sein, während Liposomen, die Cholesterol oder andere Steroide aufweisen, dazu neigen, starrer und weniger permeabel zu sein. Liposomen können in Bezug auf die Ladung positiv, negativ oder neutral sein, was von der hydrophilen Gruppe abhängt. Beispielsweise verleihen auf Cholin basierende Lipide eine neutrale Gesamtladung, auf Phosphaten und Sulfaten basierende Lipide tragen zu einer negativen Ladung bei, auf Glycerol basierende Lipide sind im allgemeinen negativ geladen, und Sterole sind allgemein neutral in Lösung, weisen aber geladene Gruppen auf.
„Zellerkennungskomponente" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Molekül, das in der Lage ist, eine Komponente auf der Oberfläche einer Zielzelle zu erkennen. Zellerkennungskomponenten umfassen Antikörper gegen Zelloberflächenantigene, Liganden für Zelloberflächenrezeptoren einschließlich jener, die an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt sind, Peptidhormone und dergleichen.
„DNA-assoziierender Anteil" bezieht sich auf ein Molekül oder Teile von diesem, die in einer nichtkovalenten Weise mit Nukleinsäuren wechselwirken. DNA-assoziierende Anteile umfassen unter anderem Mittel, die an die Haupt- oder Nebenfurche binden, DNA-Interkalationsmittel und Polykationen. Mittel, die an die Haupt- oder Nebenfurche binden, sind Moleküle, von denen angenommen wird, dass diese mit DNA wechselwirken, indem sie mit der Haupt- oder Nebenfurche einer doppelsträngigen DNA assoziieren. DNA-Interkalationsmittel sind planare Moleküle oder planare Anteile von Molekülen, von denen angenommen wird, dass diese in die DNA interkalieren, indem sie sich selbst zwischen und parallel zu den Nukleotidbasenpaaren einfügen. Von Polykationen wird angenommen, dass diese mit den negativen Ladungen auf dem DNA-Gerüst assoziieren. Zusätzlich kann, wenn eine einzelsträngige DNA oder RNA als der therapeutische Strang verwendet wird, der komplementäre „Linker-Strang" wie hierin beschrieben funktional als ein „DNA-assoziierender Anteil" wirken.
Die DNA-assoziierenden Anteile können kovalent über eine „reaktive Gruppe" mit einer funktionalen Komponente dieser Erfindung verknüpft werden. Diese reaktiven Gruppen werden leicht mit einem Nukleophil auf der funktionalen Komponente umgesetzt. Derartige reaktive Gruppen (mit ihren entsprechenden reaktiven Nukleophilen) umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, N-Hydroxysuccinimid (z. B. Amin), Maleimid und Maleimidophenyl (z. B. Sulfhydryl), Pyridyldisulfid (z. B. Sulfhydryl), Hydrazid (z. B. Kohlenhydrat) und Phenylglyoxal (z. B. Arginin).
„Subzelluläre Lokalisationskomponente" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Molekül, das in der Lage ist, eine subzelluläre Komponente in einer Zielzelle zu erkennen. Erkannte subzelluläre Komponenten umfassen den Kern, Ribosomen, Mitochondrien und Chloroplasten. Bestimmte subzelluläre Lokalisierungskomponenten umfassen die „Kernlokalisierungskomponenten", die dabei helfen, Moleküle in den Kern zu bringen, und von denen bekannt ist, dass diese Kernlokalisierungspeptide und -aminosäuresequenzen umfassen.
„Dendrimer-Polykation" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine dreidimensionale, in hohem Maße geordnete oligomere und/oder polymere Verbindung, die durch sich wiederholende Reaktionssequenzen gebildet wird, angefangen bei einem kleineren Molekül oder einem bestimmten Initiator wie unter anderem z. B. Ammoniak oder Pentaerythritol, welche eine positiv geladene Oberfläche aufweisen, wie beispielsweise von Tomalia et al. (1990) supra beschrieben wird.
DIE ZUSAMMENSETZUNG
Die Zusammensetzung dieser Erfindung ist ein sich selbst zusammensetzendes Polynukleotid-Beförderungssystem, umfassend:
ein Polynukleotid; und
ein Dendrimer-Polykation, das funktionsfähig mit dem Polynukleotid gekoppelt ist, wie in Anspruch 1 definiert.
DAS POLYNUKLEOTID
Das Polynukleotid kann eine einzelsträngige DNA oder RNA oder eine doppelsträngige DNA oder ein DNA-RNA-Hybrid sein. Drei- oder viersträngige Polynukleotide mit therapeutischem Nutzen sollen ebenfalls vom Umfang dieser Erfindung umfasst sein. Beispiele für doppelsträngige DNA umfassen unter anderem Strukturgene, Gene, welche Operator-, Kontroll- und Terminationsregionen einschließen, und selbstreplizierende Systeme wie z. B. Plasmid-DNA.
Einzelsträngige Polynukleotide oder „therapeutische Stränge" umfassen antisense-Polynukleotide (DNA und RNA), Ribozyme und triplexbildende Oligonukleotide. Um eine verlängerte Aktivität aufzuweisen, sind bei dem therapeutischen Strang vorzugsweise einige oder alle seiner Nukleotidverknüpfungen als Nichtphosphodiesterverknüpfungen stabilisiert. Solche Verknüpfungen umfassen unter anderem z. B. Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Phosphoroselenat- oder O-Alkylphosphotriester-Verknüpfungen, wobei die Alkylgruppe Methyl oder Ethyl ist.
Für diese einzelsträngigen Polynukleotide kann es bevorzugt sein, den komplementären oder „Linker-Strang" zu dem therapeutischen Strang als Teil der verabreichten Zusammensetzung herzustellen. Der Linker-Strang wird gewöhnlich mit einer Phosphodiesterverknüpfung synthetisiert, so dass dieser abgebaut wird, nachdem er in die Zelle eingetreten ist. Der „Linker-Strang" kann ein separater Strang sein oder er kann kovalent an dem therapeutischen Strang befestigt sein oder lediglich eine Verlängerung davon sein, so dass sich der therapeutische Strang im Wesentlichen rückverdoppelt und mit sich selbst hybridisiert.
Der Linker-Strang kann ebenfalls am 3'- oder 5'-Ende oder an dem Kohlenhydrat oder Gerüst, die als funktionale Komponenten dienen, Funktionalitäten aufweisen, um die Aktivität des therapeutischen Strangs zu erhöhen. Beispielsweise kann der Phosphodiester-Linker-Strang einen gezielt bindenden Liganden wie z. B. ein Folatderivat enthalten, das die Erkennung und Internalisierung in die Zielzellen erlaubt. Wenn der Linker an seinem komplementären therapeutischen Strang befestigt ist, welcher aus abbauresistenten Verknüpfungen zusammengesetzt ist, würde der Duplex internalisiert. Wenn er sich innerhalb der Zelle befindet, wird der Linker abgebaut, wodurch der therapeutische Strang freigesetzt wird. Auf diese Weise wird der therapeutische Strang keine zusätzlichen befestigten Funktionalitäten aufweisen und seine Funktion wird nicht durch unwesentliche Anteile beeinträchtigt. Diese Strategie kann auf irgend ein antisense-, Ribozym- oder triplexbildendes Polynukleotid angewandt werden und wird verwendet, um antivirale, antibakterielle, antineoplastische, antientzündliche, antiproliferative, antirezeptorblockierende oder Antitransport-Polynukleotide und dergleichen zu befördern.
Ein separater Linker-Strang kann so synthetisiert werden, dass dieser die direkt komplementäre Sequenz zu dem therapeutischen Strang aufweist und mit diesem eins zu eins hybridisiert. Alternativ kann der Linker-Strang so konstruiert werden, dass der 5'-Bereich des Linker-Strangs mit dem 5'-Bereich des therapeutischen Strangs hybridisiert und der 3'-Bereich des Linker-Strangs mit dem 3'-Bereich des therapeutischen Strangs hybridisiert, so dass ein Concatenat der folgenden Struktur gebildet wird.
Dieses Concatenat weist den Vorteil auf, dass das apparente Molekulargewicht der therapeutischen Nukleinsäuren erhöht wird und deren pharmakokinetische Eigenschaften sowie das Verhältnis von gezielt bindendem Liganden : therapeutischem Oligonukleotid eingestellt werden können, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen.
DAS DENDRIMER-POLYKATION
Das Dendrimer-Polykation ist eine dreidimensionale, in hohem Maße geordnete oligomere und/oder polymere Verbindung, die aus einem Kernmolekül oder einem bestimmten Initiator durch sich wiederholende Reaktionssequenzen, welche die Oligomere und/oder Polymere addieren, und Bereitstellen einer äußeren Oberfläche, die positiv geladen ist, gebildet wird.
Diese Dendrimere können hergestellt werden, wie in der PCT/US83/02052 der Dow Chemical Company und den US-Patenten Nr. 4,507,466, 4,558,120, 4,568,737, 4,587,329, 4,631,337, 4,694,064, 4,713,975, 4,737,550, 4,871,779 und 4,857,599 von Tomalia, D. A. et al. beschrieben wird, oder wie in der beispielhaften Offenbarung, die nachstehend angegeben wird, beschrieben wird. Typischerweise umfassen die Dendrimer-Polykationen ein Kernmolekül, an welches Polymere addiert werden. Die Polymere können Oligomere oder Polymere sein, welche endständige Gruppen umfassen, die in der Lage sind, eine positive Ladung anzunehmen. Geeignete Kernmoleküle umfassen wenigstens zwei reaktive Reste, die für die Bindung des Kernmoleküls an die Oligomere und/oder Polymere benutzt werden können. Beispiele für die reaktiven Reste sind unter anderem Hydroxyl, Ether, Amino, Imino, Amido, Imido, Ammonium, Halogenid, Carboxyl, Carboxyhalogenid und Sulfhydryl. Bevorzugte Kernmoleküle sind unter anderem Ammoniak, Tris-(2-aminoethyl)amin, Lysin, Ornithin, Pentaerythritol und Ethylendiamin. Kombinationen dieser Reste wie auch andere reaktive Reste sind ebenfalls geeignet.
Oligomere und Polymere, die für die Herstellung der Dendrimer-Polykationen der Erfindung geeignet sind, sind pharmazeutisch verträgliche Oligomere und/oder Polymere, die im Körper gut vertragen werden. Beispiele für diese sind unter anderem Polyamidoamine, welche aus der Reaktion eines Alkylesters einer α,β-ethylenisch ungesättigten Carbonsäure oder eines α,β-ethylenisch ungesättigten Amids und eines Alkylenpolyamins oder eines Polyalkylenpolyamins stammen. Bevorzugt sind Methylacrylat und Ethylendiamin. Das Polymer wird vorzugsweise kovalent an das Kernmolekül gebunden.
Die endständigen Gruppen, die an den Oligomeren und/oder Polymeren befestigt werden können, sollten in der Lage sein, eine positive Ladung anzunehmen. Beispiele für diese sind Azole und primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre aliphatische und aromatische Amine und Azole, welche mit S oder O, Guanidium und Kombinationen von diesen substituiert sein können. Die endständigen kationischen Gruppen sind vorzugsweise in kovalenter Weise an den Oligomeren und/oder Polymeren befestigt. Bevorzugte endständige kationische Gruppen sind Amine und Guanidium. Jedoch können ebenfalls andere benutzt werden. Die endständigen kationischen Gruppen können in einem Anteil von ca. 10 bis 100% aller endständigen Gruppen des Oligomers und/oder Polymers und noch bevorzugter ca. 50 bis 100% vorliegen. Das Dendrimer-Polykation kann ebenfalls 0 bis ca. 90% endständige reaktive Reste außer den kationischen Gruppen umfassen. Geeignete endständige reaktive Reste außer den endständigen kationischen Gruppen sind unter anderem Hydroxyl, Cyano, Carboxyl, Sulfhydryl, Amid und Thioether, und Kombinationen von diesen. Jedoch können auch andere benutzt werden.
Das Dendrimer-Polykation ist nichtkovalent mit dem Polynukleotid assoziiert. Dieses erlaubt eine einfache Dissoziation oder Zerlegung der Zusammensetzung, wenn diese in die Zelle befördert wurde. Typische Dendrimer-Polykationen, die zur Verwendung hierin geeignet sind, weisen ein durchschn. MG (MWave) von ca. 2.000 bis 1.000.000 und noch bevorzugter ca. 5.000 bis 500.000 durchschn. MG auf. Jedoch sind andere Molekülgewichte ebenfalls geeignet. Bevorzugte Dendrimer-Polykationen weisen einen hydrodynamischen Radius von ca. 11 bis 60 Å und noch bevorzugter ca. 15 bis 55 Å auf. Jedoch sind andere Größen ebenfalls geeignet.
Gute Ergebnisse werden mit der vorliegenden Zusammensetzung erhalten, wenn der Anteil endständiger kationischer Gruppen des Dendrimer-Polykations zu dem Polynukleotid ca. 1 : 1 bis 25 : 1 und noch bevorzugter ca. 1 : 1 bis 10 : 1 beträgt. Jedoch können andere Anteile ebenfalls benutzt werden.
Die Zusammensetzung kann weiterhin ein Mittel umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus

1) DNA-maskierenden Komponenten;
2) Zellerkennungskomponenten;
3) Ladungsneutralisations- und Membranpermeabilisierungskomponenten; und
4) Subzellulären Lokalisierungskomponenten.

Jedes Element in diesem System einschließlich des Dendrimer-Polykations ist vorzugsweise in der Lage, seine angegebene Funktion auszuführen, und ist ebenfalls in der Lage, sich nach Bedarf mit dem Polynukleotid zusammenzusetzen oder sich davon zu trennen. Die Zusammensetzung kann weiterhin eines oder mehrere der obigen Mittel und noch bevorzugter zwei oder mehrere der obigen Mittel umfassen. Eine Ausführungsform des Systems ist im nachstehenden Schema 1 gezeigt.
Schema 1
In dieser Ausführungsform des Polynukleotid-Beförderungssystems der Erfindung ist NLS eine Kernlokalisationssequenz, ist MD eine Membranpermeabilisierungskomponente und ist Ligand eine Zellerkennungskomponente.
Wenn die Zusammensetzung der Erfindung ebenfalls ein Membranpermeabilisierungsmittel umfasst, beträgt der Anteil dieses Mittels zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations vorzugsweise ca. 1 : 100 bis 1 : 4 und noch bevorzugter ca. 1 : 50 bis 1 : 8. Jedoch sind andere Anteile ebenfalls geeignet. Das Membranpermeabilisierungsmittel kann durch kovalente oder elektrostatische Kräfte an das Dendrimer-Polykation gekoppelt sein. Die Zusammensetzung der Erfindung kann zusätzlich ein Phospholipid enthalten, welches in der Form eines Liposoms, eines Polykations wie beispielsweise eines Polyamins und dergleichen vorliegen kann.
Wenn die Zusammensetzung ein subzelluläres Lokalisierungsmittel umfasst, kann der Anteil des subzellulären Lokalisierungsmittels zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations ca. 1 : 100 bis 1 : 5 und noch bevorzugter ca. 1 : 80 bis 1 : 20 betragen. Jedoch sind andere Anteile ebenfalls geeignet. Das subzelluläre Lokalisierungsmittel kann durch kovalente oder nichtkovalente Kräfte an das Dendrimer-Polykation gekoppelt sein.
Wenn das subzelluläre Lokalisierungsmittel ein Kernlokalisierungsmittel ist, kann dieses ebenfalls einen DNA-assoziierenden Anteil wie beispielsweise einen einzelsträngigen Polynukleotid-Linker, ein Dendrimer-Polykation oder ein Bindemittel für die Haupt- oder Nebenfurche enthalten, der funktionsfähig an das Kernlokalisierungsmittel gekoppelt ist, in welchem Fall die Befestigung an der DNA vorzugsweise nichtkovalent ist. Der DNA-assoziierende Anteil kann ein interkalierendes Mittel, wie diese im Stand der Technik bekannt sind, sein. Beispiele für diese werden nachstehend beschrieben. Das interkalierende Mittel kann mit einem oder mehreren Liganden gekoppelt sein, die gezielt an einen Rezeptor binden, der auf der Oberfläche der eukaryotischen Zelle lokalisiert ist. In diesem Fall bilden der Ligand und das Dendrimer-Polykation ein Zellerkennungsmittel, das in der Lage ist, die eukaryotische Zelle zu erkennen, und der gezielt bindende Ligand ist ebenfalls an das Dendrimer-Polykation gekoppelt. Das interkalierende Mittel ist nichtkovalent an das Polynukleotid gekoppelt, und der Ligand ist vorzugsweise kovalent an das interkalierende Mittel gekoppelt. Ein Membranpermeabilisierungsmittel, das funktionsfähig an das interkalierende Mittel oder den Liganden gekoppelt ist, kann ebenfalls vorliegen. Zusätzlich kann die Zusammensetzung ebenfalls ein fusogenes Polypeptid umfassen, welches funktionsfähig an das Dendrimer-Polykation gekoppelt ist. Diese Kopplung kann kova lent oder nichtkovalent sein. Die Zusammensetzung kann ebenfalls einen DNA-assoziierenden Anteil wie beispielsweise jene, die nachstehend beschrieben werden, umfassen.
Wenn ein Ligand, der gezielt an einen Rezeptor bindet, welcher auf der Oberfläche einer eukaryotischen Zelle lokalisiert ist, in der Zusammensetzung vorliegt, beträgt der Anteil des gezielt an die Zelle bindenden Liganden zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations vorzugsweise ca. 1 : 100 bis 1 : 10 und noch bevorzugter ca. 1 : 80 bis 1 : 25. Jedoch sind andere Anteile ebenfalls geeignet. Beispiele für bevorzugte gezielt an die Zelle bindende Liganden sind Vitamine, Kohlenhydrate und Polypeptide. Jedoch sind andere ebenfalls geeignet. Das Polypeptid kann Antikörper oder Fragmente von diesen mit einer vorbestimmten Spezifität umfassen.
Wenn ein fusogenes Polypeptid an das Dendrimer-Polykation gekoppelt wird, beträgt der Anteil des fusogenen Polypeptids zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations vorzugsweise ca. 1 : 100 bis 1 : 4 und noch bevorzugter ca. 1 : 80 bis 1 : 10. Jedoch sind andere Anteile ebenfalls geeignet.
Die Zusammensetzung kann ebenfalls ein DNA-maskierendes Mittel enthalten, welches in der Lage ist, die zirkulatorische Halbwertszeit des Polynukleotids zu erhöhen. Das DNA-maskierende Mittel ist funktionsfähig durch kovalente oder nichtkovalente Kräfte an das Dendrimer-Polykation gekoppelt. Das DNA-maskierende Mittel ist jedoch vorzugsweise nichtkovalent an das Polynukleotid gekoppelt. Wenn das DNA-maskierende Mittel in der Zusammensetzung vorliegt, beträgt der Anteil des DNA-maskierenden Mittels zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations vorzugsweise ca. 1 : 33 bis 1 : 3 und noch bevorzugter ca. 1 : 25 bis 1 : 8. Jedoch sind andere Anteile ebenfalls geeignet.
Andere bestimmte Formen all dieser Mittel, die zu der Zusammensetzung zugegeben werden können, werden nachstehend beschrieben.
DIE FUNKTIONALEN KOMPONENTEN
(1) DNA-maskierende Komponenten
Das DNA-maskierende Element dieses Systems ist ein Molekül, welches in der Lage ist, das gesamte oder einen Teil des Polynukleotids zu maskieren, wodurch dessen zirkulatorische Halbwertszeit erhöht wird, indem ein Angriff durch abbauende Reagenzien, die im Blutkreislauf vorliegen, vermindert wird oder die Aufnahme durch das retikuloendotheliale System blockiert wird.
In dieser Erfindung kann Polyethylenglycol (PEG) kovalent mit einem DNA-assoziierenden Anteil durch herkömmliche Methoden wie unten beschrieben verknüpft werden und als ein DNA-maskierendes Mittel verwendet werden. Das PEG kann ein Molekulargewicht von ca. 700 bis 20.000 Dalton, vorzugsweise ca. 1.800 bis 6.000 Dalton aufweisen und liegt vorzugsweise in einem Verhältnis (Moleküle PEG : bp DNA) von ca. 1 : 4 bis 1 : 100 und noch bevorzugter ca. 1 : 20 vor.
Alternativ kann die DNA durch Assoziierung mit Lipiden maskiert werden. In einer Ausführungsform wird die DNA in Standardliposomen eingeschlossen, wie beispielsweise in dem US-Patent Nr. 4,394,448 von Szoka et al. beschrieben wird. In einer anderen Ausführungsform wird die DNA mit einem synthetischen kationischen Lipid inkubiert, das denen ähnelt, die in dem US-Patent Nr. 4,897,355 von Epstein et al. beschrieben werden. Diese kationischen Lipide weisen die folgende chemische Formel auf,
worin
n eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist;
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und (C₆-C₂₄)-Alkyl oder -Alkenyl sind;
R³ Wasserstoff oder (C₁-C₁₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist; und
R⁴ ein positiv geladenes lineares oder verzweigtes (C₁-C₃₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist, wobei eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit NR' substituiert sein können, wobei R' Wasserstoff oder (C₁-C₁₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist.
Bevorzugte Gruppen, welche als der Anteil -N-R' fungieren können, sind unter anderem Tris(aminoethyl)amin (NH₂CH₂CH₂)₃N, Agmatin (Decarboxy-Arginin) H₂N(CH₂)₄C(=NH)NH₂, 3-Aminoethyl-1,3-propandiamin H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₂NH₂, 3-Dimethylaminopropylamin (CH₃)₂NH(CH₂)₃NH₂, Iminobis(N,N')dimethylpropylamin NH((CH₂)₃N(CH₃)₂)₂, Iminobis(3-aminopropyl)-1,3-propandiamin, 1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazin, Bis(propylamin) (NH₂(CH₂)₃)₂NH, Spermidin und Spermin. Diese Gruppen werden vorzugsweise über eines ihrer Stickstoffatome an dem Lipidmolekül befestigt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das synthetische kationische Lipid ein synthetisches Lipid mit kationischem Schwanz mit der folgenden chemischen Formel
worin
n eine ganze Zahl von 6 bis 24 ist;
Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Ethanolamin, Cholin, Glycerol, Serin, Monomethoxypolyethylenglycol, Sialinsäure und Inositol;
R¹ (C₆-C₂₄)-Alkyl oder -Alkenyl ist;
R³ Wasserstoff oder (C₁-C₁₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist; und
R⁴ ein positiv geladenes lineares oder verzweigtes (C₁-C₃₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist, wobei eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit NR' substituiert sein können, wobei R' Wasserstoff oder (C₁-C₁₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist.
Bevorzugte Gruppen, welche als der Anteil -N-R' fungieren können, sind unter anderem Tris(aminoethyl)amin (NH₂CH₂CH₂)₃N, Agmatin (Decarboxy-Arginin) H₂N(CH₂)₄C(=NH)NH₂, 3-Aminoethyl-1,3-propandiamin H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₂NH₂, 3-Dimethylaminopropylamin (CH₃)₂NH(CH₂)₃NH₂, Iminobis(N,N')dimethylpropylamin NH((CH₂)₃N(CH₃)₂)₂, Iminobis(3-aminopropyl)-1,3-propandiamin, 1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazin, Bis(propylamin) (NH₂(CH₂)₃)₂NH, Spermidin und Spermin. Diese Gruppen werden vorzugsweise über eines ihrer Stickstoffatome an dem Lipidmolekül befestigt.
Die oben beschriebenen synthetischen kationischen Lipide maskieren die DNA, wenn sie damit assoziiert sind, wirkungsvoll. Ohne zu versuchen, die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken, wird angenommen, dass die Lipide eine Monolayer-Struktur bilden können, welche die DNA in einer gewissen Weise einschließt.
(2) Zellerkennungskomponenten
Das Zellerkennungselement dieses Systems ist ein Molekül, das in der Lage ist, eine Komponente auf der Oberfläche einer Zielzelle zu erkennen, das durch herkömmliche Methoden wie nachstehend beschrieben kovalent mit einem DNA-assoziierenden Anteil verknüpft ist. Zellerkennungskomponenten umfassen Antikörper gegen Zelloberflächenantigene, Liganden für Zelloberflächenrezeptoren einschließlich jener, die an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt sind, Peptidhormone usw. Spezifische Liganden, welche von dieser Erfindung umfasst sein sollen, umfassen Kohlenhydratliganden wie z. B. Galactose, Mannose, Mannosyl-5-phosphat, Fucose, Sialinsäuregruppen, N-Acetylglucosamin oder Kombinationen dieser Gruppen als komplexe Kohlenhydrate wie beispielsweise jene, die auf Glycolipiden der Blutgruppen oder auf verschiedenen sezernierten Proteinen gefunden werden. Andere Liganden umfassen Folat, Biotin, verschiedene Peptide, die mit der Zelloberfläche oder intrazellulären Rezeptoren wechselwirken können, wie z. B. das Chemoattraktant-Peptid N-Formyl-Met-Leu-Phe (SEQ ID NO: 2), Peptide, welche die Sequenz Arg-Asp-Glycin enthalten, oder Cys-Ser-Gly-Arg-Glu-Asp-Val-Trp (SEQ ID NO: 3)-Peptide, Peptide, welche einen Cystinrest enthalten oder die mit einem Zelloberflächenprotein wechselwirken, wie z. B. das menschliche Immundefizienzvirus-GP-120, und Peptide, welche mit CD-4 wechselwirken. Andere Liganden umfassen Antikörper oder Antikörperfragmente wie beispielsweise jene, die von Hertler und Frankel (Hertler, A., und Frankel, A., J. Clin. Oncol. 7: 1932 (1989)) beschrieben werden. Die Spezifität der Antikörper kann gegen eine Vielzahl von Epitopen gerichtet sein, welche auf Zelloberflächen exprimiert werden können, einschließlich Histokompatibilitäts-Makromolekülen, Autoimmunantigenen, viraler, parasitischer und bakterieller Proteine. Andere Proteinliganden umfassen Hormone wie z. B. Wachstumshormon und Insulin oder Proteinwachstumsfaktoren wie z. B. GM-CSF, G-CSF, Erythropoietin, epidermalen Wachstumsfaktor, basischen und sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor und dergleichen. Andere Proteinliganden umfassen verschiedene Cytokine, welche über Zelloberflächenrezeptoren arbeiten, wie z. B. Interleukin 2, Interleukin 1, Tumornekrosefaktor, sowie geeignete Peptidfragmente aus solchen Makromolekülen.
(3) Membranpermeabilisierungskomponenten
Das Membranpermeabilisierungselement dieses Systems ist ein Molekül, welches den Durchgang eines Polynukleotids durch eine Membran unterstützt. Die Liposomen und synthetischen kationischen Lipide, die oben als DNA-maskierende Komponenten beschrieben wurden, können ebenfalls als Membranpermeabilisierungskomponenten fungieren.
Die Membranpermeabilisierungskomponenten dieser Erfindung umfassen ebenfalls Polykationen, welche die große negative Ladung auf Polynukleotiden neutralisieren. Polykationen dieser Erfindung umfassen Polylysin, Polyarginin, Poly(Lysin-Arginin) und ähnliche Polypeptide, und die Polyamine und polykationischen Dendrimere wie beispielsweise jene, die oben beschrieben wurden und in den Beispielen benutzt werden und von Tomalia et al. (Tomalia, D. A. et al. (1990) supra) beschrieben wurden. Diese Dendrimere sind eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, da diese selbst in Assoziierung mit dem Polynukleotid wie oben beschrieben die Transfektionseffizienz des Polynukleotids wesentlich erhöhen können.
Diese nichtlinearen polykationischen Kaskadenpolymere vereinigen die DNA-Bindungs- und Beförderungseigenschaften von Polylysin und die lysosomotrophen Wirkungen schwacher Basen. Von Polyamidoamin (PAMAM)-Kaskadenpolymeren, einer wohldefinierten Klasse dendritischer Polymere, welche aus Methylacrylat und Ethylendiamin synthetisiert werden, wie von Tomalia et al., supra, beschrieben wird, wird in der beispielhaften Offenbarung gezeigt, dass diese von Zellen gut toleriert werden und dass diese, wenn sie mit Plasmiden komplexiert werden, welche Reportergene codieren, eine in hohem Maße effiziente Transfektion einer großen Vielzahl von Zellen in Kultur vermitteln.
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform kann ein amphipathisches Peptid wie z. B. GALA kovalent an dem Kaskadenpolymer befestigt werden (Subbarao, N. K., et al., "pH-Dependent Bilayer Destabilization by an Amphipathic Peptide", J. Biol. Chem. 26: 2964 (1987)). Diese Zusammensetzung ist ebenfalls eine meistbevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, da von dieser in der beispielhaften Offenbarung gezeigt wird, dass sie die Transfektionseffizienz des Polynukleotids sowohl in Primärzellen als auch Zelllinien signifikant erhöht.
Eine andere Klasse von Polykationen sind die kationischen Gallensalze mit der chemischen Formel
worin
X und Y unabhängig H oder OH sind;
R³ Wasserstoff oder (C₁-C₁₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist; und
R⁴ ein positiv geladenes lineares oder verzweigtes (C₁-C₃₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist, wobei eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit NR' substituiert sein können, wobei R' Wasserstoff oder (C₁-C₁₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist.
Bevorzugte Gruppen, welche als der Anteil -N-R' fungieren können, sind unter anderem Tris(aminoethyl)amin (NH₂CH₂CH₂)₃N, Agmatin (Decarboxy-Arginin) H₂N(CH₂)₄C(=NH)NH₂, 3-Aminoethyl-1,3-propandiamin H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₂NH₂, 3-Dimethylaminopropylamin (CH₃)₂NH(CH₂)₃NH₂, Iminobis(N,N')dimethylpropylamin NH((CH₂)₃N(CH₃)2)₂, Iminobis(3-aminopropyl)-1,3-propandiamin, 1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazin, Bis(propylamin) (NH₂(CH₂)₃)₂NH, Spermidin und Spermin. Diese Gruppen sind vorzugsweise über eines ihrer Stickstoffatome an dem Gallensalz befestigt.
In einer anderen Ausführungsform ist die membranpermeabilisierende Komponente der Erfindung ein amphipathisches kationisches Peptid. Amphipathische kationische Peptide sind Peptide, deren native Konfiguration derart ist, dass von dem Peptid angenommen wird, dass es eine kationische Seite und eine neutrale, hydrophobe Seite aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ein cyclisches Peptid. Beispiele für die amphipathischen kationischen Peptide dieser Erfindung sind Gramicidin S und die Tyrocidine. Das Peptid kann ebenfalls einige oder alle Aminosäuren in der D-Konfiguration, im Gegensatz zu der natürlich auftretenden L-Konfiguration, enthalten. Die chemische Struktur von Gramicidin S ist nachstehend gezeigt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das membranpermeabilisierende Element, zusätzlich zu den amphipathischen kationischen cyclischen Peptiden, entweder (1) ein Lipid oder (2) ein einfaches Polyamin oder beide.
Das Lipid der Erfindung ist ein amphipathisches Molekül, das zur Liposomenbildung fähig ist, und ist im Wesentlichen nicht toxisch, wenn es bei den notwendigen Konzentrationen entweder in nativer Form oder als Liposomen verabreicht wird. Geeignete Lipide weisen im Allgemeinen ein polares oder hydrophiles Ende und ein nichtpolares oder hydrophobes Ende auf. Geeignete Lipide umfassen ohne Beschränkung Ei-Phosphatidylcholin (EPC), Phosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Cholesterol (Chol), Cholesterylphosphorylcholin, 3,6,9-Trioxaoctan-1-ol-cholesteryl-3e-ol, Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und andere Hydroxycholesterol- oder Aminocholesterol-Derivate (siehe, z. B., Patel, K. R., et al., Biochim. Biophys. Acta 814: 256 (1985)). Das Lipid wird vorzugsweise in der Form von Liposomen zugegeben, und das zugegebene Polyamin ist vorzugsweise Spermin oder Spermidin.
Die membranpermeabilisierenden Elemente, das cyclische Peptid und gegebenenfalls Phospholipid und Polyamin können gleichzeitig oder nacheinander zu der Zusammensetzung zugegeben werden. Vorzugsweise wird das cyclische Peptid zuerst zugegeben und das Phospholipid oder Polyamin später. Das Molverhältnis von zugegebenem cyclischem Peptid zu Polyamin liegt vorzugsweise bei ca. 1 : 1 bis ca. 1 : 3. Das Molverhältnis von zugegebenem cyclischem Peptid zu Phospholipid beträgt vorzugsweise ca. 1 : 1 bis ca. 1 : 20.
(4) Subzelluläre Lokalisierungskomponenten
Das subzelluläre Lokalisierungselement dieses Systems ist ein Molekül, das in der Lage ist, eine subzelluläre Komponente in einer Zielzelle zu erkennen, welches durch herkömmliche Methoden wie nachstehend beschrieben kovalent mit einem DNA-assoziierenden Anteil verknüpft ist. Besondere subzelluläre Komponenten umfassen den Kern, Ribosomen, Mitochondrien und Chloroplasten.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist die subzelluläre Lokalisierungskomponente eine Kernlokalisierungskomponente. Die Kernlokalisierungskomponenten umfassen bekannte Peptide mit definierten Aminosäuresequenzen und längeren Sequenzen, welche diese Peptide enthalten. Eine bekannte Peptidsequenz ist das große SV 40 T-Antigen-Heptapeptid Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (SEQ ID NO: 1). Andere Peptide umfassen das Influenzavirus-Kernprotein-Decapeptid Ala-Ala-Phe-Glu-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser (SEQ ID NO: 4) und das Adenovirus-E1a-Proteinsegment Lys-Arg-Pro-Arg-Pro (SEQ ID NO: 5). Andere Sequenzen können aus Dingwall et al. (Dingwall, C., et al., TIBS 16: 478 (1991)) entnommen werden.
In einer anderen Ausführungsform ist die subzelluläre Lokalisierungskomponente eine lysosomale Lokalisierungskomponente. Eine bekannte Komponente, um gezielt das Lysosom zu binden, ist eine Peptid, welches das Segment Lys-Phe-Glu-Arg-Gln (SEQ ID NO: 6) enthält.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die subzelluläre Lokalisationskomponente eine mitochondriale Lokalisationskomponente. Eine bekannte Komponente zur gezielten Bindung an Mitochondrien ist ein Peptid, welches die Sequenz Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg (SEQ ID NO: 7) enthält. Jedoch sind andere subzelluläre Lokalisationskomponenten oder -mittel ebenfalls geeignet.
DNA-Assoziierende Anteile
Der DNA-assoziierende Anteil dieses Systems bezieht sich auf einen Teil einer funktionalen Komponente, welcher in einer nichtkovalenten Weise mit Nukleinsäuren wechselwirkt. Dieser Anteil ist durch herkömmliche Mittel oder wie nachstehend beschrieben kovalent mit dem Rest der funktionalen Komponente verknüpft. DNA-assoziierende Anteile sind vorzugsweise Bindemittel für die Haupt- und Nebenfurche, DNA-Interkalationsmittel oder allgemeine DNA-Bindemittel. Im Fall von einzelsträngigen Polynukleotiden kann der DNA-assoziierende Anteil sogar der Linker-Strang, wie er oben beschrieben wurde, sein. In einem solchen Fall ist der funktionale Anteil wie z. B. die Zellerkennungs- oder subzelluläre Lokalisierungs-Komponente kovalent mit dem Linker-Strang verknüpft.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DNA-assoziierende Anteil ein Bindemittel für die Haupt- oder Nebenfurche. Die Bindemittel für die Haupt- und Nebenfurche sind Anteile, von welchen bekannt ist, dass diese mit der Haupt- oder Nebenfurche der DNA assoziieren oder sich „darin einlagern". Diese Bindemittel umfassen Distamycin A und den Hoechst-Farbstoff 33258.
In einer anderen Ausführungsform ist der DNA-assoziierende Anteil ein nichtspezifisches DNA-Bindemittel wie beispielsweise ein Polykation. Polykationen dieser Erfindung umfassen Polylysin, Polyarginin, poly(Lysin-Arginin) und ähnliche Polypeptide, und die Polyamine und die polykationischen Dendrimere.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der DNA-assoziierende Anteil ein DNA-Interkalationsmittel. DNA-Interkalationsmittel sind planare, polycyclische Moleküle wie z. B. Ethidiumbromid, Acridin, Mitoxantron, Oxazolopyridocarbazol, Ellipticin und N-Methyl-2,7-diazapyrenium und Derivate von diesen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Interkalationsmittel ein Dimer, welches aus zwei kovalent verknüpften planaren polycyclischen Molekülen besteht. Ein planarer polycyclischer Dimeranteil dieser Erfindung weist die chemische Formel
auf, worin
Z eine Bindung ist;
n und m unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 20 sind;
p eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist; und
Ar₁ und Ar₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend unter anderem aus Ethidiumbromid, Acridin, Mitoxantron, Oxazolopyridocarbazol, Ellipticin und N-Methyl-2,7-diazapyrenium und Derivaten von diesen.
Die Werte von n und m sind wichtig, da diese den Abstand der interkalierten Acridin-Monomere in der DNA festlegen. Stärker bevorzugte Werte von n und m sind 3 bzw. 4. Bisacridin-Dimere, in welchen Ar₁ und Ar₂ beide Acridin sind, sind bevorzugt.
Dieser bevorzugte DNA-assoziierende Anteil kann kovalent mit einem funktionalen Anteil wie beispielsweise einem Zellerkennungsanteil, einem subzellulären Lokalisationsanteil oder einem membranpermeabilisierenden Anteil wie oben beschrieben verknüpft sein. Der Wert von p legt die Trennung des Interkalationsmittels von dem funktionalen Anteil fest. Bevorzugte Werte für p sind von 0 bis 8.
Der DNA-assoziierende Anteil kann kovalent an mehreren Kopien von einem, oder mehr als einem, funktionalen Anteil befestigt werden. Beispielsweise kann ein Bisacridin-Dimer an drei Galactoseresten befestigt werden, welche an den Hepatozyten-Asialoglycoprotein-Rezeptor binden.
Eine bevorzugte Methode zur Befestigung des DNA-assoziierenden Dimers an dem funktionalen Anteil beinhaltet einen Vorläufer mit der chemischen Formel
worin
n und m unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 20 sind;
p eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist;
Ar₁ und Ar₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Ethidiumbromid, Acridin, Mitoxantron, Oxazolopyridocarbazol, Ellipticin und N-Methyl-2,7-diazapyrenium und Derivaten von diesen; und
X eine reaktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N-Hydroxysuccinimid, Maleimid, Maleimidophenyl, Pyridyldisulfid, Hydrazid und Phenylglyoxal.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Ar₁ und Ar₂ Acridin, ist p 3 und ist X p-Maleimidophenyl. Dieser interkalierende Anteil wird dann z. B. über eine Sulfhydrylgruppe an dem funktio nalen Anteil an den funktionalen Anteil gekoppelt, um eine bifunktionale Komponente mit der chemischen Formel
zu erhalten, worin
Y eine funktionale Komponente ist;
n und m unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 20 sind;
p eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist;
Ar₁ und Ar₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Ethidiumbromid, Acridin, Mitoxantron, Oxazolopyridocarbazol, Ellipticin und N-Methyl-2,7-diazapyrenium und Derivaten von diesen; und
X eine reaktive Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N-Hydroxysuccinimid, Maleimid, Maleimidophenyl, Pyridyldisulfid, Hydrazid und Phenylglyoxal.
Biologisch abbaubare Linker wie z. B. Peptide mit dem Aminosäuresegment -Lys-Lys- können ebenfalls verwendet werden, um die funktionale Komponente an dem Interkalationsmittel zu befestigen.
In noch einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung weist das planare polycyclische Dimer die chemische Formel
auf, worin
Ar₁ und Ar₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Ethidiumbromid, Acridin, Mitoxantron, Oxazolopyridocarbazol, Ellipticin und N-Methyl-2,7-diazapyrenium und Derivaten von diesen;
jedes aa unabhängig eine Aminosäure ist;
x und z ganze Zahlen sind, die unabhängig ausgewählt sind aus 1 bis 100;
y eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist;
aa₁ und aa₂ Lysinreste sind; und
N¹ und N² Stickstoffatome aus den ε-Aminogruppen der Lysinreste aa₁ und aa₂ sind.
Die Zusammensetzung der Erfindung wird geeigneterweise benutzt, um ein Polynukleotid in eine eukaryotische Zelle einzuführen, indem dieses mit der Zelle in Kontakt gebracht wird. Die Einführung des Polynukleotids in die eukaryotische Zelle kann sowohl in vitro als auch in vivo erreicht werden. In vivo kann die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht werden, die ca. 0,5 μg bis 20 mg des Polynukleotids und noch bevorzugter ca. 2,5 μg bis 10 mg des Polynukleotids umfasst. Jedoch können andere Mengen ebenfalls verabreicht werden. Die vorliegende Methode ist geeignet zur Einführung von Polynukleotiden in Pflanzen- oder Tierzellen, einschließlich menschlicher Zellen, sowohl in vitro als auch in vivo.
Das Polynukleotid-Beförderungssystem der Erfindung ist in einem therapeutischen Zusammenhang nützlich. Bei therapeutischen Anwendungen kann die Zusammensetzung der Erfindung für eine Vielzahl von Verabreichungsarten, einschließlich systemischer und topischer oder örtlich beschränkter Verabreichung, formuliert werden. Techniken und Formulierungen können im Allgemeinen gefunden werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, neuste Ausgabe.
Die Zusammensetzung der Erfindung wird typischerweise über den oralen, transdermalen, systemischen oder inhalatorischen Weg verabreicht.
Für eine systemische Verabreichung ist eine parenterale Verabreichung wie z. B. eine Injektion, einschließlich intramuskulärer, intravenöser, intraperitonealer und subkutaner, bevorzugt. Um Störungen der Lunge zu behandeln, kann eine Verabreichung des Polynukleotid-Beförderungssystems durch Inhalation oder durch eine Einrichtung des Systems direkt in der Lunge durchgeführt werden.
Zur Injektion kann die Zusammensetzung der Erfindung in Form einer flüssigen Lösung, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern wie unter anderem z. B. Hank's Lösung oder Ringer's Lösung formuliert werden. Zusätzlich kann die Zusammensetzung ebenfalls in fester Form formuliert werden und in dieser Form verkauft und transportiert werden, und unmittelbar vor der Anwendung erneut gelöst oder suspendiert werden. Lyophilisierte Formen sind ebenfalls innerhalb der Grenzen dieser Erfindung eingeschlossen. Die feste Form kann ebenfalls direkt als ein trockenes Pulver in die Lungen, die Haut, den Gastrointestinaltrakt oder den Muskel verabreicht werden.
Die systemische Verabreichung der vorliegenden Zusammensetzung kann ebenfalls über transmukosale oder transdermale Mittel erfolgen, oder die Systeme können oral, oder durch intranasale oder inhalierte Aerosole verabreicht werden. Für die transmukosale oder transdermale Verabreichung werden Penetrationsmittel, welche für die zu überwindende Grenze geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Derartige Penetrationsmittel sind allgemein im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise für die transmukosale Verabreichung Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Zusätzlich können ebenfalls Detergenzien verwendet werden, um die Permeation zu erleichtern. Physikalische Mittel wie z. B. Hochgeschwindigkeitsimpaktion können ebenfalls verwendet werden, um die Durchdringung der äußeren Schicht der Haut zu erleichtern, um den Komplex in die Epidermis zu platzieren. Die transmukosale Verabreichung kann z. B. durch Nasensprays oder mit Hilfe von Suppositorien erreicht werden.
Für die orale Verabreichung kann die Zusammensetzung der Erfindung zu herkömmlichen oralen Verabreichungsformen wie z. B. Kapseln, Tabletten und Tonika formuliert werden.
Zur topischen Verabreichung werden die Systeme der Erfindung zu Salben (ointments, salves), Gelen oder Cremes formuliert, wie allgemein im Stand der Technik bekannt ist. Die topische oder transdermale Verabreichung kann durch Hochgeschwindigkeitsimpaktionsverabreichung auf die Hautoberfläche durchgeführt werden. Jedoch sind andere Mittel für die transdermale oder topische Verabreichung ebenfalls geeignet.
Nachdem nun diese Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird dieselbe durch Bezug auf gewisse bestimmte Beispiele, welche hierin nur zu Zwecken der Veranschaulichung angegeben werden und die Erfindung oder irgendeine Ausführungsform von dieser nicht beschränken sollen, sofern nichts anderes angegeben ist, besser verstanden werden.
BEISPIELE
Beispiel 1 (nicht beansprucht): Vergleich von DNA-Dendrimer-Komplex- und DNA-Polylysin-Komplex-vermittelten Transfektionen
Um besser chemisch definierte Alternativen zu den Polyaminpolymeren wie z. B. Polylysin zu finden, wurden die hydrophilen verzweigten Polykationen-Makromoleküle, welche ebenfalls als die Starburst^TM-Dendrimer-Mikropartikel bekannt sind (Tomalia et al., supra), eingesetzt, um einen Komplex mit der DNA oder mit der DNA und dem permeabilisierenden amphipathischen Peptid GALA (Parente, R., et al., Biochemistry 29: 8720 (1990)) zu bilden. Der Komplex wurde hergestellt, indem 12 μg pCLuc4-Plasmid in 660 μl HBS (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,4) in einem Polystyrolröhrchen verdünnt wurden. Polylysin (Sigma Chemical Co.) oder Starburst^TM-Dendrimermikropartikel der fünften Generation (1 nmol) (Polysciences, Inc.) wurden in 340 μl HBS gelöst und langsam (tropfenweise) zu der DNA-Lösung zugegeben. Unter diesen Bedingungen, liegen die positiven Ladungen der epsilon-Aminogruppen der Polylysine oder von den peripheralen Aminen der Dendrimere in einem 1,3-fachen Überschuss gegenüber den negativen Ladungen der Plasmide vor. Wenn das Peptid GALA zugegeben wurde, wurde dieses so zugegeben, dass die negativen Ladungen auf dem GALA die überschüssigen Ladungen auf dem Dendrimer neutralisierten. Die Mischung wurde nach der letzten Zugabe für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, und dann wurden 500 μl der Mischung zu CV-1-Zellen zugegeben. Das Transfektionsprotokoll wurde wie oben beschrieben durchgeführt. In diesem Experiment wurde das beste Transfektionsprotokoll mit dem GALA-Dendrimer-DNA-Komplex erreicht, worauf Dendrimer-DNA und dann Polylysin-DNA folgten. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Tabelle: DNA-Dendrimer-Vermittelte Transfektion
Beispiel 2: Materialien
PAMAM-Kaskadenpolymere, welche ausgehend von einem Ammoniak-Starterkern synthetisiert wurden (Generation 2 bis 10), wurden von der Polyscience, Inc. (Warrington, PA) erhalten und sind als Starburst^TM-Dendrimere bezeichnet. Wenn nötig wurden die Dendrimerlösungen unter Verwendung eines Savant SC110 Speed Vac-Systems konzentriert. Ähnliche Ergebnisse wie die, welche hier berichtet werden, wurden erhalten, wenn das Kaskadenpolymer in unserem Labor synthetisiert wurde, indem das Verfahren von Tomalia et al. (Tomalia et al., supra) verwendet wurde, wobei aber von Tris(2-aminoethyl)amin ausgegangen wurde. Die kommerziell verfügbaren Dendrimere sollten auf einer kalibrierten Gelpermeationssäule analysiert werden, um sicherzustellen, dass das Material dem angegebenen Durchmesser entspricht, da einige Chargen den Angaben nicht entsprachen. Poly(L-Lysin)hydrobromid mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 115 Lysinresten (pLys115) wurde von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl)dithio)propionat (SPDP) wurde von Pierce (Rockford, IL) erhalten.
GALACysTrp-Glu-Ala-Ala-Leu-Ala-GIu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-His-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Ala-Cys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 8), ein Cystein-haltiges Analoges des amphipathischen Peptids GALA, wurde an dem UCSF Bioresources Center synthetisiert, gereinigt und analysiert, wie im wesentlichen früher für GALA beschrieben wurde (Subbarao et al., supra).
Beispiel 3: Abkürzungen

DME: Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium.
EDTA: Ethylenediamintetraessigsäure.
HBS: Hepes-gepufferte Salzlösung (10 mM Hepes; 150 mM NaCl, pH 7,3).
HEPES: N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure).
MEM: Eagle's essentielles Minimalmedium.
MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid.
TRIS: Tris(hydroxymethyl)aminomethan
PAMAM SD54 und SD68: Polyamidoamin Starburst^TM Dendrimer mit 54 Å und 68 Å im Durchmesser.
pLys115: poly(L-Lysin), durchschnittliche Kettenlänge 115 Monomere.

Beispiel 4: Modifikation von SD54 mit GALACys (SEQ ID NO: 8)
Das PAMAM-Dendrimer der 5. Generation (54 Å im Durchmesser, SD54) wurde nach Schema 2 unten modifiziert.
Schema 2
Beispiel 5: Funktionalisierung von SD54 mit SPDP
Das Dendrimer (66 μmol endständige Amine, 15 mg) in 0,5 ml Wasser wurde mit 0,75 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) verdünnt, und 0,75 ml einer 15 mM Lösung von SPDP in Ethanol wurden tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 1 Std. unter Argon gerührt und auf einer Biogel-P2-Säule (2,8 × 20 cm) fraktioniert, die mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) eluiert wurde. Die Fraktionen, welche 3-(2-Pyridyldithio)propionat-modifizierte Dendrimere (PDP-SD54 mit einem Durchschnitt von 16 Dithiopyridin-Gruppen pro Partikel) enthielten, wurden vereinigt und zu einem Endvolumen von 3 ml konzentriert.
Beispiel 6: Reaktion von PDP-SD54 mit GALACys (SEQ ID NO: 8)
Ein Milliliter einer 10 mM Lösung von GALACys (SEQ ID NO: 8) in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) wurde tropfenweise zu 1 ml der konzentrierten PDP-SD54-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht unter Argon gerührt, und das GALA-Konjugat wurde gereinigt, indem die Reaktionsmischung auf einer kalibrierten Sephadex^TM G75-120-Säule (2 × 90 cm) (Kalibrierungskit Sigma MW-GF-70, welches Aprotinin (66.000) und Blue Dextran (2.000.000) enthielt) fraktioniert wurde und die Säule mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) eluiert wurde. Die Fraktionen, welche das Konjugat enthielten, welches bei einem apparenten Molekulargewicht von ca. 50.000 eluierte, wurden vereinigt, konzentriert und gegen HBS (10 mM Hepes; 150 mM NaCl, pH 7,3) dialysiert. Das dialysierte Material wurde mit HBS auf 1 mg Dendrimer/ml verdünnt und durch eine Millipore-Membran mit 0,45 μm steril filtriert.
Beispiel 7: Expressionsvektoren
Die Plasmide pCLuc4, welches Leuchtkäfer-Luciferase codiert, und pCMV-βGal, welches β-Galactosidase codiert, waren großzügige Gaben von Dr. Cotten, M. (Institute of Molecular Pathology, Wien, Österreich) bzw. Dr. Mc Gregor, G. (Howard Hughes Medical Institute, Houston, TX) (De Wet, J. R., et al., "Firefly Luciferase Gene: Structure and Expression in Mammalian Cells", Mol. Cell Biol. 7: 725 (1987); Mc Gregor, G. R., und Caskey, C. T., "Construction of Plasmids that Express E. coli β-galactosidase in Mammalian Cell Lines", Biotech. 7: 1116 (1989)). Die Plasmide wurden in Escherichia coli kultiviert, durch die Alkali-Lyse-Technik extrahiert und durch Zentrifugation in Gleichgewichts-CsCl-Gradienten gereinigt. Die Reinheit der Plasmide wurde durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel überprüft, und die DNA-Konzentration wurde aus der Extinktion bei 260 nm bestimmt.
Beispiel 8: Herstellung des Komplexes
Ein typischer Komplex wurde erzeugt, indem 6 μg Plasmid-DNA in 330 μl HBS in einem Polystyrolröhrchen verdünnt wurden. Das Polykation und/oder sein GALA-funktionalisiertes Derivat (2–160 μg) wurden in 170 μl HBS verdünnt und tropfenweise zu der DNA zugegeben. Wenn die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Lösung leicht gemischt. Die Bildung des Polykation-DNA-Komplexes wurde durch einen Gelretardierungstest gezeigt; Proben (30 μl) wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, wobei ein Tris-Acetat-EDTA-Puffersystem (pH 8,0) verwendet wurde, und die DNA wurde unter Verwendung einer Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht.
Beispiel 9: Zellen und Transfektionsprotokoll
Die adhärenten Zelllinien CV-1 (Affenfibroblasten), HeLa (menschliches Karzinom), HepG2 (menschliches Hepatom) wurden von der Zellkultureinrichtung der UCSF bereitgestellt. Die Zellen wurden bei einer Dichte von ca. 5 × 10⁵ Zellen pro 60 mm-Kulturschale (Falcon) in 3 ml DME-H21, das 10% FCS und Antibiotika (Penicillin, 100 Einheiten/ml und Streptomycin, 100 μg/ml) enthielt, plattiert. Die Zellen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, bis zur halben Konfluenz wachsen gelassen. In einem typischen Experiment wurden Zellen in 1,5 ml Medium ohne Serum durch die Zugabe von 0,5 ml HBS, welche 6 μg Plasmid enthielten, das mit der angegebenen Menge an Polykation komplexiert war, transfiziert. Das Medium wurde 5 Std. später entfernt und durch frisches Medium, welches 10% FCS enthielt, ersetzt. Die Zellen wurden für weitere 24 oder 48 Std.-Zeiträume kultiviert und im Hinblick auf eine Expression des Reportergens getestet.
Die Suspensionszelllinien K-562 (menschliche Erythroleukämie), EL-4 (Mäuselymphom) und Jurkat (menschliche T-Zellen) wurden von der Zellkultureinrichtung der UCSF erhalten und in RPMI 1640, das 10% FCS und Antibiotika enthielt, wachsen gelassen. Für das Transfektionsexperiment wurden 1,2 × 10⁶ Zellen in 1,5 ml RPMI 1640, das 7,5% FCS enthielt, in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen eingeführt oder in Polypropylenröhrchen rotiert und mit 6 μg DNA wie oben beschrieben transfiziert. Die Zellen wurden 5 Std. später auf frisches Medium, welches 10% FCS enthielt, überführt. Dieses wurde nach Zentrifugation der Platte oder der Röhrchen (1200 UpM für 5 min) und durch Entfernen von 90% des Transfektionsmediums und Ersetzen von diesem mit frischem vorgewärmtem Medium erreicht. Die Zellen wurden für weitere 24 oder 48 Std.-Zeiträume kultiviert und im Hinblick auf die Expression des Reportergens getestet.
Frisch isolierte Rattenhepatozyten wurden von Dr. M. Bissel (Leberzentrum, UCSF) erhalten und bei einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro 60 mm-Kulturschale in 3 ml eines Hepatozytenmediums, das aus 75% MEM und 25% Waymouth's Medium, das 10% FCS, Insulin (10 μg/ml), Transferrin (10 μg/ml), Dexamethason (1 μM) und Antibiotika (Penicillin: 100 Einheiten/ml; Streptomycin: 100 μg/ml und Gentamycin: 25 μg/ml) enthielt, zusammengesetzt war, plattiert. Die Zellen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, wachsen gelassen und 5 bis 6 Std. später wie oben beschrieben mit 6 μg Plasmid in 2 ml Hepatozytenmedium, welches 2% FCS enthielt, transfiziert. Nach einer Inkubationsperiode über Nacht wurde das Transfektionsmedium entfernt und durch 3 ml frisches Hepatozytenmedium, welches 2% FCS enthielt, ersetzt. Die Zellen wurden für 24 Std. weiter kultiviert und im Hinblick auf die Expression des Reportergens getestet.
Die β-Galactosidase-Genexpression wurde 24 Std. nach der Transfektion durch histochemische Anfärbung der Zellen unter Verwendung von X-Gal nachgewiesen (Lim, K., und Chase, C.-B., supra). Die Expression des Luciferase-Reportergens wurde 48 Std. nach der Transfektion an Zelllysaten quantifiziert, indem die Lichtemission mit einem Bioluminometer (Analytical bioluminescence, San Diego, CA) in Gegenwart von Luciferin und ATP gemessen wurde (Brasier, A. R., et al., "Optimized use of the Firefly Luciferase Assay as a Reporter Gene in Mammalian Cell Lines", Biotech. 7: 1116 (1989)).
Beispiel 10: Toxizitätstest
Die Wirkungen der Kaskadenpolymere auf das Zellwachstum wurden beurteilt, indem der Gesamtproteingehalt nach der Transfektion gemessen wurde, wie auch, indem ein kolorimetrischer Farbstoff-Reduktionstest verwendet wurde (Mosmann, T. R., "Rapid Colorimetric Assay for cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxycity Assays", J. Immunol. Methods 65: 55 (1983)). Die Wirkung der 6. Dendrimergeneration (68 Å im Durchmesser, SD68) wurde mit der Wirkung von Polylysin (pLys115) verglichen. Die Polykationen wurden zu den Zellen mit und ohne Plasmid-DNA bei einem Verhältnis von 10 endständigen Aminen des Polykations pro Nukleotid zugegeben. Die Zellen wurden bei einer Dichte von ca. 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 300 μl DME H-21 in flachen Schalen mit 96 Vertiefungen plattiert. Nach einer Kultivierung über Nacht bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ wurden die Zellen dreifach mit 200 μl serumfreiem Medium, das 0 bis 60 μg pLys115 oder SD68 enthielt, inkubiert. Nach 5 Std. wurde das Medium durch 200 μl frisches DME H-21, das 10% FCS enthielt, ersetzt, und die Zellen wurden für weitere 48 Std. kultiviert. Dann wurden 10 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, 5 mg/ml) pro Vertiefung zugegeben und für 2 Std. bei 37°C reagieren gelassen. Eine Solubilisierungslösung (0,4 N HCl in Isopropanol, 200 μl) wurde zugegeben, und die Platte wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde bei 570 nm gemessen, indem ein automatisches ELISA-Plattenlesegerät (MR 700, Dynatech Laboratories, Inc.) verwendet wurde, und wobei im Hinblick auf eine Hintergrundextinktion, die mit Zellen erhalten wurde, welche mit 6 M Guanidiniumhydrochlorid (100% tot) behandelt wurden, korrigiert wurde. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als % Reduktion bei der Lebensfähigkeit der Zellen = {1 – [OD₅₇₀ (behandelte Zellen) – Hintergrund]/[OD₅₇₀ (unbehandelte Zellen) – Hintergrund]} × 100.
Beispiel 11: Synthese und Charakterisierung von Modifizierten Kaskadenpolymeren
Das Dendrimer wurde verwendet, um funktionale Gruppen an Polynukleotiden wie z. B. DNA zu befestigen, um Genbeförderungsvehikel zu erzeugen. Das PAMAM-Dendrimer der 5. Generation wurde mit GALACys (SEQ ID NO: 8), einem cysteinhaltigen Analogen des amphipathischen Peptids GALA verknüpft, indem die standardmäßige SPDP-Kopplungschemie verwendet wurde (Carlsson, J., et al., "Protein Thiolation and Reversible Protein-Protein Conjugation. N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate, a New Heterobi-functional Reagent", Biochem. J. 173: 723 (1978)), wie in Tabelle 1 unten gezeigt wird. Tabelle 1: Synthese, Physikalische Eigenschaften und Funktionalisierung von PAMAM-Kaskadenpolymeren
Modifiziert ausgehend von der Literaturstelle Tomalia et al.
Das Dendrimer wurde nacheinander mit dem heterobifunktionalen Reagenz SPDP funktionalisiert und mit einem Überschuss an GALACys (SEQ ID NO: 8) umgesetzt. Das resultierende Konjugat wurde aus einer kalibrierten Sephadex^TM G75-120-Säule mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 50.000 Dalton eluiert. Dieses legt das Vorliegen von ca. 10 GALA-Resten pro Dendrimer nahe. Ein Durchschnitt von 13 GALA-Resten pro Dendrimer wurde quantifiziert, wobei ein molarer Extinktionskoeffizient für Tryptophan von ε_280nm = 5570 M^–1cm^–1 (pH 7,5) verwendet wurde. Da GALA 8 negative Ladungen pro Peptid enthält, sind die meisten der unmodifizierten Amine an den Konjugaten wahrscheinlich bei pH 7,4 neutralisiert. Dieses wird unterstützt durch das schwache Binden des GALA-Dendrimer-Konjugats an die DNA (siehe unten).
Beispiel 12: Bindung der Kaskadenpolymere an DNA
Proben (30 μl) der Polykation-pCMV-βGal-Komplexe wurden für 20 min inkubiert und auf einem 0,8%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, wobei ein Tris-Acetat-EDTA-Puffersystem (pH 8,0) verwendet wurde. Die Komplexe wurden gebildet, indem 6 μg pCMV-βGal-Plasmid, verdünnt in 330 μl HBS, mit den folgenden Agenzien in 170 μl HBS gemischt wurden.
Bahn 1: pCMV-βGal allein;
Bahn 2: 2 μg pLys115;
Bahn 3: 4 μg pLys115;
Bahn 4: 4 μg SD68;
Bahn 5: 6 μg SD68;
Bahn 6: 4 μg SD54, bereitgestellt durch das GALA-SD54-Konjugat;
Bahn 7: 160 μg SD54, bereitgestellt durch das GALA-SD54-Konjugat;
Bahn 8: 4 μg SD54, bereitgestellt durch eine äquimolare Mischung von SD54 und GALA-SD54.
Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen war, wurde das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt, um die DNA sichtbar zu machen.
Die PAMAM-Dendrimere binden an DNA, wie durch die Retention des Komplexes an dem Punkt der Auftragung auf einem Agaroseelektrophoresegel nachgewiesen wird, wie in 1 gezeigt ist. Sowohl das Polylysin (Bahnen 2 und 3) als auch das Kaskadenpolymer (Bahnen 4 und 5) waren in der Lage, die DNA auf dem Gel zu retardieren und zu immobilisieren. Die Gelretardierung ist eine Folge von elektrostatischen und sterischen Effekten und legt die Bildung eines Ladungskomplexes zwischen positiv geladenen Dendrimeren und der anionischen DNA nahe. Da die endständigen Amine des Dendrimers einen niedrigeren pK_a aufweisen als das Lysin-εNH₂ (siehe Diskussion), war das Dendrimer etwas weniger wirksam bei der Herbeiführung einer Gelretardierung als Polylysin, wie in 1 gezeigt wird. Mit Polylysin wurde eine vollständige Retention des Plasmids bei einem Verhältnis εNH₂ zu Nukleotid von 1 : 1 beobachtet (Bahn 3), wogegen mit dem Dendrimer eine vollständige Retention bei einem Verhältnis von endständigen NH₂ zu Nukleotid von ca. 1,5 : 1 auftrat (Bahn 5). Das exakte Verhältnis der vollständigen Retention variierte bei den Experimenten um einen Verdünnungsfaktor. Das GALA-Dendrimer-Konjugat immobilisierte die DNA nicht und beeinflusste die Wanderung des Plasmids nur leicht, selbst wenn es in großem Überschuss gegenüber der DNA verwendet wurde (Bahnen 6 und 7). Eine Kombination aus GALA-Dendrimer-Konjugat und unmodifiziertem Dendrimer (Verhältnis 1 : 1, wie in den Transfektionstests verwendet) hielt das Plasmid teilweise zurück (Bahn 8).
Beispiel 13: Optimierung des Komplexes zur Transfektion
CV-1-Zellen (500.000 Zellen pro 60 mm-Schale) wurden zweifach mit steigenden Mengen an pCLuc4 (0,1 bis 6 μg), komplexiert mit SD68, transfiziert. In 3 wurden die Komplexe gebildet, indem das Dendrimer gelöst in 170 μl HBS zu der DNA in 330 μl HBS zugegeben wurde; (☐), Komplexe wurden zuerst gebildet, indem 25 μg SD68 auf 6 μg pCLuc4 zugegeben wurden und dann in HBS bis zu der angegebenen Menge an DNA verdünnt wurden; (O), das Plasmid wurde zuerst in HBS verdünnt und 25 μg SD68 wurden zugegeben; (Δ), ein nicht Luciferase enthaltendes Plasmid wurde zu dem verdünnten pCLuc4-Plasmid zugegeben, um die Gesamtmenge der DNA konstant bei 6 μg/330 μl zu halten, und dann wurden 25 μg SD68 zugegeben. Die Luciferaseexpression wurde 48 Std. nach der Transfektion wie in Tabelle 2 unten beschrieben gemessen. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Bereich von zweifachen Bestimmungen.
Ein unerwarteter Fund bei dieser Arbeit ist, dass die PAMAM-Kaskadenpolymere selbst DNA (z. B. Plasmide, welche Reportergene codieren) in Zellen in Kultur transfizieren können. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten und in den 2 bis 4 gezeigt.
Tabelle 2: Einfluss der Menge und Größe des PAMAM-Kaskadenpolymers, das mit dem pCLuc4-Plasmid komplexiert ist, auf die Expression des Luciferase-Reportergens in CV-1-Zellen
Die Luciferase-Aktivität in den transfizierten Zellen (Lichteinheiten pro mg Zellprotein) ist als der Mittelwert ± Bereich von doppelten [Messungen] gezeigt.
Wenn die Transfektion toxisch war, ist die prozentuale Rückgewinnung von Zellprotein in transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen in eckigen Klammern angegeben.
Die Transfektionsaktivität war besonders hoch, wenn ein Überschuss von endständigen Aminen zu Nukleotid verwendet wurde. Um die Parameter zu definieren, welche die Genbeförderung und Expression durch die Dendrimere steuerten, wurden CV-1-Zellen mit pCLuc4-Dendrimer-Komplexen transfiziert und die Luciferase-Expression als eine Funktion des Durchmessers und der Menge des Dendrimers in dem Komplex gemessen (siehe Tabelle 2 oben). Die Transfektion reagierte auf beide Faktoren. Eine hohe Luciferase-Expression erforderte einen Überschuss an Polykation. Bei einem niedrigen Dendrimerinput ([Dendrimer, primäre Amine] ≤ [Nukleotide]) waren die Zellen nur schlecht mit den Komplexen transfiziert.
In dem getesteten Konzentrationsbereich vermittelten die Dendrimere mit großem Durchmesser (ø ≥ 40 nm) bessere Transfektionseffizienzen als die kleineren. Die Luciferase-Expression stieg um 2 bis 3 Größenordnungen, wenn der Durchmesser des komplexbildenden Dendrimers von 40 Å (Generation 4) auf 54 Å (Generation 5) erhöht wurde. Dies kann am besten an einer Untersuchung der Daten in einem dreidimensionalen Diagramm erkannt werden (siehe 2). Maximale Transfektionsniveaus (≥ 10¹⁰ LU/mg Zellprotein) wurden mit dem Dendrimer der 6. Generation (SD68, 68 Å Durchmesser) bei einem Verhältnis von 6 primären Aminen pro Nukleotid erhalten. Bei diesen Bedingungen war die Luciferase-Expression in CV-1-Zellen ca. 1000-fach größer als die, welche mit einer äquivalenten Menge an Polylysin 115 erhalten wurde (siehe Tabelle 2 oben), und 100-fach größer als die, welche mit dem kationischen Lipid DOTMA erhalten wurde (Legendre, J. Y., und Szoka, F. C., "Delivery of Plasmid DNA into Mammalian Cell Lines using pH-Sensitive Liposomes: Comparison with Cationic Liposomes", Pharm. Res. 9: 1235 (1992)).
Die optimierten Bedingungen wurden in 10 separaten Experimenten in CV-1-Zellen getestet, und Luciferaseaktivitäten zwischen 2 × 10⁹ und 3 × 10¹⁰ LU/mg an Zellproteinen wurden erhalten. Wenn CV-1-Zellen mit Dendrimer in einem Medium, das 10% FCS enthielt, transfiziert wurden, war die Luciferase-Expression ca. zweifach herabgesetzt, wogegen die Expression im Fall von DOTMA (Legendre et al., supra) 50-fach herabgesetzt war.
Eine Dosis-Reaktion der Luciferaseaktivität gegenüber dem DNA-Input bei einem konstanten Verhältnis von endständigen Aminen/Nukleotid von 6 : 1 wurde konstruiert, indem das Dendrimer mit 68 Å Durchmesser (SD68) verwendet wurde, und ist in 3 gezeigt. Wenn der Komplex zuerst gebildet und dann zu der angegebenen Menge an pCLuc4-Plasmid verdünnt wurde, wurde eine lineare Abnahme bei der Expression der Luciferase beobachtet (siehe 3). Wenn nicht Luciferase enthaltendes Plasmid verwendet wurde, um das Luciferase-Plasmid und das zugegebene Dendrimer zu verdünnen, wurde die Transfektionsaktivität ebenfalls auf eine lineare Weise herabgesetzt, wenn das Plasmid zuerst verdünnt wurde und eine konstante Menge an Dendrimer zugegeben wurde. In diesem Fall stieg das Verhältnis Dendrimer/Plasmid mit der Verdünnung des pCLuc4-Plasmids an, wobei die Transfektionsaktivität in einem größeren Ausmaß sank (siehe 3).
Beispiel 14: Transfektion von Säugerzellen mit SD-68-DNA-Komplexen bei niedrigen Verhältnissen von Endständigen Aminen/Nukleotid
Jeder Zelltyp, welcher in dieser Studie untersucht wurde, einschließlich adhärenter und Suspensions-Zellen wie auch primärer Kulturen und etablierter Linien, konnte mit dem PAMAM-Dendrimer-Plasmid unter den Bedingungen von überschüssigen endständigen Aminen gegenüber Nukleotiden transfiziert werden (4A). Die Transfektionseffizienz des optimierten Komplexes wurde ebenfalls untersucht, indem das pCMV-βGal-Plasmid verwendet wurde. Die β-Galactosidaseaktivität wurde durch eine histochemische Anfärbung 24 Std. nach der Transfektion nachgewiesen und transfizierte Zellen ausgezählt. Diese Daten sind als der Prozentsatz am Ende des Balkens auf dem Diagramm angegeben (siehe 4A). Die verschiedenen untersuchten Zelltypen unterschieden sich in ihrer Fähigkeit, eine Transfektion zu durchlaufen (bis zu 80% Transfektion bei CV-1, weniger als 1% Transfektion bei EL-4 und Jurkat). Diese Variabilität ist eine allgemeine Eigenschaft, welche von allen Genbeförderungssystemen geteilt wird; der Grund für eine derartige variable Transfektion bei unterschiedlichen Zelltypen wird noch nicht verstanden.
Bei dem niedrigeren Dendrimer-Input war die Transfektionseffizienz der Dendrimer-DNA-Komplexe dramatisch verringert (siehe 4A und 4B). Die verringerte Transfektionsaktivität mit niedrigeren Verhältnissen von endständigen Aminen/Nukleotid ist ähnlich zu den Ergebnissen, die mit Polylysinen erhalten werden. So wurde die Möglichkeit untersucht, dass Behandlungen, welche die Transfektion erhöhen können, welche von linearen Polykationen vermittelt wird, die Dendrimer-vermittelte Transfektion erhöhen könnten. Die Transfektion war im Wesentlichen unempfindlich gegenüber Chloroquin (Daten nicht gezeigt), war aber signifikant erhöht, wenn das fusogene Peptid GALA an dem Dendrimer befestigt wurde (siehe 4B).
Beispiel 15: Verstärkung der Transfektion durch Kovalente Befestigung des Amphipathischen Peptids GALACys (SEQ ID NO: 8) an dem Kaskadenpolymer
Die Endosomen-zerstörenden Wirkungen von inaktivierten Viruspartikeln und von viralen fusogenen Peptiden wurden ausgenutzt, um den Polylysin-vermittelten Gentransfer auszulösen oder zu verstärken (Wagner, E., et al., "Coupling of Adenovirus to Transferrin-polylysine/DNA Complexes Greatly Enhances Receptor-Mediated Gene Delivery and expression of Transfected Genes", PNAS (USA) 89: 6099 (1992); Wagner, E., et al., "Influenza Virus Hemagglutinin HA-2N-terminal Fusogenic Peptides Augment Gene Transfer by Transferrin-polylysine/DNA Complexes: Toward a Synthetic Virus-Like Gene-Transfer Vehicle", PNAS (USA) 89: 7934 (1992)). Das Peptid GALA mit 30 Aminosäuren wurde entworfen, um Lipiddoppelschichten auf eine pH-empfindliche Weise zu destabilisieren, um die Eigenschaften von viralen fusogenen Proteinen zu imitieren (Subbarao, N. K., et al., supra). GALA wurde hierin an dem Dendrimer befestigt, um zu testen, ob es die Transfektion erhöhen würde, wie dies die Viruspartikel oder die viralen fusogenen Peptide tun. Bei einem niedrigen Verhältnis von endständigen Aminen : Nukleotid war die Transfektionseffizienz der Dendrimer-DNA-Komplexe niedrig. Jedoch war die Transfektion signifikant verbessert, wenn 50% des Dendrimers in dem Komplex durch dessen GALA-Konjugat ersetzt wurden (siehe 4B). Unter diesen Bedingungen kann das Konjugat bei einem niedrigen Dendrimer/Plasmid-Verhältnis (in diesen Experimenten ca. 50 : 1) funktionieren. Im Fall von einigen Zelltypen wie z. B. K562 war das GALA-Konjugat genauso wirksam wie wenn ein Überschuss des Dendrimers zur Transfektion eingesetzt wurde (siehe 4A und 4B). Diese Ergebnisse zeigen, dass GALA die Transfektion verstärkt, möglicherweise durch ein Katalysieren des Auslaufens der Endosomen. Bei einem Dendrimer-Input, bei welchen die Transfektion maximal war, wurde die Expression durch GALA nicht weiter verstärkt. Dieses kann daran liegen, dass die Dendrimere lysosomotrophe Wirkungen zeigen.
Beispiel 16: Vergleich der Cytotoxizität des PAMAM-Kaskadenpolymers und von pLys115
Ein Hinweis auf die Toxizität des Transfektionsvorgangs ist die Menge an Zellprotein, die aus den Kulturen nach der Transfektion erhalten wird. Behandlungen, die zu einer Abnahme bei der Ausbeute an Zellprotein führten, wenn mit unbehandelten Zellen verglichen wurde, sind in der Tabelle 2 oben in eckigen Klammern angegeben. Im Allgemeinen schien die Dendrimer-DNA-induzierte Cytotoxizität durch die folgenden drei Hauptparameter gesteuert zu werden.

1) Den Durchmesser des Dendrimers.
2) Die zugegebene Menge.
3) Ob DNA vorhanden war oder nicht.

Der letzte Faktor kann besser erkannt werden, indem die Toxizität des Dendrimers SD-68 mit der von Polylysin 115 an CV-1-Zellen in der Gegenwart und Abwesenheit von Plasmid-DNA verglichen wird (siehe 12). Die Gesamtcytotoxizität von SD68 war niedrig, wenn sie mit der von pLys115 verglichen wurde. In Abwesenheit von DNA betrug die LD₅₀ von pLys115 bei CV-1-Zellen 25 μg/ml, wogegen die LD₅₀ von SD68 größer als 300 μg/ml war. In Gegenwart von Plasmid-DNA (Verhältnis von 10 : 1 primäre Amine des Polykations : Nukleotid) wurde die Cytotoxizität von pLys115 nicht beeinflusst, während die von SD68 erhöht wurde (LD₅₀ von SD68-DNA = 100 μg/ml), aber immer noch signifikant niedriger war als die von pLys115.
Wenn optimierte Transfektionsbedingungen benutzt wurden, betrug die Konzentration von SD68 12,5 μg/ml, ein Dendrimerniveau, das eine ca. 35%ige Abnahme bei der Farbstoffreduktion (siehe 5) wie auch bei der Zellproteingewinnung (siehe Tabelle 2 oben) induzierte. Gemäß dem Zellprotein, das am Ende des Tests zurück gewonnen wurde, wurde die Transfektion mit SD68-DNA-Komplexen von all den verschiedenen getesteten Zelltypen ziemlich gut toleriert (Proteingewinnung ≥ 60%).
Beispiel 17: Diskussion der Ergebnisse
Polykationische Polymere wie z. B. Polylysine wurden weithin für einen Gentransfer in Tierzellen verwendet (Felgner, P. L., Adv. Drug Delivery Rev. 5: 163 (1990)). Die auf Polylysin basierenden Vektoren weisen eine hohe Beförderungskapazität auf, aber eine effiziente Transfektion der Zielzellen tritt nur in Gegenwart von Endosomen-zerstörenden oder lysosomotrophen Mitteln auf (Cotten, M., et al., "Transferrin-Polycation-Mediated Introduction of DNA into Human Leukemic Cells: Stimulation by Agents that Affect the Survival of Transfected DNA or Modulate Transferrin Receptor Levels", PNAS (USA) 87: 4033 (1990); Cotten, M., et al., "High Efficiency Receptor-Mediated Delivery of Small and Large (48 Kb) Gene Constructs Using the Endosome Disruption Activity of Defective or Chemically-Inactivated Adenovirus Particles", PNAS (USA) 89: 6094 (1992)). Die polykationischen Polymere aus den Beispielen 1 bis 16 zeigen die vereinigte Beförderungskapazität der Polylysine und die Transfektionskapazität eines Virus.
Die PAMAM-Kaskadenpolymere, welche hierin verwendet werden, sind abgeleitet von einem Ammoniakkern und -CH₂CH₂CONHCH₂CH₂N-Einheiten, welche aus aufeinander folgenden Additionen von Methylacrylat und Ethylendiamin resultieren, wie in Tabelle 2 oben gezeigt ist. Diese gesteuerte schrittweise Wachstumsausbreitung dieser Struktur erzeugt zunehmend höhere Generationen von Polymeren mit dimensional präzisen Oberflächen und mit einer definierten Anzahl an Oberflächengruppen (Tomalia, D. A., et al., supra). Der Durchmesser der Dendrimere einer höheren Generation ist ähnlich dem Durchmesser des Histonkerns von Chromatin (ca. 70 Å) und könnte als ein Gerüst wirken, um die DNA zu kondensieren (Richmond, T. J., et al., "Structure of the Nucleosome Core Particle at a 7 Å Resolution", Nature 311: 532 (1984)). So unterscheiden sich die PAMAM-Dendrimere von den Polylysinen in ihrer gut charakterisierten Formel und Struktur, ihrer Verzweigung und dem niedrigen pK_a ihrer endständigen Amine (pK_a = 6,9) und inneren Amine (pK_a = 3,9) (Tomalia, D. A., et al., supra).
Die effiziente Aufnahme der DNA in die Zelle, wenn diese mit Polykationen assoziiert ist, kann auf einer Reißverschluss-ähnlichen Assoziation der überschüssigen positiven Ladungen des Polykationen-DNA-Komplexes mit negativ geladenen Zelloberflächengruppen beruhen. Diese Wechselwirkung kann zu einer Adsorptionsendozytose und einer Membrandestabilisierung führen, wie dieses von Behr für kationische Liposomen-DNA-Komplexe vorgeschlagen wurde (Behr, J.-P., "Synthetic Gene Transfer Vectors", Acc. Chem. Res. 26: 274 (1993)). Tatsächlich sind die DNA-Bindungsfähigkeiten des Polylysins und des Dendrimers, welche durch Gelretardierung untersucht wurden, etwas ähnlich (siehe 1). Um die Membrandestabilisierung nach der Endozytose zu erhöhen, wurde das membrandestabilisierende Peptid GALA an dem Dendrimer befestigt.
Wenn sie im Hinblick auf die Plasmidbeförderung und Transfektion getestet wurden, zeigten die unmodifizierten PAMAM-Dendrimere ausgezeichnete Charakteristika. Es wurde festgestellt, dass die Transfektionseffizienz von der Größe und der Menge des Dendrimers in dem DNA-Dendrimer-Komplex abhängt. Bemerkenswerterweise wurde eine dramatische Zunahme bei der Transfektion beobachtet, wenn der Durchmesser des Dendrimers von 40 Å (Generation 4) auf 54 Å (Generation 5) erhöht wurde. Der Grund für diese Schwellenwirkung ist noch unklar, kann aber mit dem Durchmesser und der Struktur des Polymers zusammenhängen. Auch wenn die PAMAM-Dendrimere der Generation 3 einem Seestern ähneln, weisen sie ab der Generation 5 eine kugelförmige Form von ca. 54 Å im Durchmesser auf (Tomalia, D. A., et al., supra). Diese kugelförmige Form könnte als ein in hohem Maße strukturierter Kern dienen, um die DNA vorteilhaft einzuzwängen, wie dieses bei Chromatin auftritt (Richmond, T. J., et al., supra). Alternativ kann die kugelförmige Form effizienter sein, um Membranen zu destabilisieren, als entweder Dendrimere einer niedrigeren Generation oder lineare Polykationen.
Die PAMAM-Kaskadenpolymere unterscheiden sich von Polylysinen ebenfalls in dem pK_a ihrer primären und inneren Aminogruppen (pK_a's = 6,9, 3,9). Diese Eigenschaft kann für die Transfektion ebenfalls wichtig sein. Bei physiologischem pH sind die PAMAM-Dendrimere nur teilweise protoniert und sollten lysosomotrophe Wirkungen zeigen, die schwachen Basen ähneln (Stenseth, K. und Thyberg, J., "Monensin and Chloroquine Inhibit Transfer to lysosomes of Endocytosed Macromolecules in cultured Mouse Peritoneal Macrophages", Eur. J. Cell. Biol. 49: 326 (1989)). Zusätzlich weisen die inneren tertiären Aminogruppen, welche die Verzweigungen des Dendrimers ausmachen, einen pK_a von 3,9 auf und könnten ebenfalls zu der lysosomotrophen Wirkung beitragen. So sollte das Dendrimer in der Lage sein, die endosomale Ansäuerung nach der Aufnahme des Komplexes in die Zelle abzupuffern. Die mutmaßlichen lysosomotrophen Eigenschaften der PAMAM-Dendrimere könnten erklären, warum ein Überschuss an Dendrime ren für eine hohe Transfektion benötigt wird, wogegen ein Überschuss an Polylysinen die Transfektion nicht erhöht (siehe Tabelle 2 oben). Die Seitenketten-Aminogruppen (pK_a = 9 bis 10) von Polylysin sind bei neutralem pH stark geladen und können die Ansäuerung des Endosoms nicht abpuffern. Dieses wird durch die Beobachtung gestützt, dass die Transfektionseffizienz des Dendrimer-DNA-Komplexes durch Chloroquin nicht erhöht wird (Daten nicht gezeigt). Die Transfektionseffizienz des Polylysin-DNA-Komplexes wird andererseits in Gegenwart von Chloroquin gewöhnlich dramatisch erhöht (Cotten, M., et al. (1990), supra).
Der Komplex, welcher aus Plasmid-DNA und SD68 bei einem Verhältnis von 6 endständigen Aminen von SD68 pro Nukleotid zusammengesetzt war, zeigte die beste Transfektionsaktivität. Unter diesen optimalen Bedingungen gibt es ca. 320 SD68-Partikel pro pCLuc4-Plasmid, jedoch können nicht alle Dendrimer-Partikel an Komplexen mit DNA beteiligt sein. Wie oben vorgeschlagen, kann das überschüssige Dendrimer als ein lysosomotrophes Mittel wirken. Über diesem optimalen Verhältnis wird das System weniger effizient. Ein Erhöhen der Menge an SD68 kann die Transfektionseffizienz aufgrund der Toxizität, die mit dem Komplex verbunden ist, erniedrigen. Alternativ könnte eine Zunahme der Menge an nicht komplexiertem Dendrimer-Komplex mit dem DNA-Dendrimer um mutmaßliche Bindungsstellen auf der Zelloberfläche konkurrieren. Dieses würde den Spiegel der zellassoziierten DNA erniedrigen und auf diese Weise die Transfektionseffizienz erniedrigen.
Ein Erhöhen des Durchmessers des Dendrimers, während das Verhältnis von 6 : 1 beibehalten wurde, erhöhte die Toxizität nicht, verminderte aber die Transfektionseffizienz. Wenn sie unter dem optischen Mikroskop beobachtet wurden, zeigten Zellen, welche Dendrimer-DNA-Komplexen ausgesetzt wurden, die aus Dendrimer gebildet wurden, das größer war als das der 6. Generation, große intracytoplasmatische Vakuolen. Vakuolen mit dieser Größe werden bei Zellen, die mit Komplexen behandelt wurden, welche aus Dendrimeren der 6. Generation oder niedrigeren Generationen gebildet wurden, nicht beobachtet. Es ist nicht klar, ob die Vakuolen mit den beobachteten verminderten Transfektionsraten zusammenhängen.
Die Toxizität wurde weiter untersucht, indem der MTT-Farbstoffreduktionstest verwendet wurde. Das SD68-Dendrimer wird von Zellen gut vertragen, viel besser als äquivalente Mengen an pLys115. Der deutliche Unterschied in der Toxizität zwischen pLys115 und SD68 kann auf einem Unterschied bei dem Ionisierungszustand der Partikel beruhen. Bei physiologischem pH trägt Polylysin mehr positive Ladungen als die Dendrimere und sollte eine stärkere Wechselwirkung mit Zellmembranen aufweisen. Die Toxizität des Dendrimers war in Gegenwart von Plas mid-DNA signifikant erhöht, blieb aber geringer als die der entsprechenden Polylysin-DNA-Komplexe.
Das GALA-Peptid, ein Membrandestabilisator, war in der Lage, die Transfektionsaktivität des Komplexes signifikant zu erhöhen, wenn dieses kovalent an dem Dendrimer befestigt wurde (siehe 4B). GALA ist ein wasserlöslicher Membrandestabilisator, und dessen pH-abhängige Wechselwirkung mit Membranen ist gut untersucht (Subbarao, N. K., et al., supra); Parente, R. A., et al., "Association of a pH-Sensitive Peptide with Membrane Vesicles: Role of Amino Acid Sequence", Biochem. 29: 8713 (1990) und Literaturstellen darin). Peptide mit dem GALA-Motiv wurden von anderen an Antikörpern befestigt, um ihre Tumorzellretention und Aufnahme zu erhöhen (Anderson, D. C., et al., "Enhanced In Vitro Tumor Cell Retention and Internalization of Antibody Derivatized with Synthetic Peptides", Bioconjugate Chem. 4: 10 (1993)). Die Tatsache, dass die Dendrimer-GALA-Konjugate, gemischt mit unmodifizierten Dendrimeren in einem Verhältnis von 1 : 1, die Transfektion erhöhen, zeigt, dass die Dendrimere ausgezeichnete Bestandteile von hocheffizienten Transfektionssystemen sind.
Auf Starburst^TM-PAMAM-Dendrimeren basierende Transfektionsvorgänge bilden einfache und effiziente Methoden für einen Gentransfer in Tierzellen. Die überlegenen Ergebnisse, die mit einer großen Vielzahl von Zellen erhalten wurden (siehe 4), zeigen, dass die PAMAM-Dendrimere selbst gut für die direkte Beförderung von Genen in Tiere geeignet sind.
Beispiel 18: Synthese von MPB-bA
Ein bifunktionales Molekül, bestehend aus einem reaktiven Sulfhydrylmaleimid, das an einem Bisacridin-Spermidin befestigt war (N4[p-(Maleimidophenyl)butyryl]N₁,N₈(bis-9-acridinyl)spermidin (MPB-bA), wurde synthetisiert. Die Sulfhydryl-haltigen Peptide wurden an dem Interkalationsmittel über eine Thioether-Verknüpfung befestigt, und das resultierende Peptid-Interkalationsmittel assoziierte mit doppelsträngiger (ds) DNA über eine Bis-Interkalation der Acridine. Die Befestigung einer Kernlokalisations-Peptidsequenz an der DNA unter Verwendung dieses Reagenzes verstärkt die Transfektion bei kultivierten Zellen.
Die Synthese von MPB-bA basiert auf einer Trifunktionalisierung von Spermidin, wie sie in dem folgenden Schema 3 unten gezeigt ist.
Schema 3
N₁,N₈-Bis(-butoxycarbonyl)spermidin 1, das Ausgangsmaterial, ist ein Substrat, das für die selektive N₄-Acylierung von Spermidin geeignet ist (Bergeron, R. J., et al., Synthesis 689–692 (1989)). Verbindung 1 wurde nacheinander mit N-Succinimidyl-4[p-(maleimidophenyl)butyrat (SMPB) N4-acyliert, wie von Kitogawa und Aikawa beschrieben wird, entschützt, und die regenerierten N₁,N₈-Amine wurden mit 9-Phenoxycaridin umgesetzt, wie von Nielsen et al. beschrieben wird, um ein Bisacridin zu bilden, welches ein reaktives Maleimid trägt (MPB-bA) (Kitawa, T., und Aikawa, T., J. Biochem. 79: 233 (1976); Nielsen, P. E., et al., Bioconjugate Chem. 2: 57 (1991)).
MPB-bA wurde in Diethylether ausgefällt und durch Säulenchromatographie auf Kieselgel gereinigt und eluiert mit
n-Butanol/Essigsäure/Wasser (5 : 4 : 1 v/v).
Rf = 0,28.
LSIMS: m/z = 741,8 (M⁺H).
Eine stabile Thioetherbindung bildet sich, wenn ein Sulfhydryl-haltiges Peptid mit dem Maleimid-tragenden Interkalationsmittel umgesetzt wird, wie in Schema 3 oben gezeigt ist; eine Sulfhy drylgruppe kann mit dem Reagenz Succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionat an dem N-Terminus des Peptids befestigt werden (Carlsson, J., et al., Biochem. 173: 723 (1978)). Alternativ kann das Peptid mit einem Cysteinrest an der geeigneten Stelle synthetisiert werden. Die Synthese ist stabil und liefert eine Gesamtausbeute von ca. 15%.
Beispiel 19: Synthese von Peptiden mit 13 Aminosäuren mit Endständigem Cys
Um zu demonstrieren, dass das MPB-bA eine Befestigung des Peptids an der DNA vermitteln konnte, wurden zwei Peptide mit 13 Resten mit einem N-terminalen Cystein synthetisiert. Das erste, Cys-Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO: 9) (WTCys), enthielt eine Kernlokalisierungssequenz des großen SV40-T-Antigens. Das zweite, Cys-Gly-Tyr-Gly-Pro-Lys-Asp-Lys-Val-Gly-Gly (SEQ ID NO: 10) (cTCys), war ein Kontrollpeptid, welches die Mutation imitiert, die in der SV40 (cT)-3-Mutante vorliegt, welche im Hinblick auf den Transport des T-Antigens in den Kern defizitär ist. Diese Peptide wurden wie von Landford et al. beschrieben synthetisiert (Landford, R. E., et al., Cell. 46: 576 (1986)).
Beispiel 20: Befestigung der Peptide mit 13 Aminosäuren an MPB-bA
Die Peptide aus Beispiel 19 wurden mit MPB-bA umgesetzt, wie in dem obigen Schema 3 gezeigt ist. Ein mg HPLC-reines Peptid gelöst in 360 μl eines 0,2 M Phosphatpuffers und 1 mM EDTA, pH 7,2, wurde mit 1 mg MPB-bA gelöst in 40 μl Methanol für 45 min unter Rühren unter Argon umgesetzt. WTCysMPB-bA und cTCysMPB-bA wurden durch Gelfiltration auf einer Biogel P2-Säule gefolgt von einer C-18-Umkehrphasen-HPLC gereinigt, wie für die freien Peptide von Landford et al. (1986), supra, beschrieben wird, und lyophilisiert.
LSIMS: WTCysMPB-bA.
m/z = 2118,9 (M⁺H).
m/z = 2140,7 (M⁺Na).
cTCysMPB-bA.
m/z = 2106,2 (M⁺H).
m/z = 218,4 (M⁺Na).
Die Wechselwirkung der resultierenden Bisacridinyl-Peptide mit der Plasmid-DNA bei einem Verhältnis, welches eine Ladungsneutralisation erlaubte, führte zu einer vollständigen Inhibition der elektrophoretischen Mobilität des Plasmids, während gleiche Mengen der unkonjugierten Peptide die DNA nur teilweise zurückhielten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die Interkalation der Bisacridinyl-Peptide in ds-DNA führte zu der Verdrängung von Ethidiumbromid aus der Kalbsthymus-DNA, wie in 6 gezeigt ist.
Die Bindungskonstanten der verschiedenen Bisacridine wurden aus der kompetitiven Verdrängung von Ethidiumbromid, einer intrinsischen Dissoziationskonstante von 6,7 × 10^–6 M für Ethidiumbromid und dem Algorithmus von Wolfe und Meehan berechnet (Reinhardt, C. G. und Krugh, T. R., Biochem. 17: 4845 (1978); Wolfe, A. R. und Meehan, T., Mol. Biol. 223: 1063 (1992)). Diese Bindungskonstanten wurden mit der von Spermindin-Bisacridin allein verglichen. Als Ergebnis des Verlustes einer seiner positiven Ladungen wurde eine leichte aber signifikante Abnahme bei der Affinität beobachtet, wenn die N₄-Aminogruppe des Spermidin-Bisacridins wie in MPB-bA acyliert war. Bei den Konjugaten, die durch die cysteinhaltigen Peptide und MPB-bA gebildet wurden, wurde gefunden, dass diese DNA mit Affinititätskonstanten binden, welche mit einem Bis-Interkalationsmechnismus kompatibel sind. Die Befestigung der positiv geladenen Peptide an MPB-bA stellte die Affinität teilweise wieder her, wie in 6 gezeigt wird.
Ethidiumbromid (19 μM) wurde mit Kalbthymus-DNA (5,7 μM als Nukleotid-Äquivalente) in einem 10 nM Tris-HCl-Puffer, 0,2 M NaCl, pH 7,4 gemischt, und steigende Mengen eines Bisacridinderivats wurden zugegeben. Die Fluoreszenz, welche durch die Verdrängung von Ethidiumbromid hervorgerufen wurde, wurde unter den folgenden Bedingungen gemessen.
Anregung = 540 nm; Emission = 610 nm.
Fo: Fluoreszenz von freiem Ethidiumbromid (19 μM).
Fmax: Fluoreszenz des Ethidium-DNA-Komplexes allein (19 μM Ethidium, 5,7 μM Nukleotid).
F: Fluoreszenz des Ethidium-DNA-Komplexes in Gegenwart des Bisacridin-Derivats.

i) Die intrinsische Fluoreszenz des Acridins tritt bei 450 nm auf und stört in diesem Test nicht.
ii) Die Konzentration der Bisacridin-Stammlösungen wurde aus der Extinktion bei 412 nm bestimmt, wobei ein Spermidin-Bisacridin-Standard verwendet wurde.

Beispiel 21: Transfektionseffizienz von WTCysMPB-bA und cTCysMPB-bA
Die Transfektionseffizienzen von unmodifizierten Plasmiden oder Plasmiden, die entweder mit dem WTCysMPB-bA oder der Mutante cTCysMPB-bA gemischt waren, wurden bestimmt. Dieser funktionale Test basiert auf den folgenden Beobachtungen.

i) Die Transfektionseffizienz, welche mit rekonstituierten viralen Hüllen erhalten wurde, steigt an, wenn die eingekapselten Gene zusammen mit synthetischen Kernproteinen, welche aus BSA, verknüpft mit der Kernlokalisierungssequenz des großen SV40-T-Antigens, zusammengesetzt sind, in die Zielzellen befördert werden (Kaneda, Y., et al., Science 243: 375 (1989).
ii) Die SV40-Virionenpartikel, die in das Cytoplasma von kultivierten Zellen mikroinjiziert werden, werden durch Kernporenkomplexe transportiert. Die Einführung der Virionenpartikel in den Kern wird durch spezifische Kerntransportsignale induziert, welche in den Virionenstrukturproteinen enthalten sind (Clever, J., et al. PNAS (USA) 88: 7333 (1991)).

Ein Plasmid, welches das bakterielle Luciferasegen codiert, das pCLuc4-Plasmid, komplexiert mit den MPB-bA-Peptiden, konnte innerhalb von pH-empfindlichen Liposomen eingekapselt werden, ohne weder die Einkapselungseffizienz noch die Größe der Vesikel im Vergleich zu Liposomen, welche nur das Plasmid enthielten, zu beeinflussen (Legendre, J. Y., und Szoka, F. C., Pharm Res. 9: 1235 (1992)). In einer Reihe von Experimenten erhöhte der WTCysMPB-bA signifikant (P < 0,025) die Transfektionseffzienz um ca. 3-fach gegenüber dem Plasmid, das mit dem cTCysMPB-bA komplexiert war. Diese Daten sind in Tabelle 3 unten gezeigt.
Tabelle 3: Transfektion unter Verwendung pH-empfindlicher Liposomen, die Modifizierte Plasmide enthalten
Die CV-1-Zellen wurden dreifach mit 4 μg in Liposomen eingekapseltem pCLuc4 transfiziert, das frei oder mit WTCysMPB-bA oder cTCysMPB-bA komplexiert war, bei einem Verhältnis von 300 Peptiden/Plasmid.
Die mittleren Transfektionsaktivitäten, die mit Liposomen erhalten wurden, welche WTCys-pCLuc4- oder cTys-pCLuc4-Komplexe enthielten, wurden durch die von Liposomen geteilt, die pCLuc4 enthielten.
Die Verhältnisse, welche aus 4 unterschiedlichen Experimenten erhalten wurden, wurden gemittelt (-fache Zunahme in der Tabelle) und unter Verwendung eines Studenten-t-Test verglichen [Ho abgestoßen (rejected); p ≤ 0,025].
Es gab keine signifikanten Unterschiede im Liposomendurchmesser oder der Einkapselungseffizienz der verschiedenen Plasmide, die in den obigen Transfektionsexperimenten verwendet wurden.
Diese Erhöhung ist ähnlich zu der, welche beobachtet wird, wenn synthetische Kernproteine mit DNA kombiniert werden und mit rekonstituierten Viosomen befördert werden (Kaneda, Y., et al., supra).
Beispiel 22: Ergebnisse und Diskussion
Zusammengefasst liefert das reaktive Sulfhydryl-Bisacridin ein ausgezeichnetes Reagenz für die nichtkovalente Befestigung von Sulfhydryl-haltigen Molekülen an ds-DNA. Durch das Einsetzen einer Kombination verschiedener Effektorpeptide, welche die Merkmale verschiedener biologischer Viren imitieren, wurden unerwartet überlegene neue synthetische Genbeförderungskomplexe erzeugt.
Beispiel 23: Beförderung von Oligonukleotiden in Zellen in Kultur durch Dendrimere
1,2 μg Fluorescein-markierte Oligonukleotide in 330 μl Hepes-Puffersalzlösung (HBS: 10 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7,4) wurden in ein Polystyrolröhrchen gegeben, und 170 μl HBS, die 100 μg eines Polyamidoamindendrimers der sechsten Generation (SD68) enthielten, wurden tropfenweise unter sehr leichtem Mischen zugegeben. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 1,5 ml serum-freies DMA H21-Medium zugegeben, und die Mischung wurde auf Zellen in Kultur angewendet. Typischerweise wurden 100 μl des Komplexes zu jedem 22 mm-Deckgläschen zugegeben, das 80% konfluente CV-1-Zellen enthielt, welche 24 Std. früher plattiert worden waren. Nach 2 bis 4 Std. wurden die Deckgläschen mit DME H21 – 10% FCS gewaschen und unfixiert auf Objektträgern mit Vertiefung montiert. Diese Objektträger können 200 μl Medium unter dem Deckgläschen aufnehmen, und sie wurden an den Kanten mit warmem Paraffin abgedichtet.
Zur Analyse wurden die Deckgläschen durch eine konfokale Laserscanningmikroskopie angeschaut. Ein konfokales BioRad MRC-600 System, welches einen Krypton-Argon-Laser (Anregung: 488 nm) einsetzt, und ein Inversionsmikroskop von Nikon wurden eingesetzt. Eine typische Einstellung zur Analyse, welche für die Tests verwendet wurde, war wie folgt.
Hochlasereinstellung
Neutraldichte = 1
Verstärkung = 7
Öffnung = 10
Auto Black Ein
Kalman-Mittlung = 3
Objektiv = 63 ×
Die Zellen wurden auf der Grundlage des Vorliegens von eindeutiger Kernfluoreszenz und des Bestehens einer sichtbaren Grenze zwischen dem Kern und dem Cytoplasma als positiv bewertet. Der Anteil der beobachteten fluoreszierenden Kerne wurde berechnet, indem die Anzahl der beobachteten fluoreszierenden Kerne gezählt wurde und durch die Gesamtzahl an Zellen in zufällig ausgewählten intakten Feldern (random healthy fields) geteilt wurde.
Beispiel 24: Dendrimer zu Oligonukleotid-Verhältnis für eine Kernakkumulation von Oligonukleotiden
Die Wirkung des SD68-Dendrimer-Polykations, das in Beispiel 23 verwendet wurde, welches die Kernakkumulation von Oligonukleotiden in einer dosisabhängigen Weise vermittelt, ist in 7 gezeigt. Variierende Mengen an Dendrimer-Polykation (3–200 μg/prep) wurden wie oben beschrieben mit einer festgelegten Menge an Oligonukleotid (1,2 μg/prep) hergestellt. Diese wurden zu den CV-1-Zellen wie bei Standardverfahren zugegeben und auf eine Kernfluoreszenz hin getestet. Es wurde beobachtet, dass ein Schwellenverhältnis von Dendrimer-Polykation zu Oligonukleotid für die Akkumulation im Kern erforderlich war. Darüber hinaus wurde eine Anfärbung des Kerns bis zu ca. 25% beobachtet. Tabelle 4 unten zeigt die Ladung und die Oligonukleotid zu Dendrimer-Verhältnisse für jeden Test, und die resultierende Akkumulation im Kern der Fluoreszenz (Nukleotid).
Tabelle 4: Bedingungen und Ergebnisse
Beispiel 25: Zeitabhängigkeit der Dendrimer-vermittelten Kernakkumulation des Oligonukleotids
Die Zeitabhängigkeit, mit welcher das SD68-Dendrimer-Polykation die Kernakkumulation der Oligonukleotide erleichterte, ist in 8 gezeigt. Eine Standardpräparation von Dendrimer-Polykation-Oligonukleotid wurde zu CV-1-Zellen zugegeben, welche gewaschen, montiert und nach 5, 30, 60, 90, 120 und 180 Minuten angeschaut wurden. Die Zellen wurden aufgrund des Vorliegens oder Fehlens von Kernfluoreszenz wie oben beschrieben als positiv oder negativ bewertet. Eine Akkumulation im Kern wurde schon 30 min nach dem Zeitpunkt des Kontakts festgestellt und erreichte in 3 Std. nahezu 80%.
Beispiel 26: Wirkung der Dendrimergröße auf die Fähigkeit, eine Akkumulation im Kern zu vermitteln
Die Generation des Dendrimers, welche der Größe entspricht, beeinflusst dessen Fähigkeit, die Kernakkumulation von Oligonukleotiden zu erleichtern. Standardpräparationen von Dendrimer-Oligonukleotid wurden mit unterschiedlichen Dendrimergrößen (SD22, SD68, SD124) hergestellt. Jede wurde für 4 Std. auf CV-1-Zellen angewendet und wie gewöhnlich auf eine Akkumulation im Kern getestet. Das Experiment wurde in DME H21 oder einem optimierten Medium mit verminderter Ionenstärke durchgeführt. SD68 konnte eine Kernakkumulation von nahezu 80% vermitteln, während SD22 und SD124 als Vermittler der Kernakkumulation unter verminderten ionischen Bedingungen etwas weniger effizient waren. Die Ergebnisse dieses Tests sind in 9 gezeigt.
Beispiel 27: Eine reduzierte Ionenstärke erhöht die Kernakkumulation von Oligonukleotiden
Die Dendrimer-Polykation-Oligonukleotid-Komplexe wurden wie oben beschrieben hergestellt. Diese wurden mit entweder DME H21 oder DME H21, 30% verdünnt mit einer äquiosmolaren nichtionischen Lösung eines Saccharids, einschließlich Glucose, Lactose, Mannitol, Sorbitol und Sucrose, verdünnt. Die Komplexe wurden für 2 Std. auf CV-1-Zellen angewendet und wie oben beschrieben analysiert. Ungeachtet des Typs des verwendeten Kohlenhydrats vergrößerte eine verminderte Ionenstärke die dendrimervermittelte Akkumulation im Kern. Die Bedingungen und Ergebnisse des Tests sind in 10 gezeigt.
Beispiel 28: Befestigung von gezielt bindenden Liganden und Membrandestabilisatoren an der DNA über Bisacridine und Kombination mit dem Dendrimer
Das Peptid GALACys wurde an dem Bisacridin-Maleimid wie in Beispiel 21 beschrieben befestigt, um einen mit der DNA assoziierenden Membrandestabilisator herzustellen. Die Aminosäure Cystein wurde an dem Bisacridin-Maleimid wie in Beispiel 21 beschrieben als eine Kontrolle befestigt. Sechs Mikrogramm des Plasmids, welches das Luciferasegen enthielt, wurden in 330 μl HBS in einem Polystyrolröhrchen verdünnt. GALA CysMPB-Bisacridin (1 nmol) oder CysMPB-Bisacridin und/oder SD68-PAMAM-Dendrimer der 6. Generation (4 μg) wurden in 170 μl HBS verdünnt und tropfenweise zu der DNA zugegeben. Das Röhrchen wurde leicht gemischt, und nach 20 min wurden die resultierenden Komplexe im Hinblick auf eine Transfektion mit frisch isolierten Hepatozyten getestet.
In einer ähnlichen Weise wurde das (Galactose-6)3Lys-2-bisacridin (Haensler, J. und Szoka, F., Bioconjugate Chemistry 4: 85 (1993)) an der DNA befestigt und ein Komplex mit dem SD68-Dendrimer gebildet.
Zusätzlich wurden sowohl das GALA-CysMPB-Bisacridin als auch das (Galactose-6)3Lys-2-Bisacridin mit jeweils 0,5 nmol gemischt und zusammen mit dem Dendrimer zu der DNA zugegeben. Die Zusammensetzung, welche die drei Komponenten enthielt, wurde dann wie oben beschrieben zu den Hepatozyten zugegeben. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt. Die Mengen der Komponenten bei jeder Transfektion sind unter der Luciferaseaktivität angegeben. Das Zugeben von entweder dem Membrandestabilisator GALA-CysMPB-Bisacridin oder dem gezielt bindenden Liganden (Galactose-6)3Lys-2-Bisacridin zu dem Dendrimer erhöht die Transfektion um wenigstens zwei Größenordnungen. Das Zugeben der zwei Effektoren zusammen, aber in einer verminderten Menge, zu dem Dendrimer war ebenfalls in der Lage, die Transfektion zu erhöhen. Das Zugeben der Kontrolle CysMPB-bA zu dem Dendrimer erhöhte jedoch die Transfektion nicht.
Beispiel 29: Befestigung des gezielt bindenden Liganden und des Membrandestabilisators direkt an dem Dendrimer und Mischen in verschiedenen Verhältnissen, um die Transfektion zu erhöhen
Thiogalactose wurde an dem SPDP-modifizierten Dendrimer mit 40 Å im Durchmesser (SD40) wie in Beispiel 4 beschrieben befestigt und mit unmodifiziertem SD40-Dendrimer und GALACys-Dendrimer gemischt. Die Mischungen der Dendrimere wurden verwendet, um Hepatozyten mit dem Luciferaseplasmid zu transfizieren. Die Ergebnisse sind in 12 angegeben. Die höchsten Transfektionsniveaus wurden beobachtet, wenn das Verhältnis Dendrimer/Gal-Dendrimer/GALA-Dendrimer 24/141/42 bezogen auf das Gewicht betrug.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine Zusammensetzung zur Übergabe eines Polynukleotids an eine subzelluläre Komponente einer eukaryotischen Zelle, umfassend: ein Polynukleotid; und ein Dendrimer-Polykation mit endständigen kationischen Gruppen, die nichtkovalent an das Polynukleotid gekoppelt sind, wobei der Anteil der endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations zu dem Nukleotidgehalt des Polynukleotids 1 : 1 bis 223,3 : 1 beträgt, aber ausschließlich solcher Zusammensetzungen, die erhältlich sind durch: Verdünnen von 12 μg PCLuc4-Plasmid in 660 μl HBS (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,4), um eine DNA-Lösung zu bilden; und Lösen von 1 nmol hydrophiler verzweigter Polykation-Makromolekül-Starburst-Dendrimermikropartikel der fünften Generation in 340 μl HBS und Zugeben von diesem tropfenweise zu der DNA-Lösung.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dendrimer-Polykation ein Kernmolekül umfasst, das wenigstens zwei reaktive Reste umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Ether, Amino, Imino, Amido, Imido, Ammonium, Halogenid, Carboxyl, Carboxyhalogenid und Sulfhydryl sowie Kombinationen von diesen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Dendrimer-Polykation weiterhin ein pharmazeutisch verträgliches Polymer umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyamidoaminen, die aus der Reaktion eines Alkylesters einer α,β-ethylenisch ungesättigten Carbonsäure oder eines α,β-ethylenisch ungesättigten Amids und eines Alkylenpolyamins oder eines Polyalkylenpolyamins stammen, wobei das Polymer funktionsfähig an das Kernmolekül gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dendrimer-Polykation ein Polyamidoamin umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dendrimer-Polykation endständige Gruppen umfasst, die in der Lage sind, eine positive Ladung anzunehmen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch b, wobei die endständigen kationischen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Azolen und primären, sekundären, tertiären und quartären aliphatischen und aromatischen Aminen, welche mit S oder O substituiert sein können, Guanidium und Kombinationen von diesen, wobei die endständigen kationischen Gruppen von diesen funktionsfähig an das Polymer gekoppelt sind.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die endständigen kationischen Gruppen 10 bis 100% aller endständigen Gruppen des Polymers umfassen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Dendrimer-Polykation weiterhin 0 bis 90% der endständigen reaktiven Reste aller endständigen Gruppen des Dendrimer-Polykations umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die endständigen reaktiven Reste ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Cyano, Carboxyl, Sulfhydryl, Maleimid und Dithiopyridiyl sowie Kombinationen von diesen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dendrimer-Polykation ein durchschnittliches Molekulargewicht (MWave) von 2.000 bis 1.000.000 aufweist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Dendrimer-Polykation einen hydrodynamischen Radius von 11 bis 60 Å aufweist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Anteil der endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations zu dem Nukleotidgehalt 1 : 1 bis 25 : 1 beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin ein die Membran durchlässig machendes Mittel umfasst, das in der Lage ist, das Polynukleotid über die cytoplasmatischen oder endosomalen Membranen der eukaryotischen Zelle hinweg zu transportieren, wobei das die Membran durchlässig machende Mittel funktionsfähig an das Dendrimer-Polykation gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei der Anteil des die Membran durchlässig machenden Mittels zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations 1 : 100 bis 1 : 4 beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das die Membran durchlässig machende Mittel ein amphipathisches Peptid umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das amphipathische Peptid GALA umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Peptid ein cyclisches Peptid umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das cyclische Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gramicidin S und Tyrocidinen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das cyclische Peptid Gramicidin S umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, welche weiterhin ein Phospholipid umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Phospholipid Phosphatidylethanolamin umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das Phosphatidylethanolamin Dioleoylphosphatidylethanolamin umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Phospholipid in Form von Liposomen vorliegt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, welche weiterhin ein Polykation umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Polykation ein Polyamin umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Polyamin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polylysin, Polyarginin, Polyornithin, Spermin, Spermidin, 3,3'-Diaminobispropylamin, Iminobis(N,N)dimethylpropylamin, Iminobis(3-aminopropyl)-1,3-propandiamin und kationischen Dendrimeren.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das die Membran durchlässig machende Mittel ein kationisches Gallensalz der chemischen Formel
umfasst, worin X und Y unabhängig voneinander H oder OH sind; R³ H, (C₁-C₁₀)-Alkyl oder (C₁-C₁₀)-Alkylamin ist; und R⁴ ein positiv geladenes lineares oder verzweigtes (C₁-C₃₀)-Alkyl oder (C₁-C₃₀)-Alkylamin ist, wobei eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit NR' substituiert sein können, wobei R' H, (C₁-C₁₀)-Alkyl oder (C₁-C₁₀)-Alkylamin ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin umfasst: ein Mittel für die subzelluläre Lokalisierung, das in der Lage ist, das Polynukleotid von dem Cytoplasma der eukaryotischen Zelle zu einer subzellulären Komponente der eukaryotischen Zelle zu befördern, wobei das Mittel zur subzellulären Lokalisierung funktionsfähig an das Dendrimer-Polykation gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei der Anteil des Mittels zur subzellulären Lokalisierung zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations 1 : 100 bis 1 : 5 beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das Mittel zur subzellulären Lokalisierung ein Kernlokalisierungsmittel umfasst, das in der Lage ist, das Polynukleotid zu dem Kern der eukaryotischen Zelle zu befördern.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei das Kernlokalisierungsmittel funktionsfähig an einen DNA-assoziierenden Anteil gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei der DNA-assoziierende Anteil ein interkalierendes Mittel umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei das interkalierende Mittel die chemische Formel
aufweist, worin Z eine Bindung, eine reaktive Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Hydroxysuccinimid, Maleimid, Maleimidophenyl, Pyridyldisulfid, Hydrazid und Phenylglyoxal, oder ZY umfasst, wobei Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenrezeptorliganden, Kernlokalisierungssequenzen und die Membran durchlässig machenden Komponenten; n und m unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 20 sind; p eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist; und Ar₁ und Ar₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Ethidiumbromid, Acridin, Mitoxantron, Oxazolopyridocarbazol, Ellipticin, N-Methyl-2,7-diazapyrenium und Derivaten von diesen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei Ar₁ und Ar₂ Acridin umfassen.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 35, wobei Z Maleimidophenyl oder Dithiopyridyl umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei Z die Gruppe
umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei das interkalierende Mittel an wenigstens einen Liganden gekoppelt ist, der auf einen Rezeptor abzielt, der auf der Oberfläche eukaryotischer Zellen lokalisiert ist, wobei der Ligand und das Dendrimer-Polykation von einem Zellerkennungsmittel umfasst sind, das in der Lage ist, die eukaryotische Zelle zu erkennen, wobei der abzielende Ligand funktionsfähig an das Dendrimer-Polykation gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 38, welche weiterhin ein die Membran durchlässig machendes Mittel umfasst, das funktionsfähig an das interkalierende Mittel oder den Liganden gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 33, wobei das interkalierende Mittel die chemische Formel
aufweist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei der DNA-assoziierende Anteil einen einzelsträngigen Polynukleotidlinker umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei der DNA-assoziierende Anteil ein Dendrimer-Polykation umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei der DNA-assoziierende Anteil ein Bindemittel für die Haupt- oder Nebenfurche umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin umfasst: einen Liganden, welcher auf einen Rezeptor abzielt, der auf der Oberfläche eukaryotischer Zellen lokalisiert ist, wobei der Ligand und das Dendrimer-Polykation von einem Zellerkennungsmittel umfasst sind, das in der Lage ist, die eukaryotische Zelle zu erkennen, wobei der Zielligand funktionsfähig an das Dendrimer-Polykation gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 44, wobei der Anteil des auf die Zelle abzielenden Liganden zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations 1 : 100 bis 1 : 10 beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 44, wobei der auf die Zelle abzielende Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vitaminen, Kohlenhydraten und Polypeptiden.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 46, wobei das Polypeptid einen Antikörper oder ein Fragment von diesem umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 44, welche weiterhin ein die Membran durchlässig machendes Mittel umfasst, das funktionsfähig an das interkalierende Mittel oder den Liganden gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiche weiterhin ein fusogenes Polypeptid umfasst, wobei das fusogene Polypeptid funktionsfähig an das Dendrimer-Polykation gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 49, wobei der Anteil des fusogenen Polypeptids zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations 1 : 100 bis 1 : 4 beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiterhin umfasst: ein DNA-Maskierungsmittel, das in der Lage ist, die zirkulatorische Halbwertszeit des Polynukleotids zu erhöhen, wobei das DNA-Maskierungsmittel funktionsfähig an das Dendrimer-Polykation gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 51, wobei der Anteil des DNA-Maskierungsmittels zu den endständigen kationischen Gruppen des Dendrimer-Polykations 1 : 33 bis 1 : 3 beträgt.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 51, wobei das DNA-Maskierungsmittel funktionsfähig an einen DNA-assoziierenden Anteil gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 51, wobei das DNA-Maskierungsmittel die chemische Formel
aufweist, worin n eine ganze Zahl von 6 bis 24 ist; Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Sialyl, Ethanolamin, Cholin, Glycerol, Serin, Monomethoxypolyethylenglycol und Inositol; R¹ (C₆-C₂₄)-Alkyl oder (C₆-C₂₄)-Alkenyl ist; R³ H oder (C₁-C₁₀)-Alkyl oder (C₁-C₁₀)-Alkylamin ist; und R⁴ ein positiv geladenes lineares oder verzweigtes (C₁-C₃₀)-Alkyl oder -Alkylamin ist, wobei eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit NR' substituiert sein können, wobei R' H, (C₁-C₁₀)-Alkyl oder (C₁-C₁₀)-Alkylamin ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 51, wobei das Maskierungsmittel Polyethylenglycol (PEG) umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid einen Hybridvektor umfasst, welcher ein Strukturgen umfasst, das funktionsfähig daran gekoppelt ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1 in fester, flüssiger oder Aerosolform.
Ein Verfahren zum Einführen eines Polynukleotids in eine eukaryotische Zelle, welches das Inkontaktbringen der Zelle mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1 in vitro umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 58, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugetierzelle ist.
Ein Verfahren zum Einführen eines Polynukleotids in eine Pflanzenzelle, welches das Inkontaktbringen der Zelle mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1 umfasst.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Einführung eines Polynukleotids in eine eukaryotische Zelle, die in einem lebenden Tier vorliegt, wobei die Zusammensetzung dem Tier in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um die Zellen des Tiers zu erreichen und in diese einzudringen.
Die Verwendung nach Anspruch 61, wobei das Medikament zur Einführung eines Polynukleotids in eine eukaryotische Zelle dient, die in einem lebenden Menschen vorliegt.
Die Verwendung nach Anspruch 61, wobei das Medikament ca. 0,5 μg bis 20 mg des Polynukleotids umfasst.
Die Verwendung nach Anspruch 61, wobei das Medikament zur Verabreichung über einen oralen, transdermalen, systemischen oder inhalatorischen Weg ausgelegt ist.
Die Verwendung nach Anspruch 64, wobei das Medikament zur transdermalen Verabreichung über eine Hochgeschwindigkeitsverabreichung an die Hautoberfläche durch Aufpressen (impaction) ausgelegt ist.