DE69435005T2

DE69435005T2 - Antisense Oligonukleotide die anomales Splicing verhindern und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69435005T2
Application number: DE69435005T
Authority: DE
Inventors: Ryszard Chapel Hill KOLE; Zbigniew Chapel Hill DOMINSKI
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 1993-05-11
Filing date: 1994-05-10
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2014-05-11
Also published as: JPH08510130A; FI955428A7; NO954550L; DE69435005D1; FI955428L; EP0698092A1; ATE368107T1; WO1994026887A1; JP2009159971A; US5916808A; DK0698092T3; CA2162361C; US5976879A; CA2162361A1; US5627274A; EP1897942A1; EP0698092B1; ES2290951T3; CN1123038A; US5665593A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Medikamente zum Bekämpfen von aberrantem Spleißen von prä-mRNA-Molekülen und Hinaufregulieren der Genexpression sowie antisense-Oligonukleotide, die zum Ausführen derselben verwendbar sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Potential von Oligonuldeotiden als Modulatoren der Genexpression ist gegenwärtig unter intensiver Erforschung. Die meisten der Anstrengungen sind auf das Hemmen der Expression von als Ziel genommenen Genen wie beispielsweise Onkogenen oder viralen Genen konzentriert. Die Oligonuldeotide sind entweder gegen RNA (antisense-Oligonukleotide)(M. Ghosh und J. Cohen, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 42, 79 (1992); L. Necken et al., Crit. Rev. Oncog. 3, 175 (1992)) oder gegen DNA gerichtet, wo sie dreisträngige Strukturen erzeugen, die die Transkription durch RNA-Polymerase 11 hemmen (J. Hanvey et al., Science 258, 1481 (1992); W. McShan et al., J. Biol. Chem. 267, 5712 (1992); M. Grigoriev et al., J. Biol. Chem. 267, 3389 (1992); G. Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504 (1992)). Um eine gewünschte Wirkung zu erreichen, müssen die Oligonuldeotide einen Zerfall des vorher existierenden, nicht wünschenswerten Proteins durch wirksames Verhindern seiner Bildung de novo fördern. Derartige Techniken sind nicht brauchbar, wo es die Aufgabe ist, die Erzeugung des nativen Proteins hinaufzuregulieren. Doch würde in Fällen, wo die Expression eines Gens wegen Mutationen darin herabreguliert wird, ein Mittel zum Hinaufregulieren der Genexpression durch antisense-Technologie extrem nützlich sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur Verwendung von antisense-Nuldeotiden zum Hinaufregulieren der Expression einer DNA, enthaltend eine Mutation, bereit, welche ansonsten zur Herabregulation dieses Gens durch aberrantes Spleißen der prä-mRNA, die es codiert, führen würden.
Dementsprechend wird in einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Medikament zum Bekämpfen von aberrantem Spleißen in einem prä-mRNA-Molekül, enthaltend eine Mutation, bereitgestellt. Wenn vorhanden in der prä-mRNA, verursacht die Mutation, daß die prä-mRNA inkorrekt spleißt und eine aberrante mRNA oder ein mRNA-Fragment, verschieden von der gewöhnlich aus der prä-mRNA resultierenden mRNA, erzeugt. Genauer gesagt enthält das prä-mRNA-Molekül: (i) eine erste Gruppe von Spleißelementen, definierend ein natives Intron, welches durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation abwesend ist, um ein erstes mRNA-Molekül, codierend ein natives Protein, zu erzeugen, und (ii) eine zweite Gruppe von Spleißelementen, induziert durch die Mutation, welche ein aberrantes Intron, verschieden von dem nativen Intron, definieren, welches aberrante Intron durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation vorhanden ist, um ein aberrantes zweites mRNA-Molekül, verschieden von dem ersten mRNA-Molekül, zu erzeugen. Das Medikament umfaßt ein antisense-Oligonukleotid, fähig zum Hybridisieren mit dem prä-mRNA-Molekül, um unter Bedingungen, welche Spleißen gestatten, ein doppelsträngiges Molekül hervorzubringen. Das antisense-Oligonukleotid ist eines, welches RNase H nicht aktiviert, und ist ausgewählt, um ein Glied der aberranten zweiten Gruppe von Spleißelementen zu blockieren, so daß das native Intron durch Spleißen entfernt wird und das erste mRNA-Molekül, codierend ein Protein, erzeugt wird.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Medikament zum Hinaufregulieren der Expression eines nativen Proteins in einer Zelle, enthaltend eine DNA, codierend das native Protein, bereitgestellt. Welche DNA weiterhin eine Mutation enthält, welche Herabregulation des nativen Proteins durch aberrantes Spleißen davon verursacht. Genauer gesagt codiert die DNA eine prä-mRNA, wobei die prä-mRNA die vorstehend angegebene Gruppe von charakteristischen Eigenschaften hat. Das Medikament umfaßt ein antisense-Oligonukleotid mit den vorstehend beschriebenen charakteristischen Eigenschaften, so daß das native Intron durch Spleißen entfernt wird und das native Protein durch die Zelle erzeugt wird.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein antisense-Oligonuldeotid, verwendbar zum Bekämpfen von aberrantem Spleißen in einem prä-mRNA-Molekül, enthaltend eine Mutation. Das prä-mRNA-Molekül enthält eine erste Gruppe und eine zweite Gruppe von Spleißelementen mit der vorstehend angegebenen Gruppe von charakteristischen Eigenschaften. Das antisense-Oligonukleotid umfaßt ein Oligonuldeotid, welches (i) mit der prä-mRNA hybridisiert, um ein doppelsträngiges Molekül zu erzeugen; (ii) RNase H nicht aktiviert; und (iii) ein Glied der aberranten zweiten Gruppe von Spleißelementen blockiert.
Die vorhergehenden und andere Aufgaben und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in den Zeichnungen hier und in der nachstehend angegebenen Beschreibung ausführlich diskutiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Struktur von prä-mRNAs. Kästchen zeigen Exons; dicke Linien Introns an. Die Positionen der Mutationen (110 und 705) relativ zu Nukleotid 1 von IVS 1 bzw. IVS 2 sind oberhalb des HBΔ6-Klons angegeben. Die Zahlen unten zeigen die Länge, in Nukleotiden, von Exons und Introns an. Antisense-Oligonukleotide sind durch die numerierten kurzen Balken unter den β¹¹⁰- und IVS2⁷⁰⁵-Konstrukten und Spleißwege durch die gestrichelten Linien angezeigt.
2 zeigt die Umkehr von aberrantem Spleißen durch Oligonuldeotid 1, gerichtet gegen den normalen Verzweigungspunkt im Intron 1 von β-Globin-prä-mRNA. Die Struktur der Produkte und Zwischenverbindungen ist rechts dargestellt; ihre Größe in Nukleotiden ist links angegeben. Ein Sternchen bezeichnet aberrante Mobilität von Lariat enthaltenden Zwischenverbindungen. Die gleichen Bezeichnungen werden in den nachfolgenden Figuren verwendet. Bahn 1 zeigt das Spleißen von Kontroll-HBΔ6-prä-mRNA; Bahn 2 zeigt das Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA; die Bahnen 3-8 zeigen das Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA in Anwesenheit von zunehmenden Mengen (angezeigt oben auf der Figur) von Oligonukleotid 1; Bahn 9 zeigt das Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA in Anwesenheit von Oligonuldeotid 3, gezielt auf eine Sequenz im Intron 2 von β-Globin-prä-mRNA.
3 zeigt die Auswirkungen von Oligonukleotid 2, gerichtet gegen die aberrante 3 3'-Spleißstelle im Intron 1 von β¹¹⁰-prä-mRNA. Bahn 1 zeigt das Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA; die Bahnen 2-7 zeigen das Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA in Anwesenheit zunehmender Mengen (angezeigt oben auf der Figur) von Oligonukleotid 2.
4 zeigt die Umkehr von aberrantem Spleißen von IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA durch Oligonuldeotid 3, gerichtet gegen die kryptische 3'-Spleißstelle, und Oligonukleotid 4, gerichtet gegen die aberrante 5'-Spleißstelle im Intron 2 von der IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA. Bahn 1 zeigt Input-RNA; die Bahnen 2 und 3 zeigen das Spleißen von Kontrolltranskripten (angezeigt oben auf der Figur); die Bahnen 4-8 und 9-13 zeigen das Spleißen von IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA in Anwesenheit von Oligonukleotid 3 bzw. Oligonukleotid 4. Die Mengen der Oligonukleotide in der Reaktion sind oben angezeigt. „?" auf der linken Seite zeigt zum Vorschein kommendes Abbauprodukt an.
5 veranschaulicht die Auswirkungen der Behandlung von IVS2-654-Zellen mit einem 2'-O-Methylribooligonukleotid-(17-mer)antisense-Oligonukleotid, gerichtet auf eine kryptische 3'-Spleißstelle in Anwesenheit von LIPOFECTIN^TM-Transfektionsreagenz. In den Bahnen 1, 3 und 5 wurde die gesamte Cellulose-RNA reverser Transkriptase unterworfen – Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) wurde mit Primer A (spezifisch zum Nachweisen von aberrantem Spleißen der prä-mRNA) ausgeführt; in den Bahnen 2, 4 und 6 wurde RT-PCR mit Primer C (spezifisch zum Nachweisen des korrekten Spleißen von prä-mRNA) ausgeführt. Ungespleißte prä-mRNA und die korrekten und aberranten Spleißprodukte davon sind schematisch unter der Veranschaulichung der Gelbahnen veranschaulicht. Die Bahnen 1 und 2 zeigen Spleißen der prä-mRNA aus Zellen, behandelt mit LIPOFECTIN^TM-Transfektionsreagenz und 3 μM prä-mRNA von 2'-O-Methyloligoribonuldeotid; die Bahnen 3 und 4 zeigen Spleißen von Zellen, behandelt mit LIPOFECTIN^TM-Transfektionsreagenz allein; die Bahnen 5 und 6 zeigen Spleißen der prä-mRNA von unbehandelten Zellen.
6 ist vorstehender 5 ähnlich und zeigt die Auswirkungen der Behandlung von IVS2-654*-Zellen mit 5 und 20 μM antisense-Oligonukleotid, gerichtet auf die kryptische 3'-Spleißstelle in Anwesenheit von Teilchen von replikationsdefizientem Adenvirus. Die RT-PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von Primern ausgeführt, die mit den zweiten bzw. dritten Exons des humanen β-Globin-Gens hybridisieren. Bahn 1 zeigt das Spleißen der prä-mRNA von unbehandelten Zellen. Die Bahnen 2 und 3 zeigen das Spleißen der prä-mRNA von Zellen, behandelt mit 5 bzw. 20 μM Oligonukleotid in Anwesenheit des Adenvirus.
7 ist vorstehender 5 ähnlich und zeigt die Auswirkungen der Elektroporation von IVS2-654*-Zellen, behandelt mit 5 oder 50 μM von 2'-O-Methylribooligonuldeotid-antisense-Oligonukleotid, gerichtet auf eine aberrante 5'-Spleißstelle. Bahn 1 zeigt das Spleißen der prä-mRNA von unbehandelten Zellen. Die Bahnen 2 und 3 zeigen das Spleißen von prä-mRNA-Zellen, behandelt mit 5 bzw. 50 μM von dem Oligonukleotid.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Introns sind Anteile von eukaryotischer DNA, welche zwischen den codierenden Anteilen, oder „Exons", dieser DNA liegen. Introns und Exons werden in RNA transkribiert als „primares Transkript, Vorläufer für mRNA" (oder „prä-mRNA") bezeichnet. Introns müssen aus der prä-mRNA entfernt werden, so daß das native Protein, codiert durch die Exons, hergestellt werden kann (der Begriff „natives Protein" bezeichnet wie hier verwendet natürlich vorkommendes, Wildtyp- oder funktionelles Protein). Die Entfernung von Introns aus prä-mRNA und nachfolgende Verknüpfung der Exons wird in dem Spleißvorgang ausgeführt.
Der Spleißvorgang ist tatsächlich eine Reihe von Reaktionen, vermittelt durch Spleißfaktoren, welcher auf RNA nach der Transkription aber vor der Translation ausgeführt wird. So ist eine „prä-mRNA" eine RNA, welche sowohl Exons als auch Intron(s) enthält, und eine „mRNA" ist eine RNA, in welcher das (die) Intron(s) entfernt worden ist (sind) und die Exons nachfolgend miteinander verknüpft worden sind, so daß das Protein daraus durch die Ribosome translatiert werden kann.
Introns sind durch eine Gruppe von „Spleißelementen" definiert, welche relativ kurze, konservierte RNA-Segmente sind, welche die verschiedenartigen Spleißfaktoren binden, welche die Spleißreaktionen ausführen. So ist jedes Intron durch eine 5'-Spleißstelle, eine 3'-Spleißstelle und einen Verzweigungspunkt, der sich dazwischen befindet, definiert. Diese Spleißelemente werden „blockiert", wie hier diskutiert wird, wenn ein antisense-Oligonukleotid entweder vollständig oder teilweise das Element überlappt oder an die prä-mRNA an einer Position ausreichend nahe dem Element bindet, wobei die Bindung und Funktion der Spleißfaktoren unterbrochen wird, welche normalerweise die spezielle Spleißreaktion vermitteln würden, welche an dem Element erfolgt (z.B. an die prä-mRNA an einer Position innerhalb 3, 6, 9, 12, 15 oder 18 Nukleotiden des zu blockierenden Elements bindet).
Die Mutation in der nativen DNA und prä-mRNA kann entweder eine Substitutionsmutation oder eine Deletionsmutation sein, welche ein neues, aberrantes Spleißelement hervorbringt. Das aberrante Spleißelement ist so ein Glied einer Gruppe von aberranten Spleißelementen, welche ein aberrantes Intron definieren. Die verbleibenden Glieder der aberranten Gruppe von Spleißelementen können auch Glieder der Gruppe von Spleißelementen sein, welche das native Intron definieren. Zum Beispiel können, wenn die Mutation eine neue aberrante 3'-Spleißstelle hervorbringt, welche sowohl stromaufwärts von (d.h. 5' zu) der nativen 3'-Spleißstelle als auch stromabwärts von (d.h. 3' zu) dem nativen Verzweigungspunkt ist, dann die native 5'-Spleißstelle und der native Verzweigungspunkt als Glieder sowohl der nativen Gruppe von Spleißelementen als auch der aberranten Gruppe von Spleißelementen dienen. In anderen Situationen kann die Mutation verursachen, daß native Regionen der RNA, welche normalerweise schlafend sind oder keine Rolle als Spleißelemente spielen, aktiviert werden und als Spleißelemente dienen. Derartige Elemente werden als "kryptische" Elemente bezeichnet. Zum Beispiel kann, wenn die Mutation eine neue aberrante mutierte 3'-Spleißstelle hervorbringt, welche sich zwischen der nativen 3'-Spleißstelle und dem nativen Verzweigungspunkt befindet, sie einen kryptischen Verzweigungspunkt zwischen der aberranten mutierten 3'-Spleißstelle und dem nativen Verzweigungspunkt aktivieren. In anderen Situationen kann eine Mutation eine zusätzliche aberrante 5'-Spleißstelle hervorbringen, welche sich zwischen dem nativen Verzweigungspunkt und der nativen 5'-Spleißstelle befindet, und kann weiterhin eine kryptische 3'-Spleißstelle und einen kryptischen Verzweigungspunkt nachfolgend stromaufwärts von der aberranten mutierten 5'-Spleißstelle aktivieren. In dieser Situation wird das native Intron in zwei aberrante Introns geteilt, wobei sich ein neues Exon dazwischen befindet. Weiterhin kann es in einigen Situationen, wo ein natives Spleißelement (insbesondere ein Verzweigungspunkt) ebenfalls ein Glied der Gruppe von aberranten Spleißelementen ist, möglich sein, das native Element zu blockieren und ein kryptisches Element (d.h. einen kryptischen Verzweigungspunkt) zu aktivieren, welches die verbliebenen Glieder der nativen Gruppe von Spleißelementen rekrutieren wird, um korrektes Spleißen gegenüber inkorrektem Spleißen zu erzwingen. Man beachte weiterhin, daß, wenn ein kryptisches Spleißelement aktiviert wird, es sich in entweder dem Intron oder einem von den angrenzenden Exons befinden kann. So kann, abhängig von der Gruppe von aberranten Spleißelementen, hervorgerufen durch die spezielle Mutation, das antisense-Oligonuldeotid synthetisiert werden, um eine Vielfalt von verschiedenen Spleißelementen zu blockieren, um die vorliegende Erfindung auszuführen: es kann ein mutiertes Element, ein kryptisches Element oder ein natives Element blockieren; es kann eine 5'-Spleißstellle, eine 3'-Spleißstelle oder einen Verzweigungspunkt blockieren. Im allgemeinen wird es nicht ein Spleißelement blockieren, welches auch das native Intron definiert, wobei es natürlich die Situation berücksichtigt, wo Blockieren eines nativen Spleißelements ein kryptisches Element aktiviert, welches dann als Ersatzglied der nativen Gruppe von Spleißelementen dient und am korrekten Spleißen teilnimmt, wie vorstehend diskutiert ist.
Die Länge des antisense-Oligonukleotids (d.h. der Anzahl von Nukleotiden darin) ist nicht kritisch, so lange wie es selektiv an den vorgesehenen Standort bindet, und kann in Übereinstimmung mit routinemäßigen Verfahrensweisen bestimmt werden. Im allgemeinen wird das antisense-Oligonukleotid eine Länge von 8, 10 oder 12 Nukleotiden bis zu einer Länge von 20, 30 oder 50 Nukleotiden haben.
Antisense-Oligonukleotide, welche RNase H nicht aktivieren, können in Übereinstimmung mit bekannten Techniken hergestellt werden. Siehe z.B. die US-Patentschrift 5149797 von Pederson et al. (Die Offenbarung aller hier zitierten Patentreferenzen, soll hier durch Bezugnahme eingeschlossen sein). Derartige antisense-Oligonukleotide, welche Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Sequenzen sein können, enthalten einfach irgendeine strukturelle Modifizierung, welche die Bindung von RNase H an ein doppelsträngiges Molekül, enthaltend das Oligonukleotid als ein Glied davon, sterisch behindert oder verhindert, welche strukturelle Modifizierung die Doppelstrangbildung nicht wesentlich behindert oder unterbricht Weil die Anteile des Oligonukleotids, beteiligt an der Doppelstrangbildung, wesentlich verschieden von denjenigen Anteilen, beteiligt an der RNase-H-Bindung daran, sind, sind zahlreiche antisense-Oligonukleotide, welche RNase H nicht aktivieren, verfügbar. Zum Beispiel können derartige antisense-Oligonukleotide Oligonukleotide sein, bei denen mindestens eines oder alle von den Internukleotid-Brückenphosphat-Resten modifizierte Phosphate, wie beispielsweise Methylphosphonate, Methylphosphonothioate, Phosphoromorpholidate, Phosphoropiperazidate und Phosphoramidate, sind. Zum Beispiel kann jedes andere von den Internukleotid-Brückenphosphat-Resten wie beschrieben modifiziert werden. In einem anderen nicht begrenzenden Beispiel sind derartige antisense-Oligonukleotide Oligonuldeotide, bei denen mindestens eines, oder alle, von den Nukleotiden eine 2'-Niederalkyleinheit (z.B. C1-C4, lineares oder verzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes Alkyl, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Ethenyl, Propyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl und Isopropyl) enthält. Zum Beispiel kann jedes andere von den Nukleotiden wie beschrieben modifiziert sein. Siehe auch P. Furdon et al., Nucleic Acids Res. 17, 9193-9204 (1989); S. Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405 (1990); C. Baker et al., Nucleic Acids Res. 18, 3537-3543 (1990); B. Sproat et al., Nucleic Acids Res. 17, 3373-3386 (1989); R. Walder und J. Walder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5011-5015 (1988).
Die Medikamente, Oligonukleotide und Formulierungen der vorliegenden Erfindung haben eine Vielfalt von Verwendungen. Sie sind in einem beliebigen Fermentationsverfahren verwendbar, wo gewünscht wird, ein Mittel zum Herabregulieren der Expression eines Gens zu haben, das bis zu einer bestimmten Zeit exprimiert werden soll, nach welcher gewünscht wird, die Genexpression hinaufzuregulieren (z.B. während der Wachstumsphase der Fermentation herabregulieren und während der Produktionsphase der Fermentation hinaufregulieren). Für eine derartige Verwendung kann das zu exprimierende Gen ein beliebiges Gen, codierend ein Protein, sein, das durch Fermentation hergestellt werden soll, so lange wie das Gen ein natives Intron enthält. Das Gen kann dann durch ein beliebiges geeignetes Mittel, wie beispielsweise Stellen-spezifische Mutagenese (siebe T. Kunkel, US-Patentschrift 4873192 ), mutiert werden, um absichtlich eine aberrante zweite Gruppe von Spleißelementen hervorzubringen, welche ein aberrantes Intron definieren, welches die Expression des Gens wesentlich herabreguliert. Das Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden und der Expressionsvektor durch standardmäßige rekombinante Techniken in eine Wirtszelle (z.B. eine eukaryotische Zelle wie beispielsweise eine Hefen-, Insekten- oder Säugerzelle (z.B. Mensch, Ratte)) insertiert werden. Die Wirtszelle wird dann durch standardmäßige fermentative Techniken in Kultur gezüchtet. Wenn gewünscht wird, die Expression des mutierten Gens hinaufzuregulieren, wird dann ein antisense-Oligonukleotid in einer geeigneten Formulierung, welches an ein Glied der aberranten zweiten Gruppe von Spleißelementen bindet, zu dem Kulturmedium hinzugegeben, so daß die Expression des Gens hinaufreguliert wird.
Die Medikamente, Oligonukleotide und Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind auch als in-vitro- oder in-vivo-Werkzeuge zur Untersuchung des Spleißens in menschlichen oder tierischen Genen verwendbar, welche entwicklungsmäßig und/oder gewebereguliert sind. Derartige Experimente können durch die hier nachstehend beschriebenen Verfahrensweisen oder Modifizierungen davon, welche für den Fachmann offensichtlich sind, ausgeführt werden.
Die Medikamente, Oligonuldeotide und Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind auch als therapeutische Mittel bei der Behandlung von Krankheit unter Beteiligung von aberrantem Spleißen, wie beispielsweise β-Thalassämie (wobei das Oligonukleotid an β-Globin-, insbesondere humane, -prä-mRNA binden würde), α-Thalassämie (wobei das Oligonukleotid an α-Globin-prä-mRNA binden würde), Tay-Sachs-Syndrom (wobei das Oligonuldeotid an β-Hexoseaminidase-α-Untereinheit-prä-mRNA binden würde), Phenylketonurie (wobei das Oligonuldeotid an Phenylalaninhydroxylase-prä-mRNA binden würde) und bestimmte Formen von zystischer Fibrose (wobei das Oligonukleotid die prä-mRNA des Gens der zystischen Fibrose binden würde), verwendbar, bei welchen Mutationen, die zu aberrantem Spleißen von prä-mRNA führen, identifiziert worden sind (siehe z.B. S. Akli et al., J. Biol. Chem. 265, 7324 (1990); B. Dworniczak et al., Genomics 11, 242 (1991); L-C. Tsui, Trends in Genet. 8, 392 (1992)).
Zu Beispielen von β-Thalassämie, welche durch die vorliegende Erfindung behandelt werden können, gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, denjenigen der β¹¹⁰-, IVS1⁵-, IVS1⁶-, IVS²⁶⁵-, IVS2⁷⁰⁵- und IVS2⁷⁴⁵-mutanten Klasse (d.h., wobei die β-Globin-prä-mRNA die vorstehenden Mutationen tagt).
Der Begriff „antisense-Oligonukleotid" schließt die physiologisch und pharmazeutisch vertraglichen Salze davon ein: d.h. Salze, die die gewünschte biologische Aktivität der Elternverbindung behalten und ihnen nicht ungewünschte toxikologische Wirkungen verleihen. Beispiele derartiger Salze sind (a) Salze, erzeugt mit Kationen wie beispielsweise Natrium, Kalium, NH₄ ⁺, Magnesium, Calcium, Polyamine wie beispielsweise Spermin und Spermidin usw.; (b) Säureadditionssalze, erzeugt mit anorganischen Säuren, zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen; (c) Salze, erzeugt mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Citronensäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Palmitinsäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäure, Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Polygalacturonsäure und dergleichen; und (d) Salze, erzeugt aus Elementanionen wie beispielsweise Chlor, Brom und Iod.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen das antisense-Oligonuldeotid in einem physiologisch oder pharmazeutisch verträglichen Träger wie beispielsweise einem wässerigen Träger. So gehören zu Formulierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, ohne aber darauf begrenzt zu sein, diejenigen, geeignet für parenterale Verabreichung, einschließlich subcutane, intradermale, intramuskuläre, intravenöse und intraarterielle Verabreichung, ebenso wie topische Verabreichung (d.h. Verabreichung einer aerosolisierten Formulierung von respirablen Teilchen für die Lungen eines Patienten, leidend an zystischer Fibrose). Die Formulierungen können bequem in Einheitsdosierungsform dargeboten werden und können durch eines der auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Der geeignetste Weg der Verabreichung kann in einem gegebenen Fall von dem Patienten, der Natur und der Schwere des Leidens, das behandelt wird, und der speziellen aktiven Verbindung, die verwendet wird, abhängen.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von antisense-Oligonukleotiden mit den vorstehend angegebenen charakteristischen Eigenschaften für die Herstellung eines Medikaments zum Hinaufregulieren der Genexpression bei einem Patienten, leidend an einer Erkrankung mit aberrantem Spleißen, wie vorstehend diskutiert, bereit. Bei der Herstellung eines Medikaments gemäß der Erfindung wird das antisense-Oligonukleotid typischerweise mit, unter anderem, einem verträglichen Träger gemischt. Der Träger muß natürlich verträglich in dem Sinne sein, daß er mit allen anderen Bestandteilen in der Formulierung kompatibel ist, und darf nicht schädlich für den Patienten sein. Der Träger kann ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Ein oder mehrere antisense-Oligonukleotide können in die Formulierungen der Erfindung eingebracht werden, welche durch eine der bekannten Techniken der Pharmazie hergestellt werden können, die im wesentlichen aus Mischen der Komponenten, gegebenenfalls einschließend einen oder mehrere zusätzliche therapeutische Bestandteile, bestehen.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung können sterile Wässerige und nichtwässerige Injektionslösungen der aktiven Verbindung umfassen, welche Zubereitungen vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers und im wesentlichen pyrogenfrei sind. Diese Zubereitungen können Antioxidantien, Puffer, Bakteriostate und gelöste Stoffe enthalten, welche die Formulierung isotonisch mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers machen. Wässerige und nichtwässerige sterile Suspensionen können Suspendiermittel und Verdickungsmittel einschließen. Die Formulierungen können in Behältern für Einheitsdosis oder mehrfache Dosis, zum Beispiel verschlossenen Ampullen und Gläschen, dargeboten werden und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand aufbewahrt werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers, zum Beispiel Kochsalzlösung oder Wasser zur Injektion, unmittelbar vor dem Gebrauch erfordert.
In der Formulierung kann das antisense-Nukleotid innerhalb eines Lipidteilchens oder Vesikels, wie beispielsweise eines Liposoms oder Mikrokristalls, enthalten sein, welche für parenterale Verabreichung geeignet sein können. Die Teilchen können eine beliebige geeignete Struktur, wie beispielsweise unilamellar oder plurilamellar, haben, so lange wie das antisense-Oligonukleotid darin enthalten ist. Positiv geladene Lipide wie beispielsweise N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat oder „DOTAP" werden für derartige Teilchen und Vesikel besonders bevorzugt. Die Herstellung derartiger Lipidteilchen ist bekannt. Siehe z.B. die US-Patentschriften 4880635 von Janoff et al.; 4906477 von Kurono et al.; 4911928 von Wallach; 4917951 von Wallach; 4920016 von Allen et al.; 4921757 von Wheatley et al. usw.
Die Dosierung des verabreichten antisense-Oligonukleotids hängt von der speziellen Methode, die ausgeführt wird, ab, und wann es an einen Patienten verabreicht wird, hängt von der Krankheit, dem Zustand des Patienten, der speziellen Formulierung, dem Weg der Verabreichung usw. ab. Im allgemeinen werden intrazelluläre Konzentrationen des Oligonukleotids von 0,05 bis 50 μM, oder genauer gesagt 0,2 bis 5 μM, gewünscht. Zur Verabreichung an einen Patienten wie beispielsweise einen Menschen wird eine Dosierung von etwa 0,01, 0,1 oder 1 mg/kg bis zu 50, 100 oder 150 mg/kg angewendet.
Die vorliegende Erfindung wird in größerer Ausführlichkeit in den folgenden nichtbegrenzenden Beispielen erklärt. Nukleotidsequenzen werden hier nur durch den Einzelstrang, in der 5'- nach 3'-Richtung, von links nach rechts dargeboten.
BEISPIEL 1
Struktur und Konstruktion von prä-mRNAs
Die Konstruktion und Struktur von verschiedenen humanen β-Globin-prä-mRNA-Molekülen wird in 1 veranschaulicht Kästchen zeigen Exons an; dicke Linien Introns. Die Positionen der Mutationen (110 und 705) relativ zu Nukleotid 1 von IVS 1 bzw. IVS 2 sind oberhalb des HBΔ6-Klons angegeben. Die zahlen unten zeigen die Länge, in Nukleotiden, von Exons und Introns an. Antisense-Oligonukleotide (nachstehend ausführlich diskutiert) werden durch die numerierten kurzen Balken unter den β¹¹⁰- und IVS2⁷⁰⁵-Konstrukten und Spleißwege durch die gestrichelten Linien angezeigt. Alle prä-mRNAs wurden durch SP6-RNA-Polymerase (M. Konarska et al., Cell 38, 731 (1984)) aus geeigneten Fragmenten von humanem β-Globin-Gen, subkloniert in den SP64-Vektor, transkribiert. HBΔ6 (A. Krainer et al., Cell 36, 993 (1984)) enthält das gesamte humane β-Globin-Gen. Das ¹¹⁰-Konstrukt enthält die Exons 1 und 2 und wurde von dem ursprünglichen thalassämischen Klon subkloniert (R. Spritz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2455 (1981)). Vor der Transkription wurden Plasmide an der BamHI-Stelle linearisiert. Um das IVS2⁷⁰⁵-Plasmid zu konstruieren, wurde ein Fragment von HBΔ6, enthaltend praktisch das gesamte zweite Exon, das gesamte zweite Intron und einen Hauptanteil des dritten Exons, zuerst in SP64 subkloniert und nachfolgend in Übereinstimmung mit bekannten Techniken Stellen-spezifischer Mutagenese unterworfen (T. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367 (1987)), um eine T-zu-G-Mutation am Nukleotid 705 des Introns einzuführen. Transkription wurde dann auf einem Plasmid, linearisiert an der PvuII-Stelle, ausgeführt.
BEISPIEL 2
Synthese von antisense 2'-O-Methyloligonbonukleotiden
2'-O-Methyloligoribonuldeotide zur Verwendung in den hier beschriebenen Beispielen wurden in Übereinstimmung mit bekannten Techniken unter Verwendung von Reagenzien von Glen Research (Sterling, VA) synthetisiert und in Übereinstimmung mit bekannten Techniken unter Verwendung des von US Biochemicals erhältlichen SUREPURE^TM-Reinigungskits gereinigt.
2'-O-Methyloligonbonuldeotide, die hergestellt wurden, wurden als Oligo 1 bis Oligo 5 bezeichnet. Oligo 1 (GUCAGUGCCUAUCA)(SEQ ID NO:1), komplementär zu den Nukleotiden 82-95 von Intron 1, wird gegen den normalen Verzweigungspunkt und Oligo 2 (AUAGACUAAUAGGC)(SEQ ID NO:2), komplementär zu den Nukleotiden 103-116 von Intron 1, gegen die aberrante 3'-Spleißstelle, hervorgerufen durch β¹¹⁰-Mutation im Intron 1 des β-Globin-Gens, gezielt. Oligo 3 (CAUUAWGCCCUGAAAG)(SEQ ID NO:3), komplementär zu den Nukleotiden 573-589 von Intron 2, wird gegen die kryptische 3'-Spleißstelle am Nukleotid 579 des zweiten Introns gezielt und Oligo 4 (CCUCUUACCUCAGUUAC)(SEQ ID NO:4), komplementär zu den Nukleotiden 697-713, wird gegen die aberrante 5'-Spleißstelle, hervorgerufen durch die Mutation am Nukleotid 705 im zweiten Intron von IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA gezielt. Oligo 5 (GCUAUUACCUUAACCCAG)(SEQ ID NO:5) wird gegen die aberrante 5'-Spleißstelle, hervorgerufen durch die IVS2⁶⁵⁴-Mutation (Nukleotide 643-660 von Intron 2) gezielt. Oligo 6 (GCCUGACCACCAAC)(SEQ ID NO:6) wird gegen die kryptische 5'-Spleißstelle in Exon 1 von Globin-prä-mRNA gezielt (Nukleotide -23 bis -10 relativ zu Nukleotid 1 von Intron 1).
BEISPIEL 3
Umkehr von aberrantem Spleißen durch ein Antisense-Oligonukleotid, gezielt gegen den normalen Verzweigungspunkt von humanem β-Globin-Intron 1
Bei β¹¹⁰-Thalassämie, einer Form der Krankheit, vorwiegend bei Patienten von griechischem und zypriotischem Ursprung, bringt eine A-zu-G-Mutation am Nukleotid 110 des ersten Introns von humanem β-Globin-Gen eine zusätzliche, aberrante 3'-Spleißstelle hervor (R. Spritz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2455 (1981)). Trotz des Vorhandenseins der normalen 3'-Spleißstelle wird von der Spleißmaschinerie vorzugweise die aberrante Stelle verwendet, was in einer inkorrekt gespleißten mRNA resultiert, die 19 Nukleotide von der Intron-Sequenz enthält (1). In Zellen, transfiziert mit β¹¹⁰-Globin-Allel (M. Busslinger et al., Cell 27, 289 (1981); Y. Fukumaki et al., Cell 28, 585 (1982)) oder während des Spleißen seines Transkripts in nuklearen Extrakten (R. Reed und T. Maniatis, Cell 41, 95 (1985))(siehe auch 2, Bahn 2), macht korrekt gespleißte mRNA nur etwa 10% des gespleißten Produkts aus, im Einklang stehend mit den deutlich verringerten Niveaus von normalem Hämoglobin, die bei Patienten mit dieser Form von Thalassämie beobachtet werden. Es wurde gefunden, daß in β¹¹⁰-prä-mRNA die aberrante 3'-Spleißstelle den normalen Verzweigungspunkt am Nukleotid 93 des Introns, konkurrierend mit der korrekten 3'-Spleißstelle, rekrutiert und dadurch korrektes Spleißen verhindert (R. Reed und T. Maniatis, Cell 41, 95 (1985)). Bedeutsam für diese Arbeit ist, daß Mutationen, die den normalen Verzweigungspunkt inaktivieren, einen kryptischen Verzweigungspunkt am Nukleotid 107 aktivieren und in Spleißen an der korrekten 3'-Spleißstelle resultieren (Y. Zhuang und A. Weiner, Genes and Dev. 3, 1545 (1989)). Aberrantes Spleißen kann, zurückzuführen auf die Nähe des kryptischen Verzweigungspunkts zu der mutierten 3'-Spleißstelle, an Position 110 nicht ablaufen.
Um zu testen, ob antisense-Oligonukleotide, gezielt gegen die Sequenz des normalen Verzweigungspunkts, die Spleißmaschinerie zwingen würden, den kryptischen Verzweigungspunkt auszuwählen und eine korrekt gespleißte mRNA zu erzeugen, wurde ein 14 Nukleotide langes 2'-O-Methyloligonukleotid (Oligonukleotid 1, (SEQ ID NO:1)) gegen die Sequenz des Verzweigungspunkts im Intron 1 von β-Globin-prä-mRNA gezielt. Die 2'-O-Methyloligonukleotide wurden für dieses und nachfolgende Experimente ausgewählt, da sie gegen Nukleasen resistent sind und stabile Hybride mit RNA bilden, die nicht durch RNase H abgebaut werden (H. Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987); H. Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327 (1987); B. Sproat et al., Nucleic Acids Res. 17, 3373 (1989)). Abbau durch RNase H, gesehen zum Beispiel, wenn antisense-Oligodesoxynukleotide oder ihre Phosphorothioat-Derivate verwendet werden, würden die Substrat-prä-mRNA zerstören und jedes Spleißen verhindern.
2 zeigt die Umkehr von aberrantem Spleißen durch Oligonuldeotid 1, gerichtet gegen den normalen Verzweigungspunkt im Intron 1 von β-Globin-prä-mRNA. Spleißen von P³²-markierter β¹¹⁰-prä-mRNA (ungefähr 10⁵ cpm pro Reaktion, 25 fmol) wurde in vitro in HeLa-Zellkernextrakt für 2 Stunden im wesentlichen wie beschrieben ausgeführt (A. Krainer et al., Cell 36, 993 (1984); Z. Dominski und R. Kole, Mol. Cell. Biol. 12, 2108 (1992)), außer daß das Volumen der Reaktion auf 50 μl verdoppelt wurde. Reaktionsprodukte wurden auf einem 8%-Polyacrylamid-Sequenzierungsgel analysiert und durch Autoradiographie visualisiert. Die Struktur der Produkte und Zwischenverbindungen ist rechts dargestellt, ihre Größe in Nukleotiden ist links angegeben. Ein Sternchen bezeichnet aberrante Beweglichkeit von Lariat enthaltenden Zwischenverbindungen. Bahn 1, Spleißen von Kontroll-HBΔ6-prä-mRNA. Bahn 2, Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA. Bahnen 3-8, Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA in Anwesenheit zunehmender Mengen (angegeben oben auf der Figur) von Oligonuldeotid 1. Bahn 9, Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA in Anwesenheit von Oligonukleotid 3, gezielt auf eine Sequenz im Intron 2 von β-Globin-prä-mRNA.
Analyse dieser Daten zeigt, daß in der Kontrollreaktion ohne das Oligonuldeotid (2, Bahn 2), das Verhältnis der inkorrekt zu den korrekt gespleißten Produkten ungefähr 9:1 ist. Zugabe von Oligonuldeotid 1 mit den Konzentrationen 0,01 bis 1,0 μg pro Reaktion (0,05-5 μM) bewirkt dosisabhängige Hemmung von aberrantem Spleißen und Induktion des korrekten Spleißen des Substrats (2, Bahnen 3-6). Mit 1,0 μg des Oligonukleotids wird das Verhältnis von gespleißten Produkten zu 1:5 umgekehrt. Die Wirkung des Oligonukleotids ist sequenzspezifisch, da Zugabe von 1 μg eines Oligonukleotids, gezielt gegen die kryptische 3'-Spleißstelle in dem zweiten Intron des β-Globin-Gens (Oligonukleotid 3, (SEQ ID) NO:3); siehe auch nachstehend) nicht das ursprüngliche Verhältnis der gespleißten Produkte beeinflußt (2, Bahn 9). Bei 2,0 und 4,0 μg von Oligonuldeotid 1 wird das Spleißen an beiden Spleißstellen gehemmt, und ein 243-mer-RNA-Fragment wird erzeugt (2, Bahnen 7-8). Dieses Fragment sammelt sich nur unter Spleißbedingungen, d.h. in Anwesenheit von ATP und anderen Komponenten des Spleißgemischs, und stellt höchstwahrscheinlich ein Produkt von Spaltung an der Stelle der Bindung des Oligonukleotids durch eine ATP-abhängige Nuklease dar.
Die aberrante 3'-Spleißstelle, erzeugt durch die β¹¹⁰-Mutation, scheint auch ein Ziel für Umkehr von aberrantem Spleißen durch ein antisense-Oligonukleotid zu sein. Blockieren dieser Sequenz sollte der einfachste Weg sein, um die Spleißmaschinerie zu zwingen, die ursprüngliche 3'-Spleißstelle am Ende des Intron zu verwenden. Jedoch war ein 14-mer (Oligo 2, (SEQ ID NO:2)), gerichtet gegen die aberrante Spleißstelle, nicht wirksam; bei zunehmenden Konzentrationen des Oligonukleotids wurde die Ansammlung von beiden gespleißten Produkten gehemmt, wobei das korrekte etwas wirksamer gehemmt wird (3, Bahnen 2-5). Spleißen wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Verbindung mit 2 beschrieben ausgeführt. Interessanterweise scheint der erste Schritt der Spleißreaktion, die Spaltung an der 5'-Spleißstelle und Bildung der Lariat-Exon-Zwischenverbindung, weniger durch Oligo 2 beeinflußt zu werden als die Bildung des endgültigen gespleißten Produkts. Dies wird durch das Vorhandensein dieser Zwischenverbindungen gezeigt, sogar wenn 1 oder 2 μg des Oligonukleotids zu der Spleißreaktion hinzugegeben wurden (3, Bahnen 5-6). Bei 4 μg pro Reaktion wird die Spaltung an der 5'-Spleißstelle gehemmt (3, Bahn 7).
Die unterschiedlichen Auswirkungen von Oligo 1 und Oligo 2 reflektieren komplexe Wechselwirkungen unter den Oligonukleotiden, wobei sich die zahlreichen Spleißfaktoren und Sequenzelemente in dem Abschnitt von 37 Nukleotiden zwischen dem normalen Verzweigungspunkt und der korrekten 3'-Spleißstelle befinden. Es ist klar, daß Oligonukleotid 1, hybridisiert mit dem normalen Verzweigungspunkt an dem 5'-Ende dieser Region, Bindung der Spleißfaktoren an diese Sequenz verhindert, indem sie gezwungen werden, den kryptischen Verzweigungspunkt stromabwärts auszuwählen. Dies führt zur Hemmung von aberrantem und Induktion von korrektem Spleißen von β¹¹⁰-prä-mRNA. Im Gegensatz dazu kann Hybridisierung von Oligo 2 mit seiner zentral gelegenen Zielsequenz die Bindung einer großen Anzahl von Spleißfaktoren, die sich in dieser Region zusammenfügen, behindern und jegliches Spleißen verhindern. Man beachte auch, daß dieses Oligonukleotid einen wesentlichen Anteil von dem Polypyrimidintrakt blockiert, der zum Spleißen für sowohl die aberrante als auch die korrekte 3'-Spleißstelle wesentlich ist. Dieses ist eine alternative Erklärung, warum es diesem Oligonukleotid nicht gelang, den korrekten Spleißweg wiederherzustellen.
BEISPIEL 4
Umkehr von aberrantem Spleißen durch antisense-Oligonukleotide gegen die 5'- und 3'-Spleißstellen von humanem β-Globin-Intron 2
Ob eine aberrante 3'-Spleißstelle nichtsdestotrotz als Ziel für Umkehr von inkorrektem Spleißen verwendet werden kann, wurde weiterhin auf prä-mRNA, tragend eine T-zu-G-Mutation an Position 705 des zweiten Introns von humanem β-Globin-Gen, getestet. Diese Mutation (IVS2⁷⁰⁵), gefunden bei mediterranen Thalassämie-Patienten, bringt eine zusätzliche, aberrante 5'-Spleißstelle 145 Nukleotide stromaufwärts von der normalen 3'-Spleißstelle hervor (C. Dobkin und A. Bank, J. Biol. Chem. 260, 16332 (1985)). Während des Spleißen wird eine kryptische 3'-Spleißstelle an Position 579 des Introns aktiviert, resultierend in der Entfernung der Nukleotide 1-578 und 706-850 als separate Introns und Einbringung des verbliebenen Anteils des Introns in das gespleißte Produkt (1). In dieser RNA übertreffen die Entfernungen zwischen jedem der am Spleißen beteiligten Sequenzelemente 100 Nukleotide und es sollten keine Auswirkungen sterischer Hinderung durch das Oligonukleotid erwartet werden.
Die Umkehr von aberrantem Spleißen von IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA durch Oligonukleotid 3 (SEQ ID) NO:3), gerichtet gegen die kryptische 3'-Spleißstelle, und Oligonukleotid 4 (SEQ ID NO:4), gerichtet gegen die aberrante 5'-Spleißstelle im Intron 2 der IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA, wird in 4 gezeigt. Die Bedingungen der Spleißreaktion waren die gleichen wie vorstehend in Verbindung mit 2 beschrieben, außer daß das RNA-Transkript vor der Verwendung durch Elektrophorese auf einem 6%-Sequenzierungsgel gereinigt wurde. Bahn 1, Input-RNA. Bahnen 2 und 3, Spleißen von Kontrolltranskripten (angezeigt oben auf der Figur). Bahnen 4-8 und 9-13, Spleißen von IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA in Anwesenheit von Oligonukleotid 3 bzw. Oligonuldeotid 4. Die Mengen der Oligonukleotide in der Reaktion sind oben angegeben. "?" auf der linken Seite zeigt zum Vorschein kommendes Abbauprodukt an.
Das Kontroll-Transkript, enthaltend das zweite Intron von normaler β-Globin-prä-mRNA, wird wirksam gespleißt (4, Bahn 2), wobei die erwarteten Zwischenverbindungen (das 5'-Exon und die großen Lariate) und das korrekt gespleißte Produkt, mit einer Länge von 451 Nukleotiden, erzeugt werden. Spleißen von IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA ist ebenfalls wirksam und ergibt ein zusätliches gespleißtes Produkt, 577 Nukleotide lang, und eine erwartete 348-mer-Zwischenverbindung, resultierend aus dem von der Mutation verursachten aberranten Spleißweg (4, Bahn 3). Das 1:2-Verhältnis von korrekt zu inkorrekt gespleißten RNAs ist ähnlich dem, das früher in vivo beobachtet wurde. Oligonuldeotid 3 (1), gezielt an der aktivierten kryptischen 3'-Spleißstelle am Nukleotid 579, ist sehr aktiv, wobei es dosisabhängige Umkehr des Spleißens zu dem korrekten Spleißweg induziert (4, Bahnen 4-8). Bei 0,1 und 0,4 μg des Oligonukleotids pro Reaktion ist die Umkehr praktisch vollständig. Korrektes Spleißen wird auch bei ähnlichen Konzentrationen von Oligonuldeotid 4 (1), gezielt gegen die aberrante 5'-Spleißstelle, hervorgerufen durch die Mutation am Nukleotid 705 des zweiten Introns, erhalten (4, Bahnen 9-13). Bei 1 und 2 μg pro Reaktion hatte kein Oligonuldeotid zusätzliche Auswirkungen; bei 4 μg pro Reaktion (20 μM) wird alles Spleißen gehemmt (nicht gezeigt). Zusätzliche Banden, einschließlich einer starken Bande, markiert durch "?", in einer Figur sind höchstwahrscheinlich auf den Nuklease-Abbau der langen (1301 Nukleotide) prä-mRNA zurückzuführen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die kryptische 3'-Spleißstelle ebenso wie die mutierte 5'-Spleißstelle geeignete Ziele für spezifische Umkehr von aberrantem Spleißen bereitstellen. Ähnliche Auswirkungen der Oligonuldeotide 3 und 4 lassen vermuten, daß es keine größeren Unterschiede in ihren Zugangsmöglichkeiten zu den Ziel-Spleißstellen gibt. Beide Oligonuldeotide sind ungefähr 10 Mal wirksamer als Oligonuldeotid 1, das in den in 2 angegebenen Experimenten verwendet wird. Diese höhere Wirksamkeit kann auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein. Die Oligonukleotide 3 und 4 sind drei Nukleotide länger als Oligonukleotid 1 und können stabilere Hybride mit RNA bilden. Sie blockieren aberrante Spleißstellen, wobei der Spleißmaschinerie erlaubt wird, die korrekten Spleißstellen und, mutmaßlich, den korrekten Verzweigungspunkt zu verwenden. Im Gegensatz dazu zwingt in β¹¹⁰-prä-mRNA Oligonukleotid 1 die Spleißmaschinerie, eine Sequenz des suboptimalen kryptischen Verzweigungspunkts zu verwenden, was in relativ ineffizienter Erzeugung von korrekt gespleißter mRNA resultieren kann. In Experimenten, gezeigt in 4, ist die lange Input-prä-mRNA nach 2 Stunden der Reaktion kaum nachweisbar, was auf ihre Instabilität hinweist. So können sie, obwohl die molaren Konzentrationen der Oligonuldeotide im wesentlichen die gleichen wie in früheren Experimenten waren, in größerem Überschuß gegenüber der Substrat-prä-mRNA gewesen sein.
In den vorstehend dargestellten Experimenten wurden die Oligonukleotide gleichzeitig mit den anderen Komponenten der Spleißreaktion hinzugegeben. Prähybridisierung der Oligonukleotide mit der prä-mRNA vergrößerte ihre Wirksamkeit nicht und Oligonuldeotide, hinzugegeben 15 Minuten nach dem Start der Reaktion, d.h., nachdem die Spleißkomplexe eine Chance hatten, sich zu bilden (B. Ruskin und M. Green, Cell 43, 131 (1985)), waren fast so wirksam (Daten nicht angegeben). Diese Ergebnisse zeigen an, daß Oligonukleotide, enthaltend die 2'-O-Methyl-Modifizierung, imstande sind, mit den Spleißfaktoren wirksam um ihre Zielsequenzen zu konkurrieren. Die hohe Aktivität dieser Verbindungen ist höchstwahrscheinlich auf ihre starke Hybridisierung mit RNA zurückzuführen.
BEISPIEL 5
Umkehr von aberrantem Spleißen mit einem antisense-Oligonukleotid, welches die kryptische 3'-Spleißstelle von IVS1-5 und IVS1-6 blockiert
Dieses Experiment wird im wesentlichen wie vorstehend beschrieben ausgeführt, außer daß die thalassämischen Mutationen die IVS1-5- und IVS1-6-Mutationen sind, in welchen die authentische 5'-Spleißstelle von IVS1 mutiert ist. Aberrantes Spleißen, resultierend in Thalassämie, ist anscheinend auf die Tatsache zurückzuführen, das die Mutationen IVS1-5 und IVS1-6 die 5'-Spleißstelle schwächen und der kryptischen Spleißstelle, 16 Nukleotide stromaufwärts gelegen, erlauben, erfolgreich um die Spleißfaktoren zu konkurrieren. In diesem Experiment testen wir, ob ein Oligonukleotid antisense zu der kryptischen Spleißstelle aberrantes Spleißen zurück zu der mutierten 5'-Spleißstelle umkehren und trotz der Mutationen korrektes Spleißen wiederherstellen kann, da Spleißstellen ähnlich den mutierten in anderen prä-mRNAs funktionell zu sein scheinen. Das angewendete Oligonukleotid ist Oligo 6 (SEQ ID NO:6), ein 2-O-Methylribooligonukleotid, hergestellt wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben.
BEISPIEL 6
Umkehr von aberrantem Spleißen mit einem antisense-Oligonukleotid, welches die aberrante 5'-Spleißstelle der IVS2⁶⁵⁴-Mutation blockiert
Diese Experimente werden im wesentlichen wie vorstehend beschrieben ausgeführt, außer daß die humane β-Globin-prä-mRNA, enthaltend die WS2⁶⁵⁴-Mutation, angewendet wird und Oligo 5 (SEQ ID NO:5) angewendet wird.
Die IVS2⁶⁵⁴-Mutation, häufig bei thalassämischen Individuen chinesischen Ursprungs identifiziert, beeinflußt das Spleißen durch Hervorbringen einer zusätzlichen 5'-Spleißstelle am Nukleotid 653 und Aktivieren der gewöhnlichen kryptischen 3'-Spleißstelle am Nukleotid 579 von Intron 2. Die Wirksamkeit des aberranten Spleißen von IVS2⁶⁵⁴-prä-mRNA ist höher als die für IVS2⁷⁰⁵-prä-mRNA, und nur kleine Mengen von korrekt gespleißtem Produkt, relativ zu der von aberrantem, sind während des Spleißen in vitro nachweisbar. Trotz der hohen Wirksamkeit von aberrantem Spleißen stellten Oligo 3, gezielt gegen die kryptische 3'-Spleißstelle, ebenso wie Oligo 5, gezielt gegen die aberrante 5'-Spleißstelle, korrektes Spleißen mit Konzentrationen ähnlich den vorstehend beschriebenen wirksam wieder her. Bei 2 μM Konzentration von jedem Oligonukleotid sammelt sich das korrekt gespleißte Produkt und das aberrante Produkt ist praktisch nicht nachweisbar (Daten nicht angegeben).
BEISPIEL 7
Umkehr von aberrantem Spleißen durch antisense-Oligonukleotid, welches den Verzweigungspunkt von humanem β-Globin-Intron-1 blockiert
Dieses Experiment wird im wesentlichen wie vorstehend beschrieben ausgeführt, um korrektes Spleißen in β¹¹⁰-mutanter prä-mRNA wiederherzustellen, außer daß das Oligonukleotid an eine Sequenz bindet, die sich gerade stromaufwärts von der Sequenz des nativen Verzweigungspunkts von Intron 1 des β-Globin-Gens (Nukleotide 75-88) befindet. Die Sequenz des Oligonukleotid ist: CCCAAAGACUAUCC (SEQ ID NO:7). Korrektes Spleißen wird wiederhergestellt.
BEISPIEL 8
Konstruktion von Zell-Linien, die thalassämische humane β-Globin-prä-mRNA exprimieren
Eine Serie von stabilen Zell-Linien wird durch Transfizieren von HeLa-Zellen und CHO-Zellen mit thalassämischen Globin-Genen, kloniert unter dem unmittelbaren frohen Promoter des Cytomegalovirus (CMV), konstruiert. Die Gene schließen eine IVS1-110-, IVS2-654- und IVS1-5-Mutation ein.
Stabile Zell-Linien werden in Übereinstimmung mit Standardtechniken erhalten. Siehe z.B. Current Protocolls in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie)(P. Ausubel. et al. Hrsg. 1987). Kurz gesagt werden Zellen mit Plasmiden, tragend thalassämische Globin-Gene unter dem CMV-Promoter, und Plasmiden, tragend das Neomycin-Resistenzgen als auswählbaren Marker (pSV2neo), cotransfiziert. Die Transfektion geschieht entweder durch Elektroporation (Z. Dominnski und R. Kole, Mol. Cel. Biol. 11: 6075-6083 (1991); Z. Dominski und R. Kole, Mol. Cell. Biol. 12: 2108-2114 (1992)) oder durch des Calciumphosphat-Verfahren. Die Zellen werden plattiert und nach 24-48 Stunden mit G418 enthaltendem selektiven Medium herausgefordert Überlebende Kolonien werden expandiert und für Expression der thalassämischen Globin-mRNA wie folgt einem Assay unterzogen.
Die gesamte RNA wird aus ungefähr 10⁵ Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Tri-Reagenzes (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio) folgend dem Protokoll des Herstellers isoliert Diese Methode erlaubt leichte Verarbeitung einer großen Anzahl von kleinen Proben und ergibt hohe Ausbeuten von RNA mit guter Qualität. Die Spleißmuster werden durch RT-PCR unter Verwendung von rTth-Polymerase und folgend dem Protokoll der Hersteller (Perkin Elmer) analysiert. Nicht mehr als 1-5% von isolierter RNA sind für den Nachweis von gespleißter RNA in transient transfizierten Zellen erforderlich, so ist die Methode für den leichten Nachweis in stabilen Zell-Linien ausreichend empfindlich. Der Schnitt mit reverser Transkriptase wird mit einem 3'-Primer ausgeführt, der mit den aberranten Sequenzen in thalassämischer mRNA hybridisiert und die Spleißverbindung überbrückt. Dies sichert, daß die kontaminierende DNA und normale Globin-RNA nicht nachgewiesen werden und den Assay nicht beeinträchtigen. Die klonierten Zell-Linien, die thalassämische prä-mRNA exprimieren, werden zur Behandlung mit antisense-2'-O-Methyloligonukleotiden wie nachstehend beschrieben verwendet.
BEISPIEL 9
Verabreichung von antisense-Oligonukleotiden in Zellkultur
Zellen, hergestellt vorstehend in Beispiel 8, werden in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen gezüchtet, die 200 μl Medien pro Vertiefung enthalten. 2 × 10⁴ Zellen werden pro Vertiefung eingeimpft und sie werden, wenn gebunden, mit 200 μl Medien, enthaltend eine Konzentration von antisense-Oligonuldeotiden bis zu 50 μM, behandelt. Zellen werden bis zu 4 Tage in Anwesenheit des Oligonukleotids kultiviert, bevor sie Konfluenz (2 – 3 × 10⁵ Zellen) erreichen. Da 2'-O-Methyloligonukleotide in Serum enthaltenden Medien sehr stabil sind, wird das Medium nicht öfter als alle zwei Tage geändert. Die Konzentration von 50 μM (40 μg pro Vertiefung) des Oligonukleotids stellt 100-fachen Überschuß gegenüber dem dar, der erforderlich ist, um in vitro wirksame Wiederherstellung von Spleißen auszulösen. Sogar bei dieser Konzentration stellt eine einzelne Oligonukleotidsynthese im 1-μmol-Maßstab, die 1-1,6 mg des Oligonukleotids ergibt, ausreichend Material für 25 bis 40 Proben bereit.
In einer alternativen Herangehensweise werden Zellen vor der Zugabe von Oligonukleotiden mit Lipofectin^TM-Reagenz (DOTMA, von BRL) mit einer Konzentration von 10 μg/ml in Übereinstimmung mit bekannten Techniken vorbehandelt (C. Bennett et al., Mol. Pharm. 41: 1023-1033 (1992)).
Nach der Behandlung wird die gesamte RNA wie vorstehend isoliert und durch RT-PCR für das Vorhandensein von korrekt gespleißter mRNA einem Assay unterzogen. Amplifikation von Primer wird in Anwesenheit von alpha-P32-markiertem ATP ausgeführt, um die Empfindlichkeit des Nachweises zu vergrößern und die Anzahl der Zyklen auf 15 zu verringern.
Die vorhergehenden Beispiele sind für die vorliegende Erfindung veranschaulichend und sind nicht als begrenzend für diese aufzufassen. Die Erfindung ist durch die folgenden Ansprüche definiert, wobei Äquivalente der Ansprüche darin eingeschlossen sein sollen.
BEISPIEL 10
Liposom-Transfektion
Eine auf HeLa basierende Zell-Linie, stabil transfiziert mit dem humanen β-Globin-Klon, tragend eine thallasämische IVS2-654-Mutation, wurde verwendet, um die folgenden Experimente auszuführen. Ein Subklon der ISV2-654-Zell-Linie exprimiert vorwiegend aberrant gespleißte β-Globin-mRNA und kleine Mengen der korrekt gespleißten Spezies. Ein zweites Subklon, genannt ISV2-654*, exprimiert aberrant und korrekt gespleißte β-Globin-mRNAs in ungefähr einem 1:1-Verhältnis. Ungefähr 10⁵ von IVS2-654-Zellen, gezüchtet in Monoschicht, wurden mit 3 μM des 2'-O-Methylribooligonukleotids (17-mer) antisense zu der kryptischen 3'-Spleißstelle [Oligo 3; CAUUAUUGCCCUGAAAG; (SEQ ID) NO:3)] in Anwesenheit von 20 μg/ml von LIPOFECTIN^TM-Liposom-Transfektionsreagenz (BRL) in Übereinstimmung mit den Beschreibungen des Herstellers für 5 Stunden in OPTI-MEM-Medium ohne Serum behandelt. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen in das normale Wachstumsmedium zurückgeführt (MEM + 10% fetales Kalbsserum). Unbehandelte Zellen und Zellen, behandelt mit Lipofektion allein, wurden als Kontrollen verwendet. Nach dem Wachstum über Nacht wurde die gesamte RNA der Zellen unter Verwendung von Tri-Reagenz (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) folgend dem Protokoll des Herstellers isoliert Die RNA wurde durch Extinktion bei 260 nm quantifiziert.
Die Analyse des Spleißen wurde durch Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) ausgeführt. Eine gleiche Menge von RNA von jeder Probe wurde unter Verwendung eines rTth-RT-PCR-Kits (Cetus-Perkin Elmer) einem Assay unterzogen. Dem Protokoll des Herstellers wurde mit der Ausnahme gefolgt, daß 1 μCi von α-P³² markiertem dATP zu der RT-PCR-Reaktion hinzugegeben wurde. PCR-Produkte wurden auf 8 %igem nicht denaturierendem Polyacrylamidgel analysiert. Ein Oligonukleotid, hybridisierend mit dem zweiten Exon von humanem β-Globin-Gen, wurde als gewöhnlicher Primer verwendet. Primer, spezifisch für aberrantes Spleißen (Primer A), überbrückten die aberrante Spleißverbindung, wohingegen Primer für korrektes Spleißen (Primer C) die korrekte Spleißverbindung überbrückten (5). RT-PCR wurde mit Primer A in den Bahnen 1, 3 und 5 und mit Primer C in den Bahnen 2, 4 und 6 ausgeführt. Die Menge von PCR Produkt, aufgegeben in den Bahnen 1, 3 und 5, war 1/5 von der in den Bahnen 2, 4 und 6. Die Bahnen 1 und 2 zeigen Spleißen der prä-mRNA von Zellen, behandelt mit LIPOFECTIN^TM-Reagenz und 3 μM 2'-O-Methyloligoribonukleotid; die Bahnen 3 und 4 zeigen Spleißen der prä-mRNA von Zellen, behandelt mit LIPOFECTIN^TM-Reagenz allein; und die Bahnen 5 und 6 zeigen Spleißen der prä-mRNA von unbehandelten Zellen. Man beachte die visuell nachweisbare Zunahme im korrekten Spleißen für Zellen, behandelt mit dem Oligonukleotid in Anwesenheit des LIPOFECTIN^TM-Reagenzes, in Bahn 2.
BEISPIEL 11
Adenvirus-vermittelter Transfer
Ungefähr 10⁵ von ISV2-654*-Zellen, gezüchtet in Monoschicht über Nacht, wurden mit 5 und 20 μM 2'-O-Methylribooligonukleotid (17-mer) antisense zu der kryptischen 3'-Spleißstelle (SEQ ID NO:3) in Anwesenheit von 10⁶ Teilchen von replikationsdefizientem Adenvirus (Stamm dl-312, ein Geschenk von Dr. Hu von der University of North Carolina in Chapel Hill) behandelt Der Virus und das Oligonukleotid wurden für 30 Minuten in OPTI-MEM präinkubiert, dann zu der Zellkultur hinzugegeben, und die Inkubation wurde für 2 Stunden fortgesetzt. Das Medium wurde abgesaugt und mit einem normalen Wachstumsmedium ersetzt Nach dem Wachstum über Nacht wurde die gesamte RNA wie vorstehend beschrieben isoliert. Die RT-PCR-Reaktion wurde wie vorstehend ausgeführt, mit der Ausnahme, daß die Primer mit den zweiten bzw. dritten Exons des humanen β-Globin-Gens hybridisierten. Die Analyse der Produkte war wie vorstehend in Beispiel 10 angegeben, mit der Ausnahme, daß gleiche Mengen von PCR-Produkten auf das Gel aufgegeben wurden. Die Ergebnisse sind in 6 veranschaulicht Bahn 1 zeigte Spleißen von unbehandelten Zellen; und die Bahnen 2 bzw. 3 zeigten Spleißen von Zellen, behandelt mit 5 bzw. 20 μM Oligonuldeotid in Anwesenheit von Adenvirus. Man beachte die visuell nachweisbare Zunahme in korrektem Spleißen zusammen mit einer entsprechenden Abnahme in aberrantem Spleißen und in einer dosisabhängigen Weise für die mit 5 und 20 μM Oligo behandelten Zellen.
BEISPIEL 12
Elektroporation
Ungefähr 10⁵ IVS2-654*-Zellen, gezüchtet über Nacht in Monoschicht, wurden trypsiniert und in 0,5 ml von OPTI-MEM in eine 10-mm-Elektroporationsküvette überführt. 5 oder 50 μM 2'-O-Methylribooligonukleotid antisense zu der aberranten 5'-Spleißstelle [Oligo 4; (CCUCUUACCUCAGUUAC)(SEQ ID NO:4)] wurden pro Probe hinzugegeben und das Gemisch wurde mit einem 1500 V-Impuls unter Verwendung eines Elektroporators von dem Electronics Laboratory der University of Wisconsin, eingestellt auf 0,75 μF, elektroporiert. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in dem normalen Wachstumsmedium resuspendiert und in Monoschicht über Nacht gezüchtet Die gesamte RNA wurde wie vorstehend beschrieben isoliert und durch RT-PCR analysiert, wie vorstehend in Beispiel 11 beschrieben ist.
Die Ergebnisse sind in 7 veranschaulicht. Man beachte eine visuell nachweisbare Abnahme in aberrantem Spleißen zusammen mit einer entsprechenden Zunahme in korrektem Spleißen, besonders wo 50 μM Oligo zugeführt werden.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Antisense-Oligonukleotid zur Verwendung als Medikament zum Bekämpfen von aberrantem Spleißen in einem prä-mRNA-Molekül, enthaltend eine Mutation, wobei das prä-mRNA-Molekül eine erste Gruppe von Spleißelementen, definierend ein natives Intron, enthält, welches durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation abwesend ist, um ein erstes mRNA-Molekül, codierend ein natives Protein, zu erzeugen; und wobei die prä-mRNA weiterhin eine zweite Gruppe von Spleißelementen, induziert durch die Mutation und definierend ein aberrantes Intron, verschieden von dem nativen Intron, enthält, welches aberrante Intron durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation vorhanden ist, um ein aberrantes zweites mRNA-Molekül, verschieden von dem ersten mRNA-Molekül, zu erzeugen; wobei das Medikament umfaßt: ein antisense-Oligonukleotid, fähig zum Hybridisieren mit dem prä-mRNA-Molekül, um unter Bedingungen, welche Spleißen gestatten, ein doppelsträngiges Molekül hervorzubringen, wobei das antisense-Oligonukleotid RNase H nicht aktiviert; und wobei das Oligonuldeotid ein Glied der aberranten zweiten Gruppe von Spleißelementen blockiert; so daß das native Intron durch Spleißen entfernt wird und das erste mRNA-Molekül, codierend ein Protein, erzeugt wird, und wobei der Hybridisierungsschritt in einer Zelle ausgeführt wird und wobei die erste mRNA in das native Protein translatiert wird.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid ein mutiertes Spleißelement blockiert.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid ein natives Spleißelement blockiert.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid ein kryptisches Spleißelement blockiert.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid eine 5'-Spleißstelle blockiert.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid eine 3'-Spleißstelle blockiert.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid einen Verzweigungspunkt blockiert.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das native Protein β-Globin ist.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das native Protein humanes β-Globin ist.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid eine Länge von 8 bis 50 Nukleotiden hat
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid einen modifizierten Internukleotid-Brückenphosphatrest, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methylphosphonaten, Methylphosphonothioaten, Phosphoromorpholidaten, Phosphoropiperazidaten und Phosphoramidaten, enthält.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das antisense-Oligonukleotid ein Nukleotid mit einem Niederalkylsubstituenten an der 2'-Position davon enthält.
Antisense-Oligonukleotid zur Verwendung als Medikament zum Hinaufregulieren der Expression eines nativen Proteins in einer Zelle, enthaltend eine DNA, codierend das native Protein, welche DNA eine Mutation enthält, welche Herabregulation des nativen Proteins durch aberrantes Spleißen davon verursacht, wobei die DNA eine prä-mRNA codiert; wobei die prä-mRNA eine erste Gruppe von Spleißelementen, definierend ein natives Intron, enthält, welches durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation abwesend ist, um eine erste mRNA, codierend das native Protein, zu erzeugen; und wobei die prä-mRNA weiterhin eine zweite Gruppe von Spleißelementen, induziert durch die Mutation und definierend ein aberrantes Intron, verschieden von dem nativen Intron, enthält, welches aberrante Intron durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation vorhanden ist, um eine aberrante zweite mRNA, verschieden von der ersten mRNA, zu erzeugen; wobei das Medikament umfaßt: ein antisense-Oligonukleotid, welches mit der prä-mRNA hybridisiert, um unter Bedingungen, welche Spleißen gestatten, einen Doppelstrang davon hervorzubringen, wobei das antisense-Oligonukleotid RNase H nicht aktiviert; und wobei das atisense-Oligonukleotid ein Glied der aberranten zweiten Gruppe von Spleißelementen blockiert; so daß das native Intron durch Spleißen entfernt wird und das native Protein erzeugt wird.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 13, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hefe-, Insekten- und Säugerzellen, ist.
Antisense-Oligonukleotid in einer wässerigen Lösung eines physiologisch vertraglichen Trägers zum Bekämpfen von aberrantem Spleißen in vivo in einem prä-mRNA-Molekül, enthaltend eine Mutation, wobei das prä-mRNA-Molekül eine erste Gruppe von Spleißelementen, definierend ein natives Intron, enthält, welche durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation abwesend ist, um ein erstes mRNA-Molekül, codierend ein natives Protein, zu erzeugen; und wobei die prä-mRNA weiterhin eine zweite Gruppe von Spleißelementen, induziert durch die Mutation und definierend ein aberrantes Intron, verschieden von dem nativen Intron, enthält, welches aberrante Intron vorzugsweise durch Spleißen entfernt wird, wenn die Mutation vorhanden ist, um ein aberrantes zweites mRNA-Molekül, verschieden von dem ersten mRNA-Molekül, zu erzeugen; wobei das antisense-Oligonukleotid ein Oligonukleotid umfaßt, welches: (i) mit der prä-mRNA hybridisiert, um ein doppelsträngiges Molekül zu erzeugen; (ii) RNase H nicht aktiviert; und (iii) ein Glied der aberranten zweiten Gruppe von Spleißelementen blockiert.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 15, wobei das Oligonukleotid eine Länge von 8 bis 50 Nukleotiden hat.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 15, wobei das Oligonukleotid einen modifizierten Internukleotid-Brückenphosphatrest, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methylphosphonaten, Methylphosphonothioaten, Phosphoromorpholidaten, Phosphoropiperazidaten und Phosphoramidaten, enthält.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 16, wobei das antisense-Oligonukleotid ein Nukleotid mit einem Niederalkylsubstituenten an der 2'-Position davon enthält.
Antisense-Oligonukleotid gemäß Anspruch 16 in einer Lipidvesikel.
Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids gemäß Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krankheit, die aberrantes Spleißen mit sich bringt
Verwendung eines Antisense-Oligonuldeotids gemäß Anspruch 20, wobei die Krankheit aus der Gruppe, bestehend aus β-Thalassämie, α-Thalassämie, Tay-Sachs-Syndrom, Phenylketonurie und zystischer Fibrose, ausgewählt ist.