Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifllt Assay-Verfahren und Reagenzien zur
Verwendung darin für den Nachweis und die Quantifizierung von Analyten mit Hilfe
von Nukleinsäure-Sonden. Die Analyte sind spezielle Nukleinsäure-Sequenzen.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen homogenen Assay, wodurch Analyte in
Lösung nachgewiesen und quantifiziert werden.
Hintergrund der Erfindung
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Der Nachweis der Anwesenheit von speziellen Nukleinsäure-Sequenzen in
einer vorgegebenen Probe mit Hilfe von Nukleinsäure-Sonden, die sich an die
Sequenzen binden ("hybridisieren") ist in der Technik wohlbekannt. Das klassische
Format für die Sonden-Hybridisierung ist der "Southern blot". Eine Variante ist der
"dot-blot" oder "slot-blot". In beiden Fällen bedeutet die Immobilisierung des Targets
auf einer festen Phase, daß überschüssige, nicht hybridisierte Sonde durch
Waschen leicht entfernt werden kann.
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Jüngere Systeme schließen die Hybridisierung in der flüssigen Phase ein, die
schneller ist. Da die Charakteristika der meisten Markierungssysteme noch immer
die Entfernung von jeglicher nicht-hybridisierter Sonde erfordern, folgt in vielen Test-
Formaten auf die Lösungs-Hybridisierung ein Abfangen der Hybride auf einer
Festphase.
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Eine Vielfalt von Doppelsonden-"Sandwich"-Formaten wurde beschrieben, in
denen die Target-Sequenz eine Verknüpfung zwischen einer markierten "Reporter"-
Sonde und einer immobilisierten "Abfang"-Sonde bildet. Die Reporter-Sonde wird nur
in Anwesenheit des Targets immobilisiert. Es gibt jedoch einen zunehmenden Bedarf
an homogenen Systemen, in denen ein Signal in der flüssigen Phase nur erzeugt
werden kann, wenn Sonde : Target-Hybride gebildet werden. Mit anderen Worten, es
ist keine Entfernung von überschüssiger, nicht gebundener Sonde erforderlich.
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EP-A-0146039 beschreibt ein homogenes Assay-System auf der Basis von
Enzym-Kanalbildung. Antikörper gegen doppelsträngige DNA wird mit zwei
unterschiedlichen Enzymen konjugiert und beide Konjugat-Typen werden der
Hybridisierungs-Mischung zugesetzt; wenn Sonde Target-Hybride gebildet werden,
werden die beiden Enzym-Marker nahe zueinander gebracht. Die
Hybridisierungs-Mischung
enthält auch ein vollständiges Substrat für das erste Enzym, aber nicht für
das zweite. Ein geeignetes Enzym-Paar ist Glucoseoxidase und Peroxidase; eine
hohe lokale Konzentration von Wasserstoffperoxid wird durch die Glucoseoxidase
erzeugt, was es der Peroxidase ermöglicht, ein gefärbtes Produkt zu bilden. Wenn
beide Antikörper frei in Lösung wären, wäre die Konzentration von
Wasserstoffperoxid, die von Peroxidase erkannt wird, vernachläßigbar und es würde
sich keine Farbe bilden. Heller et al. in Kingsbury, D.T. & Falkow, S., Hrsg., Rapid
Detection and Identification of Infectious Agents, Academic Press, New York (1985)
beschreiben ein ähnliches Konzept, in welchem zwei separate Sonden, deren
Target-Sequenzen benachbart sind, verwendet werden. Beide weisen Marker, die
fluoreszierend sind, auf; dabei ist die Emissions-Wellenlänge eines Markers die
geeignete Anregungs-Wellenlänge des anderen. Wenn die beiden Marker in enger
Nachbarschaft vorliegen, sind die Energieübertragung und somit die Emission durch
den zweiten Marker hoch effizient. Wiederum ist die Emission aus dem zweiten
Marker vernachläßigbar, wenn die beiden Sonden frei in Lösung vorliegen.
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Ein homogener Fluoreszenz-Test unter Verwendung nur einer Sonde ist
ebenfalls entwickelt worden; siehe Arnold, Ciin. Chem. 35:1588-1594 (1989) und EP-
A-0309230. Der Marker ist ein Acridinium-Ester, der eine spaltbare Bindung enthält.
Die Spaltung dieser Bindung macht den Marker nicht-fluoreszierend. Die Struktur
des Sonde : Target-Hybrids schützt diese Bindung vor Spaltung. Um den Test
durchzuführen, wird Sonde dem Target in Lösung zugesetzt und hybridisieren
gelassen. Ein Spaltungsreagenz wird dann zugegeben. Der Fluoreszenz-Spiegel,
der nach der Spaltungsbehandlung verbleibt, ist ein direktes Maß für den
Hybridisierungsgrad, der aufgetreten ist, und somit für die Menge an Target.
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Homogene Tests wie die gerade beschriebenen, die vom Gesichtspunkt des
Verwenders her extrem einfach sind, werden wahrscheinlich immer häufiger.
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WO-A-9317128 offenbart ein Verfahren für den Nachweis von Chromosomen-
Struktur und Umlagerungen. In diesem Verfahren werden markierte DNA-Sonden
unter hybridisierenden Bedingungen mit den Chromosomen in Kontakt gebracht und
die Marker werden dann durch Antikörper an unterschiedliche Enzyme gebunden,
die in Kombination ein Signal liefern, das durch optische Mittel nachgewiesen
werden kann. Die Target-Sequenz ist immobilisiert. Die Enzym-Reaktionen werden
nur ablaufen gelassen, nachdem man überschüssige Sonde entfernt hat.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt einen homogenen Doppelsonden-Assay wie
in Anspruch 1 definiert bereit, in welchem die Sequenzen, die von den beiden
Sonden erkannt werden, in der linearen Sequenz des Targets eng benachbart
zueinander liegen, und in welchem jede Sonde durch irgendeines einer Vielfalt von
Mitteln mit einem unterschiedlichen Enzym markiert ist. Die Markierung ist derart,
daß beim Auftreten von Hybridisierung mit der Target-Nukleinsäure-Sequenz die
beiden Enzym-Marker in enge Nachbarschaft gebracht werden. Die Enzyme bilden
ein kanalbildendes Paar; d.h., ein Produkt der ersten Enzym-Reaktion (für welche
eine vollständige Substrat-Mischung am Anfang bereitgestellt wird) ist eine
notwendige Komponente der Substrat-Mischung für die zweite Enzym-Reaktion.
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Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene wichtige Merkmale bereit. Die
Manipulationen, die der Betreiber durchführen muß, sind minimal. Die Sonde(n), die
zu testende Probe und alle Komponenten, die für die Erzeugung des geeigneten
Signals erforderlich sind, können in einer einzigen flüssigen Mischung vereinigt
werden. Wenn die Testprobe die Target-DNA-Sequenz enthält, wird ein Signal
erzeugt. Enthält sie diese nicht, wird kein Signal erzeugt. Das Signal kann
proportional zur Menge des Targets, die in der Probe anwesend ist, sein und das
Signal kann quantifiziert werden. Der Test zeigt nicht nur, ob Target in der Probe
anwesend ist, sondern auch, wenn es vorhanden ist, wieviel vorhanden ist. Tests,
die sich Doppelsonden bedienen, weisen den weiteren Vorteil auf, daß das
Erfordernis von zwei Hybridisierungs-Ereignissen die Spezifität verbessert.
Beschreibung der Erfindung
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Der Assay wird auffolgende Art und Weise durchgeführt: eine flüssige
Mischung, die die beiden Sonden, eine vollständige Substrat-Mischung für das erste
Enzym und eine unvollständige Substrat-Mischung für das zweite Enzym (der nur die
Komponente fehlt, die ein Produkt der ersten Enzym-Reaktion ist,) enthält, wird unter
solchen Bedingungen einer flüssigen Mischung, die das Target enthält, zugesetzt,
daß eine spezifische Hybridisierung der beiden Sonden mit ihren benachbarten
Targets begünstigt wird. In Abwesenheit der Target-Sequenz bleiben alle
verfügbaren Sonden-Moleküle und folglich auch die beiden Enzym-Marker im
gesamten Volumen der flüssigen Mischung dispergiert. Obwohl die erste Enzym-
Reaktion noch immer voranschreitet, bleiben die effektiven Konzentrationen der
Produkte dieser Reaktion relativ zur Konzentration des zweiten Enzyms gering und
Produkt (Signal), das vom zweiten Enzym gebildet wird, bleibt vernachläßigbar Falls
die Target-Sequenz anwesend ist, findet eine Hybridisierung statt und einige der
verfügbaren Sonden-Moleküle und somit die beiden Enzym-Marker werden in enge
Nachbarschaft gebracht. Eine hohe lokale Konzentration der Produkte der ersten
Enzym-Reaktion wird nun in der Mikroumgebung der beiden colokalisierten Sonden
gebildet. Dies erlaubt eine Bildung des Produkts in der zweiten Enzym-Reaktion, bei
dem es sich um das primäre Signal handelt. Jegliche überschüssige Sonden, die in
Anwesenheit des Targets unhybridisiert zurückbleiben, verhalten sich so, wie sie
dies in Abwesenheit von Target tun würden. Somit besteht keine Notwendigkeit,
irgendwelche zusätzliche Manipulationen oder Trennschritte durchzuführen, um nicht
hybridisierte Sonden zu entfernen, da ihr Beitrag zum erzeugten Signal
vernachläßigbar ist.
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Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist der Einschluß eines konkurrierenden
lnhibitors der zweiten Enzym-Reaktion in die Mischung von Substraten. Dies liefert
eine weitere Verstärkung der Zunahme in der Reaktionsgeschwindigkeit des zweiten
Enzym-Systems, wenn Target anwesend ist. Wenn sich die beiden Sonden nicht
durch Hybridisierung mit dem Target an derselben Stelle befinden, findet die erste
Enzym-Reaktion noch immer statt und das Produkt dieser Reaktion, welches für das
Stattfinden der zweiten Enzym-Reaktion erforderlich ist, wird erzeugt. Die
Konzentration dieses Produkts, die für das zweite Enzym verfügbar ist, ist jedoch
niedrig. Die Anwesenheit einer Substanz, die mit diesem Produkt hinsichtlich der
aktiven Stelle des zweiten Enzyms konkurriert, vermindert die Geschwindigkeit der
Bildung des bzw. der Produkte der zweiten Enzym-Reaktion weiter. Wenn die beiden
Sonden durch Hybridisierung am Target colokalisiert sind, ist die Konzentration des
Produkts der ersten Reaktion, die für das zweite Enzym zugänglich ist, in der
Mikroumgebung der colokalisierten Sonden effektiv viel höher, während die Konzentration
des Inhibitors die gleiche bleibt wie in dem Fall, in dem die Sonden nicht colokalisiert
sind. Somit wird der Unterschied zwischen den Geschwindigkeiten der zweiten
Reaktion, die den Grad der Erzeugung des zu messenden Signals bestimmt, in den
beiden Fällen (Sonden nicht colokalisiert oder Sonden colokalisiert), und der in der
Grund-Ausführungsform der Erfindung inhärent ist, durch die Anwesenheit eines
konkurrierenden Inhibitors in der zweiten Enzym-Reaktion weiter erhöht.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein alternatives
Verfahren zum Binden der Enzyme an die Sonden eingesetzt. In dieser
Ausführungsform weist jede Sonde zusätzlich zu derjenigen, die im wesentlichen
komplementär zum Target ist, eine Sequenz auf. Im Falle der ersten Sonde befindet
sich diese zusätzliche Sequenz am 3'-Ende und im Falle der zweiten Sonde befindet
sich diese zusätzliche Sequenz am 5'-Ende, so daß, wenn die Sonden an ihre
Targets hybridisiert sind, die zusätzlichen Sequenzen in enger Nachbarschaft
zueinander vorliegen. Zwei weitere kurze Oligonukleotide sind in dem Assay
vorhanden, wobei jedes komplementär zu den zusätzlichen Sequenzen ist, so daß
kurze doppelsträngige Sequenzen erzeugt werden. Diese doppelsträngigen
Sequenzen sind so ausgelegt, daß sie in der Lage sind, durch Sequenz-spezifische
DNA-bindende Proteine erkannt zu werden. Die geeigneten DNA-bindenden
Proteine werden ebenfalls in der Assay-Mischung eingeschlossen, so formuliert, daß
jedes davon einen Teil des ersten oder des zweiten Enzyms des kanalbildenden
Paares bildet. Die Verknüpfung erfolgt covalent. Dies kann entweder durch
Expression des DNA-bindenden Proteins und des Enzyms als Fusions-Protein oder
durch Verwendung spezieller chemischer Vernetzungsreagenzien bewerkstelligt
werden, wobei beides mit Mitteln erzielbar ist, die in der Technik wohlbekannt sind.
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Beispiele für kanalbildende Enzym-Paare werden am bequemsten in mehrere
Kategorien gemäß dem zweiten Enzym des Paares gruppiert.
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Eine Gruppe umfaßt Enzym-Paare, in denen das zweite Enzym des Paares
Leuchtkäfer-Luciferase ist. Erste Enzyme in dieser Gruppe umfassen alkalische
Phosphatase, β-Galactosidase, Carboxypeptidasen A und B, carboxylische Esterase
und Arylsulphatase.
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Eine weitere Gruppe umfaßt Enzym-Paare, in denen das zweite Enzym des
Paares Meerrettich-Peroxidase ist. Erste Enzyme in dieser Gruppe umfassen
Glucoseoxidase, Xanthinoxidase und D-Aminosäureoxidase.
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Es wird besonders bevorzugt, daß das zweite Enzym Meerrettich-Peroxidase
ist und das erste Enzym Glucoseoxidase oder Xanthinoxidase oder D-
Aminosäureoxidase ist; oder das zweite Enzym Leuchtkäfer-Luciferase ist und das
erste Enzym alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase ist.
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DNA-bindende Proteine, die sich zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung eignen, schließen lac-Operator-bindendes Protein, Anaboena bifA-Gen-
Produkt, MAT-α-2-Genprodukt oder Staphylococcus aureus repN-Genprodukt ein.
Hinsichtlich spezieller Kombinationen der DNA-bindenden Proteine mit den beiden
Enzymen eines kanalbildendes Paares bestehen keine Beschränkungen, außer das
das DNA-bindende Protein, das Teil des ersten Enzyms des kanalbildenden Paares
ist, sich von dem DNA-bindenden Protein unterscheiden muß, das Teil des zweiten
Enzyms des kanalbildenden Paares ist.
BEISPIEL
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Eine detaillierte Beschreibung einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird nun beispielhaft angegeben. In dieser Beschreibung bezieht sich
"Konjugat" auf eine makromolekulare Vereinigung, die covalent an Oligonukleotid-
Sonde geknüpften Enzym-Marker umfaßt, "erste Sonde" bezieht sich auf diejenige
Sonde des Paares, die Enzym-Marker an ihrem 3'-Ende trägt, "zweite Sonde"
bezieht sich auf diejenige Sonde des Paares, die Enzym-Marker an ihrem 5'-Ende
trägt, "erstes Enzym" bezieht sich auf das Enzym, für das eine vollständige Substrat-
Mischung bereitgestellt wird, und "zweites Enzym" bezieht sich auf dasjenige Enzym,
für welches die Substrat-Mischung am Anfang unvollständig ist, wobei die fehlende
Komponente durch die Reaktion des ersten Enzyms mit seinem vollständigen
Substrat bereitgestellt wird. Man beachte, daß das erste Enzym an die erste oder
zweite Sonde geknüpft sein kann; wenn das erste Enzym an die erste Sonde
geknüpft ist, dann muß das zweite Enzym an die zweite Sonde geknüpft sein; wenn
das erste Enzym an die zweite Sonde geknüpft ist, dann muß das erste Enzym an
die erste Sonde geknüpft sein.
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In der zu beschreibenden Ausführungsform handelt es sich bei dem
kanalbildenden Enzym-Paar um alkalische Phosphatase (erstes Enzym) und
Leuchtkäfer-Luciferase (zweites Enzym). Das erste Enzym ist an die erste Sonde geknüpft
und die zweite Enzym ist an die zweite Sonde geknüpft. Das Substrat für das erste
Enzym ist Luciferin-O-phosphat, bei dem es sich um kein Substrat für die Herstellung
von durch Luciferase vermittelter Biolumineszenz handelt, das aber durch alkalische
Phosphatase in Luciferin umgewandelt wird, bei dem es sich um ein derartiges
Substrat handelt.
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Konjugate des ersten Enzyms und der ersten Sonde und des zweiten Enzyms
und der zweiten Sonde wurden hergestellt. Vorgehensweisen für die Konjugation
von Enzymen mit Oligonukleotid-Sonden sind in der Technik wohlbekannt. Die erste
Sonde wurde mit einer zusätzlichen modifizierten Base am 3'-Ende des
Oligonukleotids synthetisiert, wobei diese Base ein primäres Amin am Ende einer
Alkylkette trug; d.h., die Sonde trug an ihrem 3'-Ende eine ω-Aminoalkylgruppe.
Ähnlich wurde die zweite Sonde mit einer zusätzlichen modifizierten Base am 5'-
Ende des Oligonukleotids synthetisiert, wobei diese Base wiederum ein primäres
Amin am Ende einer Alkylkette trug; d.h., die Sonde trug an ihrem 5'-Ende eine ω-
Aminoalkylgruppe. Verfahren für die chemische Synthese derartiger modifizierter
Sonden sind dem Fachmann wohlbekannt.
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Ein Konjugat, das die erste Sonde, die durch das modifizierte 3'-Ende an
alkalische Phosphatase geknüpft war, umfaßt, wurde hergestellt und unter
Verwendung eines Reagenzsatzes (E-Link Kit, Cambridge Research Biochemicals)
gereinigt. Andere derartige Sätze sind zugänglich und geeignet.
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Ein Konjugat, das die zweite Sonde, die über das modifizierte 5'-Ende an
Leuchtkäfer-Luciferase geknüpft war, umfaßte, wurde hergestellt und gereinigt, so
daß: 70 ug Oligonukleotid in 25 ul 0,1M Natriumborat, pH 9,3, gelöst waren. Dazu
wurden 10 mg Phenylendiisothiocyanat, gelöst in 0,5 ml N,N'-Dimethylformamid,
gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln unter
fortgesetztem Mischen inkubiert; 3 ml Butan-1-ol und 3 ml Wasser wurden dann
zugesetzt und gnindlich gemischt. Die Mischung wurde 3 Minuten bei 1500 UpM
zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde verworfen. Ein gleiches Volumen
Butan-1-ol wurde zugesetzt und gründlich gemischt. Die Mischung wurde wiederum
zentrifugiert und die obere wäßrige Phase wurde entfernt und verworfen.
Extraktionen mit einem gleichen Volumen Butan-1-ol wurden fortgesetzt, bis das
Volumen der unteren Phase auf weniger als 50 ul vermindert war. Das aktivierte
Oligonukleotid wurde dann unter Vakuum vollständig getrocknet. 1 mg Luciferase
und 50 ul 0,1M Natriumborat-Puffer, pH 9,3, wurde zugesetzt und die Mischung
wurde 5 Stunden bei 4ºC inkubiert. Das Konjugat wurde dann durch
Anionenaustauscher-HPLC gereinigt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine mit
0,1M Tris, pH 8,4 äquilibrierte TSK DEAE-5PW-Säule gegeben und mit einem NaCl-
Grad ienten im selben Puffer eluiert. Fraktionen, die Luciferase-Oligonukleotid-
Konjugat enthielten, wurden durch Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind,
identifiziert und zusammengegeben.
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Die Target-Sequenz liegt vorzugsweise in einzelsträngiger Form vor.
Verfahren für die Erzeugung von einzeisträngiger DNA sind dem Fachmann
wohlbekannt. Lediglich beispielhaft kann einzelsträngige DNA durch Exonuklease III-
Verdauung, durch asymmetrische PCR oder durch PCR mit einem markierten
Primer, gefolgt vom Abfangen auf einer geeigneten Festphase, welches durch den
Marker vermittelt wird, erzeugt werden. Der nicht markierte Strang kann dann durch
Denaturierung freigesetzt werden.
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Der Assay wird wie folgt durchgeführt: der Assay-Puffer enthält 0,1 mM
Luciferin-O-phosphatase, 2,6 mM ATP, 6 mM MgCl&sub2;, 3,4 mM DU, 0,54 mM EDTA in
0,1 M Tris, pH 8,0. Zu 100 ul davon wird Target (1-2 ug) gegeben, gefolgt von
Sonden im Verhältnis 1:2 (alkalische Phosphatase-markierte Sonde:
Luciferasemarkierte Sonde). Lichtabgabe wird 10 Minuten lang in 1 Minuten-Abständen unter
Verwendung eines beliebigen geeigneten Luminometers gemessen.