DE69511876T2

DE69511876T2 - Fangtestverfahren

Info

Publication number: DE69511876T2
Application number: DE69511876T
Authority: DE
Inventors: David Squirrell
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1995-07-12
Publication date: 2000-05-31
Anticipated expiration: 2015-07-13
Also published as: JPH10502815A; HUT76447A; CN1157638A; WO1996002666A1; ZA955846B; GR3031877T3; US5798214A; NO316227B1; EP0774011A1; IN188668B; GB2304892B; DK0774011T3; CA2194458C; NZ289464A; AU691940B2; ATE184054T1; CA2194458A1; BRPI9508392B8; HU220800B1; ES2136866T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Nachweis- und Assayverfahren für Mikroorganismen, Reagenzien zur Verwendung in einem derartigen Verfahren und Test-Kits, welche die wesentlichen Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens enthalten.
In der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 217 583 wird ein Assay für einen aus Zellen extrahierten Liganden beschrieben, bei dem der Ligand gleichzeitig aus der Zelle extrahiert und mit zwei spezifischen Anti-Liganden unter Erhalten eines nachweisbaren Produktes umgesetzt wird.
Sämtliche lebenden Organismen verwenden Adenosintriphosphat (ATP) als chemische Energiequelle, und dessen Bestimmung unter Anwendung der durch ATP angetriebenen Luciferase/Luciferin- Reaktion ist bekannt. Das durch diese enzymatische Reaktion erzeugte Licht kann unter Verwendung eines Luminometers bestimmt und mit der Menge des vorhandenen ATP's in Beziehung gesetzt werden. Die Eignung von ATP als Maß für die Mikrobenanzahl ist seit Mitte der sechziger Jahre bekannt (vgl. ATP Luminescence Rapid Methods in Microbiology (1989), Herausgeber Stanley et al., Blackwell Scientific Publications, London, vgl. Seiten 1-10). Der Hauptvorteil sind die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit. Mit Hilfe dieses Assaysystems können einfache Proben innerhalb von Minuten analysiert werden, während komplexe routinemäßig lediglich eine halbe Stunde benötigen und der Nachweis bis zu 10&supmin;¹² mol/l ATP möglich ist. Es besteht jedoch ein Bedarf für Verfahren, die hinsichtlich des Nachweises von Mikroorganismen oder ihres Zellinhalts unter Beibehaltung der Geschwindigkeit und der leichten Durchführbarkeit noch empfindlicher sind.
Der Erfinder hat festgestellt, daß die Geschwindigkeit und die Empfindlichkeit des auf ATP beruhenden Verfahrens stark gesteigert werden kann, indem der Assay statt auf die Bestimmung von ATP auf ein dieses bildendes Enzym, insbesondere Adenylatkinase, ausgerichtet wird. Adenylatkinase ist ein Enzym, das von allen Organismen zur Umwandlung von Adenosindiphosphat (ADP) in Adenosintriphosphat (ATP) verwendet wird. Die Zielausrichtung auf dieses Enzym gestattet gegenüber von ATP unter Anwendung des bevorzugten Verfahrens, der bevorzugten Reagenzien und Kits der Erfindung den Nachweis von mindestens 10&supmin;²&sup0; mol des intrazellulären Markers Adenylatkinase.
Die Bestimmung von Adenylatkinase unter Verwendung des Luciferase/Luciferin-Systems zur Bestimmung von deren Aktivität ist bekannt (vgl. Brolin et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1(1979), 163-169, und Shutenko et al., Biotekhnologiya, Nr. 4, PA (1988), 542-547) und hat Anwendung bei der Untersuchung von bestimmten Säuger- und Pflanzengeweben gefunden (z. B. vgl. Rodionova et al., Fiziologiya Rastenii (1978), 25, 4, S. 731-734). Die Anwendung eines derartigen Assaysystems zum Nachweis und zur Bestimmung von Mikroorganismen wird jedoch nicht vorgeschlagen, und die Vorteile, die mit dieser Vorgehensweise verbunden sind, d. h. die sich so ergebende erhöhte Empfindlichkeit, war für die das Enzym als solches Untersuchenden nicht von Bedeutung.
Die Adenylatkinase ist zwar in geringeren Mengen als ADP oder ATP vorhanden, jedoch läßt sich durch ihre Verwendung als biologischer Marker für Mikroorganismen eine höhere Empfindlichkeit mit einer typischen Verstärkung von 400.000 erzielen, nämlich durch Bestimmung ihres Vorliegens über das von ihr gebildete ATP. Dies bedeutet, daß für jedes vorhandene Mol Enzym 400.000 mol ADP innerhalb eines Inkubationszeitraums von 10 Minuten in ATP umgewandelt werden. Somit ist über die Bestim mung des Enzyms durch Bestimmung des Substrats oder des Produktes der Reaktion, die es katalysiert, der Nachweis von bis zu 10&supmin;²&sup0; mol möglich.
Die gleichzeitig anhängigen PCT-Anmeldungen WO 94/17202 und WO 96/02665 (die nach dem maßgeblichen Zeitrang dieser Anmeldung veröffentlicht worden sind) betreffen Verfahren zur Bestimmung von Mikroorganismen in einer Probe aufgrund von deren Fähigkeit zur Umwandlung von ADP in ATP und setzen diese mit dem Vorliegen von Mikroorganismen oder derem intrazellulären Material in Beziehung. In diesen Anmeldungen sind beispielhaft Verfahren angegeben, in denen die Magnesiumionen, die für die Umsetzung von 2 Molekülen ADP an jeder aktiven Stelle der Adenylatkinase erforderlich sind, entweder als Reagenz zugesetzt oder von etwaig vorhandenen Bakterienzellen oder Verunreinigungen in den anderen Reagenzien bereitgestellt werden. Es wurde festgestellt, daß die unter Anwendung einer derartigen Technik in den Beispielen nachgewiesene Anzahl an Zellen oberhalb 102 liegt, wobei die erhaltenen Ergebnisse von 103 oder mehr statistisch zuverlässiger sind. Es ergibt sich eine lineare Beziehung zwischen der luminometrischen Messung und der Zellanzahl.
Die Erfindung betrifft eine verbesserte Technik, bei der die Aktivität der Adenylatkinase als Markierung für Mikroorganismen in einem Einfangassay dient, wobei nach dem Einfang der Mikroorganismen und der Entfernung der anderen Reagenzien die Anzahl der so eingefangenen Mikroorganismen bestimmt wird, indem ihr intrazellulärer Inhalt mit ADP in Kontakt gebracht und dann die gebildete Menge ATP bestimmt wird, und zwar insbesondere durch Bestimmung des durch die Luciferin/Luciferase-Reaktion erzeugten Lichtes, weil dadurch eine rasche Bestimmung möglich ist. Es ist klar, daß auch kolorimetrische Verfahren zur Bestimmung der in einer Probe enthaltenen Menge an ATP an gewendet werden können, falls dies erwünscht ist, z. B. unter Anwendung von Reaktionen, die auf Pyruvatkinase beruhen, weil derartige mit dem Adenylatkinase-Assay verbundene kolorimetrischen Assays eine ausgezeichnete Empfindlichkeit ergeben.
Die Mikroorganismen können mit einem beliebigen herkömmlichen Einfangassay eingefangen werden, z. B. unter Verwendung von dafür spezifischen Antikörpern, die auf einer festen Oberfläche, z. B. den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte oder Latexperlen, immobilisiert worden sind. Dem Fachmann sind viele alternative Oberflächen bekannt, die sich für Immunoassays eignen. Besonders bevorzugt in dem vorliegenden Verfahren ist die Immobilisierung der Antikörper auf magnetischen Perlen, so daß sämtliche an die Antikörper gebundenen Mikroorganismen durch ein Magnetfeld eingefangen werden können und die Aktivität ihrer Adenylatkinase bestimmt werden kann, worauf sie freigesetzt werden, so daß eine weitere Probe Testmaterial analysiert werden kann. Mit einem derartigen bevorzugten Verfahren ist die kontinuierliche Untersuchung einer Probe, die beispielsweise aus einer kontinuierlichen Quelle, wie einem Cyclon-Sammler zur Überwachung des Bakteriengehaltes von Luft, stammt, möglich.
Bei Anwendung des Adenylatkinase-Assaysystems, und zwar insbesondere unter Verwendung von Adenylatkinase- und ATP-freien Reagenzien, liegt die in einer Probe enthaltene Anzahl an Mikroorganismen, die online und kontinuierlich bestimmt werden kann, in der Größenordnung von einigen zehn bei einem Probenvolumen von 200 ul, wobei die Messung mit quantitativer Beziehung zwischen den Zellen und dem von ATP stammenden Licht bis hinunter zu 10 Zellen und sogar noch weniger als 10 möglich ist, wenn das Reaktionsvolumen verringert wird.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens und/oder der Menge von Mikroorganismen und/oder von deren intrazellulären Material, die/das in einer Probe enthalten sind/ist, bereitgestellt, bei dem
(a) die Probe der Einwirkung eines Einfangreagenzes, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, ausgesetzt wird, wobei das Einfangreagenz an die Mikroorganismen oder deren intrazelluläres Material so binden kann, daß diese/dieses mit dem festen Träger verbunden wird,
(b) der feste Träger der Einwirkung eines Reagenzes ausgesetzt wird, mit dem die mit den Mikroorganismen und/oder deren intrazellulären Material verbundene Adenylatkinase für auf den Träger angewendete Lösungen zugänglich wird,
(c) eine Adenosindiphosphat (ADP) enthaltende Lösung unter solchen Bedingungen auf den Träger angewendet wird, daß Adenosintriphosphat (ATP) durch etwaig vorhandene Adenlyatkinase gebildet werden kann,
(d) die gebildete Menge an Adenosintriphosphat (ATP) bestimmt und dann mit dem Vorliegen und/oder der Menge an Mikroorganismen oder deren intrazellulären Inhalten in Beziehung gesetzt wird.
Der Schritt (d) kann unter Anwendung von beliebigen bequemen Assays, die zur Bestimmung von ATP zur Verfügung stehen, durchgeführt werden. Zweckmäßigerweise können diese eine farbbildende Reaktion umfassen, jedoch werden am bevorzugtesten die weitverbreitet verfügbaren Luciferin/Luciferase-Lumineszenzreagenzien zum Nachweis der Umwandlung von ADP in ATP verwendet, was dem Fachmann bekannt ist. Die Beziehung zwischen der Menge an ATP und der Menge an Mikroorganismen und/oder deren intrazellulären Inhalt ergibt sich ohne weiteres durch die Anwendung von Eichkurven, die hergestellt werden, indem das Assay-Verfahren unter Verwendung bekannter Mengen an Ziel- Mikroorganismen oder intrazellulärem Material durchgeführt und die unbekannte Menge durch Vergleich damit bestimmt wird. Bei dem bevorzugten Verfahren wird eine Eichkurve für das von einer Anzahl Mikroorganismen emittierte Licht erstellt und die gemessene Lichtabgabe pro Zeiteinheit einer unbekannten Menge an Material in einer Probe damit verglichen.
Zur Maximierung der gebildeten Menge an ATP und somit zur Verstärkung der mit dem festen Träger verbundenen Menge an Adenylatkinase wird in dem Assay die Umwandlung von ADP in ATP vorzugsweise in Gegenwart von Magnesiumionen durchgeführt, und zwar in der zur maximalen Umwandlung von ADP in ATP erforderlichen molaren Konzentration. Die vorhandenen Menge an Magnesium ist vorzugsweise derart, daß sich etwa 1 mol Magnesium auf 1 mol ADP ergibt, so daß sämtliche ADP-Moleküle sich zumindest mit einem Magnesiumion verbinden können. Es sei angemerkt, daß die folgende Reaktion abläuft: ADP + Mg²&spplus; · ADP Mg²&spplus; · ATP + AMP, so daß daher ein Verhältnis von 1 : 1 zwar nicht wirklich erforderlich ist, aber einen geeigneten Richtwert liefert.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung wird die Probe in Form einer wäßrigen Suspension oder Lösung bereitgestellt, sämtliche Ziel-Mikroorganismen oder -Materialien in der Probe eingefangen und die Bestimmung der damit verbundenen Adenylatkinase durchgeführt, indem ADP und Magnesiumionen unter solchen Bedingungen zu der Probe gegeben werden, daß etwaig vorhandene Adenylatkinase ADP in ATP umwandelt, die Probe einen vorbestimmten Zeitraum inkubiert wird, so daß die Umwandlung abläuft, die Luciferase/Luciferin-Rea genzien zugegeben werden, die von der Probe emittierte Lichtmenge bestimmt und mit dem Vorliegen und der Menge an Adenylatkinase in Beziehung gesetzt wird.
Der Einfangschritt wird vorzugsweise unter Verwendung von immobilisierten Antikörpern durchgeführt, die spezifisch für eine Gattung, Art oder Klasse von Mikroorganismen sind, aber für bestimmte Materialien in den Zellwänden von vielen unterschiedlichen Typen von Mikroorganismen spezifisch bindende Reagenzien sind, beispielsweise Reagenzien wie Lectin. Am einfachsten handelt es sich bei dem Einfangreagenz um einen Antikörper, der unter Anwendung von herkömmlichen Bindungstechniken an den festen Träger gebunden wird, beispielsweise durch kovalente Kupplung oder durch die Wechselwirkung von Streptavidin/Biotin. Beispielsweise wird durch die Biotinylierung des spezifischen Antikörpers dieser an mit Streptavidin beschichtete Oberflächen bindbar.
In einem bevorzugten Verfahren wird ein magnetischer fester Träger verwendet, und zwar insbesondere magnetische Perlen, z. B. die von Dynal UK Ltd., Station House, 26 Grove Street, New Ferry, Wirral., Merseyside, erhältlichen. Dem Fachmann sind Verfahren zum Binden von spezifischen Antikörpern an diese Perlen bekannt, die auch in den Angaben des Herstellers beschrieben werden.
Durch die Verwendung derartiger Perlen können die Ziel-Mikroorganismen in einer Lösung, z. B. einer, die durch eine Leitung tritt, beispielsweise in einer kontinuierlichen Probenahmevorrichtung, an die an den Perlen immobilisierten Antikörper gebunden und in einer Behandlungsstufe durch Anlegen eines magnetischen Feldes gesammelt und so behandelt werden, daß die Adenylatkinase zugänglich wird, während die Reagenzien für den ADP- und ATP-Bindungsassay zugeführt werden. Vorzugsweise wer den ADP, Magnesium und Luciferase/Luciferin-Reagenzien zugegeben während die Perlen immobilisiert sind und das emittierte Licht unter Verwendung eines Lichtdetektors, z. B. eines Luminometers, nach dieser Stufe bestimmt. Die Luciferase/Luciferin-Reagenzien können gleichzeitig mit dem ADP und dem Magnesium zugegeben werden oder im Anschluß daran.
Das Verfahren der Erfindung kann in einem einzigen Assay-Gefäß durchgeführt werden, indem die magnetischen Perlen mit dem darauf immobilisierten Antikörper in das Gefäß gegeben werden, die zu untersuchende Probe in Form einer Lösung oder Suspension zugegeben und gerührt wird, die Perlen mit sämtlichen eingefangenen Mikroorganismen und/oder Material unter Anwendung eines Magnetfeldes immobilisiert werden, die restliche Lösung oder Suspension entfernt wird, ADP-Substrat und Extraktionsmittellösung oder -lösungen, mit denen die Adenylatkinase für die ADP-Lösung zugänglich gemacht wird, zugegeben werden, das Magnetfeld entfernt wird, die Perlen in der Substratlösung gerührt und die Perlen durch Wiederanlegen des Magnetfeldes immobilisiert werden, die das ADP, das Extraktionsmittel und sämtliches gebildetes ATP enthaltende Lösung entnommen und das ATP bestimmt wird. Der ATP-Assay kann in Form eines kolorimetrischen Assays oder, was bevorzugt ist, luminometrisch durchgeführt werden.
Bei einem weiteren bevorzugten Verfahren wird eine Einfangsäule, die ein Bindungsreagenz, z. B. einen Antikörper, auf einem festen Träger, z. B. Perlen, immobilisiert aufweist, verwendet und die Probe und verschiedene Reagenzien nacheinander durch die Säule geführt, so daß synthetisiertes ATP, das bestimmt und mit dem Vorliegen des Antikörper-Zielmaterials in Beziehung gesetzt wird, abgegeben wird.
In sämtlichen Fällen reicht die mit der Probe vermischte Menge an ADP vorzugsweise aus, daß sich in dem Gemisch eine ADP- Konzentration von mehr als 0,005 mM ergibt, und zwar insbesondere mehr als 0,01 mM und am bevorzugtesten mehr als 0,08 mM. Eine besonders bevorzugte Menge an ADP in dem Gemisch des Umwandlungsschrittes beträgt etwa 0,1 mM. Diese kann von der Reinheit des ADP's abhängig sein, wobei Verunreinigungen mit hohen Mengen an ATP die Verwendung von höheren Konzentrationen verhindern. Der praktisch geeignete Bereich für ADP beträgt etwa 10 mM bis etwa 0,1 uM. Für die oben angegebenen bevorzugten Konzentrationen an ADP beträgt die bevorzugte Konzentration an Magnesiumionen in der Suspension oder Lösung während der Umwandlung von ADP in ATP 1 mM oder mehr, noch bevorzugter 5 mM oder mehr und am bevorzugtesten 10 mM oder mehr. Die Magnesiumionen können in Form eines beliebigen Magnesiumsalzes vorgesehen werden, vorzugsweise aber in Form von Magnesiumacetat. Der praktisch geeignete Bereich beträgt für das Mg²&spplus; etwa 0,1 mM bis etwa 25 mM. Die Menge, in der das Mg²&spplus; vorhanden ist, kann unter anderen von der ADP-Konzentration und der vorhandenen Menge an Chelatbildner (z. B. EDTA) abhängig sein.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Luciferin/Luciferase-Luminometrie-Reagenzien zu Beginn der Inkubation zu der Probe gegeben, und zwar vorzugsweise in Form eines einzelnen Reagenzes mit dem ADP und der Quelle für Magnesiumionen. Für diese Ausführungsform muß das Luciferase-Reagenz eine hohe Reinheit haben, und zwar muß die Adenylatkinase während seiner Herstellung entfernt werden. In den Ausführungsformen der Erfindung, bei denen sämtliche Reagenzien zu Beginn der Umwandlung von ADP in ATP auf diese Weise zugegeben werden und/oder die Messung mit dem Luminometer nach der Zugabe von Luciferin/Luciferase fortgesetzt wird, sofern dies ein einzelner Schritt ist, kann das Magnesium durch das Luciferin/Luciferase-Reagenz bereitgestellt werden. Auf grund der Bindung von Magnesiumionen durch Luciferase und/oder EDTA ist es erforderlich, daß die Menge an Magnesiumionen durch vorherige Versuche oder Berechnungen in positiver Hinsicht sichergestellt ist. Dem Fachmann ist klar, daß die zu einem vorgegebenen Gemisch aus ADP, Probe und Luciferin/Luciferase zu gebende optimale Menge an Magnesiumsalz ohne weiteres durch Routineversuche unter Verwendung einer eine bekannte Menge an Bakterien, z. B. E. coli, enthaltenden Probe, wodurch sich maximale Signale ergeben, bestimmt werden kann.
Da die Magnesiumionen ADP instabil machen können (weil Verunreinigungen an Adenylatkinase es vorzeitig in ATP umwandeln können), befinden sie sich vor der Verwendung vorzugsweise nicht damit zusammen in Lösung, sondern werden unmittelbar vor dem Gebrauch oder in dem Schritt zur ADP-Umwandlung damit zusammengebracht. Da Magnesiumionen für die Aktivität der Adenylatkinase erforderlich sind, können diese vorzugsweise mit der Probe vermischt werden, bevor das ADP zugegeben wird. Wenn die Reagenzien zusammen aufbewahrt werden sollen, geschieht dies vorzugsweise in gefriergetrockneter Form, damit etwaige destabilisierenden Wirkungen vermieden werden.
Wie bereits oben angegeben, wird Adenosintriphosphat (ATP) vorzugsweise durch Anwendung des Luciferin/Luciferase-Systems zur Erzeugung eines photometrisch nachweisbaren Signals, das die Menge an ATP der Probe anzeigt, nachgewiesen. Die Luciferin/Luciferase-Präparate und Verfahren zu ihrem Gebrauch zur Bestimmung von ATP sind dem Fachmann gut bekannt und außerdem im Handel erhältlich (z. B. Brolin et al.). Eine typische Formulierung enthält z. B. 0,1 bis 10 mg/Liter Luciferase, 15 bis 1000 umol/Liter, vorzugsweise 15 bis 100 umol/Liter (z. B. ~ 36 umol/Liter) D-Luciferin und Reagenzien wie MgCl&sub2; (2,5-25 mmol), EDTA, BSA und Puffer, pH 7 (vgl. z. B. EP 054 676), noch typischer pH 7,8.
Wenn in den hier beschriebenen Adenylatkinase-Testverfahren die Reagenzien nur einmal verwendet werden, wird vorzugsweise der pH-Wert so eingestellt, wie er für beide Enzyme optimal ist, d. h. es wird ein Kompromiß getroffen, damit die Messung während der Umwandlung von ADP in ATP fortgesetzt werden kann. Dies kann durch Routineversuche unter Verwendung von bekannten Anzahlen an Bakterien in einer Probe geschehen. Die Probe, das ADP und die Quelle für Magnesiumionen können in jeden Puffer gemischt werden, der einen für die Adenylatkinase-Reaktion geeigneten pH-Wert ergibt, und es sind keine anderen Reagenzien erforderlich. So kann jeder Puffer verwendet werden, der einen pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 ergibt, wobei der optimale pH- Wert zwischen pH 6 und pH 7, vorzugsweise bei pH 6,5, liegt. Beispiele für geeignete Puffer sind Tris- und Phosphatpuffer. Am geeignetesten wird die Probe gesammelt und/oder in einem derartigen Puffer verdünnt, um sie zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung vorzubereiten.
Wie bei jedem auf Verstärkung beruhendem Assay wird die Empfindlichkeit des Adenylatkinase-Assays der Erfindung durch die Reinheit der Reagenzien beschränkt. In diesem Fall handelt es sich bei den signifikanten Verunreinigungen um ATP in dem ADP- Substrat und um Adenylatkinase in dem Luciferase-Präparat. Zur Verwendung als empfindlicher Assay für Mikroorganismen, insbesondere dann, wenn diese möglicherweise schädlich sind und in geringer Zahl nachgewiesen werden müssen, muß die Reinheit jedes der Reagenzien hinsichtlich der Substanz, mit der es in dem Assay umgesetzt werden soll, so hoch wie möglich sein.
Unter Verwendung einer bevorzugten Econopaq-Q-Patrone mit einem starken Anionen-Austauschergel (BioRad), die mit 20 mM Kaliumphosphat bei pH 4,6 equilibriert und in Stufen mit einer KPi(Kaliumphosphat)-Konzentration bis zu 400 mM eluiert wurde, wurde festgestellt, daß ADP in Form eines kohärenten Peaks eluiert und ATP danach eluiert. Auf diese Weise war ADP mit einem maximalen Gehalt von 2 · 10&supmin;&sup8; Mol-% erhältlich. Das den Anmeldern aus der Literatur bekannte reinste ADP enthielt 0,001% (vgl. Shutenko et al., wie oben), so daß die Erfindung ADP zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung bereitstellt, das weniger als 0,001 Mol-% ATP, noch bevorzugter 2 · 10&supmin;&sup8; Mol-% oder weniger, enthält.
Das zweite Problem ist, daß es sich bei Adenylatkinase um ein unerläßliches "Grundfunktions"-Enzym handelt, das in nahezu sämtlichen Organismen vorhanden ist und sich im allgemeinen auch in Luciferase-Präparaten befindet. Die Verunreinigung kann lediglich gering sein. Da das Ziel jedoch die Bestimmung sehr geringer Mengen an Adenylatkinase in Proben ist, kann das Vorliegen in der Luciferase aber ein beschränkender Faktor sein.
Die Molekulargewichte von Luciferase und Adenylatkinase unterscheiden sich signifikant und betragen 61 kD bzw. 21 kD. Ferner ist Luciferase ein mit der Membran assoziiertes Protein und daher verhältnismäßig hydrophob, wohingegen Adenylatkinase ein lösliches Enzym ist. Es ist daher möglich, die Adenylatkinase aus Luciferase-Präparaten beispielsweise durch Größenausschlußchromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder beides zu entfernen. Alternativ oder außerdem kann das Problem einer Verunreinigung von Luciferase mit Adenylatkinase vermieden werden, indem die Biolumineszenz-Reagenzien (Luciferase und Luciferin) unmittelbar vor den Bestimmungen oder zum Zeitpunkt der Bestimmungen zugegeben werden, so daß für etwaig als Verunreinigung vorhandene Adenylatkinase nicht genügend Zeit zur Verfügung steht, einen signifikanten Effekt zu verursachen.
Geeignete Verfahren zur Reinigung von Luciferase sind die Fraktionierung durch Säulenchromatographie mit einem Gel geringer Porosität, z. B. Sephadex G-25 (vgl. Nielsen und Rasmussen, Acta Chemica Scandinavica 22 (1968), S. 1757-1762), die Verwendung von Sephadex- und Sepharose-Säulen (z. B. Blue Sepharose) in Reihe und die SDS-Elektrophorese (vgl. Devine et al., Biochimica et Biophysica Acta 1172 (1993), 121-132) oder die Alterung bei erhöhter Umgebungstemperatur über einen Zeitraum.
Eine Quelle für von Adenylatkinase freies BSA, eines Bestandteils von kommerziellen Luciferase/Luciferin-Präparaten, ist das von Sigma und BDH erhältliche chemisch behandelte acetylierte BSA. Dem Fachmann ist klar, daß auch anderes chemisch behandeltes BSA geeignet ist.
Damit sämtliche mit einem Ziel-Mikroorganismus verbundene Adenylatkinase für das ADP, die Magnesiumionen und die Reagenzien des Luciferase/Luciferin-Assays der Erfindung verfügbar ist, ist es erforderlich, diese so zu zerstören, daß das intrazelluläre Material freigesetzt oder auf andere Weise mit den Reagenzien in Kontakt kommt. Diese Zerstörung kann mit mechanischen Mitteln wie einem Ultraschall-Generator, durch Anwendung eines osmötischen Schocks, gegebenenfalls in Verbindung mit einem Kälteschock, oder Reagenzien, wie Lysozym, oder noch geeigneter durch Anwendung von Detergenzien erfolgen. Derartige Detergenzien sind im Handel erhältlich und werden üblicherweise als "Extraktionsmittel" bezeichnet. Typische Extraktionsmittel umfassen allgemeine kationische Detergenzien wie CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) und geschützte Reagenzien wie das ATP-Freisetzungsreagenz von Enzymatics, das Extraktionsmittel Biotrace XM (von Biotrace, Bridgend, UK, erhältlich), die kationischen Extraktionsmittel von Celsis UK und Lumac NRM (Nucleotid-Freisetzungsreagenz, das von Lumac BV, Holland, er hältlich ist). Wenn CTAB verwendet wird, enthält ein geeignetes Präparat 0,01 bis 1% CTAB in Wasser, z. B. 0,2%, wobei aber dem Fachmann auch andere Konzentrationen geläufig sind.
Bevor das ADP und das/die Luciferase/Luciferin-Reagenz(ien) einer vermutlich Mikroorganismen enthaltenden Assay-Probe zugesetzt werden, werden diese daher vorzugsweise zerstört, um ihren intrazellulären Inhalt für die luminometrischen Reagenzien zugänglich zu machen, und zwar unter Verwendung eines Zerstörungsmittels. Falls zwischen Zielzellen und Zellen, wie beispielsweise Pilzsporen, unterschieden werden sollen, ist es möglich, zwei getrennte Assays durchzuführen, indem in einem mit einem nichtionischen Detergenz behandelt werden, daß nur die Sporen und multizelluläre "somatische" tierische Zellen zerstören kann (z. B. Triton X-100, das von Sigma erhältlich ist), und in dem anderen mit kationischen detergierenden "Extraktionsmitteln", die oben im Detail beschrieben sind, zur Zerstörung sämtlicher Zellen behandelt wird. Diese Assays können mit der gleichen Probe durchgeführt werden, wenn eine ATPase wie Apyrase und im Anschluß daran eine Protease zwischen den Detergenz/Luciferase/Bestimmungszyklen zugegeben wird. Ein Zyklus wird unter Verwendung eines nichtionischen und eines anderen kationischen Detergenzes im ersten Zyklusschritt durchgeführt.
Es ist bekannt, daß die Wirkung des Extraktionsmittels auf das Luciferase/Luciferin-System wichtig ist (vgl. z. B. Simpson et al. (1991), J. Biolumin Chemilumin, 6(2), S. 97-106) und daß kationische Detergenzien bekanntermaßen die Reaktion verstärken, aber allmählich die Luciferase inaktivieren, wohingegen anionische Detergenzien die Reaktion hemmen und nichtionische und zwitterionische Detergenzien bekanntermaßen in einem breiten Bereich verstärken. Es wurde gefunden, daß ein Gemisch aus 0,15% eines kationischen Detergenzes mit 0,25% eines tertiären Diamins als grenzflächenaktivem Stoff (von Celsis, Cambridge, UK erhalten) hier für diese Zwecke zufriedenstellend ist, wobei aber der Fachmann ohne weiteres nach anderen "Extraktionsmitteln" suchen kann, die eine optimale Mischung hinsichtlich der Adenylatkinase- und Luciferase-Aktivität ergeben, wenn sie zusammen in der gleichen Lösung vorliegen. Typischerweise kann das Detergenz in einem Konzentrationsbereich von 0,05% bis 1% verwendet werden. Das nach der Durchführung sämtlicher wesentlicher Schritte, d. h. der Umwandlung von ADP in ATP und der sich anschließenden Einwirkung von Luciferase auf Luciferin, von dem Gemisch abgegebene Licht, kann bestimmt werden, indem das Probenvolumen, z. B. das Luminometer-Röhrchen, unmittelbar nach oder gleichzeitig mit der Zugabe der Luciferase und des Luciferins oder anderer Reagenzien, mit denen die wesentlichen Schritte durchgeführt werden, in einen Lichtdetektor gegeben wird.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Test-Kit bereitgestellt, der die für das Verfahren der Erfindung erforderlichen wesentlichen Reagenzien enthält, d. h. das immobilisiertes Einfangreagenz, Adenosindiphosphat und vorzugsweise eine Quelle für Magnesiumionen und vorzugsweise Luciferase und Luciferin. Vorzugsweise enthält der Kit sämtliche dieser Reagenzien, wobei die Luciferase und das Luciferin in Form einer einzigen Reaktionslösung vorgesehen sind, sowie ein Detergenz, das sich zum Zerstören der Zielzellen eignet, für die der Assay vorgesehen ist. Gewöhnlich wird zur Bestimmung von Mikroorganismen lediglich ein kationisches Detergenz benötigt, wohingegen in dem Fall, wenn Pilzspuren und somatische Zellen signifikant sein könnten, ein weiteres nichtionisches Detergenz zur Bestimmung ihrer Anzahl vorgesehen werden kann. Der Kit liegt in Form einer einzelnen Packung vor, der vorzugsweise Anleitungen beigefügt sind, wie das Verfahren der Erfindung durchzuführen ist, und die Reagenzien befinden sich in Behältern und haben eine Konzentration, die sich zur unmittelbaren Verwendung oder aber erst nach erfolgter Verdünnung eignet.
Ein bevorzugter Test-Kit der Erfindung enthält immobilisierte Antikörper in Form von losen Perlen, einer mit Perlen gefüllten Säule oder beschichteter Mikrotitervertiefungen, ADP-Reagenz mit einer Reinheit von höher als 99, 999% und ein Luciferase/Luciferin-Reagenz, einschließlich BSA, das im wesentlichen von Adenylatkinase-Aktivität frei ist. Alternativ ist das verwendete Luciferase/Luciferin-Verhältnis, das in den Anweisungen zur Benutzung des Kits angegeben ist und/oder sich in ihren relativen Konzentration wiederspiegelt, derart, daß die Luciferase so ausreichend rasch auf das Luciferin-Substrat einwirken kann, daß die Anfangsemission, die durch das von der in der Luciferase enthaltenen Adenylatkinase gebildete ATP hervorgerufen wird, bendet ist, so daß von Mikroorganismen stammende Adenylatkinase durch eine kinetische Blitzreaktion und ATP als Verunreinigung durch ein Glimmen angezeigt wird.
Ferner wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung bereitgestellt, die eine Reaktionskammer, in der das immobilisierte Einfangreagenz auf die Probe einwirken kann, eine Einrichtung, mit der in die Reaktionskammer nacheinander die für die Schritte (a), (b) und (c) erforderlichen Reagenzien eingeführt werden können, und eine Luminometer-Flußzelle, die mit der Reaktionskammer und außerdem mit einer Quelle für Luciferase/Luciferin verbunden und so angeordnet ist, daß nach Beendigung der Schritte (a), (b) und (c) das gebildete ATP direkt durch Korrelation mit der emittierten Lichtmenge gemessen werden kann, aufweist. Bevorzugte Reaktionskammern der Vorrichtung der Erfindung weisen auf:
(a) ein Reaktionsgefäß, das sich im Bereich eines elektrisch betreibbaren Magneten befindet, so daß in dem Gefäß in einer Reaktionsflüssigkeit suspendierte magnetische Perlen, so wie es zum Austausch der Reagenzien erforderlich ist, z. B. mit einer Pumpvorrichtung, immobilisiert werden können, oder
(b) eine Reaktorsäule, die herkömmliches Trägermaterial für das Einfangreagenz enthält, z. B. Latexperlen, das mit dem Einfangreagenz beschichtet ist.
Die Verfahren, die Vorrichtung, die Reagenzien und Kits der Erfindung werden nun beispielhaft unter Bezugnahme auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele und Figuren veranschaulicht. Weitere Ausführungsformen ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres.

FIGUREN

Fig. 1: Eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung unter Verwendung eines automatisierten Flußsystems mit Immobilisierung des Einfangreagenzes an magnetischen Perlen und unter Verwendung eines selektiv magnetisierten Magneten zu deren Einfang.
Fig. 2: Eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung unter Verwendung eines automatisierten Flußsystems mit Immobilisierung des Einfangreagenzes an einer Reaktorsäule.
Fig. 3: Graphische Darstellung von Adenylatkinase-Assays für eine niedrige Anzahl von E.-coli-Zellen.
Fig. 4: Darstellung eines spezifischen Assays für E. coli unter Verwendung von magnetischen Perlen zum Einfang und von Adenylatkinase zum Nachweis in Form eines Balkendiagrammes.

Beispiel 1: Bestimmung von E. coli unter Verwendung der Vorrichtung von Fig. 1

Eine flüssige Probe, die E. coli zur Bestimmung enthält, wird von einer Probenquelle (1) über ein Fünfwegeventil (2), einen Peristaltikschlauch (3) und eine umkehrbare Pumpe (4) in ein Reaktionsgefäß (5), in dem sie die für E. coli spezifischen Antikörper, die durch herkömmliche kovalente Kupplung an magnetische Perlen von Dynal immobilisiert worden sind, befinden, eingeführt. Die Perlen und die Probe werden während des Einfangzeitraums, z. B. 1 bis 30 Minuten, unter Verwendung eines Rührers (6) zusammen gerührt, worauf der Magnet (7) zur Immobilisierung der Perlen mit Energie versorgt und die Probenflüssigkeit über die umkehrbare Pumpe (4) und das Ventil (2) in den Abfall (8) abgegeben wird. Die Perlen werden gewaschen, indem aus der Quelle (9) Waschpuffer zugeführt wird, worauf der Magnet (7) ausgeschaltet, der Rührer (6) betrieben und der Magnet (7) mit Energie versorgt und der Puffer in den Abfall abgegeben wird.
Dann werden das ADP-Substrat (> 99,999% Reinheit in bezug auf ATP), das Magnesiumacetat und das Extraktionsmittel (0,15% kationisches Detergenz und 0,25% tertiäres Diamin, bezogen auf das Endvolumen) aus der Quelle (10) in so ausreichender Menge zugeführt, daß sich 0,1 mM ADP und 10 mM Magnesiumionen in dem Reaktionsgefäß ergeben, worauf der Magnet ausgeschaltet und der Rührer betrieben und die Extraktion/ADP-Umwandlung während eines vorbestimmten Zeitraums zwischen 1 bis 5 Minuten ablaufengelassen wird, worauf der Rührer angehalten, der Magnet mit Energie versorgt und die Flüssigkeit unter Verwendung des Peristaltikschlauches (3) und der umkehrbaren Pumpen (4) und (12) in die Luminometer-Flußzelle (11) eingeführt wird, und zwar unter gleichzeitigem Vermischen mit einem wirksamen Volumen an von Adenylatkinase freiem Luciferase/Luciferin-Reagenz aus Quelle (13). Unter Verwendung eines mit Adenylatkinase modifizierten LDR-Reagenzes von Celsis mit ansonsten Standardgehalten an Wirkstoffen beträgt dieses Volumen etwa die Hälfte des Volumens der Probe. Das aus der Flußzelle emittierte Licht wird mit Hilfe von Standardkurven, die durch Durchführen des Assays mit bekannten Anzahlen an Zellen erhalten wurden, mit der eingefangenen Menge an E. coli in Beziehung gesetzt.
Die Regeneration der Magnetperlen im Reaktionsgefäß wird durchgeführt, indem die gebrauchten Perlen in den Abfall gepumpt und aus der Quelle (14) neue zugeführt werden, oder indem ein Reagenz oder eine Lösung verwendet werden, welches die Probe von den Perlen dissoziiert, so daß die Perlen regeneriert werden. Beispielsweise können Antikörper mit -0,1 M HCl entfernt werden.

Beispiel 2: Bestimmung von E. coli unter Verwendung der Vorrichtung von Fig. 2

Der Assay wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei aber das Gefäß (5), der Magnet (6) und der Rührer (7) durch eine Reaktorsäule ersetzt sind, die in Reihe mit einer Luminometer- Flußzelle geschaltet ist und mit den Reagenzien aus den oben angegebenen Quellen versorgt wird. Es werden drei Zweiwegeventile (2) statt eines einzelnen Fünfwegeventils verwendet, und die Pumpen sind nicht umkehrbar. Die Quelle für die Probe stammt direkt aus einem Hydrocyclon, nämlich wie in WO 95/25811 beschrieben.
Es ist klar, daß in diesem Verfahren unter Verwendung einer solchen Reaktorsäule wie in Beispiel 1 eine Anordnung mit einem Fünfwegeventil verwendet werden kann und daß die in Reihe geschalteten drei Zweiwegeventile mit dem Reaktionsgefäß und dem Rührer von Beispiel 2 verwendet werden können. Gleichermaßen können die Schritte des Assays ohne weiteres durch manuellen Betrieb des Magneten und manuelle Zugabe der Reagenzien durchgeführt werden.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens und/oder der Menge an Mikroorganismen und/oder deren intrazellulären Material in einer Probe, bei dem:

(a) die Probe der Einwirkung eines Einfangreagenzes, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, ausgesetzt wird, wobei das Einfangreagenz an die Mikroorganismen oder deren intrazelluläres Material so binden kann, daß diese/dieses mit dem festen Träger verbunden werden/wird,

(b) der feste Träger der Einwirkung eines Reagenzes ausgesetzt wird, mit dem die mit den Mikroorganismen und/oder deren intrazellulären Material verbundene Adenylatkinase für auf den Träger angewendete Lösungen zugänglich wird,

(c) eine Adenosindiphosphat (ADP) enthaltende Lösung unter solchen Bedingungen auf den Träger angewendet wird, daß Adenosintriphosphat (ATP) durch etwaig vorhandene Adenlyatkinase gebildet werden kann,

(d) die gebildete Menge an Adenosintriphosphat (ATP) bestimmt und dann mit dem Vorliegen und/oder der Menge an Mikroorganismen oder intrazellulären Inhalten in Beziehung gesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (d) unter Anwendung eines Assays durchgeführt wird, der mit einer Farbbildungsreaktion verbunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (d) unter Verwendung von Luciferase/Luciferin-Reagenz zur Bildung von Licht, das der gebildeten Menge an ATP proportional ist, durchgeführt und dieses unter Verwendung eines Luminometers bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die in Schritt ionen in einer zur maximalen Umwandlung von ADP in ATP ausreichenden molaren Konzentration umfassen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Schritte (b) und (c) durchgeführt werden, indem das Extraktionsmittel, das ADP und die Magnesiumionen zu der Probe gegeben und das Gemisch während eines vorbestimmten Zeitraums zur Umwandlung von ADP in ATP inkubiert wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das in Schritt (a) verwendete Einfangreagenz immobilisierte Antikörper, die spezifisch für eine Gattung, eine Art oder eine Klasse von Mikroorganismen sind, oder ein Bindungsreagenz, das für bestimmte Materialien auf den Zellwänden von vielen verschiedenen Typen von Mikroorganismen spezifisch ist, umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Einfangreagenz ein Antikörper ist, der durch kovalente Kupplung oder durch Streptavidin/Biotin-Wechselwirkung an einen festen Träger gebunden ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der feste Träger durch ein Magnetfeld festgehalten werden kann.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Schritt (a) durchgeführt wird, indem Magnetperlen, auf denen Antikörper immobilisiert sind, in ein Gefäß gegeben werden, die zu untersuchende Probe in Form einer Lösung oder Suspension zugegeben und gerührt wird, die Perlen mit eingefangenen Mikroorganismen und/oder Material unter Anwendung eines Magnetfeldes immobilisiert werden, die Restlösung oder -suspension entfernt, ADP-Substrat und Extraktionslösung oder -lösungen, mit denen die Adenylatkinase für die ADP-Lösung zugänglich wird, zugegeben und das Magnetfeld entfernt und die Perlen in der Substratlösung gerührt werden, die Perlen durch Wiederanlegen des Magnetfeldes immobilisiert, die das ADP, das Extraktionsmittel und sämtliches gebildetes ATP enthaltende Lösung entfernt und darin das ATP bestimmt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Einfangreagenz in einer Säule zurückgehalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Einfangreagenz auf in der Säule befindlichen Perlen zurückgehalten wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Probe und die Assay- Reagenzien nacheinander nach unten durch die Säule geführt werden, so daß synthetisiertes ATP abgegeben wird, welches dann bestimmt und mit dem Vorliegen des Zielmaterials des Einfangreagenzes in Beziehung gesetzt wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge an ADP, deren Einwirkung die gebundene Probe ausgesetzt wird, zum Erhalt einer ADP-Konzentration von höher als 0,005 mM ausreicht.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Menge an ADP zum Erhalt einer ADP-Konzentration von etwa 0,1 mM ausreicht.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Konzentration an Magnesiumionen, deren Einwirkung die gebundene Probe ausgesetzt wird, 1 mM oder höher ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Magnesiumionen-Konzentration 10 mM oder höher ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Schritt (b) durchgeführt wird, indem ein Reagenz zugegeben wird, das ein kationisches Detergenz enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Reagenz ein tertiäres Diamin enthält.

19. Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Kit ein immobilisiertes Einfangreagenz, das einen Mikroorganismus oder intrazelluläres Material binden kann, und Adenosindiphosphat-Reagenz enthält.

20. Test-Kit nach Anspruch 19, der außerdem eine Quelle für Magnesiumionen und/oder Luciferase und Luciferin enthält.

21. Test-Kit nach Anspruch 20, der einen an einen in Form von losen Perlen, einer mit Perlen gefüllten Säule oder einer beschichteten Mikrotitervertiefung vorgesehenen festen Träger immobilisierten Antikörper, ADP-Reagenz mit einer Reinheit von höher als 99, 999% und ein Luciferase/Luciferin-Reagenz, einschließlich BSA, das von Adenylatkinase- Aktivität praktisch frei ist, enthält.

22. Test-Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das Einfangreagenz ein Antikörper, der für eine Gattung, eine Art oder eine Klasse von Mikroorganismen spezifisch ist, oder ein für bestimmte Materialien auf den Zellwänden von Mikroorganismen spezifisches Reagenz ist.

23. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 3 bis 18, wobei die Vorrichtung eine Reaktionskammer (5), in der das immobilisierte Einfangreagenz mit einer Probe in Wechselwirkung treten kann, eine Einrichtung, mit der die in den Schritten (a), (b) und (c) erforderlichen Reagenzien nacheinander in die Reaktionskammer (5) eingeführt werden können, und eine Luminometer-Flußzelle (11), die mit der Reaktionskammer (5) und außerdem einer Quelle für Luciferase/Luciferin (13) verbunden und so angeordnet ist, daß nach Beendigung der Schritte (a), (b) und (c) gebildetes ATP direkt durch Korrelation der emittierten Lichtmenge bestimmt werden kann, aufweist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, die außerdem einen elektrisch betreibbaren Magneten (7) aufweist, der so angeordnet ist, daß damit die in der Reaktionskammer (5) suspendierten magnetischen Perlen immobilisiert werden können.

25. Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei die Reaktionskammer (5) eine Reaktionssäule aufweist.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, wobei die Säule ein Trägermaterial enthält, das mit einem Einfangreagenz beschichtet ist, das einen Mikroorganismus oder dessen intrazelluläres Material binden kann.