DE69518156T2

DE69518156T2 - Immunomodulatoren

Info

Publication number: DE69518156T2
Application number: DE69518156T
Authority: DE
Inventors: Borbala Gesser; Christian Groenhoej Larsen
Original assignee: STEENO RES GROUP AS ODENSE
Current assignee: STEENO RES GROUP AS ODENSE
Priority date: 1994-07-05
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2001-01-11
Anticipated expiration: 2015-06-08
Also published as: AP9700962A0; GR3034628T3; HK1012416A1; EP1013764A1; CA2194444A1; NO970020L; JPH10502249A; PL319429A1; CN1216992C; HU9603615D0; UA57702C2; CA2194444C; FI970009L; CZ1497A3; PL181042B1; HU220344B; SK161496A3; WO1996001318A1; MX9606537A; PT769054E

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die pharmazeutische Verwendung einer Substanz, die ein Interleukin 10(IL-10)-Agonist ist, insbesondere die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Prävention und/oder zur Behandlung von Krankheiten, deren Pathogenese mit der verminderten Produktion und/oder Funktion von immuninhibitorischen Mediatoren, insbesondere Cytokininen, und/oder mit einer gesteigerten Produktion und/oder Funktion von bestimmten Immunentzündungs-Mediatoren, insbesondere Cytokinen, zusammenhängt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Prävention und/oder Behandlung von Autoimmunerkrankungen (Diabetes mellitus, Typ I; entzündlichen Erkrankungen des Magen-Darm- Traktes; rheumatoider Arthritis), Arthritis urica (Gicht), Hautallergie; allergischen Reaktionen in der Haut, in den Lungen und Atemwegen (einschließlich Asthma bronchialis) Gewebebeschädigung auf Grund von Hypoxie/Ischämie (Infarzierung; Reperfusion); Atherosklerose; Psoriasis; granulomatöse Erkrankung; chronisch-myeloische Leukämie; akute myeloische Leukämie; Krebs; Transplantat-gegen-Empfänger- Reaktion und Transplantat-Abstoßungs-abhängige Erkrankungen; Lungenfibrose, Leberfibrose; chronischer, nicht-infektiöser Entzündung der Lunge; Glomerulonephritis; vorzeitigen Wehen; Periodontitis; entzündlichen Reaktionen aufgrund von Virusinfektionen, Osteoporose, septischem Schock und/oder zur Herstellung eines Kontrazeptivums.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Forschung der letzten zwei Jahrzehnte hat gezeigt, daß der Beginn, die Steuerung und das Ende entzündlicher Reaktionen sowie die Steuerung des Wachstums und die Differenzierung in Säuger-Organismen einer strengen Kontrolle durch eine spezielle Gruppe von Signal-Polypeptiden unterliegen, die allgemein Cytokine genannt werden. Cytokine sind Polypeptide, die von den meisten kernhaltigen Zellen produziert werden können und die die regulatorischen Signale zwischen den Zellen übertragen und somit ein Kommunikationssystem zwischen identischen oder unterschiedlichen Zelltypen des Organismus bilden. Die Cytokine sind extrem wirksame Mediatoren und bei Konzentrationen bis 10&supmin;¹&sup5; M wirksam. Cytokine sind auch die Schlüsselfaktoren zur Entwicklung der Immunreaktionen der Zelle, die ihrerseits die Grundlage bilden für die klinischen Manifestationen der Entzündung aufgrund von Infektion, Allergie, Trauma, Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktionen und Autoimmunerkrankungen. Die allergischen Erkrankungen und die Autoimmunerkrankungen erklären sich durch Anormalitäten im Immunsystem, insbesondere bei der T-Lymphozyten-vermittelten Immunität, allerdings sind diese Erkrankungen im allgemeinen von unbekannter Ätiologie. In-vitro-Studien, Tierexperimente und klinische Studien haben gezeigt, daß Cytokinine eine bedeutende pathophysiologische Rollen bei entzündlichen Reaktionen, die mit Autoimmunerkrankungen, Allergie, Ischämie, Reperfusionsschädigung, Trauma, Infektionen zusammenhängen, spielen und zur Entwicklung von Krebs, Atherosklerose, zur Schwangerschafts- und Fetalentwicklung und bei der Knochenhomöostase wichtig sind. Cytokine können an weiteren immunentzündlichen und proliferativen Erkrankungen beteiligt sein, wie es im folgenden ausführlich beschrieben wird.
Die genannten Erkrankungen sind üblicherweise chronisch, und die Behandlung ist palliativ, d. h. die meisten der im Zusammenhang mit den Erkrankungen verschriebenen Arzneimittel sind auf die Linderung von Symptomen ausgerichtet und besitzen im allgemeinen keine kurative Wirkung. Weitere Behandlungen sind die sogenannten Substitutionstherapien, die eine lebenslange Versorgung des Patienten mit Substanzen, z. B. Hormonen, beinhalten, die aufgrund einer verminderten/ungenügenden Eigenproduktion der Substanz benötigt werden. Die Behandlungen sind oft nicht zufriedenstellend, mit unerwünschten und oft schwerwiegenden Nebenwirkungen behaftet, und hauptsächlich verzögern sie die Progression der Erkrankung statt sie zu verhindern. Es werden also dringend verbesserte Behandlungsmethoden und verbesserte pharmazeutische Präparate benötigt.
Interleukin-10 (IL-10) ist ein unlängst beschriebenes natürliches, endogenes immunsuppressives Cytokin, das sowohl im Maus-Organismus als auch im menschlichen Organismus nachgewiesen wurde. Maus-Interleukin-10 (mIL-10) wurde ursprünglich als ein aus TH&sub2;-Helfer-T-Zellklonen freigesetzter Cytokinsynthese-Hemmfaktor beschrieben, aber es besitzt auch proliferative Wirkungen auf verschiedene Unterklassen von Lymphozyten, einschließlich einer verstärkenden Wirkung auf die Klonierungseffizienz von CD4-pos.-, CD8-pos.-Maus-Milz-T-Zellen (4). Menschliches Interleukin 10 (hIL-10) wurde unlängst sequenziert, und es hat sich herausgestellt, daß es auf DNA- Sequenzniveau und auf Aminosäuresequenzniveau eine hohe Homologie zu mIL-10 aufweist. Auch das Schweine-Interleukin 10 wurde unlängst sequenziert, und es hat sich herausgestellt, daß es auf DNA-Sequenzniveau und auf Aminosäuresequenzniveau eine hohe Homologie zu menschlichem IL-10 aufweist (88), siehe auch Fig. 2. Zudem besitzt hIL-10 eine hohe Homologie zu einem offenen Leseraster im Epstein-Barr-Virus-Genom, BCRF1, und virales IL-10 zeigt etwas von der Wirkung von hIL-10, cf. Fig. 1 (5).
Menschliches IL-10 wird von aktivierten T-Zellklonen und immortalisierten B-Zellen produziert, und abgesehen von seiner Cytokin-Synthese-Hemmfaktor(CSIF)-Wirkung, der Hemmung der Produktion mehrerer entzündungsfördernder Cytokine und der Kolonie-stimulierenden Faktoren, bewirkt es auch die Produktion eines natürlichen Interleukin-1-Rezeptorblockerproteins/Peptids (IRAP) durch einkernige Zellen, wodurch die IL-1-Wirkung indirekt gehemmt wird. IL-10 regelt auch seine eigene Produktion durch die Monozyten zurück und hemmt die Expression des Klasse-II-MHC (12). Außerdem vermindert hIL-1C die Antigen-spezifische Proliferation von menschlichen T-Zellen und CD4-pos.-T-Zellklonen, wenn Monozyten als Antigentragende Zellen eingesetzt werden. In-vivo-Experimente mit Mäusen zeigen, daß das Ausbrechen einer Leishmania-Infektion abhängig ist vom Cytokin-Profil der ansprechenden CD4-pos.-T- Lymphozyten (13). In C57BL/6-Mäusen, die resistent sind gegen eine Leishmania-Infektion, zeigen CD4-pos.-T-Zellen aus punktierten Lymphknoten eine Aufwärts-Regulierung von IFN-γ- und IL-2-Cytokinen, wohingegen die anfälligen BALB/c-Mäuse in ihren punktierten Lymphknoten ansprechende, IL-4 und IL-10 ausschüttende CD4-pos.-T-Zellen aufweisen, was nachgewiesenermaßen mit der Krankheitsprogression in Korrelation gebracht werden konnte (13). IL-10 kann also wirksame regulatorische Effekte auf die Immunreaktionen sowohl in vitro als auch in vivo ausüben. Außerdem besitzt IL-10 einen starken Einfluß in der Chemokin-Biologie, da menschliches Interleukin 10 ein spezifischer Chemotaxisfaktor für CD8-pos.-T-Zellen ist, solange IL-10 die Migrationsfähigkeit von CD4-pos.-, jedoch nicht von CD8-pos.-T-Zellen, als Reaktion auf das T- Zellen-Chemotaxiscytokin IL-8 unterdrückt (14). IL-10 hemmt auch die chemotaktische Wirkung weiterer Chemokine, MCP-1/MCAF und RANTES (75). Da IL-10 ein Desaktivator der Monozyten/Makrophagen-Funktionen und ein Inhibitor der Th1- Wirkung ist, können Arzneimittel mit kompletter oder teilweiser IL-10-Wirkung eine therapeutische Wirkung bei Krank heiten besitzen, die sich durch ein Ungleichgewicht in der Cytokin-Produktion und/oder in den Cytokin-Wirkungen auszeichnen.
Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die hIL-10 oder vIL-10 enthalten, wurde bereits vorgeschlagen, und die Verwendung von hIL-10 oder vIL-10 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung verschiedener Erkrankungen, wie septischer oder toxischer Schock, rheumatoide Arthritis, Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion, Gewebeabstoßung, Diabetes mellitus, Autoimmunerkrankungen, Leukämie und Krebs, wurde z. B. in der WO93/02693 und in der WO94/04180 offenbart. Außerdem wurden IL-10-Antagonisten, z. B. Antikörper, die spezifisch an IL-10 binden, z. B. in der EP 405 980 und in der WO94/06473 offenbart, und es wurde Überlegungen dahingehend angestellt, daß solche Antikörper bei der Behandlung von HIV-infizierten Patienten nützlich sein könnten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß eine von menschlichem Interleukin 10 verschiedene Substanz mit einer oder mehreren der folgenden Eigenschaften
a) Auslösung der Hemmung der spontanen IL-8-Produktion durch menschliche Monozyten,
b) Auslösung der Hemmung der IL-1β-induzierten IL-8-Produktion durch periphere menschliche einkernige Blutzellen (PBMC),
c) Auslösung der Produktion von Interleukin-1-Rezeptorblockerprotein (IRAP) durch menschliche Monozyten;
d) Auslösung der chemotaktischen Migration von menschlichen CD8-pos.-T-Lymphozyten in vitro,
e) Desensibilisierung menschlicher CD8-pos.-T-Zellen, was zu einer Nichtreaktivität auf rhIL-10 führt,
f) Suppression der Chemotaxisreaktion von menschlichen CD4- pos.-T-Lymphozyten auf IL-8,
g) Suppression der Chemotaxisreaktion von menschlichen Monozyten auf MCAF/MCP-1,
h) Induktion der Produktion von IL-4 durch kultivierte normale menschliche CD4-pos.-T-Zellen,
i) Verminderung der TNFα-Produktion in einer Reaktion in einer gemischten menschlichen Leukozytenkultur,
wie beispielsweise ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn, ein Nonapeptid mit Sequenzhomologie zu I1-10, das IT9302 genannt wird, oder ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz und Derivate davon, wie in den Ansprüchen definiert, zur Prävention und/oder Behandlung von bestimmten Formen entzündlicher Prozesse, insbesondere von Formen, die mit dem Immunsystem und/oder dem Hormonsystem in Verbindung stehen, verwendet werden kann. Es wird erwartet (wie ausführlich in der folgenden Beschreibung der immunologischen Mechanismen beschrieben), daß der Wirkmechanismus über den Eingriff in die Wirkung der Mediatoren des Immunsystems, insbesondere in die Wirkung der Cytokine wie Monokine, Lymphokine, Chemokine und der Monokin-Rezeptorblocker, verläuft, d. h. die erfindungsgemäße Substanz stört/unterdrückt die Produktion und/oder die Wirkung bestimmter Cytokine und hemmt somit pathologische Prozesse, die zu einer Gewebeschädigung führen, und daß die erfindungsgemäße Substanz die Produktion natürlicher Monokin- Rezeptorblocker bewirkt, und somit die Wirkung bestimmter Cytokine beeinträchtigt/unterdrückt, wobei pathologische Prozesse, die zu einer Gewebeschädigung führen, gehemmt werden.
Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung betrifft somit ein pharmazeutisches Präparat, das als Wirkstoff eine erfindungsgemäße Substanz enthält. Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind eine Substanz, die eine oder mehrere der vor stehend aufgeführten Wirkungen a) bis g) zu neutralisieren vermag, z. B. ein Antikörper, und ein pharmazeutisches Präparat, das eine solche Substanz enthält.
Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur deutlichen Hemmung einer mit einem Cytokin in Verbindung stehenden biologischen Wirkung, d. h. die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz als IL-1-Rezeptorblockerprotein/Peptid, Lymphokin, Monokin, Interleukin, Interferon, Chemokin oder als Kolonie-stimulierender Faktor. Ein weiterer Aspekt betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Prophylaxe oder zur Behandlung einer Erkrankung, die mit der Störung eines Cytokin-Systems, d. h. des IL-1-Rezeptorblockerproteins/Peptids, von Lymphokin, Monokin, Interleukin, Interferon, Chemokin oder des Koloniestimulierenden Faktorsystems, in Verbindung steht. Bei einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung bei einem Menschen, die mit einer Störung in einem Cytokin-System in Verbindung steht, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Substanz an das Individuum umfaßt.
Das Immunsystem der Zelle ist an der Entwicklung solcher Erkrankungen wie infektiöse, entzündliche und neoplastische Erkrankungen beteiligt. Immunkompetente Zellen und ihre Produkte können bei der Auslösung, Progression und bei dem möglichen chronischen Verlauf der Entwicklung der entzündlichen Erkrankungen eine bedeutende Rolle spielen. Für diese Erkrankungen existiert oft keine bekannte Äthiologie, und sie umfassen häufige Erkrankungen wie Diabetes mellitus, rheumatoide Arthritis, entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm- Traktes und der Haut. Abgesehen von diesen Beispielen, tragen allerdings die zellvermittelte Immunität oder die entzün dungsfördernden Mediatoren zu vielen anderen entzündlichen und proliferativen Erkrankungen bei (siehe Tabelle 2).

TABELLE 2

Einige Erkrankungen, bei denen Makrophagen/T-Lymphozytenvermittelte Immunreaktionen als pathogen bedeutend betrachtet werden

Hauterkrankungen:
Psoriasis
atopische Dermatitis
Kontaktdermatitis
Haut-T-Zellen-Lymphom (CTCL)
Sezary-Syndrom
Pemphigus vulgaris
bullöses Pemphigoid
Erythema nodosum
Sclerodermie
Autoimmun-Erkrankungen (einschließlich rheumatischer Erkrankungen):
Uveitis
morbus Bechet
Sarcoidosis Boeck
Sjögren-Syndrom
rheumatoide Arthritis
iuvenile Arthritis
Reiter-Syndrom
Gicht
Osteoarthrosis
systemischer Lupus erythematosis
Polymyositis
Myokarditis
primäre Nierencirrhose
morbus Crohn
ulzerative Kolitis
multiple Sklerose und andere demyelinisierende Erkrankungen aplastische Anämie
idiopathische thrombocytopenische Purpura
multiples Myelom und B-Zellen-Lymphom
Simmonscher Panhypopituitarismus
morbus Graves und Graves-Ophthalmopathie
subakute Thyreoditis und morbus Hashimoto
morbus Addison
Insulin-abhängiger Diabetes mellitus (Typ 1)
Weitere Erkrankungen:
diverse klinische Syndrome mit Vaskulitis (z. B. Polyarteritis nodosa, Wegener Granulomatose, Riesenzellarteriitis, Fieber, Übelkeit
Anorexie (z. B. bei akuten und chronisch-entzündlichen und infektiösen Erkrankungen)
akute Verbrauchskoagulopathie (DIC)
Arteriosklerose (Atherosklerose)
Schock (z. B. bei gram-negativer Sepsis)
Kachexie (z. B. bei Krebs, chronisch infektiösen und chronisch entzündlichen Erkrankungen)
Transplantatabstoßung und Transplantat-gegen-Empfänger- Reaktion
Cytokine:
T-Lymphozyten geben den Einsatz zur Auslösung und Regulierung von zellvermittelten Immunreaktionen, und die Cytokin-Produkte (Lymphokine) der T-Zellen bewirken und steuern die Immunantwort (1,2). Die Lymphozyten-aktivierenden Mediatoren (Lymphokine), die von den Antigen-aufweisenden Zellen produziert werden, gehören einer Gruppen von Polypeptiden an, die Cytokine genannt wird. Cytokine sind die Transmitter der Kommunikation von Zelle zu Zelle, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen, und können auch als Hormone funktionieren, die die Signale zwischen dem Immunsystem und anderen Geweben und Organen liefern. Cytokine können auch durch Zellen außerhalb des Immunsystems produziert werden, und es wird im allgemeinen angenommen, daß sämtliche kernhaltigen Zellen in der Lage sind, ein oder mehrere Cytokine zu produzieren. So sind z. B. Keratinozyten und Fibroblasten potente Produzenten von Cytokinen, und in diesem System können Cytokine unabhängig vom Immunsystem als autokrine oder parakrine Hormone funktionieren (3).

Interleukin-10:

Maus-Interleukin 10 (mIL-10) wurde ursprünglich als Cytokinsynthese-Hemmfaktor (CSIF) beschrieben, der von TH&sub2;-Helfer-T- Zellklonen ausgeschüttet wird, aber es besitzt auch proliferative Wirkungen auf verschiedene Unterklassen von Lymphozyten, einschließlich einer verbessernden Wirkung auf die Klonierungseffizienz von CD4-pos.-, Cd8-pos.-Maus-Milz-T- Zellen (4). Menschliches Interleukin 10 (hIL-10) wurde unlängst beschrieben (5) und besitzt eine hohe Homologie zu einem offenen Leseraster im Epstein-Barr-Virus-Genom, BCRF1, und virales IL-10 zeigt etwas von der Wirkung von hIL-10. Im folgenden werden die biochemische, biologische, physiologische und mögliche pathophysiologische Rolle von IL-10 zusammengefaßt.

IL-10 Struktur:

Die Primärstrukturen von Maus-IL-10 (mIL-10) und menschlichem IL-10 (hIL-10) ergaben über ihre gesamte Länge ein hohes Maß an Nucleotidsequenz-Homologie (> 80%) (4, 5). Der einzige signifikante Unterschied besteht in der Insertion eines sich wiederholenden, menschlichen Alu-Sequenzelementes in der 3'-untranslatierten Region des hIL-10-cDNA-Klons. Die mIL-10- und hIL-10-cDNA codieren für sehr ähnliche offene Leseraster (ORF) von 178 Aminosäuren, einschließlich hydrophober Leadersequenzen, was einer Aminosäure-Homologie von 73% entspricht. MIL-10, das auf Maus-Zellen aktiv ist, geht auf menschlichen Zellen keine signifikante Kreuzreaktion ein. hIL-10 ist ein Polypeptid von 18 kDA, dem nachweisbares Kohlenhydrat fehlt, aber mIL-10 ist an einer Stelle in der Nähe seines N-Terminus N-glycosyliert, was bei hIL-10 fehlt. Sowohl mIL-10 und rekombinantes hIL-10 (rhIL-10) werden als nicht kovalente Homodimere exprimiert. Das Ausmaß zu dem mIL-10- oder hIL-10-Monomere biologisch aktiv sind, ist noch ungewiß. mIL-10 und hIL-10 mit Polypeptid-"Anhängseln" von wenigstens 8 Aminosäuren am N-Terminus und 21 Aminosäuren am C-Terminus zeigten nach einer Veröffentlichung von Moore et al., die als erste menschliches IL-10 sequenzierten (6), keinen nachweisbaren Wirkungsverlust. Werden die C- und N-terminalen Enden des gesamten IL-10 mit Anhängseln versehen, so führt dies nicht notwendigerweise zu funktionellen Änderungen, da das Anbringen von Anhängseln gelegentlich oder zufällig erfolgt. Die hohe Anzahl möglicher Aminosäure-Substitutionen, wie im folgenden ausführlicher beschrieben, könnte auch erklären, warum beim Anbringen von Anhängseln keine fehlenden Funktionen auftraten. Rekombinantes mIL-10 und hIL-10 wurden exprimiert in: CDS7-Zellen, Maus-Myelomzellen, Chinahamster-Eierstockzellen, einem Baculovirus- Expressionssystem und in E. coli. Die biologische Wirkung dieser rIL-10-Proteine sind bis jetzt ununterscheidbar (6).
Das mIL-10-Gen enthält fünf Exons, die über ungefähr 5,1 kb DNA angeordnet sind. Der Genom-Klon selbst kodiert für ein exprimierbares mIL-10-Protein. Die mIL-10- und hIL-10-Gene befinden sich bei Maus und Mensch auf Chromosom 1 (6,7).
mIL-10 und hIL-10 zeigen eine hohe DNA- und Aminosäuresequenz-Homologie zu einem offenen Leseraster im Epstein-Barr- Virus-Genom, BCFR1, und die Homologie ist auf die für das reife Protein codierende Sequenz beschränkt und wird in der Signalsequenz oder der 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen nicht nachgewiesen (5). Hinsichtlich der drei Sequenzen ist mIL-10 und hIL-10 das auf DNA-Sequenzniveau enger verwandte Paar (81%), während die für die reifen hIL-10- und BCRF1- Proteine codierenden DNA-Sequenzen eine Homologie von 71% besitzen. Die Homologie zwischen hIL-10 und BCFRl beträgt auf Aminosäure-Niveau 84%. Eine Hypothese lautet, daß die mIL-10- und hIL-10-Gene sich aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben, während BCFR1 ein verstümmeltes, eingefangenes, zelluläres Cytokin-Erbgen darstellt, und daß das BCFR1- Protein gestaucht wurde, um hIL-10 ähnlich zu sein. BCFR1 wird während des Lyse-Cyclus des EBV exprimiert. Der BCFR1- ORF codiert für ein sezerniertes 17-kDa-Polypeptid, das wie hIL-10 wenig oder keine Glycosylierung enthält. BCFR1 zeigt einige Wirkungen von IL-10 und wurde virales IL-10 (vIL-10) genannt, obwohl festgestellt wurde, daß seine Wirkung 10% der Wirkung von hIL-10 ausmacht.

IL-10-Wirkung auf die Cytokin-Produktion:

hIL-10 hemmt die Produktion einer Reihe von Cytokinen einschließlich Interferon γ (IFN-γ), Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α), Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Granulocyten-CSF (G-CSF), IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 und Monozyten-Chemotaxis-Polypeptid-1 (MCP-1/MCAF) durch Monozyten/Makrophagen und/oder T-Lymphozyten. IL-10 hemmt auch die Fähigkeit der Monozyten zur Migration als Reaktion auf das Chemokin MCP-1/MCAF (75). Außerdem bewirkt hIL-10 die Produktion eines endogenen, natürlichen Interleukin-1-Rezeptorblockers (IRAP) (6), der IL-1α und IL-1β durch Konkurrenz um die Rezeptorbindung hemmt. Da IL-8 stark durch IL-1α und IL-1β stimulierbar ist, übt IL-10 einen Teil seiner inhibitorischen Wirkung auf die IL-8-Produktion durch Stimulierung der Produktion des IL-1- Rezeptorblockers IRAP aus. Letzterer Mechanismus ist für die vorliegende Erfindung von beträchtlicher Bedeutung, wie im folgenden beispielhaft beschrieben und erläutert. IRAP besitzt entzündungshemmende Wirkungen (9), und seine therapeutische Wirkung bei der rheumatoiden Arthritis wird diskutiert (10). Zudem erwies sich IRAP als wirksam bei der Behandlung des septikämischen Syndroms, und in einer Studie von Fisher et al. (11) ging die IRAP-Behandlung einher mit einem dosisabhängigen, 28-tägigen Überlebensvorsprung (p = 0,015). IRAP kann seine entzündungshemmenden Wirkungen teilweise durch Hemmung der Chemokin-Produktion, beispielsweise der Produktion von IL-8, ausüben.

IL-10 und Antigen-Expression:

IL-10 hemmt die Expression des Klasse-II-MHC auf menschlichen Monozyten (8). Die konstitutive und IL-4- oder IFN-γ-induzierte Expression von HLA-DR/DP und DQ wurde von hIL-10 gehemmt (12). Zudem sind mit IL-10 vorinkubierte Monozyten widerstandsfähig gegenüber der anschließende Induktion der Klasse- II-MHC-Expression durch IL-4 oder IFN-γ. IL-10 hemmt die Klasse-II-Expression durch menschliche Monozyten nach der Aktivierung durch LPS (12, 76). BALB/c-Mäusen, denen 1 bis 10 mg IL-10 zusammen mit einer letalen Dosis von LPS verabreicht wurde, wurden vor dem Tod bewahrt (6).
IL-10 hemmt Stickstoff-Zwischenstufen und Superoxid-Anionen. IL-10 hemmt zudem die reaktive Stickstoff-Zwischenstufe (NO) sowie reaktive Sauerstoff-Zwischenstufe (H&sub2;O&sub2;) durch Makrophagen nach einer Aktivierung durch IFN-γ (13).

IL-10 und T-Zellen-Aktivität:

IL-10 besitzt auch Modulationswirkungen auf die T-Zell-Funktionen/Aktivität. So ist IL-10 ein potenter Chemotaxisfaktor für CD8-pos.-T-Lymphozyten, während hIL-10 keine Chemotaxis mit CD4-pos.-T-Zellen zeigt (14). Außerdem unterdrückt IL-10 das Vermögen von CD4-pos.-T-Zellen zur Reaktion auf die chemotaktischen Signale des β-Chemokins RANTES sowie des α-Chemokins IL-8. Zudem hemmt hIL-10 direkt die Proliferation von menschlichen peripheren Blut-T-Zellen und von CD4-pos.-T- Zellklonen (14).

IL-10 und B-Lymphozyten:

hIL-10 ist ein Mitstimulator der durch Quervernetzung von Oberflächen-Ig mit immobilisiertem Anti-IgM-Antikörper ausgelösten B-Lymphozyten-Proliferation, und diese Wirkung wird verstärkt, wenn B-Zellen durch Quervernetzung ihres CD40- Antigens mit Anti-CD40-Antikörper und Maus-L-Zellen, die menschliches FcγRII/CD32 exprimieren, stimuliert werden (15). Die Wirkung von IL-10 auf die Proliferation und Differenzierung aktivierter menschlicher B-Zellen legt den Schluß nahe, daß dieses Cytokin für einen großen Teil der außergewöhnlichen Fähigkeit von hIL-10-exprimierenden T-Zellen verantwortlich sein kann, die B-Zellen-Reaktionen zu unterstützen.

IL-10 als homöostatischer Faktor des Immunsystems:

Es wird angenommen, daß die physiologischen Folgen der oben erwähnten Funktionen von IL-10 in einem bestimmten Grad an Homöostase des Immunsystems bestehen. So hemmt IL-10 eindeutig Helfer-T-Zellfunktionen und stimuliert wahrscheinlich T-Zellen mit Suppressorfunktionen. Darum wird angenommen, daß IL-10, wie IL-4, das Gleichgewicht zwischen den Th1- und Th2-Cytokin-Profilen der T-Zellen reguliert. Insbesondere wird angenommen, daß IL-10 die Differenzierung von Th1-Zellen hemmt. Da das Merkmal von Th1-Zellen in der Produktion von Cytokinen (IFN-γ und IL-10)besteht, die die Zell-vermittelten Immunreaktionen begünstigen, während Th2-Zellen Cytokine (IL-4', IL-5 und IL-10) produzieren, die eine humorale Reaktion begünstigen und eine T-Zell-vermittelte Immunreaktion unterdrücken, unterdrückt IL-10 wahrscheinlich eine T-Zellvermittelte Immunreaktion, wie Hypersensibilitätsreaktionen vom verzögerten Typ, während es humorale Reaktionen begünstigt.
Als Folge der oben erwähnten Merkmale von IL-10 wurde die Wirkung von IL-10 als Inhibitor der Makrophagen- und Th1- Cytokin-Synthese beschrieben. Darum wurde erforscht, ob eine fehlende IL-10-Produktion und/oder Aktivität eine Rolle bei Erkrankungen spielen kann, von denen angenommen wird, daß bei der Erkrankung eine verstärkte zellvermittelte Immunreaktivität eine Rolle spielt, wie Autoimmunerkrankungen und Entzündung. Mit Anti-IL-10-Antikörper behandelte Mäuse zeigen eine stärkere entzündliche Reaktion auf eine Monokin-induzierte Entzündung und sind wesentlich empfindlicher gegenüber dem durch einen LPS-induzierten septischen Schock herbeigeführten Tod, eine Monokin-vermittelte entzündliche Reaktion (16). Ferner entwickeln Mäuse, denen IL-10 fehlt, spontan entzündliche Reaktionen des Darms, entsprechend einer Kolitis ulcerosa (17). Zusätzlich wurde erforscht, ob IL-10 bei verschiedenen parasitären, mykobakteriellen oder viralen Infektionen eine Rolle spielt, und es hat sich herausgestellt, daß IL-10 bei der Immunparalyse, die mit der Infektion mit Schistosoma mansoni in Zusammenhang steht (18), eine pathophysiologische Rolle spielt. Ferner wurde eine Rolle bei Mycobacterium leprae-Infektionen vorgeschlagen. Unlängst wurde festgestellt, daß AIDS-Patienten mit schlechter Prognose einen höheren IL-10-Spiegel im Plasma aufweisen, und es wurde die Vermutung geäußert, daß dies zu der von AIDS bekannten Immunparalyse beiträgt (19).

Therapeutische Überlegungen:

Diese In-vivo-Ergebnisse/Daten lassen unbedingt auf eine homöostatische Rolle von IL-10 bei der Kontrolle der zellvermittelten und Monokin-verstärkten Immunentzündung schließen und beweisen die weitreichenden therapeutischen Anwendungen von IL-10 oder eines Arzneimittels mit IL-10- artiger Wirkung bei der Behandlung von Erkrankungen, die durch eine verminderte/unzureichende Produktion und/oder Aktivität von IL-10 gekennzeichnet sind. Da die erfindungsgemäße Substanz IT9302 eine IL-10-artige Wirkung hervorruft durch:
1) Auslösung der IRAP-Produktion durch menschliche Monozyten,
2) spontane Hemmung der IL-8-Produktion durch menschliche Monozyten,
3) Hemmung der IL-1β-stimulierten IL-8-Produktion durch periphere einkernige Blutzellen (PBMC),
4) Stimulation der chemotaktischen Migration von menschlichen CD8-pos.-, jedoch nicht von CD4-pos.-T-Lymphozyten,
5) Desensibilisierung von menschlichen CD8-pos.-T-Zellen auf eine rhIL-10-ausgelöste chemotaktische Migration,
6) Hemmung der IL-8-vermittelten Chemotaxis menschlicher CD4-pos.-T-Zellen, und
7) Hemmung der MCP-1/MCAF-vermittelten Chemotaxis menschlicher Monozyten,
8) Auslösung der IL-4-Produktion durch kultivierte, normale menschliche CD4-pos.-T-Zellen,
9) Verminderung der TNFα-Produktion durch eine gemischte menschliche Leukozytenkultur,
können dieses Polypeptid und dessen Analoga also dieselben therapeutischen Einsatzmöglichkeiten wie hIL-10 besitzen.
Tabelle 3 führt einige Krankheiten auf, für die ein Immunmodulator wie IL-10 oder ein Immunmodulator mit IL-10-artiger Wirkung von therapeutischer Bedeutung sein kann:

TABELLE 3

Einige Krankheiten, bei denen ein Immunmodulator mit IL-10- artiger Wirkung aufgrund seiner Auslösung der IRAP-Produktion und/oder Hemmung der Cytokin-Produktion und/oder Wirkung therapeutische Bedeutung besitzen kann (Ref. 20-74)
vorzeitige Wehen durch Infektion oder andere Erkrankungen
rheumatoide Arthritis
Lyme-Arthritis
Gicht
septikämisches Syndrom
Hyperthermie
ulzerative Kolitis oder Enterokolitis
Osteoporose
Cytomegalie-Virus
Erkrankungen der Wurzelhaut des Zahns
Glomerulonephritis
chronische, nicht-infektiöse Entzündung der Lunge (z. B. Sarkoidose und Raucherlunge)
Granulombildung
Fibrose der Leber
Fibrose der Lunge
Transplantatabstoßung
Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion
chronische myeloische Leukämie
akute myeloische Leukämie
weitere neoplasmatische Erkrankungen
Asthma bronchialis
Diabetes mellitus Typ I (Insulin-abhängig)
Arteriosklerose/Atherosklerose
Psoriasis
chronische B-Lymphozyten-Leukämie
allgemeine veränderliche Immundefizienz
Nebenwirkungen bei Verwendung anderer Modifikatoren der biologischen Reaktionen
disseminierte, intravaskuläre Koagulation
systemische Sklerose
Enzephalomyelitis
Lungenentzündung
Hyper-IgE-Syndrom
Enterokolitis
Krebsmetastasis und Krebswachstum
übernommene Immuntherapie
erworbenes respiratorisches Atemnotsyndrom
Sepsis
Reperfusionssyndrom
postoperative Entzündung
Organtransplantation
Alopezie

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Entwicklung eines IL-10-homologen Nonapeptids mit IL-10- artiger Wirkung:

Teilsequenzen von hIL-10 mit einer Länge von 9 Aminosäuren wurden nach dem Prinzip ausgewählt, daß die Sequenzen eine hohe Homologie mit vIL-10 und hIL-10, aber eine möglichst geringe Homologie mit mIL-10 besitzen sollten. Diese Strategie beruhte auf der Tatsache, daß vIL-10 teilweise mit hIL-10 eine Kreuzreaktion eingeht, während mIL-10 mit hIL-10 keine Kreuzreaktion eingeht (siehe oben). Somit können die für bestimmte Wirkungen im menschlichen Organismus verantwortlichen Sequenzen von hIL-10 in Domänen liegen, in denen eine hohe Homologie mit hIL-10 und vIL-10, aber eine niedrige Homologie bezüglich mIL-10 besteht.
Es wird vermutet, daß das Signal-Polypeptid von hIL-10 aus den ersten 18 Aminosäuren besteht. Das reife Protein beginnt bei Aminosäure Nr. 19 (Nr. 1 im funktionsfähigen Protein, die Serin ist), und das gesamte Protein enthält 160 Aminosäuren. Durch Betrachten der menschlichen und viralen COOH-terminalen Sequenzen von IL-10 und insbesondere der Positionen 157 und 159, die Lysin- und Arginin-Reste enthalten, wurde festgestellt, daß diese Domäne günstig ist für eine teilweise Beteiligung an der Bindung an den Rezeptor (Fig. 1 und 2).
Nach Überprüfung mehrerer, durch chemische Synthese erhaltener Testsubstanzen auf eine IL-10-artige Wirkung wurde festgestellt, daß ein synthetisches Nonapeptid, IT9302, immunsuppressive, die Wirkungen von hIL-10 nachstellende Wirkungen besitzt, wie ausführlicher in den folgenden Beispielen beschrieben. IT9302 entspricht einer Nonapeptid-Sequenz vom C-terminalen Ende von hIL-10 mit der folgenden Aminosäuresequenz:
NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NR. 1)
IT9302 besitzt eine 100%ige Homologie zu einem Segment von hIL-10, das den Aminosäuren-Nummern 152 bis 160 am C-terminalen Ende entspricht. Außerdem besteht bei dieser Polypeptid-Sequenz eine Gemeinsamkeit in 6 Aminosäuren mit dem Virus-IL-10 in dem entsprechenden Bereich, siehe Fig. 1 und 2, was bedeutet, daß 6 von 9 oder 66% der Aminosäuren homolog sind, wie es hier definiert ist, und es besteht eine Gemeinsamkeit in 4 Aminosäuren mit mIL-10, d. h. 4 von 9 oder 44%. Dieses Nonapeptid ist die einzige aus hIL-10 erhaltene oder stammende, bis jetzt überprüfte Sequenz, die die in den Beispielen gezeigten speziellen Eigenschaften aufweist. Bis zur Betrachtung durch die Erfinder hat noch niemand auf diese Sequenz als funktionelle Domäne hingewiesen.
In ihrem breitesten Aspekt betrifft die Erfindung also eine Substanz, wie definiert in Anspruch 1, die eine hIL-10-agonistische Wirkung aufweist, d. h. eine Substanz, die sich von menschlichem Interleukin 10 unterscheidet und eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist:
a) Auslösung der Hemmung der spontanen IL-8-Produktion durch menschliche Monozyten,
b) Auslösung der Hemmung der IL-1β-induzierten IL-8-Produktion durch periphere, einkernige, menschliche Blutzellen (PBMC),
c) Auslösung der Produktion von Interleukin 1-Rezeptor-blockierendem Protein (IRAP) durch menschliche Monozyten,
d) Auslösung der chemotaktischen Migration von menschlichen CD8-pos.-T-Lymphozyten in vitro,
e) Desensibilisierung von menschlichen CD8-pos.-T-Zellen, was zu einer Nichtreaktivität auf rhIL-10 führt,
f) Suppression der chemotaktischen Reaktion von menschlichen CD4-pos.-T-Lymphozyten auf IL-8,
g) Suppression der chemotaktischen Reaktion menschlicher Monozyten in Richtung MCAF/MCP-1,
h) Auslösung der Produktion von IL-4 durch kultivierte, normale menschliche CD4-pos.-T-Zellen,
i) Verminderung der TNFα-Produktion in einer gemischten menschlichen Leukozytenkultur.
Unter diesen Wirkungen werden die Wirkungen d) bis g) als besonders außergewöhnlich angesehen. Eine bedeutende Ausführungsform der Erfindung ist eine Substanz, die eine hIL-10- agonistische Wirkung, wie vorstehend definiert, und die Aminosäuresequenz Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn oder ein Analogon oder eine Variante dieser Sequenz aufweist.
Diese Sequenz und sämtliche andere Polypeptid-Sequenzen in der vorliegenden Spezifikation und in den Ansprüchen sind, auch wenn nicht ausdrücklich aufgeführt, vom N-terminalen zum C-terminalen Ende im üblichen Format geschrieben.
Das Nonapeptid IT9302 ist sehr potent zur Auslösung unterschiedlicher Funktionen und sehr stabil, und es wird angenommen, daß es nicht inkorrekt an die Rezeptoren gekoppelt werden kann. Ein Nonapeptid wurde ausgewählt, da im allgemeinen ein 9-Aminosäure-Polypeptidsequenz für ein Protein einzigartig ist. Allerdings ist zu berücksichtigen, daß anscheinend die 6 Aminosäuren gerade am Ende von hIL-10 die wichtigsten Aminosäuren sind. Im Umfang der Erfindung liegt somit eine Substanz oder ein Polypeptid, das eine Untersequenz der Aminosäuresequenz Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) enthält.
Es wird als unwahrscheinlich angesehen, daß einige Aminosäure-Substitutionen nachteiligen Wirkungen auf die hIL-10- agonistische Wirkung, wie hier definiert, besitzen, solange das Threonin, Lysin und Arginin vorhanden sind, wobei jeweils eine Aminosäure dazwischengeschoben ist.
In ihrem breitesten Aspekt betrifft die Erfindung also ein Polypeptid mit der Formel
Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID NO 19)
worin
X&sub4; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ile, Leu und Val; und
X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Polypeptid der Formel
X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID NO 20)
worin
X&sub3;, X&sub4; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ile, Leu und Val; und
X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu.
Nach noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Polypeptide der Formel
X&sub2;-X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID NR. 21)
worin
X&sub2; für Tyr oder Phe steht,
X&sub3;, X&sub4; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ile, Leu und Val; und
X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polypeptide der Formel
X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID NR. 22)
worin
X&sub1; für Ala oder Gly steht,
X&sub2; für Tyr oder Phe steht,
X&sub3;, X&sub4; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ile, Leu und Val; und
X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu.
Beispiele für spezielle Polypeptide, von denen angenommen wird, daß sie eine hIL-10-agonistische Wirkung, wie vorstehend definiert, besitzen, sind folgende:
1.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn-COOH (SEQ ID Nr. 2),
2.) NH&sub2;-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn-COOH (SEQ ID Nr. 3),
3.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu-COOH (SEQ ID Nr. 4),
4.) NH&sub2;-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 5),
5.) NH&sub2;-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 6),
6.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 7),
7.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 8),
8.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 9),
9.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 10),
10.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 11),
11.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Aps-COOH (SEQ ID Nr. 12),
12.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Aps-COOH (SEQ ID Nr. 13),
13.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 14),
14.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp-COOH (SEQ ID Nr. 15),
15.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln-COOH (SEQ ID Nr. 16),
und
16.) NH&sub2;-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu-COOH (SEQ ID Nr. 17).
Zum Vergleich wurde ein weiteres Nonapeptid, das IT9301 genannt wird, mit einer Homologie von 100% zu einer Sequenz von hIL-10 synthetisiert. Dieses Polypeptid IT9301 entspricht einer Nonapeptid-Sequenz, die am N-terminalen Ende von hIL-10 beginnt (Aminosäuren Nummern 19 bis 27, d. h. die ersten 9 Aminosäuren des reifen Proteins) und die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
NH&sub2;-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Glu-COOH (SEQ ID NR. 18)
Dieses Polypeptid zeigte unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Techniken keine IL-10-artige Wirkung und wurde nur ausgewählt, da es am anderen Ende von hIL-10 liegt und meistens als Kontrolle für Negativergebnisse diente. Es besitzt nicht die Merkmale der C-terminalen Sequenz hinsichtlich der Sequenz-Homologie zu vIL-10 und die zur Bindung an den Rezeptor geeigneten Aminosäuren. IT9301 wurde im IL-1β- induzierten peripheren, einkernigen Blutzellsystem auf die IL-8-Produktion getestet, löste allerdings in keinen Zellen eine Hemmung der IL-8-Produktion aus.
Erfindungsgemäß umfaßt die Bezeichnung "eine hIL-10-agonistische erfindungsgemäße Substanz" jede pharmazeutisch wirksame und pharmazeutisch verträgliche Verbindung, die identisch oder strukturell ähnlich ist zu IT9302 und relevante biologische Wirkungen, entsprechend den Wirkungen von IT9302 besitzt, einschließlich von Derivaten von IT9302, insbesondere pharmazeutisch verträglichen Salzen, Estern und gelösten Stoffen sowie von Konjugaten von IT9302 oder der IT9302-Derivate, einschließlich Peptidomimetika. Das kovalente Kuppeln von IT9302 am NH&sub2;-terminalen Ende an geeignete Träger, z. B. an Polyethylenglycol oder Zucker, könnte die Halbwertszeit des Polypeptids in vivo verlängern.
Im vorliegenden Text werden die folgenden Definitionen verwendet:
"Cytokin" ist eine allgemeine Bezeichnung für einen proteinartigen Mediator, der hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, von einer Zellpopulation des Immunsystems als Reaktion auf ein spezifisches, stimulierendes Mittel, z. B. ein spezifisches Antigen oder ein Alloantigen; oder einen nicht-spezifischen polyklonalen Aktivator, z. B. ein Endotoxin oder andere Zellwandkomponenten eines gram-negativen Bakteriums, ausgeschüttet wird.
"Lymphokin" ist eine allgemeine Bezeichnung für einen proteinartigen Mediator, der von sensibilisierten Lymphozyten als Reaktion auf ein Stimulans, z. B. ein spezifisches Antigen oder ein Alloantigen, oder von einem Lymphozyten, der von einem polyklonalen Aktivator, z. B. einem Endotoxin oder anderen Zellwandkomponenten eines gram-negativen Bakteriums, provoziert wurde, ausgeschüttet wird.
"Interleukin" ist eine allgemeine Bezeichnung für einen proteinartigen Mediator, der hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, von einem Makrophagen, einer T-, B- oder NK- Zelle als Reaktion auf ein Stimulans, z. B. ein spezifisches Antigen oder ein Alloantigen, oder von einem durch einen polyklonalen Aktivator provozierten Lymphozyten, z. B. einem Endotoxin oder anderen Zellwandkomponenten eines gram-negativen Bakteriums, ausgeschüttet wird.
"Monokin" ist die allgemeine Bezeichnung für einen Proteinartigen Mediator, der hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, von einem einkernigen Phagozyten (z. B. einem Monozyten oder einem Makrophagen oder einer Kupfferschen Sternzelle (Leber) oder einer Langerhans-Zelle (Haut)) als eine Reaktion auf irgendein Stimulans freigesetzt wird.
"Chemokin" ist die allgemeine Bezeichnung für einen proteinartigen, chemotaktischen und/oder Leukozyten-aktivierenden Mediator, der hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, durch eine Zellpopulation des Immunsystems als Reaktion auf ein spezifisches Stimulans, z. B. ein spezifisches Antigen oder ein Alloantigen, oder einen nicht spezifischen polyklonalen Aktivator, z. B. ein Endotoxin oder andere Zellwandkomponenten eines gram-negativen Bakteriums, der einer bestimmten Gen-Familie, entweder der Genfamilie Chemokin-α oder Chemokin-β angehört, ausgeschüttet wird.
"Interferon" ist eine allgemeine Bezeichnung für einen proteinartigen, antiviralen und/oder Monozyten-aktivierenden Mediator, der hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, von einer Zellpopulation des Immunsystems als Reaktion auf einen Virus oder einen Interferon-Induktor wie ein Polynucleotid ausgeschüttet wird, insbesondere von Zellen des Immunsystems als Reaktion auf ein spezifisches Stimulans, z. B. ein spezifische Antigen oder ein Alloantigen; oder für einen nicht spezifischen polyklonalen Aktivator, z. B. ein Endotoxin oder andere Zellwandkomponenten eines gram-negativen Bakteriums.
"Kolonie-stimulierender Faktor" ist die allgemeine Bezeichnung für einen proteinartigen, hämatopoetischen, Kolonie-stimulierenden Mediator, der hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, von einer Zellpopulation des Immunsystems als Reaktion auf ein spezifisches Stimulans, z. B. ein spezifisches Antigen oder ein Alloantigen, ausgeschüttet wird, oder für einen nicht spezifischen polyklonalen Aktivator, z. B. ein Endotoxin oder andere Zellwandkomponenten eines gram-negativen Bakteriums.
"Polypeptid", wie hier verwendet, bedeutet Peptide mit einer Länge von höchstens 10 Aminosäure-Resten, die chemisch modifiziert werden können durch Glycosylierung, Lipidierung oder indem sie prosthetische Gruppen enthalten. Die Definition für Polypeptide umfaßt auch native Formen von Peptiden/Proteinen sowie rekombinante Proteine oder Peptide in jedem Typ von Expressionsvektoren, die jede Art von Wirt transformieren und auch chemisch synthetisierte Peptide.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Substanz oder das Polypeptid in im wesentlichen reiner Form verwendet. Um diese zu erhalten, kann eine Reinigung des Polypeptids erforderlich sein. Beispiele für die zur Reini gung von Polypeptiden eingesetzten Verfahrensweisen sind: (i) Immunpräzipitation oder Affinitätschromatographie mit Antikörpern, (11) Affinitätschromatographie mit einem geeigneten Liganden, (iii) andere chromatographische Verfahren wie Gelfiltration, Tonenaustausch- oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Abwandlungen der obigen Methoden, (iv) elektrophoretische Verfahren wie Polyacrylamidgel-Elektrophorese, denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Agarosegel-Elektrophorese und isoelektrische Fokussierung, (v) alle anderen spezifischen Solubilisierungs- und/oder Reinigungstechniken.
Im Umfang der Erfindung liegt auch eine für ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, codierende Nucleotidsequenz, insbesondere eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 enthält oder ist, z. B. eine Nucleotidsequenz, die die Sequenz GCC TAC ATG ACA ATG AAG ATA CGA AAC (SEQ ID NO: 23) oder eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit einer Untersequenz dieser Aminosäuresequenz codiert, enthält. Zudem liegt eine modifizierte Nucleotidsequenz im Umfang der Erfindung, die sich von der obigen Nucleotidsequenz darin unterscheidet, daß wenigstens ein Nucleotid weggelassen, substituiert oder modifiziert wurde oder daß wenigstens ein zusätzliches Nucleotid inseriert wurde, so daß sich eine Nucleotidsequenz ergibt, die für ein Polypeptid, wie in den Ansprüchen definiert, mit hIL-10-agonistischer Wirkung, codiert.
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet die Bezeichnung "Untersequenz" eine Sequenz, die vorzugsweise eine Größe von wenigstens 18 Nucleotiden, mehr bevorzugt von wenigstens 21 Nucleotiden und besonders bevorzugt von wenigstens 24 Nucleotiden aufweist. Bei einer Reihe von Ausführungsformen der Erfindung enthält die Untersequenz oder das Analogon der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz wenigs tens 27 und höchstens 30 Nucleotide. Das Polypeptid, das durch die "Untersequenz" codiert wird, sollte mit wenigstens einem der Kriterien a)-g) vorstehend im Einklang stehen, und/oder das Nucleotid "Untersequenz" sollte mit der Nucleotidsequenz, die die Sequenz SEQ ID NO: 23 enthält, unter sehr genau festgelegten Bedingungen hybridisieren.
Wird die Bezeichnung "sehr genau festgelegt" im Zusammenhang mit Hybridisierungsbedingungen angewandt, so bedeutet dies, wie in der Technik definiert, 5-10ºC unter dem Schmelzpunkt Tm, cf. Sambrook et al., 1989, Seiten 11.45-11.49.
Die Bezeichnung "Analoga" umfaßt, bezogen auf die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente, eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, das identisch oder im wesentlichen identisch ist mit dem Polypeptid, für das die oben erwähnte DNA codiert. Es ist hinreichend bekannt, daß dieselbe Aminosäure von verschiedenen Codons codiert werden kann, wobei die Codon-Verwendung u. a. mit der Präferenz der in Frage kommenden Organismen, die die Nucleotidsequenz exprimieren, zusammenhängt. Somit können ein oder mehrere Nucleotide oder Codons des erfindungsgemäßen DNA-Fragments durch andere ausgetauscht werden, was bei der Expression ein Polypeptid ergibt, das identisch oder im wesentlichen identisch ist zu dem von dem oben gezeigten DNA-Fragment codierten Polypeptid.
Außerdem sollen die Bezeichnungen "Analogon" und "Untersequenz" Variationen in der Sequenz erlauben, wie Substitution, Insertion (einschließlich Introns), Addition und Umlagerung von einem oder mehreren Nucleotiden, wobei die Variationen keine wesentliche nachteilige Wirkung auf die hIL-10-agonistische Wirkung des von dem DNA-Fragment oder einer Untersequenz davon codierten Polypeptids besitzen. Somit umfaßt die Erfindung auch eine Nucleotidsequenz, die für ein Poly peptid mit einer Untersequenz der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 codiert.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können unter Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik produziert werden. Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Expressionssystem, das eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz enthält. Im Umfang der Erfindung liegt somit auch ein Expressionssystem, das eine erfindungsgemäße Nucleotidsequenz enthält, wie einen replizierbaren Expressionsvektor, der eine wie vorstehend definierte Nucleotidsequenz trägt und in der Lage ist, deren Expression zu vermitteln.
Der Organismus, der zur Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptides verwendet wird, kann ein höherer Organismus, z. B. ein Tier, oder ein niedriger Organismus, z. B. ein Mikroorganismus wie Escherichia coli, eine Hefe, ein Protozoon, oder eine einem mehrzelligem Organismus, wie einem Pilz, entstammende Zelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Säugerzelle oder eine Zellinie, die ein wie vorstehend definiertes Expressionssystem trägt, sein.
Ungeachtet des verwendeten Typs von verwendetem Organismus, wird das erfindungsgemäße DNA-Fragment entweder direkt oder mittels eines geeigneten Vektors in den Organismus inseriert. Alternativ können die Polypeptide in den Säuger-Zellinien durch Insertion des DNA-Fragmentes oder eines erfindungsgemäßen Analogons oder einer Untersequenz hiervon, entweder direkt oder mittels eines Expressionsvektors, hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch durch chemische Synthese, wie vorstehend besprochen, hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft zudem einen Plasmid-Vektor, der eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder für ein Fusions polypeptid, wie hier definiert, codierende DNA-Sequenz enthält. Bei einer bestimmten wichtigen Ausführungsform kann das DNA-Fragment oder ein erfindungsgemäßes Analoga oder eine Untersequenz davon oder ein erfindungsgemäßes Fusions-DNA- Fragment, wie hier definiert, von einem replizierbaren Expressionsvektor getragen werden, der zur Replikation in einem Wirtszellenorganismus oder in einer Zellinie in der Lage ist.
Insbesondere kann der Vektor ein Plasmid, ein Phage, ein Cosmid, ein Mini-Chromosom oder ein Virus sein. Bei einer interessanten Ausführungsform der Erfindung kann der Vektor ein Vektor sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingebracht wird, in das Wirtszellen-Genom integriert wird.
Das, wie vorstehend beschrieben, produzierte Polypeptid, kann Modifikationen nach der Translation oder nach der Synthese als Ergebnis von Wärmebehandlung, chemischer Behandlung (Formaldehyd, Glutaraldehyd etc.) oder enzymatischer Behandlung (Peptidasen, Proteinasen und Protein-modifizierende Enzyme) erfahren. Das Polypeptid kann, wenn es in einem Organismus produziert wird, im Vergleich zu seiner natürlichen Produktionsumgebung anders bearbeitet werden. Beispielsweise wird eine Glycosylierung oft erreicht, wenn das Polypeptid durch eine Zelle eines höheren Organismus, wie Hefe oder vorzugsweise eines Säugers, exprimiert wird. Normalerweise wird die Glycosylierung in Verbindung mit den Aminosäure-Resten Asn, Ser, Thr oder Hydroxylysin angetroffen.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie vorstehend definiert, das die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Insertion einer Nucleotidsequenz, wie vorstehend definiert, in einen Expressionsvektor,
(b) Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem in Stufe (a) hergestellten Vektor,
(c) Kultivieren des in Stufe (b) erzeugten Wirtorganismus unter geeigneten Bedingungen zur Expression des Polypeptids,
(d) Ernten des Polypeptids, und
(e) gegebenenfalls Unterziehen des Polypeptids einer Modifikation nach der Translation.
Es wird davon ausgegangen, daß eine antagonistische Wirkung auf hTL-10 oder vIL-10 unter anderem unter Verwendung von Antikörpern erreicht werden kann, die spezifisch an das Nonapeptid IT9302 binden, und daß diese Antikörper bei der Therapie zur Neutralisierung hoher IL-10-Konzentrationen eingesetzt werden können.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung also einen Antikörper, der an das erfindungsgemäße Polypeptid bindet.
Die Bezeichnung "Antikörper" bezieht sich auf eine Substanz, die von einem Säuger oder genauer gesagt von einer von einem Säuger stammenden, dem Immunsystem angehörenden Zelle als Reaktion auf die Exposition gegenüber einem erfindungsgemäßen Polypeptid-Antigen produziert wird. In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen ist "ein Antikörper" so definiert, daß er im wesentlichen aus der spezifisch bindenden Grundeinheit, die aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten besteht, besteht. In seinem weitesten Sinn sollte das Konzept eines Antikörpers allerdings auch z. B. ein Dimer oder Pentamer der Grundeinheit einschließen.
Die variable Domäne eines Antikörpers besteht aus variablen und konstanten Sequenzen. Der variable Teil der Domäne wird Idiotyp des Antikörpers genannt. Dieser Teil des Antikörpers ist verantwortlich für die Wechselwirkung mit dem Antigen, der Antigen-Bindung. Im vorliegenden Zusammenhang wird die Bezeichnung Antigen als ganzes Antikörper-Molekül oder als irgendwelche Fragmenten hiervon verstanden. Ein Antikörper kann während und/oder nach der Produktion fragmentiert werden. Er kann zunächst auch in der fragmentierten Form hergestellt werden und als solche oder nach Zusammenfügen verschiedener Fragmente verwendet werden. Besonders interessante Fragmente sind die Bindungsfragmente der erfindungsgemäßen Antikörper, z. B. Fab- oder Fab'-Fragmente.
Die idiotypische (Antigen bindende) Struktur des Antikörpers ist antigen und kann somit spezifische Antikörper ergeben, die gegen die idiotypische Struktur gerichtet sind. Die gegen den Idiotypus gerichteten Antikörper werden Anti-Idiotyp- Antikörper genannt. Solche Antikörper können die Struktur des Original-Antigens nachbilden und können darum wie das Original-Antigen funktionieren. Solche Antikörper können in der Lage sein, das Original-Antigen in einem Teil oder in allen Funktionen, in der Anwendbarkeit und in den Eigenschaften des erfindungsgemäßen Original-Polypeptids zu ersetzen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper umfassen polyklonale sowie monoklonale Antikörper.
Der Antikörper oder Fragmente davon können monospezifischer (polyklonaler) Natur sein. Der monospezifische Antikörper kann hergestellt werden, indem einem geeigneten Tier eine im wesentlichen reine Präparation des erfindungsgemäßen Polypeptides injiziert wird. Hierauf können eine oder mehrere Booster-Injektionen in geeigneten Zeitintervallen vor der ersten Blutentnahme erfolgen. Den Tieren wird etwa 5-7 Tage nach jeder Immunisierung Blut abgenommen. Aus dem Serum können die Antikörper unter Anwendung von standardisierten Antikörper-Reinigungstechniken gegebenenfalls isoliert werden.
Das Tier, das zur Herstellung von Antikörpern verwendet wird, die an das erfindungsgemäße Polypeptid binden, ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kaninchen, Affe, Schaf, Ziege, Maus, Ratte, Schwein, Pferd und Meerschweinchen. Die Antikörper-produzierenden Zellen können Milz-Zellen oder periphere Blut-Lymphozyten sein.
Ein monoklonaler Antikörper oder Fragmente davon können gegen eine essentielle Komponente des Polypeptids, d. h. ein Epitop, gebildet werden. Der monoklonale Antikörper kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken (Köhler und Milstein, 1975) unter Verwendung einer Hybridom-Zellinie oder durch Klone oder Subklone hiervon oder durch Zellen, die die genetische Information aus der Hybridom-Zellinie, die den monoklonalen Antikörper produziert, tragen, hergestellt werden. Der monoklonale Antikörper kann durch Verschmelzen von Zellen, die den monoklonalen Antikörper produzieren, mit Zellen einer geeigneten Zellinie und Klonieren der resultierenden Hybridom- Zellen, die den monoklonalen Antikörper produzieren, hergestellt werden. Alternativ kann der monoklonale Antikörper durch Immortalisierung einer unverschmolzenen Zellinie, die den monoklonalen Antikörper produziert, hergestellt werden. Die monoklonalen Antikörper werden schließlich aus dem Zellwachstumsmedium geerntet. Die zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers eingesetzten Hybridomzellen können in vitro oder in der Körperhöhle eines Tieres herangezogen werden. Der monoklonale Antikörper oder Fragmente davon kann auch unter Anwendung der DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden (Huse et al., 1989).
Monoklonale Antikörper können auch durch Immunisieren der geeigneten Tiere mit einer ungereinigten Präparation des erfindungsgemäßen Polypeptides hergestellt werden. Die resultierenden Hybridom-Klone, die monoklonale Antikörper sezer nieren, sollten auf ihre Fähigkeit überprüft werden, das/die Polypeptid(e) oder seine Analoga zu binden.
Für die Zwecke, bei denen keine hohe Spezifität erforderlich ist, kann der Antikörper ein polyklonaler Antikörper sein. Polyklonale Antikörper können erhalten werden, z. B. wie beschrieben bei Harboe und Ingild, siehe oben. Insbesondere wenn polyklonale Antikörper erhalten werden sollen, wird das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Analogon davon vorzugsweise nach Zugabe eines geeigneten Hilfsstoffes wie Freunds Inkomplett- oder Komplett-Medium in ein Tier injiziert. Den Tieren wird regelmäßig Blut abgenommen, beispielsweise in wöchentlichen Zeitabständen, und das erhaltene Blut wird in eine Antikörper-haltige Serum-Fraktion getrennt, und gegebenenfalls wird die Fraktion weiteren herkömmlichen Verfahren zur Antikörper-Reinigung und/oder Verfahren, die die Verwendung des gereinigten Polypeptids oder eines Analogons davon umfassen, unterworfen.
Der Antikörper kann auch ein Anti-Anti-Idiotyp-Antikörper sein, der gegen einen Anti-Idiotyp-Antikörper gerichtet ist, der ein gegen die Stelle eines Antikörpers gerichteter Antikörper ist, die mit dem Epitop des Antigens reaktiv ist. Der Anti-Idiotyp-Antikörper kann durch ein ähnliches Verfahren wie dasjenige, das vorstehend für den monoklonalen oder polyklonalen Antikörper beschrieben worden ist, hergestellt werden.
Im Umfang der Erfindung liegt ein Antikörper, der an eine Substanz oder ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, bindet, insbesondere ein Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys- Ile-Arg-Asn bindet.
Im weiten Sinn betrifft die Erfindung somit eine Substanz, die in der Lage ist, eine oder mehrere der hIL-10-Aktivitäten a) bis i) zu neutralisieren, d. h. mit hIL-10-antagonistischer Aktivität, wie beispielsweise ein Antikörper mit diesen Eigenschaften. Ein monoklonaler Antikörper 19F1 (82), der spezifisch an IL-10 zu binden vermag, ist bekannt und kann endogenes IL-10 blockieren, das von LPS-stimulierten Monozyten produziert wird, s. Tabelle 1 (82). Dieser Antikörper erkennt das nativ gefaltete IL-10, aber nicht notwendigerweise eine ganze funktionsfähige Domäne; allerdings bindet dieser Antikörper nicht spezifisch an IT9302.
Im Umfang der Erfindung liegt auch ein pharmazeutisches Präparat, das eine solche Substanz enthält, sowie ein pharmazeutisches Präparat, das eine erfindungsgemäße Substanz oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält.
Ein sehr wichtiger Aspekt der Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat, das eine Substanz mit hIL-10-agonistischer oder hIL-10-antagonistischer Wirkung, wie oben definiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff enthält. Das Präparat kann beispielsweise gereinigtes synthetisiertes Protein oder ein gereinigtes rekombinantes Polypeptid, einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder jede andere Substanz, die die Kriterien a) bis i) erfüllt, oder die, wenn sie hIL-10-antagonistische Wirkung besitzt, eine oder mehrere der hIL-10-Aktivitäten a) bis i) zu neutralisieren vermag, enthalten.
Der erfindungsgemäß eingesetzte IL-10-Agonist oder -Antagonist kann als Formulierung in pharmazeutisch verträglichen Medien hergestellt werden, beispielsweise in Salzlösung, Phosphat-gepufferter Salz-Lösung (PBS), Ringer-Lösung, Dextrose/Salzlösung, Hank-Lösung und Glucose. Die Präparaten können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen, wie sie zur Annäherung an die physiologischen Bedingungen erforderlich sind, enthalten, wie Puffer, Tonus-Regulatoren, Netzmittel, Detergenzien und dergleichen. Die Zusatzstoffe können auch zusätzliche Wirkstoffe enthalten, z. B. Bakterizide oder Stabilisatoren. Die dem Patienten verabreichte Menge schwankt in Abhängigkeit dessen, was verabreicht wird, des Zwecks der Verabreichung wie Prophylaxe oder Therapie, des Zustands des Wirtes, der Art der Verabreichung und dergleichen.
Die pharmazeutischen Präparate sind typischerweise zur transdermalen oder parenteralen Verabreichung vorgesehen, z. B. intravenös, subkutan oder intramuskulär. Orale Verabreichungsformen sind ebenfalls erwünscht und können durch Modifizieren der Präparat, um den Magen zu passieren, bereitgestellt werden. Das Präparat kann zur prophylaktischen und/ oder therapeutischen Behandlung eingesetzt werden. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate intravenös verabreicht. Somit stellt die Erfindung Präparate bereit, die eine IL-10-agonistische oder antagonistische Substanz, aufgelöst oder suspendiert in einem verträglichen Trägerstoff, vorzugsweise einem wäßrigen Trägerstoff, enthalten. Diese Präparate können durch herkömmliche Sterilisationstechniken sterilisiert werden oder können steril filtriert werden.
Die resultierenden wäßrigen Lösungen können so oder lyophilisiert zur Verwendung verpackt werden, wobei die lyophilisierte Präparation vor der Verabreichung mit einem sterilen wäßrigen Trägerstoff kombiniert wird. Der IL-10-Agonist oder -Antagonist kann auch mit einem zweiten biologischen Wirkstoff, wie einem Standard-Chemotherapeutikum, verabreicht werden. Solche Mittel umfassen Vincristin, Daunorubicin, L-Asparaginase, Mitoxantron und Amsacrin, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Bei den therapeutischen Anwendungen werden die pharmazeutischen Präparate einem Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung hervorzurufen, und sie wird als "therapeutische Wirkdosis" definiert. Die therapeutische Wirkdosis eines IL-10-Agonisten oder -Antagonisten schwankt in Abhängigkeit beispielsweise von der bestimmten Verwendung, für die die Behandlung erfolgt, der Verabreichungsart, der Gesundheit und dem Zustand des Patienten und von dem Urteil des verschreibenden Arztes. Beispielsweise liegt die Dosis zur kontinuierlichen Infusion typischerweise im Bereich von etwa 500 ng bis etwa 800 ug pro Tag für einen 70 kg schweren Patienten, vorzugsweise zwischen etwa 10 ug und etwa 300 ug. Die Dosis liegt typischerweise zwischen 700 ng/kg/Tag und 16 ug/kg/Tag.
Die Konzentration des IL-10-Agonsisten oder -Antagonisten in den pharmazeutischen Formulierungen kann breit variieren, d. h. von etwa 10 ug bis etwa 5 mg/ml, vorzugsweise zwischen etwa 100 ug und etwa 2 mg/ml. Die Konzentration wird im allgemeinen hauptsächlich über Fluid-Volumina, Viskositäten, etc. gemäß der bestimmten ausgewählten Verabreichungsart ausgewählt. So könnte ein typisches pharmazeutisches Präparat zur intravenösen Infusion so hergestellt sein, daß es 250 ml Dextrose/Salzlösung und 2,5 mg IL-10-Agonist oder -Antagonist enthält.
Für feste Präparate können die üblichen, nicht toxischen festen Trägerstoffe eingesetzt werden, die beispielsweise pharmazeutisch reines Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen umfassen. Zur oralen Verabreichung wird ein pharmazeutisch verträgliches, nichttoxisches Präparat durch Einarbeiten der normalerweise eingesetzten Hilfsstoffe, wie der zuvor aufgeführten Trägerstoffe, und im allgemeinen 10-95% Wirkstoff, d. h. eine IL-10-agonistische oder -antagonistische Substanz, vorzugsweise 25-75%, gebildet.
Zur Aerosol-Verabreichung wird der IL-10-Agonist oder -Antagonist vorzugsweise in fein zerteilter Form zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel und einem Treibmittel bereitgestellt. Typische Prozentgehalte von IL-10-Agonist oder -Antagonisten sind 0,01-20 Gew.-%, vorzugsweise 1-10%. Das oberflächenaktive Mittel muß natürlich nichttoxisch und vorzugsweise in dem Treibmittel löslich sein. Repräsentativ für solche Mittel sind die Ester oder Teil-Ester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoff-Atomen wie Capronsäure, Octansäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Olesterinsäure und Oleinsäuren mit einem aliphatischen Polyalkohol oder sein cyclisches Anhydrid, wie beispielsweise Ethylenglycol, Glycerin, Erythrit, Arabit, Mannit, Sorbit, die von Sorbit abstammenden Hexit-Anhydride und die Polyoxyethylen- und Polyoxypropylen-Derivate dieser Ester. Gemische Ester, wie gemischte oder natürliche Glyceride, können eingesetzt werden.
Das oberflächenaktive Mittel kann 0,1-20 Gew.-% des Präparates, vorzugsweise 0,25-5%, ausmachen. Der Rest des Präparates ist üblicherweise Treibmittel. Die verflüssigten Treibmittel sind bei Umgebungsbedingungen typischerweise Gase und werden unter Druck kondensiert. Unter den geeigneten verflüssigten Treibmitteln sind die niederen Alkane mit bis zu 5 Kohlenstoffen wie Butan und Propan und vorzugsweise fluorierte oder chlorfluorierte Alkane. Gemische der Obigen können ebenfalls eingesetzt werden. Bei der Herstellung des Aerosols wird ein mit einem geeigneten Ventil ausgestatteter Behälter mit dem geeigneten Treibmittel befüllt, das das(die) fein zerteilte(n) Polypeptid(e) und das oberflächenaktive Mittel enthält. Die Bestandteile werden also unter erhöhtem Druck gehalten, bis sie durch Betätigung des Ventils freigesetzt werden.
Zur Verlängerung der Serum-Halbwertszeit kann der IL-10- Agonist oder -Antagonist eingekapselt, in das Lumen von als Kolloid hergestellten Liposomen eingebracht werden, oder es können andere herkömmliche Techniken eingesetzt werden, die eine verlängerte Halbwertszeit der Polypeptide liefern. So kann bei bestimmten Ausführungsformen der IL-10-Agonist oder -Antagonist in einem Liposom eingekapselt sein. Zur Herstellung von Liposomen sind eine Vielzahl von Methoden verfügbar, wie beschrieben in z. B. (83), (84), (85) und (86).
Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung betrifft also die Verwendung einer Substanz zur Verminderung oder Neutralisation einer hohen hIL-10- oder vIL-10-Konzentration, wie beispielsweise die Verwendung einer Substanz mit hIL-10- antagonistischen Eigenschaften zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung oder Prophylaxe von Ovarialkrebs und/oder AIDS (87, 19).
Im Umfang der Erfindung liegt auch ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Ovarialkrebs und/oder AIDS, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutischen oder prophylaktisch wirksamen Menge einer hIL-10-antagonistischen Substanz an einen behandlungsbedürftigen Patienten sowie die Verwendung einer Verbindung mit einer hIL-10-antagonistischen Wirkung zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung oder Prophylaxe von Ovarialkrebs und/oder AIDS umfaßt.

Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz

Erfindungsgemäß wurde, wie vorstehend beschrieben, gefunden, daß IT9302 und Analoga und Varianten hiervon zur Prävention von Wirkungen von Cytokinen, die als pathogen bekannt und an den zuvor beschriebenen pathologischen Zuständen beteiligt sind, geeignet sind.
Darum werden die Möglichkeiten einer Therapie unter Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids oder der Analoga oder der Derivate hiervon betrachtet und sollten bei allen Erkrankungen, bei denen eine therapeutische Wirkung von hIL-10 und/ oder IRAP erwartet wird, überprüft werden (siehe oben, Tabelle 3).
Sehr wichtige Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Behandlung oder Prophylaxe von einer oder mehreren der in Tabelle 3 erwähnten Krankheiten, die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz oder eines erfindungsgemäßen Polypeptides zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung oder Prophylaxe von einer oder mehreren der in Tabelle 3 erwähnten Krankheiten sowie ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von einer oder mehreren der in Tabelle 3 erwähnten Krankheiten, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Substanz oder eines erfindungsgemäßen Polypeptides an einen behandlungsbedürftigen Patienten umfaßt.
Ein bedeutender Aspekt der Erfindung besteht somit in der Verwendung von IT9302 oder eines funktionellen Derivates davon zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur deutlichen Hemmung einer biologischen Wirkung bei einem Menschen, die mit einem Cytokin wie einem Lymphokin, Interleukin, Monokin, Chemokin, Interferon, dem Kolonie-stimulierenden Faktor, Prostaglandin und/oder Leukotrien zusammenhängt, zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung des Cytokin-Systems wie Lymphokin, Interleukin, Monokin, Chemokin, Interferon oder dem Kolonie-stimulierenden Faktorsystem und/oder mit einer Störung im Prostaglandin- und/oder Leukotrien-System im Zusammenhang steht. Wie hier verwendet, umfaßt die Bezeichnung "pharmazeutisches Präparat" jedes Präparat, das für den menschlichen Gebrauch, wie vorstehend ausführlich beschrieben, geeignet ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von IT9302 oder eines funktionellen Derivates davon zur
- deutlichen Hemmung einer mit einem Cytokin zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Cytokin-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Interleukin zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Interleukin-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Monokin zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Monokin-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Chemokin zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Chemokin-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Lymphokin zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Lymphokin-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Interferon zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Interferon-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Kolonie-stimulierenden Faktor zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Kolonie-stimulierenden Faktor-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Prostaglandin zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Prostaglandin-Systems zusammenhängt; und/oder
- deutlichen Hemmung einer mit einem Leukotrien zusammenhängenden biologischen Wirkung bei einem Menschen zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung, die mit einer Störung eines Leukotrien-Systems zusammenhängt.

LEGENDE FÜR DIE FIGUREN

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen von mIL-10, hIL-10 und BCRFI. Die Aminosäuresequenz-Übereinstimmungen sind durch vertikale Striche gekennzeichnet.
Fig. 2 zeigt die COOH-terminalen Polypeptid-Sequenzen von IL-10, die 9 Aminosäuren enthalten, und einen Vergleich von Schweine-, Menschen-, BCRFI- und Maus-Protein.
Fig. 3 ist ein Diagramm und zeigt, daß IT9302 spontan die IL-8-Produktion durch gereinigte, kultivierte, menschliche Monozyten hemmt.
Fig. 4 ist ein Diagramm und zeigt, daß IT9302 die IL-1-induzierte (1 ng/ml) IL-8-Produktion durch menschliche, periphere, einkernige Blutzellen hemmt.
Fig. 5 erläutert die IRAP-Produktion durch IT9302-stimulierte menschliche Monozyten.
Fig. 6 erläutert die IRAP-Produktion durch IL-10-stimulierte menschliche Monozyten.
Fig. 7 erläutert die chemotaktische Wirkung von IT9302 auf CD8-pos.-T-Zellen.
Fig. 8 erläutert die Desensibilisierung von CD8-pos.-T-Zellen durch IT9302, was zu einer Nichtreaktivität von CD8-pos.-T- Zellen auf eine IL-10(10 ng/ml)-induzierte Chemotaxis führt.
Fig. 9 erläutert die Suppression der IL-8-Wirkung durch IT9302.
Fig. 10 ist ein Diagramm und zeigt, daß IT9302 die MCAF/MCP-1-induzierte Monozyten-Chemotaxis hemmt.
Fig. 11 zeigt die IL-4-Produktion in CD4-pos.-T-Zellen-Cytosolfraktionen an Hand eines ECL-Westernblot.
Fig. 12 zeigt die TNF-α-Produktion in einer gemischten menschlichen Lymphozyten-Kultur aus Cytosol-Fraktionen an Hand von ECL-Westernblot. Der TNF-α-Westernblot wurde wie der unter "Materialien und Methoden" beschriebene IL-4-Westernblot durchgeführt, allerdings unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-Human-TNF-α-Antikörpers (Pepro Tech. Inc., London, England) und eines Meerrettich-Peroxidase-markierten zweiten Antikörpers (Kat.no. P 217, Dako, Denmark).
Fig. 13 zeigt, daß der LPS-induzierte Schock und die LPS-induzierte Leukopenie durch IT9302 moduliert werden, was durch die Bestimmung der Leukozyten-Gesamtzahl gezeigt wird.

BEISPIELE

Materialien und Methoden

Cytokine und Chemoattraktoren

Rekombinantes hIL-10 wurde von der Firma Pepro Tech. Inc., NJ. (Kat.No.200 10) erhalten. Rekombinantes hIL-1β und rekombinantes hIL-8 waren eine freundliche Spende der Firma Dainippon Pharmaceutical Company, Osaka, Japan. Das Kulturmedium war RPMI 1640, GIBCO, LPS-frei gemäß Limulus-Test (Sigma E-TOXATE-Kit Kat. Nr. 210-A1). rhMCAF/MCP-1 war eine freundliche Spende von Professor Kouji Matsushima, Kanazawa, Japan.

Leukozyten-Chemotaxistest

T-Zellen-Chemotaxis

CD4-pos.- und CD8-pos.-T-Lymphozyten-Untereinheiten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie entweder CD4- oder CD8- Antigene exprimieren, wurden auf heparinisiertem Blut norma ler Spender gereinigt. Somit wurden periphere, einkernige Blutzellen (PBMC) aus dem heparinisierten Blut durch Verdünnen von 100 ml des Blutes mit ausgewogener Bank-Lösung (HBSS) 1 : 1 und anschließendem Trennen durch Schichten der Zellen auf LymphopacTM (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen), gefolgt von einer Gradientenzentrifugation bei 2000 U/min für 20 min. gereinigt. Die einkernigen Zellen wurden dreimal in HBSS gewaschen, und das Zell-Pellet wurde in 4 ml HBSS, die 1% fetales Kälberserum enthielt, verdünnt und bei 4ºC unter Verwendung von Dynabeads, beschichtet mit monoklonalen Antikörpern gegen das CD4- oder CD8-Antigen (Dynabeads M-450 CD4 Kat. Nr. 111.16, Dynabeads M-450 CD8 Kat. Nr. 111.08, DETACHaßEAD Kat. Nr. 125.04), sortiert. Das Kügelchen : Zellen- Verhältnis betrug 10 : 1 und die Inkubationszeit 1 Stunde. Die Kügelchen wurden durch Zugabe von polyklonalem Anti-Maus- Antikörper gemäß den Anleitungen des Herstellers abgelöst.
Der Chemotaxis-Test war ein Verfahren mit einer Mikrokammer mit 48 Vertiefungen (Neuroprobe, Rockville, MD), wie bereits beschrieben (74; siehe Ref.3 und Ref.14). Die Chemoattraktoren wurden in RPMI 1640 (GIBCO Kat. Nr. 61870-010) mit 1% steril filtriertem fetalem Kälberserum verdünnt und in die untere 25-ul-Kammer eingefüllt. Zur Bestimmung der T-Zellen- Chemotaxis wurden die T-Zellen (5 · 10&sup6;/ml) in Medium suspendiert, und 50 ul wurden in die obere Kammer gegeben, die von der unteren Kammer durch ein, Polyvinylpyrrolidon-freies Polycarbonatfilter von 5 um Porengröße (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) beschichtet mit Typ-IV-Collagen (Sigma Kat. Nr. C 0543) getrennt war. Die Zellen wurden 2 h bei 37ºC unter 5% CO&sub2; wandern gelassen. Die Filter wurden anschließend sorgfältig entnommen, in 70% Methanol fixiert und 5 min. in Coomassie-Brilliantblau angefärbt. Die an der unteren Fläche des Filters anhaftenden Zellen wurden gezählt, indem ihre Fläche unter Verwendung einer Videokamera auf dem Mikroskop gemessen wurde, das an ein Computersystem zur digitalen Analyse angeschlossen war, das durch Software zur objektiven Bestimmung der chemotaktischen Migration unterstützt wurde. Ungefähr 5% der T-Zellen wandern spontan, was 12000 bis 13000 Zellen entspricht. Dies kann von Tag zu Tag, allerdings sehr wenig bei den Experimenten am selben Tag, schwanken. Wie bereits früher beschrieben (Ref. 3 und Ref. 14), wurde darum beschlossen, die Ergebnisse als Verhältnis zwischen der Anzahl der Zellen, die in der Probe und in der negativen Kontrolle wandern, anzugeben, was die spontane Migration wiedergibt. Dieses Verhältnis wird als Chemotaxis-Index (CI) bezeichnet. Sämtliche Proben wurden in dreifacher Ausführung analysiert, und die Zellmigration in jeder Vertiefung wurde in 3 Feldern gemessen, bevor der Mittelwert der Fläche bestimmt wurde. Bei einigen Experimenten war die Chemotaxis- Membran nicht mit Collagen beschichtet, und darum sinken in diesem vorliegenden Testsystem die wandernden Zellen auf den Boden der unteren Vertiefung der Chemotaxis-Kammer.
Bei einem Experiment wurde die chemotaktische Wirkung von IT9302 auf CD8-pos.-T-Zellen getestet, indem serielle, in die untere Kammer eingefüllte Verdünnungen von IT9302 getestet wurden und die Chemotaxis wie vorstehend beschrieben bestimmt wurde.
Bei einem zweiten Experiment wurde die Fähigkeit von IT9302 zur Desensibilisierung der Migration von CD8-pos.-T-Zellen als Reaktion auf rhIL-10 (10 ng/ml) durch Zugabe von IT9302 zu den Zielzellen 30 min vor der Chemotaxis geprüft. IT9302 wurde in seriellen Konzentrationen zugegeben, und die chemotaktische Reaktion von rhIL-10 wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt.
Bei einem dritten Experiment wurde die Fähigkeit von IT9302 zur Suppression der chemotaktischen Reaktion von CD4-pos.-T- Zellen auf rhIL-8 (10 ng/m) durch Zugabe von IT9302 zu den Zielzellen 30 min vor Durchführung der Chemotaxis geprüft. IT9302 wurde in seriellen Konzentrationen zugegeben, und die chemotaktische Reaktion von rhIL-8 wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt.

Monozyten-Chemotaxis

Die Monozyten-Chemotaxis wurde unter Verwendung desselben Boyden-Kammer-Gerätes, wie vorstehend für die T-Zellen beschrieben, gemessen. Der Chemoattraktor MCAF/MCP-1 wurde in RPMI-1640-Medium mit 0,5% RSA verdünnt und in einer Konzentration von 10 mg/ml in die untere Kammer gegeben. Durch standardmäßige Kunststoff-Hafttechnik gereinigte Monozyten aus normalen menschlichen PBMC, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, wurden in RPMI-1640-Medium mit 0,5% RSA suspendiert und anschließend in Gegenwart von IT9302 bei unterschiedlichen Konzentrationen 30 min. inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in einer Konzentration von 106 Zellen/ml zu den oberen Chemotaxis-Kammern gegeben. Die oberen und unteren Kammern wurden durch ein Polyvinylpyrrolidon-freies Polycarbonat-Filter von nur 8 um Porengröße (Nucleopore, Pleasanton, CA) getrennt. Die Kammer wurde bei 37ºC 90 min inkubiert. Die Membran, die die wandernden Zellen enthielten, wurden wie vorstehend beschrieben behandelt, und ein Chemotaxis-Index nach der vorstehenden beschriebenen Technik berechnet.

Produktion von IL-8 durch normale periphere einkernige menschliche Zellen (PBMC)

PBMC wurde aus heparinisiertem Blut normaler menschlicher Spender gereinigt. Nach der Gradientenzentrifugation mit LymphoprepTM (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen) wurden die einkernigen Zellen in LPS-freiem RPMI-1640-Medium (Gibco Kat. Nr. 6187-010), das 1% steril filtriertes, wärmeinaktiviertes fetales Kälberserum und Penicillin (10 000 IE/ml), Streptomycin (10 mg/ml) und Gentamycin (2,5 mg/ml) enthielt, auf 2 · 10&sup6; Zellen/ml verdünnt. Die Zellen wurden in Nung-Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen (Nung, Dänemark) und in Gegenwart von verschiedenen IT9302-Konzentrationen (0,1 ug, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, 0,01 ng/ml) 24 h kultiviert. Nach der 24-stündigen Inkubation wurde nochmals eine weitere Dosis IT9302 zugesetzt, und 1 h später wurde den Zellkulturen rhIL-1β (1 ng/ml) zugesetzt. Die Überstände wurden nach insgesamt 48 h Inkubation gesammelt, und die Konzentration des sezernierten IL-8 wurde durch IL-8-ELISA unter Verwendung eines IL-8-ELISA-Kits (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japan) gemessen. Kurz gesagt, wurden Standards und Zellüberstände 1 h und in doppelten Ausführungen bei 20ºC auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler inkubiert. Anschließend nach dem Waschen wurde ein zweiter Antikörper 1 h lang zugesetzt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Peroxidase-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG. Nach dem Waschen wurde die Reaktion mit O-Phenylendiamin entwickelt. 30 min später wurde die Reaktion mit 1,6 N Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte (OD) wurde in einem ELISA-Lesegerät bei 490 nm gemessen. Die IL-8-Konzentration wurde mit einer Absorptions-Eichkurve für unbekannte Konzentrationen im Vergleich zu einer Absorptions-Eichkurve von Konzentrationen von IL-8-Standards berechnet.

Bestimmung der IRAP-Konzentration

PBMC wurden wie vorstehend beschrieben gereinigt. Die PBMC wurden in RPMI 1640, 10% sterilem, wärmeinaktiviertem, fetalem Kälberserum (einschließlich Penicillin 10 000 IE/ml, Streptomycin 10 mg/ml, Gentamycin 2,5 mg/ml) kultiviert, und die Zellkonzentration betrug 5 · 10&sup6; Zellen/ml. Die Monozyten wurden anschließend durch eine standardmäßige Kunststoff- Hafttechnik gereinigt. Die Monozyten wurden anschließend in RPMI 1640 mit 2% FCS (2,5 · 10&sup6; Zellen/ml) mit unterschiedlichen Verdünnungen von rhIL-10 oder IT9302 kultiviert. Die Zellen wurden 24 h stimuliert und die Überstände zur IRAP- Bestimmung gesammelt. Die IRAP-ELISA wurde unter Verwendung eines menschlichen IL-1ra-Quantikin-Immuntest-Kit von R&D Systems Europa Ltd. (Kat. Nr. DRA 00,, Abingdon, Oxon, UK) durchgeführt.

Bestimmung der IL-4-Produktion durch CD4 pos.-T-Lymphozyten Zellkulturen

CD4-pos.-T-Lymphozyten wurden aus heparinisiertem normalem menschlichem Blut gereinigt. Nach der LymphoprepTM(Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen)-Gradientenzentrifugation wurden die einkernigen Zellen noch bei 4ºC sortiert, wobei Dynabeads (Dynal AS, Norwegen), beschichtet mit monoklonalen Anti-CD4- Antikörpern, verwendet wurden. Die Perlen wurden durch Zugabe von polyklonalem Anti-Maus-Antikörper (Dynal DAS, Norwegen) abgelöst. Die Reinheit der positiv ausgewählten Zellen waren höher als 99%, wie bewertet durch FACS-Analyse. Zur Überprüfung der De-novo-Produktion von IL-4 durch IL-8-stimulierte T-Zellen wurden die T-Zellen bei 5 · 10&sup6; Zellen/ml in LPS-freiem RPMI 1640 (Gibco, Kat. Nr. 61870-010), das 1% steril filtriertes, wärmeinaktiviertes fetales Kälberserum (FCS), Penicillin (10 000 IU/ml), Streptomycin (10 mg/ml) und Gentamycin (2,5 mg/ml) enthielt, kultiviert. Die T-Zellen wurden unter Verwendung von rIL-8 (100 ng/ml), rIL-10 (100 ng/ml), IT9302 (10 ng/ml) und IFN-γ (10 ng/ml) 3 Tage stimuliert. Rekombinantes menschliches IL-8 (rhIL-8) war eine freundliche Spende der Firma Dainippon Pharmaceuticals Co. Ltd., Osaka, Japan, und IFN-γ wurde von der Firma Boehringer Ingelheim am Rhein, Deutschland, bezogen. Um eine spezifische Hemmung der IL-8- Stimulation zu erhalten, wurde ein neutralisierender monoklonaler Anti-IL-8-Antikörper (WS.4) verwendet (eine freund liche Spende von Dr. K. Matsushima, Japan). Rekombinantes IL-10 wurde von der Firma Peptro Techn. Inc. (London, England) bezogen.

Präparation von Zellmaterial und Kulturüberstand für die Gelelektrophorese

T-Zellkulturen und Kulturmedium wurden durch Zentrifugation bei 2000 U/min für 5 min getrennt. Die Überstände wurden gefriergetrocknet und anschließend in 100 ul Lysepuffer aufgelöst. Die Zellen wurden direkt in 100 ul Gel-Lysepuffer resuspendiert (9). Das Material wurde bis zur weiteren Überprüfung bei -80ºC aufbewahrt.

ECL-Westernblot von Proteinen, die aus CD4-pos.-T-Zellen stammen

Zellen oder gefriergetrocknete Zellkultur-Überstände wurden zur IL-10-Protein-Gehaltsbestimmung verwendet. Die Proteine von eindimensionalen 15%igen SDS-PAGE-Gelen wurden durch Blotting auf Hybond-ECL-Nitrocellulose-Membranen (Amersham RPN 2020D, UK) übertragen und mit 5% Rinderserum-Albumin (Sigma) in Tris-Puffer, pH 7,8, der 0,1% Tween-20 enthielt, blockiert. Die Blots wurden anschließend mit einem polyklonalen Ziegen-Anti-Human-IL-4-Antikörper (R&D Systems, UK) und anschließend mit einem Meerrettich-Peroxidase-markierten zweiten Antikörper (Kat. Nr. RPN 1206 ECL, Amersham, UK) inkubiert, und anschließend wurde die Immunanfärbung durch 90-sec-Exposition eines Films (Kodak X-OMAT-S, USA) nachgewiesen.

Spezifität der IT9302-Aminosäuresequenz

Die Suche nach einer möglichen Homologie der IP9302-Sequenz mit anderen bekannten Proteinen wurde durchgeführt, indem die EMBO-Protein-Datenbasis mit freundlicher Unterstützung von Dr. Henrik Leffers, Institute for Medical Biochemistry, University of Aarhus, Dänemark, abgefragt wurde.

Aminosäuresequenz-Spezifität von IT9302

Nach Information aus der EMBO-Protein-Datenbasis (Heidelberg) vom 10. Juni 1994 besitzt IT9302 mit einer Sequenz des menschlichen IL-10 eine Homologie von 100% und mit einer Sequenz eines aus dem Epstein-Barr-Virus stammenden Proteins, das mit vIL-10 identisch ist, eine Homologie von 75%. Andere Virus-Proteine wie der Phage T7 und der Tomatenmosaikvirus zeigten eine Übereinstimmung von 75% bzw. 85%.

Ergebnisse

Die Konzeption der Erfindung erfolgte im Oktober und November 1992, als ein Nonapeptid mit der Bezeichnung IT9302 nach der oben geschilderten Strategie konstruiert und die chemische Synthese des ersten Prototyps (IT9302) beschlossen und am 27. November 1992 durchgeführt wurde. Es wurde erwartet, daß dieses Nonapeptid immunmodulatorische Wirkungen ausüben sollte, von denen einige die IL-10-artige Wirkung nachstellen würden. Die folgenden Kontrollexperimente (Beispiele) wurden während dieser Zeit ebenfalls geplant. Die chemische Synthese von IT9302 wurde unter Verwendung eines automatischen Polypeptid-Synthesizers von der Firma Carlbiotech. Ltd. A/S, Dänemark als bezahlter Auftrag der Erfinder durchgeführt. Anschließend wurde das Protein über HPLC gereinigt, und durch HPLC wurde bestimmt, daß die Reinheit größer ist als 95%. Dies bestätigte, daß das synthetisiert Produkt mit dem von den Erfindern im Oktober und November 1992 konstruierten IT9302 identisch war.

BEISPIEL 1

IT9302-induzierte Hemmung der spontanen IL-8-Produktion durch menschliche Monozyten

Der Test wurde wie beschrieben in "Produktion of I1-8 durch normale menschliche periphere einkernige Zellen (PBMC)" durchgeführt. Die Monozyten wurden durch Kunststoff-Hafttechnik gereinigt, und 3,0 · 10&sup6; Zellen/ml wurden 40 h stimuliert. Wie in Fig. 3 gezeigt, hemmte IT9302 die Produktion von IL-8 durch Monozyten, und bei 0,1 ng/ml IT9302 wurde die I1-8-Produktion zu 35% der spontanen Produktion in vitro unterdrückt. Die Lebensfähigkeit der Zellen lag nach 1 Tag in Kultur immer über 80%, und die Zugabe von IT9302 beeinflußte weder in diesem noch in den folgenden Beispielen die Lebensfähigkeit bei irgendeiner IT9302-Konzentration zwischen 0,1 und 1 000 ng/ml (MW IT9302 : 1 127 Dalton, MW rhIL-10 vorhergesagt: 18 400 Dalton).

BEISPIEL 2

IT9302-induzierte Hemmung der IL-1β-induzierten IL-8-Produktion durch periphere menschliche einkernige Blutzellen (PBMC)

Der Test wurde wie beschrieben in "Produktion of I1-8 durch normale menschliche periphere einkernige Zellen (PBMC)" durchgeführt. Wie in Fig. 4 gezeigt, hemmte IT9302 dosisabhängig die IL-1β-induzierte Produktion von IL-8 durch menschliche einkernige periphere Blutzellen in vitro. Die Suppression der IL-8-Produktion erreichte bei IT9302-Konzentrationen zwischen 0,01 und 100 ng/ml ein Plateau.

BEISPIEL 3

IT9302-induzierte Produktion von Interleukin-1-Rezeptorblockerprotein (IRAP) durch menschliche Monozyten

Der Test wurde durchgeführt, wie in "Bestimmung der IRAP-Konzentration" beschrieben. Wie in Fig. 5 gezeigt, löste IT9302 dosisabhängig die Produktion von IRAP durch menschliche Monozyten aus. Die Produktion nahm drastisch zu, wenn IT9302-Konzentrationen über 10 ng/ml eingesetzt wurden. Fig. 6 zeigt die Induktion von IRAP durch rhIL-10, und da hIL-10 ungefähr 20-mal schwerer ist als IT9302, entsprechen 10 ng/ml IT9302 200 ng/ml 11-10 in der Molarität. Darum sind die Wirkungen von IT9302 und rhIL-10 vergleichbar und bezüglich der Induktion von IRAP bei geringeren Konzentrationen ungefähr gleich. Bei IT9302-Konzentrationen über 10 ng/ml nahm die Induktion von IRAP drastisch zu und erreichte Niveaus von ungefähr 700 ng/ml.

BEISPIEL 4

Die chemotaxische Wirkung von IT9302 auf menschliche CD8- pos.-T-Lymphozyten

Das Experiment wurde durchgeführt, wie beschrieben in "Leukozyten-Chemotaxistest". Wie in Fig. 7 gezeigt, löste IT9302 die chemotaktische Migration von menschlichen CD8-pos.-T- Lymphozyten in vitro aus, während auf CD4-pos.-T-Zellen keine Wirkung vorhanden war (Daten nicht gezeigt). Wiederum ist die in diesem Experiment gezeigte Wirkung von IT9302 mit der Wirkung von rhIL10 vergleichbar, wie sie bereits geschildert wurde (Ref. 14).

BEISPIEL 5

IT9302 desensibilisiert menschliche CD5-pos.-T-Zellen und führt zu einer Nicht-Reaktivität auf rhIL10

Das Experiment wurde durchgeführt, wie in "Leukozyten-Chemotaxistest" beschrieben. IT9302 wurde einer Suspension von CD8-pos.-T-Zellen 30 min. bevor diese Zellen auf ihre chemotaktische Reaktion auf rhIL10 getestet wurden, zugesetzt. Wie in Fig. 8 gezeigt, führt die Vorinkubation von Zellen mit IT9302 zu einer unterdrückten Reaktivität der CD8-pos.-T- Zellen auf rhIL-10. Dies zeigt, daß IT9302 die Bindung von rhIL-10 an den IL-10-Rezeptor beeinträchtigen kann.

BEISPIEL 6

IT9302 unterdrückt die chemotaktische Reaktion von CD4-pos.- T-Lymphozyten auf IL-8

Das Experiment wurde durchgeführt, wie in "Leukozyten-Chemotaxistest" beschrieben. Wie in Fig. 9 gezeigt, hemmt IT9302 dosisabhängig und als Zusatz zu einer Suspension von menschlichen CD4-pos.-T-Lymphozyten die Reaktion der CD4-pos.-T- Zellen auf IL-8.

BEISPIEL 7

IT9302 unterdrückt die chemotaktische Reaktion der menschlichen Monozyten auf MCAF/MFP-1

Das Experiment wurde durchgeführt, wie in "Leukozyten-Chemotaxistest" beschrieben. Wie in Fig. 10 gezeigt, hemmt IT9302 dosisabhängig und als Zugabe zu einer Suspension menschlicher Monozyten die chemotaktische Reaktion der Monozyten auf MCAF/MCP-1.

Diskussion der Experimente

Die vorliegenden Daten zeigen eine dosisabhängige inhibitorische Wirkung des synthetischen Nonapeptids IT9302 auf Pro zesse mit entzündungsfördernder Wirkung, einschließlich der IL-8-Produktion und der Monozyten- und/oder T-Zellen-Migration. Somit vermochte IT9302 die spontane Produktion von IL-8 durch menschliche, über Nacht kultivierte Monozyten zu unterdrücken. Dies konnte durch eine direkte inhibitorische Wirkung auf die IL-8-mRNA-Produktion und/oder durch eine anschließende Protein-Produktion und/oder Freisetzung erklärt werden. Ein weiterer Mechanismus könnte dadurch erklärt werden, daß in vitro kultivierte Monozyten IL-1 exprimieren und produzieren, das dann seinerseits die Produktion von IL-8 auslöst. Dies wird durch die Tatsache gestützt, daß gezeigt wurden, daß IT9302 wirksam die Produktion von IRAP durch Monozyten auslöst. IT9302 kann darum auch die spontane IL-8- Produktion durch Beeinträchtigung der Aktivität von IL-1 hemmen. Die beobachtete IRAP-Induktion durch IT9302 scheint ein biologisch wirksames IRAP hervorzubringen, da den Kulturen zugesetztes IT9302 der IL-1-induzierten IL-8-Produktion entgegenwirkt, allerdings nur, wenn die Zugabe wenigstens 16 h vor der Zugabe von IL-1 zu den Kulturen erfolgt. Dies könnte bedeuten, daß IT9302 die IL-1-induzierte IL-8-Produktion durch Induktion der Produktion von IRAP hemmt, das dann seinerseits die Wirkung von IL-1 über seinen Rezeptor blockiert. Falls IT9302 die IL-8-Produktion direkt hemmen würde, wäre zu erwarten gewesen, daß die Zugabe von IT9302 zu den Kulturen 1 h vor der IL-1-Zugabe die IL-8-Produktion hemmen sollte, was nicht der Fall war (Daten nicht gezeigt). Darum ist die beobachtete Hemmung der IL-8-Produktion durch IT9302 wahrscheinlich in einer Induktion der IRAP-Produktion statt in einer direkten Hemmung der IL-8-Produktion begründet. Diese Funktionen von IT9302 können auch für hIL-10 festgestellt werden, was anzeigt, daß IT9302 IL-10-artige Wirkungen besitzt. IT9302 stellt auch die IL-10-Wirkung nach, indem es die Fähigkeit der Migration von CD4-pos.-T-Zellen als Reaktion auf I1-8 unterdrückt. Da IL-8 mit vielen unterschiedlichen Entzündungszuständen im Zusammenhang steht und da die CD4-pos.-T-Zellen früh im Filtrat der T-Zell-vermittelten Immunentzündung, wie Allergie der Haut, auftreten, kann dieses Merkmal den Beweis für das Vorliegen eines signifikanten therapeutischen Wertes zur Kontrolle der T-Zell-vermittelten Immunentzündung liefern.
Die gezeigte chemotaktische Wirkung von IT9302 auf CD8-pos.- T-Zellen entspricht auch der Wirkung von IL-10, und IT9302 kann somit auch T-Zellpopulationen mit suppressiver Wirkung aktivieren, die zur Beendigung der T-Zell-vermittelten Immunentzündung beitragen. Darum besitzt IT9302 gemäß den vorstehend aufgeführten Beispielen einen therapeutischen Wert bei Krankheiten, bei denen IL-10 und/oder IRAP ebenfalls einen therapeutischen Wert besitzen können. Zusätzlich kann IT9302 therapeutischen Wert bei Krankheiten besitzen, bei denen eine pathogene Rolle von IL-8 und/oder MCAF und/oder IL-1 angenommen wird.

BEISPIEL 8

IT9302 und IL-10 Zösen die Produktion von IL-4 in CD4-pos.-T- Lymphozyten aus

Hintergrund

Wie IL-10 ist IL-4 ein Produkt der CD4-pos.-T-Zellen vom Typ TH2. Es wurde festgestellt, daß rekombinantes menschliches IL- 10 die Produktion von IL-4 durch kultivierte menschliche CD4- pos.-T-Zellen auslöst. Dies bedeutet, daß IL-10, abgesehen von seinen eigenen immunsuppressiven Funktionen, auch die Produktion eines anderen immunsuppressiven Cytokins, 11-4, auslöst. Es wurde daher geprüft, ob IT9302 ebenfalls die Produktion von IL-4 durch CD4-pos.-T-Zellen auslöst.
CD4-pos.-T-Zellen, die gereinigt wurden wie in "Methoden zur T-Zellen-Chemotaxis" beschrieben, und wie im Abschnitt "Bestimmung der IL-4-Produktion durch CD4-pos.-T-Lymphozyten" beschrieben, kultiviert wurden, wurden 3 Tage lang mit IT9302 (10 ng/ml) oder IL-10 (100 ng/ml) stimuliert. Die Cytosolfraktionen wurden gesammelt und auf ihren IL-4-Gehalt unter Anwendung von Westernblotting (Fig. 11) und eines polyklonalen Ziegen-Anti-Human-IL-4-Antikörpers analysiert.
Wie in Fig. 11 gezeigt, wurde festgestellt, daß IL-10 sowie IT9302 die Produktion von IL-4 durch kultivierte normale menschliche CD4-pos.-T-Zellen auslöst.

BEISPIEL 9

IT9302 hemmt die Produktion von TNF-α in einer Reaktion einer gemischten Leukozytenkultur (MLR)

Es wurde bewiesen, daß die Reaktion in einer gemischten Leukozytenkultur teilweise von der Produktion von TNF-α während der Reaktion abhängt. Es wurde gezeigt, daß IT9302 die MLR nicht wesentlich vermindert, allerdings wurde festgestellt, daß während der MLR eine wesentliche Verminderung in der Produktion von TNF-α erfolgt.
Somit wurde die MLR durch Reinigen menschlicher Leukozyten und anschließendes Kultivieren von 1 Million Zellen/ml aus allogenen Donoren für 4 Tage durchgeführt. Vor dem Herstellen der Kulturen wurde eine Gruppe von Zellen 2 min unter Verwendung von β-Strahlen bestrahlt. Die Cytosol-Proteinfraktionen wurden gereinigt, wie in dem Abschnitt "Bestimmung der IL-4-Produktion durch CD4-pos.-Lymphozyten" beschrieben, und das Westernblotting wurde unter Verwendung eines Kaninchen- Anti-Human-TNF-α-Antikörpers durchgeführt.
Wie in Fig. 12 gezeigt, wurde während einer Reaktion in einer gemischten menschlichen Leukozytenkultur eine wesentliche Verminderung in der Produktion von TNF-α festgestellt.

BEISPIEL 10

Die Modulation des LPS-induzierten Schocks und der Leukopenie in Schweinen unter Verwendung von IT9302

Da festgestellt wurde, daß IT9302 die Cytokin-Produktion, einschließlich der Produktion von TNF-α und I1-8, moduliert, und unterstützt durch die veröffentlichte Sequenz von Schweine-IL-10 (Blancho et al., 1995) (siehe Fig. 2 zur Homologle zu dem COOH-terminalen Peptid), wurde geprüft, ob IT9302 in der Lage war, den Verlauf der LPS-induzierten Leukopenie bei Schweinen zu modulieren (Fig. 13).
In einem Vorversuch wurde getestet, wie die intravenöse Injektion von IT9302, 0,1 mg/kg, die Wirkung einer intravenösen Injektion von 2 ug/kg LPS in Schweinen (N = 3) modulierte. IT9302 wurde 30 min vor der Injektion von LPS injiziert, und Blutproben wurden wie in Fig. 13 beschrieben entnommen. Die Leukozyten-Gesamtzahl sowie die differentielle Zellenzahl wurden bestimmt, und die Gesamtzahl der neutrophilen Leukozyten wurde auf der Grundlage dieser Ergebnisse berechnet.
Wie gezeigt, wurde festgestellt, daß die Injektion von LPS zu einer vorübergehenden Leukopenie führte. Die Injektion von IT9302 verhinderte allerdings die Leukopenie, wie in der Figur gezeigt.

BEISPIEL 11

Antikörper gegen das synthetische Polypeptid IT9302

Das synthetische Polypeptid IT9302 wurde in einer Reinheit von über 95% von der Firma Kem-En-Tec A/S Kopenhagen, Dänemark, bezogen. Dieses Polypeptid wurde vom Hersteller auch an Keyhole Limpet Hämocyanin (KHL) gekoppelt. Das lösliche IT9302/KLH ist immunogener als das Polypeptid allein, und es kann auch als Kontrollprotein für ELISA oder Westernblot eingesetzt werden.

Immunisierung von Kaninchen

250 ug IT9302, gekoppelt an KLH und als Emulsion in Freund- Komplettmedium wird für intradermale oder subkutane Injektionen verwendet. Die Injektionen werden viermal in zweiwöchigen Abständen wiederholt, und den Kaninchen wird 8 und 12 Tage danach Blut abgenommen. Spätere Booster-Injektionen mit 250 ug IT9302/KLH in Freund-Inkomplettmedium werden in einmonatigen Abständen unter Anwendung subkutaner Injektionen verabreicht. Die Bildung des IT9302-Antikörpers wird durch Dotblot-Immuntest oder Westernblot getestet.

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73. Carter, D.B., Deibel, M.R.Jr., Dunn, C.J., Tomich, C.S.C., Laborde, A. L., Slightom, J.L., Berger, A.E., Bienkowski, M.J., Sun, F.F., McEwan, R.N., Harns, P.K.W., Yem, A.W., Waszak, G.A., Chosay, J.G., Sieu, L.C., Hardee, M.M.&sub1; Zurcher Neely, H.A., Reardon, I.M., Heinrikson, R.L. et al. 1990. Purification, cloning expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein. Nature 344/6267: 633-638
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76. Sankoff and Kruskal in chapter 1 of "Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison" (Addison-Wesley, Reading, Mass. 1983).
77. Berzofsky, Science 229, (1985) 932-940
78. Bowie et al., Science 247, (1990) 1306-1310
79. Wasserman et al., J. Immunol. 87, 1961, 290-295
80. Levine et al., Methods in Enzymology 11, 1967, 928-936
81. Lewis et al., Biochemistry 22, 1983, 948-954
82. Rene de Waal Maletyt, John Abrahams, Bruce Bennet, Carl G. Figdor and Jan E. de Vries (1991), Interleukin 10 (IL-10) Inhibits Cytokine Synthesis by Human Monocytes: An Autoregulatory Role of IL-10 Produced by Monocytes. J. Exp. Med. 174, 1209-1220
83. Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 1980, 467
84. US Patent No. 4,235,871
85. US 4,501,728
86. US 4,837,028.
87. Walter H. Gotlieb, John S. Abrams, Joanna M. Watson, Thierry J. Velu, Jonathan S. Berek, Otoniel Martinez- Meza (1992), Presence of interleukin 10 (IL-10) in the ascites of patients with ovarian and other intraabdominal cancers. Gytokine 4, No. 5, 385-390
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Sequenzliste

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Nycomed DAK Als
(B) STRAßE: P.O. Box 1911, Lergraversvej 59
(C) STADT: Kopenhagen 5
(E) LAND: Dänemark
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): 2300
(ii) Titel der Erfindung: Immunmodulatoren
(iii) Anzahl der Sequenzen: 23
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) Medium Typ: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 < EPO)
(2) Information für SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NR. 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NR. 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 3:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) Hypothese: keine (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NR. 3:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:
(i) SEQUENZMERKMALE:
LÄNGE: 9 Aminosäuren
B) TYP: Aminosäure
C) STRÄNGIGKEIT:
D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: NO (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:
(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) Hypothese: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 7:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) Hypothese: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 8:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) Hypothese: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 9:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) Hypothese: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 10:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) Hypothese: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 11:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: NO (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 12:
(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG; SEQ ID NR. 12:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 13:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 13:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 14:
(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 14:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 15:
(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid.
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 16:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 17:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
B) TYP: Aminosäure
C) STRÄNGIGKEIT:
D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 18:
(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 18:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 19:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren '
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 19:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 20:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 20:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 21:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 21:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 22:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(iii) HYPOTHESE: keine (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 22:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 23:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHESE: keine
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 23:
GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC

Claims

1. Polypeptid mit einer Länge von höchstens 10 Aminosäureresten, das die folgende Sequenz enthält:

Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 19)

worin

X&sub4; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ile, Leu und Val; und

X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu,

und das wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist:

a) Auslösung der Hemmung der spontanen I1-8-Produktion durch menschliche Monozyten,

b) Auslösung der Hemmung der I1-1β-induzierten IL-8- Produktion durch menschliche, periphere, einkernige Blutzellen (PBMC),

c) Auslösung der Produktion von Interleukin-1-Rezeptorblockerprotein (IRAP) durch menschliche Monozyten,

d) Auslösung der chemotaktischen Migration von menschlichen CD8-pos.-T-Zellen in vitro,

e) Desensibilisierung von menschlichen CD8-pos.-Zellen unter Entstehung einer Nichtreaktivität auf rhIL-10,

f) Suppression der chemotaktischen Reaktion von menschlichen CD4-pos.-T-Lymphozyten auf IL-8,

g) Suppression der chemotaktischen Reaktion von menschlichen Monozyten auf MCAF/MCP-1,

i) Auslösung der Produktion von IL-4 durch kultivierte normale menschliche CD4-pos.-T-Zellen,

j) Verminderung der TNFα-Produktion in einer Reaktion einer gemischten menschlichen Leukozytenkultur.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Sequenz enthält:

X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 20),

worin

X&sub3;, X&sub4; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ile, Leu und Val; und

X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Sequenz enthält:

X&sub2;-X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 21),

worin

X&sub2; für Tyr oder Phe steht,

X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Sequenz enthält:

X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 22)

worin

X&sub1; für Ala oder Gly steht,

X&sub2; für Tyr oder Phe steht,

H&sub3;, X&sub4; und X&sub5; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Met, Ile, Leu und Val; und

X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu.

5. Polypeptid der Formel

X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 22),

worin

X&sub1; für Ala oder Gly steht,

X&sub2; für Tyr oder Phe steht,

X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu,

wobei das Polypeptid wenigstens eine der in Anspruch 1 definierten Eigenschaften aufweist.

6. Polypeptid der Formel

X&sub2;-X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 21),

worin

X&sub2; für Tyr oder Phe steht,

X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu, und

7. Polypeptid der Formel

X&sub3;-Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 20)

worin

wobei das Polypeptids wenigstens eine der in Anspruch 1 definierten Eigenschaften aufweist.

8. Polypeptid der Formel

Thr-X&sub4;-Lys-X&sub5;-Arg-X&sub6; (SEQ ID Nr. 19),

worin

X&sub6; ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Asp, Gln und Glu,

9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 4-6, wobei X&sub1; für Ala steht.

10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 4-6, wobei X&sub1; für Gly steht.

11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 3-6 oder 9-10, wobei X&sub2; für Tyr steht.

12. Polypeptid nach einem der Ansprüche 3-6 oder 9-10, wobei X&sub2; für Phe steht.

13. Polypeptid nach einem der Ansprüche 2-7 oder 9-12, wobei X&sub3; für Met steht.

14. Polypeptid nach einem der Ansprüche 2-7 oder 9-12, wobei X&sub3; für Ile steht.

15. Polypeptid nach einem der Ansprüche 2-7 oder 9-12, wobei X&sub3; für Leu steht.

16. Polypeptid nach einem der Ansprüche 2-7 oder 9-12, wobei X&sub3; für Val steht.

17. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-16, wobei X&sub4; für Met steht.

18. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-16, wobei X&sub4; für Ile steht.

19. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-16, wobei X&sub4; für Leu steht.

20. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-16, wobei X&sub4; für Val steht.

21. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-20, wobei X&sub5; für Met steht.

22. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-20, wobei X&sub5; für Ile steht.

23. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-20, wobei X&sub5; für Leu steht.

24. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-20, wobei X&sub5; für Val steht.

25. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-24, wobei X&sub6; für Asp steht.

26. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-24, wobei X&sub6; für Gln steht.

27. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-24, wobei X&sub6; für Glu steht.

28. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-24, wobei X&sub6; für Asn steht.

29. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1)

30. Polypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 2),

Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 3),

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu (SEQ ID Nr. 4),

Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 5),

Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 6),

Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 7),

Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 8),

Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 9),

Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 10),

Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 11),

Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 12),

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 13),

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 14),

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (SEQ ID Nr. 15),

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln (SEQ ID Nr. 16), und

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln (SEQ ID Nr. 17).

31. Substanz, die ein pharmazeutisch verträgliches Salz, ein pharmazeutisch verträglicher Ester oder ein Konjugat eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1-30 ist.

32. Substanz nach Anspruch 31, die ein Salz, ein Ester oder ein Konjugat des Polypeptides Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys- Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) ist.

33. Substanz nach Anspruch 32, wobei das Konjugat ein Zucker- Konjugat oder ein Polyethylenglycol-Konjugat von Ala-Tyr- Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) ist.

34. Polypeptid oder eine Substanz nach einem der Ansprüche 1- 33, die in ein Liposom eingekapselt ist.

35. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-30, die in ein Liposom eingekapselt ist.

36. Polypeptid nach Anspruch 35, die in ein Liposom eingekapselt ist, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) aufweist.

37. Polypeptid oder eine Substanz nach einem der Ansprüche 1- 33 in im wesentlichen reiner Form.

38. Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-30 kodiert.

39. Nucleotidsequenz nach Anspruch 38, die für ein Polypeptid nach Anspruch 3 oder 4 kodiert.

40. Nucleotidsequenz nach Anspruch 38, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) aufweist.

41. Vektor, der eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 38 oder 39 enthält.

42. Vektor, der eine Nucleotidsequenz nach Anspruch 40 enthält.

43. Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-30 bindet.

44. Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid mit der Formel Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) bindet.

45. Antikörper nach Anspruch 44, der ein polyklonaler Antikörper ist.

46 Antikörper nach Anspruch 44, der ein monoklonaler Antikörper ist.

47. Antikörper nach Anspruch 43, der in der Lage ist, wenigstens eine der folgenden Wirkungen zu neutralisieren:

a) Induktion der Hemmung der spontanen I1-8-Produktion durch menschliche Monozyten,

b) Induktion der Hemmung der I1-1β-induzierten IL-8-Produktion durch menschliche periphere einkernige Blutzellen (PBMC),

c) Induktion der Produktion von Interleukin-1-Rezeptorblockerprotein (IRAP) durch menschliche Monozyten,

d) Induktion der chemotaktischen Migration von menschlichen CD8-pos.-T-Lyphmozyten in vitro,

e) Desensibilisierung von menschlichen CD8-pos.-T-Zellen unter Entstehung einer Nichtreaktivität auf rhIL-10,

g) Suppression der chemotaktischen Reaktion von menschlichen Monozyten auf MCAF/MCP-1.

48. Antikörper nach einem der Ansprüche 44-46, wobei der Antikörper in der Lage ist, wenigstens eine der in Anspruch 47 definierten Wirkungen zu neutralisieren.

49. Antikörper nach einem der Ansprüche 43-48 zur medizinischen Anwendung.

50. Verfahren zur Verminderung oder Neutralisation einer hohen Konzentration von hIL-10 oder vIL-10, wobei das Verfahren die Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 43-48 umfaßt.

51. Pharmazeutisches Präparat, das ein Polypeptid oder eine Substanz nach einem der Ansprüche 1-36 enthält.

52. Pharmazeutisches Präparat, das einen Antikörper nach einem der Ansprüche 43-49 enthält.

53. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-36 zur medizinischen Anwendung.

54. Polypeptid zur medizinischen Anwendung nach Anspruch 53, wobei das Polypeptid die Formel Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys- Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) besitzt.

55. Polypeptid oder Substanz nach einem der Ansprüche 1-33 zur Anwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von wenigstens einer der folgenden Erkrankungen: vorzeitige Wehen durch Infektion oder andere Erkrankungen, rheumatoide Arthritis, Lyme-Arthritis, Gicht, septikämisches Syndrom, Hyperthermie, ulzerative Kolitis oder Enterokolitis, Osteoporose, Cytomegalie-Virus, Erkran kungen der Zahnwurzelhaut, Glomerulonephritis, chronische, nicht-infektiöse Entzündung der Lunge (z. B. Sarkoidose und Raucherlunge), Granulombildung, Fibrose der Leber, Fibrose der Lunge, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion, chronische myeloische Leukämie, akute myeloische Leukämie, weitere neoplasmatische Erkrankungen, Asthma bronchialis, Diabetes mellitus Typ I (Insulin-abhängig), Arteriosklerose/Atherosklerose, Psoriasis, chronische B-Lymphozyten-Leukämie, allgemeine veränderliche Immundefizienz, Nebenwirkungen bei Verwendung anderer Modifikatoren der biologischen Reaktionen, disseminierte, intravaskuläre Koagulation, systemische Sklerose, Enzephalomyelitis, Lungenentzündung, Hyper-IgE-Syndrom, Enterokolitis, Krebsmetastasis und Krebswachstum, übernommene Immuntherapie, erworbenes respiratorisches Atemnotsyndrom, Sepsis, Reperfusionssyndrom, postoperative Entzündung, Organtransplantation und Alopezie.

56. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-30 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von wenigstens einer der in Anspruch 55 aufgeführten Erkrankungen.

57. Verwendung eines Polypeptides oder einer Substanz nach einem der Ansprüche 1-33 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus vorzeitigen Wehen durch Infektion oder andere Erkrankungen, rheumatoider Arthritis, Lyme-Arthritis, Gicht, septikämischem Syndrom, Hyperthermie, ulzerative Kolitis oder Enterokolitis, Osteoporose, Cytomegalie-Virus, Erkrankungen der Zahnwurzelhaut, Glomerulonephritis, chronischen, nicht-infektiösen Entzündung der Lunge (z. B. Sarkoidose und Raucherlunge), Granulombildung, Fibrose der Leber, Fibrose der Lunge, Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion, chronische myeloische Leukämie, akuter myeloischer Leukämie, weiteren neoplasmatischen Erkrankungen, Asthma bronchialis, Diabetes mellitus Typ I (Insulin-abhängig), Arteriosklerose/ Atherosklerose, Psoriasis, chronischer B-Lymphozyten-Leukämie, allgemeiner veränderlicher Immundefizienz, Nebenwirkungen bei Verwendung anderer Modifikatoren der biologischen Reaktionen, disseminierter, intravaskulärer Koagulation, systemischer Sklerose, Enzephalomyelitis, Lungenentzündung, Hyper-IgE-Syndrom, Enterokolitis, Krebsmetastasis und Krebswachstum, übernommener Immuntherapie, erworbenem respiratorischem Atemnotsyndrom, Sepsis, Reperfusionssyndrom, postoperativer Entzündung, Organtransplantation und Alopezie.

58. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 1- 30 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung oder Prophylaxe von wenigstens einer der in Anspruch 53 aufgeführten Erkrankungen.

59. Verwendung eines Polypeptides nach Anspruch 58, wobei das Polypeptid die Formel Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID Nr. 1) besitzt.