DE69520149T2

DE69520149T2 - Tie-2 ligande, verfahren zu ihrer herstellung, und ihre anwendungen

Info

Publication number: DE69520149T2
Application number: DE69520149T
Authority: DE
Inventors: H. Aldrich; Joanne Bruno; Samuel Davis; Mitchell Goldfarb; F. Jones; C. Maisonpierre; Czeslaw Radziejewski; D. Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2001-08-30
Anticipated expiration: 2015-10-07
Also published as: EP0784683B1; US6433143B1; IL115517A; GR3035717T3; DK0784683T3; CZ102597A3; NO971557L; DE69520149D1; JPH10509583A; JP4054375B2; WO1996011269A2; ATE199259T1; IL140138A; HUT77491A; US5814464A; PL184642B1; CN1230536C; MX9702530A; HU221422B1; IL140137A

Description

EINLEITUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen den Bereich Gentechnik und im Besonderen Gene für Rezeptor- Tyrosinkinasen und deren verwandte Liganden, ihre Insertion in rekombinante DNA-Vektoren und die Herstellung der codierten Proteine in Mikroorganismen als Empfängerstämme und in eukaryontischen Empfängerzellen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das zelluläre Verhalten, welches für die Entwicklung, Erhaltung und Reparatur differenzierter Zellen und Gewebe verantwortlich ist, wird zu einem großen Teil durch interzellulärere Signale reguliert, die durch Wachstumsfaktoren und ähnliche Liganden und deren Rezeptoren übermittelt werden. Die Rezeptoren befinden sich auf der Zelloberfläche responsiver Zellen und binden Peptide oder Polypeptide, welche als Wachstumsfaktoren oder auch andere Hormonähnliche Liganden bekannt sind. Die Ergebnisse dieser Interaktion sind schnelle biochemische Veränderungen in den responsiven Zellen sowie eine schnelle und eine langfristige Reorganisation der zellulären Genexpression. Einige Rezeptoren, die sich auf unterschiedlichen Zelloberflächen befinden, können spezifische Wachstumsfaktoren binden.
Die Phosphorylierung von Proteinen an Tyrosinresten durch Tyrosinkinasen ist eines der Schlüsselereignisse, durch welche Signale über die Plasmamembran hinweg übermittelt werden. Einige gegenwärtig bekannte Protein-Tyrosinkinase-Gene codieren Transmembran-Rezeptoren für Polypeptid- Wachstumsfaktoren und Hormone wie den epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth factor; EGF), Insulin, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-I (insulin like growth factor-I; IGF-I), die von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktoren (platelet derived growth factors; PDGF-A und -B), und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (fibroblast growth factors; FGFs). (Heldin et al., Cell Regulation, 1: 555-566 (1990); Ullrich, et al., Cell, 61 : 243-54 (1990)). In jedem Fall üben diese Wachstumsfaktoren ihre Wirkung dadurch aus, dass sie an den extrazellulären Teil ihrer sie erkennenden Rezeptoren binden, was zur Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase führt, die sich innerhalb des cytoplasmatischen Teils des Rezeptors befindet. Aufgrund einer möglichen Beteiligung von Wachstumsfaktoren an mehreren wichtigen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Vaskulogenese, Angiogenese, Ateriosklerose und entzündlichen Erkrankungen (Folkman, et al., Science, 235: 442-447 (1987)), sind Wachstumsfaktor-Rezeptoren von Endothelzellen von besonderem Interesse. Auch die Rezeptoren einiger hämatopoetischen Wachstumsfaktoren sind Tyrosinkinasen; diese beinhalten c-fms, welches dem Kolonie-stimulierenden Faktor I- Rezeptor entspricht, Sherr, et al., Cell, 41: 665-676 (1985), und c-kit, ein einfacher hämatopoetischer Wachstumsfaktor- Rezeptor, der in Huang, et al., Cell, 63: 225-33 (1990) beschrieben ist.
Die Rezeptor-Tyrosinkinasen wurden aufgrund der charakteristischen Struktur ihrer Ektodomänen in evolutionäre Unterfamilien unterteilt (Ullrich, et al., Cell, 61, 243-54 (1990)). Solche Unterfamilien beinhalten die EGF-Rezeptorähnliche Kinase (Unterklasse I) und die Insulin-Rezeptorähnliche Kinase (Unterklasse TI), wovon jede wiederholt homologe Cystein-reiche Sequenzen in ihren extrazellulären Domänen enthält. Eine einzelne Cystein-reiche Region kann man auch in den extrazellulären Domänen der eph-ähnlichen Kinasen finden, Hirai, et al., Science, 238: 1717-1720 (1987); Lindberg, et al., Mol. Cell. Biol., 10: 6316-24 (1990); Lhotak, et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2496-2502 (1991). PDGF- Rezeptoren sowie c-fms- und c-kit-Rezeptor-Tyrosinkinasen können in Unterklasse III gruppiert werden, während die FGF- Rezeptoren die Unterklasse IV bilden. Typisch für die Mitglieder dieser beiden Unterklassen sind extrazelluläre Faltungseinheiten, die durch Disulfidbrücken innerhalb der Kette stabilisiert sind. Diese sogenannten Immunglobulin (Ig)- ähnlichen Faltungen werden bei den Proteinen der Immunglobulin-Superfamilie gefunden, welche eine große Vielfalt anderer Zelloberflächen-Rezeptoren enthält, die entweder zellgebundene oder lösliche Liganden haben; Williams, et al., Ann. Rev. Immunol., 6: 381-405 (1988).
Rezeptor-Tyrosinkinasen unterscheiden sich in ihrer Spezifität und Affinität. Im Allgemeinen sind Rezeptor- Tyrosinkinasen Glycoproteine, die sich wie folgt zusammensetzen; (1) eine extrazelluläre Domäne, die in der Lage ist, den (die) spezifischen Wachstumsfaktor(en) zu binden; (2) eine Transmembran-Domäne, die gewöhnlich einem alpha-helicalen Bereich des Proteins entspricht; (3) eine der Membran unmittelbar benachbarte Domäne, an der der Rezeptor, zum Beispiel durch Protein-Phosphorylierung, reguliert werden kann; (4) eine Tyrosinkinase-Domäne, welche die enzymatische Komponente des Rezeptors darstellt; und (5) einen carboxyterminalen Rest, welcher bei vielen Rezeptoren an der Erkennung und Bindung der Substrate für die Tyrosinkinase beteiligt ist.
Von Prozessen wie alternatives Exon-Spleißen und alternative Auswahl von Gen-Promotorbereichen oder Polyadenylierungs-stellen wurde beschrieben, daß sie in der Lage sind, einige unterschiedliche Polypeptide von dem gleichen Gen herzustellen. Diese Polypeptide können die verschiedenen vorstehend aufgeführten Domänen enthalten oder nicht. Als Folge davon können einige extrazelluläre Domänen als getrennte, sekretierte Protein exprimiert werden und einigen Formen der Rezeptoren kann die Tyrosinkinase-Domäne fehlen und sie können nur die extrazelluläre Domäne, verankert in der Plasmamembran über die Transmembran-Domäne und einen kurzen carboxyterminalen Rest enthalten.
Ein Gen, welches eine Endothelzell-Transmembran- Tyrosinkinase codiert, ursprünglich durch RT-PCR als ein unbekanntes Tyrosinkinase-homologes cDNA-Fragment in menschlichen Leukämiezellen identifiziert, wurde von Partanen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8913-8917 (1990) beschrieben. Dieses Gen und sein codiertes Protein werden "tie" genannt, was eine Abkürzung für "Tyrosinkinase mit Ig und EGFhomologen Domänen" ist, Partanen, et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1698-1707 (1992).
Es wurde berichtet, dass tie-mRNA in allen fötalen menschlichen und embryonalen Mausgeweben vorhanden ist. Nach Prüfung wurde die tie-mRNA in Endothelzellen des Herzen und in vaskulären Endothelzellen lokalisiert, tie-mRNA wurde in Endothel von Blutgefäßen und des Endocards von 9,5-18,5 Tage alten Mausembryonen lokalisiert. Eine verstärkte tie- Expression wurde während der Neovaskularisierung gefunden, die mit sich entwickelnden Follikeln des Ovars und dem Granulationsgewebe von Wunden der Haut assoziiert ist;
Korhonen, et al. Blood 80: 2548-2555 (1992). Damit wurde vorgeschlagen, das tie eine Rolle bei der Angiogenese spielt, was für die Entwicklung von Behandlungen für solide Tumoren und einige andere Angiogenese-abhängigen Erkrankungen wie diabetische Retinopathie, Psoriasis, Ateriosklerose und Arthritis, wichtig ist.
Es wurde berichtet, dass zwei strukturell verwandte TIE- Rezeptorproteine von unterschiedlichen Genen mit ähnlichen Expressionsprofilen codiert werden. Eines dieser Gene, genannt tie-1, ist das Ratten-Homolog des menschlichen tie, Maisonpierre, et al., Oncogene 8: 1631-1637 (1993). Das andere Gen, tie-2, kann das Ratten-Homolog des tek-Gens der Maus sein, von welchem berichtet wurde, dass es, wie tie, in der Maus ausschließlich in Endothelzellen und ihren mutmaßlichen Vorläufern exprimiert wird; Dumont, et al. Oncogene 8: 1293- 1301 (1993).
Es wurde gefunden, dass beide Gene in endothelialen Zellen von embryonalen und postnatalen Geweben exprimiert werden. Bedeutende Mengen von tie-2-Transkripten waren auch in anderen embryonalen Zellpopulationen anwesend, einschließlich Linsenepithel, im Epicard des Herzen und Bereichen des Mesenchyms; Maisonpierre, et al., Oncogene 8: 1631-1637 (1993).
Die überwiegende Expression des TIE-Rezeptors in vaskulärem Endothel legt nahe, dass TIE bei der Entwicklung und Erhaltung des vaskulären Systems eine Rolle spielt. Dies könnte beinhalten, dass es für die Determinierung, Proliferation, Differenzierung und Zellmigration der Endothelzelle und für die Strukturierung in vaskuläre Elemente von Bedeutung ist. Es wurde berichtet, dass Analysen von Mausembryonen, welche für TIE-2-defizient sind, seine Bedeutung für die Angiogenese, insbesondere für die Bildung des vaskulären Netzwerkes in Endothelzellen, nachweisen kannten; Sato, T. N., et al., Nature, 376 : 70-74 (1994). Im ausgereiften Vaskularsystem könnte TIE für das Überleben von, die Erhaltung von und die Antwort auf pathogene Einflüsse auf Endothelzellen von Bedeutung sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Liganden, die den TIE-2-Rezeptor binden, sowie auf Verfahren zur Herstellung und Anwendung der TIE-2-Liganden. Die Erfindung stellt weiterhin Nucleinsäuresequenzen bereit, die den TIE-2- Liganden codieren und deren Genprodukte. Die TIE-2-Liganden sowie die Nucleinsäuren, welche sie codieren, können für die Diagnose und die Behandlung bestimmter Erkrankungen, welche Endothelzellen und damit assoziierte TIE-Rezeptoren beinhalten, wie neoplastische Erkrankungen, welche die Tumorangiogenese, die Wundheilung, thromboembolische Erkrankungen, ateriosklerotische und entzündliche Erkrankungen beinhalten, hilfreich sein. Im allgemeineren Sinne können biologisch aktive TIE-2-Liganden verwendet werden, um das Wachstum, die Überlebensrate und/oder die Differenzierung von Zellen, welche den TIE-2-Rezeptor exprimieren, zu verstärken. Biologisch aktiver TIE-2-Ligand kann für die in vitro- Aufrechterhaltung TIE-2-Rezeptor-exprimierender Zellen in Kultur verwendet werden. Zellen und Gewebe, welche den TIE-2- Rezeptor exprimieren, beinhalten zum Beispiel Endothelzellen des Herzens und vaskuläre Endothelzellen, Linsenepithel und das Epicard des Herzen. Alternativ dazu können solche Liganden verwendet werden, um Zellen zu unterstützen, welche derart (gentechnisch) verändert sind, dass sie den TIE-2-Rezeptor exprimieren. Darüber hinaus können TIE-2-Liganden und deren sie erkennender Rezeptor in Testsystemen verwendet werden, um Agonisten oder Antagonisten des TIE-2-Rezeptors zu identifizieren.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das den TIE-2-Liganden codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ist:
(a) die Nucleinsäuresequenz, die die codierende Region des menschlichen TIE-2-Liganden, wie in Fig. 4 oder Fig. 5 dargelegt, umfasst:
(b) eine Nucleinsäuresequenz, die unter moderatstringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz von (a) hybridisiert und die einen TIE-2-Liganden codiert, der den TIE-2-Rezeptor bindet; oder
(c) eine Nucleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit der Nucleinsäuresequenz von (a) oder (b) hybridisieren würde und einen TIE-2-Liganden codiert, der an den TIE- 2-Rezeptor bindet.
Solch eine Nucleinsäure codiert vorzugsweise einen TIE-2- Agonisten.
In einer alternativen Ausführungsform, stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, welches einen TIE-2-Liganden codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ist:
(a) die Nucleinsäuresequenz, die die codierende Region des menschlichen TIE-2-Liganden, wie in Fig. 6 dargelegt, umfasst;
(b) eine Nucleinsäuresequenz, die unter moderat tringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz von (a) hybridisiert und einen TIE-2-Liganden codiert, der an den TIE-2-Rezeptor bindet; oder
(c) eine Nucleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit der Nucleinsäuresequenz von (a) oder (b) hybridisieren würde und einen TIE-2- Liganden codiert, der an den TIE-2-Rezeptor bindet.
Solch eine Nucleinsäure codiert vorzugsweise einen TIE-2- Antagonisten.
Die isolierte Nucleinsäure kann DNA, cDNA oder RNA sein. Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, welcher ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das einen TIE-2-Liganden codiert, umfasst. Die Erfindung stellt weiterhin ein Wirt- Vektorsystem zur Herstellung eines Polypeptids, welches die biologische Aktivität eines TIE-2-Liganden besitzt, in einer geeigneten Wirtszelle bereit. Die geeignete Wirtszelle kann eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle sein. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, welches die biologische Aktivität eines TIE-2-Liganden hat, bereit, umfassend die Züchtung der Zellen des Wirt-Vektorsystems unter Bedingungen, welche die Herstellung des Polypeptids und die Gewinnung des derart hergestellten Polypeptids erlauben.
Die Erfindung, welche hierin für ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, welches einen TIE-2-Liganden codiert, beschrieben ist, stellt darüber hinaus die Entwicklung des Liganden, eines Fragmentes oder Derivates davon, oder eines anderen Moleküls, welches ein Rezeptor-Agonist oder Antagonist ist, zur Behandlung von Patienten, welche an Erkrankungen leiden, die Zellen, Gewebe, oder Organe beinhalten, die den TIE-Rezeptor exprimieren.
Die Erfindung betrifft auch einen isolierten TIE-2- Liganden, der durch eine erfindungsgemäße Nucleinsäure codiert wird, wobei das Protein im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.
Alternativ dazu stellt die Erfindung einen isolierten TIE- 2-Liganden bereit, der eine in Fig. 4, 5 oder 6 dargelegte Aminosäuresequenz besitzt, oder ein Fragment oder Derivat davon, welches an den TIE-2-Rezeptor bindet, wobei das Protein im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch solche Liganden zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers, oder in einem Diagnoseverfahren. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Antikörper bereit, der spezifisch ein solches therapeutisches Molekül bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, in welchem solch ein monoclonaler oder polyclonaler Antikörper verwendet wird, um die Menge des therapeutischen Moleküls in einer Probe, welche von einem Patienten gewonnen wurde, zum Zweck der Darstellung des Therapieverlaufes zu messen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der spezifisch an den TIE-2-Liganden bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Damit stellt die Erfindung desweiteren therapeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend einen Antikörper, welcher spezifisch einen TIE-2- Liganden bindet, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Solche Zusammensetzungen können zum Beispiel in einem Verfahren zur Blockierung des Blutgefäßwachstums in einem Säuger verwendet werden.
Die Erfindung stellt desweiteren Arzneimittel bereit, welche einen TIE-2-Liganden in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Solche Arzneimittel können zum Beispiel für die Verstärkung der Neovaskularisierung verwendet werden. In spezifischen Ausführungsformen können solche Arzneimittel verwendet werden, um Wundheilung zu verstärken oder Ischämie zu behandeln.
Alternativ dazu stellt die Erfindung bereit, dass ein TIE- 2-Ligand mit einem cytotoxischen Mittel gekoppelt sein kann und davon ein Arzneimittel hergestellt wird. Weiterhin stellt die Erfindung einen Rezeptor-Körper bereit, welcher spezifisch eine TIE-2-Liganden bindet. Die Erfindung stellt weiterhin Arzneimittel bereit, umfassend einen Rezeptor-Körper, welcher spezifisch einen TIE-2-Liganden bindet, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Solche Arzneimittel können zum Beispiel für die Blockierung des Wachstums von Blutgefäßen verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines TIE-2- Antagonisten, welcher ein TIE-2-Ligand oder ein Antikörper ist, der in der Lage ist, den TIE-2-Liganden zu binden, zur Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels bereit, welches in einem Verfahren zur Hemmung der TIE-2-Liganden- Aktivität in einem Säuger eingesetzt werden soll.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die Fig. 1A und 1B: TIE-2-Rezeptor-Körper (TIE-2-RB; receptor body) hemmt die Entwicklung von Blutgefäßen in der embryonalen Chorioallantoismembran des Huhns (chicken chorioallantoic membrane; CAM). Ein einzelnes Stück resorbierbarer Gelatineschaum (Gelschaum), getränkt mit 6 ug RB, wurde direkt unter die CAM von 1 Tag alten Hühnerembryonen eingesetzt. Nach drei weiteren Tagen Inkubation wurden die 4 Tage alten Embryonen und die umgebenden CAM entfernt und untersucht. Fig. 1A: Embryonen, die mit EHK-1 RB (rEHK-1 ecto / h IgG1 Fc) behandelt wurden, waren lebensfähig und besaßen normal entwickelte Blutgefäße in ihrer sie umgebenden CAM. Fig. 1B: Alle Embryonen, die mit TIE-2-RB (rTIE-2-ecto/h IgG1 Fc) behandelt wurden, waren tot, von verminderter Größe und nahezu vollständig ohne sie umgebende Blutgefäße.
Fig. 2 - Vektor pJFE14.
Fig. 3 - Restriktionskarte von λgt10.
Fig. 4 - Nucleinsäure- und davon abgeleitete Aminosäure (Einzelbuchstabencode)-Sequenzen von menschlichem TIE-2- Liganden vom Clon λgt10, der den htie-2-Ligand 1 codiert.
Fig. 5 - Nucleinsäure- und davon abgeleitete Aminosäure (Einzelbuchstabencode)-Sequenzen von menschlichem TTE-2- Liganden vom T98 G-Clon.
Fig. 6 - Nucleinsäure- und davon abgeleitete Aminosäure (Einzelbuchstabencode)-Sequenzen von menschlichem TIE-2- Liganden vom Clon pBluescript KS, der den menschlichen TIE-2- Ligand-2 codiert.
Fig. 7 - Western-Blot, der die Aktivierung des TIE-2- Rezeptors durch TIE-2-Ligand 1 (Spur L1), aber nicht durch TIE-2-Ligand 2 (Spur L2) oder die Kontrolle (MOCK) zeigt.
Fig. 8 - Western-Blot, der zeigt, dass die Vorbehandlung von HAEC-Zellen mit überschüssigem TIE-2-Ligand 2 (Spur 2) die nachfolgende Fähigkeit von verdünntem TIE-2-Ligand 1, den TIE- 2-Rezeptor (TIE2-R) zu aktivieren, verglichen mit der Vorbehandlung von HAEC-Zellen mit MOCK-Medium (Spur 1), antagonisiert.
Fig. 9 - Darstellung der Bindung von TIE-2-Ligand in C2C12 ras, Rat2 ras, SHEP, und T98 G konzentriertem (10x) konditioniertem Medium an Ratten-TIE2 IgG-iinmobilisierte Oberfläche in Form eines Histogramms. Ratten-TIE2 (rTIE2)- spezifische Bindung ist durch die signifikante Verminderung der Bindungsaktivität in Anwesenheit von 25 ug/ml löslichem Ratten-TIE2 RB, verglichen mit einer verminderten Reduktion in Anwesenheit von löslichem trkB RB, gezeigt.
Fig. 10 - Bindung von rekombinantem menschlichem TIE-2- Ligand 1 (hTL1) und menschlichem TIE-2-Ligand 2 (hTL2) in COS- Zell-Überständen, an eine mit menschlichem TIE-2-RBimmobilisierte Oberfläche. Menschliche TIE-2-spezifische Bindung wurde durch Inkubation der Proben mit 25 ug/ml von entweder löslichem menschlichem TIE2-RB oder trkB-RB, bestimmt; eine signifikante Minderung der Bindungsaktivität wird nur für die Proben beobachtet, die mit menschlichem TIE2- RB inkubiert wurden.
Fig. 11 - Western-Blot, der zeigt, dass der TIE-2-Rezeptor- Körper (als TIE-2-RB oder, wie hier, TIE2-Fc bezeichnet) die Aktivierung von TIE-2-Rezeptoren durch TIE-2-Ligand 1 (TL1) in HUVEC-Zellen blockiert, wohingegen ein nicht verwandter Rezeptor-Körper (TRKB-Fc) diese Aktivierung nicht blockiert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie im Nachfolgenden detaillierter beschrieben, haben die Anmelder durch Expressionsclonierung einen neuen Liganden isoliert, welcher an den TIE-2-Rezeptor bindet. Die vorliegende Erfindung umfasst einen TIE-2-Liganden sowie seine Aminosäuresequenz und ebenso funktionell äquivalente Moleküle, in welchen Aminosäurereste mit Resten innerhalb der Sequenz substituiert sind, wobei dies in einer stummen Veränderung resultiert. Zum Beispiel können einer oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch (eine) andere Aminosäure (n) mit ähnlicher Polarität substituiert sein, welche als ein funktionelles Äquivalent wirkt, wobei eine stumme Veränderung resultiert. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können von anderen Mitgliedern der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel beinhaltet die Klasse nichtpolarer (hydrophober) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren beinhalten Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren beinhalten Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren beinhalten Asparaginsäure und Glutaminsäure. Auch in dem Schutzumfang der Erfindung enthalten sind Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, welche die gleiche oder ähnliche biologische Aktivität zeigen, und Derivate, die während oder nach der Translation differentiell modifiziert werden, z. B. durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Kopplung an ein Antikörpermolekül oder an andere zelluläre Liganden, usw.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Nucleotidsequenz, welche das Protein, welches hierin als TIE- 2-Ligand 1 beschrieben ist, in einem geeigneten Expressionsvektor codiert, sowie Zellen, welche derart genetisch verändert sind, dass sie das Protein herstellen, durch z. B. Transfektion, Transduktion, Infektion, Elektroporation oder Mikroinjektion von Nucleinsäuren, welche den TIE-2-Ligand 1, der hierin beschrieben ist, codieren. Die vorliegende Erfindung umfasst weiter die Nucleotidsequenz, welche das Protein codiert, welches hierin als TIE-2-Ligand 2 beschrieben ist, in einem geeigneten Expressionsvektor sowie Zellen, die derart genetisch verändert sind, dass sie das Protein durch z. B. Transfektion, Transduktion, Infektion, Elektroporation, oder Mikroinjektion von Nucleinsäure, welche den hierin beschriebenen TIE-2- Ligand 2 codiert, herstellen.
Der Fachmann wird auch erkennen, dass die vorliegende Erfindung DNA- und RNA-Sequenzen umfasst, welche an eine abgeleitete TIE-2-Ligand-codierende Sequenz unter moderaten Stringenz-Bedingungen wie definiert in, z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 101-104, Cold Spring Habor Laboratory Press (1989), hybridisieren. Damit beinhaltet ein Nucleinsäuremolekül, welches im Sinne der Erfindung genannt wird, eines, welches eine Sequenz hat, die von einer Aminosäuresequenz eines TIE-2- Liganden, hergestellt wie hierin beschrieben, abgeleitet ist, sowie ein Molekül, welches eine Sequenz einer Nucleinsäure hat, die mit einer solchen Nucleinsäuresequenz hybridisiert, und auch eine Nucleinsäuresequenz, welche als ein Ergebnis des genetischen Codes für die vorstehenden Sequenzen degeneriert ist, welche jedoch einen Liganden codiert, der den TIE-2- Rezeptor bindet.
Alle dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Inserierung von DNA-Fragmenten in einen Vektor können verwendet werden, um Expressionsvektoren herzustellen, die den TIE-2-Liganden unter Verwendung angemessener Transkriptions-/Translations-Kontrollsignale und den Proteincodierenden Sequenzen codieren. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA, synthetische Techniken und in vivo Rekombinationen (genetische Rekombination) beinhalten. Die Expression einer Nucleinsäuresequenz, welche einen TIE-2- Liganden oder Peptidfragmente davon codiert, kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz derart reguliert sein, dass das Protein oder Peptid in einem Wirt, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, exprimiert wird. Die Expression eines TIE-2-Liganden, wie er hierin beschrieben ist, kann zum Beispiel durch jedes Promotor-/Enhancer-Element, das im Stand der Technik bekannt ist, kontrolliert werden. Promotoren, die verwendet werden können, um die Expression des Liganden zu kontrollieren, beinhalten, sind jedoch nicht limitiert auf die lange endständige Wiederholungssequenz (long terminal repeat), wie in Squinto et al., (Cell 65: 1-20 (1991)) beschrieben; die frühe Promotorregion des SV40 (SV 40 early promoter region) (Bernoist and Chambon, Nature 290: 304- 310), den CMV-Promotor, die M-MuLV 5'-terminale Wiederholungseinheit (M-MuLV 5' terminal repeat), der Promotor, der in der 3'-langen terminalen Wiederholungseinheit des Rous sarcoma-Virus enthalten ist (Rous sarcoma virus 3' terminal repeat) (Yamamoto, et al., Cell 22: 787-797 (1980)), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 1444-1445 (1981)), den Adenovirus- Promotor, die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein- Gens (Brinster et al., Nature 296 : 39-42 (1982)); prokaryontische Expressionvektoren, wie den β-Lactamase- Promotor (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75: 3727-3731 (1978)), oder den tac-Promotor (Deßoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80 : 21-25 (1983)), siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 242 : 74-94 (1980)); Promotorelemente von Hefe oder anderen Pilzen, wie den Gal 4-Promotor, den ADH- (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PGK-(Phosphoglycerinkinase)- Promotor, alkalische Phosphatase-Promotor, und die folgenden tierischen Transkriptions-Kontrollregionen, welche Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden: die Kontrollregion des Elastase I-Gens, welche in pankreatischen Acinuszellen aktiv ist (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Habor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425- 515 (1987); die Kontrollregion des Insulin-Gens, welche in pankreatischen Betazellen aktiv ist (Hanahan, Nature 315: 115- 122 (1985)), die Kontrollregion des Immunglobulin-Gens, welche in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), die Kontrollregion des Maus-Mamma-Tumorvirus, welche in den Hoden, der Brust, in den Lymphocyten und in Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), die Kontrollregion des Albumin-Gens, welche in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 : 268-276), die Kontrollregion des Alpha-Fetoprotein-Gens, welche in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); die Kontrollregion des Alpha 1-Antitrypsin-Gens, welche in der Leber aktiv ist (Kelsey et al. 1987, Genes and Devel. 1 : 161-171), die Kontrollregion des Beta-Globin-Gens, welche in myeloischen Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); die Kontrollregion des Myelin- Basisprotein-Gens, welches in oligodendritischen Zellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); die Kontrollregion des Myosin leichte Kette-2-Gens, welche im Skelettmuskel aktiv ist (Shani, 1985, Nature 314: 283-286); und die Kontrollregion des Gonadotropin-releasing-Faktor-Gens, welche im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234 : 1372-1378). Die Erfindung umfaßt weiter die Herstellung von Antisense-Präparaten, die in der Lage sind, mit einer RNA- Sequenz, die den TIE-2-Liganden codiert, spezifisch zu hybridisieren, um dessen Expression zu modulieren (Ecker, U. S. Patent Nr. S. 166.195, erteilt am 24. November 1992).
Dann werden erfindungsgemäß Expressionsvektoren verwendet, die in der Lage sind in einem bakteriellen oder eukaryontischen Wirt repliziert zu werden, welche eine Nucleinsäure umfassen, die einen TIE-2-Liganden wie hierin beschrieben codiert, um einen Wirt zu transfizieren und dabei die Expression einer solchen Nucleinsäure zu veranlassen, um den TIE-2-Liganden herzustellen, welcher dann in einer biologisch aktiven Form gewonnen werden kann. Wie hierin verwendet, beinhaltet eine biologisch aktive Form eine Form, die in der Lage ist, an den TIE-2-Rezeptor zu binden und eine biologische Antwort, wie eine differenzierte Funktion oder die Beeinflussung des Phänotyps der Zelle, welche den Rezeptor exprimiert, zu verursachen. Solche biologisch aktiven Formen würden zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosinkinase- Domäne des TIE-2-Rezeptors induzieren.
Expressionsvektoren, welche die Gen-Inserierungen enthalten, können anhand von vier allgemein verwendeten Verfahren identifiziert werden: (a) DNA-DNA Hybridisierung, (b) Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker"-Gen-Funktionen, (c) die Expression inserierter Sequenzen und (d) der Nachweis durch PCR. In dem ersten Ansatz kann die Anwesenheit eines fremden Gens, welches in einen Expressionsvektor inseriert wurde, unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, welche homolog sind zu einem inserierten TIE-2-Liganden codierenden Gen, durch DNA-DNA Hybridisierung nachgewiesen werden. In dem zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor- Wirt-System aufgrund der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter "Marker"-Gen-Funktionen (z. B. Thymidinkinase- Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformations- Phänotyp, OCClusionskörperbildung in Baculovirus, usw.), die durch die Inserierung von fremden Genen in den Vektor verursacht werden, identifiziert und selektiert werden. Wenn zum Beispiel eine Nucleinsäure, welche einen TIE-2-Liganden codiert, innerhalb der Markergen-Sequenz des Vektors inseriert wird, können die Rekombinanten, welche die Inserierung enthalten, durch die Abwesenheit der Markergen-Funktion identifiziert werden. In dem dritten Ansatz können die rekombinanten Expressionsvektoren dadurch identifiziert werden, dass das fremde Genprodukt, welches von der Rekombinante exprimiert wird, getestet wird. Solche Tests können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften eines TIE-2-Liganden-Genprodukts begründet sein, zum Beispiel durch Bindung des Liganden an den TIE-2-Rezeptor oder Teile davon, welche gekoppelt sein können mit zum Beispiel einem nachweisbaren Antikörper oder Teilen davon, oder durch Bindung an Antikörper, welche gegen das TIE-2- Ligand-Protein oder einen Teil davon hergestellt wurden.
Zellen der vorliegenden Erfindung können transient oder vorzugsweise konstitutiv sein und permanent TIE-2-Liganden wie hierin beschrieben exprimieren. In dem vierten Ansatz, können DNA-Nucleotidprimer entsprechend einer tie-2-spezifischen DNA- Sequenz hergestellt werden. Diese Primer könnten dann verwendet werden, um ein tie-2-Genfragment einer PCR zu unterziehen (PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, Edited by Michael A. Innis et al., Academic Press (1990)).
Der rekombinante Ligand kann durch jedes mögliche Verfahren, welches die nachfolgende Ausbildung eines stabilen, biologisch aktiven Proteins erlaubt, aufgereinigt werden. Der Ligand kann, als Beispiel und nicht auf eingrenzende Art und Weise, entweder als lösliches Protein oder in Form von Einschlusskörpern aus Zellen gewonnen werden, aus welchen dieses mit 8M Guanidiniumhydrochlorid und anschließender Dialyse quantitativ extrahiert werden kann. Um den Liganden weiter aufzureinigen, können herkömmliche Ionenaustausch- Chromatographie, hydrophobe Interaktions-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Gelfiltration verwendet werden.
In zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung kann ein rekombinantes, einen TIE-2-Liganden codierendes Gen, dazu verwendet werden, das endogene Gen durch homologe Rekombination zu inaktivieren oder "auszuschalten" ("knock out") und dabei ein(e) TIE-2-Ligand-defiziente(s) Zelle, Gewebe oder Tier entstehen zu lassen. Das rekombinante, den TIE-2- Ligand codierende Gen kann zum Beispiel und nicht auf eingrenzende Art und Weise derart verändert sein, dass es eine Inserierungsmutation enthält, zum Beispiel für das Neo-Gen, welche das native, den TIE-2-Liganden codierende Gen inaktivieren würde. Ein solches Konstrukt könnte unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in eine Zelle, wie eine embryonale Stammzelle, durch eine Technik wie Transfektion, Transduktion oder Injektion eingeführt werden. Unter Verwendung von G418-Resistenz könnten dann Zellen, welche das Konstrukt enthalten, selektiert werden. Zellen, welchen ein intaktes TIE-2-Ligand codierendes Gen fehlt, können dann z. B. durch Southern-Blot, PCR-Nachweis, Northern-Blot oder Testen auf Expression identifiziert werden. Zellen, welchen ein intaktes TIE-2-Ligand codierendes Gen fehlt, können dann mit frühen Embryonalzellen fusioniert werden, wobei ein transgenes Tier entsteht, welches für einen solchen Liganden defizient ist. Solch ein Tier kann verwendet werden, um spezifische in vivo-Prozesse zu definieren, welche normalerweise von dem Liganden abhängig sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper gegen den TIE-2-Liganden wie hierin beschrieben, welche zum Nachweis des Liganden in, zum Beispiel, diagnostischen Anwendungen geeignet sind. Für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern, die gegen den TIE-2-Liganden gerichtet sind, kann jede mögliche Technik, welche die Herstellung des Antikörpermoleküls durch permanente Zelllinien in Kultur bereitstellt, verwendet werden. Zum Beispiel die Hybridomtechnik, welche ursprünglich von Köhler und Milstein entwickelt wurde (1975, Nature 256: 495-497), sowie die Triom- Technik, die menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4 : 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) und ähnliche gehören zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Die monoclonalen Antikörper können menschliche monoclonale Antikörper oder chimäre Mensch-Maus (oder andere Arten) monoclonale Antikörper sein. Menschliche monoclonale Antikörper können mit jedem von zahlreichen im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden (z. B. Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3-16). Chimäre Antikörper-Moleküle, welche eine Maus-Antigen-Bindungsdomäne gekoppelt mit menschlichen konstanten Regionen enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 6851, Takeda e al., 1985, Nature 314: 452) können hergestellt werden.
Verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren können für die Herstellung von polyclonalen Antikörpern gegen Epitope der hierin beschriebenen TIE-2-Liganden hergestellt werden. Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Tiere als Wirt durch Injektion mit einem TIE-2- Liganden, oder einem Fragment oder Derivat davon immunisiert werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Kaninchen, Mäuse und Ratten. Verschiedene Hilfsmittel können in Abhängigkeit von der Art des Wirtes verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken und beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Freunds (komplettes und inkomplettes) Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl-Emulsionen, Hämocyanine der Schlüsselloch-Napfschnecke, Dinitrophenol und potentiell verwendbare Adjuvantien wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Ein molekularer Clon von einem Antikörper gegen ein ausgewähltes TIE-2-Ligand-Epitop kann durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Rekombinante DNA-Verfahren (siehe z. B. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) können verwendet werden, um Nucleinsäuresequenzen herzustellen, welche ein monoclonales Antikörpermolekül oder eine Antigen-bindende Region davon codieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper-Moleküle sowie Fragmente solcher Antikörper-Moleküle. Antikörper- Fragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Fragmente beinhalten zum Beispiel, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: das F(ab')&sub2;-Fragment, welches durch Pepsin-Verdau des Antikörper-Moleküls hergestellt werden kann; das Fab'- Fragment, welches durch Reduktion der Disulfid-Brücken des F(ab')&sub2;-Fragments hergestellt werden kann, und die Fab- Fragmente, welche durch Behandlung der Antikörper-Moleküle mit Papain und einem Reduktionsmittel hergestellt werden können. Antikörper-Moleküle können durch bekannte Verfahren hergestellt werden, z. B. Immunabsorption oder Immunaffinitäts- Chromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (hochauflösende Flüssigkeits-Chromatographie), oder einer Kombination davon.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter einen Immuntest zur Messung der Menge an TIE-2-Ligand in einer biologischen Probe durch
a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit mindestens einem Antikörper, der spezifisch an den TIE-2-Liganden bindet, derart dass der Antikörper mit jedem TIE-2- Liganden, der in der Probe vorliegt, einen Komplex bildet; und
b) Messung der Menge an Komplex und dabei Messung der Menge an TIE-2-Ligand in der biologischen Probe.
Die Erfindung umfasst weiter einen Test zur Messung der Menge an TIE-2-Rezeptor in einer biologischen Probe durch
a) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen Liganden, derart, dass der Ligand einen Komplex mit dem TIE-2-Rezeptor ausbildet; und
b) Messung der Menge an Komplex und dabei Messung der Menge an TIE-2-Rezeptor in der biologischen Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines TIE-2-Liganden zur Unterstützung der Überlebensrate und/oder des Wachstums und/oder der Differenzierung von TIE-2-Rezeptor exprimierenden Zellen dar. Damit kann der Ligand als eine Ergänzung verwendet werden, um zum Beispiel Endothelzellen in Kultur zu unterstützen. Weiterhin ermöglicht die Entdeckung eines den TIE-2-Rezeptor erkennenden Liganden durch die Anmelder die Verwendung von Testsystemen, welche zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten des TIE-2- Rezeptors zweckmäßig sind. Solche Testsysteme wären für die Identifizierung von Molekülen, welche zur Verstärkung oder Hemmung der Angiogenese befähigt sind, zweckmäßig. So können zum Beispiel in einer Ausführungsform Antagonisten des TIE-2- Rezeptors als Test-Moleküle identifiziert werden, die in der Lage sind, die Interaktion des TIE-2-Rezeptors mit einem biologisch aktiven TIE-2-Liganden zu stören. Solche Antagonisten sind durch ihre Fähigkeit identifiziert, 1) die Bindung eines biologisch aktiven TIE-2-Liganden an den Rezeptor zu hemmen wie zum Beispiel unter Verwendung der BlAcore Biosensor-Technologie (BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gemessen; oder 2) die Fähigkeit eines biologisch aktiven TIE-2-Liganden, eine biologische Antwort zu verursachen, zu hemmen. Solche biologischen Antworten beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Phosphorylierung des TIE-2-Rezeptors oder von Stromabwärts- Komponenten des TIE-2-Signaltransduktionsweg, oder die Überlebensrate, das Wachstum oder die Differenzierung von TIE- 2-Rezeptor tragenden Zellen.
In einer Ausführungsform kann das Wachstum von Zellen, welche derart verändert sind, dass sie den TIE-2-Rezeptor exprimieren, von der Zugabe des TIE-2-Liganden abhängen. Solche Zellen stellen nützliche Testsysteme zur Identifizierung zusätzlicher Agonisten des TIE-2-Rezeptors dar, oder von Antagonisten, die in der Lage sind, die Aktivität von TIE-2-Ligand auf solche Zellen zu stören. Alternativ dazu stellen autokrine Zellen, die derart verändert sind, dass sie in der Lage sind, sowohl TIE-2-Ligand und Rezeptor gemeinsam zu exprimieren, zweckmäßige Systeme zum Testen potentieller Agonisten oder Antagonisten bereit.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung das Einführen des TIE-2-Rezeptors in Zellen, welche normalerweise diesen Rezeptor nicht exprimieren, bereit, wobei diesen Zellen dadurch erlaubt wird, deutliche und leicht unterscheidbare Antworten auf einen Liganden, der diesen Rezeptor bindet, zu zeigen. Die Art der entlockten Antwort hängt von der verwendeten Zelle ab und nicht von dem spezifischen Rezeptor, der in die Zelle eingeführt wurde. Geeignete Zelllinien können ausgewählt werden, um eine Antwort von größtmöglicher Zweckmäßigkeit zum Testen, wie für die Entdeckung von Molekülen zu erhalten, welche auf Tyrosinkinase-Rezeptoren wirken können. Die Moleküle können jede Art von Molekül sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Peptide und Nicht-Peptid-Moleküle, die in Systemen wirken, welche in Rezeptor-spezifischer Art beschrieben sind.
Eines der geeigneteren Systeme, welches benutzt wird, beinhaltet die Einführung des TIE-2-Rezeptors in eine Fibroblasten-Zelllinie (z. B., NIH3T3-Zellen), damit ein solcher Rezeptor, welcher normalerweise keine proliferativen Antworten übermittelt, nach Einführung in Fibroblasten trotzdem durch eine Vielzahl gut etablierter Verfahren getestet werden kann, um Wirkungen von Fibroblasten- Wachstumsfaktoren zu quantifizieren (z. B. Thymidin- Inkorporation oder andere Arten von Proliferationstests; siehe von Zoelen, 1990, "The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors" in Progress Factor Research, Vol. 2, pp. 131-152; Zhan and M. Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., Vol. 6, pp. 3541-3544). Diese Tests haben den zusätzlichen Vorteil, dass jede Präparation sowohl mit der Zelllinie getestet werden kann, welche den eingeführten Rezeptor besitzt, als auch mit der parentalen Zelllinie, welcher der Rezeptor fehlt; nur die Effekte, die für die Zelllinie mit dem Rezeptor spezifisch sind, würden als durch den eingeführten Rezeptor-vermittelt gewertet werden. Solche Zellen können weiterhin derart verändert werden, dass sie den TIE-2-Liganden exprimieren, wobei ein autokrines System entsteht, welches für das Testen nach Molekülen, die als Antagonisten/Agonisten dieser Interaktion wirken, zweckmäßig ist. Damit stellt die vorliegende Erfindung Wirtszellen bereit, welche Nucleinsäuren, die den TIE-2-Liganden codieren, und Nucleinsäuren, die den TIE-2-Rezeptor codieren, umfassen. Die TIE-2-Rezeptor/TIE-2-Ligand-Interaktion stellt auch ein zweckmäßiges System zur Identifizierung kleiner Moleküle, die Agonisten oder Antagonisten des TIE-2-Rezeptors sind, bereit. Zum Beispiel können Fragmente, Mutanten oder Derivate eines TIE-2-Liganden können gefunden werden, welche den TIE-2- Rezeptor binden, jedoch keine biologische Aktivität induzieren. Alternativ dazu erlaubt die Charakterisierung eines TIE-2-Liganden die Bestimmung aktiver Bereiche des Moleküls. Weiterhin erlaubt die Identifizierung eines Liganden die Bestimmung der Röntgenstrahl-Kristallstruktur des Rezeptor/Ligand-Komplexes, wobei die Identifizierung der Bindungsstelle auf dem Rezeptor möglich wird. Kenntnis der Bindungsstelle wird nützliche Einsicht in den rationalen Entwurf neuer Agonisten und Antagonisten gewähren.
Die spezifische Bindung eines Test-Moleküls an den TIE-2- Rezeptor kann auf eine ganze Reihe von Arten gemessen werden. Die tatsächliche Bindung des Testmoleküls an Zellen, welche tie-2-exprimieren, kann beispielsweise nachgewiesen oder gemessen werden, indem nachgewiesen oder gemessen wird, (i) ob das Testmolekül an die Oberfläche von intakten Zellen gebunden ist; (ii) ob das Testmolekül in Zelllysaten mit dem TIE-2- Protein vernetzt ist; oder (iii) ob das Testmolekül in vitro an TIE-2-gebunden ist. Die spezifische Interaktion zwischen Testmolekül und TIE-2-kann mit Reagenzien ausgewertet werden, welche die einzigartigen Eigenschaften dieser Interaktion darstellen.
Als ein spezifisches, nicht einschränkendes Beispiel können die erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt angewendet werden. Man stelle sich einen Fall vor, bei welchem der TIE-2- Ligand in einer Probe gemessen werden soll. Variierende Verdünnungen der Probe (das Testmolekül), parallel mit einer negativen Kontrolle (NC), welche keine TIE-2-Ligandenaktivität enthält, und eine positive Kontrolle (PC), welche eine bekannte Menge von einem TIE-2-Liganden enthält, kann Zellen ausgesetzt werden, welche in Anwesenheit eines nachweisbaren markierten TIE-2-Liganden (in diesem Beispiel, ein radiojodierter Ligand), exprimieren. Die Menge an TIE-2-Ligand in der zu testenden Probe kann ausgewertet werden, indem die Menge an 1251 markiertem TIE-2-Ligand, welcher in den Kontrollen und in jeder der Verdünnungen bindet, bestimmt wird und dann die Probenwerte mit einer Standardkurve verglichen werden. Je mehr TIE-2-Ligand in der Probe ist, umso weniger ¹²&sup5;I-Ligand wird an TIE-2-binden.
Die Menge an gebundenem ¹²&sup5;I-Ligand kann durch Messung der Menge an Radioaktivität pro Zelle, oder durch Vernetzung des TIE-2-Liganden an Zelloberflächenproteine unter Verwendung von DSS, wie in Meakin and Shooter, 1991, Neuron 6: 153-163 beschrieben, und dem Nachweis der Menge an markiertem Protein in Zellextrakten unter Verwendung von zum Beispiel SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt werden, welche ein markiertes Protein, das einer Größe entsprechend dem TIE-2- Ligand/TIE-2-Rezeptor besitzt, anzeigen kann. Die spezifische Testmolelkül/TIE-2-Interaktion kann weiter durch Zugabe verschiedener Verdünnungen eines unmarkierten Kontrollliganden zu den Ansätzen getestet werden, welcher nicht an den TIE-2- Rezeptor bindet und deshalb keine wesentliche Wirkung auf die Konkurrenz zwischen markiertem TIE-2-Liganden und Testmolekül um die TIE-2-Bindung haben sollte. Alternativ kann erwartet werden, dass ein Molekül, welches dafür bekannt ist, dass es in der Lage ist, die TIE-2-Ligand/TIE-2-Bindung zu zerstören wie, jedoch nicht eingeschränkt auf, ein anti-TIE-2- Antikörper, oder ein TIE-2-Rezeptor-Körper wie hierin beschrieben, die Konkurrenz zwischen ¹²&sup5;I-TIE-2-Ligand und Testmolekül um die Bindung an den TIE-2-Rezeptor stören kann.
Nachweislich markierter TIE-2-Ligand beinhaltet, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, einen TIE-2-Liganden, welcher kovalent oder nicht-kovalent an eine radioaktive Substanz, eine fluoreszierende Substanz, eine Substanz, welche enzymatische Aktivität besitzt, eine Substanz, welche als ein Substrat für ein Enzym dienen kann (Enzyme und Substrate, welche mit colorimetrisch nachweisbaren Reaktionen assoziiert sind, werden bevorzugt) oder an eine Substanz, die durch ein Antikörpermolekül erkannt werden kann, welches vorzugsweise ein nachweisbares markiertes Antikörpermolekül ist, gekoppelt ist.
Alternativ dazu kann die spezifische Bindung des Testmoleküls an TIE-2 durch Auswerten der sekundären biologischen Effekte von TIE-2-Ligand/TIE-2-Rezeptor-Bindung gemessen werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Zellwachstum und/oder Differenzierung oder die sofortige Expression früher Gene oder die Phosphorylierung von TIE-2. Die Fähigkeit des Testmoleküls zum Beispiel, Differenzierung zu induzieren, kann in Zellen getestet werden, welchen tie-2- fehlt, und in vergleichbaren Zellen, welche tie-2-exprimieren. Differenzierung in tie-2-exprimierenden Zellen jedoch nicht in vergleichbaren Zellen ohne tie-2-würde auf eine spezifische Testmolekül/TIE-2-Interaktion hinweisen. Eine ähnlich Analyse könnte durch Nachweis der sofortigen Induktion früher Gene (z. B. fos und jun) in tie-2-minus- und tie-2-plus-Zellen durchgeführt werden, oder durch den Nachweis der Phosphorylierung von TIE-2-unter Verwendung von Standard- Phosphorylierungstests, welche im Stand der Technik bekannt sind. Solche Analysen könnten für die Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten, welche nicht kompetitiv an TIE-2- binden, nützlich sein.
In ähnlicher Weise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Moleküls, welches die biologische Aktivität eines TIE-2-Liganden hat, bereit, umfassend (i) Versetzen einer Zelle, welche tie-2-exprimiert mit einem Testmolekül und (ii) Nachweis der spezifischen Bindung des Testmoleküls an den TIE-2-Rezeptor, bei welcher die spezifische Bindung an TIE-2-mit TIE-2-ähnlicher Aktivität positiv korreliert. Die spezifische Bindung kann entweder durch Testen der direkten Bindung oder der sekundären biologischen Effekte der Bindung, wie vorstehend diskutiert, nachgewiesen werden. Ein solches Verfahren kann insbesondere für die Identifizierung neuer Mitglieder der TIE-2- Ligandenfamilie oder, in der pharmazeutischen Industrie, beim. Durchmustern einer großen Anordnung aus Peptid- und nicht- Peptidmolekülen (z. B., Peptidomimetika) nach TIE-assoziierter biologischer Aktivität, nützlich sein. In einer bevorzugten, spezifischen, nicht einschränkenden Ausführungsform der Erfindung kann ein großes Gitter von Kulturvertiefungen hergestellt werden, welche in abwechselnden Reihen PC12 (oder Fibroblasten, siehe infra)-Zellen, welche entweder tie-2-minus oder derart verändert sind, dass sie tie-2-plus sind, enthalten. Eine Vielzahl von Testmolekülen kann dann derart hinzugegeben werden, dass jede Reihe des Netzes, oder ein Teil davon, ein unterschiedliches Testmolekül enthält. Jede Vertiefung könnte dann auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum und/oder Differenzierung ausgewertet werden. Auf diese Art und Weise könnte eine außerordentlich große Zahl von Testmolekülen auf eine solche Aktivität durchmustert werden. In zusätzlichen Ausführungsformen stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis oder zur Messung von TIE-ähnlicher Aktivität oder zur Identifizierung eines Moleküls, welches eine solche Aktivität besitzt, bereit, umfassend (i) das Versetzen eines Testmoleküls mit einem TIE-2-Rezeptorprotein in vitro unter Bedingungen, die erlauben, dass die Bindung stattfindet und (ii) Nachweis der Bindung des Testmoleküls an das TIE-2-Protein, wobei die Bindung des Testmoleküls an TIE- 2-mit TIE-ähnlicher Aktivität korreliert. Entsprechend solcher Verfahren kann TIE-2-im wesentlichen aufgereinigt sein oder nicht, an einen festen Träger gekoppelt sein (z. B. als eine Affinitätssäule oder als ein ELISA-Test), oder kann in eine künstliche Membran inkorporiert sein. Die Bindung des Testmoleküls an TIE-2-kann durch jedes mögliche Verfahren, welches im Stand der Technik bekannt ist, ausgewertet werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann die Bindung des Testmoleküls durch Auswertung seiner Fähigkeit, mit dem nachweisbar markierten bekannten TIE-2-Liganden um die TIE-2- Rezeptorbindung zu kompetieren, nachgewiesen oder gemessen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis der Fähigkeit eines Testmoleküls, als ein Antagonist von TIE-ähnlicher Aktivität zu wirken bereit, umfassend den Nachweis der Fähigkeit des Moleküls, einen Effekt der TIE-2- Ligandbindung an TIE-2-auf einer Zelle, welche tie-2- exprimiert, zu hemmen. Solch ein Antagonist kann mit der TIE- 2-Ligand/TIE-2-Rezeptor-Bindung interferieren oder nicht. Effekte der TIE-2-Liganden-Bindung an den TIE-2-Rezeptor sind vorzugsweise biologische oder biochemische Wirkungen, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Zellüberlebensrate oder Proliferation, Zelltransformation, die sofortige Induktion früher Gene, oder TIE-2-Phosphorylierung.
Die Erfindung stellt weiter sowohl ein Verfahren zur Identifizierung von Antikörpern oder anderer Moleküle, welche dazu in der Lage sind, den Liganden zu neutralisieren oder die Bindung an den Rezeptor zu blockieren, als auch die Moleküle, welche durch das Verfahren identifiziert werden, bereit. Als ein nicht einschränkendes Beispiel kann das Verfahren anhand eines Tests durchgeführt werden, welcher konzeptionell einem ELISA-Test ähnlich ist. Der TIE-2-Rezeptor-Körper kann zum Beispiel an einen festen Träger gebunden sein, wie eine Vielfach-Vertiefungsplatte aus Plastik. Als eine Kontrolle kann eine bekannte Menge TIE-2-Ligand, welcher mit einem Myc- Marker versehen wurde dann in die Vertiefungen zugegeben werden und jeder mögliche, mit irgendeinem Marker versehene, TIE-2-Ligand, welcher den Rezeptor-Körper bindet, kann dann mit Hilfe eines Reporter-Antikörpers, welcher gegen den Myc- Marker gerichtet ist, identifiziert werden. Dieses Testsystem kann dann verwendet werden, um Testproben nach Molekülen zu durchmustern, welche in der Lage sind, (i) an den mit einem Marker versehenen Liganden zu binden oder (ii) an den Rezeptor-Körper zu binden und dabei die Bindung an den Rezeptor-Körper durch den mit einem Marker versehenen Liganden zu blockieren. Eine Testprobe, welche zum Beispiel ein vermeintliches interessierendes Molekül zusammen mit einer bekannten Menge an mit einem Marker versehenen Liganden enthält, kann in die Vertiefung hinzugegeben werden und die Menge an mit einem Marker versehenen Liganden, welcher an den Rezeptor-Körper bindet, kann gemessen werden. Durch Vergleich der Menge an gebundenem, mit einem TAG versehenen Liganden in der Testprobe mit der Menge in der Kontrolle können Moleküle identifiziert werden, die in der Lage sind, die Ligandenbindung an den Rezeptor zu blockieren. Die auf diese Art identifizierten interessierenden Moleküle können anhand von Verfahren, die dem Fachmann aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, isoliert werden.
Wenn dann ein Blocker der Ligandenbindung gefunden ist, würde ein Fachmann wissen, wie sekundäre Tests durchzuführen wären, um zu bestimmen, ob der Blocker an den Rezeptor oder den Liganden bindet, sowie Tests, um zu bestimmen, ob das Blocker-Molekül die biologische Aktivität des Liganden neutralisieren kann. Unter Verwendung eines Bindungstests, zum Beispiel einer, der die BIAcore Biosensor-Technologie (oder etwas ähnliches) verwendet, bei welcher entweder der TIE-2- Rezeptor-Körper oder der TIE-2-Ligand kovalent an einen festen Träger gebunden ist (z. B. Carboxymethyldextran auf einer Goldoberfläche), wäre ein Fachmann in der Lage, zu bestimmen, ob das Blocker-Molekül spezifisch an den Liganden oder den Rezeptor-Körper bindet. Um zu bestimmten, ob das Blocker- Molekül die biologische Aktivität des Liganden neutralisieren kann, könnte ein Fachmann einen Phosphorylierungstest (siehe Beispiel 5) oder alternativ einen funktionellen Biotest wie einen Überlebenstest, unter Verwendung von Primärkulturen von zum Beispiel Endothelzellen, durchführen. Alternativ dazu könnte ein Blocker-Molekül, welches an den Rezeptor-Körper bindet, ein Agonist sein und ein Fachmann würde wissen, wie er dies durch Ausführen eines geeigneten Tests zur Identifizierung zusätzlicher Agonisten des TIE-2-Rezeptors bestimmen könnte.
Da der TIE-2-Rezeptor in Verbindung mit Endothelzellen identifiziert wurde und wie hierin demonstriert die Blockierung des Liganden die Vaskularisierung zu verhindern scheint, haben die Anmelder gezeigt, dass der TIE-2-Ligand für die Induktion von Vaskularisierung in Krankheiten oder Störungen, bei welchen eine solche Vaskularisierung zu erkennen ist, zweckmäßig sein wird. Solche Erkrankungen oder Störungen würden Wundheilung, Ischämie und Diabetes beinhalten. Andererseits wären Antagonisten des TIE-2- Rezeptors, wie Rezeptor-Körper wie sie hierin in den Beispielen 2 und 3 beschrieben sind, und der TIE-2-Ligand 2, wie in Beispiel 9 beschrieben, nützlich sein, Vaskularisierung zu verhindern oder abzuschwächen und damit zum Beispiel Tumorwachstum zu verhindern oder abzuschwächen.
Da TIE-2-Rezeptor tragende Zellen bei der Vaskularisierung hochreguliert zu sein scheinen, können TIE-2-Ligand-Körper auch zur Verhinderung oder Abschwächung von zum Beispiel Tumorwachstum verwendet werden. TIE-2-Ligand-Körper können für die Bereitstellung von Toxinen für eine Rezeptor-tragende Zelle verwendet werden.
Alternativ können andere Moleküle wie Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Nährstoffe über TIE-2-Ligand-Körper für eine TIE-2-Rezeptor tragenden Zelle bereitgestellt werden. TIE-2- Ligand-Körper könnten auch als ein diagnostischer Wirkstoff für den TIE-2-Rezeptor verwendet werden, um den Rezeptor in vivo oder in vitro nachzuweisen. Dort wo der TIE-2-Rezeptor mit einem Erkrankungszustand assoziiert ist, können TIE-2- Ligand-Körper als diagnostische Wirkstoffe zum Nachweis der Erkrankung durch zum Beispiel Gewebefärbung oder Ganzkörper- Bildanalyse verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel, umfassend den TIE-2-Liganden oder Ligand-Körper wie hierin beschrieben, Peptidfragmente davon, oder Derivate mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die TIE-2-Ligand- Proteine, Peptidfragmente oder Derivate können systemisch oder lokal verabreicht werden. Jede angemessene Form der Verabreichung, die im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, intravenös, intrathekal, intraarteriell, intranasal, oral, subcutan, intraperitoneal oder durch lokale Injektion oder operative Implantation. Formulierungen mit Langzeitwirkung werden ebenfalls bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül bereit, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, welche einen menschlichen TIE-2-Liganden codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ausgewählt ist aus:
(a) der Nucleinsäuresequenz, umfassend die codierende Region des menschlichen TIE-2-Liganden wie in Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6 dargelegt;
(b) eine Nucleinsäuresequenz, die unter moderat stringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz von (a) hybridisiert und die einen TIE-2-Liganden codiert, der den TIE-2-Rezeptor bindet; und
(c) eine Nucleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nucleinsäuresequenz von (a) oder (b) hybridisieren würde und einen TIE-2-Liganden codiert, der an den TIE-2-Rezeptor bindet.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das einen TIE-2- Liganden codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ist:
(a) die Nucleinsäuresequenz, die die codierende Region des menschlichen TIE-2-Liganden, wie in Fig. 4, Fig. 5 oder Fig. 6 dargelegt, umfasst;
(b) eine Nucleinsäuresequenz, die unter moderat stringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz von (a) hybridisiert und einen TIE-2-Liganden codiert, der an den TIE-2-Rezeptor bindet; oder
(c) eine Nucleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit der Nucleinsäuresequenz von (a) oder (b) hybridisieren würde und einen TIE-2-Liganden codiert, der an den TIE-2-Rezeptor bindet.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter einen isolierten und aufgereinigten menschlichen TIE-2-Liganden bereit, welcher durch ein erfindungsgemäßes isoliertes Nucleinsäuremolekül codiert wird. Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, welcher ein isoliertes Nucleinsäuremolekül umfasst, welches eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die einen menschlichen TIE- 2-Liganden codiert. In einer Ausführungsform wird der Vektor als pB1uescript KS, welcher den menschlichen TIE-2-Ligand 2 codiert, bezeichnet.
Die Erfindung stellt weiter einen Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül, welches einen menschlichen TIE-2- Liganden codiert, bereit, wobei das DNA-Molekül funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz gekoppelt vorliegt. Die Erfindung stellt auch ein Wirts-Vektor-System zur Herstellung eines Polypeptids bereit, welches die biologische Aktivität eines menschlichen TIE-2-Liganden besitzt, welches den erfindungsgemäßen Expressionsvektor in einer geeigneten Wirtszelle umfasst. In einer Ausführungsform kann die geeignete Wirtszelle eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle sein. Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereit, welches die Aktivität eines biologisch aktiven TIE-2- Liganden besitzt, umfassend das Wachsen der Zellen des erfindungsgemäßen Wirts-Vektor-Systems unter Bedingungen, welche die Herstellung des Polypeptids und die Gewinnung des derart hergestellten Polypeptids erlauben.
Die hierin beschriebene Erfindung eines isolierten Nucleinsäuremoleküls, welches einen TIE-2-Liganden codiert, stellt weiter die Entwicklung des Liganden, eines Fragments oder Derivates davon, oder eines anderen Moleküls, welches ein Rezeptor-Agonist oder Antagonist ist, für ein Arzneimittel bereit zur Behandlung von Patienten, welche an Störungen leiden, die Zellen, Gewebe oder Organe beinhalten, welche den TIE-2-Rezeptor exprimieren. Als nicht einschränkendes Beispiel stellt die vorliegende Erfindung einen Liganden-Körper bereit, der spezifisch an den TIE-2-Rezeptor oder an TIE-2 bindet. In einer alternativen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Ligandenkörper bereit, welcher einen TIE-2- Liganden umfasst, der mit der konstanten Region eines Immunglobulins fusioniert ist. In einer Ausführungsform umfasst der Ligandenkörper den TIE-2-Ligand 1 oder den TIE-2- Ligand 2 und den Fc-Teil des menschlichen IgGl. Der Liganden- Körper kann in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder in einem Verfahren zur Diagnose verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Antikörper bereit, der solch ein therapeutisches Molekül spezifisch bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verwendung eines solchen monoclonalen oder polyclonalen Antikörpers zur Messung der Menge des therapeutischen Moleküls in einer Probe, welche von einem Patienten zum Zwecke der Darstellung des Therapieverlaufs entnommen wurde, bereit.
Die Erfindung stellt weiter ein Arzneimittel bereit, umfassend einen menschlichen TIE-2-Liganden oder Liganden- Körper und ein cytotoxisches Mittel, welches daran gekoppelt ist. In einer Ausführungsform kann das cytotoxische Mittel ein Radioisotop oder ein Toxin sein.
Die Erfindung stellt auch einen Antikörper bereit, welcher spezifisch an einen menschlichen TIE-2-Liganden bindet. Der Antikörper kann monoclonal oder polyclonal sein.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Aufreinigung eines menschlichen TIE-2-Liganden bereit, umfassend:
a) Kopplung Von mindestens einem TIE-2-bindenden Substrat an eine feste Matrix;
b) Inkubation des Substrates aus a) mit einem Zelllysat, derart, dass das Substrat mit jedem menschlichen TIE-2-Liganden in dem Zelllysat einen Komplex bildet;
c) Waschen der festen Matrix; und
d) Elution des menschlichen TIE-2-Liganden von dem gekoppelten Substrat.
Das Substrat kann jede mögliche Substanz sein, welche spezifisch an den menschlichen TIE-2-Liganden bindet. In einer Ausführungsform ist das Substrat ausgewählt aus dem anti-TIE- 2-Liganden-Antikörper, dem TIE-2-Rezeptor und dem TIE-2- Rezeptor-Körper.
Die Erfindung stellt weiter einen Rezeptor-Körper bereit, welcher spezifisch einen menschlichen TIE-2-Liganden bindet, sowie ein Arzneimittel, umfassend den Rezeptor-Körper in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Erfindung stellt auch eine therapeutische Zusammensetzung bereit, umfassend einen menschlichen TIE-2- Liganden oder Liganden-Körper in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Zelle bereit, welche den TIE-2- Rezeptor exprimiert, umfassend Inkontaktbringen einer Zelle mit einem nachweisbar markierten TIE-2-Liganden oder Liganden- Körper unter Bedingungen, die die Bindung des nachweisbar markierten Liganden an den TIE-2-Rezeptor erlauben, und die Bestimmung, ob der nachweisbar markierte Ligand an TIE-2- Rezeptor gebunden ist, wobei die Zelle als eine, die den TIE- 2-Rezeptor exprimiert, identifiziert wird. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Arzneimittel bereit, umfassend einen TIE-2-Liganden oder Liganden-Körper und ein daran gekoppeltes cytotoxisches Mittel. Das cytotoxische Mittel kann ein Radioisotop oder ein Toxin sein.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis de Expression des TIE-2-Liganden durch eine Zelle bereit, umfassend die Gewinnung von mRNA aus der Zelle, das Inkontaktbringen der derart erhaltenen mRNA mit einem markierten Nucleinsäuremolekül, welches einen TIE-2-Liganden codiert, unter Hybridisierungsbedingungen, Bestimmung der Anwesenheit von mRNA hybridisiert an das markierte Molekül, und dabei Nachweis der Expression des TIE-2-Liganden in der Zelle.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines TIE-2-Liganden in Gewebeschnitten bereit, umfassend das Inkontaktbringen des Gewebeschnittes mit einem markieren Nucleinsäuremolekül, welches einen TIE-2-Liganden codiert, unter Hybridisierungsbedingungen, Bestimmung der Anwesenheit von mRNA hybridisiert an das markierte Molekül, und dabei Nachweis der Expression des TIE-2-Liganden in Gewebeschnitten.

BETSPIEL 1 - IDENTIFIZIERUNG DER ABAE-ZELLLINIE ALS REPORTERZELLEN FÜR DEN TIE-2-REZEPTOR

Erwachsene BAE-Zellen sind bei der European Cell Culture Repository unter der Nummer ECACC#92010601 registriert (siehe PNAS 75 : 2621 (1978)). Northern (RNA)-Analysen zeigen mäßige tie-2-Transkriptmengen in der ABAE (Adult Bovine Arterial Endothelial; arterielles Endothel des erwachsenen Rinds)- Zelllinie, in Einklang mit in situ-Hybridisierungs- Ergebnissen, die zeigten, dass tie-2-RNA nahezu ausschließlich in vaskulären Endothelzellen lokalisiert war. Deshalb untersuchten wir ABAE-Zelllysate auf die Anwesenheit von TIE- 2-Protein sowie auf das Ausmaß, mit dem das TIE-2-Protein, unter normalen gegenüber Wachstumsbedingungen mit Serumentzug an Tyrosinresten phosphoryliert ist. ABAE-Zelllysate wurden geerntet und einer Immunpräzipitation unterzogen, gefolgt von Westen Blot-Analysen der immunpräzipitierten Proteine mit TIE- 2-spezifischen und Phosphotyrosin-spezifischen Antiseren. Das Weglassen oder die Einbeziehung von TIE-2-Peptiden als spezifische blockierende Moleküle während der TIE-2- Immunpräzipitation erlaubte die eindeutige Identifizierung von TIE-2 als ein mäßig nachweisbares Protein von - 150 kD, dessen kontinuierlich vorhande Phosphotyrosinmengen durch vorheriges Serum-"Hungern" der Zellen auf annähernd nicht nachweisbare Mengen vermindert werden.
Die Züchtung der ABAE-Zellen und die Ernte der Zelllysate wurde wie folgt durchgeführt. ABAE-Zellen von niedriger Passagierungszahl wurden als Monolayer in einer Dichte von 2 · 106 Zellen / 150 mm Plastikpetrischale (Falcon) ausgesät und in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 10% Rinder-Kälberserum (10% BCS; bovine calfserum), 2 mM L- Glutamin (Q) und jeweils 1% Penicillin und Streptomycin (P-S) in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2;, gezüchtet. Vor der Ernte der Zelllysate wurden die Zellen für 24 Stunden in DMEM/Q/P-S Serum-"gehungert", gefolgt von Absaugen des Mediums und Waschen der Platten mit eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; phosphate buffered sahne), ergänzt mit Natriumorthovanadat, Natriumfluorid und Natriumbenzamidin. Die Zellen wurden in einem kleinen Volumen dieses Waschpuffers, ergänzt mit 1% NP40-Detergenz und den Proteaseinhibitoren PMSF und Aprotinin lysiert. Unlösliche Zelltrümmer wurden von dem Zelllysat durch Zentrifugation bei 14.000 · g für 10 Minuten bei 4ºC entfernt und die Überstände wurden der Immunpräzipitation mit Antiseren, welche für den TIE-2- Rezeptor spezifisch sind, mit oder ohne Anwesenheit von Blockierungspeptiden, welche in - 20 ug/ml dem Lysat zugegeben wurden, unterzogen. Immunpräzipitierte Proteine wurden durch PAGE (7,5% Laemmli-Gel) aufgetrennt und dann auf eine PVDF- Membran elektrotransferiert und entweder mit verschiedenen TIE-2- oder Phosphotyrosin-spezifischen Antiseren inkubiert. Das TIE-2-Protein wurde durch Inkubation der Membran mit HRPgekoppelten sekundären Antiseren, gefolgt von einer Behandlung mit ECL-Reagenz (Amersham), sichtbar gemacht.

BEISPIEL 2 - CLONIERUNG UND EXPRESSION DES TIE-2-REZEPTOR- KÖRPERS FÜR DIE AUF AFFINITÄT BASIERENDE STUDIE VON TIE-2- LIGANDEN-INTERAKTIONEN

Es wurde ein Expressionskonstrukt hergestellt, welches ein sekretiertes Protein erzeugen würde, bestehend aus dem gesamten extrazellulären Teil des TIE-2-Rezeptors der Ratte, fusioniert an die konstante Region des menschlichen Immunglobulins gamma-1 (IgG1 Fc). Dieses Fusionsprotein wird ein TIE-2-"Rezeptor-Körper" (RB; receptorbody) genannt und es wird normalerweise erwartet, dass es in Lösung basierend auf der Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen individuellen IgG1 Fc-Resten als ein Dimer vorkommt. Der Fc-Teil des TIE-2- RB wurde wie folgt hergestellt. Ein DNA-Fragment, welches den Fc-Teil von menschlichem IgG1 codiert, der sich von der Gelenkregion bis zum carboxyterminalen Ende des Proteins erstreckt, wurde durch PCR mit Oligonucleotiden, welche der publizierten Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, aus menschlicher Plazenta-cDNA amplifiziert; das resultierende DNA-Fragment wurde in einen Plasmidvektor cloniert. Geeignete DNA-Restriktionsfragmente aus einem Plasmid, welches den vollständigen TIE-2-Rezeptor codiert, und aus dem menschlichen IgG1-Fc-Plasmid wurden auf beiden Seiten eines kurzen durch PCR-erhaltenen Fragments ligiert, welches derart entworfen worden war, dass es die TIE-2- und menschliches IgG1 Fc Protein codierenden Sequenzen im Leseraster fusionieren konnte. Damit ersetzte das resultierende TIE-2-Ektodomäne-Fc- Fusionsprotein präzise das IgG1-Fc an der Stelle des Bereiches, der die TIE-2-Transmembran- und -cytoplasmatische Domäne enthält. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von RBs ist in Goodwin et. al. Cell 73 : 447-456 (1993) beschrieben. Durch Clonierung des TIE-2-RB-DNA-Fragments in den pVL1393-Baculovirusvektor und nachfolgende Infektion der SDodoptera frucriperda SF-21AE-Insektenzelllinie wurden Milligramm-Mengen des TIE-2-RB erhalten. Alternativ dazu können die Zelllinien SF-9 (ATCC-Hinterlegungs-Nr. CRL-1711) oder die Zelllinie BTI-TN-5b1-4 verwendet werden. TIE-2-RB codierende DNA wurde als ein EcoRI-Notl-Fragment in das Baculovirus-Transferplasmid pVL 1393 cloniert. Durch Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation gereinigte Plasmid-DNA wurde durch Mischen von 3 ug Plasmid-DNA mit 0,5 ug Baculo-Gold-DNA (Pharmingen) in virale DNA rekombiniert, gefolgt von der Einbringung in Liposomen unter Verwendung von 30 ug Lipofection (GIBCO-BRL). DNA-Liposomen-Gemische wurden zu den SF-21AE-Zellen (2 · 10&sup6; Zellen/60 mm Schale) in TMN-FH- Medium (modifiziertes Grace's Insektenzellmedium (GIBCO-BRL)) für 5 Stunden bei 27ºC zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 5 Tage bei 27ºC in TMN-FH-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum. Das Gewebekulturmedium wurde zur Plaque- Aufreinigung rekombinanter Viren geerntet, was unter Verwendung zuvor beschriebener Verfahren durchgeführt wurde (0'Reilly, D. R., L. K. Miller, and V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vektors - A Laboratory Manual. 1992, New York: W. H. Freeman), ausgenommen, dass die Agaroseüberschichtung 125 ug/M1 X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; GIBCO- BRL) enthielt. Nach 5 Tagen Inkubation bei 27ºC wurden nichtrekombinante Plaques durch die positive chromogene Reaktion mit dem X-gal-Substrat ausgewertet und ihre Positionen markiert. Rekombinante Plaques wurden dann durch Zugabe einer zweiten Überschichtung, enthaltend 100 ug/ml MTT (3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]2,5,diphenyltetrazoliumbromid; Sigma) sichtbar gemacht. Putative rekombinante Virus-Plaques wurden durch Ansaugen isoliert (gepickt) und über multiple Plaque- Isolierungsrunden gereinigt, um Homogenität sicher zu stellen. Durch serielle, niedrig multiplizierende Passagen von Plaquegereinigtem Virus wurden Virus-"Stämme" generiert. Stämme aus niedrigen Passagen eines Virusclons (vTIE-2-Rezeptor-Körper) wurden hergestellt.
SF-21AE-Zellen wurden in serumfreiem Medium (SF-900 II, GIBCO-BRL), enthaltend 1 · Antibiotika/Antimycotika-Lösung (GIBCO-BRL) und 25 mg/L Gentamycin (GIBCO-BRL), gezüchtet. Als Tensid wurde Pluronic F-68 in einer Endkonzentration von 1 g/L zugegeben. Vor der Infektion wurden die Kulturen (4 L) in einem Bioreaktor (Artisan Cell Station System) für mindestens drei Tage vermehrt. Die Zellen wurden bei 27ºC unter Begasung mit 50% gelöstem Sauerstoff, bei einer Gasflussrate von 80 ml/Min. (Belüftung über ein Einblasrohr) gezüchtet. Das Schütteln wurde mit Hilfe eines Schiffsflügelrads mit einer Geschwindigkeit von 100 UpM durchgeführt. Die Zellen wurden in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (- 2 · 106 Zellen pro ml) geerntet, durch Zentrifugation konzentriert und mit 5 Plaquebildenden Einheiten vTIE-2-Rezeptor-Körper pro Zelle infiziert. Die Zellen und das Inokulat wurden mit frischem Medium auf 400 ml aufgefüllt, und das Virus wurde für 2 Stunden bei 27ºC in einem Schüttelkolben adsorbiert. Die Kultur wurde dann in einem Endvolumen von 8 l mit frischem serumfreiem Medium resuspendiert und die Zellen unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen in dem Bioreaktor inkubiert.
72 Stunden nach der Infektion wurde das Kulturmedium der vTIE-2-Rezeptor-Körper-infizierten SF21AE-Zellen durch Zentrifugation gesammelt (500 · g, 10 Minuten). Die Zellüberstände wurden mit NaOH auf pH 8 gebracht. EDTA wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben und der pH- Wert des Überstandes wurde wiederum auf 8 eingestellt. Die Überstände wurden filtriert (0,45 um, Millipore) und auf eine Protein A-Säule geladen (Protein A Sepharose 4 fast flow oder HiTrap-Protein A, beide von Pharmacia). Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl, gewaschen bis die Absorption bei 280 nm auf die Basislinie zurückging. Die Säule wurde in PBS gewaschen und mit 0,5 M Essigsäure eluiert. Die Fraktionen der Säule wurden durch Elution in Röhrchen, welche 1 M Tris pH 9 enthielten, sofort neutralisiert. Die Peak-Fraktionen, welche den TIE-2-RB enthielten, wurden vereint und gegen PBS dialysiert.

BEISPIEL 3 - DARSTELLUNG, DASS TIE-2-EINE KRITISCHE ROLLE BEI DER ENTWICKLUNG DES GEFÄßSYSTEMS BESITZT

Unter der Voraussetzung, dass kein bekannter Ligand für den TIE-2-Rezeptor anwesend ist, wurde überlegt, dass es möglich sein könnte, Einsicht in die Funktion von TIE-2-zu gewinnen, wenn löslicher TIE-2-Rezeptor-Körper (TIE-2-RB) im Überschuss in ein sich entwickelndes System eingebracht würde. Die potentielle Fähigkeit von TIE-2-RB verfügbaren TIE-2- Liganden zu binden und dabei zu neutralisieren könnte in einer beobachtbaren Störung der normalen vaskulären Entwicklung und der Charakterisierung des Liganden resultieren. Um zu testen, ob TIE-2-RB dazu verwendet werden könnte, die vaskuläre Entwicklung in frühen Hühnerembryonen zu stören, wurden kleine Stücke eines biologisch resorbierbaren Schaumstoffes mit TIE- 2-RB getränkt und unmittelbar neben die chorioallantoische Membran, an Positionen direkt seitlich an dem primitiven Embryo, eingesetzt.
Frühe Hühnerembryonen entwickeln sich oberhalb des Dotters aus einer schmalen Scheibe von Zellen, welche durch die Chorioallantoismembran (CAM) bedeckt ist. Die Endothelzellen, die entstehen, um das Blutgefäßsystem in dem Embryo auszukleiden, entwickeln sich sowohl aus extra- und intraembryonalen Quellen von Zellen. Extraembryonal abstammende Endothelzellen, welche die Hauptquelle an Endothelzellen in dem Embryo bereitstellen, stammen von Auswachsungen des Mesenchyms, welche sich seitlich, rund herum den Embryo eingrenzend direkt unter der CAM, befinden. Während der Reifung dieser Mesenchym-Zellen lassen sie einen gemeinsamen Vorläufer von sowohl den endothelialen als auch hämatopoetischen Zelllinien entstehen, welcher als Hämangioblast bezeichnet wird. Der Hämangioblast wiederum lässt eine gemischte Population von Angioblasten (der Vorläufer der Endothelzelle) und Hämatoblasten (der pluripotente hämatopoetische Vorläufer) entstehen. Die Bildung von Rudimenten des Zirkulationssystems beginnt, wenn die Nachkommen der Endothelzellen sich absondern, um ein eine Zelle dickes Vesikel auszubilden, welches die primitiven Blutzellen umgibt. Die Proliferation und Migration dieser zellulären Komponenten produziert gegebenenfalls ein ausgedehntes Netzwerk von mit Blut gefüllten Mikrogefäßen unter der CAM, welches schließlich in den Embryo eindringt, um sich mit den begrenzten intraembryonal abstammenden vaskulären Elementen zu vereinen.
Frisch befruchtete Hühnereier, welche von Spafas, Inc. (Boston, MA) erhalten wurden, wurden bei 99,5ºF, 55% RH inkubiert. Nach etwa 24 Stunden der Entwicklung wurde die Eischale mit 70%igem Alkohol abgewischt und unter Verwendung eines Zahnarztbohrers wurde ein 1,5 cm Loch in die flache Spitze von jedem Ei gebohrt. Die Schalenmembran wurde entfernt, wobei ein Luftraum direkt über dem Embryo erhalten wurde. Kleine rechteckige Stücke des sterilen Gelschaumes (Upjohn) wurden mit einem Skalpell geschnitten und in der gleichen Konzentration von entweder TIE-2- oder EHK-1- Rezeptor-Körper getränkt. Der EHK-1-Rezeptor-Körper wurde wie in Beispiel 2 dargestellt hergestellt, wobei die EHK-1- extrazelluläre Domäne anstatt der TIE-2-extrazellulären Domäne verwendet wurde (Maisonpierre et al., Oncogene 8: 3277-3288 (1993). Jedes Gelschaum-Stück absorbierte etwa 6 ug Protein in 30 ul. Sterile Uhrmacherpinzetten wurden verwendet, um einen kleinen Riss in der CAM an einer Position, welche sich einige Millimeter seitlich des primitiven Embryos befindet, zu setzen. Der größte Teil des Stücks RB-getränkten Gelschaumes wurde unter der CAM inseriert und die Eischale wurde mit einem Stück haftendem Klebeband bedeckt. Andere Eier in ähnlichen Stadien wurden parallel dazu mit RB der nicht verwandten, neuronal exprimierten Rezeptor-Tyrosinkinase, EHK-1, behandelt (Maisonpierre et al., Oncogene 8 : 3277-3288 (1993). Der Entwicklungsvorgang konnte sich daraufhin für vier weitere Tage fortsetzen und dann wurden die Embryonen durch visuelle Inspektion überprüft. Die Embryonen wurden entfernt, indem die Schalen in Schälchen mit erwärmtem PBS vorsichtig zerbrochen wurden und der Embryo mit der umgebenden CAM vorsichtig herausgeschnitten wurde. Von 12 Eiern, welche mit jedem RB behandelt wurden, hatten sich 6 TIE-2-RB- und 5 EHK-1-RBbehandelte Embryonen über das Stadium hinaus entwickelt, welches zum Beginn des Experimentes zu beobachten war. Wie in den Fig. 1A und 1B gezeigt, war zwischen diesen entwickelten Embryonen ein dramatischer Unterschied zu sehen. Diejenigen, die mit EHK-1-RB behandelt wurden, schienen sich relativ normal entwickelt zu haben. Vier von fünf EHK-1- Embryonen waren lebensfähig, was durch die Anwesenheit eines schlagenden Herzens beurteilt wurde. Darüber hinaus war das extraembryonale Blutgefäßsystem üppig und erstreckte sich mehrere Zentimeter seitlich unter der CAM, was aufgrund der Anwesenheit von roten Blutzellen deutlich sichtbar war. Im Gegensatz waren diejenigen, welche mit TIE-2-RB behandelt wurden, stark verkümmert, mit einem Durchmesser von 2-5 mm im Vergleich mit mehr als 10 mm im Durchmesser für die EHK-1-RB- Embryonen. Alle TIE-2-RB-behandelten Embryonen waren tot und ihre CAMs waren ohne Blutgefäße. Die Fähigkeit von TIE-2-RB, in dem Huhn die vaskuläre Entwicklung zu blockieren, zeigt, dass der TIE-2-Ligand für die Entwicklung des Blutgefäßsystems notwendig ist.

BEISPIEL 4 - IDENTIFIZIERUNG EINER TIE-2-SPEZIFISCHEN BINDUNGSAKTIVITÄT IN KONDITIONIERTEM MEDIUM AUS EINER MIT DEM RAS-ONKOGEN-TRANSFORMIERTEN C2C12-MAUS-MYOBLASTENZELLLINIE

Die Durchmusterung eines zehnfach konzentrierten Zellkonditionierten Mediums (10 · CCM) von verschiedenen Zelllinien auf die Anwesenheit von löslicher, TIE-2- spezifischer Bindungsaktivität (BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) offenbarte Bindungsaktivität in serumfreien Medium von mit onkogenem-ras-transformierten C2C12-Zellen (C2C12-ras), in RAT 2-ras (eine mit ras transformierte Fibroblastenzelllinie), in menschlichem Glioblastom T98 G und in der menschlichen Neuroblastomzelllinie, welche als SHEP-1 bekannt ist.
Das C2C12-ras 10 · CCM stammte von einer stabil transfizierten Linie von C2C12-Myoblasten, welche durch Transfektion mit Hilfe von auf Calciumphosphat basierenden Standardverfahren mit der T-24 Mutante von H-ras onkogen transformiert wurde. Um die Selektion transfizierter Clone zu erlauben, wurde ein auf SV40 basierendes Neomycin-Resistenz- Expressionsplasmid mit dem ras-Eypressionsplasmid physikalisch gekoppelt. Die resultierende G418-resistenten ras-C2C12-Zellen wurden routinemäßig als ein Monolayer auf Plastikschalen in DMEM/Glutamin/Penicillin-Streptomycin, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), erhalten. Serumfreies C2C12-ras 10 x CCM wurde durch Aussaat der Zellen in 60% Konfluenz in einem serumfreien definierten Medium für 12 Stunden hergestellt. (Zhan and Goldfarb, Mol. Cell. Biol. 6: 3541-3544 (1986)); Zhan et al., Oncogene 1: 369-376 (1987)). Das Medium wurde verworfen und für 24 Stunden mit frischem DMEM/Q/P-S ersetzt. Das Medium wurde geerntet und die Zellen wurden wieder mit frischem DMEM/Q/P-S versetzt, welches nach weiteren 24 Stunden ebenfalls geerntet wurde. Diese CCM wurden mit den Proteaseinhibitoren PMSF (1 mM) und Aprotinin (10 ug/ml) ergänzt und mit sterilen Größenausschluss-Membranen (Amicon) konzentriert. Die TIE-2-Bindungsaktivität konnte vor der BlAcore-Analyse durch Inkubation des Mediums mit einem Überschuss an TIE-2-RB, jedoch nicht durch Inkubation mit EHK- 1 RB, neutralisiert werden.
Die Bindungsaktivität der 10 · CCM wurde unter Verwendung der Biosensor-Technologie (BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gemessen, welche biomolekulare Interaktion über Oberflächen-Plasmonresonanz in Echtzeit kontrolliert. Gereinigtes TIE-2-RB wurde über primäre Amide an die Carboxymethyldextranschicht eines CM5-Forschungsgrad- Sensorchip (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ) gekoppelt.
Die Sensorchip-Oberfläche wurde unter Verwendung eines Gemisches aus N-Hydroxysuccinimid (NHS) und N-Ethyl-N'-(3- Dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), aktiviert, gefolgt von der linmobilisation von TIE-2-RB (25 ug/ml, pH 4, 5) und der Desaktivierung nicht umgesetzter Stellen mit 1,0 M Ethanolamin (pH 8,5). Eine Negativ-Kontroll-Oberfläche des EHK-1-Rezeptor- Körpers wurde auf ähnliche Art und Weise hergestellt.
Der in dem System verwendete Laufpuffer war HBS (10 mM Hepes, 3, 4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005% P20-Tensid, pH 7,4). Die 10 · CCM-Proben wurden für 15 Min. bei 4ºC zentrifugiert und unter Verwendung eines sterilen 0,45 psn-Filters mit niedriger Protein-Bindungsaktivität (Millipore; Bedford, MA) weiter geklärt. Zu jeder CCM-Probe wurde Dextran (2 mg/ml) und P20-Tensid (0,005%) zugegeben. Aliquote von 40 ul wurden bei einer Durchflussrate von 5 ul/min über die immobilisierte Oberfläche injiziert (entweder TIE-2-oder EHK-1) und die Rezeptorbindung wurde für 8 min kontrolliert. Die Bindungsaktivität (Resonanzeinheiten, RU) wurde als die Differenz zwischen einem Basiswert, welcher 30 s bevor die Probe injiziert wurde bestimmt wurde, und einer Messung, welche 30 s nach der Injektion durchgeführt wurde, festgelegt. Die Regeneration der Oberfläche wurde mit einem 12-ul-Puls aus 3 M MgCl&sub2; erreicht.
Das Hintergrundrauschen des Instruments beträgt 20 RU; aufgrund dessen kann jede Bindungsaktivität mit einer Signalstärke über 20 RU als eine tatsächliche Interaktion mit dem Rezeptor interpretiert werden. Für C2C12-raskonditioniertes Medium lagen die Bindungsaktivitäten im Bereich zwischen 60-90 RU für die TIE-2-RB-immobilisierte Oberfläche. Für die gleichen Proben, welche mit einer EHK-1- RB-immobilisierten Oberfläche getestet wurden, waren die gemessenen Aktivitäten geringer als 35 RU. Die spezifische Bindung des TIE-2-Rezeptor-Körpers wurde durch Inkubation der Proben mit einem Überschuss von entweder löslichem TIE-2-oder EHK-1-RB vor dem Testen der Bindungsaktivität bewertet. Die Zugabe von löslichem EHK-1-RB hatte keinen Effekt auf die TIE- 2-Bindungaktivität mit jeder der Proben, während in Anwesenheit von löslichem TIE-2 die Bindung an die Oberfläche um zwei Drittel weniger ist als die in Abwesenheit von TIE-2- gemessene. Ein Wiederholungstest, in dem > 50 · konzentriertes C2C12-ras-CCM verwendet wurde, resultierte in einer Vierfachverstärkung über den Hintergrund des TIE-2- spezifischen Bindungssignals.

BEISPIEL 5 - C2C12-RAS CCM ENTHÄLT EINE AKTIVITÄT, WELCHE DIE TYROSIN-PHOSPHORYLIERUNG DES TIE-2-REZEPTORS INDUZIERT

C2C12-ras-CCM wurde auf seine Fähigkeit, Tyrosin- Phosphorylierung von TIE-2-in ABAE-Zellen zu induzieren, getestet. Serum-gehungerte ABAE-Zellen wurden kurz mit C2C12- ras-CCM inkubiert, lysiert und einer Immunpräzipitation und Western-Analysen, wie nachfolgend beschrieben, unterzogen. Die Stimulation der Serum-gehungerten ABAE-Zellen mit serumfreiem C2C12-ras 10 · CCM wurde wie folgt durchgeführt. Das Medium von ABAE-Zellen, welche wie vorstehend beschrieben gehungert wurden, wurde entfernt und entweder mit definiertem Medium oder 10 · CCM, welches auf 37ºC vorgewärmt war, ersetzt. Nach 10 Minuten wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden auf Eis zweimal mit einem Überschuss an eiskaltem PBS, ergänzt mit Orthovanadat/NaF/Benzamidin, zweimal gewaschen. Die Zelllyse und TIE-2-spezifische Immunpräzipitation wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
ABAE-Zellen, welche 10 Minuten mit definiertem Medium inkubiert wurden, zeigten keine Induktion von TIE-2-Tyrosin- Phosphorylierung, wohingegen die Inkubation mit C2C12-ras-CCM einen mindestens hundertfachen Anstieg der TIE-2- Phosphorylierung stimulierte. Diese Aktivität wurde durch Vorinkubation des C2C12-ras 10 · CCM für 90 Minuten bei Raumtemperatur mir 13 ug TIE-2-RB, gekoppelt an Protein G- Sepharose-Kügelchen, nahezu vollständig aufgehoben. Medium, welches ausschließlich mit Protein G-Sepharose inkubiert wurde, zeigte keine verringerte Phosphorylierungsaktivität.

BEISPIEL 6 - EXPRESSIONSCLONIERUNG DES TIE-2-LIGANDEN

COS-7-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 10% fötales Kälberserum (FBS; fetal bovine serum), 1% von sowohl Penicillin als auch Streptomycin (P/S) und 2 mM Glutamin in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; gezüchtet. Die Maus-Myoblastenzelllinie C2C12-ras wurde in Eagle's minimalem essentiellen Medium (EMEM) mit 10% FBS, (P/S) und 2 inH Glutamin gezüchtet. Vollständige Maus-TIE-2- Ligand-cDNA-Clone wurden anhand der Durchmusterung einer C2C12-ras-cDNA-Bibliothek in dem pJFEl4-Vektor, welcher in COS-Zellen exprimiert wurde, erhalten. Dieser Vektor ist, wie in Fig. 2 gezeigt, eine modifizierte Version des Vektors pSRa (Takebe, et al. 1988, Mol. Cell. Biol. 8 : 466-472). Die Bibliothek wurde unter Verwendung der beiden BSTX1- Restriktionsstellen in dem pJFE-Vektor hergestellt.
COS-7-Zellen wurden entweder mit der pJFE14- Bibliothek oder dem Kontrollvektor mit Hilfe des DEAE-Dextran- Transfektionsprotokoll transient transfiziert. Kurz zusammengefasst, die COS-7-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion in einer Dichte von 1,0 · 106 Zellen pro 100 mm Platte ausgesät. Zur Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, enthaltend 400 ug/ml DEAE-Dextran, 1 uM Chloroquin, und 2 mM Glutamin, und 1 ug der jeweiligen DNA bei 37ºC für 3-4 Stunden in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; gezüchtet. Das Transfektionsmedium wurde abgesaugt und mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10% DMSO für 2-3 Minuten ersetzt. Nach diesem DMSO-"Schock", wurden die COS-7-Zellen für 48 Stunden in DMEM mit 10% FBS, 1% von jeweils Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin gegeben.
Da der TIE-2-Ligand sekretiert wird, war es notwendig, die Zellen zu permeabilisieren, um die Bindung der Rezeptor-Körper-Sonde an den Liganden nachzuweisen. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und dann mit PBS, enthaltend 1,8% Formaldehyd, für 15-30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und für 15 Min. mit PBS, enthaltend 0,1% Triton X- 100 und 10% Rinder-Kälberserum, inkubiert, um die Zellen zu permeabilisieren und nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren, Die Durchmusterung wurde durch direkte Lokalisation von Färbung, unter Verwendung eines TIE-2- Rezeptor-Körpers, welcher aus der extrazellulären Domäne von TIE-2-fusioniert an die konstante Region von IgG1 zusammengesetzt war, durchgeführt. Dieser Rezeptor-Körper wurde wie in Beispiel 2 dargestellt hergestellt. Eine 100 mm- Schale von transfizierten, fixierten und permeabilisierten COS-Zellen wurden durchmustert, indem sie für 30 Minuten mit TIE-2-RB inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und für zusätzliche 30 Minuten mit PBS/10% Rinder-Kälberserum/anti-Mensch IgG-alkalische Phosphatase- Konjugat inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS wurden die Zellen für 30-60 Minuten in alkalische Phosphatase- Substrat inkubiert. Die Schale wurde dann mikroskopisch auf die Anwesenheit gefärbter Zellen inspiziert. Für jede gefärbte Zelle wurde ein kleiner Bereich von Zellen, einschließlich der gefärbten Zelle, unter Verwendung einer Plastik-Pipettenspitze von der Platte geschabt und die Plasmid-DNA wurde dann gewonnen und verwendet, um bakterielle Zellen einer Elektroporation zu unterziehen. Einzelne bakterielle Kolonien, welche aus der Elektroporation resultierten, wurden gepickt und die Plasmid-DNA, welche aus diesen Kolonien hergestellt wurde, wurde dazu verwendet, um COS-7-Zellen zu transfizieren, welche auf TIE-2-Liganden-Expression getestet wurden, was sich durch Bindung an TIE-2-Rezeptor-Körper ausdrückt. Dies erlaubte die Identifizierung eines einzelnen Clons, der den TIE-2-Liganden codiert. Die Bestätigung der TIE-2-Liganden- Expression wurde durch Phosphorylierung des TIE-2-Rezeptors erhalten, wobei das Verfahren, welches in Beispiel 5 dargestellt ist, verwendet wurde. Ein Plasmid-Clon, der den TIE-2-Liganden codiert, wurde bei der ATCC mit der ATCC- Hinterlegungs-Nr. 75910 am 07. Oktober 1994 hinterlegt und als "pJFE14, welcher den TIE-2-Liganden codiert" bezeichnet.

BEISPIEL 7 - ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES VOLLSTÄNDIGEN cDNA-CLONS, DER DEN MENSCHLICHEN TIE-2-LIGANDEN CODIERT

Von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) wurde eine menschliche fötale Lungen-cDNA-Bibliothek in Lambda gt-10 erhalten (siehe Fig. 3). Die Plaques wurden in einer Dichte von 1,25 · 106/20 · 20 cm Platte ausgesät, und unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Seite 8.46, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) wurden Replikafilter davon hergestellt.
Die Isolierung des menschlichen tie-2-Liganden-Clons wurde wie folgt durchgeführt. Ein 2, 2 kb XhoI-Fragment des hinterlegten tie-2-Liganden-Clons (ATCC Nr. 75910 - siehe vorstehendes Beispiel 6) wurde mit Hilfe des "random priming" zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 5 · 10&sup8; cpm/ng markiert. Die Hybridisierung wurde bei 65ºC in Hybridisierungslösung, welche 0,5 mg/ml Heringssperma-DNA enthielt, durchgeführt. Die Filter wurden bei 65ºC in 2 · SSC, 0,1% SDS gewaschen und über Nacht bei -70ºC mit Kodak XAR-5 Film exponiert. Positive Phagen wurden Plaque-gereinigt. Hohe Titer von Phagenlysaten aus gereinigte Phagen wurden für die Isolierung von DNA unter Verwendung von Standardverfahren mit Hilfe einer Qiagensäule (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, 1995 Katalog, Seite 36) eingesetzt. Die Phagen-DNA wurde mit EcoRI geschnitten, um das clonierte cDNA-Fragment für die nachfolgende Subclonierung freizusetzen. Ein Lambda- Phagenvektor, welcher DNA von menschlichem tie-2-Liganden enthielt, wurde am 26. Oktober 1994 unter der Bezeichnung λgt10, welcher htie-2-Ligand 1 codiert, bei der ATCC hinterlegt (ATCC Hinterlegungs-Nr. 75928). Die Phagen-DNA kann direkt der DNA-Sequenzanalyse durch die Didesoxy-Kettenabbruchmethode (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 74: 5463- 5667) unterzogen werden.

Subclonierung des menschlichen TIE-2-Liganden in einen Säuger- Exuressionsvektor

Der Clon λgt10, der htie-2-Ligand 1 codiert, enthält eine EcoRI-Schnittstelle, welche 490 Basenpaare stromabwärts vom Start der codierenden Sequenz für den menschlichen TIE-2- Liganden entfernt lokalisiert ist. Die codierende Region kann unter Verwendung einzelner Restriktions-Schnittstellen stromaufwärts und stromabwärts des Initiations- bzw. Stop- Codons ausgeschnitten werden. Eine SpeI-Schnittstelle zum Beispiel ist 70 bp 5' des Initiationscodons lokalisiert, und eine BpullO2i (auch bekannt als Blpl)-Schnittstelle, welche 265 bp 3' des Stopcodons lokalisiert ist, können verwendet werden, um die vollständige codierende Region auszuschneiden. Diese kann dann in den pJFE14-Clonierungsvektor subcloniert werden, wobei die XbaI (verträglich mit dem SpeI-Überhang) und die PstI-Schnittstellen (sowohl die PstI und die Bpu11O2i- Schnittstellen werden beide an den Enden geglättet) verwendet werden.

Sequenzierung des menschlichen TIE-2-Liganden

Die codierende Region von Clon λgt10, welche den htie-2-Ligand 1 codiert, wurde unter Verwendung des ABI 373A- DNA-Sequenzierautomaten und dem Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing-Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Die Nucleotid- und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem TIE-2-Liganden des Clons λgt10, welcher den htie-2-Ligand 1 codiert, ist in Fig. 4 gezeigt.
Zusätzlich wurden vollständige menschliche TIE-2- Ligand-cDNA-Clone mit Hilfe der Durchmusterung einer menschlichen Glioblastom T98 G cDNA-Bibliothek in dem pJFE14- Vektor erhalten. Clone, welche den menschlichen tie-2-Liganden codieren, wurden durch DNA-Hybridisierung unter Verwendung eines 2,2 kb XhoI-Fragments aus dem hinterlegten tie-2- Liganden-Clon (ATCC Nr. 75910) als Sonde (siehe vorstehendes Beispiel 6) identifiziert. Die codierende Region wurde unter Verwendung des ABI 373A-DNA-Sequenzierautomaten und dem Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing-Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Diese Sequenz war mit der von Clon λgt10, welche htie-2-Ligand 1 codiert, nahezu identisch. Wie in Fig. 4 gezeigt, enthält der Clon λgt10, welcher den htie-2-Ligand 1 codiert, einen zusätzlichen Glycin-Rest, welcher durch die Nucleotide 1114-1116 codiert wird. Die codierende Sequenz des T98 G-Clons enthält diesen Glycin-Rest nicht, ist ansonsten aber identisch mit der codierenden Sequenz des Clons λgt10, welcher htie-2-Ligand 1 codiert. Fig. 5 stellt die Nucleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem TIE-2-Ligand aus dem T98 G- Clon dar.

BEISPIEL 8 ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG EINES ZWEITEN VOLLSTÄNDIGEN CDNA-CLONS, WELCHER EINEN MENSCHLICHEN TIE-2- LIGANDEN CODIERT

Von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) wurde eine menschliche fötale Lungen-cDNA-Bibliothek in Lambda gt-10 erhalten (siehe Fig. 3). Die Plaques wurden in einer Dichte von 1,25 · 10&sup6;/20 · 20 cm-Platte ausgesät und unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Seite 8.46, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) wurden Replikafilter davon hergestellt.
Doppelbestimmungs-Filter wurden bei niedriger Stringenz (2 · SSC, 55ºC) mit Sonden, welche gegen die menschliche tie-2-L-1-Sequenz gemacht wurden, durchmustert. Einer der Doppel-Filter wurde mit einer 5'-Sonde, codierend die Aminosäuren 25-265 von menschlichem tie-2-L-1, wie in Fig. 4 dargestellt, getestet. Der zweite Doppel-Filter wurde mit einer 3'-Sonde, codierend die Aminosäuren 282-498 der menschlichen tie-2-L-1-Sequenz (siehe Fig. 4) getestet (hybridisiert). Beide Sonden wurden bei 55ºC in einer Hybridisierungslösung, enthaltend 0,5 mg/ml Lachsssperma-DNA, hybridisiert. Die Filter wurden bei 55ºC in 2 · SSC gewaschen und über Nacht einem Röntgenfilm ausgesetzt. Zusätzlich wurden Doppel-Filter auch bei normaler Stringenz (2 · SSC, 65ºC) gegen eine vollständige codierende Sonde des Maus-tie2L (F3- 15, XhoI-Insertion) hybridisiert. Drei positive Clone wurden gepickt, welche die folgenden Kriterien erfüllten: i. bei normaler Stringenz war gegen die vollständige (Maus) Sonde keine Hybridisierung nachweisbar, und ii. bei niedriger Stringenz war eine Hybridisierung sowohl mit der 5'- als auch mit der 3'-Sonde nachweisbar. Eine Spaltung der Phagen-DNA, welche aus diesen Clonen erhalten wurde, mit EcoRI ergab zwei unabhängige Clone mit Insertionsgrößen von etwa 2,2 kb und etwa 1,8 kb. Die 2,2 kb-EcoRI-Insertion wurde in die EcoRI- Schnittstellen von sowohl pBluescript KS (Stratagene) und eines Expressionsvektors für Säuger, welcher für die Verwendung in COS-Zellen geeignet ist, subcloniert. Für den Säuger-Expressionsvektor wurden zwei Orientierungen identifiziert. Die 2,2 kb-Insertion in den pBluescript KS wurde am 9. Dezember 1994 bei ATCC hinterlegt und als pBluescript KS, welcher menschlichen TIE-2-Ligand 2 codiert, hinterlegt. Die Startstelle der TIE-2-Ligand 2-codierenden Sequenz liegt etwa 355 Basenpaare stromabwärts der EcoRI- Schnittstelle des pBluescript.
COS-7-Zellen wurden entweder mit dem Expressionsvektor oder dem Kontrollvektor mit Hilfe des DEAE- Dextran-Transfektionsprotokolls transient transfiziert. Kurz, 24 Stunden vor der Transfektion wurden COS-7-Zellen in einer Dichte von 1,0 · 106 Zellen pro 100 mm-Platte ausgesät. Für die Transfektion wurden die Zellen in serumfreiem DMEM, enthaltend 400 ug/ml DEAE-Dextran, 1 uM Chloroquin und 2 mM Glutamin, und 1 ~g der jeweiligen DNA für 3-4 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; gezüchtet. Die Transfektionsmedien wurden abgesaugt und für 2-3 Min. mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 10% DMSO ersetzt. Nach diesem DMSO-"Schock" wurden die COS-7-Zellen für 48 Stunden in DMEM mit 10% FBS, 1% von jeweils Penicillin und Streptomycin und 2 mM Glutamin gegeben.
Da der TIE-2-Ligand sekretiert wird, war es notwendig, die Zellen zu permeabilisieren, um die Bindung der Rezeptor-Körper-Sonde an den Liganden nachzuweisen.
Transfizierte COS-7-Zellen wurden in einer Dichte von 1,0 · 10&sup6; Zellen pro 100 mm-Platte ausgesät. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann bei Raumtemperatur mit PBS, enthaltend 1,8% Formaldehyd für 15-30 Min. inkubiert. Um die Zellen zu permeabilisieren und nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurden die Zellen dann mit PBS gewaschen und für 15 Min. mit PBS, enthaltend 0,1% Tritron X-100 und 10% Rinder-Kälberserum, inkubiert. Die Durchmusterung wurde durch direkten Nachweis der Färbung, unter Verwendung eines TIE-2- Rezeptor-Körpers, welcher aus der extrazellulären Domäne von TIE-2 fusioniert an die konstante Region des IgG1 zusammengesetzt ist, durchgeführt. Dieser Rezeptor-Körper wurde wie in Beispiel 2 dargestellt hergestellt. Transfizierte COS-Zellen wurden getestet, indem sie für 30 Min, mit TIE-2-RB inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen, mit Methanol fixiert, und dann für weitere 30 Min. mit PBS/10% Rinder-Kälberserum/anti-Mensch IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat inkubiert. Nach drei PBS-Waschschritten wurden die Zellen für 30-60 Min. in alkalische Phosphatase- Substrat inkubiert. Die Schale wurde dann mikroskopisch auf die Anwesenheit von gefärbten Zellen inspiziert. Die Zellen, welche eine Orientierung des Clons exprimieren, jedoch nicht die andere Orientierung, konnten nachweislich den TIE-2- Rezeptor-Körper binden.
Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden können, um weiterhin andere verwandte Mitglieder der TIE Liganden-Familie zu identifizieren.
Sequenzierunci des zweiten menschlichen TIE-2-Liganden Die codierende Region des Clons pBluescript KS, welcher menschlichen TIE-2-Ligand 2 codiert, wurde unter Verwendung des ABI 373A DNA-Sequenzierautomaten und mit Hilfe des Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing-Kits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Die Nucleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem TIE- 2-Ligand aus dem Clon pBluescript KS, welcher menschlichen TIE-2-Ligand 2 codiert, ist in Fig. 6 gezeigt.

BEISPIEL 9 - DER TIE-2-LIGAND 2 IST EIN REZEPTOR-ANTAGONIST

Konditionierte Medien aus COS-Zellen, welche entweder TIE-2-Ligand 2 (TL 2) oder TIE-2-Ligand 1 (TL1) exprimieren, wurden auf ihre Fähigkeit, die in einer menschlichen Endothelzelllinie natürlicherweise vorkommenden TIE-2- Rezeptoren zu aktivieren, verglichen.
Lipofectamin-Reagenz (GIBCO-BRL, Inc.) und die empfohlenen Protokolle wurden verwendet, um COS-7-Zellen entweder mit dem pJFE14-Expressionsvektor alleine, die cDNA des menschlichen TIE-2-Ligand 1 enthaltenden pJFE14-Vektor oder mit einem pMT21-ExpressicSnsvektor (Kaufmann, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689-693), welcher die cDNA des menschlichen TIE-2-Ligand 2 enthält, zu transfizieren. COS- Medien, welche die sekretierten Liganden enthalten, wurden nach drei Tagen geerntet und durch Diafiltration (DIAFLO Ultrafiltrationsmembranen, Amicon, Inc.) 20-fach konzentriert. Die Menge an aktivem TIE-2-Ligand 1 und TIE-2-Ligand 2, die in diesen Medien vorhanden war, wurde bestimmt und ausgedrückt als die Menge an TIE-2-Rezeptor-spezifischer Bindungsaktivität, welche durch einen BlAcore-Bindungstest gemessen wurde (in Resonanzeinheiten, R. U.; resonance units). Northern (RNA)-Analysen zeigten signifikante Mengen TIE-2- Transkripte in HAEC (Human Aortic Endothelial Cell; Endothelzelle der menschlichen Aorta) primären menschlichen Endothelzellen (Clonetics, Inc.). Deshalb wurden diese Zellen verwendet, um zu testen, ob der TIE-2-Rezeptor Tyrosinphosphoryliert wird, wenn sie den COS-Medien, welche die TIE- 2-Liganden enthalten, ausgesetzt werden. HAEC-Zellen wurden in einem vollständigen Endothelzell-Wachstumsmedium (Clonetics, Inc.), welches 5% fötales Kälberserum, löslichen Kälber- Hirnextrakt, 10 ng/ml menschlichen EGF, 1 mg/ml Hydrocortison, 50 mg/ml Gentamicin und 50 ng/ml Amphotericin-B enthielt, erhalten. Die Bewertung, ob TL1 und TL2 den TIE-2-Rezeptor in den HAEC-Zellen aktivieren kann, wurde wie folgt durchgeführt. Semikonfluente HAEC-Zellen wurden für zwei Stunden in Hoch- Glucose-Dulbecco's MEM mit zugesetztem L-Glutamin und Penicillin-Streptomycin bei 37ºC Serum-gehungert, gefolgt von dem Ersatz des Hungermediums mit Liganden-enthaltenden konditionierten COS-Medien für 7 Minuten bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;-Inkubator. Nachfolgend wurden die Zellen lysiert und das TIE-2-Rezeptorprotein wurde durch Immunpräzipitation mit TIE- 2-Peptidantiserum aus den Lysaten wiedergewonnen, gefolgt von Western Blot-Analyse mit anti-Phosphotyrosin-Antiserum, genau wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. Die Phosphotyrosin-Mengen am TIE-2-Rezeptor (TIE-2-R) wurden durch die Behandlung von HAEC-Zellen mit TIE-2-Ligand 1 (Spur L1) aber nicht durch TIE-2-Ligand 2 (Spur L2) konditionierte COS-Medien induziert. MOCK ist konditioniertes Medium aus COS-Zellen, welche mit dem leeren JFE14-Vektor transfiziert wurden.
Hinweise darauf, dass sowohl TL1 als auch TL2 spezifisch an den TIE-2-Rezeptor binden, wurden unter Verwendung eines BlAcore, um die TIE-2-Rezeptor-spezifischen Bindungsaktivitäten in transfizierten COS-Medien zu testen und durch Immunfärbung von TL1- und TL2-exprimierenden COS-Zellen mit TIE-2-Rezeptor-Körpern, dargestellt.
Da TL2 den TIE-2-Rezeptor nicht aktivierte, beabsichtigten die Amnelder zu bestimmen, ob TL2 in der Lage wäre, als ein Antagonist der TL1-Aktivität zu wirken. Es wurden HAEC-Phosphorylierungstests durchgeführt, in welchen die Zellen zuerst mit einem "Überschuss" an TL2 inkubiert wurden, gefolgt von der Zugabe von verdünntem TL1. Es wurde vermutet, dass die vorherige Besetzung des TIE-2-Rezeptors durch die hohen Mengen an TL2 die nachfolgende Stimulation des Rezeptors nach Zusatz von TL1 in limitierender Konzentration verhindern könnte.
Semikonfluente HAEC-Zellen wurden wie vorstehend beschrieben Serum-gehungert und dann für 3 Min. bei 37ºC mit 1-2 ml 20 · COS/JFE14-TL2 konditioniertem Medium inkubiert. Kontrollplatten wurden mit 20 · COS/JFE14-Ausschließlich- Medium (MOCK) behandelt. Die Platten wurden aus dem Inkubator genommen und verschiedene Verdünnungen von COS/JFEI4-TL1- Medium wurde dann zugegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation der Platten von 5-7 Min. bei 37ºC. Die Zellen wurden darauffolgend gewaschen, lysiert und die TIE-2- spezifische Tyrosin-Phosphorylierung in den Lysaten wurde durch Rezeptor-Immunpräzipitation und Western-Blot wie vorstehend beschrieben getestet. TL1-Verdünnungen wurden unter Verwendung von 20 · COS/JFE14-TL1-Medium, verdünnt auf 2 x, 0,5 x, 0,1 · oder 0,02 · durch Zugabe von 20 · COS/JFE14- Ausschließlich-Medium hergestellt. Ein Test der initialen 20 · TL1- und 20 · TL2-COS-Medien unter Verwendung der BlAcore- Biosensor-Technologie zeigte, dass sie ähnliche Mengen an TIE- 2-spezifischen Bindungsaktivitäten enthielten, d. h. 445 R. U. und 511 R. U. für TL1 bzw. TL2. Die Ergebnisse des anti- Phosphotyrosin-Western-Blots, welche in Fig. 8 dargestellt sind, zeigen, dass im Vergleich zu der vorherigen Behandlung von HAEC-Zellen mit MOCK-Medium (Spur 1) mit der zuvorigen Behandlung von HAEC-Zellen mit einem Überschuss an TIE-2- Ligand 2 (Spur 2), die nachfolgende Fähigkeit von verdünntem TIE-2-Ligand 1 den TIE-2-Rezeptor (TIE-2-R) zu aktivieren, antagonisiert.
Diese Ergebnisse zeigen, dass TL2, im Gegensatz zu TL1, nicht in der Lage war, die TIE-2-Rezeptor-Kinaseaktivität in HAEC-Zellen zu aktivieren. Darüber hinaus blockierte die Vorinkubation der Endothelzellen mit hoher Konzentration an TL2, gefolgt von der Zugabe von TL1 die Fähigkeit von TL1 den TIE-2-Rezeptor zu stimulieren, was zeigt, dass TL2 ein TIE-2- Rezeptor-Antagonist ist.

BEISPIEL 10 - IDENTIFIZIERUNG DER TIE-2-SPEZIFISCHEN BINDUNGSAKTIVITÄT IN KONDITIONIERTEM MEDIUM UND COS-ZELL- ÜBERSTÄNDEN

Die Bindungsaktivität von 10 · CCM aus den Zelllinien C2C12-ras, Rat2 ras, SHEP, und T98 G, oder COS-Zellüberständen nach Transfektion entweder mit menschlichem TIE-2-Ligand 1 (hTL1) oder menschlichem TIE-2-Ligand 2 (hTL2) wurde unter Verwendung der Biosensor-Technologie (BlAcore; Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ), welche biomolekulare Interaktionen in Echtzeit anhand von Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR; surface plasmon resonance) darstellt, gemessen. Gereinigtes TIE-2-RB der Ratte oder des Menschen wurde über primäre Amine an die Carboxymethyldextran-Schicht an einen CM5- Forschungsgrad-Sensorchip (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) gekoppelt. Die Sensorchip-Oberfläche wurde unter Verwendung eines Gemisches aus N-Hydroxysuccinimid (NHS) und N-Ethyl-N' - (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) aktiviert, gefolgt von der Immobilisierung von TIE-2-RB (25 ug/ml, pH 4,5) und der Desaktivierung nicht umgesetzter Stellen mit 1,0 M Ethanolamin (pH 8,5), aktiviert. Im Allgemeinen wurden 9000-10000 RU von jedem Rezeptorkörper an den Sensorchip gekoppelt.
Der Laufpuffer, welcher in dem System verwendet wurde, war HBS (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,005% P20-Tensid, pH 7,4). Die Proben wurden 15 Min. lang bei 4ºC zentrifugiert und unter Verwendung eines sterilen 0,45 um-Filter (Millipore, Bedford, MA) mit niedriger Proteinbindungsaktivität weiter aufgereinigt. Dextran (2 mg/ml) und P20-Tensid (0,005%) wurden zu jeder Probe zugegeben. Aliquote von 40 ul wurden mit einer Durchflussrate von 5 ul/Min. über die immobilisierte Oberfläche (entweder TIE-2-von der Ratte oder dem Menschen) injiziert und die Rezeptorbindung wurde für 8 Min. beobachtet. Die Bindungsaktivität (Resonanz-Einheit, RU) wurde als der Unterschied zwischen einem Basislinienwert, welcher 30 s vor der Probeninjektion gemessen wurde, und einer Messung, welche 30 s nach der Injektion gemacht wurde, bewertet. Die Regeneration der Oberfläche wurde mit einem 15 ul-Puls mit 3 M MgCl&sub2; bewerkstelligt.
Die CCM-Proben (C2C12-ras, Rat2 ras, SHEP, T98 G) wurden auf der mit TIE-2-RB der Ratte immobilisierten Oberfläche getestet, während rekombinantes hTL1 und hTL2 auf der mit menschlichem TIE-2-RB-immobilisierten Oberfläche getestet wurde. In jedem Fall wurde die spezifische Bindung an den TIE-2-Rezeptor-Körper durch Inkubation der Proben mit 25 mg/ml von entweder löslichem TIE-2-(Ratte oder Mensch)-RB oder trkB-RB vor dem Testen der Bindungsaktivität ausgewertet. Wie in den Fig. 9 und 10 gezeigt, verursacht die Zugabe von löslichem trkB-RB einen leichten Abfall an TIE-2- Bindungsaktivität, während die Zugabe von löslichem TIE-2-RB im Vergleich zu derjenigen, welche bei Abwesenheit von TIE-2- RB gemessen wurde, die Bindungsaktivität signifikant reduziert.

BEISPIEL 11 - TIE-2-RB BLOCKIERT SPEZIFISCH DIE AKTIVIERUNG DES TIE-2-REZEPTORS DURCH TIE-2-LIGAND 1

Die Anmelder beabsichtigten zu bestimmen, ob löslicher TIE-2-RB als ein kompetitiver Hemmstoff dienen kann, um die Aktivierung des TIE-2-Rezeptors durch TIE-2-Ligand 1 (TL1) zu blockieren. Um dies zu erreichen, wurden TL1- enthaltende COS-Medien entweder mit TIE-2- oder TrkB-RB vorinkubiert und dann auf ihre Fähigkeit hin verglichen, TIE- 2-Rezeptoren zu aktivieren, welche natürlicherweise in einer menschlichen Endothelzelllinie anwesend sind.
Konditionierte COS-Medien wurden aus COS-7-Zellen, welche entweder mit pJFE14-Expressionsvektor alleine (MOCK) oder dem pJFE14-Vektor enthaltend die menschliche cDNA des TIE-2-Ligand 1 (TL1) hergestellt und wie in Beispiel 9 hierin vorstehend beschrieben geerntet, mit der Ausnahme, dass die Medien steril filtriert wurden, jedoch nicht konzentriert wurden. Die Menge an TL1 wurde bestimmt und als die Menge (in Resonanzeinheiten, R. U.) an TIE-2-Rezeptor-spezifische Bindungsaktivität, gemessen durch den BlAcore-Bindungstest, ausgedrückt.
Northern (RNA)-Analysen offenbarten signifikante Mengen an TIE-2-Transkripten in HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell; menschlichen primären Endothelzellen) (Clonetics, Inc.). Deshalb wurden diese Zellen verwendet, um zu testen, ob der TIE-2-Rezeptor Tyrosinphosphoryliert werden kann, wenn er in Anwesenheit von TIE-2- oder TrkB-RBs COS- Medien, enthaltend TL1, ausgesetzt wird. HUVEC-Zellen wurden bei 37ºC, 5% CO&sub2; in einem vollständigen endothelialen Zellwachstumsmedium (Clonetics, Inc.), welches 5% fötales Kälberserum, löslichen Rinderhirnextrakt mit 10 gg/ml Heparin, 10 ng/ml menschlichen EGF, 1 ug/ml Hydrocortison, 50 gg/ml Gentamicin und 50 ng/ml Amphotericin-B enthielt, erhalten. Die Bewertung darüber, ob TL1 den TIE-2-Rezeptor in den HUVEC- Zellen aktivieren konnte, wurde wie folgt durchgeführt.
Konfluente Schalen von HWEC-Zellen wurden für 2-4 Stunden in Niedrig-Glucose Dulbecco's MEM bei 37ºC, 5% 002 Serumgehungert, gefolgt von einer zehnminütigen Inkubation in Hungermedium, welches 0,1 mM Natriumorthovanadat, einen potenten Hemmstoff von Phosphotyrosin-Phosphatasen, enthielt. In der Zwischenzeit wurden konditionierte COS-Medien für 30 Min. bei Raumtemperatur entweder mit TIE-2- oder TrkB-RB, zu 50 ug/ml zugegeben, vorinkubiert. Dann wurde das Hungermedium von den HUVEC-Schalen entfernt und für 7 Minuten bei 37ºC mit den RB-enthaltenden COS-Medien inkubiert.
Nachfolgend wurden HUVEC-Zellen lysiert und TIE-2-Rezeptor- Protein wurde durch Immunpräzipitation mit TIE-2-Peptid- Antiserum wiedergewonnen, gefolgt von Western-Blot mit einem anti-Phosphotyrosin-Antikörper, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 gezeigt. Phosphotyrosin-Mengen am TIE-2-Rezeptor wurden durch Behandlung von HIJVEC-Zellen mit TIE-2-Ligand 1 (TL1) in Relation zu demjenigen, was mit Kontrollmedium (MOCK) gesehen wurde, induziert und diese Induktion wird durch zuvorige Inkubation mit TIE-2-RB (TIE-2- Fc) jedoch nicht durch Inkubation mit TrkB-RB (TrkB-Fc) spezifisch blockiert. Diese Daten zeigen, dass löslicher TIE- 2-RB als ein selektiver Hemmstoff dienen kann, um die Aktivierung des TIE-2-Rezeptors durch den TIE-2-Ligand 1 zu blockieren.

BEISPIEL 12 - HESTELLUNG VON TIE-2-LIGANDEN-KÖRPERN

Es wurde ein Expressionskonstrukt hergestellt, welches ein sekretiertes Protein herstellen würde, zusammengesetzt aus der vollständigen codierenden Sequenz des menschlichen TIE-2- Ligand 1 (TL1) oder TIE-2-Ligand 2 (TL2), gekoppelt an die konstante Region des menschlichen Immunglobulins Gamma-1 (IgG1 Fc). Diese Fusionsproteine werden TIE-2-"Liganden-Körper" (TL1- Fc oder TL2-Fc) genannt. Der Fc-Teil von TL1-Fc und TL2-Fc wurde wie folgt hergestellt. Ein DNA-Fragment, welches den Fc- Teil des menschlichen IgG1 codiert, welches sich von der Gelenkregion bis zu dem carboxyterminalen Ende des Proteins erstreckt, wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden, die der publizierten Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, aus menschlicher Plazenta-cDNA amplifiziert; das resultierende DNA-Fragment wurde in einen Plasmid-Vektor cloniert. Geeignete DNA-Restriktionsfragmente aus einem Plasmid, welches den vollständigen TL1 oder TL2 codiert und aus dem menschlichen IgG1-Fc-Plasmid wurden auf beide Seiten eines kurzen, PCR-abstammenden Fragments, welches derart konstruiert war, dass es TL1 oder TL2 mit menschlichem IgG1-Fc-Proteincodierenden Sequenzen im Leseraster fusioniert, ligiert.
Durch Clonierung des TL2-Fc-DNA-Fragments in den pVL1393-Baculovirusvektor und nachfolgender Infektion der Insektenzelllinie Spodoptera fruaiperda SF-21AE, wurden Milligramm-Mengen von TL2-Fc erhalten. Alternativ dazu wurden die Zelllinie SF-9 (ATCC Registrier-Nr. CRL-1711) oder die Zelllinie BTI-TN-5b1-4 verwendet. Die DNA, welche den TL2-Fc codiert, wurde als ein EcoRI-NotI-Fragment in das Baculovirus- Transferplasmid pVL1393 cloniert. Durch Mischen von 3 mg Plasmid-DNA mit 0,5 mg Baculo-Gold-DNA (Pharmingen) wurde die Plasmid-DNA in virale DNA rekombiniert, gefolgt von einer Einführung in Liposomen unter Verwendung von 30 mg Lipofektin (GIBCO-BRL). DNA-Liposomengemische wurden in TMN-FH-Medium (Modified Grace's Insect Cell Medium; GIBCO-BRL) für 5 Stunden bei 27ºC auf SF-21AE-Zellen (2 · 10&sup6; Zellen/60 mm-Schale) gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 27ºC für 5 Tage in TMN-FH-Medium, ergänzt mit 5% fetalem Kälberserum. Zur Plaque-Reinigung rekombinanter Viren wurde das Gewebekulturmedium geerntet, was unter Verwendung von zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt wurde (O'Reilly, D. R., L. K. Miller, and V. A. Luckow, Baculovirus Expression Vectors - A Laboratory Manual. 1992, New York: W. H. Freeman), ausgenommen, dass die Agarose-Überschichtung 125 mg/ml X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactopyranosid; GIBCO-BRL) enthielt. Nach 5 Tagen Inkubation bei 27ºC wurden die nichtrekombinanten Plaques durch positive chromogene Reaktion mit dem X-gal-Substrat ausgewertet und ihre Positionen markiert. Rekombinante Plaques wurden dann durch Zugabe einer zweiten Überschichtung, enthaltend 100 mg/ml MTT (3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]2, 5,diphenyltetrazoliumbromid; Sigma), sichtbar gemacht. Putative rekombinante Virus-Plaques wurden durch Absaugen gepickt und über multiple Runden von Plaque- Isolierung aufgereinigt, um Homogenität zu gewährleisten. Durch serielle Passagierung mit niedriger Multiplikationsrate Plaque-gereinigter Viren wurden Virusstämme hergestellt. Niedrig-Passagestämme von einem Virus-Clon wurden hergestellt (vTL2-Fc Clon #7).
SF-21AE-Zellen wurden in serumfreiem Medium gezüchtet (SF-900 II, GIBCO-BRL), welches 1 x
Antibiotikum/Antimykotikum-Lösung (GIBCO-BRL) und 25 mg/l Gentamicin (GIBCO-BRL) enthielt. Pluronisches F-68 wurde in einer Endkonzentration von 1 g/l als Tensid zugegeben. Die Kulturen (4 l) wurden in einem Bioreaktor (Artisan Cell Station System) für mindestens drei Tage vor der Infektion gezüchtet. Die Zellen wurden bei 27ºC, unter Begasung mit 50% gelöstem Sauerstoff bei einer Gasflussrate von 80 ml/min. (Begasung über ein Einblasrohr), gezüchtet. Das Schütteln wurde mit Hilfe eines Schiffsflügelrades mit einer Frequenz von 100 UpM durchgeführt. Die Zellen wurden in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase (-2 · 10&sup6; Zellen pro ml) geerntet, durch Zentrifugation konzentriert und mit 5 Plaquebildenden Einheiten vTL2-Fc pro Zelle infiziert. Die Zellen und das Inokulat wurden mit frischem Medium auf 400 ml gebracht und das Virus wurde für 2 Stunden bei 27ºC in einem Spinner-Kolben adsorbiert. Die Kultur wurde dann in einem Endvolumen von 8 l mit frischem serumfreiem Medium resuspendiert und die Zellen unter Verwendung der zuvor beschriebenen Bedingungen in dem Bioreaktor inkubiert. Das Kulturmedium der vTL2-Fc-infizierten SF21AE- Zellen wurde 72 Stunden nach Infektion durch Zentrifugation (500 · g, 10 Minuten) gesammelt. Die Zellüberstände wurden mit NaOH auf pH 8 gebracht. EDTA wurde zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben und der pH-Wert des Überstands wurde wieder auf 8 eingestellt. Die Überstände wurden filtriert (0,45 mm, Millipore) und auf eine Protein-A-Säule (Protein A Sepharose 4, fast flow oder HiTrap Protein A, beide von Pharmacia) aufgetragen. Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 0,5 M NaCl gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm auf die Basislinie zurückging. Die Säule wurde in PBS gewaschen und mit 0,5 M Essigsäure eluiert. Die Säulenfraktionen wurden durch Elution in Gefäße, welche 1 M Tris pH 9 enthielten, sofort neutralisiert. Die Peak-Fraktionen, welche den TL2-Fc enthalten, wurden vereint und gegen PBS dialysiert.

HINTERLEGUNGEN

Folgendes wurde in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt. Ein Plasmid-Clon, welcher einen TIE-2-Liganden codiert, wurde am 7. Oktober 1994 bei der ATCC mit der ATCC-Hinterlegungs- Nr. 75910 hinterlegt und als "pJFE14, welcher den TIE-2- Liganden codiert" bezeichnet. Rekombinantes AutograDha californica Baculovirus, welches TIE-2-Rezeptor-Körper codiert, wurde am 7. Oktober 1994 mit der ATCC-Hinterlegungs- Nr. VR2484 bei der ATCC hinterlegt und als "vTIE-2-Rezeptor- Körper" bezeichnet. Ein Lambda-Phagenvektor, welcher menschliche TIE-2-Liganden-DNA enthält, wurde am 26. Oktober 1994 mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 75928 bei der ATCC hinterlegt und als λgt10, welcher htie-2-Ligand 1 codiert, bezeichnet. Ein Plasmid-Clon, welcher einen zweiten TIE-2- Liganden codiert, wurde mit der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 75963 am 9. Dezember 1994 bei der ATCC hinterlegt und als "pBluescript KS, welcher den menschlichen TIE-2-Ligand 2 codiert" bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Schutzumfang durch die spezifischen Ausführungsformen, welche hierin beschrieben sind, nicht eingeschränkt. In der Tat werden verschiedene Modifikationsmöglichkeiten der Erfindung zusätzlich zu denjenigen, die hierin beschrieben sind, durch die vorangehende Beschreibung und die begleitenden Figuren dem Fachmann offensichtlich werden. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifikationen in dem Schutzumfang der anhängenden Ansprüche enthalten sind.

Claims

1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das einen TIE-2 Liganden codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ist:

(a) die Nucleinsäuresequenz, die die codierende Region des menschlichen TIE-2 Liganden, wie in Fig. 4 oder Fig. 5 dargelegt, umfaßt;

(b) eine Nucleinsäuresequenz, die unter moderat stringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz Von (a) hybridisiert und die einen TIE-2 Liganden codiert, der den TIE-2 Rezeptor bindet; oder

(c) eine Nucleinsäuresequenz, die auf Grund der Degeneration des genetischen Codes mit der Nucleinsäuresequenz von (a) oder (b) hybridisieren würde und einen TIE-2 Liganden codiert, der an den TIE-2 Rezeptor bindet.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei der codierte TIE-2 Ligand ein TIE-2 Agonist ist.

3. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das einen TIE-2 Liganden codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz ist:

(a) die Nucleinsäuresequenz, die die codierende Region des menschlichen TIE-2 Liganden, wie in Fig. 6 dargelegt, umfaßt;

(b) eine Nucleinsäuresequenz, die unter moderat stringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz von (a) hybridisiert und einen TIE-2 Liganden codiert, der an den TIE-2 Rezeptor bindet; oder

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei der codierte TIE-2 Ligand ein TIE-2 Antagonist ist.

5. Nucleinsäuremolekül, das zu einer Sequenz nach Anspruch 1 oder 3 degeneriert ist und einen Liganden codiert, der den TIE-2 Rezeptor bindet.

6. Nucleinsäuremolekül, das unter moderat stringenten Bedingungen an die Sequenz hybridisiert, die einen TIE-2 Liganden codiert, wie in Fig. 4, 5 oder 6 dargelegt.

7. Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.

8. Vektor nach Anspruch 7, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die in der Lage ist, dessen Expression in einer Wirtszelle zu steuern.

9. Vektor nach Anspruch 7 oder 8, der ein Plasmid ist.

10. Plasmid nach Anspruch 9, mit der Bezeichnung pJFE14, das den TIE-2 Liganden codiert (ATCC-Hinterlegungsnummer 75910).

11. Plasmid nach Anspruch 9, mit der Bezeichnung pB1uescript KS, das den menschlichen TIE-2 Liganden 2 codiert (ATCC- Hinterlegungsnummer 75963).

12. Vektor nach Anspruch 7 oder 8, mit der Bezeichnung λgt10, der den hTIE-2 Liganden 1 codiert (ATCC- Hinterlegungsnummer 75928).

13. Isolierter TIE-2 Ligand, der eine in Fig. 4, 5 oder 6 dargelegte Aminosäuresequenz besitzt, oder ein Fragment oder Derivat davon, das an den TIE-2 Rezeptor bindet, wobei das Protein im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.

14. Isolierter TIE-2 Ligand, codiert durch eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, der im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.

15. Isolierter TIE-2 Ligand, codiert durch eine Nucleinsäure nach Anspruch 3 oder 4, der im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.

16. Wirts-Vektor-System zur Herstellung eines Liganden nach einem der Ansprüche 13 bis 15, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12 in einer Wirtszelle.

17. Wirts-Vektor-System nach Anspruch 16, wobei die Wirtszelle eine bakterielle, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle ist.

18. Wirts-Vektor-System umfassend das Wirts-Vektor-System nach Anspruch 16 oder 17 und eine Nucleinsäure, die den TIE-2 Rezeptor codiert.

19. Verfahren zur Herstellung eines Liganden, gemäß der Definition in einem der Ansprüche 13 bis 15, umfassend das Züchten von Zellen eines Wirts-Vektor-Systems nach einem der Ansprüche 16 bis 18 unter Bedingungen, die geeignet sind zur Herstellung des Liganden, und Gewinnung des so hergestellten Liganden.

20. Antikörper, der spezifisch an den Liganden nach einem der Ansprüche 13 bis 15 bindet.

21. Antikörper nach Anspruch 20, der ein monoclonaler Antikörper ist.

22. Ligand-Körper, umfassend einen TIE-2 Liganden gemäß der Definition in einem der Ansprüche 13 bis 15, der mit einer konstanten linmunglobulin-Region fusioniert ist.

23. Ligand-Körper nach Anspruch 22, wobei der TIE-2 Ligand die in Fig. 4, 5 oder 6 dargelegte Aminosäuresequenz besitzt und die konstante linmunglobulin-Region der Fc-Teil des menschlichen IgG1 ist.

24. Konjugat, umfassend einen Liganden nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und daran konjugiert eine cytotoxische Substanz.

25. Konjugat nach Anspruch 24, wobei die cytotoxische Substanz ein Radioisotop oder Toxin ist.

26. Arzneimittel, umfassend einen TIE-2 Liganden nach einem der Ansprüche 13 bis 15 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

27. Arzneimittel umfassend einen Antikörper nach Anspruch 20 oder 21 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

28. Arzneimittel, umfassend einen Ligand-Körper nach Anspruch 22 oder 23 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

29. Arzneimittel, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 24 oder 25 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

30. Ligand nach einem der Ansprüche 13 bis 15, Antikörper nach Anspruch 20 oder 21, Ligand-Körper nach Anspruch 22 oder 23, Konjugat nach Anspruch 24 oder 25 oder Arzneimittel nach einem der Ansprüche 26 bis 29 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers, oder in einem Diagnoseverfahren.

31. Ligand nach Anspruch 14 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers.

32. Ligand nach Anspruch 15 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers.

33. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 20 oder 21, der spezifisch an den Liganden nach Anspruch 14 bindet, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Blockierung des Blutgefäßwachstums in einem Säuger.

34. Verwendung nach Anspruch 33, wobei der Säuger ein Mensch ist.

35. Verwendung eines Liganden nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Förderung von Gefäßneubildung in einem Säuger.

36. Verwendung nach Anspruch 35 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Förderung der Wundheilung.

37. Verwendung nach Anspruch 35 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Ischemie.

38. Verwendung eines Antikörpers, der in der Lage ist, spezifisch an den TIE-2 Liganden nach Anspruch 20 oder 21 zu binden, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der TIE-2 Liganden-Aktivität in einem Säuger.

39. Verwendung eines Liganden nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der TIE-2 Liganden-Aktivität in einem Säuger.

40. Verwendung nach Anspruch 38 oder 39, wobei der Säuger ein Mensch ist.

41. Verwendung nach Anspruch 40 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Attenuierung oder Prävention von Tumorwachstum in einem Menschen.

42. Verfahren zur Aufrechterhaltung einer TIE-2 Rezeptor exprimierenden Zelle in Kultur, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Liganden nach Anspruch 14 zu der TIE-2 Rezeptor exprimierenden Zelle umfaßt.

43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei die TIE-2 Rezeptor exprimierende Zelle eine Endothelzelle ist.

44. Verfahren zur Identifizierung eines TIE-2 Rezeptor- Antagonisten, umfassend das Inkontaktbringen der TIE-2 Rezeptor exprimierenden Zellen mit:

(a) einer Testverbindung; und

(b) einem Liganden nach Anspruch 14 oder 15; unter Bedingungen, die die Bindung des Liganden an den Rezeptor erlauben, und Bestimmung, ob die Testverbindung in der Lage ist, mit der Bindung des Liganden an den Rezeptor zu interferieren.

45. Rezeptor-Körper, der spezifisch an den TIE-2 Liganden nach einem der Ansprüche 13 bis 15 bindet.

46. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das einen Rezeptor-Körper nach Anspruch 45 codiert.

47. Vektor, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 46.

48. Vektor nach Anspruch 47, der ein Plasmid ist.

49. Plasmid nach Anspruch 48, mit der Bezeichnung vTIE-2 Rezeptor-Körper (ATCC-Hinterlegung VR 2484).

50. Arzneimittel, umfassend einen Rezeptor-Körper nach Anspruch 45 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

51. Rezeptor-Körper nach Anspruch 45 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren des menschlichen oder tierischen Körpers oder in einem Diagnoseverfahren.