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DE69527650T2 - Katonische amphiphile und plasmide für die intrazelluläre abgabe von therapeutischen mitteln - Google Patents

Katonische amphiphile und plasmide für die intrazelluläre abgabe von therapeutischen mitteln

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Publication number
DE69527650T2
DE69527650T2 DE69527650T DE69527650T DE69527650T2 DE 69527650 T2 DE69527650 T2 DE 69527650T2 DE 69527650 T DE69527650 T DE 69527650T DE 69527650 T DE69527650 T DE 69527650T DE 69527650 T2 DE69527650 T2 DE 69527650T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
group
amphiphiles
dna
alkylamine
cationic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Revoked
Application number
DE69527650T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69527650D1 (de
Inventor
Rebecca G. Bagley
Chau-Dung Chang
Seng H. Cheng
Simon J. Eastman
David J. Harris
Shirley C. Hubbard
Mathieu B. Lane
Edward R. Lee
John Marshall
Eric A. Rowe
Ronald K. Scheule
Craig S. Siegel
Nelson S. Yew
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority claimed from US08/352,479 external-priority patent/US5650096A/en
Priority claimed from US08/540,867 external-priority patent/US5747471A/en
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of DE69527650D1 publication Critical patent/DE69527650D1/de
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Description

    Ausgangspunkt der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue kationische amphiphile Verbindungen, die die intrazelluläre Abgabe biologisch aktiver bzw. wirksamer (therapeutischer) Moleküle erleichtern. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die derartige kationische Amphiphile umfassen und die zur Abgabe bzw. Lieferung therapeutisch wirksamer Mengen biologisch wirksamer Moleküle in die Zellen von Patienten von Nutzen sind. Die neuen kationischen amphiphilen Verbindungen der Erfindung sind insbesondere in Bezug auf die Gentherapie von Nutzen.
  • Eine wirksame therapeutische Nutzung vieler Arten biologisch wirksamer Moleküle wurde einfach deswegen nicht erreicht, weil keine Verfahren verfügbar sind, die eine Abgabe therapeutisch wirksamer Mengen derartiger Substanzen in spezielle Zellen eines Patienten bewirken, für den eine Behandlung damit einen therapeutischen Vorteil darstellen würde. Eine gut funktionierende Abgabe therapeutisch ausreichender Mengen derartiger Moleküle in Zellen hat sich oftmals als schwierig, wenn nicht unmöglich erwiesen, weil beispielsweise die Zellmembran eine selektiv permeable Barriere darstellt. Selbst wenn biologisch wirksame Moleküle erfolgreich in Zielzellen eintreten, können sie im Zellcytoplasma abgebaut oder sogar zu Strukturen in den Zellen transportiert werden, wie beispielsweise lysosomale Kompartimente, die auf Abbauprozesse spezialisiert sind. Sowohl die Art der Substanzen, denen es möglich ist in Zellen einzutreten als auch deren Mengen, die letztendlich am Zielort innerhalb der Zellen ankommen, an denen sie einen therapeutischen Vorteil bewirken können, ist strikt limitiert.
  • Obwohl eine derartige Selektivität im allgemeinen notwendig ist, damit eine geeignete bzw. richtige Zellfunktion aufrecht erhalten werden kann, bringt sie den Nachteil mit sich, dass viele therapeutisch wertvolle Substanzen (oder therapeutisch wirksame Mengen hiervon) ausgeschlossen werden. Zusätzlich stört die komplexe Struktur, das komplexe Verhalten und die in einem intakten Gewebe vorliegende Umgebung, die für eine intrazelluläre Abgabe biologisch wirksamer Moleküle vorgesehen ist, oftmals eine derartige Abgabe im Vergleich zu dem Fall, der bei in vitro kultivierten Zellpopulationen vorliegt, beträchtlich.
  • Beispiele biologisch aktiver Moleküle, für die ein wirksames Targeting für Patientengewebe oftmals nicht erreicht wird, sind die folgenden: (1) zahlreiche Proteine, einschließlich Immumglobulin-Proteine, (2) Polynukleotide, wie beispielsweise genomische DNA, cDNA oder mRNA, (3) Antisensepolynukleotide; und (4) viele Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, gleichgültig ob synthetisch oder natürlich vorkommend, wie beispielsweise die Peptidhormone und Antibiotika.
  • Eine der fundamentalen Herausforderungen, denen sich der praktizierende Mediziner gegenüber sieht, besteht darin, dass, obwohl mit zahlreichen Erbkrankheiten verbundene defekte Gene (oder die Risikofaktoren, einschließlich für verschiedene Krebserkrankungen) isoliert und charakterisiert wurden, Verfahren, diese Krankheitszustände selbst zu korrigieren, indem Patienten in normaler Weise mit Kopien derartiger Gene (der Technik der Gentherapie) versorgt werden, im Wesentlichen fehlen. Demgemäß ist die Entwicklung von verbesserten Verfahren zur intrazellulären Lieferung bzw. Abgabe von großer medizinischer Bedeutung. Beispiele von Krankheiten, von denen erhofft wird, dass sie durch Gentherapie behandelt werden können, schließen erbliche Störungen wie beispielsweise zystische Fibrose, Gaucher's Krankheit, Fabry's Krankheit und Muskel-dystrophie ein. Repräsentativ für erworbene Störungen, die behandelt werden können sind: (1) für Krebserkrankungen - Multiples Myelom, Leukämien, Melanome, Ovarialkarzinome und kleinzelliges Lungenkarzinom; (2) für Herz-Kreislaufleiden - progressiver Herzfehler, Restenose und Hämophilie; und (3) für neurologische Leiden - traumatische Gehirnverletzung.
  • Eine Gentherapie erfordert eine erfolgreiche Transfektion von Zielzellen in einem Patienten. Eine Transfektion kann im allgemeinen als der Prozeß definiert werden, ein exprimierbares Polynukleotid (beispielsweise ein Gen, eine cDNA oder eine mRNA, die darin kodiert sind) in eine Zelle einzuführen. Eine erfolgreiche Expression des kodierenden Polynukleotids führt in den Zellen zur Produktion eines normalen Proteins und führt zur Korrektur des Krankheitszustands, der mit dem abnormalen Gen verbunden ist. Therapien, die auf der Bereitstellung derartiger Proteine direkt an Zielzellen (Proteinersatztherapie) begründet sind, sind oftmals aus den oben erwähnten Gründen nicht wirksam.
  • Die zystische Fibrose, eine häufige letale genetische Störung ist ein besonderes Beispiel für eine Krankheit, die ein Ziel für die Gentherapie darstellt. Die Krankheit wird durch das Vorhandensein einer oder mehrerer Mutationen in dem Gen verursacht, das ein als zystische Fibrose-Transmembran Konduktanz-Regulator ("cystic fibrosis transmembrane conductance regulator = CFTR") bekanntes Protein kodiert, das die Bewegung der Ionen (und deswegen von Flüssigkeiten) durch die Zellmembran von Epithelzellen hindurch reguliert, einschließlich von Lungenepithelzellen. Ein abnormaler Ionentransport in Atemwegszellen führt zu einer abnormalen Schleimsekretion, Entzündung und Infektion, Gewebsschädigung und letztendlich Tod.
  • Es ist eine weit verbreitete Hoffnung, dass die Gentherapie eine lang anhaltende und vorhersehbare Form der Therapie für bestimmte Krankheitszustände bereitstellen wird und es ist wahrscheinlich die einzige Form der Therapie, die für viele Erbkrankheiten geeignet ist. Es verbleibt jedoch ein entscheidender Bedarf danach, Verbindungen zu entwickeln, die den Eintritt funktioneller Gene in Zellen erleichtern und deren Aktivität bzw. Wirksamkeit diesbezüglich ausreichend ist, um eine in vivo Abgabe von Genen oder anderen biologisch aktiven therapeutischen Molekülen in Konzentrationen von diesen bereitzustellen, die für eine intrazelluläre therapeutische Wirksamkeit ausreichend sind.
    • Bisherige Entwicklungen
  • Insofern Verbindungen entwickelt werden, die die intrazelluläre Abgabe biologisch aktiver Moleküle erleichtern und die mit sowohl unpolaren als auch polaren Umgebungen interagieren müssen (in oder an beispielsweise der Plasmamembran, Gewebsflüssigkeiten, Kompartimenten innerhalb der Zelle und mit dem biologisch aktiven Molekül selbst) werden derartige Verbindungen typischerweise so konzipiert, dass sie sowohl polare als auch unpolare Domänen aufweisen. Verbindungen, die beide derartige Domänen aufweisen, können als Amphiphile bzw. amphiphile Verbindungen bezeichnet werden und viele Lipide und synthetische Lipide, die zur Verwendung bei der Erleichterung einer derartigen intrazellulären Abgabe offenbart wurden (gleichgültig ob zur in vitro oder in vivo Anwendung) entsprechen dieser Definition. Eine besonders wichtige Klasse derartiger amphiphiler Verbindungen sind die kationischen Amphiphile. Im allgemeinen weisen kationische Amphiphile polare Gruppen auf, die bei oder um den physiologischen pH herum positiv geladen sind und diese Eigenschaft ist in der Fachwelt als bei der Definition, wie Amphiphile mit den vielen Arten biologisch aktiver (therapeutischer) Moleküle interagieren, einschließlich beispielsweise negativ geladenen Polynukleotiden wie beispielsweise DNA, verständlich.
  • Beispiele derartiger kationischer amphiphiler Verbindungen, die sowohl polare als auch unpolare Domänen aufweisen und von denen festgestellt wurde, dass sie bezüglich der intrazellulären Abgabe biologisch aktiver Moleküle brauchbar sind, sind beispielsweise in den nachfolgenden Literaturstellen zu finden, die auch eine brauchbare Diskussion (1) der Eigenschaften derartiger Verbindungen, von denen in der Technik ausgegangen wird, dass sie diese für solche Anwendungen geeignet machen und (2) der Art der Strukturen enthalten, wie sie in der Fachwelt verstanden wird, die durch Komplexieren derartiger Amphiphile mit therapeutischen Molekülen, die zur intrazellulären Abgabe vorgesehen sind, gebildet werden.
  • (1) Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7.413-7.417 (1987) offenbart die Verwendung positiv geladener synthetischer kationischer Lipide, einschließlich N-[1(2,3- dioleyloxy)propy]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid ("DOTMA") zur Bildung von Lipid-DNA-Komplexen, die für Transfektionen geeignet sind. Siehe ebenfalls Felgner et al., The Journal of Biological Chemistry, 269(4), 2.550-2.561 (1994).
  • (2) Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 6.982-6.986 (1989) offenbaren zahlreiche Amphiphile, einschließlich Dioctadecylamidoglycylspermin ("DOGS").
  • (3) US-Patent Nr. 5 283 185 auf den Namen Epand et al. beschreibt zusätzliche Klassen und Arten von Amphiphilen, einschließlich 3β [N-(N¹,N¹-dimethylaminoethan)- carbamoyl]cholesterin, genannt "DC-chol".
  • (4) Zusätzliche Verbindungen, die den Transport biologisch aktiver Moleküle in Zellen erleichtern, sind im US-Patent Nr. S 264 618 von Felgner et al. offenbart. Siehe ebenfalls Felgner et al., The Journal of Biological Chemistry, 269(4), 2.550-2.561 (1994) für die darin enthaltene Offenbarung und für weitere Verbindungen, die "DMRIE" 1,2- Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammoniumbromid einschließen, das unten erörtert wird.
  • (5) Eine Bezugnahme auf Amphiphile, die zur intrazellulären Lieferung bzw. Transport biologisch aktiver Moleküle geeignet sind, ist ebenfalls im US-Patent Nr. 5 334 761 auf den Namen Gebeyehu et al. und in Felgner et al., Methods (Methods in Enzymology), 5, 67-75 (1993) zu finden.
  • Obwohl von den oben erwähnten Literaturstellen erwähnten Verbindungen deutlich gezeigt wurde, dass sie den Eintritt biologisch aktiver Moleküle in Zellen erleichtern (obwohl in vielen derartigen Fällen nur in vitro), wird angenommen, dass die Aufnahmeleistungsfähigkeit, die dadurch bewirkt wird, zur Unterstützung zahlreicher therapeutischer Anwendungen, insbesondere der Gentherapie, nicht ausreichend ist. Weil die oben identifizierten Verbindungen nur eine schwache Wirksamkeit aufweisen, müssen beträchtliche Mengen hiervon verwendet werden, was zu Bedenken bezüglich der Toxizität derartiger Verbindungen oder deren Metaboliten führt.
  • Es existiert demgemäß ein Bedarf, eine "zweite Generation" kationischer Amphiphile zu entwickeln, deren Aktivität so ausreichend ist, dass erfolgreiche Therapien damit erreicht werden können.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Bei einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine kationische amphiphile Verbindung bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie der nachfolgenden allgemeinen Formel entspricht:
  • bei der R¹ und R² jeweils unabhängig -N(H)-, Alkylamin oder Polyalkylamin darstellen, unter der Voraussetzung, dass nicht beide -N(H)- darstellen;
  • bei der R³ und R&sup4; unabhängig H, eine wahlweise derivatisierte Aminosäure oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe darstellen;
  • bei der X C oder N darstellt;
  • bei der Y, falls vorhanden, eine Bindungsgruppe darstellt;
  • und Q -Z oder
  • darstellt wobei Z Alkylamin, Dialkylamin, das unterschiedliche Alkylgruppen aufweist, oder ein Steroid darstellt;
  • wobei A und B jeweils unabhängig O, N oder S darstellt;
  • wobei C -C(H&sub2;)-, -C(O)- oder -C(S)- darstellt und
  • R&sup5; und R&sup6; unabhängig eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl- oder Acylgruppe darstellt.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Komplex umfaßt, der folgendes aufweist:
  • (1) eine solche kationische amphiphile Verbindung;
  • (2) ein biologisch aktives Molekül, das aus ribosomaler RNA, einem Antisensepolynukleotid aus RNA oder DNA, einem Ribozym oder einem Polynukleotid aus genomischer DNA, cDNA oder mRNA ausgewählt ist, die ein therapeutisch verwendbares Protein kodieren; und, wahlweise
  • (3) ein Co-Lipid;
  • und ebenfalls wahlweise einen Trägerstoff, der aus Laktose, Trehalose, Saccharose, Mannitol, Maltose und Galaktose ausgewählt ist, wobei die Zusammensetzung in gefriergetrockneter Form vorliegen kann.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Gentherapie- Zusammensetzung für einen Krankheitszustand bereit, der mit einer Entzündung verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein DNA-Molekül umfaßt, das zum Eintritt in Zellen eines Gewebes in der Lage ist, das von dem Krankheitszustand befallen ist, wobei das DNA-Molekül folgendes umfaßt: (1) ein Transgen, das dazu in der Lage ist, eine Behandlung für den Krankheitszustand bereitzustellen und das vorzugsweise aus CFTR, p 53, alpha-1 Antitrypsin, TIMP-1 und TIMP-2 ausgewählt ist; und stromaufwärts hiervon, (2) eine Nukleotidsequenz, die derjenigen eines RNA-Polymerase-Promotors für ein Cytokingen entspricht, und die vorzugsweise aus Interleukin 2, Interleukin 8, Interleukin 1, Interleukin 11, Interleukin 6, Endothelin-1, Monocyten-chemische-Attraktans-Protein-1 (monocyte chemoattractant protein-1), IL-1ra und GM-CSF ausgewählt ist, deren Expression auf der Transkriptionsebene durch eine Entzündung nach oben reguliert wird; wobei die Expression des Transgens vorzugsweise durch Tumornekrosefaktor nach oben reguliert wird, wobei das DNA-Molekül mit einer solchen kationischen amphiphilen Verbindung komplexiert wird.
  • Bei einer noch weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine gentherapeutische Zusammensetzung zur intravenösen Behandlung des Herzens eines Patienten bereit, dadurch gekennzeichnet, dass sie folgendes umfaßt: (1) ein DNA-Molekül, das eine kodierende Sequenz für ein therapeutisches Protein einschließt; und (2) eine solche kationische amphiphile Verbindung; wobei die Zusammensetzung derart als eine Zubereitung bereitgestellt wird, dass das Molverhältnis der kationischen amphiphilen Verbindung: DNA (gemessen die Molarität des Nukleotids) bewirkt, dass die Komplexe der kationischen amphiphilen Verbindung/DNA in Lösung ein positives Zetapotential aufweisen, vorzugsweise ungefähr +30 mV.
  • Nachdem der Umfang der vorliegenden Erfindung angegeben wurde, wird diese nunmehr weiter beschrieben und in allgemeineren Begriffen dargestellt.
  • Diese Erfindung betrifft kationische amphiphile Verbindungen, die insbesondere zur Erleichterung des Transports biologisch aktiver Moleküle in Zellen wirksam sind. Die kationischen amphiphilen Verbindungen werden in vier (4) Gruppen aufgeteilt, obwohl ersichtlich sein wird, dass bestimmte strukturelle und funktionelle Merkmale existieren, die viele der amphiphilen Verbindungen miteinander teilen.
  • Demgemäß sind kationische amphiphile Verbindungen der Gruppe I (siehe Fig. 1, Tafeln A, B und C) dazu in der Lage, den Transport biologisch aktiver Moleküle in Zellen zu erleichtern, wobei die amphiphilen Verbindungen die folgende Struktur (I) aufweisen,
  • wobei:
  • Z ein Steroid ist;
  • X ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • Y eine kurze Verbindungs- bzw. Bindungsgruppe ist, oder Y fehlt;
  • R&sub3; H ist oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; H, eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R² -NH- ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und wobei R¹ und R² gleich oder verschieden sind, außer dass nicht sowohl R¹ und R² -NH- sein können.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Steroidbestandteil "Z" aus der Gruppe ausgewählt, die aus 3-Sterolen besteht, wobei das Sterolmolekül durch dessen 3-O-Gruppe, oder durch N- in Ersatz hiervon, an Y (oder direkt an X, falls Y nicht vorhanden ist) gebunden ist. Gemäß dieses Grundgedankens der Erfindung schließen besonders wirksame Amphiphile beispielsweise Spermidincholesterincarbamat (N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat, Amphiphil Nr. 53) und Spermincholesterincarbamat (N&sup4;-Spermincholesterincarbamat, Amphiphil Nr. 67) und daraus gebildete Amphiphile ein.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Steroid-Gruppe an Y (oder direkt an X, falls Y fehlt) von Ringposition 17 des Steroidringes (siehe Fig. 1 und 22) oder von dem Arm weg gebunden, der sich normalerweise bei vielen Steroiden von Position 17 (siehe die Struktur von Cholesterin in Fig. 1) weg erstreckt oder von irgendeiner verkürzten Form des Armes.
  • Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind innerhalb der Bindungsgruppe Y nicht mehr als ungefähr drei oder vier Atome enthalten, die selbst eine Brücke von kovalenten Bindungen zwischen X und Z bilden. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Y eine Bindungsgruppe, wobei nicht mehr als ein Atom der Gruppe eine Bindung mit sowohl X als auch Z bildet, oder Y fehlt.
  • Repräsentative Amphiphile gemäß Gruppe I schließen ein: N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat N&sup4;-Spermincholesterincarbamat N¹,N&sup8;-Bis(3-aminopropyl)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat N&sup4;(N&sup4;-3-aminopropylspermidin)cholesterincarbamat
  • Zusätzliche kationische Amphiphile der Gruppe II (siehe Fig. 5) sind dazu in der Lage, den Transport biologisch aktiver Moleküle in die Zellen zu erleichtern, wobei diese Amphiphile die folgende Struktur (II) aufweisen:
  • bei der:
  • Z ein Steroid ist;
  • X ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • Y eine Bindungsgruppe ist, oder Y fehlt;
  • R³ eine Aminosäure, eine derivatisierte Aminosäure, H oder Alkyl ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; eine Aminosäure, eine derivatisierte Aminosäure, H oder Alkyl ist;
  • R² -NH- ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und bei der R¹ und R² gleich oder verschieden sind, außer dass nicht beide, R¹ und R²- Nil- sein können.
  • Repräsentative Amphiphile gemäß Gruppe II schließen Folgendes ein: N¹,N&sup8;-Bis (3-arginincarboxamid)-N&sup4;-spermidincholesterincarbarriat
  • Zusätzliche kationische Amphiphile der Gruppe III (siehe Fig. 6) sind dazu in der Lage, den Transport biologisch aktiver Moleküle in Zellen zu erleichtern, wobei die Amphiphile die Struktur (III) aufweisen,
  • wobei: Z ein Alkylamin oder ein Dialkylamin ist, und an Y (oder direkt an X, falls Y fehlt) durch das N-Atom hiervon gebunden ist, wobei, wenn Z ein Dialkylamin ist, die Alkylgruppen hiervon gleich oder unterschiedlich sein können;
  • X ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • Y eine kurze Bindungsgruppe ist, oder Y fehlt;
  • R³ H, oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; H oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R² -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und bei der R¹ und R² gleich oder verschieden sind, außer dass, sowohl R¹ als auch R² nicht -NH- sein können.
  • Bezüglich der Amphiphile gemäß Struktur (III) wird wiederum bevorzugt, dass innerhalb der Bindungsgruppe Y nicht mehr als ungefähr drei oder vier Atome enthalten sind, die selbst eine Brücke kovalenter Bindungen zwischen X und Z bilden. Bei einer speziell bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Y eine Bindungsgruppe, wie beispielsweise > C=O, wobei nicht mehr als ein Atom dieser Gruppe eine Bindung mit sowohl X als auch Z bildet, oder Y fehlt.
  • Repräsentative Amphiphile gemäß Gruppe III schließen folgendes ein: N,N-Dioctadecyllysinamid-diHCl-Salz N¹,N¹-Dioctadecyl-1,2,6-triaminohexan-TriHCl-Salz
  • Zusätzliche kationische Amphiphile der Gruppe IV (siehe Fig. 7) sind dazu in der Lage, den Transport biologisch aktiver Moleküle in diese Zellen zu erleichtern, wobei die Amphiphile die folgende Struktur (IV) aufweisen,
  • wobei A und B unabhängig O, N oder S sind;
  • R&sup5; und R&sup6; unabhängig Alkyl oder Acyl-Gruppen sind oder gesättigt sein können oder ungesättigte Stellen enthalten;
  • C aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH&sub2;-, > C=O und > C=S besteht;
  • E ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • D eine Bindungsgruppe wie beispielsweise -NH(C=O)- oder -O(C=O)- ist oder D fehlt;
  • R³ H, eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; H oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R² -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und wobei R¹ und R² gleich oder verschieden sind, außer dass nicht beide, R¹ und R², -NH- sein können.
  • Repräsentative Amphiphile der Gruppe IV schließen folgendes ein: 1-(N&sup4;-Spermin)-2,3-dilaurylglycerolcarbamat N&sup4;-spermin-2,3-dilauryloxypropylamin
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere kationische Amphiphile und ein oder mehrere biologisch aktive Moleküle umfassen, wobei die Zusammensetzungen die intrazelluläre Lieferung bzw. Transport therapeutisch wirksamer Mengen der biologisch wirksamen Moleküle in die Gewebe des Patienten erleichtern. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können so zubereitet sein, dass sie ein oder mehrere physiologisch verträgliche Substanzen enthalten, die die Zusammensetzungen zur Lagerung stabilisieren und/oder zum erfolgreichen intrazellulären Transport der biologisch aktiven Moleküle beitragen.
  • Die Verwendung zur Erleichterung des Transfers biologisch aktiver Moleküle in die Zellen kann die folgenden Schritte umfassen: Herstellung einer Dispersion eines kationischen Amphiphils; in Berührung bringen der Dispersion mit einem biologisch aktiven Molekül zur Bildung eines Komplexes zwischen dem Amphiphil und dem Molekül und in Berührung bringender Zellen mit dem Komplex, wodurch der Transfer des biologisch aktiven Moleküls in die Zellen erleichtert wird.
  • Zur pharmazeutischen Verwendung können das kationische Amphiphil (die kationischen Amphiphile) mit einem oder mehreren zusätzlichen kationischen Amphiphilen, einschließlich denjenigen, die in der Technik bekannt sind oder mit neutralen Co-Lipiden wie beispielsweise Dioleoylphosphatidylethanolamin ("DOPE") zubereitet werden, um die Abgabe der biologisch aktiven Moleküle zu erleichtern. Zusätzlich können Zusammensetzungen, die ein oder mehrere kationische Amphiphile umfassen, dazu verwendet werden, biologisch aktive Moleküle in Pflanzenzellen, wie beispielsweise Pflanzelzellkulturgewebe, einzubringen.
  • Es existieren zusätzlich mögliche neue Plasmide, die zur Komplexbildung mit den Amphiphilen geeignet sind, um Patienten durch Gentherapie so zu behandeln, dass ein hohes Expressionsniveau des geeigneten therapeutischen Transgens erreicht werden kann. Repräsentative Beispiele hiervon schließen das Plasmid pCMVHI und pCFI ein. Das pCF1-Plasmid enthält die Enhancer/Promotorregion vom sehr frühen Gen (immediate early gene) des Cytomegalievirus. Das Plasmid enthält ebenfalls ein Hybridintron, das sich zwischen dem Promotor und der transgenen cDNA befindet. Das Polyadenylierungssignal des Rinderwachstumshormon-Gens wurde zur Anordnung stromabwärts vom Transgen ausgewählt. Diese und andere Merkmale tragen wesentlich zur verbesserten Transgenexpression bei, die mit diesem Plasmid möglich ist.
  • Weitere Steigerungen der Plasmidleistung sind durch Bereitstellung von replizierenden episomalen Plasmiden möglich. Zusätzliche therapeutische Verbesserungen werden durch Bereitstellung von Plasmiden möglich gemacht, bei denen die Expression des therapeutischen Transgens unter die Kontrolle eines Transkriptionspromotors gestellt wird, der gegenüber der Konzentration an mit einer Entzündung verbundenen Substanzen im Zielgewebe empfindlich ist. Derartige Plasmide sind zur Behandlung klinischer Fälle von besonderem Nutzen, bei denen die Entzündung eine Hauptkomplikation darstellt.
  • Besondere Organe oder Gewebe können als Ziel für die Gentherapie ins Auge gefaßt werden, und zwar durch intravenöse Verabreichung von amphiphilen/transgenen Komplexen, indem das Verhältnis von Amphiphil zu DNA in derartigen Komplexen und die apparente Ladung oder das Zetapotential hiervon eingestellt wird.
  • Weitere zusätzliche und repräsentative Aspekte der Erfindung werden gemäß der ausführlichen Beschreibung der Erfindung beschrieben, die direkt anschließend folgt.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 stellt repräsentative kationische Amphiphile der Gruppe I dar.
  • Fig. 2 stellt repräsentative lipophile Steroid-Gruppen dar.
  • Fig. 3 stellt repräsentative lipophile Steroid-Gruppen dar.
  • Fig. 4 stellt eine Transacylierungsreaktion dar.
  • Fig. 5 stellt repräsentative kationische Amphiphile der Gruppe II dar.
  • Fig. 6 stellt repräsentative kationische Amphiphile der Gruppe III dar.
  • Fig. 7 stellt repräsentative kationische Amphiphile der Gruppe IV dar.
  • Fig. 8 zeigt einen Syntheseweg für Spermidincholesterincarbamat.
  • Fig. 9 zeigt einen Syntheseweg für Spermincholesterincarbamat.
  • Fig. 10 sieht einen Vergleich der in vivo Transfektionsleistungsfähigkeit für bestimmte kationische Amphiphile unter speziellen Bedingungen vor.
  • Fig. 11 ist eine Beschreibung der in vivo Transfektionsleistungsfähigkeit als einer Funktion der DNA-Konzentration für spezielle kationische Amphiphile.
  • Fig. 12 ist eine Darstellung der in vivo Transfektionsleistungsfähigkeit als einer Funktion der Konzentration eines speziellen kationischen Amphiphils.
  • Fig. 13 zeigt relative Transfektionsleistungen für Amphiphile der Gruppe I.
  • Fig. 14 zeigt relative Transfektionsleistungen für Amphiphile der Gruppe II.
  • Fig. 15 zeigt relative Transfektionsleistungen für Amphiphile der Gruppe IV.
  • Fig. 16 zeigt eine Karte des pCMVHI-CAT Plasmids.
  • Fig. 17 zeigt das Hybridintron von pCMVHI-CAT.
  • Fig. 18 (Tafel A) zeigt eine Karte des pCF1/CAT Plasmids.
  • Fig. 18 (Tafel B) zeigt eine Karte des pCF2/CAT Plasmids.
  • Fig. 19 zeigt einen Plot des korrigierten Chloridionen-Transportes in Nasenpolypen- Epithelzellen von einem zystischen Fibrose-Patienten.
  • Fig. 20 zeigt eine Karte des pMyc4-CFTR Plasmids.
  • Fig. 21 zeigt das intravenöse Targeting des Herzens und der Lunge.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung Informationen bezüglich der Struktur der kationischen Amphiphile der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft kationische amphiphile Verbindungen und Zusammensetzungen, die diese enthalten, die zur Erleichterung des Transports biologisch aktiver Moleküle in Zellen von Nutzen sind. Die Amphiphile sind insbesondere bei der Erleichterung des Transports biologisch aktiver Polynukleotide in Zellen von Nutzen und insbesondere in Zellen von Patienten zum Zwecke der Gentherapie.
  • Kationische Amphiphile besitzen gemäß der Anwendung der Erfindung mehrere neue Merkmale. Diese Merkmale sind im Vergleich mit beispielsweise kationischen Amphiphil- Strukturen zu sehen, wie beispielsweise den in US-Patent Nr. 5 283 185 auf den Namen Epand et al. offenbarten Strukturen, für die 3β[N-(N¹,N¹-dimethylaminoethan)- carbamoyl]cholesterin eine repräsentative Struktur ist, das üblicherweise als "DC-chol" bekannt ist, und im Vergleich mit denjenigen, die von Behr et al. Roc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 6.982-6.986 (1989) offenbart werden, und für die eine repräsentative Struktur Dioctadecylamidologlycylspermin ("DOGS") ist.
  • Kationische Amphiphile der vorliegenden Erfindung enthalten folgende unverwechselbaren strukturelle Merkmale: (1) das Vorhandensein einer lipohilen Gruppe, die direkt, oder durch eine Bindungsgruppe, an zwei kationische Gruppen (siehe unten) gebunden ist, die selbst Amino-, Alkylamin- oder Polyalkylamin-Gruppen umfassen, ergibt eine gesamte und neue "T-förmige" Struktur; und (2) in vielen Fällen und im Vergleich mit zahlreichen in der Technik bekannten Amphiphilen, die Verwendung einer relativ kurzen Bindungsgruppe, um die lipophilen und kationischen Bereiche des Amphiphils in enge Nachbarschaft zu bringen. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass diese Merkmale beträchtlich zur transfektionssteigernden Fähigkeit dieser Verbindungen beitragen. Als Beispiel hiervon zeigt Fig. 10 nachstehend deutlich die beträchtliche in vivo transfektionssteigernde Fähigkeit von Spermidincholesterincarbamat (ein neues Amphiphil der Erfindung) im Vergleich zu DC-chol und DMRIE - zwei wohlbekannten Transfektionsmitteln.
  • In Verbindung mit der Anwendung der vorliegenden Erfindung wird angemerkt, dass "kationisch" bedeutet, dass die R-Gruppen, wie hierin definiert, dazu neigen, eine oder mehrere positive Ladungen in einer Lösung aufzuweisen, die einen physiologischen pH aufweist oder einen pH, der diesem nahe ist. Eine derartige kationische Eigenschaft kann die Interaktion des Amphiphils mit therapeutischen Molekülen (wie beispielsweise Nukleinsäuren) oder mit Zellstrukturen (wie beispielsweise Plasmamembranglykoproteinen) verbessern, wodurch zu einem erfolgreichen Eintritt der therapeutischen Moleküle in Zellen oder zur Prozessierung bzw. Verarbeitung in deren Subkompartimenten (wie beispielsweise dem Kern) beigetragen wird. In dieser Hinsicht wird die Aufmerksamkeit des Lesers auf zahlreiche Theorien in der Technik gelenkt, die die transfektionssteigernde Funktion kationischer Amphiphile betreffen, wobei keine von diesen als die Ausübung der vorliegenden Erfindung einschränkend aufgefaßt werden soll.
  • Biologische Moleküle, für die der Transport in Zellen gemäß der Anwendung der vorliegenden Erfindung vereinfacht werden kann schließen beispielsweise genomische DNA, cDNA, mRNA, Antisense- RNA oder -DNA, Polypeptide und Arzneistoffe mit kleinem Molekulargewicht oder Hormone ein. Repräsentative Beispiele hiervon sind unten in Verbindung mit der Beschreibung therapeutischer (pharmazeutischer) Zusammensetzungen der Erfindung erwähnt.
  • In einer bedeutenden Ausführungsform der Erfindung ist das biologisch aktive Molekül ein kodierendes Polynukleotid, das exprimiert wird, wenn es in den Zellen eines Patienten eingebracht wird, und zur Korrektur eines metabolischen Defektes führt. Bei einem besonders bedeutenden Beispiel kodiert das Polynukleotid ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mit derjenigen des menschlichen zystischen Fibrose-Transmembran-Regulators ("CFTR") ausreichend duplizierbar bzw. duplikativ ist, um die biologische Eigenschaft der Epithelzell-Anionenkanal-Regulation zu gewährleisten.
  • Wie vorher erwähnt schließen charakteristische und neue Merkmale der Amphiphile der vorliegenden Erfindung zuerst ein, dass die Verbindungsgruppe, die die beiden kationischen Amino-Gruppen an die lipophile Gruppe bindet, sehr kurz ist oder vollkommen fehlt und schließen zweitens ein, dass die sich ergebende Bindung der beiden kationischen R- Gruppen an die lipophile Gruppe eine T-förmige Struktur bildet, wenn sie aus der Position von "X" (ein Kohlenstoff oder Stickstoffatom) betrachtet wird, wie es beispielsweise in den Strukturen (I), (II), (III) und (VI, siehe Atom "E") dargestellt ist.
  • Als Beispiele der kationischen Amphiphile der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass sowohl Spermidincholesterincarbamat (N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat) als auch Spermincholesterincarbamat (N&sup4;-Spermincholesterincarbamat) in vivo im Vergleich mit nicht-T-förmigen Amphiphilen, die ansonsten äquivalente Mengen der kationischen Alkylaminstruktur aufweisen, überlegene Transfektionsmittel sind. Eine überlegene Leistung (siehe ebenfalls Beispiel 3) wurde für folgendes bestimmt: (Spermidincholesterincarbamat)
  • im Vergleich mit beispielsweise (N¹-Spermidincholesterincarbamat)
  • Zusätzlich wurde eine überlegene Leistung für (Spermincholesterincarbamat)
  • im Vergleich mit beispielsweise (N¹-Thermospermincholesterincarbamat)
  • und (N¹-Spermincholesterincarbamat)
  • festgestellt.
  • Die Anmelder haben ebenfalls festgestellt, dass zahlreiche der kationischen Amphiphile der vorliegenden Erfindung strukturelle Merkmale mit natürlich vorkommenden Polyaminen wie beispielsweise Spermin und Spermidin (einschließlich des N-Atomabstandes) aufweisen. In dieser Hinsicht sind die Strukturen der Amphiphile 53, 67, 78, 90 und 91 repräsentativ. Wie durch Überprüfung der Daten in den Fig. 13, 14 und 15 ersichtlich ist führt eine solche Anordnung der Stickstoffatome in den polaren Kopfgruppen der Amphiphile, so dass sie durch ein oder mehrere Kombinationen von 3 und 4 Kohlenstoffatomen getrennt sind, zu einer hohen in vivo Transfektionsleistung für Plasmidtransgene, die damit komplexiert sind. Die Anmelder haben ebenfalls bemerkt, dass diese gemeinsamen strukturellen Merkmale eine nützliche Wirkung auf die Bindung der Amphiphile an DNA und auf die Interaktion mit Zelloberflächenpolyamin-Rezeptoren aufweisen. Eine Interaktion mit Zellpolyamin-Rezeptoren kann bezüglich der Behandlung von Krebszellen durch Gentherapie von besonderer Bedeutung sein, weil die DNA-Replikations- Erfordernisse derartiger Zellen zu einem hohen Expressionsniveau derartiger Rezeptoren führen können.
    • Amphiphile der Gruppe I
  • In Verbindung mit dem Design bzw. der Konzeption der Amphiphile der Gruppe I werden die nachfolgenden Betrachtungen vorgenommen. Viele dieser Konzeptionsmerkmale werden dann in Verbindung mit den anderen Amphiphilen diskutiert, wie sie unter den Gruppen II, III und IV klassifiziert sind.
  • Demgemäß sind die kationischen Amphiphile der Gruppe I (siehe Fig. 1, Tafeln A, B und C) zur Erleichterung des Transports biologisch aktiver Moleküle in Zellen in der Lage, wobei diese Amphiphile die folgende Struktur (I) aufweisen
  • wobei:
  • Z ein Steroid ist;
  • X ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • Y eine kurze Verbindungsgruppe ist oder Y fehlt;
  • R³ H oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; H oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R² -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und bei der R¹ und R² gleich oder verschieden sind, außer dass nicht sowohl R¹ als R² -NH- sein können.
    • Die Verbindungsgruppe
  • Vorzugsweise ist die Verbindungsgruppe, die die lipophile Gruppe an die beiden kationischen R-Gruppen bindet, relativ kurz. Es wird bevorzugt, dass innerhalb der Bindungsgruppe Y nicht mehr als ungefähr drei oder vier Atome enthalten sind, die selbst eine Brücke kovalenter Bindungen zwischen X und Z bilden. Beispiele der Y-Gruppe schließen -(CH&sub2;)&sub2;; -(CH&sub2;)&sub3;; -(CH&sub2;)-(C=O)-; -(CH&sub2;)n-NH-(C=O)- ein, wobei n vorzugsweise 4 oder weniger ist. Zusätzliche Verbindungsgruppen, die in der Ausübung der Erfindung von Nutzen sind, sind diejenigen, die kleinen Aminosäuren wie beispielsweise Glycinyl, Alanyl, Beta-Alanyl, Serinyl und dergleichen nachgebildet sind.
  • Bezüglich der oben genannten Darstellungen soll die linke Seite an Atom "X" - wie dargestellt - und die rechte Seite an die Gruppe "Z" binden (siehe Struktur I).
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist Y eine Verbindungsgruppe, bei der nicht mehr als ein Atom dieser Gruppe eine Bindung sowohl mit "X" als auch "Z" bildet. Beispiele bevorzugter Verbindungsgruppen schließen -CH&sub2;-, > C=S, und > C=O ein. Alternativ kann die Verbindungsgruppe "Y" vollkommen fehlen.
  • Wie vorher erwähnt (siehe Struktur I, direkt vorstehend), bildet "X" einen Verbindungspunkt in den Amphiphilen, an den ebenfalls die beiden kationischen R-Gruppen gebunden sind. Wie dort ersichtlich ist (siehe ebenfalls Fig. 1) verursacht das Anordnen des Stickstoffatoms, das "X" darstellt, in klarer Weise, dass das Molekül eine T-Form annimmt.
    • Lipophile Steroid-Gruppen
  • Kationische Amphiphile gemäß der Anwendung der vorliegenden Erfindung können eine Vielzahl von Strukturen als lipophile Gruppe einschließen. Steroide stellen eine bevorzugte Gruppe derartiger Strukturen dar.
  • Bezüglich des Designs bzw. der Konzeption und der Orientierung der Steroide als lipophile Gruppen gemäß der Anwendung der Erfindung werden die nachfolgenden Betrachtungen vorgenommen. Steroide sind im Tier-, Mikroben- und Pflanzenreich weit verbreitet. Sie können als feste Alkohole definiert werden, die typischerweise ein Basis- Grundgerüst von 17 Kohlenstoffatomen enthalten, die in Form eines Perhydrocyclopentenophenanthrenringsystems angeordnet sind. Demgemäß schließen derartige Verbindungen Gallensäuren, Cholesterin und verwandte Substanzen, Vitamin D, bestimmte Insect Molting-Hormone, bestimmte Geschlechtshormone, Corticoidhormone, bestimmte Antibiotika und alle Derivate aller oben genannten Substanzen ein, wobei zusätzliche Ringe der Grundstruktur hinzugefügt oder aus dieser entfernt werden (siehe Natural Products Chemistry, K. Nakanashi et al. Hrsg., Academic Press, Inc., New York (1974) Band 1, Kapitel 6 für eine weitere Diskussion der allgemeinen Molekülklassen, die in der Technik als Steroide aufgefaßt werden). Zusätzlich wird der Begriff Steroid für die Zwecke der vorliegenden Erfindung in einer allgemeinen Weise verwendet, so dass er verwandte Moleküle einschließt, die aus mehreren bzw. vielfachen Isoprenoid-Einheiten gewonnen werden, wie beispielsweise Vitamin E. Steroide, die für diese repräsentativ sind und bei der Anwendung der Erfindung von Nutzen sind, sind in den Fig. 1, 2, 3 und 5 dargestellt.
  • Wie nachstehend dargelegt schließen bestimmte bevorzugte Amphiphile der vorliegenden Erfindung einen Steroidbestandteil "Z" ein, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 3- Sterolen besteht, wobei das Sterol-Molekül durch dessen 3-O-Gruppe oder ersatzweise durch N an Y (siehe Fig. 1) gebunden ist. Derartige Strukturen schließen beispielsweise Spermidincholesterincarbamat, Spermincholesterincarbamat, Spermidin 7- dehydrocholesterincarbamat, Lysin-3-N-dihydrocholesterincarbamat, Spermidincholestaminharnstoff, und N-3-aminopropyl-N-4-aminobutylcholestamin ein.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Steroidgruppe an Y (oder direkt an X, wenn Y fehlt) von Ringposition 17 des Steroidringes (siehe die Fig. 1 und 3) gebunden oder von dem Arm, der sich normalerweise bei vielen Steroiden aus Position 17 heraus erstreckt (siehe Fig. 1 und 3) oder aus irgendeiner verkürzten Form des Armes.
  • In Verbindung mit der Auswahl der Steroide für die Amphiphile der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, dass die Moleküle Strukturen aufweisen, die durch den Körper metabolisiert bzw. verstoffwechselt werden können und die in den verwendeten Dosen hiervon untoxisch sind. Bevorzugt sind Steroide wie beispielsweise Cholesterin und Ergosterol, die im wesentlichen untoxisch sind und die eine biologisch normale Stereospezifität besitzen, um deren sicheren Metabolismus in den Patienten zu erleichtern. Zusätzliche Steroide, die in der Ausübung der Erfindung brauchbar sind, schließen beispielsweise Ergosterol B1, Ergosterol B2, Ergosterol B3, Androsteron, Cholsäure, Desoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure, Lithocholsäure und, beispielsweise, verschiedene Derivate hiervon ein, wie sie in den Tafeln der Fig. 2 und 3 dargestellt sind.
  • Bezüglich der Orientierung der lipophilen Steroidgruppe, d. h. wie die Gruppe (mit oder ohne einem Linker) an die kationische (Alkyl)-Amin-Gruppen eines Amphiphils gebunden ist, sei die nachfolgende weitere Information erwähnt. Jede Ringposition oder Substituent auf dem Steroid kann im allgemeinen als Bindungspunkt verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt, einen Bindungspunkt zu verwenden, der (1) die Komplexität der chemischen Synthesen minimiert und (2) jedem "Ende" des Steroidmoleküls nahe positioniert ist, beispielsweise einer Position nahe der Ringposition 3 oder nahe der Ringposition 17 (oder dem Arm, der sich typischerweise hiervon weg erstreckt). Derartige Positionen stellen eine Orientierung des Steroids bezüglich des Restes der Amphiphil-Struktur bereit, die eine Bilayer- bzw. Doppelschichtbildung und/oder eine Mizellen-Bildung erleichtert und/oder eine Interaktion bzw. Wechselwirkung mit den biologisch aktiven Molekülen, die zu den Zielzellen transportiert werden sollen, stabilisiert. Repräsentative Strukturen, die die Bindung der kationischen (Alkyl) Amin-Gruppen an die lipophile Steroidgruppe über den Arm, der sich aus Ringposition 17 heraus erstreckt, zeigen, sind in Fig. 3 (Tafeln A, B) dargestellt. Bezüglich dieser Art von Struktur wird weiter bevorzugt, dass irgendeine polare Gruppe am Steroid, wie sie beispielsweise an Ringposition 3 gebunden sein kann, entweder entfernt oder gecapped bzw. geschützt wird (beispielsweise Hydroxy als Methoxy) um eine potentielle Destabilisierung der Bilayer oder der Mizell-Strukturen zu vermeiden.
  • Die Darstellung von kationischen Amphiphilen in Fig. 3, bei denen die lipophile Steroid- Gruppe an die kationischen Alkylamin-Gruppen über Steroidringposition 17 gebunden ist, ist jedoch nur ein Beispiel der Erfindung. In ähnlicher Weise ist die Darstellung von kationischen Amphiphilen in den Fig. 1 bis 4, bei denen die lipophile Steroid-Gruppe an die kationischen Alkylamin-Gruppen über Steroidringposition 3 gebunden ist, ein Beispiel der Erfindung. Wie vorher erwähnt liegt die Verwendung irgendeiner Steroidringposition (oder einer Komponente oder einer Verzweigung, die sich hieraus erstreckt) als Bindungspunkt innerhalb der Anwendung der vorliegenden Erfindung.
  • Bevorzugte Steroide zur Verwendung als Gruppe in "Z" gemäß der Anwendung der Erfindung schließen Folgendes ein: 3-Sterole (abgeleitet von Cholesterin) 3-N Steryl-Gruppen (Cholesterin nachgebildet) Ergosterol bzw. Ergosterin und Derivate
  • Repräsentative Steroidarten, die Ergosterol nachgebildet sind bzw. auf diesem basieren und die zur Definierung der Struktur der kationischen Amphiphile der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Folgendes ein: Ergosterol (Doppelbindungen wie dargestellt); Ergosterol B1 (Δ8, 9; Δ14, 15; Δ22, 23); Ergosterol B1 (Δ6, 7; Δ8, 14; Δ22, 23); Ergosterol B1 (Δ7, 8; Δ14, 15; Δ22, 23); und Lumisterol (das 9b-H Isomer von Ergosterol). Cholsäure und Derivate
  • Repräsentative Steroidarten, die Cholsäure nachgebildet sind bzw. auf Cholsäure basieren und die zur Definierung der Struktur kationischer Amphiphile der Erfindung verwendet werden können, schließen: Cholsäure ein, wobei r¹ und r² = OH; Desoxycholsäure, wobei r¹ = H und r² = OH; Chenodesoxycholsäure, wobei r¹ = OH und r² = H; und Lithocholsäure, wobei r¹ und r² = H. Androsteron und Derivate
    • Auswahl der Gruppen R¹, R², R³ und R&sup4; Für R³ und R&sup4;:
  • Gemäß der Anwendung der Erfindung sind R³ und R&sup4; unabhängig H oder gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppen. Die aliphatischen Gruppen können verzweigt oder unverzweigt sein. Repräsentative Gruppen schließen Alkyl, Alkenyl und Cykloalkyl ein.
    • Für R¹ und R²:
  • R¹ und R² stellen Strukturen dar, die in der Technik als Amin; Alkylamine (einschließlich primärer, sekundärer und tertiärer Amine) oder als verlängerte Versionen hiervon (hierin als "Polyalkylamine" bezeichnet), bekannt sind. Es ist verständlich, dass sowohl Alkylamin- als auch Polyalkylamin-Gruppen, wie hierin definiert, ein oder mehrere Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindungen einschließen können und die Verwendung derartiger Alkenylamine liegt deswegen innerhalb des Anwendungsbereichs der vorliegenden Erfindung.
  • Repräsentative Alkylamine schließen ein: (a) -NH-(CH&sub2;)z- wobei z von 0 verschieden ist; (b) -[[CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z wobei z von 0 verschieden ist; und (c) -[[CH&sub3;(CH&sub2;)x][CH&sub3;(CH&sub2;)y]]N-(CH&sub2;)z- wobei z von 0 verschieden ist.
  • Bezüglich der Bedingung, bei der eines oder beides von R¹ und R² tertiäre Amine sind, wie es beispielsweise in Struktur (c) oben dargestellt wird, ist verständlich, dass ein Wasserstoffatom, das entweder R³ oder R&sup4; entspricht, wie geeignet, vorliegen oder nicht vorliegen kann, weil derartige Wasserstoffatome der N : H(+) Struktur entsprechen, deren Protonierungsgrad mit dem pH variieren wird.
  • Der Begriff "Polyalkylamin", wie er hierin verwendet wird, definiert eine Polymerstruktur, bei der zumindest zwei Alkylamine verbunden sind. Die Alkylamineinheiten, die so verbunden sind, können primär oder sekundär sein und die Polyalkylamine, die sich ergeben, können primäre, sekundäre oder tertiäre N-Atome enthalten. Die Alkylmin(unter)einheiten können gesättigt oder ungesättigt sein und deswegen umfaßt der Begriff "Alkylamin" in der Beschreibung der Erfindung Alkenylamine.
  • Repräsentative, sich ergebende Polyalkylamine schließen folgendes ein: (d) -[NH- (CH&sub2;)(z)]q- wobei z von 0 verschieden ist und q 2 oder größer ist; (e) -[NH-(CH&sub2;)(y)]p-[NH- (CH&sub2;)(z)]q- wobei y und z jeweils von 0 verschieden sind und p und q jeweils von 0 verschieden sind; (f) -[NH-(CH&sub2;)(x)]n-[NH-(CH&sub2;)(y)]p-[NH-(CH&sub2;)(z)]q- wobei x, y und z jeweils von 0 verschieden sind und n, p und q jeweils von 0 verschieden sind; (g) -[NH- (CH&sub2;)(w)]m-[NH-(CH&sub2;)(x)]n-[NH-(CH&sub2;)(y)]p-[NH-(CH&sub2;)(z)]q- wobei w, x, y und z jeweils von 0 verschieden sind und m, n, p und q jeweils von 0 verschieden sind; (h) -[NH- (CH&sub2;)(w)]m-[NH-(CH&sub2;)(x)]n-[CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z- wobei x, n und z jeweils von 0 verschieden sind; (i) -[NH-(CH&sub2;)(w)]p-[[CH&sub3;(CH&sub2;)x]N]-(CH&sub2;)y-[NH-(CH&sub2;)(z)]q- wobei w, p, y, z und p jeweils von 0 verschieden sind, und (j) -[NH-(CH&sub2;)(v)]l-[NH-(CH&sub2;)(w)]m-[NH- (CH&sub2;)(x)]n-[NH-(CH&sub2;)(y)]p-[NH-(CH&sub2;)(z)]q- wobei v, w, x, y und z jeweils von 0 verschieden sind und l, m, n, p und q jeweils von 0 verschieden sind.
  • Wie oben erwähnt können R¹ und R² unabhängig -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin sein und können gleich oder voneinander verschieden sein, außer dass nicht sowohl R¹ als auch R² -NH- sein können, um (1) die "T-Form" der sich ergebenden Verbindung zu erhalten und (2) für deren Stabilität zu sorgen. Es wird bevorzugt, dass - in Kombination - die kombinierte Grundgerüstlänge von R³R¹ (oder von R&sup4;R²) weniger als ungefähr 40 Stickstoff und Kohlenstoffatome, besonders bevorzugt weniger als ungefähr 30 Stickstoff- und Kohlenstoffatome beträgt.
  • In dem Fall, in dem die R¹-Gruppe, die der R³-Gruppe benachbart ist (oder R² R&sup4; benachbart ist) ein terminales Stickstoffatom einschließt, das ein tertiäres Zentrum definiert, wird dann ein quartäres Amin gebildet (an diesem Stickstoffatom von R¹), wenn R³ eine aliphatische Gruppe ist und ein tertiäres Amin bleibt zurück (an diesem Stickstoffatom von R¹), wenn R³ H ist. Demgemäß sind bezüglich derartiger sich ergebender R³R¹ oder R&sup4;R² Strukturen jeweils die folgenden Formeln repräsentativ:
  • (k) H-(CH&sub2;)(w)-[[CH&sub3;(CH&sub2;)x][CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z- wobei w und z jeweils von 0 verschieden sind; und (1) H-[[CH&sub3;(CH&sub2;)x][CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z wobei z von 0 verschieden ist.
  • In Verbindung mit der Auslegung der Strukturdiagramme, die hierin beschrieben sind, ist beabsichtigt, dass die Bindung der R³R¹- (oder R&sup4;R²-) Strukturen an das Atom "X" durch die rechte Seite (wie dargestellt) von R³R¹, d. h. durch eine CH&sub2;-Komponente erfolgt. Die Koeffizienten (d. h. v, w, x, y und z und l, m, n, p und q) wie hierin beschrieben, stellen ganze Zahlen dar. Zum Zwecke der Erfindung bedeutet "ganze Zahl" 0 und die natürlichen Zahlen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und mehr, soweit sie nicht speziell beschränkt sind.
  • Bezüglich der erfindungsgemäßen Amphiphile, die diejenigen einschließen, die durch die Formeln (a) bis (1) dargestellt sind, wird angemerkt, dass bestimmte Präferenzen bezüglich des Designs derartiger Gruppen existieren, abhängig davon, ob Atom "X" wie es gemäß Struktur (I) oben dargestellt ist, ein Stickstoffatom oder ein Kohlenstoffatom ist. Wenn "X" Stickstoff ist, dann werden Amphiphile, die R³-R¹ (oder R&sup4;R²)-Gruppen enthalten, die in einem N-Atom enden [d. h. Formel (e), bei der z gleich 0 ist und q = 1 ist; Formel (h) bei der z gleich 0 ist] nicht bevorzugt, weil die sich ergebende N-N Bindung, die die Position X einschließt, ein Amphiphil zur Folge hat, das unstabil ist und/oder schwer herzustellen ist. Eine zusätzliche Gruppe von Strukturen, die schwierig herzustellen und/oder instabil sind, wird beispielsweise durch die R-Sequenz -NH-CH&sub2;-NH-CH&sub2;- darstellt (ob in R¹, oder in Verbindung von R¹ und R³). Demgemäß ist die Verwendung von Strukturen [d. h. Formel (a) bei der Z gleich 1 ist, Formel (e), bei der eines oder beides von y und z 1 gleich ist] in der Anwendung der Erfindung nicht bevorzugt.
  • Bezüglich des Designs der Strukturen (wie es beispielsweise oben stehend dargestellt ist), die in kationische Amphiphile eingeschlossen werden sollen, werden die nachfolgenden weiteren Betrachtungen vorgenommen. Jede Kombination von alternierenden Amin- und Alkylkomponenten erzeugt eine R-Struktur innerhalb des Umfangs der Erfindung. Ein Polyalkylamin kann beispielsweise durch die obigen Formeln darstellt werden, obwohl eine viel größere Zahl an Strukturen (derartige Strukturen liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung) durch Vergrößern der Anzahl oder der Arten oder Kombinationen von Alkylamin-Untereinheiten innerhalb der Amphiphilstruktur dargestellt werden kann. Dass weitere derartige Variationen durchgeführt werden können, ist für den Fachmann offensichtlich.
  • Es sei erwähnt, dass eine Polyalkylamin-Gruppe (oder eine sich ergebende R³R¹-Gruppe), die sehr lang ist, beispielsweise die Löslichkeit des sich ergebenden Amphiphils oder dessen Fähigkeit stören kann, stabil mit dem biologisch aktiven Molekül zu interagieren, das zur intrazellulären Abgabe ausgewählt ist. In dieser Hinsicht sind Polyalkylamine (oder sich ergebende R³R¹-Gruppen) mit einer Gerüstlänge von ungefähr 40 Stickstoff und Kohlenstoffatomen oder mehr nicht mehr zum Einschluß in die Amphiphile geeignet. Jedoch können für jede derartige vorgeschlagene Struktur deren Eigenschaften durch Experimente bestimmt werden und deren Verwendung liegt nichtsdestoweniger innerhalb der Anwendung bzw. des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Demgemäß ergeben sich spezielle Alkylamin- und Polyalkylaminstrukturen wie folgt:
    • Tabelle 1 Für R¹ und/oder R²
  • R²
  • (1) -NH-
  • (2) -NH-(CH&sub2;)(2)-
  • (3) -NH-(CH&sub2;)(3)-
  • (4) -NH-(CH&sub2;)(4)-
  • (5) -NH-(CH&sub2;)(6)-
  • (6) -NH-(CH&sub2;)(3)-NH-(CH&sub2;)(4)-
  • (7) -NH-(CH&sub2;)(2)-NH-(CH&sub2;)(2)-
  • (8) -NH-(CH&sub2;)(4)-NH-(CH&sub2;)(3)-
  • (9) -NH-(CH&sub2;)(y)-NH-(CH&sub2;)(z)-
  • (10) -NH-(CH&sub2;)(x)-NH-(CH&sub2;)(y)-NH-(CH&sub2;)(z)-
  • (11) -NH-(CH&sub2;)(w)-NH-(CH&sub2;)(x)-NH-(CH&sub2;)(y)-NH-(CH&sub2;)(z)-
  • (12) -NH-(CH&sub2;)(v)-NH-(CH&sub2;)(w)-NH-(CH&sub2;)(x)-NH-(CH&sub2;)(y)-NH- (CH&sub2;)(z)-
  • (13) -[NH-(CH&sub2;)(w)]m-[NH-(CH&sub2;)(x)]n-[[CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z-
  • (14) -[NH-(CH&sub2;)(x)]n-[[CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z-
  • (15) -[NH-(CH&sub2;)(w)]m-[NH-(CH&sub2;)(x)]n-[[CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z-
  • (16) -[[CH&sub3;(CH&sub2;)x][CH&sub3;(CH&sub2;)y]N]-(CH&sub2;)z-
  • (17) -NH-(CH&sub2;)(z)-NH-
  • (18) -NH-(CH&sub2;)(y)-NH-(CH&sub2;)(z)-NH-
  • (19) -NH-(CH&sub2;)(y)-CH=CH-(CH&sub2;)z-
  • (20) -[NH-(CH&sub2;)(w)]p-[[CH&sub3;(CH&sub2;)x]N]-(CH&sub2;)y-[NH-(CH&sub2;)(z)]q-
    • Für R³ und/oder R&sup4;
  • R&sup4;
  • (1) H-
  • (2) CH&sub3;-
  • (3) CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub2;-
  • (4) CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub4;-
  • (5) CH&sub3;-(CH&sub2;)z-
  • (6) CH&sub3;-[CH&sub3;-(CH&sub2;)z]CH-
  • (7) CH&sub3;-[CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub2;]CH-
  • (8) CH&sub3;-[[CH&sub3;-(CH&sub2;)y][CH&sub3;-(CH&sub2;)z]]C-
  • (9) CH&sub3;-(CH&sub2;)z-CH=CH-CH&sub2;-
  • (10) CH&sub3;-[CH&sub3;-(CH&sub2;)y-CH=CH-(CH&sub2;)z]CH-
  • (11) CH&sub3;-[[CH&sub3;-(CH&sub2;)w-CH=CH-(CH&sub2;)x][CH&sub3;-(CH&sub2;)y-CH=CH- (CH&sub2;)z]]CH-
  • (12) CH&sub3;-[CH&sub3;-(CH&sub2;)y]CH-(CH&sub2;)z-
    • Amphiphile der Gruppe II
  • Zusätzlich sind kationische Amphiphile der Gruppe II (siehe Fig. 5) dazu in der Lage, den Transport biologisch aktiver Moleküle in Zellen zu erleichtern, wobei die Amphiphile die folgende Struktur (II) aufweisen.
  • wobei
  • Z ein Steroid ist;
  • X ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • Y eine Verbindungsgruppe ist oder Y fehlt;
  • R³ eine Aminosäure, eine derivatisierte Aminosäure, H oder ein Alkyl ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; eine Aminosäure, eine derivatisierte Aminosäure, H oder ein Alkyl ist;
  • R² -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und bei der R¹ und R² gleich oder verschieden sind, außer dass nicht beide, R¹ und R², -NH- sein können.
  • Repräsentative Amphiphile, die gemäß Gruppe II bereitgestellt sind, schließen die Amphiphile 87, 91, 93, 95, 97, 99, 100 und 103 ein. Bezüglich der strukturellen Merkmale dieser Amphiphile und der anderen Amphiphile der Gruppe II sollte das Folgende in Erwägung gezogen werden.
  • Die Steroid-Gruppe kann gemäß der oben für die Gruppe I-Amphiphile definierten Kriterien ausgewählt werden. Demgemäß schließen bevorzugte Amphiphile diejenigen ein, die aus 3-Sterolen ausgewählt sind, wobei das Sterol-Molekül durch die 3-O-Gruppe hiervon, oder ersatzweise durch N, an "Y" gebunden ist.
  • Die Verbindungsgruppe Y der Amphiphile der Gruppe II besteht aus einer N- Acylaminosäure (oder einem Derivat hiervon) oder besteht aus einer Gruppe (wie beispielsweise C=O oder > C=S) wobei nicht mehr als ein Atom dieser Gruppe eine Bindung mit sowohl "X" als auch "Z" bildet. Wahlweise kann die Gruppe Y fehlen. Repräsentative N-Acylamino-Gruppen schließen ein N-Acylserin (Nr. 87), ein N-Acylglycin (Nr. 91) und eine N-Acylasparaginsäure Nr. 103) ein. Bezüglich der Verwendung von N- Acylasparaginsäure im Amphiphil Nr. 103 sei angemerkt, dass, wie vorgesehen, das Gamma-Carboxyl hiervon weiter zu einem zusätzlichen Alkylamin-Bestandteil derivatisiert wird.
  • Die Kriterien zur Auswahl von R¹ und R² sind wie für die Gruppe I-Amphiphile dargelegt. R³ und R&sup4; stellen H oder Alkyl dar oder können natürliche oder künstliche Aminosäuren sein, einschließlich Derivate von beiden. Repräsentative Beispiele von R³ und R&sup4; Aminosäure-Gruppen schließen diejenigen ein, die aus Tryptophan (Nr. 97) und aus Arginin (Nr. 95) gewonnen werden.
    • Amphiphile der Gruppe III
  • Zusätzlich sind kationische Amphiphile der Gruppe III (siehe Fig. 6) dazu in der Lage, den Transport biologisch aktiver Moleküle in Zellen zu erleichtern, wobei die Amphiphile die folgende Struktur (III) aufweisen:
  • wobei: Z ein Alkylamin oder ein Dialkylamin ist, an Y durch dessen N-Atom gebunden oder direkt an X gebunden, wenn Y fehlt, wobei Z ein Dialkylamin ist, wobei die Alkyl- Gruppen hiervon gleich oder unterschiedlich sein können;
  • X ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • Y eine kurze Verbindungsgruppe ist oder Y fehlt;
  • R³ H, oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; H oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R² -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und wobei R¹ und R² identisch oder unterschiedlich sind, außer dass nicht beide, R¹ und R², -NH- sein können.
  • Repräsentative kationische Amphiphile gemäß der Anwendung der Erfindung, die ein Alkylamin oder Dialkylamin als lipophile Gruppen enthalten, schließen beispielsweise N,N- Dioctadecyllysinamid; N¹,N¹-Dioctadecyl-1,2,6-triaminohexan; N,N-Didodecyllysinamid; N,N-Didecyllysinamid; Spermidin-N,N-dioctadecylharnstoff, N-Myristyllysinamid; und N-(Dioctyldecylaminoethyl)-lysinamid ein. Repräsentative Amphiphile sind (Fig. 6) als Amphiphile 43, 47, 56, 60 und 73 dargestellt. Bezüglich der Strukturmerkmale dieser Amphiphile und der anderen Amphiphile der Gruppe III sollte das Folgende in Erwägung gezogen werden.
  • Bezüglich der Auswahl des lipophilen Alkylamins oder der Dialkylamin-Gruppe "Z" stellt Tabelle 2 nachstehend repräsentative Strukturen bereit.
    • Tabelle 2 Für "Z"
  • (1) CH&sub3;-(CH&sub2;)&sub1;&sub3;-NH-
  • (2) CH&sub3;-(CH&sub2;)z-NH-
  • (3) [[CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub7;][CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub7;]]N-
  • (4) [[CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;][CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;]]N-
  • (5) [[CH&sub3;(CH&sub2;)&sub9;][CH&sub3;(CH&sub2;)&sub9;]]N-
  • (6) [[CH&sub3;(CH&sub2;)x][CH&sub3;(CH&sub2;)y]]N-
  • (7) [[CH&sub3;(CH&sub2;)x][CH&sub3;(CH&sub2;)yCH=CH(CH&sub2;)z]]N-
  • (8) [[CH&sub3;(CH&sub2;)w][CH&sub3;(CH&sub2;)xCH=CH(CH&sub2;)yCH=CH(CH&sub2;)z]]N-
  • In Verbindung mit der Auswahl geeigneter Alkylamin- oder Diyalkylamin-Gruppen zum Einschluß in Position Z in die Amphiphile der Erfindung sollte eine Alkylkette(n) der Gruppe bezüglich ihres Molekulargewichts nicht so groß sein, dass sie die Löslichkeit des Amphiphils stört oder dessen Fähigkeit stört, mit Plasmid-DNA wechselzuwirken. Zusätzlich kann eine Alkylkette eines Alkylamins oder Dialkylamins ein oder mehrere Stellen einer Unsättigung einschließen. Die Auswahl der R-Gruppen R¹, R², R³ und R&sup4; folgt derjenigen, die für die Gruppe I Amphiphile offenbart sind und diese R-Gruppen können beispielsweise aus Tabelle 1 ausgewählt werden. Die Verbindungsgruppe Y, kann, wie bei den Amphiphilen der Gruppe I ausgewählt werden und bevorzugte Beispiele hiervon schließen -CH&sub2;- und > C=O ein.
    • Amphiphile der Gruppe IV
  • Zusätzliche kationische Amphiphile der Gruppe IV (siehe Fig. 7) sind dazu in der Lage, den Transport biologisch aktiver Moleküle in Zellen zu erleichtern, wobei diese Amphiphile die folgende Struktur (IV) aufweisen:
  • wobei:
  • A und B unabhängig O, N oder S sind,
  • R&sup5; und R&sup6; unabhängig Alkyl- oder Acyl-Gruppen sind und gesättigt sein können oder Stellen einer Unsättigung enthalten können;
  • C aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH&sub2;-, > C=O und > C=S besteht;
  • E (analog zu "X" in den Strukturen I, II, III) ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist;
  • D eine Verbindungsgruppe wie beispielsweise -NH(C=O)- oder -O(C=O)- ist oder D fehlt;
  • R³ H oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R¹ -NH-, ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • R&sup4; H, eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe ist;
  • R² -NH- ein Alkylamin oder ein Polyalkylamin ist;
  • und wobei R¹ und R² gleich oder verschieden sind, außer dass beide, R¹ und R² nicht -NH- sein können.
  • Repräsentative Amphiphile der Gruppe IV schließen die Nummern 64, 76, 85, 89, 94, 98, 102, 105, 110 und 111 ein. Bezüglich der strukturellen Merkmale dieser Amphiphile und der anderen Amphiphile der Gruppe IV sollte Folgendes berücksichtigt werden.
  • Bezüglich der Auswahl von R¹, R², R³ und R&sup4; sind die Lehren, die für die Gruppe I, II und III-Amphiphile vorgesehen sind, anwendbar. Wie vorher erwähnt, stellt die Gruppe "E" ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom dar.
  • R&sup5; und R&sup6; sind unabhängig Alkyl- oder Acyl-Gruppen, die vorzugsweise ungefähr 8 bis ungefähr 30 Kohlenstoffatome enthalten und derartige Gruppen können ein oder mehrere Punkte bzw. Stellen einer Unsättigung enthalten.
  • Bezüglich der Auswahl der Gruppe D werden Linker wie beispielsweise -NH(C=O)- oder -O(C=O)- bevorzugt und werden derartig beschrieben, dass deren linke Seite zur Bindung an "C" vorgesehen ist und deren rechte Seite zur Bindung an "E" vorgesehen ist. Wahlweise kann die Gruppe D fehlen (Amphiphil Nr. 94). Zusätzliche Linker können auf Grundlage der Lehren der Gruppen I, II und III, siehe oben, ausgewählt werden und auf Grundlage der in vivo Testdaten, die gewonnen wurden (Fig. 15), wird bevorzugt, dass der Linker D kurz ist oder abwesend ist.
    • Co-Lipide
  • Repräsentative Co-Lipide, die gemäß der Ausübung der vorliegenden Erfindung zum Mischen mit einem oder mehreren kationischen Amphiphilen brauchbar sind, schließen Dioleoylphosphatidylethanolamin ("DOPE"), Diphytanoylphosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylethanolamine anderer Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylcholine, Lyso- Phosphatidylcholine und Cholesterin ein. Typischerweise ist ein bevorzugtes Molverhältnis von kationischem Amphiphil zu Co-Lipid ungefähr 1 : 1. Es liegt jedoch innerhalb der Praxis bzw. des Umfangs der vorliegenden Erfindung, dieses Verhältnis zu variieren (siehe Beispiel 3 unten) einschließlich auch über einen beträchtlichen Bereich hinweg.
  • Es wird im allgemeinen in der Technik angenommen, dass die Zubereitung kationischer Amphiphile als Komplexe mit Co-Lipiden (insbesondere neutralen Co-Lipiden) die Fähigkeit des Amphiphils steigert, Transfektionen zu erleichtern. Obwohl eine durch Co-Lipide gesteigerte Leistung für zahlreiche der erfindungsgemäßen Amphiphile beobachtet wurde sind die Amphiphile der Erfindung als Transfektionsmittel ohne Co-Lipide wirksam. Demgemäß soll der Umfang der vorliegenden Erfindung keineswegs als durch Theorien wie beispielsweise die Teilnahme des Co-Lipids am intrazellulären Abgabemechanismus beschränkt angesehen werden, noch die Einbeziehung eines Co-Lipids erfordern.
    • Transacylierungsreaktionen
  • Obwohl bisher in der Technik bzw. der Wissenschaft unerkannt, wurde ebenfalls festgestellt, dass bestimmte Co-Lipide chemisch mit bestimmten Typen kationischer Amphiphile unter den Bedingungen einer gemeinsamen Lagerung chemisch reagieren können, wodurch eine neue Molekülart die Folge ist. Es wird angenommen, dass die Erzeugung einer derartigen neuen Art über Mechanismen wie beispielsweise eine Transacylierung auftritt. In dieser Hinsicht siehe Fig. 4, die eine Transacylierungsreaktion beschreibt, die Spermincholesterincarbamat (Nr. 67) und DOPE einschließt, wodurch sich Lyso PE-Spezies und multiple Formen besonderer kationischer Acyl-Amphiphile ergeben (bezeichnet als Nr. 80).
  • Bezüglich derartiger Reaktionen sind die nachfolgenden Bemerkungen von Interesse. Bezüglich der Verwendung von Amphiphil Nr. 67 wurde beobachtet, dass ein Gemisch aus Amphiphil und DOPE in Chloroformlösungsmittel nicht an derartigen Reaktionen teilzunehmen scheint. Jedoch wird die Herstellung des Amphiphils und des Co-Lipids in einer wässrigen Lösung, in der sich Bilayer-enthaltende Strukturen wie beispielsweise Liposome bilden können, eine Transacylierung ermöglichen. Zusätzlich tritt eine Transacylierung ebenfalls auf, wenn Amphiphil und Co-Lipid zu einem dünnen Film getrocknet werden, wie beispielsweise aus Chloroform (wodurch die beiden Spezies in enge Berührung miteinander gebracht werden) was möglicherweise eine Folge von Entropiewirkungen ist. Es wird angenommen, dass diese Phänomene ebenfalls auf lyophilisierte Amphiphil/DOPE- Zubereitungen anwendbar sein könnten.
  • Es wird demgemäß stark bevorzugt, derartige Amphiphil/DOPE-Zubereitungen bei sehr kalten Temperaturen wie beispielsweise -70ºC zu halten. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die Zubereitung von Amphiphil Nr. 67 als ein Mono-, Di- oder Triacetatsalz Transacylierungen verlangsamt.
  • Es sollte klar sein, dass therapeutisch wirksame pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung derartige Transacylierungsnebenprodukte oder andere Nebenprodukte enthalten oder nicht enthalten können und dass das Vorhandensein derartiger Nebenprodukte die therapeutische Anwendung der Zusammensetzungen, die diese enthalten, nicht verhindert. Jede Anwendung derartiger Zusammensetzungen liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung und derartige Zusammensetzungen und die neuen Molekülarten hiervon werden deswegen speziell beansprucht.
    • Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und deren Verabreichung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die die intrazelluläre Abgabe therapeutisch wirksamer Mengen biologisch aktiver Moleküle erleichtern. Pharmazeutische Zusammensetzungen erleichtern den Eintritt von biologisch aktiven Molekülen in Gewebe und Organe wie beispielsweise die Magenschleimhaut, das Herz, die Lunge und feste bzw. solide Tumore. Zusätzlich erleichtern derartige Zusammensetzungen den Eintritt biologisch aktiver Moleküle in Zellen, die in vitro gehalten werden, wie beispielsweise in Gewebskultur. Die amphiphile Natur der Verbindungen der Erfindung ermöglicht es diesen, sich mit den Lipiden der Zellmembranen, anderen Zelloberflächenmolekülen und Gewebsoberflächen zu verbinden und mit diesen zu verschmelzen oder an diese zu binden. Eine Art einer Struktur, die durch Amphiphile gebildet werden kann, ist das Liposom, ein Vesikel, das zu einer mehr oder weniger kugelförmigen Bilayer bzw. Doppelschicht ausgebildet wird, die in biologischen Flüssigkeiten stabil ist und das biologische Moleküle, die für eine intrazelluläre Abgabe vorgesehen sind, einschließt. Durch Fusionieren mit Zellmembranen erlauben derartige liposomale Zusammensetzungen, dass biologisch aktive Moleküle damit mitgeführt bzw. getragen werden, um einen Zugang zum Inneren einer Zelle durch ein oder mehrere Prozesse zu gewinnen, die Endocytose und Pinocytose einschließen. Jedoch müssen die kationischen Amphiphile der Erfindung, anders als im Falle vieler Klassen von Amphiphilen oder anderen lipidartigen Molekülen, die zur Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen vorgeschlagen wurden, hoch organisierte Vesikel bilden, um wirksam zu sein und können tatsächlich (mit den biologisch aktiven Molekülen, an die sie binden) eine breite Vielzahl von locker organisierten Strukturen annehmen. Jede derartige Struktur kann in pharmazeutischen Zubereitungen der Erfindung vorhanden sein und kann zu deren Wirksamkeit beitragen.
  • Biologisch aktive Moleküle, die intrazellulär in therapeutischen Mengen vorgesehen sind, und die Amphiphile der vorliegenden Erfindung anwenden, schließen folgendes ein:
  • (a) Polynukleotide, wie beispielsweise DNA, cDNA und mRNA, die für therapeutisch brauchbare Proteine kodieren, die in der Technik bekannt sind,
  • (b) ribosomale RNA;
  • (c) Antisensepolynukleotide, egal ob RNA oder DNA, die zur Inaktivierung von Transkriptionsprodukten von Genen brauchbar sind und die beispielsweise als Therapien zur Regulierung des Wachstums maligner Zellen brauchbar sind; und
  • (d) Ribozyme.
  • Im allgemeinen und wegen der Möglichkeit eines Inhaltsverlustes aus diesen werden Vesikel oder andere Strukturen, die aus zahlreichen der kationischen Amphiphile gebildet werden, vom Fachmann nicht bevorzugt, um biologisch aktive Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht abzugeben. Obwohl es nicht eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist liegt es nichts desto trotz im Umfang der vorliegenden Erfindung, derartige Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht intrazellulär abzugeben. Repräsentative Typen von biologisch aktiven Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, die abgegeben werden können, schließen Hormone und Antibiotika ein.
  • Kationische Amphiphil-Spezies bzw. -Arten der Erfindung können so gemischt werden, dass zwei oder mehrere Arten hiervon in Kombination verwendet werden, so dass sie den Eintritt biologisch aktiver Moleküle in Zielzellen und/oder in deren subzelluläre Kompartimente erleichtern. Kationische Amphiphile der Erfindung können ebenfalls zu einer derartigen Anwendung mit Amphiphilen gemischt werden, wie sie in der Technik bekannt sind.
  • Dosierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung variieren, abhängig von solchen Faktoren wie beispielsweise der Halbwertszeit des biologisch aktiven Moleküls, der Wirkstärke des biologisch aktiven Moleküls, der Halbwertszeit des Amphiphils (der Amphiphile), irgendwelchen potentiellen Nebenwirkungen bzw. abträglichen Wirkungen des Amphiphils (der Amphiphile) oder von Abbauprodukten hiervon, dem Verabreichungsweg, dem Zustand des Patienten und dergleichen. Derartige Faktoren sind einer Bestimmung durch den Fachmann zugänglich.
  • Eine Vielzahl von Mitteln zur Verabreichung können verwendet werden, um eine hochgenaue Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung bereitzustellen. Derartige Zubereitungen können oral, parenteral, topisch, transmukosal oder durch Injektion einer Zubereitung in eine Körperhöhle des Patienten oder durch Verwendung einer Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, die ein biologisch abbaubares Material enthält oder durch an den Ort Transport unter Verwendung zusätzlicher Mizellen, Gels und Liposomen verabreicht werden. Vernebelungsvorrichtungen, Pulver-Inhaler und aerosolisierte Lösungen sind für Verfahren repräsentativ, die zur Verabreichung derartiger Zubereitungen an den Respirationstrakt verwendet werden können.
  • Zusätzlich können die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung im allgemeinen mit Trägerstoffen formuliert bzw. zubereitet werden (wie beispielsweise den Kohlenhydraten Lactose, Trehalose, Saccharose, Mannitol, Maltose oder Galactose) und können ebenfalls in Gegenwart derartiger Trägerstoffe gefriergetrocknet bzw. lyophilisiert (und dann rehydratisiert werden), bevor sie angewendet werden. Bedingungen einer optimierten Zubereitung für jedes Amphiphil der Erfindung sind der Bestimmung durch den Fachmann auf dem Gebiet der pharmazeutischen Wissenschaft zugänglich. Beispielsweise wurde für das Spermidincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 53) festgestellt, dass die Verwendung von Saccharose bezüglich derjenigen von Mannitol zu bevorzugen ist, um die Bildung von Amphiphil/DNA-Aggregaten zu vermeiden, insbesondere, wenn die Konzentration der DNA darin erhöht wird. Der Zusatz derartiger Trägerstoffe hält die Konsistenz der lyophilisierten pharmazeutischen Zusammensetzungen während der Lagerung aufrecht und vermeidet Schwierigkeiten wie beispielsweise Aggregation oder Unlöslichkeit, die wahrscheinlich nach Rehydratation aus dem lyophilisierten Zustand auftreten können.
  • Demgemäß schließt ein Hauptaspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer Zusammensetzung ein, die ein biologisch aktives Molekül (beispielsweise ein Polynukleotid) und ein oder mehrere kationische Amphiphile (einschließlich wahlweise einem oder mehreren Co-Lipiden) umfaßt und dann die Aufrechterhaltung der Zusammensetzung in Gegenwart von einem oder mehreren Trägerstoffen wie vorher erwähnt, wobei die sich ergebende Zusammensetzung in flüssiger oder fester (vorzugsweise lyophilisierter) Form vorliegt, so dass:
  • (1) die therapeutische Wirksamkeit der biologisch aktiven Moleküle im wesentlichen konserviert wird; (2) die Transfektions-erhöhende Natur des Amphiphils (oder eines Amphiphil/DNA-Komplexes) aufrecht erhalten wird. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass die Trägerstoffe die Interaktion (Komplexe) des Amphiphils und des biologisch aktiven Moleküls durch ein oder mehrere Effekte stabilisieren, die folgendes einschließen:
  • (1) Minimieren der Wechselwirkungen mit Behälteroberflächen,
  • (2) Vermeiden einer irreversiblen Aggregation der Komplexe, und
  • (3) Aufrechterhalten von Amphiphil/DNA-Komplexen in einem chemisch stabilen Zustand, d. h., Vermeiden einer Oxidation und/oder einer Hydrolyse.
  • Obwohl das Vorhandensein von Trägerstoffen in den pharmazeutischen Zubereitungen der Erfindung die Zusammensetzungen stabilisiert und die Aufbewahrung und Manipulation hiervon erleichtert wurde ebenfalls festgestellt, dass moderate Konzentrationen zahlreicher Trägerstoffe die Transfektions-steigernde Fähigkeit pharmazeutischer Zubereitungen, die diese enthalten, stören können. In dieser Hinsicht ist eine zusätzliche und wertvolle Eigenschaft der erfindungsgemäßen Amphiphile, dass jede derartige potentiell abträgliche Wirkung wegen der in hohem Maße gesteigerten in vivo Aktivität der Amphiphile der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit amphiphilen Verbindungen, die in der Technik bekannt sind, minimiert werden kann. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass osmotischer Streß (bei einer niedrigen Gesamtlösungskonzentration) positiv zur erfolgreichen Transfektion von Polynukleotiden von Zellen in vivo beitragen kann. Ein derartiger Streß kann auftreten, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung, die in ungepuffertem Wasser bereitgestellt wird, die Zielzellen berührt. Die Verwendung von ansonsten bevorzugten Zusammensetzungen kann deswegen mit den behandelnden Zielgeweben unverträglich sein, die bereits unter Streß stehen, wie beispielsweise geschädigtes Lungengewebe eines Patienten mit zystischer Fibrose. Demgemäß und unter Verwendung von Saccharose als Beispiel stellt die Auswahl von Konzentrationen dieses Trägerstoffs, die sich von ungefähr 15 mM bis ungefähr 200 mM bewegen, einen Kompromiß zwischen den Zielen bereit, (1) die pharmazeutische Zusammensetzung zur Lagerung zu stabilisieren und (2) jeden Effekt zu minimieren, den hohe Konzentrationen an gelösten Stoffen in der Zusammensetzung auf die Transfektionsleistung haben können.
  • Die Auswahl optimaler Konzentrationen spezieller Trägerstoffe für spezielle Zubereitungen ist Gegenstand von Experimenten, kann jedoch durch den Fachmann auf dem Gebiet für jede derartige Zubereitung bestimmt werden.
  • Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung betrifft die Protonierungsstelle der kationischen Amphiphile der Erfindung bevor sie die Plasmid-DNA berühren, um eine therapeutische Zusammensetzung zu bilden. Es liegt innerhalb der Anwendung der Erfindung, vollständig protonierte, teilweise protonierte und freie Basen-Formen der Amphiphile zu verwenden, um derartige therapeutische Zusammensetzungen zu bilden. Bezüglich des Amphiphils Nr. 67 (Spermincholesterincarbamat) wurde beobachtet, dass, wenn dieses Amphiphil für eine transfizierende Zusammensetzung mit DOPE (das selbst als ein Zwitterion bereitgestellt wird) vorgesehen ist die Transgenexpression für die freie Base am besten war, jedoch abnahm, wenn das Amphiphil als ein Acetatsalz zubereitet wurde. Die Aktivität nahm schrittweise durch die Mono- und Diacetatsalze ab und war für das Triacetatsalz minimal. Unter den beschriebenen Umständen wurde die zum in Berührung bringen mit dem Amphiphil bereitgestellte Plasmid-DNA (ohne Puffer) als ein Natriumsalz in Wasser präpariert bzw. hergestellt.
    • Syntheseverfahren
  • Die nachfolgenden Verfahren veranschaulichen die Herstellung bestimmter der kationischen Amphiphile der Erfindung. Der Fachmann auf dem Gebiet wird andere Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen erkennen um auch die anderen Verbindungen der Erfindung herzustellen.
    • Amphiphile der Gruppe I (A) N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat
  • Spermidincholesterincarbamat (Fig. 1, Nr. 53) wurde gemäß des nachfolgenden Verfahrens synthetisiert, das in Fig. 8 beschrieben ist.
    • Synthese von N¹,N&sup8;-DiCBZ-N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat
  • N¹,N&sup8;-Dicarbobenzoxyspermidin (61% Ausbeute, Schmelzpunkt 104-105ºC) wurde gemäß des Verfahrens von S. K. Sharma, M. J. Miller und S. M. Payne, J. Med. Chem., 1989, 32, 357-367 hergestellt. Das N¹,N&sup8;-Dicarbobenzoxyspermidin (25 g, 60,5 mmol) und Triethylamin (25 ml, 178 mmol) wurden in 625 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst, auf 0- 4ºC abgekühlt und unter N&sub2; gerührt. Cholesterinchloroformiat (27,2 g, 60,6 mmol) wurde in 250 ml Methylenchlorid gelöst und dem Reaktionsgemisch über eine Zeitspanne von 20 Minuten zugesetzt. Ein weißes Präzipitat bildet sich nach dem Zusatz. Nachdem der Zusatz abgeschlossen war wurde das Reaktionsgemisch bei 0-4ºC 10 Minuten und darauf bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden lang gerührt. Zu diesem Zeitpunkt war das weiße Präzipitat vollständig aufgelöst. Der Reaktion folgte TLC mit Hexan/Ethylacetat 6/4 als Elutionsmittel (Produkt Rf = 0,25). Diesem Reaktionsgemisch wurden 625 ml Methylenchlorid und 625 ml Wasser zugesetzt. Man lies die Schichten sich trennen. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um ein Öl zu ergeben. Eine Vakuumtrocknung wurde dann über Nacht durchgeführt. Dieses Rohprodukt wies eine klebstoffartige Konsistenz auf. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie (2 kg Silicagel, Elutionsmittel-Hexan/Ethylacetat 6/4) gereinigt, so dass sich 46,8 g des 3-β-[N&sup4;-(N¹,N&sup8;-Dicarbobenzoxyspermidin)carbamoyl]cholesterins (ebenfalls hierin als N¹,N&sup8;-diCBZ-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat beschrieben) in 93%iger Ausbeute ergaben.
    • Endsynthese des Spermidincholesterincarbamats
  • Zu 6,0 g 10% Palladium auf Aktivkohle unter N&sub2; wurde eine Lösung von 30 g 3-β-[N&sup4;- (N¹,N&sup8;-Dicarbobenzoxyspermidin)carbamoyl]cholesterin in 1 Liter Ethanol zugesetzt, siehe Fig. 13. Das Reaktionsgemisch wurde mit N&sub2; gespült und unter H&sub2; (atmosphärischem Druck) 18 Stunden lang gerührt. Dieses Gemisch wurde wiederum mit N&sub2; gespült und durch ein 10 g Bett aus Celite filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 2 Litern 10% Triethylamin in Ethanol gewaschen und die kombinierten Filtrate wurden im Vakuum konzentriert, um ein Gel zu ergeben. Das Produkt wurde dann unter Vakuum über Nacht zu einem klebrigen Feststoff getrocknet. Dieses Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie gereinigt (2 kg Silicagel, Elutionsmittel - 4 l Chloroform/Methanol 95/5 gefolgt von 30 l Chloroform/Methanol/Isopropylamin 95/5/5, Rf = 0,24), um 13,1 g des erwünschten Spermidincholesterincarbamats in 64%iger Ausbeute zu gewinnen. Eine HPLC- (C-18 Umkehrphasensäule, lineares Gradientenelutionsprofil - Methanol/Isopropanol/Wasser/Tri- fluoressigsäue 60/20/20/0,1 zu Methanol/Isopropanol/Trifluoressigsäure 70/30/0,1 zu Methanol/Isopropanol/Chloroform/Trifluoressigsäure 60/20/20/0,1) Analyse dieses Materials zeigte, dass es zu 99,2% rein war, wobei das 7-Dehydrocholesterinanalogon in einer Konzentration von 0,8% vorlag.
  • In Verbindung mit diesem Beispiel und denjenigen die folgen sei angemerkt, dass alle TLC-Platten mit Phospormolybdänsäure sichtbar gemacht wurden.
    • (B) N&sup4;-Spermincholesterincarbamat
  • Spermincholesterincarbamat (Fig. 1, Nr. 67) wurde gemäß des nachfolgenden Verfahrens hergestellt, das in Fig. 9 dargestellt ist.
    • N¹,N¹²-diCBZ-spermin
  • Benzylchloroformiat (1,76 g, 1,5 ml, 10,36 mmol) wurde in Methylenchlorid (5 ml) gelöst und in einem Dreihalskolben unter Stickstoffatmosphäre angeordnet. Imidazol (1,4 g, 20,6 mmol) wurde in Methylenchlorid (20 ml) gelöst und in einem zusätzlichen Trichter angeordnet. Der Dreihalskolben wurde auf 0ºC abgekühlt und die Imidazollösung wurde schrittweise über 20 Minuten hinweg zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt und darauf wurden Methylenchlorid (25 ml) und Citronensäure (10%, 25 ml) zugesetzt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Fraktion wurde mit Citronensäure (10%, 25 ml) gewaschen. Der organische Bestandteil wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde unter Hochvakuum eine Stunde bei Umgebungstemperatur getrocknet.
  • Dem Rest wurde Dimethylaminopyridin (35 mg), Methylenchlorid (25 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt und zwar unter einer Stickstoffatmosphäre. Einem zusätzlichen Trichter wurde eine Lösung von Spermin (1 g, 4,94 mmol) in Methylenchlorid (25 ml) zugesetzt. Die Sperminlösung wurde schrittweise über 15 Minuten hinweg zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt und darauf im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde in Ethylacetat (80 ml) gelöst und drei Mal mit Wasser (15 ml) gewaschen. Die organischen Bestandteile wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, um einen rohen weißen Feststoff zu ergeben. Das Material wurde durch Flash-Chromatografie (65 g Silicagel, 100 : 100 : 10 CHCl&sub3; : MeOH : NH&sub4;OH, Produkt Rf = 0,33) gereinigt, so dass sich nach Trocknen unter Hochvakuum 1,01 g (2,146 mmol, 43% Ausbeute) des Produktes ergaben.
    • N¹,N¹²-diCBZ-N&sup4;-Spermincholesterincarbamat
  • Cholesterinchloroformiat (964 mg, 2,15 mmol) wurde in Chloroform (10 ml) gelöst und tropfenweise einer gekühlten (0ºC) Lösung von N¹,N¹²-diCBZ-N&sup4;-Spermin (1,01 g, 2,15 mmol), Triethylamin (1 ml) in Chloroform (10 ml) zugesetzt. Man ließ die Reaktion auf Umgebungstemperatur aufwärmen und rührte diese für 2 Stunden. Der Reaktions- bzw. Umsetzungs-Lösung wurde Wasser (25 ml) und Chloroform (25 ml) zugesetzt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Fraktion über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, um ein Rohmaterial zu ergeben, das durch Flash-Chromatografie gereinigt wurde (68 g Silicagel, MeOH/CHCl&sub3; 1/4, Produkt Rf = 0,36), so dass sich 1,23 g (1,39 mmol, 65% Ausbeute) des Produktes ergaben.
    • Endsynthese von N&sup4;-Spermincholesterincarbamat
  • N¹,N¹²-diCBZ-N&sup4;-Spermincholesterincarbamat (262 mg, 0,300 mmol) wurden in 5 ml Essigsäure gelöst und 45 mg 10% Pd auf C wurde zugesetzt. Die Lösung wurde mit Stickstoff gespült und unter Wasserstoff bei atmosphärischem Druck gerührt. Die Hydrogenolyse ließ man 7 Stunden lang fortschreiten. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Katalysator mit 40 ml Ethylacetat/Essigsäure 9/1 gewaschen und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben. Das Rohprodukt wurde in 35 ml 1 N NaOH gelöst und drei Mal mit 40 ml Chloroform/Methanol 9/1 extrahiert. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit 20 ml Wasser gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Lösung wurde filtriert, im Vakuum konzentriert und unter Vakuum getrocknet, so dass sich 125 mg des erwünschten Produktes in einer 67%igen Ausbeute ergaben.
  • In Verbindung mit dem obigen Verfahren sei angemerkt, dass die Hydrogenolyse unter sauren Bedingungen durchgeführt werden sollte, um die Vergiftung des Katalysators zu minimieren.
  • Urea- bzw. Harnstoffanaloge, wie beispielsweise Spermin oder Spermidincholestaminharnstoff - können durch eine Reaktionsfolge hergestellt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der organischen Synthese wohl bekannt sind. Beispielsweise kann ein Amin mit einer gleichen molaren Menge an Carbonyldiimidazol gefolgt vom Zusatz eines zweiten Amins behandelt werden, um den erwünschten Harnstoff zu ergeben.
    • (C) N,N Bis (3-Aminopropyl)-O-cholesterin-3-carbarnat
  • N,N Bis (3-Aminopropyl)-O-cholesterin-3-carbamat (Fig. 1, Nr. 69) wurde gemäß des nachfolgenden Verfahrens hergestellt.
  • Bis(3-CBZ aminopropyl)amin wurde unter Verwendung des oben für N¹,N¹²-diCBZspermin beschriebenen Verfahrens hergestellt, außer dass N-(3-aminopropyl)1,3- propandiamin für Spermin als Reaktionspartner eingesetzt wurde. Das reine Produkt wurde in 34%igen Ausbeute durch Silicagel Flash-Chromatografie unter Verwendung von CHCl&sub3;/MeOH/NH&sub4;OH 80/20/0,5 als Lösungsmittel isoliert.
  • Das Bis(3-CBZ aminopropyl)amin, das so hergestellt wurde, wurde darauf mit Cholesterinchloroformiat gemäß des oben für die Synthese von N¹,N&sup8;-DiCBZ-N&sup4;- spermidincholesterincarbamat beschriebenen Verfahrens umgesetzt. Das reine Produkt (N,N Bis(3-CBZ aminopropyl)-O-cholesterin-3-carbamat) wurde in 73%iger Ausbeute gewonnen.
  • Die Synthese von N,N Bis(3-aminopropyl)-O-cholesterin-3-carbamat wurde durch Hydrogenolyse der CBZ-Gruppen von N,N Bis(3-CBZ aminopropyl)-O-cholesterin-3-carbamat) im Anschluß an das oben in Bezug auf die Synthese von N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat beschriebene Verfahren abgeschlossen. Das Produkt wurde in 23%iger Ausbeute ohne Silicagel-Chromatografiereinigung gewonnen.
    • (D) N,N Bis(6-Aminohexyl)-O-cholesterin-3-carbamat
  • N,N Bis(6-Aminohexyl)-O-cholesterin-3-carbamat (Fig. 1, Nr. 70) wurde gemäß des nachfolgenden Verfahrens hergestellt.
  • Zunächst wurde Bis(6-CBZ aminohexyl)amin unter Verwendung des oben für N¹,N¹²- diCBZ-Spermin beschriebenen Verfahrens hergestellt, außer dass Spermin durch Bis(hexamethylen)triamin als Reaktionspartner ersetzt wurde. Das reine Produkt wurde in 24%iger Ausbeute durch Umkristallisieren aus Toluol isoliert.
  • Bis(6-CBZ aminohexyl)amin wurde dann mit Cholesterinchloroformiat gemäß des oben für die Synthese von N¹,N&sup8;-DiCBZ-N&sup4;-spermidincholesterylcarbamat beschriebenen Verfahrens umgesetzt. Das Produkt (N,N Bis(6-CBZ aminohexyl)-O-cholesterin-3-carbamat) wurde in 40%iger Ausbeute durch Silicagel-Flash-Chromatografie unter Verwendung von Hexanen/Ethylacetat 7/3 isoliert.
    • (E) Lysin 3-N-Dihydrocholesterincarbamat
  • Lysin 3-N-Dihydrocholesterincarbamat (Fig. 1, Tafel C) wurde gemäß des nachfolgenden Verfahrens hergestellt.
  • Eine Lösung von Dihydrocholesterin (5,0 g, 12,9 mmol, Aldrich), Phthalimid (2,0 g, 13,6 mmol, Aldrich), und Triphenylphosphin (3,8 g, 13,6 mmol, Aldrich) in THF (20 ml, Aldrich) gerührt bei 0ºC unter einer Stickstoffatmosphäre wurden tropfenweise Diethylazodicarboxylat (2,3 ml, 14,5 mmol, Aldrich) zugesetzt. Nach Abschluß des Zusatzes ließ man das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur erwärmen und es wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum bis auf einen Rest konzentriert. Dieser Rest bzw. Rückstand wurde in 50 ml Hexan/Ethylacetat 95/5 gelöst und es bildete sich ein Präzipitat. Das Gemisch wurde filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockne im Vakuum konzentriert, in 25 ml Hexan/Ethylacetat 95/5 gelöst und auf 200 g Silicagel (Elutionsmittel 21 Hexan/Ethylacetat 95/5, darauf 1 l Hexan/Ethylacetat 90/10) chromatografiert. Eine 76%ige Ausbeute des erwünschten 3-Phthalimidocholestans (5,43 g) wurde gewonnen.
  • Das 3-Phthalimidocholestan (5,40 g, 9,75 mmol) wurde in 60 ml Methanol gelöst und wasserfreies Hydrazin (3,1 ml, 9,9 mmol) wurde zugesetzt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde gerührt und unter Rückflußkühlung unter einer Stickstoffatmosphäre 4 Stunden lang erhitzt. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, 3,1 ml konzentrierte HCl wurden zugesetzt und das sich ergebende Gemisch bei Rückflußkühlung über Nacht erhitzt. Nach Abkühlen auf Umgebungstemperatur wurden 100 ml Diethylether und 50 ml 1N NaOH zugesetzt (End-pH von 10,1) und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit 50 ml Diethylether extrahiert und die vereinigten organischen Fraktionen wurden filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde durch Silicagel-Chromatografie (ChloroformfMethanol 90/10) gereinigt, um 2,24 g 3-Aminocholestan in 59%iger Ausbeute zu ergeben.
  • L-Nα,Nε-diBOC lysin Nhydroxysuccinimidester (286 mg, 0,644 mmol, Sigma) und 3- Aminocholestan (250 mg, 0,644 mmol) wurden in 5 ml Methylenchlorid gelöst, 0,1 ml Triethylamin wurden zugesetzt und die sich ergebende Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Dem Reaktionsgemisch wurden 10 ml Wasser und 25 ml Methylenchlorid zugesetzt und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde mit 25 ml Methylenchlorid extrahiert und die kombinierten organischen Fraktionen wurden über MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand wurde durch Chromatografie auf 25 g Silicagel gereinigt (Elutionsmittel-Hexan/Ethylacetat 6/4, Probe aufgebracht in Hexan/Ethylacetat 9/1). Das gereinigte Material wurde in 25 ml Chloroform gelöst und HCl- Gas wurde durch die Lösung 2 Stunden lang perlen gelassen, gefolgt von Stickstoff für 10 Minuten. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, um 299 mg des erwünschten Produkts in 79%iger Ausbeute als das Dihydrochloridsalz zu ergeben.
    • (F) N¹,N&sup8;-Bis(3-Aminopropyl)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat
  • N¹,N&sup8;-Bis(3-Aminopropyl)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat (Fig. 1, Nr. 75) wurde gemäß des nachfolgenden Verfahrens hergestellt.
  • N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat (1,14 g, 2,04 mmol) wurden in MeOH (5 ml) gelöst. Frisch destilliertes Acrylonitril (0,28 ml, 4,29 mmol) wurde zugesetzt und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum konzentriert, um ein Öl zu ergeben. Eine Vakuumtrocknung wurde dann über Nacht durchgeführt. Das Rohprodukt wurde Säulenchromatografie (125 g Silicagel, Elutionsmittel - CHCl&sub3; MeOH 1/9) gereinigt, um 1,15 g (85%) des N¹,N&sup8;-Bis(cyanoethyl)N&sup4;- spermidincholesterincarbamats zu ergeben.
  • Eine Raney Nickel 50% Aufschlemmung (1,2 g, Aldrich) wurde in einer Parr-Bombe mit 1 M NaOH in 95% EtOH (50 ml) angeordnet. Das N¹,N&sup8;-Bis(cyanoethyl)N&sup4;- Spermidincholesterincarbamat wurde in EtOH (35 ml) gelöst und der Bombe zugesetzt. Das Vesikel wurde evakuiert und drei Mal unter Argon angeordnet, Druck (80-100 psi) und dann evakuiert und drei Mal unter Wasserstoffdruck (100 psi) angeordnet. Das Reaktionsgemisch wurde unter Wasserstoffdruck (100 psi) bei Raumtemperatur 72 Stunden lang gerührt. Das Vesikel wurde evakuiert und unter Argondruck angeordnet. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Das sich ergebende Öl wurde in 2 : 1 CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH (100 ml) gelöst und mit H&sub2;O (35 und 25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtiert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand durch Chromatografie auf 100 g Silicagel gereinigt (Elutionsmittel - CHCl&sub3;/MeOH/konzentriertes NH&sub4;OH 40/25/10, Probe aufgebracht in CHCl&sub3;/MeOH 40/25). Das gereinigte Material wurde im Vakuum mit iPrOH (3 · 50 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (3 · 50 ml) konzentriert und dann vakuumgetrocknet, so dass sich 986 mg (85%) N¹,N&sup8;-Bis(3-aminopropyl)-N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat ergaben.
    • (G) N(N&sup4;-3-Aminopropylspermidin)cholesterincarbamat
  • N(N&sup4;-3-Aminopropylspermidin)cholesterincarbamat (Fig. 1, Nr. 78) wurde wie folgt hergestellt.
  • N¹,N&sup8;-Dicarbobenzoxyspermidin (1,0 g, 2,4 mmol) wurde in MeOH gelöst (10 ml). Frisch destilliertes Acrylonitril (0,3 ml, 4,5 mmol) wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum konzentriert, um ein Öl zu ergeben. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie (100 g Silicagel, Elutionsmittel - CHCl&sub3;/MeOH 1/19) gereinigt, um 1,10 g (97%) von N&sup4;-2- Cyanoethyl-N¹,N&sup8;-dicarbobenzoxyspermidin zu ergeben.
  • Das N&sup4;-2-Cyanoethyl-N¹,N&sup8;-dicarbobenzoxyspermidin (0,5 g, 1,7 mmol) wurde in MeOH (5 ml) gelöst und CoCl&sub2; (280 mg, 2,15 mmol, Aldrich) wurden zugesetzt. Die blaue Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt und NaBH&sub4; (405 mg, 10,7 mmol, Aldrich) wurde in Portionen über 15 Minuten hinweg zugesetzt. Die sich ergebende schwarze Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt. Die schwarze Lösung wurde über diese Zeitspanne hinweg blau. Dem Reaktionsgemisch wurden CHCl&sub2;/MeOH 2/1 (30 ml) zugesetzt. Es bildete sich ein schwarzes Präzipitat. Diesem wurde H&sub2;O (20 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde filtriert. Die sich ergebenden Schichten wurden getrennt und die organische Schicht mit MgSO&sub4; getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum konzentriert, so dass sich ein Öl ergab. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie (50 g Silicagel, Elutionsmittel - CHCl&sub3;/MeOH/konzentriertes NH&sub4;OH 100/100/5) gereinigt, um 309 mg (62%) des N&sup4;-3-Aminopropyl-N¹,N&sup8;- dicarbobenzoxyspermidin zu ergeben.
  • Dem in CH&sub2;Cl&sub2; gelösten N&sup4;-3-Aminopropyl-N¹,N&sup8;-dicarbobenzoxyspermidin (300 mg, 0,66 mmol) wurde Et&sub3;N unter N&sub2; zugesetzt. Cholesterinchloroformiat (326 mg, 0,726 mmol, Aldrich) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und der Reaktion tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zusatz von CH&sub2;Cl&sub2; (25 ml) und H&sub2;O (10 ml), wurden die Schichten getrennt. Die organische Schicht wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, so dass sich 640 mg Rohprodukt ergab. Der Rest wurde durch Chromatografie auf 80 g Silicagel (Elutionsmittel - CHCl&sub3;/MeOH 90/10, Probe aufgebracht in CHCl&sub3;/MeOH 90/10) gereinigt. Das gereinigte Material wurde im Vakuum konzentriert und dann vakuumgetrocknet, so dass sich 329 mg (57%) N(N&sup4;-3-Aminopropyl-N¹,N&sup8;-dicarbobenzoxyspermidin) cholesterincarbamat ergaben.
  • Zu 10% Pd auf Kohlenstoff (65 mg, Aldrich) wurde eine Lösung von N-(N&sup4;-3- Aminopropyl-N¹,N&sup8;-dicarbobenoxyspermidin)cholesterincarbamat (300 mg) in Essigsäure (25 ml) zugesetzt. Die Reaktion wurde unter H&sub2; angeordnet und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Anordnung unter N&sub2; wurde das Reaktionsgemisch filtriert. Der Katalysator wurde mit 10% Essigsäure in EtOAc (50 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, so dass sich ein Öl ergab. Das Öl wurde in 2/1 CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (35 ml) gelöst und mit 1 M NaOH (15 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und vakuumgetrocknet, um 196 mg (93%) N-(N&sup4;-3-Aminopropylspermidin)cholesterincarbamat zu ergeben.
    • (H) N-[N¹,N&sup4;,N&sup8;-Tris(-3-Aminopropyl)spermidin]cholesterincarbamat
  • N-[N¹,N&sup4;,N&sup8;-Tris(-3-Aminopropyl)spermidin]cholesterincarbamat (Fig. 1, Nr. 96) wurde durch Umsetzen von N-(N&sup4;-Aminopropylspermidin)cholesterincarbamat mit Acrylonitril (90% Ausbeute) und anschließender Reduktion des Di-Adduktes mit Raney Nickel (75% Ausbeute) wie für die Herstellung von N¹,N&sup8;Bis(3-aminopropyl)-N&sup4;- spermidincholesterincarbamat beschrieben, hergestellt.
    • (I) N,N-Bis(4-aminobutyl)cholesterincarbamat
  • N,N-Bis(4-aminobutyl)cholesterincarbamat (Fig. 1, Nr. 82) wurde wie folgt hergestellt.
  • Einem Gemisch von Benzylamin (2,0 g, 18,6 mmol, Aldrich), Na&sub2;CO&sub3; (4,4 g, 42 mmol) und KI (1,4 g, 9,5 mmol) in n-Butanol (50 ml) wurden 4-Chlorbutyronitril (4,0 ml, 95 mmol) unter Stickstoff zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückflußkühlung 4ß Stunden lang unter Stickstoff gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Diethylether (50 ml) zugesetzt und das Präzipitat abfiltriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Toluol (100 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde im Vakuum konzentriert. Chloroform (100 ml) wurde zugesetzt und wiederum wurde die Lösung im Vakuum konzentriert und dann für 18 Stunden vakuumgetrocknet. Das sich ergebende Öl wurde in Chloroform (100 ml) gelöst, filtriert und im Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie gereinigt (250 g Silicagel, Elutionsmittel - Hexane/EtOAc 60/40), so dass sich 3,75 g (97%) N,N-Bis(3-cyanopropyl)benzylamin ergaben.
  • Das N,N-Bis(3-cyanopropyl)benzylamin (3,7 g, 17,8 mmol) wurde in EtOH (150 ml) gelöst und Essigsäure (4 ml) wurde zugesetzt. Diese Lösung wurde zu 10% Pd auf Kohlenstoff (400 mg) unter N&sub2; zugesetzt. Das Gemisch wurde unter H&sub2; angeordnet und das Reaktionsgemisch 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter N&sub2; angeordnet. Der Katalysator wurde abfiltriert und mit EtOH gewaschen (150 ml). Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, Chloroform (50 ml) wurde zugesetzt und wiederum im Vakuum konzentriert. Das sich ergebende Öl wurde für 0,5 Stunden vakuumgetrocknet und direkt in der nächsten Reaktion verwendet. Zu diesem, in CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) gelösten Öl wurde Et&sub3;N (5 ml, 35 mmol) unter N&sub2; zugesetzt und die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt. Cholesterinchloroformiat (6,2 g, 13,87 mmol) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) gelöst und diese Lösung wurde der Reaktion tropfenweise über 10 Minuten hinweg zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 18 Stunden unter N&sub2; gerührt. CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) und H&sub2;O (100 ml) wurden zugesetzt und die sich ergebenden Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und für 1 Stunde lang vakuumgetrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie gereinigt (600 g Silicagel, Elutionsmittel- Hexane/EtOAc 60/40), so dass sich 1,05 g (10%) N,N- Bis(3-cyanopropyl)cholesterincarbamat ergaben.
  • Eine Aufschlemmung von 50% Raney Nickel (1,2 g) wurde in einer Parr-Bombe mit 1 M NaOH in 95% EtOH (50 ml) angeordnet. Das N,N-Bis(3-cyanopropyl)cholesterincarbamat (1,0 g, 1,77 mmol) wurde in EtOH (100 ml) gelöst und der Bombe zugesetzt. Das Vesikel wurde evakuiert und unter Argondruck (80-100 psi) angeordnet und zwar 3 Mal und dann evakuiert und unter Wasserstoffdruck (100 psi) 3 Mal angeordnet. Das Reaktionsgemisch wurde unter Wasserstoffdruck (100 psi) 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Vesikel wurde evakuiert und unter Argondruck angeordnet. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Das sich ergebende Öl wurde in 2 : 1 CH&sub2;Cl&sub2; : MeOH (250 ml) gelöst und zwei Mal mit H&sub2;O (75 und 50 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der Rest wurde durch Chromatografie auf 110 g Silicagel (Elutionsmittel - CHCl&sub3;/MeOH/iPrNH&sub2; 95/5/5, Probe aufgebracht in CHCl&sub3;/MeOH 95/5) gereinigt. Das gereinigte Material wurde im Vakuum konzentriert und dann vakuumgetrocknet, so dass sich 900 mg (85%) N,N-Bis(4-aminobutyl)cholesterincarbamat ergaben.
    • (J) N,N-Bis(N'-3-aminoproyyl-4-aminobutyl)cholesterincarbamat
  • N,N-Bis(N'-3-aminopropyl-4-aminobutyl)cholesterincarbamat (Fig. 1, Nr. 83) wurde durch Umsetzen von N,N-Bis(4-aminobutyl)cholesterincarbamat mit Acrylonitril (82% Ausbeute) und anschließender Reduktion des Di-Acrylonitriladductes mit Raney Nickel (81% Ausbeute) wie Ihr die Herstellung von N¹,N&sup8;-Bis(3-aminopropyl)-N&sup4;- spermidincholesterincarbamat beschrieben, hergestellt.
    • (K) N&sup4;-Spermidincholesterincarboxamid
  • N&sup4;-Spermidincholesterincarboxamid (Fig. 1, Nr. 90) wurde wie folgt hergestellt.
  • Eine Lösung von Cholesterinchlorid (5,0 g, 12,3 mmol) in THF (50 ml) wurde über 0,5 Stunden hinweg tropfenweise unter Rückflußkühlung Magnesiumspänen (390 mg) in THF (25 ml) zugesetzt. Zu Beginn wurde eine Prise Jod und 3 Tropfen Methyliodid zum Start der Reaktion zugesetzt. Nach Rückflußkühlung für 3 Stunden wurde die Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt. Dieses Gemisch wurde auf Trockeneis (10 g) gegossen und dann für eine Stunde gerührt. Diese Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt und eiskalter 1 M H&sub2;SO&sub4; (100 ml) zugesetzt. Nach Rühren für 5 Minuten wurde Natriumchlorid (1 g) und Diethylether (100 ml) zugesetzt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Diethylether (100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit einer Lösung von Natriumthiosulfatpentahydrat (120 mg) in H&sub2;O (30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde im Vakuum konzentriert und für 18 Stunden vakuumgetrocknet. Der rohe Feststoff wurde mit Hexanen (25 ml) titriert. Nach Filtration wurde der Feststoff mit eiskalten Hexanen (10 ml) gewaschen. Der Feststoff wurde für 1 Stunde vakuumgetrocknet. Die Cholesterincarbonsäure, die gewonnen wurde (3,0 g, 59%) war ca. 90% rein und wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
  • Cholesterincarbonsäure (500 mg, 1,2 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (140 mg, 1,2 mmol) wurden in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Dieser Lösung wurde Dicyclohexylcarbodümid (2,75 mg, 1,32 mmol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch unter N&sub2; 2 Stunden lang gerührt. N¹,N&sup8;- Dicarbobenzoxyspermidin (474 mg, 1,2 mmol) und Et&sub3;N (1,0 ml, 7,1 mmol) wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch unter N&sub2; 72 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde filtriert und das Präzipitat wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde mit H&sub2;O (25 ml) gewaschen. Die getrennte organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der Rest wurde durch Chromatografie auf 150 g Silicagel (Elutionsmittel - Hexan/EtOAc 1/1) gereinigt. Das gereinigte Material wurde im Vakuum konzentriert und darauf vakuumgetrocknet, so dass sich 680 mg (70%) N¹,N&sup8;-Dicarbobenzoxy-N&sup4;-spermidincholesterincarboxamid ergaben.
  • Die Carbobenzoxy-Gruppe wurde von N¹,N&sup8;-Dicarbobenzoxy-N&sup4;-spermidincholesterincarboxamid wie in der Herstellung von N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat beschrieben entfernt. Das gereinigte Produkt, nämlich N&sup4;-Spermidincholesterincarboxamid, wurde in 53%iger Ausbeute gewonnen.
    • Amphiphile der Gruppe II (A) N¹,N&sup8;-Bis(arginincarboxamid)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat
  • N¹,N&sup8;-Bis(arginincarboxamid)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat (Fig. 5, Nr. 95) wurde wie folgt hergestellt.
  • Zu N(a),N(e),N(e)(alpha, epsilon, epsilon)-tricarbobenzoxyarginin in CH&sub2;Cl&sub2; (25 ml) wurden N-Hydroxysuccinimid (100 mg, 0,89 mmol) und Dicyclohexylcarbodümid (240 mg, 0,89 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter N&sub2; bei Raumtemperatur 2,5 Stunden lang gerührt. N&sup4;-Spermidincholesterincarbamat (250 mg, 0,448 mmol) und Et&sub3;N (0,25 ml, 1,8 mmol) wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur unter N&sub2; 72 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Präzipitat mit CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde mit H&sub2;O (20 ml) gewaschen. Die getrennte organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und der Rest wurde durch Chromatografie auf 70 g Silicagel (Elutionsmittel - CHCl&sub3;/MeOH 95/5) gereinigt. Das gereinigte Material wurde im Vakuum konzentriert und darauf vakuumgetrocknet, so dass sich 533 mg (71%) N(a),N(e),N(e)tricarbobenzoxyarginincarboxamid)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat ergaben.
  • Die Carbobenzoxy-Gruppe wurde von N¹,N&sup8;-Bis(N(a),N(e),N(e)(tricarboenzoxyarginincarboxamid)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat wie bei der Herstellung von N-(N&sup4;-3- Aminopropylspermidin)cholesterincarbamat beschrieben entfernt. Das Produkt, nämlich Bis(Arginincarboxamid)-N&sup4;-spermidincholesterincarbamat wurde in 27%iger Ausbeute gewonnen.
    • Amphiphile der Gruppe III (A) N,N-Dioctadecyllysinamid
  • N,N-Dioctadecyllysinamid (Fig. 6, Nr. 73) wurde gemäß des nachfolgenden Verfahrens hergestellt.
  • N,N-Dioctadecylamin (1,35 g, 2,58 mmol, Fluka) und L-Nα,Nε-diBOC lysin N- hydroxysuccinimidester (1,00 g, 2,58 mmol, Sigma) wurden in 15 ml Methylenchlorid vereinigt und 2 ml Triethylamin wurden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde kurz erhitzt, um eine vollständige Auflösung zu bewirken und wurde dann bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Wasser (20 ml) und Methylenchlorid (50 ml) wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Fraktion wurde ein zweites Mal mit 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde durch Säulenchromatografie (150 g Silicagel, Elutionsmittel-Hexan/Ethylacetat 8/2) gereinigt. Das gereinigte Material N,N-Dioctadecyl-Nα,Nε-DiBOC lysinamid (1,59 g) wurde in 25 ml Chloroform gelöst und 2 Stunden lang gerührt, während HCl-Gas durch die Lösung perlen gelassen wurde. Diese Lösung würde mit N&sub2;-Gas durchspült und im Vakuum konzentriert. N,N-Dioctadecyllysinamid (1,34 g) wurde in einer 68%igen Ausbeute als das diHCl-Salz gewonnen.
    • (B) N¹,N¹-Dioctadecyl-1,2,6-triaminohexan
  • N¹,N¹-Dioctadecyl-1,2,6-triaminohexan (Fig. 6, Nr. 47) wurde wie folgt zubereitet.
  • N,N-Dioctadecyl-Nα,Nε-DiBOC lysinamid (760 mg, 0,823 mmol) in 30 ml wasserfreiem THF, gerührt bei Umgebungstemperatur, wurde LiAlH&sub4; (185 mg, 4,87 mmol) in Portionen zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Reaktion bzw. Umsetzung wurde durch tropfenweisen Zusatz von 2 ml Wasser abgeschreckt bzw. gelöscht und die sich ergebende Lösung wurde im Vakuum konzentriert. Diesem Rest wurde in dieser Reihenfolge 10 ml 1 M HCl, 50 ml Methylenchlorid und 10 ml 1 M NaOH (End-pH 10) zugesetzt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Fraktion wurde ein zweites Mal mit 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über MgSO&sub4; getrocknet und filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 50 ml Methylenchlorid gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden im Vakuum konzentriert, um 700 mg Rohprodukt zu ergeben. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatografie (80 g Silicagel, Elutionsmittel - Hexan/Ethylacetat 7/3) gereinigt. Die Fraktionen, die das gereinigte Produkt enthielten wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, um 490 mg des Produktes zu gewinnen, das als das diBOC-Derivat geschützt war. Zu 200 mg dieses diBOC-Derivates wurden 4 ml Chloroform und 1 ml TFA zugesetzt. Das sich ergebende Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 2 Stunden gerührt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in 25 ml und 25 ml Methylenchlorid gelöst und der pH auf pH 10 mit ungefähr 2 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde ein zweites Mal mit 25 ml Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden kombiniert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der sich ergebende Rückstand wurde in 10 ml Diethylether gelöst, HCl-Gas wurde durch die Lösung 2 Minuten lang hindurch perlen gelassen und die Lösung wurde bei 4ºC über Nacht gekühlt. Das ausgefallene Produkt wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem (4ºC) Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet, so dass sich 160 mg des erwünschten Produktes in 67%iger Ausbeute ergaben.
    • Amphiphile der Gruppe IV (A) 1-(N&sup4;-Spermin)-2,3-dilaurylglycerolcarbamat
  • 1-(N&sup4;-Spermin)-2,3-dilaurylglycerolcarbamat (Fig. 7, Nr. 89) wurde wie folgt hergestellt.
  • Eine Lösung von 3-Benzyloxy-1,2-Propandiol (1,00 g, 5,49 mmol) in THF (20 ml) wurde einer Suspension von Natriumhydrid (60% G/G in Öl, 550 mg, 13,725 mmol) in THF (30 ml) zugesetzt und man ermöglichte über Nacht unter wasserfreiem Stickstoff eine Rückflußkühlung. Eine Lösung von Dodecylmethansulfonat (3,39 g, 12,078 mmol) in THF (20 ml) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde für weitere 2 Tage unter Rückflußkühlung erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktion durch ein Bett aus Celite unter Spülen mit THF filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zu einem gelben Ölreduziert, das in Diethylether (100 ml) erneut gelöst wurde. Die Etherlösung wurde mit 0,1 N NaOH (30 ml) und dH2O (2 · 30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem rotbraunen Öl reduziert. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Säulenchromatografie (300 g Silicagel) gereinigt unter Elution mit 3% Ethylacetat/Hexanen. Das erwünschte Produkt wurde als ein blaßgelbes Öl isoliert und durch ¹H NMR als 3-Obn-1,2-dilaurylglycerol (1,70 g, 60%) charakterisiert. 3-Obn-1,2-dilaurylglycerol (1,70 g, 3,28 mmol) in Ethanol (100 ml) wurden mit 10% Pd/C (250 mg, 15 Gew.-%) unter einer Wasserstoffatmosphäre 24 Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Stickstoff gespült und durch Unterspülen mit Ethanol zur Entfernung des Katalysators durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Feststoff einreduziert. Das Rohmaterial wurde durch Flash- Säulenchromatografie (140 g Silicagel) unter Elution mit 10% Ethylacetat/Hexanen gereinigt. Das erwünschte Produkt wurde als weißer Feststoff isoliert und durch ¹H NMR als 1,2-dilaurylglycerol (1,23 g, 88%) charakterisiert.
  • Eine 1,93 M Lösung von Phosphen in Toluol (0,77 ml, 1,49 mmol) wurde einer Lösung von 1,2-Dilaurylglycerol (580 mg, 1,35 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,26 ml, 1,49 mmol) in Methylenchlorid (10 ml) zugesetzt und über Nacht gerührt. Eine Lösung von N¹,N²-di-CBz-spermin·2HCl (734 mg, 1,35 mmol) in 60 : 25 : 4 Chloroform/Methanol/Wasser (80 ml) wurde zugesetzt. Nach 3 Stunden wurde ein weiteres Äquivalent N,N-Diisopropylethylamin (0,26 ml, 1,49 mmol) zugesetzt. Zusätzliche 0,5 Äquivalente N,N-Diisopropylethylamin (0,13 ml, 0,75 mmol) wurden drei Stunden später zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Stickstoff bei Umgebungstemperatur rühren gelassen. Die Reaktion wurde mit 1 M NaOH (20 ml) und dH2O (15 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zu einem weißen Feststoff einreduziert. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Säulenchromatografie (125 g Silicagel) gereinigt, unter Elution mit 90 : 10 : 0,5 Chloroform/Methanol/Ammoniumhydroxid. Das erwünschte Produkt wurde als ein Öl isoliert und durch ¹H NMR als 1-(N&sup4;-(N¹,N¹²-di-CBz-spermin))-2,3- dilaurylglycerolcarbamat (188 mg, 15%) charakterisiert.
  • Das 1-(N&sup4;-(N¹,N¹²-di-CBz-spermin))-2,3-dilaurylglycerolcarbamat (188 mg, 0,203 mmol) wurde in Eisessig (10 ml) gelöst und mit 10% Pd/C (45 mg, 24 Gew.-%) unter einer Wasserstoffatmosphäre 5 Stunden lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Vakuumfiltration unter Spülen mit 10% Essigsäure/Ethylacetat (10 ml) entfernt. Das Filtrat wurde zu einem Öl durch Rotationsverdampfung einreduziert. Das sich ergebende Öl wurde in 10% Methanol/Chloroform (85 ml) gelöst und wurde mit 1 M NaOH (15 ml) und dH2O (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und in Vakuum zu einem Öl reduziert. Das Produkt wurde durch ¹H NMR als 1- (N&sup4;-spermin))-2,3-dilaurylglycerolcarbamat (125 mg, 94%) charakterisiert.
  • Weitere Amphiphile der Erfindung können gemäß der Verfahren hergestellt werden, die innerhalb des Wissens des Fachmanns liegen.
    • Beispiele
  • Die nachfolgenden Beispiele sind für die Anwendung der vorliegenden Erfindung repräsentativ.
    • Beispiel 1 - Zelltransfektionsassay
  • Getrennte 3,35 umol Proben von Spermidincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 53) und des neutralen Lipides Dioleylphosphatidylethanolamin ("DOPE") wurden jeweils in Chloroform als Stammzubereitungen gelöst. Im Anschluß an die Vereinigung der Lösungen wurde ein dünner Film durch Entfernen von Chloroform aus dem Gemisch durch Abdampfen unter reduziertem Druck (22 mm Hg) erzeugt. Der Film wurde weiter unter Vakuum (1 mm Hg) für 24 Stunden getrocknet. Wie vorher erwähnt nehmen einige der Amphiphile der Erfindung an Transacylierungsaktionen mit Co-Lipiden wie beispielsweise DOPE teil oder sind Gegenstand anderer Reaktionen, die einen Abbau hiervon verursachen können. Es wird demgemäß bevorzugt, dass Amphiphil/Co-Lipid-Zusammensetzungen bei einer niedrigen Temperatur aufbewahrt werden, wie beispielsweise -70ºC, bis sie verwendet werden.
  • Um eine dispergierte Suspension zu erzeugen wurde der Lipidfilm dann mit sterilem entionisiertem Wasser (1 ml) für 10 Minuten hydriert und dann für 1 Minute vorgetext (eine Beschallung für 10 bis 20 Sekunden in einem Badbeschallungsgerät kann ebenfalls angewendet werden und die Beschallung hat sich für andere Amphiphile wie beispielsweise DC-chol als brauchbar bestätigt). Die sich ergebende Suspension wurde dann mit 4 ml Wasser verdünnt, um eine Lösung zu erzielen, die 670 uM kationisches Amphiphil und 670 uM neutrales Co-Lipid aufweist.
  • Es wurden ebenfalls Experimente unter Verwendung von Spermincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 67) und anderen erfindungsgemäßen Amphiphilen durchgeführt. Bezüglich Spermincholesterincarbamat wurde das optimale Molverhältnis von Amphiphil zu DOPE unter den getesteten Bedingungen als 1 : 2, nicht 1 : 1 bestimmt. Optimierte Verhältnisse für viele der Amphiphile der Erfindung werden in den Fig. 13, 14 und 15 berichtet und können durch den Fachmann leicht bestimmt werden.
  • Zur Zubereitung der Transfektionslösung wurde DNA, die für β-Galaktosidase kodiert (pCMVβ, ClonTech, Palo Alto, CA) in OptiMEM-Kulturmedium (Gibco/BRL Nr. 31885- 013) gelöst. Die sich ergebende Lösung wies eine DNA-Konzentration von 960 uM auf (unter der Annahme eines durchschnittlichen Molekulargewichts von 330 Dalton für die Nukleotide in der kodierenden DNA).
  • Das nachfolgende Verfahren wurde dazu verwendet, ein 1 : 1 molares Gemisch des kationischen amphiphilen Spermidincholesterincarbamats in Kombination mit DOPE zu testen. Eine 165 ul Teilmenge von Spermidincholesterincarbamat (670 uM), die ebenfalls das Co- Lipid (bei 670 um) enthielt, wurde in 8 separate Wells bzw. Vertiefungen in einer 96-Well Platte einpipettiert, die OptiMEM (165 ul) in jeder Well enthielt. Die sich ergebenden 335 um Lösungen wurden dann reihenweise 7 Mal verdünnt, um 8 getrennte Amphiphile enthaltende Lösungen zu erzeugen, die Konzentrationen im Bereich von 335 uM bis 2,63 uM aufwiesen, wobei jede sich ergebende Lösung ein Volumen von 165 ul aufwies. Somit wurden insgesamt 64 Lösungen hergestellt, wobei 8 Wells jeweils 8 unterschiedliche Konzentrationen von Amphiphil/DOPE enthielten.
  • Unabhängig wurden DNA-Lösungen (165 ul, 960 uM) in 8 Wells pipettiert, die OptiMEM (165 ul) enthielten und die sich ergebenden 480 uM Lösungen wurden dann seriell 7 Mal verdünnt, um 8 getrennte 165 ul Lösungen aus jedem Well zu erzeugen, wobei die Konzentrationen der DNA in den Wells sich von 480 uM bis 3,75 uM bewegten.
  • Die 64 Testlösungen (kationisches Amphiphil: neutrales Lipid) wurden dann mit den 64 DNA Lösungen vereinigt, so dass sich getrennte Mischungen in 64 Wells ergaben, die jeweils ein Volumen von 330 ul aufwiesen, wobei die DNA Konzentrationen sich entlang einer Achse von 240 uM bis 1,875 uM bewegten und sich die Lipid-Konzentrationen entlang der anderen Achse von 167 uM bis 1,32 uM bewegten. Somit wurden insgesamt 64 Lösungen hergestellt, wobei jede ein unterschiedliches Amphiphil : DNA Verhältnis und/oder Konzentration aufwies. Die Lösungen der DNA und des Amphiphils ließ man für 15 bis 30 Minuten stehen, um eine Komplexbildung zu ermöglichen.
  • Eine CFT-1 Zelllinie (menschliche zystische Fibrose-Bronchialepithelzellen, die mit Papillomaviren unsterblich gemacht wurden) bereitgestellt von Dr. James Yankaskas, University of North Carolina, Chapel Hill, wurde für den in vitro Assay verwendet. Die Zellen waren für ein mutiertes Allel (Deletion von Phenylalanin in Position 508, hierin nachstehend ΔF508) des Gens, das für das zystische Fibrose-Transmembrankonduktanzregulator ("CFTR")-Protein kodiert, homozygot. CFTR ist ein cAMP-reguliertes Chlorid (Cl&supmin;) Kanalprotein. Eine Mutation des CFTR-Gens hat typischerweise einen vollständigen Verlust (oder zumindest eine beträchtliche Verschlechterung) der Cl&supmin;-Kanalaktivität durch beispielsweise Zellmembranen betroffener Epithelgewebe hindurch zur Folge.
  • Die ΔF508 Mutation ist die üblichste Mutation, die mit der Erkrankung der zystischen Fibrose verbunden ist. Bezüglich einer Diskussion der Eigenschaften der ΔF508 Mutation und des genetischen Hintergrunds der zystischen Fibrose Erkrankung siehe beispielsweise Cheng et al., Cell, 63, 827-834 (1990). Siehe ebenfalls Riordan et al., Science, 245, 1.066- 1.073 (1989); die veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 913 01 819.8 von Gregory et al. mit der Veröffentlichungsnummer 0 446 017 Al; und Gregory et al., Nature, 347, 382-385 (1990).
  • Die Zellen wurden in Hams F12 Nährmedien kultiviert bzw. gezüchtet (Gibco/BRL Nr. 31765-027) ergänzt mit 2% fötalem Rinderserum ("FBS", Irvine Scientifc, NR. 3000) und mit 7 zusätzlichen Ergänzungen. Die Zellen wurden in 96-Well Gewebskulturplatten in einer Dichte von ungefähr 7.500 Zellen/Well ausplattiert. Bevor sie im Assay verwendet wurden, ließ man die Zellen für Zeitspannen von 5-7 Tagen wachsen, bis ein konfluentes Muster erreicht worden war.
  • Im Anschluß an die zugewiesene Zeitspanne wurden die drei 96-Well Platten mit CFT-1 Zellen abgesaugt, um das Wachstumsmedium zu entfernen. Die verschiedenen Konzentrationen des DNA-Lipidkomplexes (in 100 ul Teilmengen) wurden auf jede der drei 96-Well Platten übertragen, wodurch die DNA-Lipidkomplexe mit den Zellen in Berührung gebracht wurden. Nur DNA/Zellen- und nur Lipid/Zellen-Kontroll-Wells wurden ebenfalls auf einer der drei Platten hergestellt.
  • Die 100 ul Lösungen des DNA-Lipidkomplex wurden über den Zellen für 6 Stunden aufrecht erhalten, wonach 50 ul 30% FBS (in OptiMEM) jedem Well zugesetzt wurde. Nach einer weiteren 20-stündigen Inkubationsperiode wurden zusätzliche 100 ul 10% FBS in OptiMEM zugesetzt. Im Anschluß an eine weitere 24-stündige Inkubationsperiode wurden die Zellen bezüglich einer Expression des Proteins und β-Galaktosidase untersucht.
  • Für die Assays wurde das sich ergebende Medium aus den Platten entfernt und die Zellen wurden mit Phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Der Lysepuffer (50 ul, 250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,15% Triton X-100) wurde dann hinzugesetzt und die Zellen wurden für 30 Minuten lysiert. Die 96-Well Platten wurden vorsichtig für 10 Sekunden gevortext, um die Zellen und die Zellbruchstücke zu entfernen und 5 ul Volumina des Lysats aus jedem Well wurden auf eine Platte transferiert, die 100 ul Volumina Coomassie Plus® Proteinassay-Reagenz (Pierce Company, NR. 23236) enthielten. Die Protein-Assay-Platten wurden auf einem Bio-Rad Model 450 Plattenlesegerät abgelesen, das einen 595 nm Filter enthielt, wobei eine Proteinstandardkurve in jedem Assay enthalten war.
  • Der Grad der β-Galaktosidaseaktivität in jedem Well wurde durch Zusatz von Phosphatgepufferter Salzlösung (50 ul) zu den verbleibenden Lysaten gemessen, gefolgt vom Zusatz einer gepufferten Lösung, die aus Chlorphenolrotgalactopyranosid (100 ul, 1 mg pro ml, Calbiochem Nr. 220588), 60 mM Dinatriumhydrogenphosphat pH 8,0, 1 mM Magnesiumsulfat, 10 mM Kaliumchlorid, und 50 mM 2-Mercaptoethanol bestanden. Das Chlorphenolrotgalactopyranosid ergab, im Anschluß an die enzymatische (β- Galaktosidase) Hydrolyse eine rote Farbe, die durch ein Plattenablesegerät, das einen 570 nm Filter enthielt, nachgewiesen wurde. Eine β-Galaktosidase (Sigma Nr. G6512) Standardkurve wurde eingeschlossen, um jeden Assay zu kalibrieren bzw. zu eichen.
  • Im Anschluß an die Subtraktion der Stör- bzw. Hintergrundmeßdaten ermöglichten optische Daten, die durch das Plattenablesegerät bestimmt wurden, die Bestimmung der β- Galaktosidaseaktivität und des Proteingehalts. Im Vergleich zu der Menge an β- Galaktosidase, die von bekannten Transfektionsmitteln exprimiert wird, beispielsweise DMRIE (1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxymethylammoniumbromid) sind Verbindungen der Erfindung bei der Transfektion von Atemwegsepithelzellen und bei der Induktion der β-Galaktasidase-Expression in diesen besonders wirksam. In Bezug auf DMRIE : DOPE (1 : 1) zeigte das Spermidincholesterincarbamat: DOPE Gemisch (ebenfalls 1 : 1) eine um einen Faktor von ungefähr 5 verbesserte Transfektionsleistung (siehe beispielsweise Fig. 13, 14 und 15).
    • Beispiel 2 - Transfektion des Gens, das für das menschliche zystische Fibrose- Transmembrankonduktanzregulatorprotein kodiert
  • Die Fähigkeit der kationischen Amphiphile der vorliegenden Erfindung, Zellen zu transfizieren und darin biochemische Korrekturen zu induzieren wurde mit einem getrennten in vitro Assay demonstriert. Unsterblich gemachte menschliche zystische Fibrose-Atemwegs- bzw. Atemwegszellen (CFT-1, wie oben) wurden verwendet.
  • Bei der Herstellung des Assays wurden die Zellen auf Glasdeckgläsern bis zu einer Konfluenz von ungefähr 60% gezüchtet. Die Zellen wurden dann mit einem Komplex aus Spermidincholesterincarbamat : DOPE (1 : 1) und einem Plasmid (pCMV-CFTR), das eine cDNA enthielt, und die das menschliche Wildtyp CFTR kodiert, transfiziert. Das PCMV- CFTR-Plasmid ist ein Konstrukt, das die kodierenden Sequenz für CFTR und die folgenden regulatorischen Elemente enthält, nämlich einen CMV-Promotor und Enhancer und ein SV40 Polyadenylierungssignal. Zusätzliche Konstrukte, die zur Ausübung dieses Beispiels geeignet sind, schließen pMT-CFTR, Cheng et al., Cell, 63, 827-834 (1990) ein. Der verwendete Komplex war 10,5 umolar bezüglich Spermidincholesterincarbamat (ebenfalls von DOPE) und 30 umolar bezüglich pCMV-CFTR auf Grundlage des Nukleotids.
  • 48 Stunden nach der Amphiphil-vermittelten Transfektion wurden die Zellen bezüglich ihrer cAMP-stimulierten CF-Kanalaktivität unter Verwendung des 6-Methoxy-N-(3- sulfopropyl)chinolinium ("SPQ") Assays getestet. Siehe S. Cheng et al., Cell, 66, 1.027- 1.036 (1991) für weitere Informationen betreffend der Assay-Methodologie. Im Assay wurde die cAMP-abhängige Cl&supmin;-Kanalaktivität unter Verwendung von "SPQ" (von Molecular Probes, Eugene, Oregon), einem Halogenid-empfindlichen Fluorophor bestimmt. Zunahmen in der Halogenid-Permeabilität haben eine schnellere Zunahme der SPQ- Fluoreszenz zur Folge und die Geschwindigkeit der Veränderung (eher als die absolute Veränderung der Fluoreszenz) ist die bedeutende Variable bei der Bestimmung der Cl&supmin; Permeabilität. Siehe ebenfalls Rich et al., Nature, 347, 358-363 (1990) für Hintergrundinformationen.
  • Die Fluoreszenz des SPQ Moleküls in individuellen Zellen wurde unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops bzw. Le-Chateller-Mikroskops, Nikon, einem digitalen Bildgebungssystem von Universal Imaging und einer ICCD Kamera, Hamamatsu, Inc., gemessen. Die Zellen wurden für die Analyse ohne vorheriges Wissen ihrer erwarteten Eigenschaften der Geschwindigkeit der Fluoreszenzveränderung ausgewählt.
  • Bei jedem Experiment wurden bis zu 5 Mikroskop-Gebiete zwischen 90 und 100 Zellen an einem vorgegebenen Tag überprüft und die Studien unter jeder Bedingung wurden an zumindest drei verschiedenen Tagen wiederholt. Weil die Expression von CFTR heterogen ist (d. h. die Zellen produzieren keine identischen Mengen an CFTR), wurden die Daten für die 20% der Zellen in jedem Feld, die die größte Reaktion zeigten, präsentiert.
  • Wie erwartet zeigten Zellen, die Schein-transfiziert wurden, keine meßbare Zunahme der cAMP-stimulierten Halogenid-Fluoreszenz. Im Gegensatz hierzu zeigten Zellen, die mit der Wildtyp CFTR cDNA transfiziert wurden, eine schnelle Zunahme der SPQ- Fluoreszenz nach Stimulation mit einem cAMP Agonisten, was auf eine erhöhte Permeabilität gegenüber Anionen hinweist. Ungefähr 60% der Zellen, die untersucht wurden, zeigten eine meßbare cAMP-stimulierte CF-Kanalaktivität. Demgemäß sind Spermidincholesterincarbamat und andere kationische Amphiphile der Erfindung, die in ähnlicher Weise getestet wurden, bei der Übertragung des CFTR-kodierenden Plasmids auf immortalisierte CF Atemwegszellen wirksam.
    • Beispiel 3 - CAT Assay Teil A
  • Dieser Assay wurde dazu verwendet, die Fähigkeit der kationischen Amphiphile der Erfindung zu bestimmen, Zellen von lebenden Proben in vivo zu transfizieren. In diesem Assay wurden die Lungen von Balb/C Mäusen intranasal instilliert (das Verfahren kann ebenfalls transtracheal durchgeführt werden), und zwar mit 100 ul kationischem Amphiphil : DNA- Komplex, den man sich während einer 15-minütigen Zeitspanne vor der Verabreichung gemäß der nachfolgenden Prozedur bilden ließ. Das Amphiphil (vorgemischt mit Co-Lipid siehe unten) wurde in Wasser für 10 Minuten hydriert, eine Zeitspanne die ausreichend ist, um eine Suspension zu ergeben, die zwei Mal die erforderliche Endkonzentration aufweist. Diese wurde zwei Minuten lang vorgetext und in Teilmengen aufgeteilt, um 55 ul Mengen für jede zu instillierende Maus bereitzustellen. In ähnlicher Weise wurde die DNA, die das Reportergen (CAT) kodierte, mit Wasser in einer Konzentration von zwei Mal derjenigen verdünnt, die für die Endkonzentration erforderlich war und wurde dann für jede Maus, die instilliert werden sollte, in Teilmengen von 55 ul eingeteilt. Das Lipid wurde sanft mit der DNA (in einem Polystyrolrohr) vereinigt und man ließ den Komplex sich für 15 Minuten bilden, bevor die Mäuse damit instilliert wurden.
  • Das verwendete Plasmid (pCMVHI-CAT, siehe Beispiel 4) stellt eine kodierende DNA für das Chloramphenicoltransferase-Enzym bereit. Einzelheiten bezüglich der Amphiphil- DNA-Komplexe sind unten bereitgestellt.
  • Zwei Tage im Anschluß an die Transfektion wurden die Mäuse getötet und die Lungen und die Trachea entfernt, gewogen und in einer Pufferlösung homogenisiert (250 mM Tris, pH 7,8, 5 mM EDTA). Das Homogenat wurde durch Zentrifugation geklärt und die darin enthaltenen Deacetylasen wurden durch Hitzebehandlung bei 70ºC für 10 Minuten inaktiviert. Das Lysat wurde über Nacht mit Acetylcoenzym A und C¹&sup4;-Chloramphenicol inkubiert. Die CAT Enzymaktivität wurde dann durch Dünnschicht-Chromatografie ("TLC") im Anschluß an eine Ethylacetatextraktion sichtbar gemacht. Die Enzymaktivität wurde durch Vergleich mit einer CAT Standardkurve quantifiziert.
  • Die Gegenwart des Enzyms CAT verursacht, dass eine Acetyl-Gruppe von Acetylcoenzym A auf C¹&sup4;-Chloramphenicol übertragen wird. Das acetylierte/radioaktiv markierte Chloramphenicol wandert auf einer TLC-Platte schneller, seine Gegenwart kann somit nachgewiesen werden. Die Menge an CAT, die zur Erzeugung der bestimmten Menge an acetyliertem Chloramphenicol notwendig war, kann dann aus Standards berechnet werden.
  • Die Aktivität von Spermidincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 53) wurde im CAT Assay bezüglich der bekannten Transfektionsreagenzien DMRIE und DC-Chol bestimmt. Fig. 10 zeigt deutlich (als ng CAT Aktivität pro 100 mg Gewebe) das gesteigerte Vermögen von Spermidincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 53), Zellen in vivo zu transfizieren, wobei diese Steigerung in jedem Assay ungefähr 20-fach oder mehr beträgt. Im Assay wurde die Aktivität als ng CAT Enzym pro 100 mg Lungengewebe gemessen. Als Vergleich wurde im allgemeinen beobachtet, dass DMRIE ein wohl bekanntes Transfektionsmittel, wenn es in einem 1 : 1 molaren Gemisch mit DOPE zubereitet und dann mit Plasmid-DNA (1,7 mM DMRIE, 1,7 mM DOPE, 1,2 mM Plasmid-DNA, gemessen als Nukleotid) komplexiert wird, ungefähr 1 bis 2 ng Aktivität pro 100 mg Lungengewebe in diesem Assay ergibt.
  • Bezüglich des in Fig. 10 bereitgestellten Vergleichs seien die nachfolgenden Bedingungen bzw. Umstände erwähnt. Die Transfektionslösung des Spermidincholesterincarbamats enthielt 6 mM DNA gemessen als Konzentration an Nukleotid und 1,5 mM kationisches Amphiphil. Unter im allgemeinen Befolgung des Verfahrens von Beispiel 1 wurde jedes Amphiphil ebenfalls mit DOPE vorgemischt, in diesem Fall in einem 1 : 1 molaren Verhältnis. Zur Transfektion mit DC-Chol, war das Molverhältnis von DC-Chol zu DOPE 3 : 2 und die Konzentrationen des kationischen Amphiphils und der DNA (als Nukleotid) waren 1,3 mM bzw. 0,9 mM. Zur Transfektion mit DMRIE betrug das Molverhältnis von DMRIE zu DOPE 1 : 1 und die Konzentrationen an kationischem Amphiphil und DNA betrugen 1,7 mM bzw. 1,2 mM. Diese Konzentrationen (und Konzentrationsverhältnisse) für jedes Amphiphil und Co-Lipid und DNA erwiesen sich als für die Transfektion für das jeweilige Amphiphil optimal und wurde demgemäß als Basis für den hierin präsentierten Vergleich verwendet.
  • Für Spermidincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 53) wurden ebenfalls Optimierungsexperimente durchgeführt, um bevorzugte Plasmid-Konzentrationen für eine spezielle Amphiphilkonzentration (siehe Fig. 11) zu bestimmen und um ebenfalls bevorzugte Konzentrationen des selben Amphiphils bezüglich einer speziellen Plasmidkonzentration zu bestimmen (siehe Fig. 12). Die Transfektionsleistung war bei einer Amphiphilkonzentration von 1,5 mM (DOPE lag ebenfalls in 1,5 mM vor) und ungefähr 6 mM (pro Nukleotid) Plasmid oder ungefähr bei einem Verhältnis von 1 : 4 optimal. Es war jedoch zu bemerken, dass Konzentrationen von ungefähr 0,75 mM Amphiphil und 3,0 mM Plasmid für die Zielzellen weniger toxisch waren.
  • Eine intranasale Transfektion mit dem pCMVHI-CAT Vektor wurde ebenfalls in Mäusen unter Verwendung von Spermidincholesterincarbamat als kationischem Amphiphil durchgeführt, jedoch mit Cholesterin als Co-Lipid. In diesem Experiment waren die getesteten Konzentrationen an Spermidincholesterincarbamat zwischen 1,0 und 1,5 mM (wobei Cholesterin in jedem Fall in einem Molverhältnis von 1 : 1 vorlag, wobei das Mischen des Amphiphils und des Co-Lipids wie oben durchgeführt wurde). Die DNA Konzentration (gemessen als Nukleotidkonzentration) war zwischen 4,0 und 6,0 mM. Die Transfektionsleistung (wiederum als CAT/100 mg Gewebe gemessen) war mit DOPE als Co-Lipid weniger effektiv. Jedoch waren die Transfektionen wesentlich wirksamer als diejenigen, die unter Verwendung von DC-Chol/DOPE erreicht wurden.
    • Teil B
  • Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um die Transfektionsleistungsfähigkeit kationischer Amphiphile, die in den Fig. 1, 5 und 7 dargestellt sind, in vivo zu vergleichen. Die Ergebnisse hierfür sind jeweils in den Fig. 13, 14 und 15 dargestellt. Die Verbindungen wurden intranasal unter Verwendung von zwischen 12 und 15 Mäusen pro Verbindung verabreicht. Wie in Teil A oben wurden die ng CAT Aktivität pro 100 mg Gewebe gemessen. Jedoch wurden verbesserte Vektoren (pCF1/CAT und dessen eng verwandtes Äquivalent pCF2/CAT) verwendet. Teilweise als Folge der verbesserten Vektorleistung wurden Inkubationen von Lysat mit Acetylcoenzym A und C¹&sup4;-Chloramphenicol für nur 30 Minuten durchgeführt. Die Konstruktion von pCF1/CAT und pCF2/CAT ist nachstehend in Beispiel 4 dargestellt.
  • Die in den Fig. 13, 14 und 15 dargestellten in vivo Daten wurden im allgemeinen wie folgt gewonnen. Wie vorher erwähnt zeigen die Fig. 10 und 11 Daten von der vollständigen in vivo Optimierung von Amphiphil Nr. 53. Amphiphil Nr. 67 wurde einer ähnlichen Teiloptimierung unterworfen. Bezüglich all der anderen erwähnten kationischen Amphiphile und indem man sich zahlreiche strukturelle Ähnlichkeiten zunutze machte, wurden optimierte Zusammensetzungen zum in vivo Testen aus in vitro Ergebnissen extrapoliert. Dies erleichterte das Screening nach großen Mengen Amphiphilen und erzeugte im allgemeinen, wenn nicht genau, vergleichbare Daten. Für alle anderen Amphiphile als die der Nr. 53 und 67 wurde das Verhältnis der Amphiphilkonzentration zur DOPE- Konzentration zum in vivo Testen aus den in vitro Experimenten entnommen, genauso wie das optimale Verhältnis der Amphiphilkonzentration zur DNA-Konzentration (siehe Beispiel 1) entnommen wurde. Demgemäß wurde für derartige Amphiphile die in vivo Testkonzentration bei 1 mM festgelegt, wodurch ebenfalls die Co-Lipid Konzentration festgelegt wurde. [Im allgemeinen bewegte sich das Molverhältnis des Amphiphils zum Co- Lipid DOPE im Bereich von 1 : 2 (beispielsweise Spermidincholesterincarbamat Nr. 67) über 1 : 1 (beispielsweise Spermidincholesterincarbamat Nr. 53) bis ungefähr 2 : 1 (beispielsweise Amphiphil Nr. 75)]. Die Konzentration der Plasmid-DNA variierte für jede Amphiphilart, die getestet wurde, um das optimierte Amphiphil/DNA-Verhältnis, das in vitro bestimmt wurde zu verdoppeln bzw. zu vervielfältigen.
    • Teil C
  • Dass die neuen Amphiphile der vorliegenden Erfindung einen bedeutenden Beitrag zur Technik liefern, ist unmittelbar durch einen Vergleich ihrer Leistung - als in vivo Transfektionsverstärker bzw. -verbesserer - mit derjenigen von eng verwandten kationischen Amphiphilen ersichtlich, denen die neue T-Form fehlt. Es wurde festgestellt, dass Spermidincholesterincarbamat einen viel höheren Verstärkungsgrad als N¹- Spermidincholesterincarbamat bereitstellt, das die selbe Anzahl von Kohlenstoff und Stickstoffatomen in seinem kationischen Alkylaminbestandteil enthält, das jedoch linear und nicht "T-förmig" ist. Im allgemeinen den Verfahren von Beispiel 3, Teil B folgend und unter Verwendung von jeweils 6 mM (als Nukleotid), 1,5 mM und 1,5 mM Konzentrationen an DNA, Amphiphil und Co-Lipid wurde eine um das 30-fache verbesserte bzw. verstärkte bzw. gesteigerte Transfektion von Spermidincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 53) bezüglich N¹-Spermidincholesterincarbamat festgestellt.
  • Ebenfalls den Verfahren von Beispiel 3, Teil B, folgend und unter Verwendung von jeweils 4 mM (als Nukleotid), 1 mM und 2 mM Konzentrationen an DNA, Amphiphil und Co-Lipid, war die Transfektionsverstärkung, die von Spermincholesterincarbamat (Amphiphil Nr. 67) - bezüglich N¹-Thermospermidincholesterincarbamat und N¹- Spermidincholesterincarbamat, dem Spermincholesterincarbamat ähnlich verwandt ist - bereitgestellt wird, zumindest ungefähr 30-fach.
    • Beispiel 4 - Konstruktion der Vektoren
  • Wie vorher erwähnt können zahlreiche Arten biologisch aktiver Moleküle in Zellen in therapeutischen Zusammensetzungen transportiert werden, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen kationischen Amphiphile enthalten.
  • Das biologisch aktive Makromolekül kann eine kodierende DNA sein. Es folgt eine Beschreibung neuer Vektoren (Plasmide), die bevorzugt werden, um die Expression derartiger kodierender DNAs in Zielzellen zu erleichtern.
    • Teil A - pCMVHI-CAT
  • pCMVHI-CAT ist für nutzbare Plasmidkonstrukte repräsentativ. Obwohl das Plasmid in einer Form bereitgestellt wird, die ein Reportergen trägt (siehe Beispiel 3) können Transgene mit therapeutischem Nutzen ebenfalls darin enthalten sein.
  • Der pCMVHI-CAT Vektor basiert auf dem kommerziell erhältlichen Vektor pCMVβ (Clontech). Das pCMVβ Konstrukt weist ein pUC19 Grundgerüst (J. Vieira, et al., Gene, 19, 259-268 (1982) auf, das einen prokaryontischen Replikationsursprung aufweist, der ursprünglich von pBR322 abstammt. Grundlegende Merkmale des pCMVHI-CAT Plasmids (das so konstruiert ist, dass es Nukleotidsequenzen einschließt, die für CAT kodieren) sind wie folgt. Im Uhrzeigersinn vorgehend - der menschliche Cytomegalievirus Immediate Early Gene Promotor und Enhancer, ein Fused Tripartite Leader vom Adenovirus und ein Hybridintron, eine Linkersequenz, die CAT cDNA, eine zusätzliche Linkersequenz, das späte SV40 Polyadenylierungssignal und den pUC Replikationsursprung und das Grundgerüst schließt das Gen für eine Ampicillinresistenz ein.
  • Der humane Cytomegalievirus Immediate Early Gene Promotor und Enhancer überspannt die Region der Nukleotide 1 bis 639. Dies entspricht der Region von -522 bis +72 bezüglich der Transkriptionsstartstelle (+1) und schließt beinahe die gesamte Enhancer-Region von -524 bis -118 wie ursprünglich von Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985, definiert, ein. Die CAAT Box befindet sich bei den Nukleotiden 487-491 und die TATA Box befindet sich bei den Nukleotiden 522-526 in pCMVHI-CAT. Das CAT Transkript beginnt vorhergesagter Weise bei Nukleotid 549, was die Transkriptionsstartsfelle des CMV- Promotors ist. Das dreiteilige (tripartite) Leader-Hybridintron ist aus einem fusionierten Tripartite Leader vom Adenovirus, das ein 5' Spleiß-Donorsignal und ein 3' Spleiß- Akzeptorsignal enthält, das aus einen IgG-Gen abgeleitet ist, zusammengesetzt. Die Elemente im Intron sind wie folgt: die erste Leadersequenz, die zweite Leadersequenz, ein Teil der dritten Leadersequenz, die Spleiß-Donorsequenz und die Intronregion von der ersten Leadersequenz und die Mausimmunglobulingen Spleiß-Donorsequenz. Die Länge des Introns beträgt 230 Nukleotide. Die CAT kodierende Region umfaßt die Nukleotide 1.257-1.913. Das SV40 Poly A-Signal erstreckt sich von Nukleotid 2.020-2.249. Demgemäß ging die Konstruktion des pCMVHI-CAT Plasmids wie folgt vor sich. Der Vektor pCMVß (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit Not I digeriert bzw. verdaut, um das β- Galaktosidasegen auszuschneiden. Das Vektorfragment, dem das β-Galaktosidasegen fehlt wurde isoliert und zur Bildung von pCMV ligiert.
  • Das Hybridintron (Fig. 17) wurde aus dem Plasmid pADß (Clontech) gewonnen. Das Hybridintron wurde aus einem 695 Basenpaar XhoI-EcoRI Fragment von p91023(B) isoliert, siehe Wong et al., Science, 228, 810-815 (1985). Das Hybridintron enthält den Fused Tripartite Leader von Adenovirus, die Donorstelle vom ersten Segment des Tripartite Leaders und die Akzeptorstelle von einem IgG-Gen und weist eine Länge von 230 bp auf.
  • pADß wurde mit PmII und NotI digeriert und das ~500 Basenpaar (bp) Fragment wurde isoliert und dann in die NotI Stelle von pBluescriptII KS(-) (Statagene, La Jolla, CA) zur Bildung von pBlueII-HI ligiert.
  • pBlueII-HI wurde mit XhoI und NotI verdaut, um das Hybridintronfragment aus zu schneiden. Dieses Fragment wurde in XhoI und NotI Stellen von pCMV ligiert, wodurch das SV40 Intron ersetzt wurde, um pCMVHI zu bilden.
  • Das CAT Gen wurde vom Chloramphenicolacetyltransferase GenBlock (Pharmacia, Piscataway, NY) gewonnen. Dieses 792 bp Hindill Fragment wurde mit stumpfen Enden mit dem Klenow Fragment von DMA Polymerase I verbunden, darauf wurden NotI-Linker (New England Biolabs) an jedes Ende ligiert. Nach Digestion mit NotI, um die klebrigen NotiI-Enden (NotI Sticky Ends) zu exponieren, wurde das Fragment in die NotI Stelle von pCMV zur Bildung von pCMV-CAT subkloniert. pCMV-CAT wurde mit NotI digeriert, um das CAT Fragment auszuschneiden. Das CAT Fragment wurde zur Bildung von pCMVHI-CAT in pCMVHI ligiert, was in Fig. 16 dargestellt ist.
    • Teil B - pCF1 und pCF2
  • Obwohl pCMVHI für therapeutische Transfektionen geeignet ist, wurden weitere Leistungsverbesserungen (einschließlich einer erhöhten Expression von Transgenen) durch die pCF1 und pCF2 Plasmide bereitgestellt. Eine Karte von pCF1/CAT ist in Fig. 18, Tafel B dargestellt und eine Karte von pCF2/CAT ist in Tafel B dargestellt.
  • Kurz gesagt enthält pCF 1 die Enhancer/Promotorregion aus dem Immediate Early Gene des Cytomegalievirus (CMV). Ein Hybridintron befindet sich zwischen dem Promotor und der transgenen cDNA. Das Polyadenylierungssignal des Rinderwachstumshormon-Gens wurde zur Anordnung stromabwärts vom Transgen ausgewählt. Der Vektor enthält weiterhin einen Arzneistoffresistenzmarker, der das Aminoglycosidase 3'- Phosphortransferasegen kodiert (abgeleitet vom Transposon Tn903, A. Oka et. al., Journal of Molecular Biology, 147, 217-226, 1981), wodurch eine Resistenz gegenüber Kanamycin verliehen wurde. Weitere Einzelheiten der pCF1 Struktur sind direkt nachstehend angegeben, einschließlich einer Beschreibung der Anordnung einer cDNA-Sequenz darin, die für das zystische Fibrosetransmembrankonduktanzregulatorprotein (CFTR) kodiert.
  • Der pCF1 Vektor basiert auf dem kommerziell erhältlichen Vektor pCMVβ (Clontech). Das pCMVβ Konstrukt weist ein pUC19 Rückgrat (j. Vieira, et al., Gene, 19, 259-268, 1982) auf, das einen ursprünglich von pBR322 stammenden prokaryontischen Replikationsursprung einschließt.
  • Grundmerkmale des pCF1-Plasmids (wie es konstruiert ist, so dass es eine Nukleotidsequenz einzuschließt, die für CFTR kodiert) sind wie folgt. Im Uhrzeigersinn vorgehend der humane Immediate Early Gene Cytomegalievirus Gen-Promotor und Enhancer, eine Fused Tripartite Leader Sequenz vom Adenovirus und ein Hybridintron, eine Linkersequenz, die CFTR cDNA, eine zusätzliche Linkersequenz, das Rinderwachstumshormon Polyadenylierungssignal, den pUC Replikationsursprung und das Grundgerüst, und das Kanamycinresistenzgen. Das pCF1-CFTR Plasmid wurde an beiden Strängen vollständig sequenziert.
  • Der humane Immediate Early Gene Cytomegalievirus Gen-Promotor und Enhancer umspannt die Region der Nukleotide 1-639. Dies entspricht der Region von -522 bis +72 bezüglich der Transkriptionsstartstelle (+1) und schließt beinahe die gesamte Enhancer- Region von -524 bis -118 ein, wie ursprünglich von Boshart et al., Cell 41: 521-S30 (1985) definiert. Die CAAT Box befindet sich bei den Nukleotiden 486-490 und die TATA Box befindet sich bei den Nukleotiden 521-525 in pCF1-CFTR. Das CFTR Transkript beginnt vorhergesagter Weise bei Nukleotid 548, was die Transkriptionsstartstelle des CMV- Promotors ist.
  • Das Hybridintron ist aus einer Fused Tripartite Leader Sequenz vom Adenovirus, die ein 5' Spleiß-Donorsignal enthält, und einem 3' Spleiß-Akzeptorsignal, das von einem IgG-Gen stammt, zusammengesetzt. Die Elemente im Intron sind wie folgt: die erste Leadersequenz (Nukleotide 705-745), die zweite Leadersequenz (Nukleotide 746-816), die dritte Leadersequenz (partial, Nukleotide 817-877), die Spleiß-Donorsequenz und die Intronregion von der ersten Leadersequenz (Nukleotide 878-1.042) und die Mausimmunglobulingen Spleiß- Donorsequenz (Nukleotide 1.043-1.138). Die Donorstelle (G/GT) befindet sich bei den Nukleotiden 887-888, die Akzeptorstelle (AG/G) befindet sich bei den Nukleotiden 1. 128- 1.129 und die Länge des Introns beträgt 230 Nukleotide. Die CFTR-kodierende Region umfaßt die Nukleotide 1.183-5.622.
  • Innerhalb der CFTR-kodierenden cDNA von pCF1-CFTR existieren zwei Unterschiede von der ursprünglich publizierten vorhergesagten cDNA Sequenz (J. Riordan et al., Science, 245, 1.066-1.073 (1989); (1) eine A zu C-Veränderung in Position 1.990 der CFTR cDNA, die einen Fehler in der ursprünglich publizierten Sequenz korrigiert und (2) einen T zu C-Veränderung, die in Position 936 eingeführt wird. Die Veränderung an Position 936 wurde durch ortsgerichtete Mutagenese eingebracht und ist eine stille (silent) Veränderung, erhöht jedoch die Stabilität der cDNA in hohem Maße, wenn sie in bakteriellen Plasmiden vermehrt wird (R. Gregory et al., Nature, 347, 382-386, 1990). Die 3' untranslatierte Region des vorhergesagten CFTR Transkripts umfaßt 51 Nukleotide der 3' untranslatierten Region der CFTR cDNA, 21 Nukleotide einer Linkersequenz und 114 Nukleotide des BGH Poly A-Signals.
  • Das BGH Poly A-Signal enthält 90 Nukleotide einer flankierenden Sequenz 5' zum konservierten AAUAAA-Motiv und 129 Nukleotide einer flankierenden Sequenz 3' zum A- AUAAA-Motiv. Das CFTR Primärtranskript wird vorhergesagter Weise stromabwärts des BGH Polyadenylierungssignals bei Nukleotid 5808 gespalten. Es existiert eine Deletion in pCF1-CFTR an Position +46 bezüglich der Spaltstelle, es wird jedoch nicht vorhergesagt, dass die Deletion entweder eine Polyadenylierungseffizienz oder Spaltstellengenauigkeit bewirkt, basierend auf den Studien von E. C. Goodwin et al., J. Biol. Chem., 267, 16.330- 16.334 (1992). Nach dem Zusatz eines Poly A-Endes beträgt die Größe des sich ergebenden Transkripts ungefähr 5,1 kb.
  • Das pCF2-Plasmid, Fig. 18 (B) enthält einen zweiten CMV Enhancer im Tandem mit dem ersten. Die gesteigerte Expression der Transgene von pCF1 oder pCF2 folgt aus der Kombination eines starken Promotors, der Gegenwart eines hoch effizienten Polyadenylierungssignals, einer Leadersequenz, die die Translation steigert und einem Intron, das die Stabilität der Botschaft erhöht.
    • Beispiel 5 - Korrektur eines Chloridionentransportdefektes in Nasenpolypen-Epithelzellen eines Patienten mit zystischer Fibrose durch einen durch kationisches Amphiphilvermittelten Gen-Transfer
  • Primäre (nicht immortalisierte) Nasenpolypen-Zellen von einem erwachsenen männlichen zystischen Fibrose-Patienten (homozygot für die ΔF508 Mutation) wurden auf Collagenbeschichteten permeablen Filterträgern (Millicells) zur Bildung einer polarisierten und konfluenten Epithel-Monolayer bzw. Einfachschicht gezüchtet. Wenn die Monolayer einmal elektrisch eng verbunden (tight) sind (ungefähr 5 bis 7 Tage nach der Aussaat und wie durch die Entwicklung der Resistenz über das Zellblatt hinweg angezeigt) kann die apikale Oberfläche gegenüber Zubereitungen aus kationischem Amphiphil: DNA Komplex ausgesetzt werden.
  • In diesem Fall wurde das Amphiphil (Spermidincholesterincarbamat) als ein 1 : 1 (pro Mol) Gemisch mit DOPE bereitgestellt und dieses Gemisch wurde dann mit dem pCMV-CFTR Plasmidvektor (einem Konstrukt, das menschliche Wildtyp-zystische Fibrose- Transmembrankonduktanzregulatorprotein kodiert, siehe oben) komplexiert. Konzentrationen im Endgemisch waren 42 umolar für Spermidincholesterincarbamat (und ebenfalls DOPE) und 60 umolar (auf Grundlage der Molarität bei den Nukleotiden) für den Plasmidexpressionsvektor.
  • Die Expression von CFTR wurde durch Messen einer cAMP-stimulierten transepithelialen Chlorid-Sekretion in einer modifizierten Ussing-Kammer gemessen, Zabner et al., Nature Genetics, 6, 75-83 (1984). Die Schleimhautseite des Epithels wurde in Ringer'sche Hydrogencarbonat-Lösung gebadet, die mit 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; durchperlt wurde. Die Zusammensetzung der submukosalen Lösung war der mukosalen Lösung ähnlich mit der Ausnahme, dass Natriumgluconat Natriumchlorid ersetzte. Die transepitheliale Spannung wurde an 0 mV geklemmt und ein Kurzschlußstrom wurde aufgezeichnet. Amilorid (10 um) wurde in das apikale Bad aufgebracht, gefolgt von dem mukosalen Zusatz von Foskolin und IBMX (jeweils zu 100 um). 5-Nitro-2-(3-phenylproylamino)benzoesäure ("NPPB"), ein Inhibitor für CFTR Chloridkanäle wurde dann der mukosalen Lösung zu 10 bis 30 um zugesetzt.
  • Die Chloridsekretion (d. h. die Bewegung von Chlorid aus den epithelialen Zellen zur mukosalen Lösung) ist als eine nach oben gerichtete Deflektion (siehe Fig. 19) dargestellt. Der selbe Plasmidvektor, der jedoch ein Reportergen enthielt, wurde als Negativkontrolle verwendet. Ein cAMP-stimulierter Strom (0,5 bis 2,5 uamper/cm²) wurde in Monolayers beobachtet, die mit dem Wildtyp CFTR-Gen transfiziert wurden. Ein Strom wurde bei der pCMV-β-Galaktosidase-Kontrolle nicht nachgewiesen.
    • Beispiel 6 - Korrektur eines Chloridionentransportdefektes in Atemwegsepithel-Zellen eines zystischen Fibrose-Patienten durch einen durch ein kationisches Amphiphil vermittelten Gen-Transfer
  • Ein empfohlenes Verfahren zur Zubereitung und Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung zur Behandlung der zystischen Fibrose bei menschlichen Patienten ist wie folgt.
  • Im allgemeinen folgend den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird ein dünner Film (abgedampft aus Chloroform) erzeugt, wobei Spermincholesterincarbamat (Amphipbil Nr. 67) und DOPE in einem Molverhältnis von 1 : 2 vorliegen. Der Amphiphil enthaltende Film wird in Wasser zu Injektionszwecken unter sanftem Vortexen rehydratisiert, bis zur einer resultierenden Amphiphil-Konzentration von ungefähr 3 mM. Es kann, um die Menge des Amphiphil/DNA Komplexes zu erhöhen, der durch ein Aerosol als eine homogene Phase stabil abgegeben wird (beispielsweise unter Verwendung eines Puritan Bennett Raindrop Verneblers von Lenexa Medical Division, Lenexa, KS, oder dem PARI LC JetTM Vernebler von PARI Respiratory Equipment, Inc., Richmond, VA), den Amphiphil enthaltenden Film so herzustellen, dass er weiterhin ein oder mehrere weitere Inhaltsstoffe einschließt, die zur Stabilisierung der endgültigen Amphiphil/DNA Zusammensetzung dienen. Es wird demgemäß gegenwärtig bevorzugt, den Amphiphil enthaltenden Film als ein 1 : 2 : 0,05 molares Gemisch von Amphiphil Nr. 67, DOPE und PEG(5000)-DMPE herzustellen. [Eine geeignete Quelle für PEG-DMPE, Polyethylenglycol 5000- Dimyristoylphosphatidylethanolamin ist Katalog Nr. 880210 von Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL]. Zusätzliche Fettsäurearten von PEG-PE können hierfür ersatzweise verwendet werden.
  • Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass PEG(5000)-DMPE die therapeutischen Zusammensetzungen durch Vermeiden einer weiteren Aggregation gebildeter Amphiphil/DNA Komplexe stabilisiert. Es wird zusätzlich angemerkt, dass sich herausgestellt hat, dass PEG(2000)-DMPE in der Anwendung der Erfindung weniger wirksam war.
  • Das pCF1-CFTR Plasmid (das eine kodierende Sequenz für den menschlichen zystischen Fibrose-Transmembrankonduktanzregulator enthält, siehe Beispiel 4) wird in Wasser zu Injektionszwecken in einer Konzentration von 4 mM, gemessen als Nukleotid, bereitgestellt. Das Komplexieren des Plasmids und des Amphiphils läßt man dann durch sanftes in Berührung bringen der beiden Lösungen für eine Zeitspanne von 10 Minuten vor sich gehen.
  • Es wird gegenwärtig bevorzugt, aerolisierte DNA zur Lunge in einer Konzentration von zwischen ungefähr 2 und ungefähr 12 mM (als Nukleotid) zu transportieren. Eine Probe von ungefähr 10 bis ungefähr 40 ml ist im allgemeinen für eine Aerosolverabreichung an die Lunge eines erwachsenen Patienten ausreichend, der für die ΔF508 Mutation im CFTR kodierenden Gen homozygot ist.
  • Es wird erwartet, dass dieses Verfahren (unter Verwendung einer frisch zubereiteten Probe von Amphiphil/DNA) in Zeitintervallen von ungefähr 2 Wochen wiederholt werden muß, jedoch in beträchtlichem Maße abhängig von der Reaktion des Patienten, der Dauer der Expression aus der transfizierten DNA und dem Auftreten irgendwelcher potentiellen Nebenwirkungen, wie beispielsweise einer Entzündung, die alle für jeden individuellen Patienten bestimmt werden und von den Ärzten des Patienten berücksichtigt werden können.
  • Ein bedeutender Vorteil der kationischen Amphiphile der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie - in vivo - wesentlich wirksamer sind als andere gegenwärtig verfügbare Amphiphile und somit in beträchtlich niedrigeren Konzentrationen als bekannte kationische Amphiphile verwendet werden können. Es ergibt sich die Möglichkeit, Nebenwirkungen bzw. unerwünschte Wirkungen beträchtlich zu reduzieren (wie beispielsweise die Amphiphil-Toxizität, entzündliche Reaktionen), die ansonsten den Erfolg der Gentherapie in nachteiliger Weise beeinflussen würden. Ein weiterer besonderer Vorteil, der mit der Verwendung vieler der erfindungsgemäßen Amphiphile verbunden ist, sollte erneut erwähnt werden. Viele der erfindungsgemäßen Amphiphile wurden so konzipiert, dass deren Metabolismus hin zu relativ harmlosen biologisch verträglichen Bestandteilen rasch fortschreiten wird. In dieser Hinsicht seien die hochaktiven Amphiphile 53, 67 und 75 besonders erwähnt.
    • Beispiel 7 - Weitere Verbesserungen im Plasmid-Design für die Gentherapie: replizierende episomale Plasmide
  • Obwohl die oben erwähnten Design- bzw. Konzeptionsmerkmale die Leistung verfügbarer Plasmide beträchtlich erhöhen können, sind weitere Modifikationen wünschenswert, so dass therapeutische Zusammensetzungen, die derartige Plasmide und kationische Amphiphile umfassen, eine optimale Leistung für die Gentherapie aufweisen.
  • Es ist wünschenswert, dass Plasmide für die Gentherapie ebenfalls dazu in der Lage sind, sich in den Zellen von Patienten zu replizieren, weil ein fortgesetztes Vorhandensein des Plasmids eine Korrektur des genetischen Defektes über eine längere Zeitspanne mit sich bringt (im Falle der zystischen Fibrose ein Fehlen des funktionierenden CFTR-Proteins in der Zellmembran der Lungenepithelzellen oder anderer Zellen). Es existiert ein Bedarf danach, dass Plasmide, die für den gegenwärtigen Stand der Technik repräsentativ sind (d. h. diejenigen, die sich nicht in den Zielzellen eines Patienten replizieren können) nach einer nur kurzen Zeitspanne der Aufrechterhaltung in Patienten abgebaut werden, wodurch exzessive sich wiederholende Verabreichungen erforderlich sind.
  • Eine Langzeitkorrektur könnte vielleicht unter Verwendung eines Vektors erreicht werden, der so konzipiert ist, dass er in die Chromosomen der Patienten-Zielzellen integriert wird (beispielsweise ein Vektor, der einem Retrovirus nachgebildet ist). Eine derartige Strategie schließt jedoch Risiken ein, die einschließen dass (1) der Vektor in eine essentielle Region eines Chromosoms integriert wird oder (2) der Vektor in die Nachbarschaft eines Onkogens integriert wird und dieses aktiviert.
  • Es wäre demgemäß wünschenswert, eine kontinuierliche Erhaltung von Gentherapie- Vektoren (Plasmiden) in Zielzellen durch andere Mittel zu bewerkstelligen. Eine derartige Strategie besteht darin, ein Plasmid zu konstruieren, das zur separaten Aufrechterhaltung im Kern einer Zielzelle in der Lage ist und das ebenfalls dazu in der Lage ist, sich dort zu replizieren (d. h. ein Episom).
  • Derartige Plasmide können wie folgt konstruiert werden. Es wurde festgestellt (C. McWhinney et al., Nucleic Acids Research, 18, 1.233-1.242, 1990), dass das 2,4 kb HindIII-XhoI Fragment, das unmittelbar 5' zu Exon I des menschlichen c-myc Gens liegt, einen Replikationsursprung enthält. Das Fragment wurde dann in ein Plasmid kloniert, das, wenn es in HeLa-Zellen transfiziert wurde, sich als darin für mehr als 300 Generationen unter Arzneistoff-Selektion persistierend dargestellt hat. Es stellte sich heraus, dass die Replikation semikonservativ war (C. McWhinney et al.). Obwohl ungefähr 5% der Plasmidpopulation pro Zellgeneration ohne Arzneistoffselektion in diesen Experimenten verloren gingen, zeigt dieses Ergebnis nichtsdestoweniger, dass eine beträchtliche Stabilisierung bezüglich des Designs therapeutischer Plasmide für die Gentherapie von Vorteil sein würde.
  • Demgemäß kann bei einem Beispiel eines replizierenden episomalen Vektors eine Variante von pCF1-CFTR (oder pCF1-CAT) konstruiert werden, bei der eine Kopie des 2,4 kb HindIII-XhoI Fragmentes gerade 5' zur CMV Enhancer/Promotor Region des pCF1 Grundgerüstes angeordnet wird. Alternativ kann zwischen 2 und ungefähr 4 - in Tandem - Kopien des 2,4 kb Fragments in ähnlicher Weise angeordnet werden. Die Zunahme der Plasmidgröße, die sich aus der Einfügung des 2,4 kb Fragmentes (oder multipler Kopien hiervon) ergibt, stellt vorhergesagter Weise einen zusätzlichen Vorteil bereit, d. h., die Entwindung des Plasmids zu erleichtern, wodurch die Aktivität der DNA Polymerase erleichtert wird.
  • Die Verwendung dieses Replikationsursprungs oder multipler Kopien hiervon ermöglicht die effiziente Replikation des Plasmids in menschlichen Zellen. Weitere DNA Sequenzen, die diese Replikationsursprünge enthalten, können ebenfalls verwendet werden (wie sie beispielsweise im menschlichen β-Globin-Gen oder dem Maus DHFR-Gen zu finden sind).
  • Ein Plasmid, das konstruiert werden kann, kann Folgendes enthalten: den Cytomegalievirus-Promotor und Enhancer, ein Intron, die CFTR cDNA, das Rinderwachstumshormon Polyadenylierungssignal, das Kanamycinresistenztransposon Tn903 und 4 Kopien der 2,4 kb 5' flankierenden Region des menschlichen c-myc Gens, wie in Fig. 20 dargestellt ist.
    • Beispiel 8 - Weitere Verbesserungen des Plasmid-Designs für die Gentherapie Verwendung von Cytokin-Promotoren zur Modulierung der Expression von Transgenen in der Gentherapie
  • Eine chronische Entzündung ist mit zahlreichen der Erkrankungszustände verbunden, die mit der Gentherapie behandelt werden können. Repräsentativ für solche Krankheitszustände sind die zystische Fibrose (unter Verwendung von CFTR), die Bronchitis, die Schocklunge (Adult Respiratory Distress Syndrome = ARDS) (unter Verwendung von α-1 Antitrypsin) und metastasierender Krebserkrankungen (durch nach oben-Regulation von p53, TIMP-1 und TIMP-2). Entzündliche Zustände schließen typischerweise viele miteinander verbundene Prozesse ein (beispielsweise die Einbeziehung von vielen Typen von Immunsystemzellen und Leberproteinen), wodurch der Körper versucht, ein beschädigtes oder infiziertes Gewebe zu heilen. Jedoch kann eine chronische Entzündung, die als Folge eines ungelösten Zustandes persistiert zu einer permanenten Gewebsschädigung führen, wie es bei Lungengewebe der Fall ist, das von zystischer Fibrose und damit verbundenen und ungelösten Lungeninfektionen der Fall ist. Tatsächlich ist die Dauerschädigung des Lungengewebes von Patienten mit zystischer Fibrose eine Hauptursache für deren Mortalität. Es wäre deswegen wünschenswert, eine Gentherapie in einer solchen Weise bereitzustellen, dass entzündliche Zustände, die mit dem ins Ziel gefaßten Krankheitszustand assoziiert sind, behandelt werden.
  • Demgemäß ist die Konstruktion von Gentherapievektoren möglich, bei denen das therapeutische Transgen unter Kontrolle eines RNA Polymerase-Promotors von einem Cytokingen (oder einem Gen, das ein anderes in ähnlicher Weise regulatorisches Protein kodiert) angeordnet wird, beispielsweise dem Promotor für Interleukin 2, Interleukin 8, Interleukin 1, Interleukin 11, Interleukin 6, Endothelin -1, Monocyte Chemoattractant Protein -1, IL-1ra (Rezeptoragonist), oder für GM-CSF.
  • Cytokine können also als hormonartige intrazelluläre Signalproteine definiert werden, die in die Regulation der Zellproliferation, Differentiation und Funktion involviert sind, wie beispielsweise die Blutbildung und die Lymphbildung bzw. Lymphozytenbildung. Die Interleukine sind eine spezielle Gruppe der Cytokine mit Promotoren, die von Nutzen sind. Die Interleukine sind Proteine, typischerweise von nicht verwandtem Ursprung, die als interzelluläre Signale dienen, die Reaktionen zwischen immunreaktiven Zellen vermitteln. Es ist jedoch klar, dass viele "Interleukine" Wirkungen auf zusätzliche Zelltypen aufweisen, einschließlich Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten.
  • Weil die Konzentration vieler Cytokine an einer befallenen Stelle in Reaktion auf den Grad einer vorliegenden Entzündung nach oben reguliert wird, können Gentherapie-Vektoren entwickelt werden, bei denen die Konzentration eines therapeutischen Transgens, das daraus exprimiert wird, teilweise durch den Grad der vorliegenden Entzündung, bestimmt wird. Es folgt hiernach eine Beschreibung, wie derartige Vektoren unter Verwendung in erster Linie von Eigenschaften des Interleukin 8 Gens als Beispiel konzipiert werden.
  • Es wurde festgestellt, dass zahlreiche biologisch aktive Moleküle in Geweben in Konzentrationen vorliegen, die mit dem Schweregrad eines entzündlichen Zustandes zunehmen (beispielsweise der Tumor Nekrose Faktor "TNF" und potentiell Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise NF-kB, AP-1, NF-IL6 und das Octamer Bindungsprotein).
  • Es hat sich ebenfalls herausgestellt, dass Interleukin 8, ein Polypeptid von Molekulargewicht 8.500, durch eine Entzündung nach oben reguliert wird und als ein starkes Chemoattractans für T-Lymphozyten und neurophile Zellen dient, die selbst in die Entzündungsreaktion involviert sind. Das Interleukin 8 Gen reguliert in erster Linie das Transkriptionsniveau und es wurde ebenfalls festgestellt (H. Nakamura et al., Journal of Biological Chemistry, 266, 19.611-19.617, 1991), dass TNF die Interleukin 8 Transkription in bronchialen Epithelzellen in vitro um das mehr als 30-fache erhöhen kann. Es folgt demgemäß eine Beschreibung von Gentherapie-Vektoren, die aus dem oben genannten Nutzen ziehen können.
  • Er kann ein Plasmid konstruiert werden, das pCF1 im wesentlichen ähnlich ist, d. h. aus einem pUC Plasmid abgeleitet ist, das einen Bakterien-abgeleiteten Replikationsursprung enthält und ein Gen, das eine Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht. Das sich ergebende Plasmid enthält ebenfalls in der Sequenz einen CMV Enhancer, einen Promotor, ein Hybridintron, eine cDNA Sequenz, die CFTR kodiert und das Rinderwachstumshormons- Polyadenylierungssignal. Als RNA Polyrnerasepromotor wird die -335 bis +54 Region des Interleukin 8 Promotors ausgewählt. Diese Region ergab das höchste Verhältnis bezüglich der Promotoraktivität plus TNF über minus TNF (Nakamura, 1991).
  • Ein derartiges Plasmid weist besonders wertvolle Leistungseigenschaften auf. Wenn die Entzündung in einer durch zystische Fibrose befallenen Lunge zunimmt (und deswegen der Bedarf, die Lunge durch eine Gentherapie zu behandeln ebenfalls zunimmt), nimmt die Konzentration verschiedener entzündungsverwandter Moleküle (wie beispielsweise TNF) zu. Durch Anordnen der CFTR-kodierenden cDNA des therapeutischen Plasmids unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors (beispielsweise dem von Interleukin 8), der selbst gegenüber der Konzentration an entzündungsverwandten Substanzen in Berührung mit der Zelle empfindlich ist, wird der Promotor derart als natürlicher Gen-Schalter funktionieren, dass die Menge der vorteilhaften CFTR Transkription an die Entzündungsmenge angepaßt wird. Wie vorher erwähnt, sind RNA Polymerase-Promotorsequenzen, die aus den anderen vorher erwähnten Genen abgeleitet sind, ebenfalls brauchbar.
    • Beispiel 9 - Intravenöse Abgabe von Transgenen
  • Für einige Erkrankungszustände, wie beispielsweise zystische Fibrose, ist es wünschenswert, die Transgene an die Lunge abzugeben. Die Abgabe durch Aerosol ist der direkteste Ansatz um dieses Ziel zu erreichen. Es ist jedoch unter Vorgabe der Schwierigkeiten, die der Abgabe eines Aerosols eigen sind, zusammen mit dem potentiellen Bedarf, andere Zielorgane als die Lunge ins Ziel zu fassen (beispielsweise den Pankreas für die zystische Fibrose), von Bedeutung, die Durchführbarkeit der Lungenabgabe unter Verwendung von nicht-Aerosol-Abgabeformaten zu evaluieren. Demgemäß wurde eine intravenöse Abgabe eines Reportertransgens unter Verwendung eines Maus-Modells durchgeführt und die Durchführbarkeit eines intravenösen Organ-Targeting wurde untersucht. Ein Vergleich der Durchführbarkeit der Abgabe an die Lunge und das Herz wurde durchgeführt.
  • Das Reporterplasmid pCF-1 CAT (Beispiel 4) wurde verwendet und wurde zur Minimierung von Endotoxin (< 1 EU/mg pDNA) und auch von chromosomalen DNA- Verunreinigungen (< 2%) gereinigt. Amphiphil Nr. 53 (1 : 1 mit DOPE)/DNA Komplex wurde gemäß den Verfahren von Beispiel 3 hergestellt. Das Amphiphil wurde als freie Base bereitgestellt und das Plasmid wurde als Natriumsalz in Wasser zubereitet und das DOPE wurde in zwitterionischer Form bereitgestellt.
  • Das Tiermodell war die BALB/c Maus. Weibliche 6-8 Wochen alte Tiere, die 16-18 g wogen, wurden unter Verwendung der Schwanzvene intravenös geimpft, wobei 5 Tiere pro Gruppe verwendet wurden. Das Volumen von Lipid : pDNA Komplex das verwendet wurde, war in allen Experimenten 100 ul. Soweit nichts anderes angegeben ist, wurden die Mäuse nach 48 Stunden nach Verabreichung des Komplexes getötet. Die Organe wurden unmittelbar auf Trockeneis eingefroren, um sie für eine anschließende Analyse aufzubewahren.
  • Die Expression der Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) wurde unter Verwendung eines radiochemischen Assays für die enzymatische CAT-Aktivität quantifiziert. Die Organe wurden gewogen und auf Eis in einem Lysepuffer, der Proteaseinhibitoren enthielt, homogenisiert. Das Lysat wurde 3 x gefrier-getaut (freeze-thawed), zentrifugiert und auf 65ºC erhitzt, um die Deacetylasen zu inaktivieren, bevor es einem Reaktionsgemisch zugesetzt wurde, das ¹&sup4;C-Chloramphenicol enthielt. Nach einer Inkubation bei 37ºC wurde das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert, konzentriert, auf TLC-Platten getupft und mit CHCl&sub3;/MeOH eluiert. Die den acylierten Reaktionsprodukten entsprechenden Spots wurden quantifiziert (Betagen) und unter Verwendung von authentischen CAT-Standards in ng CAT Aktivitäten umgewandelt.
  • Es hat sich überraschender Weise herausgestellt, dass ein Targeting zum Herz durch Veränderung des Molverhältnisses (bei einer konstanten DNA Konzentration von 0,9 mM, gemessen als Nukleotid) von Amphiphil/DNA in der therapeutischen Zusammensetzung beträchtlich verbessert werden konnte. Diese Information ist in Verbindung mit der Gentherapie für das Herz, wie beispielsweise für die koronare Herzkrankheit wertvoll. Jedoch blieb das Targeting an die Lunge über einen Bereich von Amphiphil/DANN-Verhältnissen relativ konstant, alle bei konstanten DNA Konzentrationen (Fig. 21).
  • Bei Molverhältnissen von weniger als 0,5 stellte sich heraus, dass die Organverteilung stark hin zur Lunge gewichtet war. In diesem Molverhältnis ist das Zeta-Potential des Komplexes negativ (ungefähr -30 mV), was teilweise auf den Überschuß einer negativen Ladung aus der DNA bezüglich dem Amphiphil zurückzuführen ist. Bei einem Amphiphil/DNA-Verhältnis von 1,25 jedoch weist der Komplex ein positives Zeta- Potential (ungefähr +30 mV) auf, und die Organverteilung war bemerkenswerter Weise verändert und eine beträchtliche Expression war im Herz zu finden (Fig. 21).
  • Die Zeta-Potentiale der Probe können (unter Verwendung von typischerweise 5 Messungen pro Probe) unter Verwendung eines Malvern Zetasizer 4 (Malvern Instruments, Southborough, M. A.) und einer Zeta-Zelle (AZ-104-Zelle, Malvern Instuments Co.) gemessen werden. Trockenlipidfilme, die das kationische Lipid und DOPE enthalten, wurden in destilliertem Wasser (dH&sub2;O) hydratisiert. Die DNA sollte typischerweise auf eine Konzentration von ungefähr 300 uM in dH&sub2;O verdünnt werden. Die DNA-Lösung (1,5 ml) kann dann einem gleichen Volumen kationischer Lipid-Vesikeln zugesetzt und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert werden. Genug NaCl (beispielsweise eine 4 mM Stammlösung) kann zugesetzt werden, so dass eine Endkonzentration von 1 mM NaCl resultiert. Falls notwendig kann die Probe weiter mit 1 mM NaCl verdünnt werden (um ein Photomultipliersignal unter 4.000 Zählern pro Sekunde aufrecht zu erhalten), und destilliertes Wasser kann anstelle der NaCl Lösungen verwendet werden.
  • Die Amphiphile Nr. 53 und Nr. 67 zählen zu den zur Verwendung in einem intravenösen Targeting des Herzens bevorzugten Verbindungen, wie es viele andere Amphiphile sind, die aus den Gruppen I und II ausgewählt sind.
    • Beispiel 10 - Zusätzliche experimentelle Verfahren (A) Zusätzliche Syntheseverfahren für N&sup4;-Spermincholesterincarbamat, Amphiphil Nr. 67 (Synthese des N¹,N¹²-diCbz-spermin di-HCl-Salzes)
  • Benzylchloroformiat (15 ml, 105 mmol) wurde in Methylenchlorid (335 ml) gelöst und in einem Dreihalskolben unter einer Stickstoffatmosphäre angeordnet. Imidazol (14 g, 206 mmol) wurde in Methylenchlorid (200 ml) gelöst. Der Dreihalskolben wurde unter Verwendung eines Eiswasserbades auf 0-2ºC abgekühlt, und die Imidazollösung wurde schrittweise über 30 Minuten hinweg zugesetzt. Das Kühlbad wurde entfernt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Methylenchlorid (250 ml) und wässrige Citronensäure (10%, 250 ml) wurden dem Gemisch zugesetzt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit wässriger Citronensäure (10%, 250 ml) gewaschen. Die organische Fraktion wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das sich ergebende Öl wurde für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur vakuumgetrocknet. Dem Öl wurde Dimethylaminopyridin (530 mg, 4,3 mmol) und Methylenchlorid (250 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 0-2ºC abgekühlt und unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Eine Lösung von Spermin (10 g, 49 mmol) in Methylenchlorid (250 ml) wurde schrittweise über 15 Minuten hinzugesetzt, wobei eine Reaktionstemperatur von 0-2ºC beibehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt und darauf im Vakuum konzentriert. Dem sich ergebenden Material wurde 1 M Salzsäure (67 ml) und Methanol (400 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei 4ºC abgekühlt und ergab ein weißes Präzipitat. Das Präzipitat wurde durch Vakuumfiltration unter Verwendung von Whatman #1 Filterpapier isoliert. Das N¹,N¹²-diCbz-spermin di-HCl-Salz (13,38 g, 24,7 mmol, 50% Ausbeute), das so gewonnen wurde, wurde unter Vakuum bei Umgebungstemperatur 17 Stunden lang getrocknet.
    • (Synthese von N¹,N¹²-diCbz-N&sup4;-spermincholesterincarbamat)
  • N¹,N¹²-diCbz-spermin di-HCl-Salz (13,38 g, 24,7 mmol) wurde in einem Chloroform, Methanol und Wassergemisch im Verhältnis 65 : 25 : 4 (940 ml) gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt und Cholesterinchloroformiat (11 g, 24,5 mmol) wurden zugesetzt. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur für 1,5 Stunden gerührt und dann mit 1 M Natriumhydroxidlösung (165 ml) verdünnt. Die wässrigen und organischen Schichten wurden getrennt und die organische Schicht, die das Produkt enthielt, wurde mit Wasser gewaschen (110 ml). Die organische Fraktion wurde über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum konzentriert und vakuumgetrocknet. Das rohe Öl wurde durch Chromatografe unter Verwendung von Silicagel (60 Å, 1 kg) gereinigt. Das Siliziumdioxid wurde in 10% MeOH/CHCl&sub3; gepackt und die Säule wurde mit 25% MeOH/CHCl&sub3; eluiert. Fraktionen von 900 ml wurden gesammelt und durch Dünnschichtchromatografie analysiert. Fraktionen, die das Produkt enthielten (Rf. = 0,5 in 20% MeOH/CHCl&sub3;) wurden kombiniert und im Vakuum konzentriert. Das sich ergebende Öl wurde unter Vakuum 17 Stunden lang getrocknet, so dass sich 8,5 g (9,67 mmol, 39% Ausbeute) des Produktes ergaben.
    • (Synthese von N&sup4;-spermincholesterincarbamat)
  • N¹,N¹²-diCbz-N&sup4;-spermincholesterincarbamat (8,5 g, 9,67 mmol) wurde in 200 ml Essigsäure gelöst und 1,66 g 10% Pd auf Kohlenstoff wurden zugesetzt. Die Lösung wurde mit Stickstoff gespült und unter Wasserstoff bei atmosphärischem Druck gerührt. Der Wasserstoff wurde dem Reaktionskolben unter Verwendung eines Ballons, der mit Wasserstoffgas befüllt war, zugeführt. Die Hydrogenolyse ließ man 3 Stunden voranschreiten. Das Reaktionsgemisch wurde durch Whatman #1 Filterpapier filtriert und der Katalysator mit 250 ml 10% Essigsäure in Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, und eine Coevaporation mit Chloroform unterstützte die Entfernung der Essigsäure. Dem Rohprodukt wurden 1 M Natriumhydroxidlösung (400 ml) zugesetzt und die Lösung wurde dreimal mit 10% MeOH/CHCl&sub3; (700 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Fraktionen wurden mit Wasser (600 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde filtriert, im Vakuum konzentriert und bei Umgebungstemperatur für 48 Stunden vakuumgetrocknet. Das Rohmaterial wurde durch Chromatografie auf Silicagel (500 g) gereinigt. Die Säule wurde in 40 : 25 MeOH : CHCl&sub3; gepackt und mit 40 : 25 MeOH : CHCl&sub3; und dann 40 : 25 : 10 MeOH : CHCl&sub3; : NH&sub4;OH eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatografie analysiert und die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und im Vakuum konzentriert (die Abdampfung wurde durch Zusatz von Isopropanol unterstützt, um ein Azeotrop mit dem restlichen Wasser herzustellen). Das Material wurde bei Umgebungstemperatur für 48 Stunden vakuumgetrocknet, so dass sich N&sup4;-Spermincholesterincarbamat (4 g, 6,5 mmol, 67% Ausbeute) ergaben.
    • (B) N&sup4;-(N'-Cholesterincarbamatglycinamid)-spermin(amphiphil Nr. 91)
  • N-t-BOC-glycin-N-hydroxysuccinimidester (0,5 g, 1,83 mmol) wurde einer Lösung von diCbz-spermin 2HCl (1,0 g, 1,94 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (0,3 ml, 1,72 mmol) in 65/25/4 Chloroform/Methanol/Wasser (50 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Eine Untersuchung der Reaktion durch TLC (20% Methanol/Chloroform) wies auf die Gegenwart eines neuen Spots hin. Die Reaktion wurde zuerst mit 1 M NaOH (10 ml), und darauf mit H&sub2;O (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, vakuumfiltriert und im Vakuum zu einem Öl reduziert. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Säulenchromatografie (85 g Silicagel) unter Elution mit 20% Methanol/Chloroform gereinigt. Das erwünschte Produkt wurde isoliert und durch ¹H NMR als N¹,N¹²-diCbz-N&sup4;-(N'-t-BOC-glycinamid)-spermin (402 mg, 0,65 mmol, 35%) charakterisiert.
  • Benzylchloroformiat (100 mg, 0,58 mmol) wurden einer Lösung von N¹,N¹²-diCbz-N&sup4;- (N'-t-BOC-glycinamid)-spermin (220 mg, 0,354 mmol) und Triethylamin (4 Tropfen) in Methylenchlorid (20 ml) zugesetzt. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Eine Analyse der Reaktion durch TLC (20% Methanol/Chlorofonm) zeigte die Gegenwart eines neuen, höher laufenden Spots an. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 1 M HCl (5 ml) gelöscht bzw. gestoppt. Die organische Schicht wurde isoliert, mit H&sub2;O (5 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum reduziert.
  • Das sich ergebende Rohmaterial wurde in Chloroform (30 ml) gelöst und wasserfreies HCl-Gas wurde durch die Lösung 2 Stunden lang perlen gelassen. Eine Analyse der Reaktion durch TLC (10% Methanol/Chloroform) zeigte das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials an. Die Reaktion wurde mit wasserfreiem bzw. trockenem Stickstoff durchspült und mit 1 M NaOH (2 · 10 ml) und dH2O (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde isoliert, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum reduziert, so dass sich N¹,N&sup9;,N¹²-triCbz-N&sup4;-glycinamidspermin (219 mg, 0,33 mmol, 93% Ausbeute für zwei Schritte) ergaben.
  • Cholesterinchloroformiat (148 mg, 0,33 mmol) wurden einer Lösung von N¹,N&sup9;,N¹²- triCbz-N&sup4;-glycinamidspermin (219 mg, 0,33 mmol) und Triethylamin (0,3 ml, 2,1 S mmol) in Methylenchlorid (30 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit H&sub2;O (10 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum reduziert. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Säulenchromatografie (30 g Silicagel) gereinigt, unter Elution mit 65% Ethylacetat/Hexanen. Das erwünschte Produkt wurde isoliert und durch ¹H NMR als N¹,N&sup9;,N¹²-triCbz-N&sup4;-(N'-cholesterincarbamatglycinamid)- spermin (221 mg, 0,2 mmol, 62% Ausbeute) charakterisiert.
  • N¹,N&sup9;,N¹²-triCbz-N&sup4;-(N'-cholesterincarbamatglycinamid)-spermin (221 mg, 0,2 mmol) wurden mit 10% Pd/C (50 mg) in Eisessig (10 ml) unter einer Wasserstoffatmosphäre für 2,5 Stunden gerührt. Eine Analyse der Reaktion durch TLC (65% Ethylacetat/Hexane) zeigte das vollständige Verschwinden des Ausgangsmaterials an. Der Kolben wurde mit Stickstoff durchspült und der Katalysator wurde durch Vakuumfiltration durch Filterpapier unter Spülen mit 10% Essigsäure/Ethylacetat (20 ml) entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum zu einem Öl reduziert, das in 10% Methanol/Chloroform (100 ml) gelöst wurde und mit 1 M NaOH (20 ml) und H&sub2;O (15 ml) gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde getrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum reduziert. Das isolierte Produkt wurde durch ¹H NMR als N&sup4;-(N'-cholesterincarbamatglycinamid)-spermin (128 mg, 0,19 mmol, 95% Ausbeute) charakterisiert.
    • (C) Synthese von N&sup4;-Spermidin-2,3-dilauryloxypropylamin, Amphiphil Nr. 94
  • 2,3 Dimyristoylglycerol (600 mg, 1,4 mmol) wurde in Pyridin gelöst und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. Die Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt und p- Toluolsulfonylchlorid (300 mg, 1,57 mmol) wurden zugesetzt. Man ließ die Lösung auf Raumtemperatur aufwärmen und diese wurde dann über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Der Lösung wurde Salzsäure (2,5 M, 20 ml) zugesetzt und die Lösung wurde drei Mal mit Methylenchlorid (25 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, um ein rohes Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch Flash-Chromatografie (50 g Silicagel, 60 Å) unter Elution mit 5% Ethylacetat/Hexan gereinigt. Das durch Flash-Chromatografie gewonnene Öl wurde unter Hochvakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet, so dass sich 2,3- Dimyristoylglyceroltosylat (630 mg, 77% Ausbeute) ergaben.
  • 2,3-Dimyristoylglyceroltosylat (300 mg, 0,51 mmol) und N¹,N&sup8;-diCbz-spermidin (1,5 g, 3,6 mmol) wurden in Toluol (15 ml) gelöst. Die Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt und unter Rückflußkühlung erhitzt (110ºC). Das Reaktionsgemisch wurde 5 Tage lang bei Rückflußkühlungs-Temperatur erhitzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann durch ein Whatman #1 Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in Chloroform (50 ml) gelöst und mit Natriumhydroxid-Lösung (1 M, 10 ml) und Wasser (10 ml) gewaschen. Die organische Fraktion wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Chromatografie (30 g Silicagel, 60 Å) unter Elution mit 5% Methanol/Chloroform gereinigt. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden im Vakuum konzentriert. Das Material wurde durch eine zweite Flash-Chromatografiesäule (20 g Silica, 60 Å) gereinigt unter Elution mit 50% Ethylacetat/Hexan. Die Chromatografle ergab nach Trocknen des Produktes unter Hochvakuum bei Umgebungstemperatur N&sup4;-(N¹,N&sup8;)-diCbzspermidin-2,3-dilauryloxypropylamin als ein Öl (142 mg, 35% Ausbeute).
  • N&sup4;-(N¹,N&sup8;)-diCbz-spermidin-2,3-dilauryloxypropylamin (142 mg, 0,18 mmol) in Eisessig (5 ml) wurden mit 10% Pd/C (50 mg) unter einer Stickstoffatmosphäre für 2 Stunden gerührt. Der Katalysator wurde durch Vakuumfiltration durch ein Whatman #1 Filterpapier entfernt. Der Katalysator wurde mit Ethyl/Acetathexan gewaschen (10%, 10 ml). Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und für 2 Stunden unter Hochvakuum getrocknet. Dem Rückstand wurde eine Natriumhydroxid-Lösung (1 M, 8 ml) zugesetzt und die Lösung wurde drei Mal mit Methanol/Chloroform (10%, 20 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, so dass sich nach Trocknen unter Hochvakuum N&sup4;-Spermidin-2,3- dilauryloxypropylamin (52 mg, 52% Ausbeute) ergaben.
    • (D) Synthese von N&sup4;-Spermidin-2,3-dilauryloxypropylamin, Amphiphil Nr. 102
  • N¹,N¹²-diCbz-spermin (0,87 g, 1,85 mmol) und 2,3-Dimyristoylglyceroltosylat (280 mg, 0,48 mmol) wurden in Toluol gelöst (25 ml) und bei Reflux-Temperatur (110ºC) für 3 Tage erhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert und das sich ergebende Material durch Flash-Chromatografie (30 g Silicagel, 60 Å) unter Elution mit 10% MethanollChloroform gereinigt. Das isolierte Material wurde in Methanol/Chloroform (10%, 85 ml) gelöst und zwei Mal mit Natriumhydroxid-Lösung (1 M, 15 ml) und Wasser (10 ml) gewaschen. Die organische Fraktion wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Das Material wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur unter Hochvakuum getrocknet, so dass sich N&sup4;-(N¹,N¹²-diCbz-spermin)-2,3- dilauryloxypropylamin (180 mg, 43% Ausbeute) ergaben.
  • N&sup4;-(N¹,N¹²-diCbz-spennin)-2,3-dilauryloxypropylamin (180 mg, 0,2 mmol) in Eisessig (10 ml) wurden mit 10% Pd/C (50 mg) unter einer Wasserstoffatmosphäre für 3 Stunden gerührt. Der Katalysator wurde durch Vakuumfiltration durch ein Whatman #1 Filterpapier entfernt. Der Katalysator wurde mit Ethylacetat/Hexan (10%, 30 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und für 2 Stunden unter Hochvakuum getrocknet. Dem Rückstand wurde Methanol/Chloroform (10%, 85 ml) zugesetzt und die organische Schicht wurde zwei Mal mit Natriumhydroxid-Lösung (1 M, 15 ml) und Wasser (10 ml) gewaschen. Die organische Fraktion wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, so dass sich nach Trocknen unter Hochvakuum N&sup4;-Spermin-2,3- dilauryloxypropylamin (50 mg, 40% Ausbeute) ergaben.

Claims (11)

1. Kationische amphiphile Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie der nachfolgenden allgemeinen Formel entspricht:
bei der
R¹ und R² jeweils unabhängig -N(H)-, Alkylamin oder Polyalkylamin repräsentieren, unter der Voraussetzung, daß nicht beide -N(H)- repräsentieren;
bei der R³ und R&sup4; jeweils unabhängig H, eine wahlweise derivatisierte Aminosäure oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe repräsentieren;
bei der X C oder N repräsentiert;
bei der Y, falls vorhanden, eine Bindungsgruppe repräsentiert; und
Q -Z oder
repräsentiert, wobei
Z Alkylamin, Dialkylamin repräsentiert, die unterschiedliche Alkyl-Gruppen aufweisen können, oder eine Steroid repräsentiert;
wobei A und B jeweils unabhängig O, N oder S repräsentieren;
wobei C -C(H&sub2;)-, -C(O)- oder -C(S)- repräsentiert; und
R&sup5; und R&sup6; jeweils unabhängig eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl- oder Acyl-Gruppe repräsentieren.
2. Verbindung nach Anspruch 1, die einer der nachfolgenden allgemeinen Formeln entspricht:
bei der
Z ein Steroid repräsentiert;
X C oder N repräsentiert;
Y eine kurze Bindungsgruppe repräsentiert oder fehlt;
bei der R¹ und R² jeweils unabhängig -N(H)-, Alkylamin oder Polyalkylamin repräsentieren, unter der Voraussetzung, daß nicht beide -N(H)- repräsentieren; und
R³ und R&sup4; jeweils unabhängig H oder eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe repräsentieren; oder
bei der Z, X, R¹ und R² wie oben in Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) definiert sind;
bei der Y eine Bindungsgruppe repräsentiert oder fehlt; und
R³ und R&sup4; jeweils unabhängig eine wahlweise derivatisierte Aminosäure, H oder Alkyl repräsentieren;
oder
bei der X, Y, R¹, R², R³ und R&sup4; wie oben in Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) definiert sind; und
Z Alkylamin oder Dialkylamin repräsentiert, die unterschiedliche Alkylgruppen aufweisen können; oder
bei der X, R¹, R², R³ und R&sup4; wie oben in Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) definiert sind;
bei der A und B jeweils unabhängig O, N oder S repräsentieren;
bei der C -C(H&sub2;)-, -C(O)- oder -C(S)- repräsentiert;
bei der Y, falls vorhanden, -(H)N(C(O))- oder O(C(O))- repräsentiert; und
R&sup5; und R&sup6; jeweils unabhängig eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl- oder Acyl-Gruppe repräsentieren.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 mit der allgemeinen Formel (I):
bei der Z ein 3-Sterol repräsentiert, das über dessen 3-O-Gruppe oder über N in Ersatz hiervon gebunden ist;
oder bei der Z-Y - an
oder
oder
gebunden ist, wobei die Gesamtzahl an Stickstoff und Kohlenstoffatomen in jeder (Poly)alkylamingruppe weniger als ungefähr 30 beträgt und x, x', y, y', z und z' jeweils eine ganze Zahl größer 1 ist; oder wobei sie einer der nachfolgenden allgemeinen Formeln entspricht:
oder
oder
oder
oder
oder
oder
wobei die Gesamtzahl der Stickstoff und Kohlenstoffatome in jeder (Poly)alkylamingruppe weniger als ungefähr 30 beträgt und wobei x, x', y und y' jeweils eine ganze Zahl größer 1 ist, außer in der letzten Formel, wo x' ebenfalls 1 repräsentieren kann, wobei vorzugsweise zumindest eines 3 und zumindest eines 4 ist; wobei die Doppelbindung an C5 und/oder C7 im Steroidring wahlweise hydriert ist; und N eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist;
oder wobei sie eines des Nachfolgenden ist:
4. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, allgemeine Formel (II):
bei der nicht mehr als ein Atom der Bindungsgruppe Y eine Bindung mit sowohl X als auch Z bildet, wobei Y vorzugsweise Carbonyl ist;
oder bei der die Bindungsgruppe Y eine acylierte Aminogruppe ist, wobei das Carbonyl aus der Aminosäure an X gebunden ist und das Carbonyl aus dem N-Acyl-Anteil an den Sauerstoff oder den Stickstoff des Steroids Z gebunden ist, wobei Y vorzugsweise ein N- Acylglycin oder N-Acylserin ist;
oder bei der Z ein 3-Sterol repräsentiert, das über dessen 3-O-Gruppe oder über N in Ersatz hiervon gebunden ist, wobei Z vorzugsweise Cholesterin ist;
oder bei der zwei oder mehr Stickstoffe in den R¹ und/oder R² (Poly)alkylamingruppen durch eine oder mehrere Kombinationen von 3 und 4 Kohlenstoffatomen getrennt sind;
oder wobei sie eines des Nachfolgenden ist:
5. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, allgemeine Formel (III):
bei der
Z ein Dialkylamin repräsentiert;
Y eine Bindungsgruppe, vorzugsweise Carbonyl oder Methylen repräsentiert, wobei nicht mehr als ein Atom hiervon eine Bindung mit sowohl X als auch Z bildet;
X Kohlenstoff repräsentiert;
R³ und R&sup4; Wasserstoff repräsentieren,
R¹ ein Alkylamin repräsentiert; und
R² -N(H)- repräsentiert;
oder bei der sie N,N-Dioctadecyllysinamid, N,N-Didecyllysinamid, N,N-Didodecyllysinamid oder N¹,N¹-Dioctadecyl-1,2,6-traminohexan ist;
oder bei der
Z ein Alkylamin oder ein Dialkylamin repräsentiert;
bei der Y eine Bindungsgruppe repräsentiert, die vorzugsweise Carbonyl oder Methylen ist, wobei nicht mehr als ein Atom hiervon eine Bindung mit sowohl X als auch Z bildet;
X Kohlenstoff repräsentiert;
R³ und R&sup4; Wasserstoff repräsentieren;
R¹ ein Polyalkylamin repräsentiert, wobei vorzugsweise zwei oder mehr Stickstoffatome durch ein oder mehrere Kombinationen von 3 und 4 Kohlenstoffatomen getrennt sind; und
R² -N(H)- repräsentiert;
oder bei der
Z ein Alkylamin oder ein Dialkylamin repräsentiert;
Y eine Verbindungsgruppe repräsentiert, vorzugsweise Carbonyl oder Methylen, wobei nicht mehr als ein Atom hiervon eine Bindung mit sowohl X als auch Z bildet;
bei der X Kohlenstoff oder Stickstoff repräsentiert;
bei der R³ und R&sup4; Wasserstoff repräsentieren; und
bei der R¹ und R² jeweils unabhängig ein Alkylamin oder Polyalkylamin repräsentieren, wobei vorzugsweise zwei oder mehr Stickstoffatome durch eine oder mehrere Kombinationen von 3 und 4 Kohlenstoffatomen getrennt sind;
oder bei der sie einer der nachfolgenden Formeln entspricht:
oder
oder
oder
6. Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, allgemeine Formel (IV):
bei der
repräsentiert, wobei die Gesamtzahl der Stickstoff und Kohlenstoffatome in jeder (Poly)alkylamingruppe weniger als ungefähr 30 beträgt und x, x', y, y', z und z' jeweils eine ganze Zahl größer 1 ist;
oder wobei sie einer der nachfolgenden allgemeinen Formeln entspricht:
oder
oder
wobei die Gesamtzahl der Stickstoff und Kohlenstoffatome in jeder (Poly)alkylamingruppe weniger als ungefähr 30 beträgt, wobei x, x', y und y' jeweils eine ganze Zahl größer 1 ist, wobei vorzugsweise zumindest eines 3 und zumindest eines 4 ist, und m und n jeweils zwischen ungefähr 7 und ungefähr 29 sind;
oder wobei sie eines des Nachfolgenden ist:
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Komplex umfaßt, der folgendes umfaßt:
(1) eine kationische amphiphile Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6;
(2) ein biologisch aktives Molekül, das aus ribosomaler RNA, einem Antisense- Polynukleotid aus RNA oder DNA, einem Ribozym und einem Polynukleotid aus genomischer DNA, cDNA oder mRNA ausgewählt ist, die ein therapeutisch brauchbares Protein kodieren;
und, wahlweise
(3) ein Co-Lipid;
und ebenfalls, wahlweise, einen Träger, der aus Lactose, Trehalose, Saccharose, Mannitol, Maltose und Galactose ausgewählt ist, wobei die Zusammensetzung in lyophilisierter Form vorliegen kann.
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das biologisch aktive Molekül (2) hiervon eine DNA ist, die (i) eine Nukleotidsequenz, die ein therapeutisch brauchbares Polypeptid codiert, und (ii) eine oder mehrere regulatorische Elemente umfaßt, die zur Erleichterung der Expression der codierenden Sequenz in einer Zelle eines Patienten in der Lage sind, wobei die codierende Nukleotidsequenz vorzugsweise ein Polypeptid codiert, das eine zu derjenigen von CFTR ausreichend duplikative Aminosäuresequenz aufweist, um die Kontrolle der biologischen Eigenschaft der Anionenkanal-Regulation von Epithelzellen zu ermöglichen.
9. Gentherapie-Zusammensetzung für einen Krankheitszustand, der mit einer Entzündung verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein DNA-Molekül umfaßt, das zum Eintritt in Zellen eines Gewebes in der Lage ist, das durch diesen Krankheitszustand geschädigt ist, wobei das DNA-Molekül folgendes umfaßt: (1) ein Transgen, das zur Bereitstellung einer Behandlung des Krankheitszustands in der Lage ist, und das vorzugsweise aus CFTR, p53, alpha-1 Antitrypsin, TIMP-1 und TIMP-2 ausgewählt ist; und, stromaufwärts hiervon, (2) eine Nukleotidsequenz, die derjenigen eines RNA Polymerasepromotors für ein Cytokin-Gen entspricht, das vorzugsweise aus Interleukin 2, Interleukin 8, Interleukin 1, Interleukin 11, Interleukin 6, Endothelin-1, Monocyte Chemoattractant Protein -1, IL-1ra und GM-CSF ausgewählt ist, wobei die Expression hiervon auf der Transkriptionsebene durch Entzündung nach oben reguliert wird; wobei die Expression des Transgens vorzugsweise durch Tumomekrosefaktor nach oben reguliert wird, wobei das DNA-Molekül mit einer kationischen amphiphilen Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 komplexiert wird, die vorzugsweise der allgemeinen Formel (I) entspricht, bevorzugter einer Verbindung, die eines von Folgenden ist:
10. Gentherapiezusammensetzung zur intravenösen Behandlung eines Patientenherzens, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes umfaßt: (1) ein DNA-Molekül, das eine codierende Sequenz für ein therapeutisches Protein einschließt; und (2) eine kationische amphiphile Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, die vorzugsweise der allgemeinen Formel (I) oder (II) entspricht, bevorzugter einer Verbindung, die eines von Folgendem ist:
wobei die Zusammensetzung derart als Zubereitung bereitgestellt wird, daß das molare Verhältnis von kationischer amphiphiler Verbindung: DNA (gemessen durch die Molarität des Nukleotids) verursacht, daß die Komplexe aus kationischer amphiphiler Verbindung/DNA in Lösung ein positives Zeta-Potential, vorzugsweise von ungefähr +30 mV, aufweisen.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei der die kationische amphiphile Verbindung N&sup4;- Spermidincholesterylcarbamat (53) ist und das Molverhältnis von kationischer amphiphiler Verbindung DNA ungefähr 1,25 : 1 ist, wobei die Zusammensetzung vorzugsweise durch Mischen des Folgenden zubereitet wird: (1) einer ersten Lösung, die aus einer unprotonierten freien Basen-Form eines N&sup4;-Spermidincholesterylcarbamats, zwitterionischem DOPE und Wasser besteht, wobei das Molverhältnis der kationischen amphiphilen Verbindung: DOPE 1 : 1 ist, und (2) einer zweiten Lösung, die aus dem Natriumsalz der DNA in Wasser besteht.
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