DE69528270T2

DE69528270T2 - Gasgefüllte mikrokügelchen mit fluor enthaltenden hüllen

Info

Publication number: DE69528270T2
Application number: DE69528270T
Authority: DE
Inventors: Rolf Lohrmann
Original assignee: Molecular Biosystems Inc
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1994-08-02
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 2003-05-08
Anticipated expiration: 2015-08-01
Also published as: AU703652B2; KR970704475A; AU3153695A; EP0769969A1; DE69528270D1; EP0769969B1; JPH10505585A; CA2196599A1; EP0769969A4; WO1996004018A1; ES2183881T3; US5562893A; ATE224205T1

Description

Fachgebiet

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Ultraschall-Bildgebung. Genauer gesagt betrifft sie für die Ultraschall-Bildgebung nützliche Mikrokügelchen, die Mikro- Gasblasen, eingekapselt in Schalen, umfassen, welche sich aus einem biokompatiblen, fluorhaltigen, amphiphilem Material zusammensetzen, als auch wässrige Suspensionen solcher Mikrokügelchen, ebenso wie die Verwendung dieser Mikrokügelchen zur Herstellung solcher Suspensionen für den Gebrauch in der Ultraschall-Bildgebung.

Hintergrund

Die diagnostische Ultraschall-Bildgebung beruht auf dem Prinzip, dass Wellen von Schallenergie auf eine Fläche von Interesse fokussiert und so reflektiert werden können, dass ein Bild davon entsteht. Der Ultraschallkopf wird auf der Körperoberfläche plaziert, die über dem bildlich darzustellenden Bereich liegt, woraufhin Ultraschallenergie in Form von Schallwellen auf jenen Bereich gerichtet wird. Beim Wandern der Ultraschallenergie durch den Körper bestimmen die Geschwindigkeit der Energie und die akustischen Eigenschaften von Körpergewebe und -substanzen, auf die die Energie trifft, den Grad der Absorption, Streuung, Transmission und Reflexion der Ultraschallenergie. Der Ultraschallkopf stellt dann die Menge und Eigenschaften der reflektierten Ultraschallenergie fest und übersetzt die Daten in Bilder.
Beim Wandern der Ultraschallwellen durch eine Substanz zu einer anderen entsteht ein gewisser Grad an Reflexion an der Grenzfläche. Der Reflexionsgrad steht mit den akustischen Eigenschaften der Substanzen, die die Grenzfläche definieren, in Zusammenhang. Sind diese akustischen Eigenschaften unterschiedlich, wie zum Beispiel bei Flüssig-Fest- oder Flüssig-Gas-Grenzflächen, so erhöht dies den Reflexionsgrad. Aus diesem Grunde sind gashaltige Kontrastmittel beim Reflektieren von Ultraschallwellen besonders wirkungsvoll. In der Folge intensivieren diese Kontrastmittel den Reflexionsgrad der angetroffenen Substanzen und erhöhen die Bildschärfe der Ultraschallbilder.
Ophir und Parker beschreiben zwei Arten von gashaltigen bildgebenden Mitteln: (1) freie Gasblasen; und (2) eingekapselte Gasblasen (Ultrasound in Medicine and Biology 15(4): 319-333 (1989)), wobei Letztere bei einem Versuch entwickelt wurden, die Instabilitäts- und Toxizitätsprobleme zu überwinden, die bei Ersteren vorlagen. Eingekapselte Gasblasen, im folgenden als "Mikrokügelchen" bezeichnet, setzen sich aus einer Mikroblase aus einem Gas, umgeben von einer Schale aus Protein oder einem anderen biokompatiblen Material, zusammen. Eines dieser bildgebenden Mittel ist ALBUNEX® (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, Kalifornien), welches in einer Suspension von luftbefüllten Albumin-Mikrokügelchen besteht.
Im allgemeinen zeigen Mikrokügelchen aus einem bestimmten Gas eine verbesserte In-vivo-Stabilität im Vergleich zu freien Blasen desselben Gases. Die meisten Mikrokügelchen ergeben jedoch nach wie vor relativ kurze In-vivo-Halbwertszeiten, was ihre Nützlichkeit als Kontrastmittel einschränkt. Diese In-vivo-Instabilität wird für das Ergebnis des Zusammenbruchs oder Abbaus der Schalen unter dem Druck gehalten, der aus der schnellen Diffusion des Gases aus den Mikrokügelchen resultiert. So konzentrierten sich viele der Anstrengungen der letzten Zeit auf Verbesserungen der Schale als Weg zur Erhöhung der In-vivo-Stabilität. Zu bekannten Verbesserungen bezüglich Mikrokügelchen mit Proteinschale zählt eine Beschichtung der Proteinschale mit oberflächenaktiven Mitteln (Giddy, PCT/WO92/ 05806) und eine chemische Vernetzung der Proteinschale (Holmes et al., PCT/WO92/17213).
Zu weiteren, auf eine Verbesserung der Stabiltität der Mikrokügelchen gerichteten Bemühungen zählt die Verwendung nicht-proteinhaltiger schalenbildender Materialien. Bichon et al. (EP 92/810367) und Schneider et al. (Inv. Radiol. 27: 134- 139 (1992)) beschreiben die Herstellung polymerer "Mikroballone", die durch auf den Grenzflächen abgelagerte Polymere hergestellt werden und verschiedene Gase wie Kohlendioxid, Distickoxid, Methan, Freon, Helium und andere Edelgase einkapseln. Klaveness (PCT/WO92/17212) beschreibt die Verwendung chemisch vernetzter, nicht-proteinhaltiger amphiphiler Komponenten, die "Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Distickoxid, Kohlendioxid, Helium, Argon, Schwefelhexafluorid und niedermolekulare, wahlweise fluorierte Kohlenwasserstoffe wie Methan, Acetylen oder Tetrafluorkohlenstoff" einkapseln. Erbel et al. (US-Patentschrift Nr. 5.190.982) beschreibt die Verwendung von Polyaminodicarbonsäurecoimid-Derivaten.
Vor kürzerem haben Schneider et al. (Europäische Patentanmeldung Nr. 554.213 A1) gezeigt, dass Mikrokügelchen, die Gase mit bestimmten physikalischen Eigenschaften enthalten, eine verbesserte Stabilität aufweisen. Es wird die Theorie aufgestellt, dass die Instabilität der Mikrokügelchen durch eine Zunahme des Drucks bewirkt wird, dem die Mikrokügelchen ausgesetzt sind, sobald sie in das Kreislaufsystem gelangen. Obschon Schneider et al. keine Spekulationen bezüglich des Mechanismus anstellen, der für den beobachteten erhöhten Druckwiderstand verantwortlich ist, halten wir ihn für auf die Auswirkungen der Gaslöslichkeit auf die Rate des Gasaustausches mit der wässrigen Umgebung rückführbar.
Gemäß den Prinzipien des Henry-Gesetzes nimmt mit steigendem Druck die Löslichkeit eines gegebenen Gases in Lösung ebenfalls zu. Wird eine Blase aus einem Gas in Lösung einem Druck ausgesetzt, so nimmt die Rate des Gasaustausches zwischen dem Gas in der Blase und der umgebenden Lösung proportional zur Höhe des Drucks zu, so dass die Gasblase schließlich vollständig solubilisiert ist. Je unlöslicher das Gas in der umgebenden Lösung, um so länger braucht es, bis die Blase vollständig solubilisiert ist.
Ist die Gasblase von einer Schale in Form einer Mikrokugel umgeben, so sind die Wirkungen des Gasaustausches nach wie vor beobachtbar, da die Schalen der Mikrokügelchen den Kontakt zwischen dem Gas im Mikrokügelchen und der umgebenden Flüssigkeit nicht völlig verhindern. Werden folglich in einer Lösung suspendierte Mikrokügelchen einem Druck ausgesetzt, so wird das Gas im Inneren der Mikrokügelchen schließlich in der umgebenden Lösung solubilisiert, was zu einem Zusammenbruch der Mikrokügelchen führt.
Für die Ultraschall-Bildgebung nützliche Mikrokügelchen weisen typischerweise Schalen mit einem gewissen Grad an Elastizität auf. Diese Eigenschaft ist aus zwei wichtigen Gründen erforderlich. Erstens können Mikrokügelchen mit starren Schalen bei Frequenzen, die höher als die zur Ultraschall-Bildgebung angewandten sind, schwingen, was ihre Wirksamkeit als Kontrastverstärker herabsetzt. Zweitens können Mikrokügelchen mit starren Schalen einreißen oder brechen, wenn sie einem Druck ausgesetzt werden, und dadurch ihre gasförmigen Inhaltsstoffe in die wässrige Umgebung freisetzen. Mikrokügelchen mit elastischen Schalen können, obschon die zuvor genannten Probleme mit ihnen überwunden werden, ungünstigerweise empfindlicher für die Wirkungen des Gasaustausches mit der wässrigen Umgebung sein, was daran liegt, dass sie zu höherer Durchlässigkeit neigen. Dies führt zu einem höheren Grad an Kontakt zwischen dem Gas in den Mikrokügelchen und dem umgebenden wässrigen Milieu, was den Gasaustausch erleichtert.
Um den Austausch des Gases im Inneren der Mikrokügelchen mit dem umgebenden wässrigen Milieu zu hemmen, ist bei der vorliegenden Erfindung die Einführung von Fluor in das Schalenmaterial der Mikrokügelchen beschrieben. Mikrokügelchen mit fluorhaltigen Schalen zeigen eine verminderte Wasserdurchlässigkeit und so einen erhöhten Widerstand gegenüber einer Druckinstabilität durch den Gasaustausch.
In WO-94/03468 sind amphiphile Derivate von Aminosäuren oder Peptiden beschrieben, umfassend einen polyhydroxylierten hydrophilen Teil, der von einem Zucker, einem Polyol, einem Aminopolyol oder einem Oligosaccharid stammt, und mindestens einen hydrophoben Teil, der von einem Kohlenwasserstoff, Fluorkohlenstoff oder einem Fluorkohlenstoff/Kohlenwasserstoff-Gemisch stammt und gesättigt oder ungesättigt bei 5 bis 20 Kohlenstoffatomen ist, welche/r hydrophobe Teil(e) an den hydrophilen Teil durch einen Knotenpunkt gekoppelt ist der eine Aminosäure oder ein Peptid trägt.

Beschreibung der Erfindung

Mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die sich zur Ultraschall-Bildgebung unter Verwendung neuartiger gasbefüllter Mikrokügelchen mit fluorhaltigen Schalen eignen. Insbesondere werden mit der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen zur Verwendung als Ultraschall-Kontrastmittel bereitgestellt, die eine wässrige Suspension von Mikrokügelchen umfassen, welche Mikrokügelchen in einer fluorhaltigen Schale bestehen, die aus einem amphiphilen, biokompatiblen Material hergestellt ist und eine Mikroblase aus mindestens einem biokompatiblen Gas umgibt.
Das Gas ist vorzugsweise unlöslich und bevorzugter fluoriert, und sogar noch bevorzugter ein C&sub1; bis C&sub5;-Perfluorkohlenstoff. Zu geeigneten perfluorierten Gasen zählen Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan und Perfluorpentan.
Zu geeigneten fluorhaltigen Schalenmaterialien zählen Lipide, Proteine (was sowohl natürlich vorkommende Proteine als auch synthetische Aminosäure-Polymere umfasst), synthetische organische Polymere, und Gemische und Copolymere davon. Das Schalenmaterial ist vorzugsweise ein Protein und bevorzugter Humanserumalbumin.
Mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung druckbeständiger Mikrokügelchen bereitgestellt, welche Mikrokügelchen eine Schale aus einem fluorhaltigen amphiphilen, biokompatiblen Material umfassen, die eine Mikroblase aus mindestens einem biokompatiblen Gas umgeben, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Einführen von Fluor in ein amphiphiles, biokompatibles Material durch Umsetzen einer fluorhaltigen reaktiven Verbindung mit dem amphiphilen, biokompatiblen Material zum Erhalt eines fluorhaltigen, amphiphilen, biokompatiblen Schalenmaterials; und
(b) gleichzeitiges oder anschießendes Bilden der Mikrokügelchen aus dem fluorhaltigen, amphiphilen, biokompatiblen Schalenmaterial und dem biokompatiblen Gas.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann bei einer Methode zur Verstärkung des Kontrastes von Geweben und Organen in einem Ultraschallbild Verwendung finden, umfassend die Schritte des Injizierens der oben beschriebenen Zusammensetzung in ein Individuum und des Darstellens eines Ultraschallbildes.

Ausführungsformen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft stabilisierte Mikrokügelchen, die eine fluorhaltige Schale umfassen, bestehend aus einem biokompatiblen Material, das eine Mikroblase aus Gas umgibt. Dieses Schalenmaterial ist weniger wasserdurchlässig als sein nicht-fluorhaltiges Äquivalent. Außerdem können Wechselwirkungen, die zwischen bestimmten Gasen und der Schale stattfinden, die Mikrokügelchen weiter stabilisieren. Insbesondere dann, wenn das Gas ebenfalls Fluor enthält, bieten die Fluor-Fluor-Wechselwirkungen zwischen dem Gas und der Schale eine zusätzliche Barriere für den Gasaustausch mit dem umgebenden wässrigen Milieu.
Geeignete Schalenmaterialien müssen amphiphil sein, d. h. sowohl hydrophobe als auch hydrophile Komponenten enthalten. Sie müssen auch zur Bildung einer Dünnschicht oder Haut um das eingekapselte Gas in der Lage sein, was im allgemeinen dazu führt, dass sich die hydrophilen Gruppen nach außen orientieren und die hydrophoben Gruppen nach innen orientieren. Werden Mikrokügelchen zur Aufnahme von unlöslichem Gas erzeugt, so wird diese Orientierung durch das Vorhandensein des unlöslichen Gases während der Bildung der Mikrokügelchen vermutlich noch verstärkt.
Die derart erzeugte Schale muss auch Festigkeit aufweisen. Der Begriff Festigkeit wird in Verbindung mit dem Zustand des Materials bei der Temperatur eines der bildgebenden Untersuchung zu unterziehenden Individuums verwendet, der sowohl vom flüssigen als auch gasförmigen Zustand verschieden ist und generell als abgegrenzt, nicht-flüssig und zur Beibehaltung von Form oder Gestalt in der Lage charakterisiert wird. Zusammensetzungen, die bei der Temperatur quasiflüssig sind, bei der das Individuum der bildgebenden Untersuchung unterzogen wird (der Abbildungs-Temperatur), wie etwa bestimmte Lipide mit Übergangstemperaturen nahe (d. h. innerhalb von 15ºC) der Abbildungs-(Körper)-Temperatur, weisen einige der Eigenschaften sowohl von Flüssigkeiten als auch Feststoffen auf. Diese Quasiflüssigkeiten sind ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst und in den Begriff Feststoff einbezogen. Die Dicke einer Mikrokügelchen-Schale hängt in erster Linie von ihrer Starrheit im hergestellten Zustand ab, doch liegt allgemein im Bereich von 10 bis 500 nm.
Zu verschiedenen Klassen von Materialien, die sich zur Herstellung der Mikrokügelchen-Schalen eignen würden, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lipide, Proteine (sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Aminosäure- Polymere), synthetische organische Polymere, und Gemische oder Copolymere davon. Die Lipidschalen können entweder aus natürlich vorkommenden oder synthetischen Lipiden erzeugt werden, zum Beispiel Phospholipiden, wie etwa Phosphoglyceriden, Phosphatidinsäure, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Diphosphatidylglycerol (Cardiolipin); Glycolipiden, wie etwa Cerebrosiden, Galactocerebrosiden, Glucocerebrosiden, Sphingomyelin, Sphingolipiden, derivatisiert mit Mono-, Di- und Trihexosiden, Sulfatiden, Glycosphingolipiden und Lysophophatidylcholin; ungesättigten Fettsäuren, wie etwa Palmitoleinsäure, Oleinsäure, Vaccensäure, Linolsäure, α-Linolensäure und Arachidonsäure; gesättigten Fettsäuren, wie etwa Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachidinsäure, Beheninsäure, Lignocerinsäure und Cerotinsäure; Mono-, Di- und Triglyceriden; und Steroiden, wie etwa Cholesterol, Cholesterolester, Cholestanol, Ergosterol, Coprostanol, Squalen und Lanosterol.
In erster Linie aus Lipiden bestehende Schalen sind generell so orientiert, dass sich die hydrophobe Seite angrenzend an das Gas befindet, wohingegen die hydrophile Seite die Außenfläche der Mikrokügelchen bildet. Die hydrophilen Komponenten der meisten Lipide sind polar, d. h. kationisch oder anionisch, wie etwa die Phosphat- Komponente eines Phospholipids, oder sie können zwitterionisch sein wie bei Phosphatidylcholinen. Alternativ können Lipide ohne polare Gruppen polar gemacht werden, indem beispielsweise nicht-ionische hydrophile Komponenten eingeführt werden, wie etwa Polyethylenglycol oder Kohlenhydrate.
Bei Phospholipiden handelt es sich um eine besonders nützliche Unterklasse der lipidischen Schalenmaterialien. Die verschiedenen Phospholipide weisen charakteristische Phasenübergangstemperaturen, Tc, auf, unterhalb derer die Fettsäure-Acylketten eine quasikristalline Struktur bilden und oberhalb derer die Ketten sich in einem eher quasiflüssigen Zustand befinden. Ihre Fähigkeit zum Übergang vom quasikristallinen zum quasiflüssigen Zustand unter Temperaturanstiegen kann die Bildung von Mikrokügelchen erleichtern, die in vivo elastischer werden. Zum Beispiel kann unter Verwendung eines Phospholipids mit einer Tc, die zwischen 25ºC und 37ºC liegt, ein Mikrokügelchen mit fester Schale bei Raumtemperatur (20-25ºC) erzeugt werden, welches bei der Abbildungs-Temperatur von 37ºC weniger starr wird. Dies kann aufgrund der verbesserten Elastizität der Schale eine erhöhte Echogenität ergeben. Phospholipide mit niedrigeren Tc-Werten, zum Beispiel Dimyristoyl oder Dipentadecanoylglycero-phosphocholin, sind zur Verwendung bei dieser Ausführungsform der Erfindung besonders geeignet.
Ein Vergleich der Tc-Werte einer Reihe synthetischer L-α-Lecithine (1,2-Diacyl-snglycero-3-phosphocholine oder Glycerophosphocholine) offenbart, dass die Tc relativ zur Länge der Kohlenwasserstoffkette ständig steigt. Dipalmitoylglycerophosphocholin weist eine Tc von 41ºC auf, das Dimyristoyl-Derivat dagegen eine Tc von 23ºC. Die Diasteroyl- und Diarchidoyl-Derivate weisen Tcs von 55ºC bzw. 66ºC auf. Es wird auch in Betracht gezogen, dass Gemische von diesen und anderen Phospholipiden, die unterschiedliche Tc-Werte aufweisen, ebenfalls zur Erzielung der gewünschten Übergangs-Eigenschaften der Mikrokügelchen-Schalen verwendet werden könnten. Weiterhin können das Gas in den Mikrokügelchen und die Einführung von Fluor in das Schalenmaterial den Tc-Wert verändern. Diese Wirkung sollte bei Auswahl des Phospholipids bedacht werden.
Die Lipidschalen können auch wahlweise Proteine, Aminosäure-Polymere, Kohlenhydrate oder andere Substanzen umfassen, die zur Veränderung der Schalen- Eigenschaften wie Starrheit, Elastizität, biologische Abbaubarkeit und/oder biologische Verteilung nützlich sind. Die Aufnahme von Sterolen ist zur Erhöhung der Starrheit der Schale besonders nützlich. Die Starrheit der Schale kann auch durch Vernetzung, zum Beispiel unter Bestrahlung, erhöht werden.
Das Protein des Schalenmaterials umfasst sowohl natürlich vorkommende Proteine als auch synthetische Aminosäure-Polymere, welche beide hierin generell zur Klasse der "Proteine" der Schalenmaterialien gezählt werden. Zu Beispielen der natürlich vorkommenden Proteine zählen Gammaglobulin (human), Apotransferrin (human), Beta-Lactoglobulin, Urease, Lysozym und Albumin. Synthetische Aminosäure- Polymere können wahlweise in Form von Block- oder Zufalls-Copolymeren vorliegen, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Aminosäuren in derselben oder verschiedenen Ketten kombinieren.
Die Struktur eines Proteins oder eines Aminosäure-Polymers ist dargestellt wie folgt:
worin R die Seitenkette der Aminosäure ist (das R von Cystein z. B. ist HSCH&sub2;). Die Aminosäure-Seitenkette ist außerdem generell der fluorhaltige Abschnitt des Protein/Polymers.
Auch synthetische organische Polymere sind zur Herstellung der Schalen der Mikrokügelchen geeignet. Diese Polymere können aus einer einzigen, sich wiederholenden Einheit oder unterschiedlichen, sich wiederholenden Einheiten bestehen, die ein regelloses, alternierendes oder blockartiges Copolymer bilden. Zu diesen organischen Polymeren zählen vernetzte Polyelektrolyte, wie etwa Phosphazene, Imino-substituierte Polyphosphazene, Polyacrylsäuren, Polymethacrylsäuren, Polyvinylacetate, Polyvinylamine, Polyvinylpyridin, Polyvinylimidazol und die ionischen Salze davon. Die Vernetzung dieser Polyelektrolyte wird durch Reaktion mit mehrwertigen Ionen der entgegengesetzten Ladung erreicht. Eine weitere Stabilisierung kann durch Zugeben eines Polymers derselben Ladung wie der des Polyelektrolyts erzielt werden. Siehe US-Patentschrift Nr. 5.149.543.
Weitere synthetische organische, sich wiederholende Monomer-Einheiten, die zum Erhalt der für die Schalenmaterialien der vorliegenden Erfindung geeigneten Polymere verwendet werden können, zählen Hydroxysäuren, Lactone, Lactide, Glycolide, Acryl-enthaltende Verbindungen, Aminotriazol, Orthoester, Anhydride, Esterimide, Imide, Acetale, Urethane, Vinylalkohole, Enolketone und Organosiloxane.
Die Einführung von Fluor in das Schalenmaterial kann mittels jeglicher bekannter Methode erreicht werden. So ist zum Beispiel die Einführung von Perfluor-t-butyl- Komponenten beschrieben in US-Patentschrift Nr. 5.234.680; SYNTHESIS OF FLUOROORGANIC COMPOUNDS (Springer-Verlag, New York, 1985); Zeifman, Y. V. et al., Uspekhi Khimii (1984) 53 S. 431; und Dyatkin, B. L. et al., Uspekhi Khimii (1986) 45, S. 1205. Diese Methoden umfassen generell die Reaktion von Perfluoralkylcarbonionen mit Wirtsmolekülen wie folgt:
worin R ein Wirtsmolekül ist und X eine gute Abgangsgruppe ist, wie zum Beispiel Br, Cl, I oder eine Sulfonato-Gruppe. Nach Hinzufügen einer Abgangsgruppe zu den vorangegangenen monomeren Schalenmaterialien unter Anwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Methoden können dann Perfluor-t-butyl-Komponenten ohne weiteres in diese derivatisierten Schalenmaterialien (die Wirtsmoleküle) in der oben beschriebenen Weise eingeführt werden.
Zur Einführung der Trifluormethyl-Gruppen in verschiedene organische Verbindungen sind weitere Methoden bekannt. Bei einer derartigen Methode wird die Einführung von Trifluormethyl-Gruppen durch nukleophile Perfluoralkylierung unter Verwendung von Perfluoralkyltrialkylsilanen beschrieben (SYNTHETIC FLUORINE CHEMISTRY S. 224-245 (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1992)).
Fluor kann in jegliches der zuvor genannten Schalenmaterialien entweder in deren monomere oder polymere Form eingeführt werden. Vorzugsweise werden die Fluor- Komponenten in Monomere eingeführt, wie zum Beispiel Fettsäuren, Aminosäuren oder polymerisierbare synthetische organische Verbindungen, die dann zur anschließenden Verwendung als schalenbildendes Material für Mikrokügelchen polymerisiert werden.
Die Einführung von Fluor in das Schalenmaterial kann auch durch Herstellen der Mikrokügelchen in Gegenwart eines Perfluorkohlenstoffgases erfolgen. Werden zum Beispiel die Mikrokügelchen aus Proteinen wie Humanserumalbumin in Gegenwart eines Perfluorkohlenstoffgases wie Perfluorpropan unter Anwendung der mechanischen Kavitation (Hohlraumerzeugung) erzeugt, so wird das Fluor aus der Gasphase während der Herstellung an die Proteinschale gebunden. Das Vorhandensein des Fluors im Schalenmaterial kann später mittels einer NMR der Schalentrümmer nachgewiesen werden, die aus zerbrochenden Mikrokügelchen ausgereinigt wurden. Das Fluor kann auch in das Schalenmaterial der Mikrokügelchen unter Anwendung anderer Methoden zur Herstellung von Mikrokügelchen eingeführt werden, wie zum Beispiel einer Beschallung, Sprühtrocknung oder Emulgation.
Eine andere Methode, mittels derer Fluor in das Schalenmaterial eingeführt werden kann, besteht in der Verwendung einer fluorhaltigen reaktiven Verbindung. Die Bezeichnung "reaktive Verbindung" bezieht sich auf Verbindungen, die zur Wechselwirkung mit dem Schalenmaterial in solcher Weise in der Lage sind, dass die Fluor-Komponenten kovalent an das Schalenmaterial gebunden werden. Ist das schalenbildende Material ein Protein, so sind bevorzugte reaktive Verbindungen entweder Alkylester oder Acylhalide, die zur Reaktion mit den Aminogruppen des Proteins zur Bildung einer Amid-Verknüpfung über eine Acylierungsreaktion fähig sind (siehe ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY S. 417-418 (John Wiley & Sons, New York, New York, 4. Aufl., 1992)). Die reaktive Verbindung kann zu jedem Stadium während der Herstellung der Mikrokügelchen eingeführt werden, doch wird vorzugsweise vor Bildung der Mikrokügelchen zur Gasphase gegeben. Sollen die Mikrokügelchen zum Beispiel unter Anwendung mechanischer oder Ultraschall- Kavitations-Methoden hergestellt werden, so kann die reaktive Verbindung zur Gasphase durch Sprudeln des zur Herstellung der Mikrokügelchen zu verwendenden Gases (Ausgangs-Gas) durch eine Lösung der reaktiven Verbindung gegeben werden. Diese Lösung wird bei einer Konstanttemperatur gehalten, die zur Einführung einer gewünschten Menge an reaktiver Verbindung in die Gasphase ausreichend ist. Das resultierende Gasgemisch, das jetzt das Ausgangs-Gas und die reaktive Verbindung enthält, wird dann zur Bildung der Mikrokügelchen verwendet. Die Mikrokügelchen werden vorzugsweise durch Beschallung von Humanserumalbumin in Gegenwart des Gasgemischs gebildet, wie beschrieben in US-Patentschrift Nr. 4.957.656.
Geeignete fluorhaltige Alkylester und Acylhalide sind in Tabelle I zusammengestellt:

Tabelle I

REAKTIVE VERBINDUNG SIEDEPUNKT* (ºC)
ALKYLESTER:
Diethylhexafluorglutarat 75 (bei 3 mm Hg)
Diethyltetrafluorsuccinat 78 (bei 5 mm Hg)
Ethylheptafluorbutyrat 95
Ethylheptafluorbutyrat 80
Ethylpentafluorpropionat 76
Ethylpentafluorpropionat 60
Ethylperfluoroctanoat 176
Ethylperfluoroctanoat 159
ACYLHALIDE:
Nonafluorpentanoylchlorid 70
Perfluorpropionylchlorid 8
Hexafluorglutarylchlorid 111
Heptafluorbutyrylchlorid 38
* bei 1 atm (760 mm Hg), sofern oben nicht anders angegeben
Über die oben beschriebene Verwendung von Alkylhaliden und Säureestern hinaus ist den Fachleuten des Gebiets der synthetischen organischen Chemie wohlbekannt, dass viele weitere fluorhaltige reaktive Verbindungen synthetisiert werden können, wie etwa Aldehyde, Isocyanate, Isothiocyanate, Epoxide, Sulfonylhalide, Anhydride, Säurehalide und Alkylsulfonate, die Perfluorkohlenstoff-Komponenten (-CF&sub3;, -C&sub2;F&sub6;, -C&sub3;F&sub8;, -C(CF&sub3;)&sub3;) enthalten. Diese reaktiven Verbindungen können dann zur Einführung von Fluor-Komponenten in jegliche der zuvor genannten Schalenmaterialien durch Wählen einer Kombination verwendet werden, die zur Erzielung der kovalenten Bindung der Fluor-Komponente geeignet ist.
Es sollte ausreichend Fluor zur Verminderung der Durchlässigkeit der Mikrokügelchen-Schale gegen die wässrige Umgebung eingeführt werden. Dies führt zu einer langsameren Rate des Gasaustausches mit der wässrigen Umgebung, was sich durch einen erhöhten Druckwiderstand zeigt. Obschon die spezifische Menge an zur Stabilisierung der Mikrokügelchen erforderlichem Fluor vom Schalenmaterial und dem darin enthaltenen Gas abhängt, enthält das Schalenmaterial nach Einführung vorzugsweise 0,5 bis 20 Gewichtsprozent, und bevorzugter 1 bis 10 Gewichtsprozent Fluor.
Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind pharmakologisch geeignete Gase, d. h. biokompatible und für Menschen minimal giftige Gase. Der Begriff "biokompatibel" bezeichnet die Metabolisierbarkeit des Gases ohne Bildung toxischer Nebenprodukte. Der Begriff "Gas" bezieht sich auf jegliche Verbindung, die ein Gas ist oder zur Bildung von Gas bei der Temperatur in der Lage ist, bei der die Bilddarstellung vorgenommen wird (typischerweise bei normaler physiologischer Temperatur). Das Gas kann sich aus einer einzelnen Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen zusammensetzen. Beispiele der zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung geeigneten Gase sind Luft, O&sub2;, N&sub2;, H&sub2;, CO&sub2;, N&sub2;O; Edelgase wie Argon, Helium, Xenon; Kohlenwasserstoffgase wie Methan, Ethan, Propan, n-Butan, Isobutan und Pentan, und Perfluorkohlenstoffgase wie Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan, Perfluorisobutan und Perfluorpentan. Das Gas ist vorzugsweise ein Perfluorkohlenstoff, der in Wasser unlöslich ist, was eine Löslichkeit von weniger als 0,01 ml Gas pro ml Wasser bei atmosphärischem Druck und bei einer Temperatur von 25ºC meint. Dieser Grad der Unlöslichkeit ergibt eine maximale In-vitro-Stabilität und In-vivo-Persistenz. Die Löslichkeit kann mittels jeder geeigneten Methode bestimmt werden. Siehe zum Beispiel Wen-Yang Wen et al. (1979) J. Solubility Chem. 8(3): 225-246. Eine nicht erschöpfende Liste der bevorzugten unlöslichen Gase, die sich zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung eignen, ist in Tabelle II wiedergegeben. Tabelle II
Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung können mittels bekannter Methoden erzeugt werden, etwa den herkömmlichen Herstellungsmethoden für gasbefüllte Mikrokügelchen wie Beschallung, mechanische Kavitation unter Verwendung eines Mahlapparates, oder den Emulgationsmethoden. Beispiele dieser Methoden sind angegeben in US-Patentschriften Nrn. 4.957.656; 5.137.928; 5.190.982; 5.149.543; PCT-Anmeldungen Nrn. WO 92/17212; WO 92/18164; WO 91/09629; WO 89/06978; WO 92/17213; GB 91/00247 und WO 93/02712; und EPA-Nrn. 458.745 und 534.213.
Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung sind echogen (d. h. zum Zurückwerfen von Schallwellen in der Lage), da sie aus einem Material mit akustischen Eigenschaften zusammengesetzt sind, die wesentlich verschieden von denen von Blut oder Gewebe sind. Die Maximalgröße (mittlerer Durchmesser) der Mikrokügelchen ist durch jene Größe definiert, die durch Lungenkapillaren wandern kann. Im Falle von Menschen beträgt diese Größe typischerweise weniger als etwa 10 Mikrometer. Entsprechend ist die minimale Größe eine solche, die eine wirksame akustische Streuung bei den Ultraschallfrequenzen erreicht, die typischerweise bei der Ultraschall-Bildgebung eingesetzt werden. (Die Frequenz kann mit der Art und Weise der Bildgebung variieren, wie etwa transthorakal, transösophagial, und liegt normalerweise im Bereich von 2-12 MHz). Die Minimalgröße beträgt typischerweise etwa 0,1 Mikrometer. Die typische mittlere Größe der bei der Methode der Erfindung verwendeten Mikrokügelchen beträgt etwa 2 bis etwa 7 Mikrometer. Diese Größe erlaubt ihren Durchgang durch Kapillaren, sofern erforderlich, ohne vor Erreichen des abzubildenden Bereichs ausgefiltert zu werden (zum Beispiel, wenn eine Injektionsstelle an einer peripheren Vene verwendet wird). So sind Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung zum Perfundieren von Gewebe und Erzeugen einer erhöhten Bildschärfe von Gewebe, Organen und jeglicher Unterschiede zwischen gut perfundiertem und schwach perfundiertem Gewebe in der Lage, ohne in die Arterien oder direkt in die abzubildende Fläche injiziert zu werden. Demgemäß können sie in eine periphere Vene oder andere zuvor bestimmte Fläche des Körpers injiziert werden, was beträchtlich weniger invasiv ist als die für ein Angiogramm erforderlichen Arterien-Injektionen.
Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung können zur Bildgebung an einer breiten Vielfalt von Flächen eingesetzt werden. Zu diesen Flächen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Myokardgewebe, Leber, Milz, Nieren und andere Gewebe und Organe, die derzeit mittels Ultraschallmethoden untersucht werden. Die Verwendung der Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung kann zu einer erhöhten Bildschärfe bei den derzeit erzielbaren Abbildungen führen.
Die Suspensionen der Mikrokügelchen werden durch Verdünnen der Mikrokügelchen nach deren Herstellung auf die gewünschte Konzentration von vorzugsweise 5 · 10&sup7; bis 5 · 10&sup9; Mikrokügelchen pro ml der Suspendierflüssigkeit, die eine wässrige, biologisch kompatible Flüssigkeit sein kann, hergestellt. Beispiele solcher Flüssigkeiten sind Puffer, Kochsalzlösung, Proteinlösungen und Zuckerlösungen.
Eine Mikrokügelchen-Suspension der vorliegenden Erfindung ist sowohl in vivo als auch in vitro stabil. Die In-vivo-Stabilität stellt eine Funktion der Widerstandsfähigkeit einer konzentrierten Suspension (etwa 1 · 10&sup9; Mikrokügelchen pro ml) gegenüber einem Druck von 276 kPa (40 Pounds pro Quadrat-Inch (psi)) dar, wie durch keine bemerkbare Veränderung der Größenverteilung nach einer Minute bei diesem Druck nachgewiesen.
Bezüglich der Funktionsmethode kommt die Verwendung der vorliegenden Mikrokügelchen der von herkömmlichen Ultraschall-Kontrastmitteln gleich. Die verwendete Menge an Mikrokügelchen hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der · Wahl des Flüssigträgers (Wasser, Zuckerlösung etc.), dem Grad der erwünschten Dunkelheit, den abzubildenden Körperflächen, der Injektionsstelle und der Zahl der Injektionen. In allen Fällen werden jedoch ausreichende Mengen an Mikrokügelchen im Flüssigträger verwendet, um eine erhöhte Bildschärfe bei den erkennbaren Bildern durch Abtasten mit Ultraschall zu erzielen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Diese Beispiele sollen die Erfindung in keinster Weise einschränken.

Beispiel 1

Herstellung der Mikrokügelchen, bestehend aus einem Material auf Lpid-Basis als Kapsel um ein unlösliches Gas

Ein Phosphatidylcholin wird wie folgt fluoriert: ein -Bromcarbonsäureester (Br(CH&sub2;)nCOOCH&sub2;CH&sub3;) und Perfluorisobutylen ((CF&sub3;)&sub2;CF=CF&sub2;) werden in Gegenwart von CsF und Monoglym bei Raumtemperatur zum Erhalt eines fluorierten Esters ((CF&sub3;)&sub3;C(CH&sub2;)nCOOCH&sub2;CH&sub3;) umgesetzt. Dieser Ester wird zum Erhalt der freien Säure ((CF&sub3;)&sub3;C(CH&sub2;)nCOOH) hydrolysiert, die zum Acylchlorid ((CF&sub3;)&sub3;C(CH&sub2;)nCOCl) durch Umsetzen mit Thionylchlorid umgewandelt wird. Das Acylchlorid wird in Gegenwart von Base mit Glycerophosphocholin (1,2-Dihydroxy-3-(2'-trimethylammoniumethyl-1'-phosphat)) zum Erhalt des fluorierten Glycerophosphocholins wie folgt umgesetzt:
Die Länge der Kohlenstoffkette des verwendeten Bromcarbonsäureesters kann zum Beispiel zwischen C5 und C20 variiert werden.
Die Mikrokügelchen werden gebildet, indem zunächst die folgenden Inhaltsstoffe zum Erhalt einer Öl-in-Wasser-Emulsion emulgiert werden: fluoriertes Glycerophosphocholin (entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Lecithinen), ein unlösliches Gas (siehe zum Beispiel obige Tabelle II) und Wasser. Wahlweise enthält die Emulsion Triolein, Cholesterol und/oder α-Tocopherol. Die Homogenisierung der Emulsion wird unter Druck und bei einer Temperatur oberhalb der Übergangstemperatur des fluorierten Glycerophosphocholins vorgenommen, gefolgt von Abkühlen bei Raumtemperatur.

Beispiel 2

Herstellung eines Fluor enthaltenden synthetischen Aminosäure-Polymers unter Verwendung eines Polymers als dem Ausgangsmaterial

Ein Fluor enthaltendes Polyglutaminsäure-Polymer (Polynatrium-L-glutamatcoperfluor-t-butylpropylglutamin) wurde wie folgt hergestellt: Poly-L-glutaminsäure (MG 95.000, 1,77 g, 13,7 mmol) wurde in 40 ml Diemthylformamid (DMF) bei 50ºC gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 10 ml Pyridin, 1-Hydroxybenzotriazol (1,85 g, 13,7 mmol) und Perfluor-t-butylpropylaminhydrochlorid (2,15 g, 6,85 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde durch Eindampfen des Pyridins in vacuo anhydrisch gemacht. Dicyclohexylcarbodiimid (2,82 g, 13,7 mmol) wurde zugegeben und die Lösung bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. N,N'-Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat in auf pH 3,0 eingestelltes Wasser gegossen. Das entstandene Präzipitat wurde herausfiltriert und anschließend in Wasser bei pH 8,0 gelöst. Ungelöstes Material wurde durch Filtration entfernt (0,22 u Membranfilter). Die Polymerlösung wurde über Nacht zur Entfernung des löslichen niedermolekularen Materials dialysiert. Die Polymerlösung wurde lyophilisiert, was ein weißes schwammartiges Material ergab, bestehend in Polynatrium-L-glutamatcoperfluor-t-butylpropylglutamin.
Die resultierende fluorierte Polyglutaminsäure weist die folgende Struktur auf:
wobei die fluorierten Komponenten willkürlich in etwa 40-50% der Glutaminsäure- Reste im Polymer vorhanden sind.
Das Polymer wird dann Humanserumalbumin zugegeben, zum Beispiel in einem Verhältnis von 1 : 10, und die Mikrokügelchen wie in Beispielen 4 oder b beschrieben hergestellt.

Beispiel 3

Herstellung eines Fluor enthaltenden synthetischen Aminsäure-Polymers unter Verwendung eines Monomers als dem Ausgangsmaterial

Ein Fluor enthaltendes Polyaminosäure-Polymer (Poly-3-(perfluor-t-butyl)-2- aminobutyrsäure) wird wie folgt synthetisiert:
Bromacetaldehyddiethylacetal wird mit Perfluorisobutylen in Gegenwart von CsF und Diglym umgesetzt, was ergibt:
Die Säurehydrolyse des Diethylacetals ergibt den Aldehyd. Die Strecker-Synthese mit Ammoniumcyanid ergibt das entsprechende Aminonitril:
Die Hydrolyse ergibt das folgende Aminosäure-Derivat:
Diese Verbindung wird entweder einzeln oder mit anderen Aminosäuren unter Anwendung bekannter Methoden zum Erhalt eines fluorhaltigen synthetischen Aminosäure-Polymers polymerisiert.
Das Polymer wird dann Humanserumalbumin zum Beispiel in einem Verhältnis von 1 : 10 zugegeben und die Mikrokügelchen wie in Beispielen 4 oder 5 beschrieben hergestellt.

Beispiel 4

Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen mittels mechanischer Kavitation

Die Mikrokügelchen werden unter Verwendung der Materialien zur Formung der Schalen aus Beispiel 2 oder 3 wie folgt hergestellt: Eine 5% Lösung wird unter kontinuierlichen Vakuum über zwei Stunden hinweg entlüftet. Das Vakuum wird durch Anfüllen des entlüfteten Gefäßes mit dem zur Herstellung der Mikrokügelchen zu verwendenden Gas aufgehoben. Die Lösung wird auf eine Temperatur (etwa 68ºC) eingestellt, die zur Erzielung der lokalen Denaturierung des Albumins auf die Kavitation hin über einen In-line-Wärmeaustauscher erforderlich ist, und bei etwa 100 ml/min in eine Kolloidmühle gepumpt, zum Beispiel eine 50,8 mm (2")-Kolloidmühle (Greerco, Hudson NH, Modell W250V oder AF Gaulin, Everett, MA, Modell 2F). Das Gas wird der Flüssigkeitszufuhr bei Raumtemperatur direkt oberhalb der Einlassöffnung bei einer Flussgeschwindigkeit von etwa 120-220 ml/min zugeführt. Die Lücke zwischen dem Rotor und dem Stator wird auf etwa 0,051 mm (2/1000 inches) eingestellt und die Albuminlösung kontinuierlich bei etwa 7000 UpM bei einer Prozesstemperatur von etwa 73ºC gemahlen.
Die dichte weiße Lösung der derart hergestellten Mikrokügelchen wird sofort auf eine Temperatur von etwa 10ºC mittels eines Wärmeaustauschers gekühlt und in Glasphiolen gesammelt. Die Phiolen werden sofort versiegelt.

Beispiel 5

Verfahren zur Herstellung der Mikrokügelchen durch Schall-Kavitation

Die Mikrokügelchen werden unter Verwendung des Materials zur Bildung von Schalen aus Beispiel 2 oder 3 wie folgt hergestellt: Eine 5% Lösung wird unter kontinuierlichem Vakuum über zwei Stunden hinweg entlüftet. Das Vakuum wird durch Befüllen des evakuierten Gefäßes mit dem zur Herstellung der Mikrokügelchen zu verwendenden Gas aufgehoben. Der kontinuierliche Beschallungsvorgang wird vorgenommen, wie beschrieben bei Cerny (USP 4.957.656).
Die dichte weiße Lösung der derart hergestellten Mikrokügelchen wird sofort auf eine Temperatur von etwa 10ºC mittels eines Wärmeaustauscher abgekühlt und in Glasphiolen gesammelt. Die Phiolen werden sofort versiegelt.

Beispiel 6

Druckwiderstand der Mikrokügelchen

Mikrokügelchen mit fluorhaltigen Schalen werden wie in obigen Beispielen 4 oder 5 beschrieben hergestellt. Eine Teilmenge von 10 ml jeder Suspension, eingestellt auf eine Konzentration von etwa 1 · 10&sup9; Mikrokügelchen pro ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, wird in eine gasdichte 10 ml-Glasspritze (Hamilton, Reno NV), ausgestattet mit einem Druckmesser, eingebracht. Der gesamte Luftraum wird entfernt und der Apparat versiegelt. Ein Konstantdruck von etwa 276 kPa (40 psi) wird etwa 3 Minuten lang angelegt. Zur Messung der Partikelkonzentration und -Verteilung in der Probe wird ein Coulter-Zähler verwendet. Stabile Mikrokügelchen zeigen keine signifikante Veränderung (weniger als 10%) der mittleren Größe der Mikrokügelchen nach Anlegen des Drucks.

Beispiel 7

Elastizität

Mikrokügelchen mit fluorhaltigen Schalen wurden wie in obigen Beispielen 4 oder 5 beschrieben hergestellt. Die Mikrokügelchen wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung auf eine Konzentration von etwa 1 · 10&sup9; Mikrokügelchen pro ml verdünnt und in eine Klarzelle eingebracht, die auf dem Schritt eines Mikroskops positioniert wurde. Die Zelle wurde an eine Stickstoffquelle angeschlossen, die die Beobachtung der Wirkungen des schnellen Anlegens und Entspannens von bis zu 20,7 kPa (3 psi) Druck auf die Mikrokügelchen ermöglicht. Elastische Mikrokügelchen sind zur Rückkehr zu ihren ursprünglichen Dimensionen nach Entspannung des angelegten Drucks in der Lage.

Beispiel 8

Diagnostische Bildgebung

Mikrokügelchen, die wie in Beispielen 4 und 5 beschrieben hergestellt worden waren, wurden zur diagnostischen Bildgebung wie folgt verwendet: Bei einem Hund mit einem Gewicht von etwa 25 kg wurde eine Volumeneinheit von 1,0 ml einer Mikrokügelchen-Suspension, enthaltend 5 · 10&sup7; bis 5 · 10&sup9; Mikrokügelchen pro ml, in eine periphere (kephalische) Vene bei einer Geschwindigkeit von 0,3 ml pro Sekunde injiziert. Die Abbildungen des Herzens wurden unter Verwendung eines Hewlett Packard Sonos 1500-(Andover, MA)-Ultrasonographen im B-Modus unter Verwendung eines transthorakalen 5,0 MHz-Ultraschallkopfes erhalten. Die Bilder wurden bei einer Einzelbildrate von 30 Einzelbildern pro Sekunde während des gesamten Vorgangs aufgezeichnet und auf S-VHS-Band zur späteren Verarbeitung gespeichert.

Claims

1. Zusammensetzung zur Verwendung als ein Ultraschall-Kontrastmittel, umfassend eine wässrige Suspension von Mikrokügelchen, welche Mikrokügelchen eine Schale aus fluorhaltigem, amphiphilem, biokompatiblem Material umfassen, welche eine Mikroblase aus mindestens einem biokompatiblem Gas umgibt:

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gas eine Löslichkeit von weniger als 0,01 ml pro ml Wasser bei 25ºC und 101,325 kPa (1 atm) besitzt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Gas Perfluorkohlenstoff ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Perfluorkohlenstoffgas gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluorbutan und Perfluorpentan.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Gas ein Kohlenwasserstoff ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Kohlenwasserstoffgas gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Methan, Ethan, Propan, n-Butan, Isobutan und Pentan.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fluorhaltige, amphiphile, biokompatible Material gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lipiden, Proteinen, synthetischen organischen Polymeren und Gemischen und Copolymeren davon.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fluorhaltige, amphiphile biokompatible Material ein Lipid ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Lipid ein Phospholipid ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fluorhaltige, amphiphile biokompatible Material ein Protein ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Protein ein Humanserumalbumin ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fluorhaltige, amphiphile, biokompatible Material ein synthetisches organisches Polymer ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Schalen der Mikrokügelchen 0,5 bis 20 Gewichtsprozent Fluor enthalten.

14. Verfahren zur Herstellung druckbeständiger Mikrokügelchen, welche Mikrokügelchen eine Schale aus fluorhaltigem, amphiphilem, biokompatiblem Material umfassen, die eine Mikroblase aus mindestens einem biokompatiblen Gas umgibt, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführen von Fluor in ein amphiphiles, biokompatibles Material durch Umsetzen einer fluorhaltigen reaktiven Verbindung mit dem amphiphilen, biokompatiblen Material zum Erhalt eines fluorhaltigen, amphiphilen, biokompatiblen Schalenmaterials; und

(b) gleichzeitiges oder anschließendes Bilden der Mikrokügelchen aus dem fluorhaltigen, amphiphilen, biokompatiblen Schalenmaterial und dem biokompatiblen Gas.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die reaktive Verbindung gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aldehyden, Isocyanaten, Isothiocyanaten, Epoxiden, Alkylestern, Acylhaliden, Sulfonylhaliden, Anhydriden, Säurehaliden und Alkylsulfonaten.

16. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die reaktive Verbindung mindestens eine Perfluorkohlenstoff-Komponente enthält, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus -CF&sub3;, -C&sub2;F&sub6;, -C&sub3;F&sub8; und -C(CF&sub4;)&sub3;.

17. Verfahren nach Anspruch 14, außerdem umfassend das Bilden der Mikrokügelchen in Gegenwart mindestens eines Gases mit einer Löslichkeit von weniger als 0,01 ml pro ml Wasser bei 25ºC und 101,325 kPa (1 atm).

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Gas ein Perfluorkohlenstoffgas ist.

19. Verwendung von Mikrokügelchen, umfassend eine Schale aus fluorhaltigem, amphiphilem, biokompatiblem Material, die eine Mikroblase aus mindestens einem biokompatiblem Gas umgibt, bei der Herstellung eines Ultraschall- Kontrastmittels, umfassend eine wässrige Suspension der Mikrokügelchen, zur Verwendung bei einer Methode zur Verstärkung des Kontrastes von Geweben und Organen eines Patienten in einem Ultraschallbild.