DE69531057T2

DE69531057T2 - Elektrophile polyethylenoxide für die modifikation von polysacchariden, polypeptiden (proteinen) und oberflächen

Info

Publication number: DE69531057T2
Application number: DE69531057T
Authority: DE
Inventors: Eric K. Dolence; Chen-Ze Hu; Ray Tsang; Clifton G. Sanders; Shigemasa Osaki
Original assignee: Biosurface Engineering Technologies Inc
Current assignee: Biosurface Engineering Technologies Inc
Priority date: 1994-09-09
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2015-09-09
Also published as: EP0779894A1; EP0779894A4; JP4250202B2; EP0779894B1; DE69531057D1; JPH10505088A; WO1996007670A1; US5650234A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen für das Beschichten von Substratoberflächen, die Polyoxyalkylen-Ankermoleküle daran gebunden haben. Diese Ankermoleküle ermöglichen es bioaktiven Verbindungen wie Polysacchariden, Polypeptiden, Proteinen und anderen Arzneimitteln, kovalent an die Oberfläche gebunden zu werden. Eine solche bioaktive Verbindung ist Heparin, die solche Oberflächen thromboresistent macht. Membranbeschichtungen einschließlich dieser thromboresistenten Oberflächen sind besonders geeignet für die Verwendung in Verbindung mit biomedizinischen Geräten.
Hintergrund der Erfindung
Veröffentlichungen und andere Referenzen, auf die hier Bezug genommen wird, sind hier unter Bezugnahme aufgenommen und sind numerisch im folgenden Text angegeben und entsprechend im angehängten Literaturverzeichnis, welches gleich den Ansprüchen folgt, gruppiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf chemische Modifikationen von Aminoglycanen, Proteinen und Aminbeschichteten Oberflächen mit Hilfe des kovalenten Bindens von Polyoxyalkylen-Polymerketten, wie Polyethylenoxid (auch Polyethylenglykol genannt) und Polypropylenglykol.
Die Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) in der Biotechnologie und in biomedizinischen Anwendungen wird fortlaufend größer und ist kürzlich in einem Review besprochen worden (1). Modifikation von Enzymen (2), RGD Peptiden (3), Liposomen (4) und CD4-IgG Glycoprotein (5) sind einige der jüngsten Fortschritte in der Verwendung von Polyethylenglykol. Die Modifikation der Toxizität, Pharmakokinetik, Bioverteilung und anderer Biofunktionen sind eine Reihe der vielversprechenden Gebiete für die Verwendung dieses einfachen Polymers. Man hat bei mit PEG behandelten Oberflächen gezeigt, dass diese der Proteinablagerung widerstehen und dass sie eine verbesserte Widerstandskraft gegenüber Thrombogenizität haben, wenn sie auf Biomaterialien (6), die mit Blut in Kontakt gekommen sind, beschichtet sind. Entsprechend wären Aufbringen von auf PEG basierenden Beschichtungen auf verschiedene polymere Materialien, insbesondere für die „fortlaufende" Beschichtung von mikroporösen Hohlfasern oder anderen Plastikteilen, sehr nützlich für medizinische Geräte.
Elektrophil aktivierte Polyoxyalkylene wie PEG für durchgehende Beschichtungsanwendungen sollten den folgenden Anforderungen genügen:

1. Die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen einer mit Aminogruppen beschichteten Oberfläche und/oder einem Amino-enthaltenen Biomolekül, mit einem elektrophil aktivierten PEG, sollte unter milden Bedingungen eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit sein.
2. Idealerweise sollte das elektrophil aktivierte PEG eine angemessene Hydrolyse-Halbwertszeit in Wasser bei pH-Werten von 7.5–8.5 haben. Dies ist besonders wichtig in Bezug auf zu beschichtende polymere Substrate, die der Einwirkung von organischen Lösungsmitteln nicht standhalten.
3. Die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen einem Amino-enthaltenem Biomolekül und dem elektrophil aktivierten PEG sollte durch spektroskopische Methoden, wie kernmagnetischer Resonanz und/oder Infrarotspektroskopie, gezeigt werden, um zu zeigen, dass die Chemie wie erwartet abläuft.
4. Sollten organische Lösungsmittel im Beschichtungsprozess verwendet werden, sollte die Stabilität des elektrophil aktivierten PEG aus wirtschaftlichen Gründen abschätzbar sein.
5. Die Reaktion des elektrophil aktivierten PEG mit den biologischen Molekülen von Interesse sollte ortsgerichtet sein, so dass ein essentieller Rezeptor- und/oder aktive Stellen nicht blockiert sind. Im Gegenzug sollte eine aufrecht behaltene biologische Funktion durch eine geeignete Untersuchung gezeigt werden.
6. Die Qualität oder Funktionalität des elektrophil aktivierten PEG sollte leicht durch schnelle spektroskopische Methoden während des Herstellungsprozesses bestimmt werden.
7. Die Abgangsgruppe, die durch Acylierung der Aminogruppen freigesetzt wird, sollte eine hohe Löslichkeit im Reaktionsmedium haben, minimale Adsorption an das modifizierte Substrat haben und Idealerweise nicht toxisch sein.
8. Das elektrophil aktivierte PEG sollte eine Langzeitstabilität für Zwecke der Langzeitlagerung haben.
9. Die gebildete kovalente Bindung sollte sowohl unter den Beschichtungsbedingungen, als auch den folgenden „tatsächlichen Verwendungsbedingungen" hydrolysebeständig sein.

Um kovalent zu binden, muss die Hydroxylgruppe des PEG aktiviert sein. Dies hat man bei der Verwendung einer Vielzahl von reaktiven funktionellen Gruppen einschließlich Cyanurylat (7–9), Tresylat (10–11), von N-Hydroxysuccinimid abgeleitete aktive Ester (12–17), Carbonate (18–20), Imidazolylformiate (21–22), 4-Dithiopyridine (23), Isocyanates (24) und Epoxide (25) als erreicht berichtet. Jede der oben genannten funktionellen Gruppen besitzt Nachteile, was von der Toxizität der Abgangsgruppe, Konjugaten, die für Hydrolyse unter physiologischen Bedingungen anfällig sind, bis zu langsamen Reaktionsgeschwindigkeiten beim Konjugationsverfahren reicht. Die Stabilität von radioaktiv markierten Urethan-PEG-Derivatenist unter einer Vielzahl von physiologischen Bedingungen gezeigt worden (26). Die hydrolysebeständige Urethanbindung, die durch ausreichend reaktive PEG-Carbonate hergestellt wird, kann erhebliche Vorteile zeigen, die Hydrolyse der konjugierten kovalenten Bindung zu vermeiden. Bis jetzt haben sich Literaturberichte zur Verwendung von PEG-Carbonaten auf die Modifikation von Proteinen oder Polypeptiden konzentriert.
Die DD 287 951 offenbart ein Verfahren für die Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen auf Polyoxyalkylenglykolen und ihrer Monoalkoxy-Derivate. Sie offenbart die Aktivierung von bifunktionellen oder monofunktionellen Polyoxyalkylenglykolen durch die Einführung einer endständig aktivierten Carbonatgruppe und das Koppeln der modifizierten Produkte mit biologisch aktivem Material einschließlich Proteinen und Polypeptiden. Die Aktivierungsgruppen können eine Carbonyloxy-N-benzotriazol-Gruppe sein.
EP-A-426 488 bezieht sich auf die Herstellung von modifizierten Superoxid-Dismutasen, die als Arzneimittel für die Behandlung verschiedener Krankheiten verwendbar sind. Diese Europäische Patentanmeldung offenbart ebenso das Konzept der Modifizierung von bifunktionellen oder monofunktionellen Polyoxyalkylenglykolen durch das Einführen einer endständigen, aktivierten Carbonatgruppe und das Koppeln des modifizierten Produktes mit biologisch aktivem Material einschließlich Proteinen und Polypeptiden. Die Gruppen sind jedoch zu den Gruppen, die in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, unterschiedlich.
Desweiteren ist WO 91/15952 auf thromboresistente Beschichtungen für die Verwendung mit gas-durchlässigen biomedizinischen Geräten und Implantaten gerichtet. Die Herstellung von thromboresistenten Oberflächen durch Bereitstellen einer darauf befindlichen Amino-funktionellen Polysiloxan-Beschichtung, dann Umsetzen zuerst mit einem aktivierten Polyoxyalkylenglykol, insbesondere aktiviertem PEG, und dann mit Heparin, wodurch das Heparin auf der Oberfläche durch ein PEG-Ankermolekül gebunden wird, sind offenbart. Obwohl viele endständige reaktive Gruppen auf dem PEG benutzt werden können, bevorzugt WO91/15952 Epoxy- oder Isocyanat-Gruppen. Das Siloxan bevorzugt Epoxy- oder Isocyanat-Gruppen. Die Siloxanbeschichtung kann durch Plasmapolymerisation hergestellt werden, und die Amingruppen auf dem Polysiloxan können durch Plasmaätzen in Gegenwart von Ammoniak oder durch Plasmapolymerisation eingeführt werden.
Vorangetrieben durch unser Interesse an der Entwicklung eines fortlaufenden Beschichtungsprozesses für kovalent gebundenes Heparin auf einer mikroporösen Hohlfaseroberfläche untersuchten wir die Reaktivität einer Vielzahl von PEG-Carbonaten mit dem Aminoglycan-D-glycosamin und verschiedenen kommerziell erhältlichen Natrium-Heparinen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen mit der Formel:
bereit, wobei R₁ aus einer Gruppe, die aus einer N-2-Pyrrolidinon-Gruppe und einer 2-Oxypyrimidin-Gruppe besteht, ausgewählt wird; R₂, R₃ und R₄ unabhängig ausgewählte, niedere Alkylengruppen sind, bevorzugt mit ungefähr 2 bis ungefähr 3 Kohlenstoffatomen und gleich oder verschieden sein können; R₅ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Methyl, einer Carbonyloxy-N-2-pyrrolidinon-Gruppe und einer Carbonyl-2-oxypyrimidin-Gruppe besteht, ausgewählt wird a eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und jedes von b und c eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist, und a, b und c so ausgewählt werden, dass die Summe von a, b und c eine ganze Zahl zwischen 3 und 1000 ist.
Bevorzugt sind Verbindungen nach Formel (I), bei denen jedes von R₂, R₃ und R₄ unabhängig -CH₂CH₂- oder -CH₂CH(CH₃)- oder eine Kombination davon ist.
Diese Verbindungen können homobifunktionell oder heterobifunktionell sein und sind geeignet eine Vielzahl von bioaktiven Verbindungen zu modifizieren, als auch als ein Ankermolekül zu agieren, um eine bioaktive Verbindung an eine Membran oder eine polymere Oberfläche zu knüpfen.
Des weiteren können diese Verbindungen verwendet werden, um eine modifiziert bioaktive Verbindung, wie z. B. ein Polysaccharid oder Polypeptid oder ein anderes Arzneimittel, dass über eine Urethan-Bindung wenigstens ein Molekül Polyoxyethylen mit der Struktur:
konjugiert hat, herzustellen, wobei R₅ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Methyl, einer Carbonyloxy-N-2-pyrrolidinon-Gruppe oder einer Carbonyl-2-oxypyrimidin-Gruppe besteht, ausgewählt wird, R₂, R₃ und R₄ Ethylen sind, R₆ eine bioaktive Verbindung, die aus einem Aminoglycan Polysaccharid, einem Polypeptid, einem Protein oder einer anderen reaktiven Arzneimittelverbindung ausgewählt wird, ist, und a, b und c wie in Verbindung mit Formel (I) definiert sind. Diese modifizierten bioaktiven Verbindungen mit kovalent gebundenen Polyoxyalkylen-Gruppen, haben eine Vielzahl von in-vivo Verwendungen, da diese Substanzen eine verringerte Clearancerate der Nieren und/oder eine gesteigerte Assoziation an Zellen und in bestimmten Beispielen verringerte Immunogenizität zeigen.
Gemäß eines weiteren Aspekts stellt diese Erfindung zusätzlich ein Verfahren für das kovalente Binden eines Aminoglycan Polysaccharids, Polypeptids oder Proteins, die ein Polyoxyalkylen, wie PEG, dass mit einer Carbonyloxy-N-2-pyrrolidinon-Gruppe oder einer Carbonyl-2-oxypyrrimidin-Gruppe aktiviert ist, verwenden, an irgendeine polymere Oberfläche in Besitz von reaktiven Aminogruppen oder anderen geeigneten Nukleophilen, breit. Zusätzlich besitzen die dadurch hergestellten hetero-bifunktionellen Polyoxyalkylene verschiedene Aktivierungsgruppen an jedem Ende der Polyoxyalkylenkette, die als Linker oder Ankermoleküle nützlich sind. Die Verwendung dieser Ankermoleküle ermöglicht die Verankerung der Aminoglycan-Polysaccharide, Polypeptide oder Proteine an andere Substanzen mit einer Amino- oder geeigneten nukleophilen Gruppe.
Daher beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren für das kovalente Binden einer bioaktiven Verbindung, die aus einem Aminoglycan Polysaccharid, einem Peptid, einem Protein oder anderer pharmazeutisch aktiven Substanz ausgewählt wird, an eine polymere Oberfläche, unter Verwendung eines Polyoxyalkylen-Ankermoleküls, dass das In-Kontaktbringen eines Substrats; das eine mit Amin gepfropfte, polymere Oberfläche mit freien Aminogruppen hat, mit einer Verbindung nach Formel (I) umfasst, um eine modifizierte polymere Oberfläche mit daran kovalent gebundenen, aktivierten Polyoxyalkylengruppen zu ergeben; und In-Kontaktbringen der modifizierten polymeren Oberfläche mit der bioaktiven Verbindung.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, um eine Beschichtung herzustellen, die eine Membran, die durch die Plasmapolymerisation eines Hydrocyclosiloxan-Monomers der allgemeinen Formel:
gebildet wird, umfasst, wobei R eine aliphatische Gruppe mit 1 bis ungefähr 5 Kohlenstoffatomen ist und n eine ganze Zahl von 2 bis ungefähr 10 ist, die kovalent durch eine Carbamat-Bindung an ein Ende eines Polyoxyalkylen-Ankermoleküls gebunden wird, wobei das Ankermolekül an seinem anderen Ende durch eine Carbamat-Bindung kovalent an ein bioaktives Molekül gebunden ist. Wo das bioaktive Molekül aus Verbindungen mit antithrombotischen oder thrombolytischen Eigenschaften, wie Heparin, Gewebe-Plasmogen-Aktivator, Streptokinese, Prostaglandin und Anti-Platelet-Wirkstoffe ausgewählt wird, werden Beschichtungen mit erweiterter Thromboresistenz bereitgestellt. Alternativ ist die bioaktive Verbindung ein Metall-Chelator, wie z. B. Deferoxamin.
Beschichtungen, die durch Plasmapolymerisation eines Hydrocyclosiloxan-Monomers, das aus der Gruppe, die aus 1,3,5,7-Tetramethydrocyclotetrasiloxan, 1,3,5,7,9-Pentamethylhydrocyclopentasiloxan, 1,3,5,7,9,11-Hexamethylhydrocyclohexasiloxan und einem Gemisch aus 1,3,5,7,9-Pentamethylcyclopentasiloxan und 1,3,5,7,9,11-Hexamethylcyclohexasiloxan besteht, ausgewählt wird, hergestellt werden, sind besonders nützlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 beschreibt bestimmte elektrophile PEG Analoga.
2 beschreibt ein Reaktionsschema eines PEG Analogons der vorliegenden Erfindung mit D-Glucosaminen und N-Trimethylsilylallylamin.
3 beschreibt ein Kohlenstoff-NMR-Spektrum bezüglich natürlicher Häufigkeit (Nebenbild) und mit 95% ¹³C-angereichertem PEG 1-Heparin-Konjugat.
4 beschreibt ein Gel-Filtrations-Hochdruckflüssigkeitschromatogram (HPLC) von Natriumheparin und PEG Konjugaten, die von 1, 2, 3, 4 und 5 abgeleitet sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt verschiedene, auf Carbonat basierende Polyalkylenoxide 2 (siehe 1) nach der allgemeinen Formel:
bereit, wobei R₁ eine N-2-Pyrralidinon-Gruppe oder eine 2-Oxypyrimidin-Gruppe ist; R₂, R₃ und R₄ unabhängig ausgewählte niedere Alkylengruppen sind und gleich oder verschieden sein können; R₅ aus Wasserstoff, Methyl, einer Carbonyloxy-N-2-pyrrolidinon-Gruppe oder einer Carbonyl-2-oxypyrimidin-Gruppe ausgewählt wird; a eine ganze Zahl zwischen 1 und 1000 ist; und jedes von b und c eine ganze Zahl zwischen 0 und 1000 ist, so dass die Summe von a, b und c zwischen 3 und 1000 ist. Geeignete niedere Alkylengruppen beinhalten die, mit ungefähr 2 bis ungefähr 3 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt sind Verbindungen nach Formel (I), wobei R₂, R₃ und R₄ unabhängig -CH₂CH₂- oder -CH₂CH(CH₃)- oder eine Kombination davon sind. R₂, R₃ und R₄ sind bevorzugter Ethylen. Entsprechend eines bevorzugten Aspektes, werden a, b und c so ausgewählt, dass sie ein Molekulargewicht für den PEG Anteil von ungefähr 500 bis ungefähr 20.000, bevorzugter von 3.000 bis 4.000 ergeben.
Bevorzugte Polyoxyalkylen Analoga
Gemäß eines Aspektes, ist diese Erfindung auf die Synthese und die Verwendung neuer Carbonat-PEG-Analoga, welche in 1 als 2 und 3 beschrieben werden und Polyoxyethylen-bis-(2-hydroxypyrimidyl)-Carbonat 3, Polyoxyethylen-bis-(N-hydroxy-2-pyrrolidinonyl)-Carbonat 2 für die Modifikation und Oberflächenanbindung eines Aminoglycan Polysaccharids oder Proteins einschließen, gerichtet. Gemäß eines bevorzugten Aspekts wird die Kettenlänge des PEG-Teils so ausgewählt, dass sie einem Molekulargewicht von ungefähr 500 bis ungefähr 20.000, bevorzugter von ungefähr 3.000 bis ungefähr 4.000, entspricht.
Das kovalente Binden der Aminogruppen der Carbonate 1, 2 und 3, des PEG-Chlorameisensäureesters 4 und des von N-Hydroxysuccinimid abgeleiteten PEG-carbonats 5 (siehe U.S.-Patent 5,122,614 von Zalipsky) kann in geeignter Weise durch die Verwendung von ¹³C-kernmagnetischer Resonanz-Spektroskopie, in Verbindung mit der Synthese von ¹³C-angereicherten PEG-Carbonat-Analoga gezeigt werden. Das Auflösen eines Proteins, wie das menschliche Serum Albumin oder die Aminoglycane, wie D-Glucosamin, D-Glucosamin-6-sulfat oder Natriumheparin in Wasser bei einem pH von 8.5, gefolgt von die Zugabe von festem PEG-Carbonat bei Umgebungsraumtemperatur für 30 Minuten, gefolgt von Ultrafiltration (das menschliche Serum Albumin-PEG Konjugat und Natriumheparin verwenden eine bei 10.000 Mr abgeschnittene Membran und eine bei 500 Mr abgeschnittene Membran für D-Glucosamin und D-Glucosamin-6-Sulfat), liefert nach Lyophilisation weiße Feststoffe. Die Reaktion wurde ebenso unter Verwendung von N-Trimethylsilylallylamin in Ethanol durchgeführt (siehe 2). Die Feststoffe wurden unter Verwendung von ¹H- und ¹³C-kernmagnetischer Resonanz nach Anzeichen einer Urethanbindung charakterisiert (siehe 3 und Tabelle 1 und 4).
Die ungefähre Halbwertszeit jedes der PEG-Carbonate bei pH 7.5–8.5 wurde unter Verwendung von FT-Infrarotspektroskopie bestimmt (siehe Tabelle 2). Die Hydrolyse konnte für das Poly(oxyethylen)-bis-(2-hydroxypyrimidyl)-carbonat 3 nicht bestimmt werden, da das N-Migrationsprodukt 6 in Abwesenheit eines Aminonucleophils vorherrschend war. Analogon 2 zeigte verglichen mit 1 oder 5 eine in Wasser verlängerte Halbwertszeit. Diese in Wasser verlängerte Lebensdauer wird sich beim Beschichten von Plastikteilen, die nur wässrigen Beschichtungsbedingungen standhalten, als nützlich erweisen. Alkoholische Lösungsmittel, wie Methanol und Ethanol, reagieren schnell mit 1 unter Bildung des Alkylcarbonats. Man hat jedoch die hervorragende Stabilität von 1, vor Luftfeuchtigkeit ungeschützt, für bis zu 6 Monate in Dichloromethan gezeigt. Die Carbonate 2 und 3, als auch 5, haben, wie durch ¹H-NMR Spektroskopie gezeigt, in Ethanol eine hervorragende Stabilität.
Da die Aminoglycane, wie Heparin und andere Proteine und Peptide, Substrate für die Modifikation sind, wurde der Heparin-Aminogehalt unter Verwendung der Fluorsonde Fluorescamine bestimmt. Mehrere kommerziell erhältliche und chemisch modifizierte Heparine wurden auf den primären Aminogehalt analysiert (siehe Tabelle 3). Alle untersuchten Heparine zeigten ausreichend Aminogruppen, die für die chemische Modifikation zur Verfügung stehen, was durch Synthese von mit 95% ¹³C-angereicherten Carbonaten und durch Reaktion mit verschieden Heparinen gezeigt wurde (Tabelle 4).
HPLC-Chromatographie zur Größenexklusion wurde im Fall von Natriumheparin verwendet, um den Grad der Vermischung von PEG in die Polysaccharidkette zu bestimmen (Siehe Tabelle 4 und 4). Verglichen mit dem Ausgangsheparin, war die Vermischung von PEG in das Heparin in Übereinstimmung mit der Anzahl der vorliegenden Aminogruppen, basierend auf den Retentionszeiten, klein. Die Bildung von Carbonatgruppen zwischen PEG und Heparin-Hydroxylgruppen kann jedoch, basierend auf ¹³C-NMR Daten, nicht ausgeschlossen werden.
Die Hemmung der Faktor X Aktivität in Gegenwart von Antithrombin III („AD") wurde für die PEG-Urethan-Heparin Konjugate gezeigt. Die Fähigkeit der Konjugate den Faktor X in Gegenwart von Antithrombin III zu hemmen ist durch PEG Konjugation verringert. Es verbleibt eine ausreichende Aktivität, die darauf hinweist, dass die AT III Bindungsseite noch nicht vollständig gespalten wurde.
Eine Tetramethylcyclotetrahydrosiloxan-Plasma abgelagerte, N-Trimethylsilylallyamin-Plasma gepfropfte, mikroporöse Hohlfaser wurde mit diesen PEG Carbonaten behandelt und ausgewertet. Die Faser wurde mit Polyoxyethylen-bis-(N-hydroxybenzotriazolyl)-carbonat 1 beschichtet (Lösungsmittel: Dichloromethan, Verweildauer 10 Minuten), und anschließend mit Dichlormethan gewaschen, gefolgt von einer Behandlung mit einer pH 8.5 Lösung eines Natrium-Dowex-Kationen Austauschers, der mit Natriumheparin behandelt wurde (Verweildauer 10 Minuten), und anschließend mit Wasser gewaschen. Die Fähigkeit den Faktor X in Gegenwart von AT III zu hemmen, wurde für die Faseroberfläche, unter Verwendung des chromogenen Substrats 5-2222, ausgewertet. Die Oberflächenaktivität relativ zum USP K2 Heparinstandard erstreckte sich von 7.8–14.0 milliInternational Units pro cm² (Tabelle 5).
Polyoxyalkylen modifizierte Membrane und Beschichtungen
Polyoxyalkylen modifizierte polymere Membrane oder Beschichtungen können, unter Verwendung der vorgenannten Polyoxyalkylen-Analoga hergestellt werden. Die daraus resultierenden Membrane oder Beschichtungen umfassen eine Membran oder einen Beschichtung auf einem Substrat, das durch Plasmapolymerisation eines Hydrocyclosiloxan-Monomers der allgemeinen Formel
gebildet wird, wobei R eine aliphatische Gruppe mit 1 bis ungefähr 5 Kohlenstoffatomen ist und n eine ganze Zahl von 2 bis ungefähr 10 ist, die kovalent durch eine Carbamat-Bindung an ein Ende eines Polyoxyalkylen-Ankermoleküls gebunden ist, wobei das Ankermolekül an seinem anderen Ende durch eine Carbamat-Bindung kovalent an ein bioaktives Molekül gebunden ist.
Die allgemein übertragene United States Patentanmeldung, Seriennr. 08/152,176, „Hydrocyclosiloxan Membran hergestellt durch Plasmapolymerisationsprozess", die am 12. November 1993 eingereicht wurde, deren Offenbarung hier unter Bezugnahme aufgenommen worden ist, beschreibt bevorzugte Membrane und ihre Herstellung. Die allgemein übertragene und gleichzeitig eingereichte United States Patentanmeldung „Plasmapfropfen von Oberflächen durch Verwendung von N-geschützten Aminen" beschreibt bevorzugte N-geschützte Amine und Verfahren für ihre Verwendung für Plasmapfropfen, um amingepfropfte Membrane zu ergeben. Diese amingepfropften Membrane können dann in praktischer Weise mit dem hier beschrieben elektrophilen Carbonat-Polyoxyalkylen reagieren, um Polyoxyalkylen modifizierte Membrane oder Beschichtungen zu ergeben. Diese können im Gegenzug mit geeigneten bioaktiven Verbindungen reagieren, um die Polyoxyalkylen modifizierten Membrane oder Beschichtungen, die ein Polyoxyalkylen- Ankermolekül, das die bioaktive Verbindung mit der Membran oder der Beschichtung verbindet, haben, zu ergeben. Es ist besonders nützlich, wenn das bioaktive Molekül Heparin ist und die sich ergebende Membran oder Beschichtung verbesserte Thromboresistenz gezeigt hat. Solche Membrane oder Beschichtungen sind für die Verwendung in biomedizinischen Geräten einschließlich intravaskulärer Oxygeneratoren, geeignet.
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu unterstützen, sind die folgenden Beispiele enthalten, welche die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten beschreiben. Die folgenden Beispiele, die sich auf diese Erfindung beziehen, sollen natürlich nicht als besondere Limitierung der Erfindung ausgelegt werden und solche Variationen der Erfindung, die jetzt bekannt sind oder später entwickelt werden, die in den Bereichs des Durchschnittsfachmanns fielen, werden erachtet, in den Bereich der vorliegenden Erfindung, wie im Anschluß beansprucht, zu fallen.
Beispiel 1: Synthese von Poly(oxyethylen)-bis-(N-hydroxybenzotriazolyl)-carbonat 1. Ein all emeines Syntheseverfahren für PEG Carbonate
Es sollte angemerkt werden, dass Beispiel 1, soweit es die spezielle Synthese von Poly(oxyethylen)-bis-(N-hydroxybenzotriazolyl)-carbonat 1 betrifft, außerhalb des Bereichs der Erfindung ist und einzig aufgenommen ist, um das Verständnis zu unterstützen.
Eine azeotrope Toluollösung von Polyethylenglykol MW 3350 (1000 Gramm, 0.299 mol) in 2 Litern warmen Toluol unter Stickstoff wurde mittels einer Kanüle langsam über 1 Stunde zu einer 500 ml Lösung von Phosgen (Vorsicht: geeignete Lüftung verwenden) in Toulol (0.965 mol) und festem Natriumcarbonat (63.6 g, 0.600 mol) bei 0°C transferiert. Das Reaktionsgemisch wurde für 2 Stunden unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Eisbad wurde entleert, eine Wasserstrahlpumpe wurde angebracht und Vakuum unter starkem Rühren angelegt. Das Bad wurde mit warmen Wasser gefüllt und das Vakuum für 30 Minuten aufrechterhalten. Die Lösung wurde, um bei der Filtration zu helfen, mit 2 Litern wasserfreiem Dichlormethan verdünnt und schnell durch einen grobporösen Sinter-Glasfilter filtriert. Die Lösung des rohen Chlorameisensäureesthers wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei einer Wasserbadtemperatur von 40– 42°C eingeengt.
Der resultierende Halbfestkörper wurde sofort in 2.5 Litern trockenem Acetonitril gelöst und in einen 5 Liter 3-Halsrundkolben unter Stickstoffatmosphäre transferiert. Dieser Kolben wurde unter heftigem Rühren, durch Messung mittels eines Innenthermometers, auf 0–3°C abgekühlt. Die N-Hydroxy-Verbindung, N-Hydroxybenzotriazolmonohydrate (130.4 g, 0.965 mol), wurde in 100 ml trockenem Acetonitril und Triethylamin (135 ml, 0.965 mol) gelöst. Diese Lösung wurde tropfenweise zu der gekühlten Lösung des Chlorameisensäureesther mit solch einer Geschwindigkeit zugegeben, dass die Innentemperatur 5°C nicht überstieg. Die Reaktion wurde für 15 Minuten gerührt, dann wurde die Mischung, um Trieethylaminhydrochlorid zu entfernen, durch einen grobporösen Sinter-Glasfilter filtriert. Die Reaktionsmischung wurde, um das Acetonitril zu entfernen, unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingeengt, wobei das Wasserbad 40°C nicht übersteigen soll.
Die dicke Öl/Suspension wurde dann in 2 Litern Dichlormethan und 2 Litern destilliertem, deionisiertem Wasser gelöst. Die Mischung wurde in einen Scheidetrichter gegossen und die wässrige Phase mit drei 1 Liter Portionen Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden sukzessive mit 2.5% wässriger HCl, 1 M wässrigem Natriumcarbonat und Wasser gewaschen. Die organischen Phasen wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Absaugen durch einen grobporösen Sinter-Glasfilter gefiltert. Das Dichlormethan wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt, was das Rohcarbonat als ein Öl lieferte. Dieses Öl wurde in 2 mechanisch gerührte, 5 Liter Erlenmeyerkolben (annähernd eine Hälfte des Öls in jeden Kolben) gegossen, wobei jeder 4 Liter eisgekühltes Ethylacetat enthielt. Dichlormethan (100 ml) wurde verwendet, um den Kolben von Carbonat freizuwaschen, was dann in das Ethylacetat gegossen wurde. Die Ausfällung des Carbonats wurde durch Stellen der Kolben über Nacht in einen explosionsgeschützten Kühlschrank unterstützt. Das feste Carbonat wurde dann durch Saugfiltration gesammelt, mit einem Minimum an eiskaltem Ethylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet (916 g). Das Filtrat kann im Vakuum eingeengt werden und in Ethylacetat ausgefällt werden, um eine zweite Ausbeute an Carbonat zu erhalten. Die Ausbeute war 94% eines körnigen weißen Feststoffs.
Spektroskopische Daten: IR (TF, NaCl) 2942, 2885, 1773 und 1754 (Carbonat Carbonyl), 1494, 1465, 1434, 1359, 1344, 1302, 1281, 1258, 1241, 1148, 1113, 1061, 962, 843, 767, 748 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8.22 (ddd, J = 1, 2 und 8.4 Hz, 1H, aromatisches H), 8.00 (ddd, J = 1, 2 und 8.4 Hz, 1H, aromatisches H), 7.79 (ddd, J = 8.4 und 2 Hz, 1H, aromatisches H), 7.56 (ddd, J = 8.4 und 2 Hz, 1H, aromatisches H), 4.69 (Quintett, J = 3.3 und 9.6 Hz, vier PEG Methylenprotonen a zum Carbonatsauerstoff), 4.58 (Quintett, J = 3.3 und 9.6 Hz, vier PEG Methylenprotonen a zum Carbonatsauerstoff – mögliches Konformations-Isomer), 4.28 (sehr kleines Quintett aufgrund des hohen Molekulargewichtes des PEG Carbonats), 3.92 (Quintett, J = 3.6 und 9.3 Hz, vier PEG Methylenprotonen b zum Carbonatsauerstoff), 3.88 (m, ¹³C-Isotop-Seitenbande), 3.64 (großes Singulett, PEG Rückgrat), 3.40 (m, ¹³C-Isotop-Seitenbande); ¹³C-NMR (CDCL₃) δ 146.90 (Carbonat Carbonyl); 113.03, 132.44, 132.37, 125.98, 115.35, 114.90 (aromatische Kohlenstoffatome); 70.47, 70.24 (PEG Rückgrat); 68.12, 67.65.
Beispiel 2: Verfahren zur Synthese von Poly(oxyethylen)bis-(N-hydroxy-2-pyrrolidinonyl)-Carbonat 2
Die Titelverbindung wurde durch Befolgen des allgemeinen Verfahrens, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von N-Hydroxy-2-pyrrolindinon als N-Hydroxyverbindung, anstelle von N-Hydroxybenzotriazol-Monohydrat, hergestellt. Die Ausbeute war 93%.
Spektroskopische Daten: IR (KBr) 2880, 1790, 1732, 1465, 1358, 1278, 1113, 946, 842 cm^–1; ¹H-NMR (CDCL₃) δ 4.40 (Quintett, J = 2.7 und 9.6 Hz, vier PEG Methylenprotonen a zum Carbonatsauerstoff), 3.88 (m, ¹³C-Isotop Seitenbande), 3.76 (Quintett, J = 3.0 und 9.6 Hz, vier PEG Methylenprotonen b zum Carbonatsauerstoff), 3.64 (großes Singulett, PEG Rückgrat und 2 H überlagert, NCH₂CH₂CH₂CO) , 3.40 (m, ¹³C-Isotop Seitenbande), 2.40 (t, J = 7.2 und 8.4 Hz, 2H, NCH₂CH₂CH₂CO), 2.10–2.22 (m, 2H, NCH₂CH₂CH₂CO); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 170.41 (NCH₂CH₂CH₂CO), 152.76 (Carbonat Carbonyl), 70.14 (PEG Rückgrat), 68.56, 68.07, 46.39 (NCH₂CH₂CH₂CO), 26.43 (NCH₂CH₂CH₂CO), 14.95 (NCH₂CH₂CH₂CO).
Beispiel 3: Verfahren zur Synthese von Poly(oxyethylen)bis-(2-hydroxypyrimidyl)-carbonat 3
Der Chlorameisensäureesther von PEG 3350 4 wurde unter Verwendung des allgemeinen Verfahrens, wie in Beispiel 1 für die Synthese von Carbonat 1 beschrieben, unter Verwendung von 2-Hydroxypyrimidinhydrochlorid als N-Hydroxy-Verbindung, anstelle von N-Hydroxybenzotriazolmonohydrat wie folgt hergestellt.
Der rohe PEG Chlorameisensäureesther wurde in 2.0 l Chloroform gelöst und unter einer Stickstoffatmosphäre ausgebracht. Zu dieser Lösung wurde festes 2-Hydroxypyrimidinhydrochlorid (170 g, 1.257 mol) gegeben. Tributylamin (300 ml, 1.247 mol) wurde tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde zum Rückfluss gebracht und, unter Verwendung von Protonen-NMR in CDCl₃, die Reaktionsvervollständigung beobachtet. Die Beobachtung war entscheidend um sicherzustellen, dass das N-Migrationsprodukt 6 minimiert wird. An dem Punkt, an dem das Protonen-NMR zeigte, dass der ganze Chlorameisensäureesther verbraucht worden war, wurde die Reaktionsmischung, um das überschüssige 2-Hydroxypyrimidin-hydrochlorid auszufällen, in einem Eisbad abgekühlt. Die kalte Reaktionsmischung wurde dann durch einen grobporösen Sinter-Glasfilter in drei 5 Liter Saugkolben, die eisgekühlten Diethylether (jeweils 3 Liter) enthielten, gefiltert, was die Ausfällung des Carbonatproduktes herbeiführte. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt. An diesem Punkt war der Feststoff mit Tributylamin und seinem Hydrochloridsalz kontaminiert. Diese Kontaminate wurden aus dem Feststoff durch Einbringen des Feststoffs in eine Mitteldruckflüssigchromatographiekolonne und durch Pumpen von eiskaltem Diethylether durch die Kolonne, bis alle Anzeichen von Tributylamin und seine Hydrochloridsalze, wie durch Protonen-NMR beobachtet, fehlten, entfernt. Der verwendete Diethylether kann im Extraktionsprozess unter Verwendung eines einfachen Rotationsverdampfers recycelt werden. Wenn alles Tributylamin und seine Hydrochloridsalze entfernt waren, wurde der Feststoff im Vakuum getrocknet, was zu einem hellgelben Feststoff führte.
Spektroskopische Daten: IR (TF, NaCl) 2885, 1775, 1735, 1630, 1465 cm^–1; ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8.54 (d, J = 4.8 Hz, 2H, Pyrimidyl), 7.16 (t, J = 4.8 Hz, 1H, Pyrimidyl), 4.20–4.10 (m, vier PEG Methylen Protonen a zum Carbonatsauerstoff), 3.68 (m, ¹³C-Isotop Seitenbande), 3.57 (großes Singulett, PEG Rückgrat), 3.20 (m, ¹³C-Isotop Seitenbande); ¹³C-NMR (CDCl₃) δ 159.8, 159.6, 159.29 (Carbonat Carbonyl), 119.28, 69.93 (PEG Rückgrat), 67.79, 66.45. Urethan-N-Umlagerungsprodukt – Polyoxethylen-bis-(1-Pyrimidyl-2-on)-carbamat 6: ¹H-NMR (CDCl₃) δ 9.19 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Pyrimidyl), 7.62 (d, J = 14.1 Hz, 1H, Pyrimidyl), 5.69 (dd, J = 8.1 und 14.1 Hz, 1H, Pyrimidyl), 4.20–4.10 (m, vier PEG Methylen Protonen α zum Carbonatsauerstoff), 3.68 (m, ¹³C-Isotop Seitenbande), 3.57 (großes Singulett, PEG Rückgrat), 3.20 (m, ¹³C-Isotop Seitenbande).
Beispiel 4: Bestimmung der Hydrolyse Halbwertszeit (t_1/2) der PEG Carbonate
In einen Kolben mit 100 ml destilliertem Wasser, mit pH 8.5, wurde, unter Anwendung des pH Stat (1.0 M wässriges Natriumhydroxyd), unter heftigem Rühren 5 Gramm festes PEG Carbonat gegeben. 10 ml Proben wurden nach Zeiten von 5, 15, 30, 60, 90, 120, 180 und 320 Minuten genommen. Jede Probe wurde sofort mit 25 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, gefiltert und eingedampft. Der Rest wurde auf einem Natriumchlorid-Wafer aufgebracht und ein FT-IR wurde erhalten. Die Intensität der Carbonat Carbonyl-Bande wurde, verglichen zur PEG Rückgratbande, die bei ungefähr 1462 cm^–1 lokalisiert wurde, gemessen. Das Verhältnis der Bandenintensität wurde gegen die Zeit geplottet. Der Zeitpunkt, bei welchem die Carbonat Bandenintensität sich verglichen mit dem Anfangscarbonat um 50% verringert hatte, wurde als die ungefähre Hydrolyse-Halbwertszeit bei pH 8.5 bestimmt.
Beispiel 5: Kopplung von PEG Carbonaten mit D-Glucosaminen, Natriumheparinen und menschlichem Serum Albumin (HSA)
Eine Lösung von 288 mg (1.33 mmol) D-Glucosaminhydrochlorid in 10 ml destilliertem, deionisiertem Wasser wurde mit Hilfe des pH Stat (Metrohm Model 702) unter Verwendung von 0.1 M wässrigem Natriumhydroxyd auf pH 8.5 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde das PEG Carbonat (0.133 mmol) als Feststoff zugegeben und der pH Stat ermöglichte es, den pH zurück auf 8.5 zu bringen. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt, dann das Produkt durch Extraktion mit Dichlormethan oder durch Ultrafiltration (Amicon Membran YM1: mwco 500) und Lyophilisation isoliert. Die Ausbeuten waren mit Ultrafiltration für die Produktreinigung und Isolierung höher.
Die Natriumheparinreaktion mit PEG Carbonaten wurden in gleicher Weise ausgeführt, außer das gleiche Gewichtsteile PEG Carbonat und Natriumheparin verwendet wurden, um die vollständige Acylierung aller zur Verfügung stehenden freien Aminogruppen sicher zustellen. Die rohe Reaktionsmischung wurde mit destilliertem, deionisiertem Wasser, durch Verwendung von 1.5 Litern für jedes 1.0 Gramm des verwendeten PEG Carbonats, ultrafiltriert (Amicon YM1 10.000 mwco).
Beispiel 6: Kopplung des PEG Carbonats an eine Amin gepfropfte polymere Oberfläche
Das PEG Carbonat der vorliegenden Erfindung kann in geeigneter Weise an eine Plasma Amin gepfropfte Tetramethylhydrocyclotetrasiloxan KDF-190 Polypropylen-Faser (wie in der allgemein übertragenen und gleichzeitig eingereichten U.S. Patentanmeldung „Plasma Pfropf-Methoden und Verbindungen" beschrieben) entsprechend der folgenden Methode gekoppelt werden:
Die Amin gepfropfte beschichtete Faser wird entweder tauchbeschichtet oder durch eine Lösung des gewünschten PEG Carbonats in Dichlormethan, mit einer PEG Carbonat Konzentration von ungefähr 3 bis ungefähr 10% (ungefähr 4.25% ist bevorzugt), gezogen. Für das Tauchverfahren ist die Kontaktzeit ungefähr 10 Minuten. Für das Zugverfahren ist die Verweildauer ungefähr 10 Minuten. Die Faser wird dann entfernt und mit Dichlormethan gewaschen. Für das Durchzugsverfahren (fortlaufender Beschichtungsprozess) kann eine modulare Beschichtungsmaschine verwendet werden.
Beispiel 7: Kopplung der PEG Carbonat gekoppelten Faser an Heparin
Die Carbonat gekoppelte Faser, die gemäß Beispiel 6 hergestellt wurde, kann in geeigneter Weise, durch Verwendung von Verfahren ähnlich denen in Beispiel 5 beschrieben, an Heparin gekoppelt werden.
Zum Beispiel kann eine PEG Carbonat gekoppelte Faser durch einen Behälter einer Heparin-Lösung, durch eine Trockenzone und zurück auf eine Spule gezogen werden.
Beispiel 8: Bestimmung der Heparin vermittelten Antithrombin III Hemmung von Bovin Faktor X unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2222.
Die Bestimmung der Heparinaktivität der beschichteten Fasern wurde, unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Coatest^® Probenkits, dass von Helena Laboratories verkauft wird, ausgeführt. Diese Modifikationen beinhalteten die Beschallung während der Inkubationsperiode und eine Säurestopmethode, unter Verwendung von Essigsäure. Die Beschallung hatte, während" die Inkubation die Reproduzierbarkeit der Faseroberflächen gebundenen Proben vergrößerte, noch keinen Effekt auf die Lösung der löslichen Proben. Die Kalibrierungsstandardisierung bezog sich auf den kommerziell erhältlichen United States Pharmakopeia K2 Heparin Standard. Absorbtionsänderung wurde bei 405 nm überwacht. Die Probenaktivität des Lösungsheparins und Heparin-PEGs wurde als IU/mg des Festkörpers ausgedrückt. Die Aktivität des Oberflächenheparins wurde als mIU/cm² Oberflächengebiet ausgedrückt. Man hat gezeigt, dass die an Heparin gekoppelten, Plasma Amin gepfropften Tetramethylcyclotetrasiloxan KDF-190 Polypropylen Fasern, unter Verwendung der hier beschrieben PEG Carbonate, eine Aktivität des Oberflächenheparins haben, welche von ungefähr 7 bis ungefähr 14 ^mIU/cm³ reicht.
Tabelle 1. Screening von PEG Analoga für die Acylierung mit Aminen: Ausbeute^(a) und l-gebundene chemische Verschiebung (¹³C) [ppm]^(b)
Tabelle 2. Ungefähre Halbwertszeit (Minuten) der PEG Carbonate 1, 2, 3 und 5, durch FT-IR bei pH 8.5 bestimmt
Tabelle 3. Fluorescamin Analyse von verschiedenen Heparinen für primäre freie Amine
Tabelle 4. Chemische Verschiebung im ¹³C-NMR (ppm) der natürlichen Isotopenzusammensetzung und von 95% ¹³C ε Heparin und PEG-HSA Urethan Konjugate, GF-HPLC und Heparin vermittelt von Faktor Xa Aktivität
Tabelle 5. Antithrombin III vermittelte Faktor Xa Inhibierung durch Oberflächen-gebundenes Heparin^(a)
Literaturverzeichnis

1. Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (J. M. Harris, Ed.), Plenum Press New York 1992.
2. Chiu, H.; Zalipsky, S.; Kopeckova, P.; Kopacek, J. (1993) Enzymatic Activity of Chymotrypsin and Its Poly(ethylene glycol) Conjugates toward Low and High Molecular Weight Substrates, Bioconjugate Chem. 4, 290–295.
3. Braatz, J. A.; Yasuda, Y.; Olden, K.; Yamada, K. M.; Heifetz, A. H. (1993) Functional Peptide-Polyethane Conjugates with Extended Circulatory Half-Lives, Bioconjugate Chem. 4, 262–267.
4. Zalipsky, S. (1993) Synthesis of an End-Group Functionalized Polyethylene Glycol-Lipid Conjugate for preparation of Polymer-Grafted Liposomes, Bioconjugate Chem. 4, 296–299.
5. Chamow, S. M.; Kogan, T. P.; Venuti, M.; Gadek, T.; Harris, R. J.; Peers, D. H.; Mordenti, J.; Shak, S.; Ashkenazi A. (1993) Modification of CD4 Immunoadhesin with Monomethoxypoly(ethylene glycol) Aldehyde via Reductive Alkylation, Bioconjugate Chem. 4, 133–140.
6. Merrill, E. W. (1992) Poly(ethylene oxide) and blood contact: A chronicle of one laboratory, pp. 199–220. Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (J. M. Harris, Ed.), Plenum Press New York.
7. Abuchowski, A.; McCoy, J. R.; Palczuk, N. C.; van Es, T.; Davis, F. F. (1977) Effect of covalent attachment of PEG on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase, J. Biol. Chem. 252, 3582–3586.
8. Jackson, C. J. C.; Charlton, J. L.; Kuzminski, K.; Lang, G. M.; Sehon, A. H. (1987) Synthesis, isolation and characterization of conjugates of ovalbumin with PEG using cyanuric chloride as the coupling agent, Anal. Biochem. 165, 114–127.
9. Koide, A.; Kobayashi, S. (1983) Modification of amino groups in porcine pancreatic elastase with PEG in relation to binding ability towards anti-serum and to enzymatic activity, Biochem Biophys. Res. Commun. 111, 659–667.
10. Nilsson, K.; Mosbach, K. (1984) Immobilization of ligands with organic sulfonyl chlorides, Methods Enzymol. 104, 56–69.
11. Delgado, C.; Patel, J. N.; Francio, G. E.; Fisher, D. (1990) Coupling of PEG to albumin under very mild conditions by activation with tresyl chloride: characterization of the conjugate by portioning in aqueous two-phase systems, Biotechnol. Appl. Biochem. 12, 119–128.
12. Buckmann, A. F.; Morr, M.; Johansson, G. (1981) Functionalization of PEG and monomethyoxy-PEG, Makromol. Chem. 182, 1379–1384.
13. Joppich, M.; Luisi, P. L. (1979) Synthesis of glycyl-L-tryptophanylglycine substituted by PEG at both carboxy and amino end groups, Makromol. Chem. 180, 1381–1384.
14. Abuchowski, A.; Kazo, G. M.; Verhoesst, C. R.; Jr.; Van Es, T.; Kafkewitz, D.; Nucci, M. L.; Viau, A. T.; Davis, F. F. (1984) Cancer therapy with chemically modified enzymes: Anti-tumor properties of PEGasparaginase conjugates, Cancer Biochem. Biophys. 7, 175–186.
15. Katre, N. V.; Knauf, M. J.; Laird, W. J. (1987) Chemical modification of recombinant interleukin 2 by PEG increases its potency in the murine Meth A sarcoma model, Proc. Natl. Acad. Aci. U.S.A. 84, 1487–1491.
16. Kitamura, N. V.; Takahashi, T.; Yamaguchi, T.; Noguchi, A.; Takashina, K. I.; Tsurumi, H.; Inagake, M.; Toyokuni, T.; Hakamori, S. (1991) Chemical engineering of the monoclonal antibody A7 by polyethylene glycol for targeting cancer chemotherapy, Cancer Res. 51, 4310–4315.
17. Boccu, E.; Largajolli, R.; Veronese, F. M. (1983) Coupling of McPEGs to proteins via active esters, Z. Naturforsch. 38C, 94–99.
18. Zalipsky, S.; Lee, C. (1992) Use of Functionalized PEGs for modification of polypeptides, pp. 347–370. Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (J. M. Harris, Ed.), Plenum Press New York 1992.
19. Zalipsky, S.; Seltzer, R.; Menon-Rudolph, S. (1992) Evaluation of a new reagent for covalent attachment of PEG to proteins, Biotechnol. Appl. Biochem. 15, 100– 114.
20. Veronese, F. M.; Largajolli, R.; Boccu, E.; Benassi, C. A.; Schiavon, O. (1985) Activation of PEG by phenylchloroformates and modification of ribonuclease and superoxide dismutase, Appl. Biochem. Biotech. 11, 141–152.
21. Beauchamp, C. O.; Gonias, S. L.; Menapace, D. P.; Pizzo, S. V. (1983) A new procedure for the synthesis of McPEG-protein adducts: Effects on function, receptor recognition and clearance of superoxide dismutase, lactoferrin and alpha-2-macroglobulin, Anal. Biochem. 131, 25–33.
22. Berger, H.; Pizzo, S. V. (1988) Preparation of polyethylene glycol-tissue plasminogen activator adducts that retain functional activity: Characteristics and behavior in three different species, Blood 71, 1641–1647.
23. Woghiren, C. Sharma, B.; Stein, S. (1993) Protected thiol-polyethylene glycol: A new activated polymer for reversible protein modification, Bioconjugate Chem. 4, 314–318.
24. Byun, Y,; Jacobs, H. A.; Kim, S. W. (1992) Binding kinetics of thrombin and Antithrombin III with immbilized heparin using a spacer, ASAIO Journal, M649–M653.
25. Use of poly(propylene) bis-glycidyl ether: Noishiki, Y.; Kodaira, K.; Furuse, M.; Miyata, T. (1989) Method of preparing antithrombogenic medical materials, U.S. Patent 4,806,595
26. Larwood, D.; Szoka, F. (1984) Synthesis, characterization, and in vivo disposition of iodinatable polyethylene glycol derivatives: Differences in vivo as a function of chain length, J. Labelled Comp. Radiopharm. 21, 603.

Claims

Eine Verbindung der Formel:
wobei R₁ aus einer N-2-Pyrrolidinon-Gruppe oder einer 2-Oxypyrimidin Gruppe ausgewählt wird; R₂, R₃ und R₄ unabhängig ausgewählte Alkylengruppen von etwa 2 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen sind und gleich oder verschieden sein können; R₅ aus Wasserstoff, Methyl, einer Carbonyloxy-N-2-pyrrolidinon-Gruppe und einer Carbonyl-2-oxypyrimidin-Gruppe ausgewählt wird; a eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und jedes von b und c eine ganze Zahl von 0 bis 1000 ist, wobei a + b + c eine ganze Zahl von 3 bis 1000 ist.
Eine Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂, R₃ und R₄ unabhängig -CH₂CH₂- oder -CH₂CH(CH₃)- oder eine Kombination davon sind.
Eine Verbindung nach Anspruch 2, wobei R₂, R₃ und R₄ -CH₂CH₂- sind.
Eine Verbindung nach Anspruch 3, wobei R₅ so ausgewählt wird, dass es eine homobifunktionelle Verbindung ergibt.
Ein Verfahren für das kovalente Binden einer bioaktiven Verbindung, die aus einem Aminoglycan-Polysaccharid, einem Peptid und einem Protein ausgewählt wird, an eine polymere Oberfläche unter Verwendung eines Polyoxyalkylen-Ankermoleküls, das umfasst: In-Kontakt-bringen eines Substrats mit einer amingepfropften polymeren Oberfläche mit freien Aminogruppen mit einer Verbindung nach Anspruch 1 unter solchen Bedingungen umfasst, wobei die Gruppe R₅ der Verbindung nach Anspruch 1 mit einer freien Aminogruppe der polymeren Oberfläche unter Bildung einer kovalenten Bindung reagiert, um eine modifizierte polymere Oberfläche mit daran kovalent gebundenen, aktivierten Polyoxyalkylen-Gruppen zu ergeben; und In-Kontakt-bringen der modifizierten polymeren Oberfläche mit der bioaktiven Verbindung unter solchen Bedingungen, wobei die bioaktive Verbindung kovalent an das Ankermolekül gebunden wird und wobei die polymere Oberfläche eine Membran, die durch Plasma-Polymerisation eines Hydrocyclosiloxan-Monomers der allgemeinen Formel
wobei R eine aliphatische Gruppe ist, die 1 bis etwa 5 Kohlenstoffatome besitzt und n eine ganze Zahl von 2 bis etwa 10 ist, gebildet wird, umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Hydrocyclosiloxan-Monomer aus einer Gruppe, die aus 1,3,5,7-Tetramethylhydrocyclotetrasiloxan, 1,3,5,7,9-Pentamethylhydrocyclopentasiloxan, 1,3,5,7,9,11-Hexamethylhydrocyclohexasiloxan und einer Mischung aus 1,3,5,7,9-Pentamethylcyclopentasiloxan und 1,3,5,7,9,11-Hexamethylcyclohexasiloxan Monomeren besteht, ausgewählt wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die freien Aminogruppen auf die polymere Oberfläche durch Reaktion mit einem Gas eines N-geschützten ungesättigten oder cyclischen Amins in einer Plasmakammer unter Reaktionsbedingungen einer Plasma-Propfpolymerisation gepfropft wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das N-geschützte, ungesättigte oder cyclische Amin Trimethylsilylallylamin ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines thromboresistenten Überzugs, das umfasst (a) In-Kontakt-bringen eines Gegenstandes, der eine mit amingepfropfte polymere Oberfläche mit primären Aminogruppen hat, mit einer Verbindung nach Anspruch 1; und (b) In-Kontakt-bringen des Gegenstandes mit einer Heparin-Lösung, wobei die polymere Oberfläche eine Membran, die durch Plasmapolymerisation eines Hydrocyclosiloxan-Monomers der allgemeinen Formel
wobei R eine aliphatische Gruppe ist, die 1 bis etwa 5 Kohlenstoffatome besitzt und n eine ganze Zahl von 2 bis etwa 10 ist, gebildet ist, umfasst.