DE69533796T2

DE69533796T2 - Für die glutamatabhängigen chloridkanäle kodierende dna

Info

Publication number: DE69533796T2
Application number: DE69533796T
Authority: DE
Inventors: Doris F. Cully; Joseph P. Arena; Ken K. Liu; Demetrios Vassilatis
Original assignee: Columbia University in the City of New York; Merck and Co Inc
Current assignee: Columbia University in the City of New York; Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1995-05-19
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2015-05-20
Also published as: CA2191063C; JP3623798B2; ATE283368T1; WO1995032302A1; JPH10507064A; DE69533796D1; CA2191063A1; US5527703A; EP0760864A1; EP0760864B1; ES2232822T3; EP0760864A4

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Avermectine sind eine Familie von makrocyclischen Lactonen, die ursprünglich aus dem Actinomyceten Streptomyces avermitilis isoliert wurden. Das halbsynthetische Avermectin-Derivat Ivermectin (22,23-Dihydroavermectin B_1a) wird auf der ganzen Welt zur Behandlung von parasitischen Helminthen und Insektenschädlingen von Menschen und Tieren verwendet. Vor etwa 15 Jahren entdeckt, bleiben die Avermectine die wirksamsten Breitband-Endektozide mit niedriger Toxizität für den Wirt. Avermectine zeigen eine im Wesentlichen irreversible Wechselwirkung mit einer hochaffinen Stelle in Membranen von Nematoden [Schaeffer, J. M. & Haines, H. W., Biochem. Pharm. 38, 2329–2338 (1989); Cully, D. F. & Paress, P. S., MolecularPharm. 40: 326–332 (1991)] und Insekten [Rohrer, S. P., Meinke, P. T., Hayes, E. C., Mrozik, H. & Schaeffer, J. M., Proc. Natl. Acad. Sci, 89, 4168–4172 (1992)] und induzieren eine Erhöhung der Membranpermeabilität für Chlorid in Nematoden [Martin, R. J. & Pennington, A. J., Br. J. Pharmacol. 98, 747–756 (1989)], Arthropoden [Scott, R. H. & Duce, I. R., Pestic. Sci. 16, 599–604 (1985)], (Duce, I. R. & Scott, R. H., Brit. J. Pharmacol. 85, 395–401 (1985)] und Crustaceen [Zufall, F., Franke, C. & Hatt, H., J. Exp. Biol. 142, 191–205 (1989)]. Der natürliche Ligand des avermectin-sensitiven Chlorid-Kanals bleibt unklar [Turner, M. J. & Schaeffer, J. M., in Ivermectin and Abamectin (Hrsg. Campbell, W. C.), 73–88 (Springer-Verlag, New York, 1989)]. Glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle oder H-Rezeptoren wurden in Nerven und Muskeln von Arthropoden identifiziert [Lingle, C. & Marder, E., Brain Res. 212, 481–488 (1981)], [Horseman, B. G., Seymour, C., Bermudez, I. & Beadle, D. J., Neurosci. Lett. 85, 65–70 (1988)], [Wafford, K. A. & Sattelle, D. B., J. Exp. Bio. 144, 449–462 (1989)], [Lea, T. J. & Usherwood, P. N. R., Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333–350 (1973)], (Cull-Candy, S. G., J. Physiol. 255, 449–464 (1976)]. Es wurde postuliert, dass Avermectine glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle auf dem Heuschreckenmuskel aktivieren (Scott, R. H. & Duce, I. R., Pestic, Sci. 16, 599–604 (1985)].
Der Boden-Nematode Caenorhabditis elegans ist sehr sensitiv gegenüber den Avermectinen und wird als in vitro-Modell verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener anthelminthischer Verbindungen zu prüfen [Schaeffer, J. M. & Haines, H. W., Biochem. Pharm. 38, 2329–2338 (1989)]. Xenopus laevis-Oozyten, denen C. elegans-Poly(A)⁺-RNA injiziert wurde, exprimieren einen avermectin-sensitiven Chlorid-Kanal (Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S. & Cully, D. F., Mol. Pharmacol. 40, 368–374 (1991)]. Es wurde bestätigt, dass dieser Kanal auch für Glutamat sensitiv ist [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)]. Ähnlich wie bei den H-Rezeptoren aus dem Heuschreckenmuskel, wird der glutamat- und avermectin-sensitive Strom durch Ibotenat aktiviert und mit niedriger Affinität durch Picrotoxin blockiert [Scott, R. H. & Duce, I. R., Pestic, Sci. 16, 599–604 (1985)], [Lea, T. J. & Usherwood, P. N. R., Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333–350 (1973)], [Cull-Candy, S. G., J. Physiol. 255, 449–464 (1976)], [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)].
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der Avermectin-Wirkung bei Invertebraten wurde kloniert und charakterisiert und repräsentiert eine neue Klasse von liganden-gesteuerten Chlorid-Kanälen. Unter Verwendung eines rekombinanten Expressionssystems wurden zwei funktionelle DNA-Moleküle isoliert, welche für die glutamat- und avermectin-sensitiven Chlorid-Kanäle von Invertebraten codieren. Die elektrophysiologischen und strukturellen Eigenschaften dieser Proteine werden offenbart, ebenso die Aminosäure- und Nukleotidsequenz. Das rekombinante Protein ist zur Identifizierung von Modulatoren des Kanals von Nutzen. Die bei diesem Verfahren identifizierten Modulatoren eignen sich als Therapeutika, Insektizide und Anthelminthika.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
1 – Die Nukleotidsequenz von GluClα ist gezeigt.
2 – Die Nukleotidsequenz von GluClβ ist gezeigt.
3 – Die Aminosäuresequenz von GluClα ist gezeigt.
4 – Die Aminosäuresequenz von GluClβ ist gezeigt.
5 – Elektrophysiologische Eigenschaften von glutamat- und IVMPO₄-sensitiven Strömen in Xenopus-Oozyten
6 – Permeabilität und Spannungsabhängigkeit von GluClα und GluClβ
7 – Modulation des glutamat-sensitiven Stroms durch IVMPO₄
8 – Eine phylogenetische Analyse von GluClα und GluClβ ist gezeigt.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA, welche für glutamat- und avermectin-sensitive Chlorid-Kanäle (GluCl) von Invertebraten codiert, welche aus GluCl-produzierenden Zellen isoliert wurden. GluCl, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Protein, welches eine spezifische Funktion als ein durch Glutamat gesteuerter Anionenkanal ausüben kann.
Die Aminosäuresequenz von Invertebraten-GluCl war bisher nicht bekannt, ebenso nicht die Nukleotidsequenz, welche für GluCl codiert. Dies ist der erste Bericht über die Klonierung eines glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanals. Es ist auch der erste Bericht über die Klonierung eines Invertebraten-Ziels von Avermectin und eines avermectin-sensitiven Invertebraten-Chlorid-Kanals. Es wird vorausgesagt, dass alle Organismen, welche für die Avermectine sensitiv sind, die beschriebenen glutamat- und avermectin-sensitiven Kanäle enthalten werden. Invertebraten-Zellen, welche zur Bildung von GluCl in der Lage sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Muskel- oder Nervenzellen, isoliert aus Organismen, welche Sensitivität für die Avermectine zeigen. Avermectin-sensitive Lebewesen sind unterschiedlich und umfassen Invertebraten, die zu den Stämmen Arthropoda und Nematoda gehören.
Andere Zellen und Zellinien können für die Verwendung zur Isolierung von GluCl-cDNA ebenfalls geeignet sein. Die Selektion geeigneter Zellen kann durch Screening hinsichtlich GluCl-Aktivität in Zellextrakten erfolgen. GluCl-Aktivität kann mittels Durchführung eines ³H-Ivermectin-Bindungsassays (Cully und Paress, oben; Rohrer et al., oben) oder durch direkte elektrophysiologische Messung eines glutamat- und avermectin-sensitiven Chlorid-Kanals [Martin, R. J. & Pennington, A. J., Br. J. Pharmacol. 98, 747–756 (1989); Scott, R. H. & Duce, I. R., Pestic. Sci. 16, 599–604 (1985); Duce, I. R. & Scott, R. H., Brit. J. Pharmacol. 85, 395–401 (1985); Zufall, F., Franke, C. & Hatt, H. J., Exp. Biol. 142, 191–205 (1989)] überprüft werden. Zellen, welche GluCl-Aktivität in diesem Assay besitzen, könnten zur Isolierung von GluCl-DNA oder -mRNA geeignet sein.
Irgendeines aus einer Vielfalt von im Stand der Technik bekannter Verfahren kann zur molekularen Klonierung von GluCl-DNA eingesetzt werden. Diese Verfahren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, direkte funktionelle Expression der GluCl-Gene, gefolgt von der Erstellung einer GluCl-enthaltenden cDNA-Bank in einem geeigneten Expressionsvektorsystem. Ein weiteres Verfahren ist das Sceenen einer GluCl-enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer markierten Oligonukleotid-Sonde, welche anhand der Aminosäuresequenz der GluCl-Untereinheiten entwickelt wurde. Ein weiteres Verfahren besteht in dem Screenen einer GluCl-enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer partiellen cDNA, welche für die GluCl-Untereinheiten codiert. Diese partielle cDNA wird erhalten durch die spezifische PCR-Amplifizierung von GluCl-DNA-Fragmenten durch die Konstruktion von degenerierten Oligonukleotid-Primern anhand der Aminosäuresequenz der gereinigten GluCl-Untereinheiten.
Ein weiteres Verfahren ist die Isolierung von RNA aus GluCl-produzierenden Zellen und Translation der RNA in Protein mittels eines in vitro- oder in vivo-Translationssystems. Die Translation der RNA in ein Peptid oder ein Protein wird zur Bildung mindestens eines Teils des GluCl-Proteins führen, welches beispielsweise durch immunologische Reaktivität mit einem Anti-GluCl-Antikörper oder durch biologische Aktivität von GluCl-Protein identi fiziert werden kann. Bei diesem Verfahren können Pools von RNA, isoliert aus GluCl-produzierenden Zellen, hinsichtlich der Anwesenheit einer RNA, welche für mindestens einen Teil des GluCl-Proteins codiert, analysiert werden. Eine weitere Fraktionierung des RNA-Pools kann erfolgen, um die GluCl-RNA von Nicht-GluCl-RNA zu reinigen. Das nach diesem Verfahren produzierte Peptid oder Protein kann analysiert werden, um Aminosäuresequenzen bereitzustellen, welche wiederum zur Bereitstellung von Primern für die Bildung von GluCl-cDNA verwendet werden, oder die zur Translation verwendete RNA kann analysiert werden, um Nukleotidsequenzen, welche für GluCl codieren, bereitzustellen und Sonden für diese Bildung von GluCl-cDNA zu bilden. Dieses Verfahren ist im Stand der Technik bekannt und ist beispielsweise in Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, zu finden.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, dass andere Typen von Banken sowie Banken, die von anderen Zellen oder Zelltypen erstellt wurden, zur Isolierung von GluCl-codierender DNA geeignet sein mögen. Andere Typen von Banken umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, cDNA-Banken, die von anderen Zellen, von anderen Organismen als C. elegans stammen, und genomische DNA-Banken, welche YAC (künstliches Hefe-Chromosom) und Cosmid-Banken einschließen.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, dass geeignete cDNA-Banken aus Zellen oder Zellinien, welche GluCl-Aktivität aufweisen, erstellt werden können. Die Selektion von Zellen oder Zellinien zur Verwendung bei der Erstellung einer cDNA-Bank zur Isolierung von GluCl-cDNA kann erfolgen, indem zuerst die zellassoziierte GluCl-Aktivität unter Verwendung der elektrophysiologischen Messung von avermectin- und glutamat-sensitiven Chlorid-Kanälen oder eines Glutamat- oder Avermectin-Ligandenbindungsassays gemessen wird.
Die Erstellung von cDNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren erfolgen. Wohlbekannte Techniken zur Erstellung einer cDNA-Bank sind beispielsweise in Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) zu finden.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist auch unschwer ersichtlich, dass für GluCl codierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank isoliert werden kann. Die Erstellung von genomischen DNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren erfolgen. Wohlbekannte Techniken zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank sind in Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) zu finden.
Zur Klonierung des GluCl-Gens durch die obigen Methoden mag die Aminosäuresequenz von GluCl erforderlich sein. Um diese zu erhalten, kann das GluCl-Protein gereinigt und eine partielle Aminosäuresequenz mit automatischen Sequenatoren bestimmt werden. Es ist nicht erforderlich, die vollständige Aminosäuresequenz zu bestimmen, sondern die lineare Sequenz von zwei Bereichen von 6 bis 8 Aminosäuren aus dem Protein wird zur Herstellung von Primern für die PCR-Amplifizierung eines partiellen GluCl-DNA-Fragments bestimmt.
Nachdem geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert wurden, werden die DNA-Sequenzen, welche in der Lage sind, dafür zu codieren, synthetisiert. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon dazu verwendet werden, für eine spezielle Aminosäure zu codieren, und deshalb kann die Aminosäuresequenz von irgendeinem aus einem Satz ähnlicher DNA-Oligonukleotide codiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der GluCl-Sequenz identisch sein, wird jedoch zur Hybridisierung mit GluCl-DNA sogar in Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen in der Lage sein. Die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide könnten immer noch ausreichend mit der GluCl-DNA hybridisieren, um die Identifizierung und Isolierung von GluCl-codierender DNA zu erlauben. DNA, die nach diesen Verfahren isoliert wurde, kann zum Screenen von DNA-Banken aus einer Vielfalt von Zelltypen aus Invertebraten- und Vertebraten-Quellen und zur Isolierung homologer Gene verwendet werden.
Gereinigtes biologisch aktives GluCl kann mehrere verschiedene physikalische Formen aufweisen. GluCl kann als naszierendes oder unprozessiertes Polypeptid vollständiger Länge vorliegen oder als teilweise prozessierte Polypeptide oder Kombinationen prozessierter Polypeptide. Das naszierende Vollängen-GluCl-Polypeptid kann durch spezifische proteolytische Spaltungsereignisse, welche zur Bildung von Fragmenten des naszierenden Vollängen-Polypeptids führen, posttranslational modifiziert werden. Ein Fragment oder eine physikalische Assoziation von Fragmenten kann die volle biologische Aktivität aufweisen, welche mit GluCl (glutamat-gesteuerter und avermectin-gesteuerter Chlorid-Kanal) assoziiert ist, jedoch kann der Grad der GluCl-Aktivität zwischen individuellen GluCl-Fragmenten und physikalisch assoziierten GluCl-Polypeptidfragmenten variieren.
Die klonierte GluCl-DNA, welche mit den hier beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente enthält, rekombinant exprimiert und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen überführt werden, um rekombinantes GluCl herzustellen. Techniken für solche Manipulationen sind in Maniatis, T., et al., oben, vollständig beschrieben und im Stand der Technik wohlbekannt.
Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einen geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression von eukaryotischen Genen in einer Vielfalt von Wirten, wie z. B. Bakterien, einschließlich E. coli, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, und Tierzellen, eingesetzt werden.
Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebratenzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promoter ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung von RNA-Synthese veranlasst. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlasst. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
Eine Vielfalt von Säuger-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem GluCl in Säugerzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante GluCl-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und IZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielfalt von bakteriellen Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem GluCl in Bakterienzellen verwendet werden. Im Handel erhältlich bakterielle Expressionsvektoren, welche für die rekombinante GluCl-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pET-Vektoren (Novagen) und pQE-Vektoren (Qiagen).
Eine Vielfalt von Pilzzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem GluCl in Pilzzellen, wie z. B. Hefe, verwendet werden. Im Handel erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante GluCl-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen) und Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen).
Eine Vielfalt von Insektenzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem GluCl in Insektenzellen verwendet werden. Im Handel erhältliche Insektenzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Expression von GluCl geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pBlueBaclI (Invitrogen).
DNA, die für GluCl codiert, kann auch in einen Expressionsvektor zur Expression in einer rekombinanten Wirtszelle kloniert werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien, wie z. B. E. coli, Pilzzellen, wie z. B. Hefe, Säugerzellen, welche Zellinien von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagern einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, von Drosophila und Seidenraupe abgeleitete Zellinien. Zellinien, die sich von Säugerspezies ableiten, welche geeignet sein mögen und im Handel erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-Zellen und HEK-293 (ATCC CRL 1573).
Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mit irgendeiner aus einer Vielzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion, Lipofektion und Elektroporation. Die Zellen, welche Expressionsvektor enthalten, werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um festzustellen, ob sie GluCl-Protein produzieren. Die Identifizierung von GluCl-exprimierenden Wirtszellklonen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-GluCl-Antikörpern und Anwesenheit von wirtszell-assoziierter GluCl-Aktivität.
Die Expression von GluCl-DNA kann auch mit Hilfe von in vitro hergestellter synthetischer mRNA erfolgen. Synthetische mRNA oder mRNA, die aus GluCl-produzierenden Zellen isoliert wurde, kann sowohl effizient in verschiedenen zellfreien Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozytenextrakte, als auch effizient in Systemen auf Zellbasis translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Froschoozyten, wobei die Mikroinjektion in Froschoozyten bevorzugt ist.
Zur Feststellung der GluCl-DNA-Sequenz(en), welche optimale Niveaus an GluCl-Aktivität und/oder GluCl-Protein ergibt/ergeben, können GluCl-DNA-Moleküle, welche die folgenden einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, konstruiert werden: der offene Leserahmen vollständiger Länge der GluCl-cDNA, codierend für die GluClα- (52.550 kD) und GluClβ(49.900 kD)-Untereinheiten, erstreckt sich von etwa Base 51 bis etwa Base 1433 bzw. von etwa Base 14 bis etwa Base 1315 (diese Nummern entsprechen dem ersten Nukleotid des ersten Methionins und dem letzten Nukleotid vor dem ersten Stopcodon) und mehrere Konstrukte, welche Teile der für das GluCl-Protein codierenden cDNA enthalten. Alle Konstrukte können so konstruiert werden, dass sie die Gesamtheit, Teile oder nichts der 5'- oder der 3'-untranslatierten Region von GluCl-cDNA enthalten. GluCl-Aktivität und Niveaus der Proteinexpression können nach der Einführung, sowohl einzeln als auch in Kombination, dieser Konstrukte in geeignete Wirtszellen bestimmt werden. Nach der Bestimmung der GluCl-DNA-Kassette, welche eine optimale Expression in transienten Assays ergibt, wird dieses GluCl-DNA-Konstrukt in eine Vielfalt von Expressionsvektoren zur Expression in Wirtszellen einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Säugerzellen, baculovirus-infizierte Insektenzellen, E. coli, und die Hefe S. cerevisiae, überführt.
Wirtszell-Transfektanten und mikroinjizierte Oozyten können sowohl hinsichtlich der Niveaus der GluCl-Kanal-Aktivität als auch der Niveaus an GluCl-Protein nach den folgenden Verfahren einem Assay unterworfen werden. Im Falle rekombinanter Wirtszellen beinhaltet dies die Cotransfektion von einem oder möglicherweise zwei oder mehr Plasmid(en), enthaltend die GluCl-DNA, die für eine oder mehrere Untereinheiten) codiert. Im Falle von Oozyten beinhaltet dies die Coinjektion synthetischer RNAs für eine oder mehrere GluCl-Untereinheiten. Nach einem geeigneten Zeitraum, um die Expression zu ermöglichen, wird zelluläres Protein metabolisch mit beispielsweise ³⁵S-Methionin 24 h lang markiert, wonach Zellysate und Zellkulturüberstände geerntet und einer Immunpräzipitation mit polyklonalen Antikörpern, gerichtet gegen das GluCl-Protein, unterworfen werden.
Andere Verfahren zum Nachweis von GluCl-Aktivität beinhalten die direkte Messung von GluCl-Aktivität in ganzen Zellen, die mit GluCl-cDNA transfiziert wurden, oder in Oozyten, denen GluCl-mRNA injiziert wurde. Die GluCl-Aktivität wird durch spezifische Ligandenbindung und elektrophysiologische Charakteristiken der Wirtszellen, welche GluCl-DNA exprimieren, gemessen. Im Falle rekombinanter Wirtszellen, die GluCl exprimieren, können „Patch Clamp"-Spannungsklemmen-Techniken eingesetzt werden, um die Chlorid-Kanal-Aktivität zu messen und das GluCl-Protein quantitativ zu bestimmen. Im Falle von Oozyten können „Patch Clamp"- sowie Zweielektroden-Spannungsklemmen-Techniken eingesetzt werden, um die Chlorid-Kanal-Aktivität zu messen und das GluCl-Protein quantitativ zu bestimmen.
Niveaus an GluCl-Protein in Wirtszellen werden durch Immunaffinitäts- und/oder Ligandenaffinitätstechniken quantitativ bestimmt. Zellen, die GluCl exprimieren, können hinsichtlich der Anzahl der exprimierten GluCl-Moleküle einem Assay unterworfen werden, indem das Ausmaß der Bindung von radioaktivem Glutamat- oder Ivermectin an Zellmembranen gemessen wird. GluCl-spezifische Affinitätsperlen oder GluCl-spezifische Antikörper werden zur Isolierung von beispielsweise ³⁵S-Methionin-markiertem oder unmarkiertem GluCl-Protein eingesetzt. Markiertes GluCl-Protein wird mittels SDS-PAGE analysiert. Unmarkiertes GluCl-Protein wird mittels Westernblots, ELISA- oder RIA-Assays unter Verwendung von GluCl-spezifischen Antikörpern nachgewiesen.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon zur Codierung einer speziellen Aminosäure eingesetzt werden und deshalb kann die Aminosäuresequenz von irgendeinem aus einen Satz ähnlicher DNA-Olignukleotide codiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der GluCl-Sequenz identisch sein, wird jedoch in der Lage sein, mit GluCl-DNA sogar in Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren. Unter alternativen Bedingungen könnten die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide immer noch mit der GluCl-DNA hybridisieren, um die Identifizierung und Isolierung von für GluCl codierender DNA zu erlauben.
Für GluCl codierende DNA aus einem speziellen Organismus kann zur Isolierung und Reinigung von Homologen von GluCl aus anderen Organismen eingesetzt werden. Um dies zu erreichen, kann die erste GluCl-DNA mit einer Probe, welche DNA enthält, die für Homologe von GluCl codiert, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gemischt werden. Der hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert und die für die homologe DNA codierende DNA daraus gereinigt werden.
Es ist bekannt, dass es ein beträchtliches Maß an Redundanz in den verschiedenen Codons gibt, welche für spezielle Aminosäuren codieren. Deshalb betrifft diese Erfindung auch diejenigen DNA-Sequenzen, welche alternative Codons enthalten, die für die schließliche Translation der identischen Aminosäure codieren. Für die Zwecke dieser Patentbeschreibung wird eine Sequenz, die ein oder mehrere ersetztes) Codons) trägt, als Degenerationsvariante definiert werden. Ebenfalls vom Umfang dieser Erfindung eingeschlossen sind Mutationen entweder in der DNA-Sequenz oder dem translatierten Protein, welche die schließlichen physikalischen Eigenschaften des exprimierten Proteins nicht wesentlich ändern. Beispielsweise mag eine Substitution von Leucin durch Valin, Lysin durch Arginin oder Glutamin durch Asparagin keine Veränderung der Funktionalität des Polypeptids verursachen.
Es ist bekannt, dass DNA-Sequenzen, die für ein Peptid codieren, verändert werden können, so dass sie für ein Peptid mit Eigenschaften codieren, welches sich von denjenigen des in der Natur vorkommenden Peptids unterscheiden. Verfahren zur Veränderung der DNA-Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, stellengerichtete Mutagenese. Beispiele veränderter Eigenschaften umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Veränderungen der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
Wie hier verwendet, ist ein "funktionelles Derivat" von GluCl eine Verbindung, welche eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) besitzt, welche der biologischen Aktivität von GluCl im wesentlichen ähnlich ist. Der Begriff "funktionelle Derivate" soll die "Fragmente", "Varianten", "Degenerationsvarianten", "Analoga" und "Homologe" oder "chemischen Derivate" von GluCl einschließen. Der Begriff "Fragment" soll sich auf jedes Polypeptid-Subset von GluCl beziehen. Der Begriff "Variante" soll sich auf ein Molekül beziehen, das hinsichtlich Struktur und Funktion entweder dem gesamten GluCl-Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist. Ein Molekül ist "im wesentlichen ähnlich" GluCl, wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen besitzen oder wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche biologische Aktivität besitzen. Deshalb werden, wenn zwei Moleküle im wesentlichen ähnliche Aktivität besitzen, sie als Varianten betrachtet, selbst wenn die Struktur eines der Moleküle nicht im anderen wiedergefunden wird oder selbst wenn die beiden Aminosäuresequenzen nicht identisch sind. Der Begriff „analog" bezieht sich auf ein Molekül, das in der Funktion entweder dem gesamten GluCl-Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist.
Nach der Expression von GluCl in einer rekombinanten Wirtszelle kann GluCl-Protein gewonnen werden, um GluCl in aktiver Form bereitzustellen. Mehrere Reinigungsverfahren für GluCl stehen zur Verfügung und sind für den Einsatz geeignet. Wie oben für die Reinigung von GluCl aus natürlichen Quellen beschrieben, kann rekombinantes GluCl aus Zellysaten und -extrakten oder aus konditioniertem Kulturmedium gereinigt werden durch verschiedene Kombinationen von oder individuelle Anwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie, Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und Chromatographie hydrophober Wechselwirkung.
Darüber hinaus kann rekombinantes GluCl von anderen zellulären Proteinen mit Hilfe einer Immunaffinitätssäule abgetrennt werden, die mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt wurde, welche für naszierendes GluCl voller Länge, Polypeptid-Fragmente von GluCl oder GluCl-Untereinheiten spezifisch sind.
Monoklonale Antikörper gegen GluCl werden aus Säuger-Antiseren gereinigt, welche Antikörper mit Reaktivität gegen GluCl enthalten, oder werden als monoklonale Antikörper mit Reaktivität gegen GluCl unter Anwendung der Technik von Kohlen und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975), hergestellt. Ein monospezifischer Antikörper, wie hier verwendet, ist definiert als eine einzelne Antikörperspezies oder multiple Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für GluCl. Homogene Bindung, wie hier verwendet, bezieht sich auf das Vermögen der Antikörperspezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie z. B. den mit dem GluCl assoziierten, wie oben beschrieben, zu binden. GluCl-spezifische Antikörper werden induziert durch Immunisierung von Tieren wie Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferden und dgl., wobei Kaninchen bevorzugt sind, mit einer geeigneten Konzentration an GluCl entweder mit oder ohne ein Immun-Adjuvans.
Vorimmunserum wird vor der ersten Immunisierung gewonnen. Jedes Tier erhält zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg GluCl, assoziiert mit einem annehmbaren Immunadjuvans. Solche annehmbaren Adjuvanzien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, vollständiges Freund-Adjuvans, unvollständiges Freund-Adjuvans, Alaun-Präzipitat, Wasser-in-Öl-Emulsion, die Corynebacterium parvum und tRNA enthält. Die erste Immunisierung besteht aus dem GluCl in, vorzugsweise, vollständigem Freund-Adjuvans an mehreren Stellen, entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP) oder beides. Jedem Tier wird in regelmäßigen Abständen, vorzugsweise wöchentlich, Blut entnommen, um Antikörperfiter zu bestimmen. Die Tiere können nach der ersten Immunisierung Booster-Injektionen erhalten oder nicht. Diejenigen Tiere, welche Booster-Injektionen erhalten, bekommen gewöhnlich eine gleiche Menge des Antigens in unvollständigem Freund-Adjuvans auf dem gleichen Weg. Booster-Injektionen werden in etwa dreiwöchigen Intervallen gegeben, bis maximale Titer erhalten werden. Nach etwa 7 Tagen nach jeder Booster-Immunisierung oder etwa wöchentlich nach einer Einzelimmunisierung wird den Tieren Blut entnommen, das Serum gewonnen und Aliquots bei etwa –20°C gelagert.
Monoklonale Antikörper (mAb), die mit GluCl reagieren können, werden durch Immunisierung von Inzucht-Mäusen, vorzugsweise Balb/c, mit GluCl hergestellt. Die Mäuse werden auf dem IP- oder SC-Weg mit etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg, vorzugsweise etwa 1 mg, GluCl in etwa 0,5 ml Puffer oder Salzlösung, inkorporiert in einem gleichen Volumen eines annehmbaren Adjuvans wie oben erörtert, immunisiert. Vollständiges Freund-Adjuvans ist bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine erste Immunisierung am Tag 0 und etwa 3 bis etwa 30 Wochen Ruhe. Die immunisierten Mäuse erhalten eine oder mehrere Booster-Immunisierung(en) von etwa 0,1 bis etwa 10 mg GluCl in einer Pufferlösung wie phosphatgepufferter Salzlösung auf dem intravenösen (IV) Weg. Lymphozyten aus antikörper-positiven Mäusen, vorzugsweise Milz-Lymphozyten, werden durch Entfernung der Milz aus immunisierten Mäusen nach auf diesem Gebiet bekannten Standardverfahren erhalten. Hybridomzellen werden erzeugt durch Mischen der Milz-Lymphozyten mit einem geeigneten Fusionspartner, vorzugsweise Myelomzellen, unter Bedingungen, welche die Bildung stabiler Hybridome erlauben. Fusionspartner können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Maus-Myelome P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 bevorzugt sind. Die antikörper-produzierenden Zellen und Myelomzellen werden in Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bei Konzentrationen von etwa 30% bis etwa 50% fusioniert. Die fusionierten Hybridomzellen werden durch Wachstum in mit Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin ergänztem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren selektioniert. Überstandsflüssigkeiten werden aus Vertiefungen mit positivem Wachstum etwa an den Tagen 14, 18 und 21 gewonnen und durch einen Immunoassay, wie z. B. Festphasen-Immunoradioassay (SPIRA), unter Verwendung von GluCl als Antigen auf Antikörperproduktion gescreent. Die Kulturflüssigkeiten werden auch in dem Ouchterlony-Präzipitationsassay getestet, um den Isotyp der mAb zu bestimmen. Hybridomzellen aus antikörper-positiven Vertiefungen werden nach einer Technik wie der Soft-Agar-Technik von MacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, Hrsg., Academic Press, 1973, kloniert.
Monoklonale Antikörper werden in vivo produziert, indem pristan-geprimten Balb/c-Mäusen, etwa 0,5 ml pro Maus, etwa 2 × 10⁶ bis etwa 6 × 10⁶ Hybridomzellen etwa 4 Tage nach dem Primer injiziert werden. Ascites-Flüssigkeit wird etwa 8–12 Tage nach dem Zelltransfer gewonnen und die monoklonalen Antikörper werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt.
Die in vitro-Produktion von Anti-GluCl-mAb erfolgt durch Züchtung der Hybridome in DMEM mit etwa 2% fetalem Kalbsserum, um ausreichende Mengen der spezifischen mAb zu erhalten. Die mAb werden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt.
Die Antikörperfiter von Ascites- oder Hybridomkultur-Flüssigkeiten werden durch verschiedene serologische oder immunologische Assays bestimmt, welche umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Präzipitation, passive Agglutination, enzym-gekoppelte Immunosorbens-Antikörper (ELISA)-Technik und Radioimmunoassay (RIA)-Techniken. Ähnliche Assays werden eingesetzt, um die Anwesenheit von GluCl in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und Zellextrakten nachzuweisen.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist ohne weiteres ersichtlich, dass die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung monospezifischer Antikörper eingesetzt werden können, um Antikörper herzustellen, die für GluCl-Polypeptidfragmente oder naszierendes GluCl-Polypeptid vollständiger Länge oder die individuellen GluCl-Untereinheiten spezifisch sind. Konkreter ist für Fachleute unschwer ersichtlich, dass monospezifische Antikörper hergestellt werden können, welche für nur eine GluCl-Untereinheit oder den voll funktionellen glutamat-gesteuerten/avermectin-gesteuerten Chlorid-Kanal spezifisch sind.
GluCl-Antikörper-Affinitätssäulen werden hergestellt durch Zugabe der Antikörper zu Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, der mit N-Hydroxysuccinimidestern aktiviert ist, so dass die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit dem Agarosegelperlen-Träger bilden. Die Antikörper werden dann an das Gel über Amidbindungen mit dem Spacer-Arm gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gequencht. Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6), gewaschen, um jeg lichen nicht-konjugierten Antikörper oder Fremdprotein zu entfernen. Die Säule wird dann in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, die GluCl oder GluCl-Untereinheiten enthalten, werden langsam durch die Säule geleitet. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, bis die optische Dichte (A₂₈₀) bis zum Hintergrund abnimmt, dann das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) eluiert. Das gereinigte GluCl-Protein wird dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert.
Zwei DNA-Klone, mit der Bezeichnung pGluClα und pGluClβ, werden identifiziert, welche für Proteine codieren, die bei Expression in Xenopus-Oozyten einen Chlorid-Kanal bilden, der für Glutamat und Ivermectin-4-O-Phosphat (IVMPO₄) sensitiv ist. Jede Untereinheit ist zur Bildung homomerer Chlorid-Kanäle in der Lage, welche deutlich verschiedene elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften zeigen. Wenn die GluClα- und GluClβ-Untereinheiten zusammen exprimiert werden, weisen die resultierenden Eigenschaften auf eine Wechselwirkung der beiden Proteine unter Bildung heteromerer Chlorid-Kanäle in Oozyten hin. Die Coexpression von GluClα & -β führt zur Rekonstitution der Eigenschaften, welche in Oozyten beobachtet wurden, denen GluCl-codierende Poly(A)⁺-RNA injiziert wurde [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S. & Cully, D. F., Mol. Pharmacol. 40, 368–374 (1991)], [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)]. Diese umfassen: direkte Aktivierung eines Stroms mit IVMPO₄, Glutamat und Ibotenat, Desensitivierung in Gegenwart von Glutamat; Verstärkung des glutamat-sensitiven Stroms mit IVMPO₄; eine auswärts-rektifizierende I/V-Beziehung, eine Blockierung mit niedriger Affinität durch Picrotoxin und Flufenaminsäure und keine Sensitivität für GABA und Glycin.
Über glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle wurde nur in Invertebraten berichtet und sie werden auf Muskeln und Neuronenzellkörpern von Insekten, Muskeln von Krustentieren gefunden und in Oozyten von Insektenmuskel-Poly(A)⁺-RNA exprimiert [Lingle, C. & Marder, E., Brain Res. 212, 481–488 (1981)], [Horseman, B. G., Seymour, C., Bermudez, I. & Beadle, D. J., Neurosci. Lett. 85, 65–70 (1988)], [Wafford, K. A., & Sattelle, D. B., J. Exp. Biol. 144, 449–462 (1989)], [Lea, T. J. & Usherwood, P. N. R., Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333–350 (1973)], [Cull-Candy, S. G., J. Physiol. 255, 449–464 (1976)]. [Fraser, S. P., et al., Mol. Brain Res. 8, 331–341 (1990)]. Die Terminologie H (Hyperpolarisations)-Rezeptor wird verwendet, um glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle von den exzitatorischen D(Depolarisations)-Glutamat-Rezeptoren des Heuschreckenmuskels [Lea, T. J. & Usherwood, P. N. R., Comp. Gen. Pharmacol. 4, 333–350 (1973)], [Cull-Candy, S. G., J. Physiol. 255, 449–464 (1976)] zu unterscheiden. Ähnlich wie Oozyten, denen GluClα & -β-RNA injiziert wurde, werden Arthropoden-H-Rezeptoren charakteristischerweise durch Ibotenat aktiviert, mit niedriger Affinität durch Picrotoxin blockiert und werden durch GABA nicht aktiviert [Lingle, C. & Marder, E., Brain Res. 212, 481–488 (1981)], [Wafford, K. A. & Sattelle, D. B., J. Exp. Biol. 144, 449–462 (1989)], [Cull-Candy, S. G., J. Physiol. 255, 449–464 (1976)], (Lea, T. J. & Usherwood, P. N. R., Comp. Gen. Pharmacol. 4, 351–363 (1973)]. Heuschreckenmuskel-H-Rezeptoren werden direkt mit Avermectinen aktiviert, ebenso die glutamat-gesteuerten Chlorid-Kanäle, die von C. elegans-Poly(A)⁺-RNA exprimiert werden [Scott, R. H. & Duce, I. R., Pestic, Sci. 16, 599–604 (1985)], [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)]. Darüber hinaus werden glutamat-gesteuerte Chlorid-Kanäle auf Neuronenzellkörpern von Heuschrecken potenziert und direkt durch Avermectin aktiviert [Aydar, E., Hardin, L., Beadle, D. J. & Bermudez, I., Proceedings of the British Pharmacological Society, S. 24 (1993)]. Deshalb scheinen GluClα und GluClβ eine Klasse von liganden-gesteuerten Chlorid-Kanälen zu repräsentieren, welche mit Arthropoden-H-Rezeptoren verwandt sind. Diese Klasse von Kanälen repräsentiert das Ziel für Avermectine in C. elegans und könnte die anthelminthischen und Insektiziden Wirkungen von Avermectinen in anderen Organismen vermitteln.
Phylogenetische Analysen legen nahe, das GluClα und GluClβ eine einzigartige Unterklasse von liganden-gesteuerten Chlorid-Kanälen repräsentieren, welche mit den Glycin-α- und -β-, Lym-z- und Dros-rdl-Proteinen verwandt sein könnten. Obwohl diese Proteine phylogenetisch verwandt sind, sprechen sie auf unterschiedliche Liganden an und sind pharmakologisch verschieden [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P. R. & Betz, H., EMBO Journal 8, 695–700 (1989)], [ffrench-Constant, R. H., Rocheleau, T. A., Steichen, J. C. & Chalmers, A. E., Nature 363, 449–451 (1993)], [Grenningloh, G., et al., Neuron 4, 963–970 (1990)], [Hutton, M. L., Harvey, R. J., Earley, F. G. P., Barnard, E. A. & Darlison, M. G., FEBS letters 326, 112–116 (1993)]. Die Verwandtschaft der GluClα-Untereinheit mit der GluClβ-Untereinheit wird auch in der anscheinenden Konservierung von Bindungsstellen für sowohl Glutamat als auch IVMPO₄ reflektiert. Homomere GluClβ-Kanäle werden direkt durch Glutamat aktiviert, binden jedoch auch IVMPO₄, da die Aktivierung des Stroms durch Glutamat nach IVMPO₄ inhibiert ist. In homomeren GluClα-Kanälen wird der mit IVMPO₄ direkt aktivierte Strom weiter durch Glutamat aktiviert, was eine Glutamat-Bindungsstelle auf GluClα demonstriert.
Es wurde berichtet, dass Avermectine mit anderen Mitgliedern der liganden-gesteuerten Chlorid-Kanal-Familie wechselwirken. In Nematoden und Insekten blockieren Avermectine den GABA-sensitiven Strom, während bei Panzerkrebsen Avermectine direkt einen multitransmitter-gesteuerten Chlorid-Kanal (Glutamat, Acetylcholin, GABA) aktivieren [Martin, R. J. & Pennington, A. J., Br. J. Pharmacol. 98, 747–756 (1989)], [Zufall, F., Franke, C. & Hatt, H., J. Exp. Biol. 142, 191–205 (1989)], [Holden-Dye, L. & Walker, R. J., Parasitology 101, 265– 271 (1990)], [Bermudez, I., Hawkins, C. A., Taylor, A. M. & Beadle, D. J., Journal of Receptor Research 11, 221–232 (1991)]. In Oozyten, die Hühnergehirn-GABA_a-Rezeptoren exprimieren, potentieren Avermectine die GABA-Reaktion [Sigel, E. & Baur, R., Mol. Pharmacol. 32, 749–752 (1987)]. Darüber hinaus inhibieren Avermectine die Strychnin-Bindung an Säuger-Glycin-Rezeptoren (Graham, D., Pfeiffer, F. & Betz, H., Neurosci. Letters 29, 173–176 (1982)]. Jedoch sind GluClα- und GluClβ-Proteine die einzigen Mitglieder der liganden-gesteuerten Chlorid-Kanal-Familie, welche einmalige pharmakologische Eigenschaften bezüglich Glutamat und Ibotenat zeigen, und repräsentieren deshalb eine neue Subklasse der liganden-gesteuerten Ionenkanal-Familie.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Screening hinsichtlich Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, codierend für GluCl, sowie die Funktion des GluCl-Proteins in vivo modulieren. Verbindungen, welche diese Aktivitäten modulieren, können DNA, RNA, Peptide, Proteine oder organische Nicht-Protein-Moleküle sein. Verbindungen können modulieren durch Erhöhung oder Abschwächung der Expression von DNA oder RNA, welche für GluCl codiert, oder der Funktion des GluCl-Proteins. Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, codierend für GluCl, oder die Funktion des GluCl-Proteins modulieren, können mit einer Vielfalt von Assays nachgewiesen werden. Der Assay kann ein einfacher "Ja/Nein"-Assay sein, um festzustellen, ob eine Veränderung der Expression oder Funktion vorliegt. Der Assay kann quantitativ gemacht werden durch Vergleich der Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Niveaus der Expression oder Funktion in einer Standardprobe. Modulatoren, die bei diesem Verfahren identifiziert werden, sind von Nutzen als therapeutische Mittel, Insektizide und Anthelminthika.
Kits, welche GluCl-DNA, Antikörper gegen GluCl oder GluCl-Protein enthalten, können hergestellt werden. Solche Kits werden zum Nachweis von DNA, welche mit GluCl-DNA hybridisiert, oder zum Nachweis der Anwesenheit von GluCl-Protein oder -Peptidfragmenten in einer Probe verwendet. Eine solche Charakterisierung ist für eine Vielfalt von Zwecken von Nutzen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, forensische Analysen und epidemiologische Studien.
Die DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, rekombinanten Proteine und Antikörper der vorliegenden Erfindung können zum Screenen und Messen der Niveaus von GluCl-DNA, GluCl-RNA oder GiuCl-Protein eingesetzt werden. Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper eignen sich zur Formulierung von Kits, welche für den Nachweis und die Typenbestimmung von GluCl geeignet sind. Ein solcher Kit würde einen in Abteile aufgeteilten Träger umfassen, welcher dazu geeignet ist, in festem Einschluß mindestens einen Behälter zu halten. Der Träger würde weitere Reagenzien wie rekombinantes GluCl-Protein oder Anti-GluCl-Antikörper, geeignet zum Nachweis von GluCl, umfassen. Der Träger kann auch ein Nachweismittel, wie z. B. ein markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dgl., enthalten.
Nukleotidsequenzen, welche zu der für GluCl codierenden DNA-Sequenz komplementär sind, können für eine Antisense-Therapie synthetisiert werden. Diese Antisense-Moleküle können DNA, stabile Derivate von DNA, wie z. B. Phosphorothioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA wie 2'-O-Alkyl-RNA, oder andere GluCl-Antisense-Oligonukleotid-Mimetika sein. GluCl-Antisense-Moleküle können mittels Mikroinjektion, Liposomen-Verkapselung oder durch Expression von Vektoren, welche die Antisense-Sequenz beherbergen, in Zellen eingeführt werden. Eine GluCl-Antisense-Therapie kann besonders nützlich sein zur Behandlung von Krankheiten, bei denen es von Vorteil ist, die GluCl-Aktivität zu verringern.
Die GluCl-Gentherapie kann zur Einführung von GluCl in die Zellen von Zielorganismen verwendet werden. Das GluCl-Gen kann in virale Vektoren ligiert werden, welche den Transfer der GluCl-DNA durch Infektion von aufnehmenden Wirtszellen vermitteln. Geeignete virale Vektoren umfassen Retrovirus, Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vacciniavirus, Poliovirus und dgl. Alternativ kann GluCl-DNA in Zellen für die Gentherapie überführt werden durch nicht-virale Techniken, einschließlich rezeptor-vermitteltem zielgerichteten DNA-Transfer unter Verwendung von Ligand-DNA-Konjugaten oder Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugaten, Lipofektion-Membranfusion oder direkte Mikroinjektion. Diese Verfahren und Variationen davon sind sowohl für die ex vivo- als auch in vivo-GluCl-Gentherapie geeignet. GluCl-Gentherapie kann besonders von Nutzen sein für die Behandlung von Krankheiten, bei denen es von Vorteil ist, die GluCl-Aktivität zu erhöhen.
Pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen, die GluCl-DNA, GluCl-RNA oder GluCl-Protein oder Modulatoren von GluCl-Rezeptor-Aktivität umfassen, können nach bekannten Verfahren, wie z. B. die Zumischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, formuliert werden. Beispiele solcher Träger und Formulierungsverfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences zu finden. Zur Bildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die für eine effektive Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins, der DNA, RNA oder des Modulators enthalten.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden einem Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um Störungen zu behandeln oder zu diagnostizieren, bei denen eine Modulation der GluCl-verwandten Aktivität indiziert ist. Die wirksame Menge kann in Abhängigkeit von einer Vielfalt von Faktoren, wie z. B. dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsmodus. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielfalt von Wegen, wie z. B. subkutan, topisch, oral und intramuskulär, verabreicht werden.
Der Begriff "chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, welches zusätzliche chemische Gruppierungen enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Gruppierungen können die Löslichkeit, Halbwertszeit, Absorption etc. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppierungen unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Grundmoleküls herabsetzen. Beispiele solcher Gruppierungen sind in einer Vielzahl von Texten, wie z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben.
Verbindungen, die nach den hier offenbarten Verfahren identifiziert wurden, können allein in geeigneten, in Routinetests festgelegten Dosierungen eingesetzt werden, um eine optimale Inhibierung des GluCl-Rezeptors oder dessen Aktivität zu erhalten, während eine etwaige potentielle Toxizität minimiert wird. Darüber hinaus kann eine gemeinsame Verabreichung oder sequentielle Verabreichung anderer Wirkstoffe wünschenswert sein.
Die vorliegende Erfindung hat auch die Aufgabe, geeignete topische, orale, systemische und parenterale pharmazeutische Formulierungen zur Verwendung in den neuen Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Die Zusammensetzungen, welche erfindungsgemäß identifizierte Verbindungen als aktiven Bestandteil zur Verwendung bei der Modulierung von GluCl-Rezeptoren enthalten, können in einer breiten Vielfalt von therapeutischen Dosierungsformen in herkömmlichen Vehikeln zur Verabreichung verabreicht werden. Beispielweise können die Verbindungen in solchen oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen zur zeitlich bestimmten Freisetzung und verzögerten Freisetzung), Dragees, Pulvern, Granula, Elixieren, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirupen und Emulsionen oder mittels Injektion verabreicht werden. Gleichermaßen können sie auch in intravenöser Form (sowohl Bolus als auch Infusion), intraperitonealer, subkutaner, topischer Form, mit oder ohne Okklusion, oder intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei alle Verwendungsformen Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt sind. Eine wirksame, jedoch nicht toxische Menge der gewünschten Verbindung kann als GluCl-Modulator eingesetzt werden.
Die tägliche Dosis der Produkte kann über einen breiten Bereich von 0,01 bis 1.000 mg pro Patient pro Tag variiert werden. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen vorzugsweise in Form von eingekerbten oder nicht eingekerbten Tabletten, enthaltend 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 und 50,0 Milligramm des aktiven Bestandteils, für die symptomatische Einstellung der Dosierung auf den zu behandelnden Patienten bereitgestellt. Eine wirksame Menge des Arzneiwirkstoffs wird gewöhnlich in einem Dosierungsniveau von etwa 0,0001 mg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag bereitgestellt. Der Bereich ist spezieller von etwa 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Dosierungen der GluCl-Rezeptor-Modulatoren werden eingestellt, wenn sie kombiniert werden, um gewünschte Effekte zu erzielen. Andererseits können die Dosierungen dieser verschiedenen Mittel unabhängig voneinander optimiert und kombiniert werden, um ein synergistisches Ergebnis zu erzielen, wobei die Pathologie geringer ist als sie es wäre, wenn jedes Mittel allein eingesetzt würde.
Vorteilhafterweise können Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer einzigen Tagesdosis verabreicht werden oder die gesamte Tagesdosis kann in aufgeteilten Dosen von zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Ferner können Verbindungen für die vorliegende Erfindung in intranasaler Form mittels topischer Anwendung geeigneter intranasaler Vehikel oder über transdermale Routen verabreicht werden, wobei solche Formen transdermaler Hautpflaster verwendet werden, die Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Zur Verabreichung in Form eines transdermalen Abgabesystems wird die Dosierungsverabreichung natürlich eher kontinuierlich als intermittierend während des Verabreichungsplans erfolgen.
Für eine Kombinationsbehandlung mit mehr als einem Wirkstoff, wobei die Wirkstoffe in separaten Dosierungsformulierungen vorliegen, können die Wirkstoffe gleichzeitig verabreicht werden oder sie können jeweils zu separaten versetzten Zeiten verabreicht werden.
Der Dosierungsplan unter Anwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird gemäß einer Vielfalt von Faktoren gewählt, welche Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Zustands, den Verabreichungsweg, die Nieren- und Leberfunktion des Patienten und die speziell eingesetzte Verbindung einschließen. Ein durchschnittlich befähigter Arzt oder Veterinärmediziner kann unschwer die wirksame Menge des Arzneiwirkstoffes, welche zur Verhinderung, Entgegenwirkung oder zum Stillstandbringen des Krankheitsfortschritts erforderlich ist, feststellen und verschreiben. Eine optimale Präzision bei der Erreichung von Arzneiwirkstoffkonzentrationen innerhalb des Bereichs, welche eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert einen Plan, der auf der Kinetik der Verfügbarkeit des Arzneiwirkstoffs für Zielstellen basiert. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung eines Arzneiwirkstoffs.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die hier detailliert beschriebenen Verbindungen den aktiven Bestandteil bilden und werden typischer Weise in Mischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Exzipienten oder Trägern (zusammen hier als "Träger"-Materialien bezeichnet), die in geeigneter Weise im Hinblick auf die vorge sehene Verabreichungsform ausgewählt sind, d. h. orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirupe und dgl., und in Einklang mit herkömmlicher pharmazeutischer Praxis verabreicht.
Beispielsweise kann für die orale Verabreichung in Form einer Tablette oder einer Kapsel die aktive Wirkstoffkomponente mit einem oralen nicht-toxischen pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger wie Ethanol, Glycerin, Wasser und dgl. kombiniert werden. Darüber hinaus können erwünschtenfalls oder erforderlichenfalls geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Zerfallsmittel und Färbemittel ebenfalls in die Mischung inkorporiert werden. Geeignete Bindemittel umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Gelatine, natürliche Zucker wie Glucose oder Beta-Lactose, Maissüßstoffe, natürliche und synthetische Gummiarten wie Akaziengummi, Tragant oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und dgl. Gleitmittel, die in diesen Dosierungsformen eingesetzt werden, umfassen, ohne Beschränkung, Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dgl. Zerfallsmittel schließen ein, ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dgl.
Für flüssige Formen kann die aktive Arzneiwirkstoffkomponente in geeignet aromatisierten Suspendier- oder Dispergiermitteln, wie z. B. den synthetischen und natürlichen Gummiarten, beispielsweise Tragant, Akaziengummi, Methylcellulose und dgl., kombiniert werden. Andere Dispergiermittel, welche eingesetzt werden können, umfassen Glycerin und dgl. Für die parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen erwünscht. Isotonische Präparate, welche im allgemeinen geeignete Konservierungsstoffe enthalten, werden eingesetzt, wenn eine intravenöse Verabreichung erwünscht ist.
Topische Präparate, welche die aktive Wirkstoffkomponente enthalten, können mit einer Vielzahl von Trägermaterialien gemischt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z. B. Alkohole, Aloe Vera-Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A- und E-Öle, Mineralöl, PPG2-Myristylpropionat und dgl., um z. B. alkoholische Lösungen, topische Reinigungsmittel, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotionen und Shampoos in Creme- oder Gel-Formulierungen zu bilden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Form von Liposom-Abgabesystemen verabreicht werden, wie z. B. kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln. Liposomen können aus einer Vielfalt von Phospholipiden, wie z. B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern als individuelle Träger, an welche die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind, abgegeben werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit löslichen Polymeren als gezielte Arzneiwirkstoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoylresten, einschließen. Ferner können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung an eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt werden, welche zur Erzielung einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneiwirkstoffs geeignet sind, beispielsweise Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipathische Block-Copolymere von Hydrogelen.
Die Verbindungen sind antiparasitische Mittel gegen Endo- und Ektoparasiten, insbesondere Helminthen und Arthropoden, welche zahlreiche parasitische Erkrankungen bei Menschen, Tieren und Pflanzen verursachen.
Parasitische Erkrankungen können durch entweder Endoparasiten oder Ektoparasiten verursacht werden. Endoparasiten sind diejenigen Parasiten, welche innerhalb des Körpers des Wirts leben, entweder innerhalb eines Organs (wie z. B. der Magen, die Lungen, das Herz, die Därme etc.) oder einfach unter der Haut. Ektoparasiten sind diejenigen Parasiten, welche auf der äußeren Oberfläche des Wirts leben, jedoch noch Nährstoffe vom Wirt beziehen.
Die endoparasitischen Erkrankungen, die allgemein als Helminthiasis bezeichnet werden, beruhen auf einer Infektion des Wirts mit parasitischen Würmern, die als Helminthen bekannt sind. Helminthiasis ist ein verbreitetes und weltweit ernsthaftes ökonomisches Problem infolge der Infektion von domestizierten Tieren wie Schweinen, Schafen, Pferden, Rindern, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Viele dieser Infektionen werden von der Gruppe von Würmern verursacht, welche als Nematoden beschrieben werden, die Erkrankungen bei verschiedenen Tierspezies auf der ganzen Welt verursachen. Diese Erkrankungen sind häufig schwerwiegend und können zum Tod des infizierten Tieres führen. Die häufigsten Gattungen von Nematoden, welche die obengenannten Tiere infizieren, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris und Parascaris. Viele Parasiten sind speziesspezifisch (infizieren nur einen Wirt) und haben meistens auch eine bevorzugte Infektionsstelle innerhalb des Tieres. So infizieren Haemonchus und Ostertapia hauptsächlich den Magen, während Nematodirus und Cooperia hauptsächlich den Darm angreifen. Andere Parasiten bevorzugen den Aufenthalt im Herz, den Augen, Lungen, Blutgefäßen und dgl., während noch andere subkutane Parasiten sind. Helminthiasis kann zu Schwäche, Gewichtsverlust, Anämie, Darmschädigung, Unterernährung und Schädigung anderer Organe führen. Wenn sie unbehandelt bleiben, können diese Erkrankungen zum Tod des Tieres führen.
Infektionen durch ektoparasitische Arthropoden wie Zecken, Milben, Läuse, Stallfliegen, Hornfliegen, Schmeissfliegen, Flöhe und dgl. sind ebenfalls ein schwerwiegendes Problem. Die Infektion durch diese Parasiten führt zu Blutverlust, Hautläsionen und kann das normale Essverhalten stören und somit Gewichtsverlust verursachen. Diese Infektionen können auch zu einer Übertragung ernsthafter Krankheiten wie Enzephalitis, Anaplasmose, Schweinepocken und dgl., welche tödlich sein können, führen.
Tiere können von mehreren Parasitenspezies gleichzeitig infiziert werden, da die Infektion durch einen Parasiten das Tier schwächen und für eine Infektion durch eine zweite Parasitenspezies anfälliger machen kann. Somit ist eine Verbindung mit einem breiten Aktivitätsspektrum besonders vorteilhaft bei der Behandlung dieser Erkrankungen. Die Verbindungen dieser Erfindung besitzen Aktivität gegen diese Parasiten und darüber hinaus auch gegen Dirofilaria bei Hunden, Nematospiroides und Syphacia bei Nagern, Stechinsekten und wandernde Diptera-Larven wie Hypoderma sp. bei Rindern und Gastrophilus bei Pferden.
Die Verbindungen sind auch von Nutzen gegen Endo- und Ektoparasiten, welche parasitische Erkrankungen bei Menschen verursachen. Beispiele solcher Endoparasiten, welche den Menschen infizieren, umfassen gastro-intestinale Parasiten der Gattungen Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius und dgl. Andere Endoparasiten, welche den Menschen infizieren, werden im Blut oder in anderen Organen gefunden. Beispiele solcher Parasiten sind die Fadenwürmer Wucheria, Brugia, Onchocerca und dgl., sowie extra-intestinale Stadien der intestinalen Würmer Strongylides und Trichinella. Ektoparasiten, welche den Menschen parasitieren, umfassen Arthropoden, wie z. B. Zecken, Flöhe, Milben, Läuse und dgl., und wie bei domestizierten Tieren kann eine Infektion durch diese Parasiten zur Übertragung ernster und sogar tödlicher Erkrankungen führen. Die Verbindungen sind aktiv gegen diese Endo- und Ektoparasiten und zusätzlich aktiv auch gegen Stechinsekten und andere Diptera-Schädlinge, welche Menschen belästigen.
Die Verbindungen eignen sich auch gegen übliche Haushaltsschädlinge wie Blatella sp. (Schabe), Tineola sp. (Kleidermotte), Attagenus sp. (Teppichkäfer), Musca domestica (Hausfliege) und gegen Solenopsis Invicta (importierte Feuerameise).
Die Verbindungen sind ferner von Nutzen gegen landwirtschaftliche Schädlinge wie Aphiden (Acyrthiosiphon sp.), Heuschrecken und Baumwollkapselkäfer sowie Insektenschädlinge, welche gelagertes Korn befallen, wie z. B. Tribolium sp., und gegen unreife Stadien von Insekten, die auf Pflanzengewebe leben. Die Verbindungen sind auch geeignet als Nematozid zur Bekämpfung von Boden-Nematoden, welche in der Landwirtschaft von Bedeutung sein können.
Zur Verwendung als Antiparasitikum bei Tieren können die Verbindungen innerlich entweder oral oder durch Injektion oder topisch als flüssige Beize oder als Shampoo verabreicht werden.
Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen in Kapsel-, Tabletten- oder Bolusform verabreicht werden oder können alternativ in das Futter der Tiere eingemischt werden. Die Kapseln, Tabletten und Boli umfassen den aktiven Bestandteil in Kombination mit einem geeigneten Trägervehikel, wie z. B. Stärke, Talkum, Magnesiumstearat oder Dicalciumphosphat. Diese Dosierungseinheitsformen werden durch inniges Mischen des aktiven Bestandteils mit geeigneten feinpulverigen inerten Bestandteilen, einschließlich Verdünnungsmittel, Füller, Zerfallsmittel und/oder Bindemittel, hergestellt, so dass eine gleichförmige Mischung erhalten wird. Ein inerter Bestandteil ist einer, welcher mit den Verbindungen nicht reagieren wird und welcher für das behandelte Tier nicht toxisch ist. Geeignete inerte Bestandteile umfassen Stärke, Lactose, Talkum, Magnesiumstearat, Pflanzengummis und Öle und dgl. Diese Formulierungen können eine im großen Umfang variable Menge der aktiven und inaktiven Bestandteile enthalten, in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren wie der Größe und dem Typ der zu behandelnden Tierspezies und dem Typ und der Schwere der Infektion. Der aktive Bestandteil kann auch als Futterzusatz verabreicht werden durch einfaches Mischen der Verbindung mit dem Futter oder durch Aufbringen der Verbindung auf der Oberfläche des Futters. Alternativ kann der aktive Bestandteil mit einem inerten Träger gemischt und die resultierende Zusammensetzung kann entweder mit dem Futter gemischt oder direkt dem Tier gefüttert werden. Geeignete inerte Träger umfassen Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, Sojaschrot, getrocknete Getreidekörner und dgl. Die aktiven Bestandteile werden mit diesen inerten Trägern innig gemischt durch Feinmahlen, Rühren, Mahlen oder Trommeln, so dass die endgültige Zusammensetzung 0,001 bis 5 Gew.-% des aktiven Bestandteils enthält.
Die Verbindungen können alternativ parenteral verabreicht werden durch Injektion einer Formulierung, die aus dem aktiven Bestandteil, gelöst in einem inerten flüssigen Träger, besteht. Die Injektion kann entweder intramuskulär, intraruminal, intratracheal oder subkutan erfolgen. Die injizierbare Formulierung besteht aus dem aktiven Bestandteil in Mischung mit einem geeigneten inerten flüssigen Träger. Annehmbare flüssige Träger umfassen die Pflanzenöle, wie z. B. Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl und dgl., sowie organische Lösungsmittel wie Solketal, Glycerinformal und dgl. Als Alternative können wässerige parenterale Formulierungen ebenfalls verwendet werden. Die Pflanzenöle sind die bevorzugten flüssigen Träger. Die Formulierungen werden hergestellt durch Lösen oder Suspendieren des aktiven Bestandteils in dem flüssigen Träger, so dass die endgültige Formulierung 0,005 bis 10 Gew.-% des aktiven Bestandteils enthält.
Eine topische Verabreichung der Verbindungen ist möglich durch die Verwendung einer flüssigen Beize oder eines Shampoos, enthaltend die vorliegenden Verbindungen als wässerige Lösung oder Suspension. Diese Formulierungen enthalten gewöhnlich ein Suspendiermittel, wie z. B. Bentonit, und werden normalerweise auch ein Antischaummittel enthalten. Formulierungen, die von 0,005 bis 10 Gew.-% des aktiven Bestandteils enthalten, sind akzeptabel. Bevorzugte Formulierungen sind diejenigen, welche von 0,01 bis 5 Gew.-% der vorliegenden Verbindungen enthalten.
Die Verbindungen sind hauptsächlich von Nutzen als antiparasitische Mittel zur Behandlung und/oder Verhütung von Helminthiasis bei domestizierten Tieren wie Rindern, Schafen, Pferden, Hunden, Katzen, Ziegen, Schweinen und Geflügel. Sie sind ebenfalls von Nutzen zur Verhütung und Behandlung von parasitischen Infektionen dieser Tiere durch Ektoparasiten wie Zecken, Milben, Läuse, Flöhe und dgl. Sie sind auch bei der Behandlung parasitischer Infektionen von Menschen wirksam. Bei der Behandlung solcher Infektionen können die Verbindungen individuell oder in Kombination miteinander oder mit anderen nicht-verwandten antiparasitischen Mitteln eingesetzt werden. Die Dosis der Verbindungen, welche für beste Ergebnisse erforderlich ist, hängt von mehreren Faktoren wie der Spezies und Größe des Tiers, dem Typ und der Schwere der Infektion, dem Verabreichungsverfahren und der verwendeten Verbindung ab. Die orale Verabreichung der Verbindungen in einem Dosisniveau von 0,0005 bis 10 mg pro kg Tierkörpergewicht, entweder in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen im Abstand von mehreren Tagen, ergibt im allgemeinen gute Ergebnisse. Eine Einzeldosis einer der Verbindungen ergibt normalerweise eine ausgezeichnete Kontrolle, jedoch können Wiederholungsdosen gegeben werden, um eine erneute Infektion zu bekämpfen, oder für Parasitenspezies, welche ungewöhnlich persistent sind. Die Techniken zur Verabreichung dieser Verbindungen an Tiere sind Fachleuten auf dem Gebiet der Veterinärmedizin bekannt.
Die Verbindungen können auch zur Bekämpfung von landwirtschaftlichen Schädlingen eingesetzt werden, welche Getreide entweder auf dem Feld oder bei der Lagerung befallen. Die Verbindungen werden für solche Anwendungen als Sprays, Stäube, Emulsionen und dgl. entweder auf die wachsenden Pflanzen oder das geerntete Getreide aufgebracht. Die Techniken zur Aufbringung dieser Verbindungen auf diese Weise sind Fachleuten auf dem Gebiet der Landwirtschaft bekannt.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
C. elegans-RNA-Isolierung
C. elegans-Kulturen wurden auf mit E. coli angeimpften Agar-Petrischalen aufrechterhalten und durch Flotation auf 60%iger Sucrose isoliert wie von Sulston und Hodgkin beschrieben [In: The Nematode Caenorhabditis Elegans, S. 602–603 (1988), W. B. Wood, Herausgeber, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, Verlag]. C. elegans-Präparationen wurden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und, in flüssigem Stickstoff eingetaucht, mit einem Mörser und Pistill gemahlen. Eine Lösung, enthaltend 4 M Guanidiniumthiocyanat, 5 mM Natriumcitrat, pH 7,0, und 0,1 M β-Mercaptoethanol wurde mit einem Polytron-Homogenisator gemischt, während die eingefrorenen pulverisierten Würmer mit 10 ml/g Würmer zugegeben wurden. Nach 5 Minuten Homogenisierung wurde 0,5% Natriumsarkosyl zugegeben und gut gemischt und die Lösung 10 Minuten lang mit 10.000 × UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde über ein 5,7 M CsCl-Kissen überschichtet und 16 h lang mit 33.000 UpM zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, in H₂O resuspendiert und mit 4 : 1 Chloroform : Isobutanol extrahiert und mit Ethanol gefällt. PolyA(+)-RNA wurde durch zwei Reinigungsdurchgänge auf Oligo(dT)-Cellulose-Säulen isoliert.
Agarosegelreinigung von PolyA(+)-RNA
Agarose mit ultraniedriger Geltemperatur (SeaPrep, FMC) wurde zur Größenfraktionierung von PolyA(+)-RNA verwendet. Agarose (2%) wurde in 15 mM NaPO₄, 1 mM EDTA, pH 6,5, gekocht und nach vollständiger Auflösung wurde 15 mM Iodessigsäure (IAA) zugegeben und die Agarose wurde weitere 2 Minuten lang gekocht, um etwaige vorhandene RNase zu inaktivieren. Alle Lösungen wurden 12 h lang mit 0,1% Diethylpyrocarbonat behandelt und 15 Minuten lang autoklaviert. Die Gelvorrichtung und der präparative Kamm wurden in 15 mM IAA 12 h lang getränkt und mit DEP-behandeltem H₂O gespült. Das Gel wurde gegossen und einer Elektrophorese bei 4°C in 15 mM NaPO₄, 1 mM EDTA, pH 6,5, und 6,5 V/cm unter Pufferzirkulation unterworfen. Die RNA wurde etwa 20 h lang elektrophoresiert oder bis das Xylencyanol sich 7 cm im Gel befand. Gelscheiben von etwa 1–2 mm wurden von 7,5 cm im Gel bis zum Gelanfang entnommen und als 1–47 numeriert (vom Boden bis oben).
RNA-Größenfraktionierung
Etwa 150 μg C. elegans-PolyA(+)-RNA wurden ethanolgefällt und das getrocknete Pellet wurde in 400 μl Formamid resuspendiert und 3 Minuten lang bei 65°C denaturiert, 50 μl 1%iges SDS, 10 mM EDTA, wurden zugegeben, gemischt und die Probe wurde drei Minuten lang auf 65°C erhitzt. 50 μl RNA-Auftragspuffer (50% Glycerin, 1 mM EDTA, 0,4% BPB, 0,4% XC) wurden zugegeben und die Probe sofort aufgetragen.
RNA-Gewinnung
Die Gelscheiben wurden zu 15-ml-Röhrchen zugegeben und in einem Bad von 65°C plaziert, bis sie geschmolzen waren. 10 ml vorgewärmter 1 × Oligo-dT-Bindungspuffer (BB) wurde zugegeben (0,5 M KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EDTA), die Probe wurde gemischt und auf Raumtemperatur (etwa 23°C) gebracht. 1 g Oligo-dT-Cellulose (Typ 7, Pharmacia) wurde in 1 × BB hydratisiert und in 15 ml 1 × BB mit 1 μg/ml tRNA und 25 E/ml RNasin (Promega) resuspendiert. 200 μl der Oligo-dT-Cellulosesuspension wurden auf die geschmolzenen Agaroseproben als Aliquots verteilt und 1 h lang über Kopf geschüttelt. Die Probe wurde zentrifugiert, einmal mit 1 × BB und zweimal mit 1 × Waschpuffer (0,1 M KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5, und 1 mM EDTA) gewaschen. Die Probe wurde in Röhrchen überführt und 1 Minute lang mit 10.000 × g zentrifugiert und das Pellet wurde in 200 μl Elutionspuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die RNA wurde mit gepuffertem Phenol bei 65°C und CHCl₃ bei 22°C extrahiert, Natriumacetat wurde bis 0,3 M mit 1 μg Träger-tRNA zugegeben und die RNA wurde mit 2 Volumina Ethanol gefällt. Die Ethanolfällung wurde wiederholt und die RNA wurde bis zur Verwendung bei –20°C als Ethanolpräzipitat gelagert.
BEISPIEL 2
Plasmidherstellung
Der Plasmidvektor pBluescript SKII(+) wurde von Stratagene erhalten. Das Plasmid (4 μg) wurde mit 20 Einheiten NotI und 24 Einheiten EcoRV in 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 1 mM DTT, in einem Volumen von 46 μl 2 h lang bei 37°C verdaut. Die Enzyme wurden 10 Minuten lang bei 65°C hitzeinaktiviert und zweimal mit gepuffertem Phenol, zweimal mit CHCl₃ extrahiert und mit 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumina 100%igem Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in 20,5 μl Wasser resuspendiert und 2,5 μl 10 × AP-Puffer (0,5 M Tris-HCl, pH 9,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂, 10 mM Spermidin) wurden mit 1 μl (1 Einheit) alkalischer Phosphatase (Promega) zugegeben und 30 Minuten lang bei 42°C umgesetzt und mit Zugabe eines weiteren Aliquots von 1 Einheit AP weitere 30 Minuten lang bei 37°C umgesetzt. Die Probe wurde durch ein 0,8%iges SeaKem-LE-Agarosegel in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,3) elektrophoresiert und die lineare Vektor-DNA aus dem Gel unter Verwendung von Clean Gene (Bio101) gereinigt.
Ligierungen
Etwa 75 ng linearer EcoRV-NotI-verdauter pBluescript SK II(+)-DNA wurden mit etwa 6 ng cDNA von etwa 3,1 ml vom Beginn der CL6B-Säule in 15 μl gemischt und mit 0,5 Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) 16 Stunden lang bei 16°C behandelt. Die Proben wurden durch Zugabe von 7,5 μl 8 M NH₄-Acetat und 2 Volumina 100%igem Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 2 μl Wasser resuspendiert.
BEISPIEL 3
Klonierung von pGluClα und pGluClβ
cDNA-Synthese
Synthese des ersten Stranges: Etwa die Hälfte der RNA aus den Fraktionen 21 und 22 wurde zur Synthese von cDNA verwendet. Das RNA-Präzipitat wurde zentrifugiert und das Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das RNA-Pellet wurde in 25 μl DEP-behandeltem H₂O resuspendiert, 10 Minuten lang auf 65°C erwärmt und auf Eis gestellt. Die folgenden Reagenzien wurden auf Eis zugegeben: 2 μl RNasin (40 E/μl), 1 μl Actinomycin D (800 μg/μl, frisch in 100%igem Ethanol hergestellt), 10 μl 5 × RT-Puffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂, BRL), 5 μl 0,1 M DTT, 5 μl 5 mM dNTPs, 2,8 μl von 11 ng/μl Primer-Oligonukleotid
5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ-ID-NR. 5)
und 0,5 μl von 200 E/μl Reverse Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus. Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert, mit Phenol : CHCl₃ (1 : 1, Vol : Vol, mit Tris-HCl, pH 7,4, gepuffertem Phenol, BRL) extrahiert und auf einer Sepharose G-50-Säule nach den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim) gereinigt.
Synthese des zweiten Stranges: Das Produkt des ersten Stranges von der G-50-Säule (Boehringer Mannheim) wurde auf 55 μl eingestellt und die folgenden Reagenzien wurden bei 4°C zugegeben: 10 μl 10 × Puffer für den zweiten Strang (200 mM Tris, pH 7,4, 70 mM MgCl₂, 1 M KCl), 5 μl BSA (1 mg/ml), 3 μl 5 mM dNTPs (Nukleotidtriphosphate), 10 μl NAD (1,4 mM, pH 7,2, hergestellt mit RNase-freien Methoden und bei –20°C gelagert), 5 μl αP³²dCTP (3000 Ci/mmol, 10,0 mCi/ml), 2,5 μl E. coli-Ligase (NEBL 6 E/μl), 1,1 μl RNase H (1,1 E/μl, Pharmacia), 7 μl DNA-Polymerase I (4 E/μl, Pharmacia). Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 16°C, 120 Minuten bei 22°C, 10 Minuten bei 65°C plaziert und auf Eis gestellt. Die Reaktion wurde zweimal mit gepuffertem Phenol, zweimal mit CHCl₃ : Isoamylalkohol (24 : 1, Vol./Vol.) extrahiert. Eine Probe von 1 μl wurde zur quantitativen Bestimmung der cDNA-Synthese entnommen und Natriumacetat wurde auf 0,3 M mit 20 μg Glycogen (Boehringer Mannheim) und 2 Volumina 100%igem Ethanol zugegeben und die DNA bei –20°C gefällt. Die cDNA-Synthese wurde durch TCA-Fällung quantitativ bestimmt. Eine 1 : 10-Verdünnung wurde nach der Synthese des zweiten Stranges durchgeführt und 1 μl wurde zu 10 ml Aquasol zugegeben, um das gesamte zugegebene radioaktive Material abzuschätzen. Ein Aliquot von 1 μl wurde mit 50 μg Träger-DNA in 100 μl gemischt und 100 μl 25%ige TCA und 0,1%iges Natriumpyrophosphat wurden für 15 Minuten auf Eis zugegeben. Das Präzipitat wurde durch Vakuumfiltration auf einem GF-B-Glasfilter gewonnen, der zuvor in 10%iger TCA und 0,1%igem Natriumpyrophosphat bei 4°C getränkt worden war, und die Filter wurden mit eiskalter 10%iger TCA gewaschen. Die Filter wurden zu Gefäßen zugegeben, die 10 ml Aquasol enthielten, und die Radioaktivität wurde quantitativ bestimmt. Die geschätzte Ausbeute an cDNA von etwa einer Hälfte der RNA von den Fraktionen 21 und 22 betrug 282 ng.
DNA von der Synthese des zweiten Stranges wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um die DNA-Enden glattendig zu machen. Das DNA-Pellet wurde in 25 μl Wasser resuspendiert und 3 μl 10 × T4-DNA-Polymerasepuffer wurden mit 1,5 μl 5 mM dNTPs und 0,5 μl T4-DNA-Polymerase zugegeben. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang auf 37°C gebracht und durch die Zugabe von 0,5 μl 500 mM EDTA gestoppt, zweimal mit gepuffertem Phenol : CHCl₃ (1 : 1), zweimal mit CHCl₃ extrahiert und mit 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumina 100%igem Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wurde in 17 μl Wasser und 0,2 μl 1 mg/ml BSA und 2 μl 10 × NotI-Puffer (NEBL) und 0,4 μl (4 E) NotI resuspendiert und bei 37°C 3 h lang inkubiert. Die Probe wurde zweimal mit gepuffertem Phenol : CHCl₃ (1 : 1), zweimal mit CHCl₃ extrahiert und mit 0,3 M Natriumacetat und 2 Volumina an 100%igem Ethanol gefällt. Das DNA-Präzipitat wurde in 25 μl Wasser resuspendiert und 5 Minuten lang auf 65°C erwärmt und auf Eis abgeschreckt, 2,5 μl 5 M NaCl wurden zugegeben und die Probe wurde auf eine Sepharose CL6B-Säule (0,7 × 22 cm) aufgetragen, welche in 0,5 m NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, und 1 MM EDTA voräquilibriert und laufen gelassen wurde. 100-μl-Proben wurden gewonnen und mittels Tscherenkoff-Zählung hinsichtlich Fraktionen überprüft, die cDNA enthielten, welche von der Säule ausgeschlossen und in dem Säulenausschlußvolumen, etwa 3,1 ml, eluiert wurde. Die cDNA wurde auf Grundlage der spezifischen Aktivitäten, welche von der TCA-Fällung erhalten worden waren, quantitativ bestimmt unter Annahme einer gemessenen 21%igen Effizienz der Tscherenkoff-Zählung. Die cDNA-Ausbeute von den 8 Gipfelfraktionen wurde als etwa 268 ng abgeschätzt. Jede der 100-μl-Fraktionen wurde mit 10 μg Glycogen und zwei Volumina 100%igem Ethanol ethanolgefällt. Die Pellets wurden in 10 μl Wasser resuspendiert und mit gepuffertem Phenol : CHCl₃ (1 : 1) extrahiert, das Phenol/Chloroform wurde mit 5 μl Wasser reextrahiert und zweimal mit CHCl₃ extrahiert, und 1,5 μl 3 M Natriumacetat und 16,5 μl Isopropanol bei 22°C wurden zuge geben. Das Pellet wurde durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und getrocknet und in 5 μl Wasser resuspendiert. DNA wurde in TOP10-E. coli-Zellen (Invitrogen) elektroporiert und Klone durch Wachstum in flüssigem Medium mit Ampicillin selektioniert. DNA, die aus amplifizierten Banken, welche 2 × 10⁵ Rekombinanten repräsentierten, extrahiert worden war, wurde mit NotI verdaut und durch Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Die lineare 4,0–4,7-Kb-DNA wurde gewonnen (mit Clean Gene, Bio101) und in Pools von 5000 Rekombinanten rekloniert. Die 5000 Kolonien wurden auf einzelnden LB-Amp-Agarplatten ausplattiert, über Nacht gezüchtet, in LB-Medium abgeschabt und ein Drittel wurde als bakterielle Stammlösung bei –70°C eingefroren und der Rest zur Herstellung von DNA mit dem Promega Wizard Miniprep-System eingesetzt. Die DNA wurde mit NotI linearisiert und zur Synthese von RNA in vitro eingesetzt.
BEISPIEL 4
Charakterisierung von pGluClα und pGluClβ
Xenopus laevis-Oozyten wurden präpariert und ihnen nach bereits beschriebenen und im Stand der Technik bekannten Standardverfahren Injektionen verabreicht [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S. & Cully, D. F., Mol. Pharmacol. 40, 368–374 (1991); Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)]. Weibliche ausgewachsene Xenopus laevis wurden mit 0,17%igem Tricainmethansulfonat betäubt und die Eierstöcke wurden chirurgisch entfernt und in eine Schale plaziert, bestehend aus (mM): NaCl 82,5, KCl 2, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1,8, HEPES 5, eingestellt auf pH 7,5 mit NaOH (OR-2). Die Eierstocksäcke wurden aufgebrochen, mehrere Male gespült und sanft in OR-2, enthaltend 0,2% Collagenase (Sigma, Typ 1A), 2–5 h sanft geschüttelt. Als etwa 50% der Follikelschichten entfernt waren, wurden Oozyten im Stadium V und VI ausgewählt und für 24–48 h vor der Injektion in Medium plaziert, bestehend aus (mM): NaCl 86, KCl 2, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1,8, HEPES 5, Natriumpyruvat 2,5, Theophyllin 0,5, Gentamicin 0,1, eingestellt auf pH 7,5 mit NaOH (ND-96). Oozyten wurden 50–70 nl Poly(A⁺)-RNA (1 mg/ml) oder 50 nl GluClα (0,1–100 ng) und/oder GluClβ (0,1–100 ng) injiziert. Kontroll-Oozyten wurde 50 nl Wasser injiziert. Die Oozyten wurden 2–10 Tage lang in ND-96 vor der Aufzeichnung inkubiert. Inkubationen und Collagenaseverdauung wurden bei 18°C durchgeführt.
Die Aufzeichnungen erfolgten bei Raumtemperatur 2–10 Tage nach der Injektion. Soweit nicht anders angegeben, erfolgten die Aufzeichnungen in Standardfroschsalzlösung, bestehend aus (mM): NaCl 115, KCl 2, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1,8, HEPES 10, eingestellt auf pH 7,5 mit NaOH. An die Oozyten wurden unter Verwendung eines Standard-Zweimikroelektroden-Verstärkers (Dagan 8500 oder TEV-200, Minneapolis, MN) Spannungsklemmen angelegt. Pipetten wurden mit 3 M KCl gefüllt und wiesen Widerstände zwischen 0,5–3,0 MΩ auf. Eine Plexiglas-Aufzeichnungskammer (Volumen 200 μl) wurde konstant mit einer Rate von 10 ml/Min. perfundiert. Die Aufzeichnungskammer wurde mit einer Ag/AgCl-Elektrode direkt geerdet oder über eine 3 M KCl-Agarbrücke wenn das extrazelluläre Chlorid variiert wurde. Für Lösungen mit wenig Chlorid wurde NaCl durch äquimolare Konzentrationen an Natriumisethionsäure ersetzt. Für Lösungen mit wenig Natrium wurde NaCl durch äquimolares KCl oder Cholin-Cl ersetzt. Die Daten wurden ermittelt und analysiert unter Verwendung von PCLAMP mit einem TL-1-Interface (Axon Instruments, Foster City, CA). Es wurde ein Membranstrom bei einem Haltepotential von –80 mV aufgezeichnet. Die Amplitude des arzneiwirkstoff-sensitiven Stroms wurde bestimmt durch Subtraktion des Haltestroms bei –80 mV von dem in Anwesenheit des Arzneiwirkstoffs erhaltenen Gipfelstrom. Die Daten wurden bei 30 Hz gefiltert und bei 16,6 Hz gewonnen. Strom/Spannungs-Beziehungen (I/V) und Umkehrpotentiale (E_rev) wurden mit Hilfe einer 1–3 Sekunden langen linearen Spannungsanstiegs über den Spannungsbereich von –110 bis +80 mV bestimmt. Für die linearen Anstiege wurden die Daten bei 0,3–3 kHz gefiltert und bei 160 Hz gewonnen. Der Strom in arzneiwirkstoff-freier Lösung wurde von dem Strom in Gegenwart von Arzneiwirkstoff subtrahiert, um arzneiwirkstoff-sensitive Strom/Spannungs-Beziehungen zu erhalten.
Xenopus-Oozyten, denen C. elegans-Poly(A)⁺-RNA injiziert worden war, zeigten einen sich rapid aktivierenden reversiblen glutamat-sensitiven und irreversiblen Ivermectin-4-O-Phosphat (IVMPO₄)-sensitiven Strom (5) [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M., & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992); Arena, et al., 1991, oben]. Zur Isolierung eines funktionellen cDNA-Klons für den glutamat- und IVMPO₄-sensitiven Kanal wurde eine direktionale cDNA-Bank von der 1,7–1,9-kB-Fraktion der größenfraktionierten C. elegans-Poly(A)⁺-RNA erstellt. Glutamat- und IVMPO₄-sensitive Ströme wurden beobachtet nach Injektion von in vitro-RNA, die von einem Pool von 5000 cDNAs synthetisiert worden war. Eine Subfraktionierung dieser Population von cDNAs in kleinere Pools zeigte an, dass zwei verschiedene Untereinheiten nötig waren, um die Glutamat- und IVMPO₄-Antworten zu erhalten. Zwei Pools von 500 cDNAs wurden identifiziert, welche zusammengenommen beide Reaktionen ergaben. Der cDNA-Klon pGluClα wurde isoliert durch gemeinsame Injektion von RNA aus einem subfraktionierten Pool mit RNA aus einem zweiten Pool von 500 cDNAs. Der cDNA-Klon pGluClβ wurde isoliert durch Subfraktionierung des zweiten Pools von 500 Klonen und gemeinsame Injektion mit in vitro-RNA von pGluClα. Als die Komplexität der subfraktionierten Pools auf 25 cDNAs reduziert war, war es möglich, Reaktionen in Oozyten zu identifizieren, denen ein einzelner Pool injiziert worden war.
Elektrophysiologische Eigenschaften wurden in Oozyten untersucht, denen in vitro-RNA aus pGluClα und pGluClβ injiziert worden war (5). Oozyten, die gleichzeitig GluClα & -β-Proteine exprimierten, wiesen den sich schnell aktivierenden reversiblen glutamat- sensitiven und irreversiblen IVMPO₄-sensitiven Strom auf, der in Oozyten, denen Poly(A)⁺-RNA-injiziert worden war, gefunden wurde (5). Die Zeit für die maximale Aktivierung eines IVMPO₄-sensitiven Stroms betrug 42 ± 2 Sekunden für GluClα & β und 36 ± 3 Sekunden für Poly(A)⁺-RNA. Die Densibilisierung des glutamat-sensitiven Stroms, die bei Oozyten beobachtet wurde, denen Poly(A)⁺-RNA injiziert worden war, wurde auch in Oozyten, denen GluClα & β injiziert worden war, bei Glutamat-Konzentrationen von größer als 1 mM beobachtet. Die individuellen Untereinheiten, GluClα oder GluClβ, exprimierten funktionelle homomere Kanäle, welche selektiv auf IVMPO₄ bzw. Glutamat ansprachen (5). Der Zeitverlauf für die IVMPO₄-Aktivierung von homomeren GluClα-Kanälen betrug 18 ± 1 Sekunden, schneller als der für GluClα & β oder Poly(A)⁺-RNA beobachtete (p < 0,001). GluClα-Kanäle waren unsensitiv für so hohe Glutamatkonzentrationen wie 10 mM, während der Schwellenwert für die Aktivierung von homomeren GluClβ-Kanälen mit Glutamat 50 μM betrug. Es war erforderlich, 10 mal mehr RNA der individuellen Untereinheiten zu injizieren, um Ströme mit Amplituden zu erreichen, welche mit den von coinjizierten Oozyten vergleichbar waren, was nahelegt, dass die funktionelle Bildung von homomeren Kanälen weniger effizient ist.
Eine Analyse der Glutamat- und IVMPO₄-Dosis-Antwort-Kurven zeigte an, dass die Coexpression von GluClα & β zu Veränderungen der Ligandenaffinität und des HilI-Koeffizienten führte (5). Eine Coinjektion von GluClα mit GluClβ führte zu einer Verschiebung des EC₅₀-Werts für Glutamat von 380 auf 1360 μM (1b). Die HilI-Coeffizienten von 1,9 für GluClβ und 1,7 für GluClα & β legen nahe, dass mehr als ein Glutamat-Molekül erforderlich ist, um die Kanäle zu steuern. Der EC₅₀-Wert für IVMPO₄-Aktivierung des Stroms war bei Oozyten, denen GluClα und GluClα & β injiziert worden war, ähnlich, mit Werten von 140 bzw. 190 nM (5). Jedoch wurde der Hill-Coeffizient von 1,5 für GluClα auf 2,5 für GluClα & β verändert, was eine Erhöhung der Anzahl von IVMPO₄-Molekülen nahe fegt, welche zur Öffnung des Kanals erforderlich sind. Die bei dem EC₅₀-Wert und HilI-Coeffizienten beobachteten Veränderungen können nicht auf die Aktivierung von GluClα-Kanälen mit Glutamat oder Aktivierung von GluClβ-Kanälen mit IVMPO₄ zurückzuführen sein, da diese homomeren Kanäle nicht auf diese Liganden reagieren (5).
Die Permeabilitätseigenschaften und Strom-Spannungs-Beziehung in Oozyten, die GluClα & β-Kanäle exprimieren, war ähnlich den bei Oozyten, denen Poly(A)⁺-RNA injiziert worden war, beobachteten (6) [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S. & Cully, D. F., Mol. Pharmacol. 40, 368–374 (1991); Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)]. Die GluClα & β-Kanäle waren selektiv für Chlorid, wie gezeigt durch die Verschiebung des Umkehrpotentials (E_rev) für einen glutamat- oder IVMPO₄-sensitiven Strom nach Ersatz von externem NaCl durch Natriumisothionat (6). Die GluClα & β-Kanäle waren nicht permeabel für monovalente Kationen, da ein Ersatz von externem NaCl durch KCl oder Cholin-Cl E_rev nicht verschob (6). Permeabilitätsstudien für homomere GluClα- oder GluClβ-Kanäle offenbarten auch eine Selektivität für Anionen gegenüber Kationen (6). Bei sowohl GluClα- als auch GluClβ-Kanälen verschob ein Ersatz von NaCl durch Na-Isothionat den E_rev-Wert auf positive Spannungen, während ein Ersatz durch KCl oder Cholin-Cl keine Wirkung auf E_rev hatte (6). Der E_rev-Wert für GluClα-Kanäle in Na-Isothionat zeigte an, dass es eine Permeabilität für das große Anion Isothionat mit einem Verhältnis zu Chlorid von 0,2 gab [Goldman, D. E., J. Gen. Physiol. 27, 37–60 (1943); Hodgkin, A. L. & Katz B., J. Physiol. (Lond.) 108, 37–77 (1949)].
Die Strom-Spannungs-Beziehung (I/V) in Oozyten, denen GluClα & β injiziert worden war, zeigte eine auswärts-rektifizierende Spannungsabhängigkeit (6). Die I/V für glutamat- oder IVMPO₄-sensitive Ströme zeigte eine ähnliche Spannungsabhängigkeit, wie bestätigt durch Datenanpassungen an die Gleichung eines konstanten Feldes (6) [Goldman, D. E., J. Gen. Physiol. 27, 37–60 (1943)], [Hodgkin, A. L. & Katz, B., J. Physiol. (Lond.) 108, 37–77 (1949)]. Die I/V-Kurven für die homomeren GluClα- oder GluClβ-Kanäle wichen stark von der I/V-Kurve für GluClα & β ab und wurden durch Annahme eines konstanten Feldes nicht gut angepaßt (6). Der glutamat-sensitive Strom von GluClβ-Kanälen zeigte eine steile auswärts-rektifizierende Spannungsabhängigkeit mit kleinen Strömen bei negativen Spannungen (6). Der IVMPO₄-sensitive Strom von GluClα-Kanälen zeigte im wesentlichen eine lineare Spannungsabhängigkeit (6).
IVMPO₄ hat eine doppelte Wirkung auf Oozyten, denen C. elegans-Poly(A)⁺-RNA injiziert worden war [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S. & Cully, D. F., Mol. Pharmacol. 40, 368–374 (1991)], [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)]. Neben einer direkten Aktivierung des Stroms (5) wird der glutamat-sensitive Strom durch niedrige Konzentrationen an IVMPO₄ verstärkt (7) (Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)]. Gleichermaßen verstärkte IVMPO₄ (5 nM) den glutamat-sensitiven Strom 490 ± 45% in Oozyten, denen GluClα & β injiziert worden war (7). Eine gemeinsame Applikation von IVMPO₄ und Glutamat verschob den EC₅₀-Wert für Glutamat von 1360 auf 360 μM und verringerte den HilI-Koeffizienten von 1,7 auf 1,3. Die Glutamat-Reaktion von homomeren GluClβ-Kanälen wurde mit IVMPO₄ nicht verstärkt (7). Im Gegensatz dazu wurde nach höheren Konzentrationen von IVMPO₄ (1 μM) der glutamat-sensitive Strom auf 88 ± 4% in GluClβ-injizierten Oozyten reduziert (7). In Oozyten, welche GluClα-Kanäle exprimieren, die nicht auf Glutamat ansprechen (5), führte eine vorherige Stromaktivierung mit IVMPO₄ zu einer 20 ± 4%igen Stromerhöhung mit Glutamat (7). Der glutamat-sensitive Strom von GluClα-injizierten Oozyten wurde nur nach einer IVMPO₄-Strom aktivierung beobachtet und konnte mit so niedrigen Glutamat-Konzentrationen wie 10 μM beobachtet werden.
Das pharmakologische Profil von Oozyten, denen GluClα & β injiziert worden war, unterschied sich von allen anderen klonierten liganden-gesteuerten Chlorid-Kanälen und glutamat-gesteuerten Kationenkanälen (Tabelle 1). Mehrere Agonisten und Antagonisten von liganden-gesteuerten Ionenkanälen wurden auf Oozyten getestet, denen GluClα & β injiziert worden war (Tabelle 1). Alle Verbindungen waren inaktiv, mit Ausnahme von Ibotenat, ein strukturelles Analogon von Glutamat, welches bekannterweise glutamat-sensitive Chlorid-Kanäle aktiviert [Cull-Candy, S. G., J. Physiol. 255, 449–464 (1976); Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992); Lea, T. J. & Usherwood, P. N. R., Comp. Gen. Pharmacol. 4, 351–363 (1973)]. Glutamat- und IVMPO₄-sensitive Ströme wurden mit Picrotoxin und Flufenaminsäure mit einer ähnlichen Konzentrationsabhängigkeit blockiert wie für C. elegans-Poly(A)⁺-RNA berichtet [Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S. & Cully, D. F., Mol. Pharmacol. 40, 368–374 (1991); Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. & Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339–348 (1992)].
Mehrere Indizien wiesen darauf hin, dass eine Coexpression von GluClα & β zur Bildung heteromerer Kanäle führt. Das erste Anzeichen einer Untereinheit-Assoziation zeigte sich während des Klonierungsverfahrens, bei dem zwei cDNA-Pools erforderlich waren, um Reaktionen hervorzurufen. Zweitens ist es erforderlich, 10 mal mehr RNA der individuellen Untereinheiten zu injizieren, um das Expressionsniveau zu erreichen, welches mit coinjizierten Oozyten erreicht wird. Darüber hinaus wurden die folgenden Veränderungen von liganden-spezifischen Reaktionen bei Oozyten beobachtet, die GluClα & β coexprimieren: der Zeitverlauf der IVMPO₄-Stromaktivierung, die Affinität für Glutamat und der HilI-Koeffizient der IVMPO₄-Stromaktivierung, Unterschiede in der Rektifizierung der I/V-Beziehung, die Permeabilität für Isethionat und die IVMPO₄-Verstärkung der Glutamat-Reaktion. Die identische Spannungsabhängigkeit der glutamat- und IVMPO₄-sensitiven I/V-Kurven in coinjizierten Oozyten legt stark nahe, dass die Mehrheit der gebildeten Kanäle heteromer sind. Falls eine signifikante Anzahl von homomeren GluClα- und GluClβ-Kanälen in coinjizierten Oozyten anwesend wäre, würde die glutamat-sensitive I/V-Kurve stärker auswärtsrektifizierend sein als die I/V-Kurve für den IVMPO₄-sensitiven Strom. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die bei coinjizierten Oozyten beobachteten Eigenschaften die Eigenschaften von heteromeren Kanälen repräsentieren.
TABELLE 1
Den Oozyten wurde gleichzeitig GluClα- und GluClβ-RNA (jeweils 25 pg) injiziert.

n = mindestens 4 für jede Gruppe.

BEISPIEL 5
Glutamat- und Ivermectin-Bindungsassay mit Oozyten, denen GluCl-RNA injiziert worden war
Oozyten, denen GluClα- und GluClβ-in vitro-RNA injiziert worden war, wurden in ³H-Ivermectin- und ³H-Glutamat-Bindungsassays eingesetzt. GluClα- (1 ng) oder GluClβ-RNA (1 ng) wurden einzeln in Oozyten injiziert oder zusammen injiziert (jeweils 0,5 ng) und zwei Tage später wurden die Oozyten mit einem Dounce-Homogenisator aufgebrochen und die Eidotterproteine unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren entfernt. Gleichgewichts-Liganden-Bindungsassays wurden unter Anwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt. Oozyten, die GluClα & β beide oder GluClα exprimierten, banden beide ³H-Ivermectin mit hoher Affinität, etwa 0,2 nM. Eine spezifische ³H-Glutamat-Bindung wurde in Membranpräparationen von GluClα-injizierten Oozyten beobachtet. Oozyten, die GluClα & β exprimieren, werden zur Messung der Bindungsaffinität von anderen Verbindungen und ihres Vermögen zur Verdrängung der ³H-Ivermectin- und ³H-Glutamat-Bindung verwendet.
BEISPIEL 6
Primärstruktur der GluClα- und GluClβ-Kanäle
Die Nukleotidsequenzen von pGluClα und pGluClβ offenbarten einzelne große offene Leserahmen von etwa 1383 und etwa 1302 Basenpaaren. Die cDNAs weisen 5'- und 3'-untranslatierte Verlängerungen von etwa 50 und etwa 90 Nukleotiden für pGluClα bzw. etwa 13 und etwa 144 Nukleotiden für pGluClβ auf. Die Nukleotidsequenz in den offenen Leserahmenbereichen von pGluClα und pGluClβ war zu etwa 50% identisch. Die ersten Methionine im Leserahmen wurden als Initiationscodons für offene Leserahmen festgelegt, welche ein GluClα-Protein mit einer geschätzten Molekülmasse (M_r) von etwa 52.550 und ein GluClβ-Protein mit einer geschätzten M_r von etwa 49.900 voraussagen. Beide Proteine enthielten hydrophobe aminoterminale Reste mit Sequenzen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit Signal-Spaltstellen voraussagen, welche reife Proteine mit einem Beginn bei Aminosäure 21 für GluClα und 23 bei GluClβ ergeben würden. Ein Vergleich der GluClα- und GluClβ-Proteine zeigte 45% Aminosäureidentität und 63% Ähnlichkeit.
Die vorausgesagten GluClα- und GluClβ-Proteine wurden mit Nukleotid- und Protein-Datenbanken verglichen und befunden, mit den Glycin- und GABA_a-Rezeptoren verwandt zu sein. Etwa 21% der Aminosäuren in GluClα und CluClβ waren hochkonserviert und zeigten mindestens 75% Aminosäureidentität innerhalb der Familie von liganden-gesteuerten Chlorid-Kanälen. Die konservierten Motive, die bei dieser Familie von Kanälen gefunden werden, wie z. B. eine große NH₂-terminale extrazelluläre Domäne und die vier hydrophoben Transmembrandomänen M1 bis M4, wurden auch in den GluClα- und GluClβ-Sequenzen gefunden. Die GluClα- und GluClβ-Proteine enthielten die konservierten Cysteinreste, die in der extrazellulären Domäne aller liganden-gesteuerten Chlorid-Kanäle gefunden werden (Aminosäuren 191 und 205 in GluClα und 161 und 175 in GluClβ). Zwei zusätzliche Cysteinreste waren vorhanden, welche auch in glycin-gesteuerten Chlorid-Kanälen gefunden werden (Aminosäuren 252 und 263 in GluClα und Aminosäuren 223 und 234 in GluClβ). Das GluClα-Protein enthielt eine starke Consensus-Sequenz für eine Proteinkinase C-Phosphorylierungsstelle, lokalisiert zwischen den mutmaßlichen membran-überspannenden Domänen M3 und M4. Bei GABA_a-Rezeptor-Untereinheiten befinden sich ähnliche Phosphorylierungsstellen in der intrazellulären Domäne zwischen M3 und M4 und von ihnen wird angenommen, dass sie eine Rolle bei der Kanal-Regulierung spielen [Leidenheimer, N. J., McQuilkin, S. J., Hahner, L. D., Whiting, P. & Harris, R. A., Mol. Pharm. 41, 1116–1123 (1992)], [Kellenberger, S., Malherbe, P. & Sigel, E., J. Biol. Chem. 267, 24660–25663 (1992)]. Wie in GABA_A- und Glycin-Rezeptor-Sequenzen gefunden, enthielten die GluClα- und GluClβ-Proteine mutmaßliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen in der postulierten extrazellulären Domäne. Zuordnungsanalysen mit den Acetylcholin- und Glutamat-Kationenkanal-Untereinheiten zeigten, dass GluClα und GluClβ etwa 10% bzw. < 5% Ähnlichkeit aufweisen.
Eine phylogenetische Analyse wurde mit den gesamten GluClα- und GluClβ-Proteinsequenzen, den GABA_a- und Glycin-Rezeptor-Untereinheiten und verwandten Invertebraten-Proteinsequenzen durchgeführt. Eine deutliche evolutionäre Trennung bei dieser Familie von Proteinen wurde gezeigt durch eine Aufspaltung in zwei Hauptzweige, was zur Trennung der GABA_A-α- und -γ-Untereinheiten von den restlichen Proteinen führte. Innerhalb dieser Hauptzweige gibt es Unterzweige, welche die Proteine in die jeweiligen Subklassen gruppieren, wie z. B. GABA_a α, β, γ, delta (d), rho (r) und Glycin α und β. Die Drosophila melanogaster (Dros)- und Lymnae stagnalis (Lym)-Sequenzen repräsentieren die verfügbaren Invertebraten-Proteinsequenzen, welche den liganden-gesteuerten Anionenkanälen ähnlich sind. Die C. elegans-GluClα- und -GluClβ-Proteinsequenzen sind verstreut auf dem gleichen Zweig mit den Glycin-α- und -β-, Lym-zeta (ζ) und Dros rdl-Proteinen gruppiert, was nahelegt, dass diese Proteine von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen. Die GluClα- und GluClβ-Proteine sind am engsten verwandt mit den Glycin-α-Proteinen, wie durch die kürzesten verbindenden Gliedlängen angezeigt. Diese Analyse legt nahe, dass die GluClα- und GluClβ-Proteine einen unabhängigen Subzweig bilden, der von den anderen Proteinen getrennt ist. Ähnliche phylogenetische Bäume wurden erhalten unter Anwendung eines Maximum-Parsimony-Programms oder wenn die extrazellulären oder membran-überspannenden Domänen von GluClα oder GluClβ separat analysiert wurden.
Obwohl die GluClα- und GluClβ-Proteine phylogenetisch mit den Glycin-α- und -β-, Lym-ζ- und Dros rdl-Proteinen verwandt sind, sind sie pharmakologisch verschieden. Expressionsstudien in Xenopus-Oozyten zeigen, dass funktionelle homomere Chlorid-Kanäle von den Glycin-α-Proteinen gebildet werden, welche sensitiv gegenüber Glycin sind [Schmieden, V., Grenningloh, G., Schofield, P. R. & Betz, H., EMBO Journal 8, 695–700 (1989)], und dem Dros-rdl-Protein, welches sensitiv gegenüber GABA ist [ffrench-Constant, R. H., Rocheleau, T. A., Steichen, J. C. & Chalmers, A. E., Nature 363, 449–451 (1993)]. Homomere Glycin-β-Kanäle werden mit sehr niedriger Effizienz gebildet [Grenningloh, G., et al., Neuron 4, 963–970 (1990)] und das Lym-ζ-Protein bildet keine funktionellen homomeren Kanäle [Hutton, M. L., Harvey, R. J., Earley, F. G. P., Barnard, E. A. & Darlison, M. G., FEBS letters 326, 112–116 (1993)]. Nachdem die homomeren GluClα- und GluClβ-Kanäle unsensitiv gegenüber GABA, Glycin und verwandten Kanal-Agonisten und -Antagonisten (siehe Tabelle 1) sind, scheinen diese Kanäle eine unterschiedliche Ligandenselektivität, unabhängig von ihren phylogenetisch verwandten Kanälen, entwickelt zu haben.
Eine Hybridisierungsanalyse wurde mit genomischer C. elegans-DNA und Poly-A⁺-RNA unter Verwendung der GluClα- und GluClβ-cDNAs als Sonden vorgenommen. Eine hochstringente Hybridisierung der cDNA-Sonden mit restriktionsverdauter genomischer DNA zeigte, dass die GluCl-cDNAs nur mit einem Einzelkopie-DNA-Fragment hybridisieren. Eine hochstringente Hybridisierung mit C. elegans-RNA zeigte, dass GluClα mit einer 2,4- und 1,7-Kb-RNA hybridisierte und GluClβ mit einer 1,7-Kb-RNA hybridisierte. Die für diese Studie verwendeten Sonden repräsentieren nur diejenigen Regionen der GluClα- und GluClβ-cDNAs, welche für die einzelnen großen offenen Leserahmen kodieren. Die GluClα- und GluClβ-Sonden wurden mit einer C. elegans-YAC- und Cosmid-Bank hybridisiert. Diese Hybridisierung zeigte, dass das GluClα-Gen auf dem Chromosom V, auf YAC # Y42B4 und dem Cosmid # C25D4 lokalisiert ist. Das GluClβ-Gen ist auf dem Chromosom I, YAC # Y24C9 und dem Cosmid # C04E4 lokalisiert. Die YAC- und Cosmid-Klassifizierung stammt von John Sulston, MRC-Laboratorien, Cambridge, England.
BEISPIEL 7
Klonierung der GluCl-cDNA in E. coli-Expressionsvektoren
Rekombinantes GluCl wird in E. coli nach dem Transfer der GluCl-Expressionskassette in E. coli-Expressionsvektoren, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, pET-Reihe (Novagen), gebildet. Die pET-Vektoren stellen die GluCl-Expression unter die Kontrolle des streng regulierten Bakteriophagen-T7-Promoters. Nach dem Transfer dieses Konstrukts in einen E. coli-Wirt, welcher eine chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerasegens, gesteuert von dem induzierbaren lac-Promoter, enthält, wird Expression von GluCl induziert, wenn ein geeignetes lac-Substrat (IPTG) der Kultur zugegeben wird. Die Niveaus an exprimiertem GluCl werden mit den oben beschriebenen Assays bestimmt.
Die cDNA, welche für den vollständigen offenen Leserahmen für GluClα und β kodiert, wird in die NdeI-Stelle von pET [16]11a inseriert. Konstrukte in der positiven Orientierung werden durch Sequenzanalyse identifiziert und zur Transformation des Expressionswirtsstammes BL21 verwendet. Transformanten werden dann verwendet, um Kulturen zur Produktion von GluCl-Protein anzuimpfen. Die Kulturen können in M9- oder ZB-Medien gezüchtet werden, deren Formulierung Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist. Nach dem Wachstum auf eine OD₆₀₀ = 1,5 wird Expression von GluCl mit 1 mM IPTG 3 h lang bei 37°C induziert.
BEISPIEL 8
Klonierung von GluCl-cDNA in einen Säuger-Expressionsvektor
Die GluCl-cDNAs wurden in die Säuger-Expressionsvektoren pMAMneo und pcDNA3 kloniert. Die GluClα- und GluClβ-Bluescript-Plasmide wurden mit NotI verdaut und mit Klenow-Enzym behandelt, um ein glattes Klonierungsende zu schaffen. Die Inserts wurden mittels SalI-Verdauung ausgeschnitten und mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Der pMAMneo-Vektor wurde mit XhoI-, Klenow-Enzym und dann mit SalI und Kalbsdarm-Phosphatase (CIP) behandelt. Der lineare Vektor wurde auf einem Agarosegel gereinigt und zur Ligierung mit den GluCl-cDNA-Inserts verwendet. Rekombinante wurden isoliert, als GluClα-pMAMneo und GluClβ-pMAMneo bezeichnet, und zur Transfektion von Säugerzellen (L-Zellen) mittels CaPO₄-DNA-Fällung verwendet. Zellen wurden mit GluClα-pMAMneo, GluClβ-pMAMneo oder sowohl GluClα-pMAMneo als auch GluClβ-pMAMneo transfiziert. Stabile Zellklone wurden durch Wachstum in Gegenwart von G418 selektioniert. Einzelne G418-resistente Klone wurden isoliert und befunden, das intakte GluClα- oder GluClβ-Gen oder sowohl das GluClα- als auch das GluClβ-Gen zu enthalten. Klone, welche die GluCl-cDNAs enthalten, werden hinsichtlich Expression unter Anwendung immunologischer Techniken, wie z. B. Immunpräzipitation, Westernblot und Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern, welche für die GluCl-Proteine spezifisch sind, analysiert. Antikörper wird von Kaninchen erhalten, die mit Peptiden geimpft sind, welche anhand der aus den GluCl-Sequenzen vorausgesagten Aminosäuresequenz synthetisiert wurden. Die Expression wird auch mit Hilfe von "Patch Clamp"-Elektrophysiologie-Techniken und ³H-Ivermectin- und ³H-Glutamat-Bindungsassays analysiert.
Die GluClα- oder GluClβ-Gene wurden in pcDNA3 inseriert. GluClα-Bluscript SKII+ und GluClβ-Bluescript SKII+ wurden mit XhoI und NotI verdaut und die cDNA-Inserts durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Der Vektor, pcDNA3, wurde mit XhoI und NotI verdaut, mit CIP behandelt und der lineare Vektor durch Gelelektrophorese isoliert und mit cDNA-Inserts ligiert. Die rekombinanten Plasmide GluClα-pcDNA3 und GluClβ-pcDNA3 werden zur Transformation der COS- oder CHO-Säugerzellen verwendet.
Zellen, welche GluClα oder GluClβ und GluClα & β stabil oder transient exprimieren, werden zum Testen hinsichtlich Expression von avermectin- und glutamat-sensitiven Chlorid-Kanälen und hinsichtlich Ligandenbindungsaktivität verwendet werden. Diese Zellen werden zur Identifizierung und Überprüfung anderer Verbindungen hinsichtlich ihres Vermögens zur Modulierung, Inhibierung oder Aktivierung des avermectin- und glutamat-sensitiven Chlorid-Kanals und zur Konkurrenz um die Bindung von radioaktivem Ivermectin oder Glutamat verwendet.
Kassetten, welche die GluCl-cDNA in der positiven Orientierung bezüglich des Promoters enthalten, werden in geeignete Restriktionsstellen 3' des Promoters kloniert und durch Restriktionsstellenkartierung und/oder Sequenzierung identifiziert. Diese cDNA-Expressionsvektoren werden in Fibroblasten-Wirtszellen, beispielsweise COS-7 (ATCC# CRL1651) und CV-1 tat [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], 293, L (ATCC# CRL6362)] nach Standardverfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Elektroporation oder chemische Verfahren (kationische Liposomen, DEAE-Dextran, Calciumphosphat), eingeführt. Transfizierte Zellen und Zellkulturüberstände können geerntet und hinsichtlich GluCl-Expression wie hier beschrieben analysiert werden.
Alle zur transienten Expression in Säugern verwendeten Vektoren können zur Etablierung stabiler Zellinien, die GluCl exprimieren, verwendet werden. Von unveränderten GluCl-cDNA-Konstrukten, kloniert in Expressionsvektoren, steht zu erwarten, dass sie Wirtszellen programmieren, um GluCl-Protein herzustellen. Darüber hinaus wird GluCl extrazellulär als sekretiertes Protein exprimiert durch Ligierung von GluCl-cDNA-Konstrukten mit DNA, welche für die Signalsequenz eines sekretierten Proteins kodiert. Die Wirtszellen für die Transfektion umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, CV-1-P [Sackevitz et al., Science 238: 1575 (1987)], tk-L [Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)], NS/0 und dHFr-CHO [Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601 (1982)].
Eine Cotransfektion irgendeines Vektors, der GluCl-cDNA enthält, mit einem Arzneiwirkstoff-Selektionsplasmid, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, G418, Aminoglycosidphosphotransferase, Hygromycin, Hygromycin-B-phosphotransferase, APRT, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, wird die Selektion stabil transfizierter Klone erlauben. Die Niveaus an GluCl werden mit den hier beschriebenen Assays quantitativ bestimmt.
GluCl-cDNA-Konstrukte werden auch in Vektoren ligiert, welche amplifizierbare Arzneiwirkstoffresistenz-Marker enthalten, zur Herstellung von Säugerzellklonen, welche die höchstmöglichen Niveaus an GluCl synthetisieren. Nach der Einführung dieser Konstrukte in Zellen werden Klone, die das Plasmid enthalten, mit dem geeigneten Mittel selektioniert und die Isolierung eines überexprimierenden Klons mit einer hohen Kopienzahl an Plasmiden wird durch Selektion in zunehmenden Dosen des Mittels erreicht.
Die Expression von rekombinantem GluCl wird durch Transfektion von Vollängen-GluCl-cDNA in eine Säuger-Wirtszelle erreicht.
BEISPIEL 9
Klonierung von GluCl-cDNA in einen Baculovirus-Expressionsvektor zur Expression in Insektenzellen
Baculovirus-Vektoren, welche sich von dem Genom des AcNPV-Virus ableiten, sind konstruiert, um eine hohe Expression von cDNA in der Sf9-Linie von Insektenzellen (ATCC CRL# 1711) zu ergeben. Rekombinante Baculoviren, exprimierend GluCl-cDNA, werden nach den folgenden Standardverfahren (InVitrogen Maxbac Manual) hergestellt: die GluCl-cDNA-Konstrukte werden in das Polyhedrin-Gen in einer Vielfalt von Baculovirus-Transfervektoren, einschließlich des pAC360- und des BlueBac-Vektors (InVitrogen), ligiert. Rekombinante Baculoviren werden erzeugt durch homologe Rekombination nach einer Cotransfektion des Baculovirus-Transfervektors und linearisierter genomischer AcNPV-DNA [Kitts, P. A., Nuc. Acid. Res. 18: 5667 (1990)] in Sf9-Zellen. Rekombinante pAC360-Viren werden identifiziert durch die Abwesenheit von Einschlusskörpern in infizierten Zellen und rekombinante pBlueBac-Viren werden auf Basis der β-Galactosidase-Expression (Summers, M. D., und Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin Nr. 1555) identifiziert. Nach Plaque-Reinigung wird die GluCl-Expression mit den hier beschriebenen Assays gemessen.
Die cDNA, welche für den gesamten offenen Leserahmen für GluCl-Untereinheiten kodiert, wird in die BamHI-Stelle von pBlueBaclI inseriert. Konstrukte in der positiven Orientierung werden durch Sequenzanalyse identifiziert und zur Transfektion von Sf9-Zellen in Anwesenheit von linearer AcNPV-Wildtyp-DNA verwendet.
Authentisches aktives GluCl wird im Zytoplasma von infizierten Zellen gefunden. Aktives GluCl wird aus infizierten Zellen durch hypotonische oder Detergens-Lyse extrahiert.
BEISPIEL 10
Klonierung von GluCl-cDNA in einen Hefe-Expressionsvektor
Rekombinantes GluCl wird in der Hefe S. cerevisiae nach der Insertion des optimalen GluCl-cDNA-Cistrons in Expressionsvektoren, welche zur Steuerung der intrazellulären oder extrazellulären Expression von heterologen Proteinen ausgelegt sind, gebildet. Im Falle von intrazellulärer Expression werden Vektoren wie EmBLyex4 oder dgl. mit dem GluCl-Cistron [Rinas, U., et al., Biotechnology 8: 543–545 (1990); Horowitz, B., et al., J. Biol. Chem. 265: 4189–4192 (1989)] ligiert. Für die extrazelluläre Expression wird das GluCl-Cistron in Hefe-Expressionsvektoren ligiert, welche ein Sekretionssignal (ein Hefe- oder Säugerpeptid) mit dem NH₂-Terminus des GluCl-Proteins fusionieren [Jacobson, M. A., Gene 85: 511–516 (1989); Riett, L., und Bellon, N., Biochem. 28: 2941–2949 (1989)].
Diese Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pAVE1 > 6, welcher das Humanserumalbumin-Signal mit der exprimierten cDNA fusioniert [Steep, O., Biotechnology 8: 42–46 (1990)], und den Vektor pL8PL, welcher das Human-Lysozym-Signal mit der exprimierten cDNA fusioniert [Yamamoto, Y., Biochem. 28: 2728–2732)]. Darüber hinaus wird GluCl in Hefe als Fusionsprotein in Konjugation mit Ubiquitin unter Verwendung des Vektors pVEP exprimiert [Ecker, D. J., J. Biol. Chem. 264: 7715–7719 (1989), Sabin, E. A., Biotechnology 7: 705–709 (1989), McDonnell, D. P., Mol. Cell Biol. 9: 5517–5523 (1989)]. Die Niveaus an exprimiertem GluCl werden mit den hier beschriebenen Assays bestimmt.
BEISPIEL 11
Reinigung von rekombinantem GluCl
Rekombinant hergestelltes GluCl kann mittels Antikörper-Affinitätschromatographie gereinigt werden.
GluCl-Antikörper-Affinitätssäulen werden hergestellt durch Zugabe der Anti-GluCl-Antikörper zu Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, welcher mit N-Hydroxysuccinimidestern voraktiviert ist, so dass die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit den Agarosegelperlen-Träger bilden. Die Antikörper werden dann über Amidbindungen mit dem Spacer-Arm an das Gel gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gequencht. Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6), gewaschen, um jeglichen nicht-konjugierten Antikörper oder Fremdprotein zu entfernen. Die Säule wird dann in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) zusammen mit geeigneten membransolubilisierenden Mitteln wie Detergenzien äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, welche solubilisierte(s) GluCl oder GluCl-Untereinheiten enthalten, werden langsam durch die Säule geleitet. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung zusammen mit Detergenzien gewaschen, bis die optische Dichte (A280) auf den Hintergrund abfällt, dann wird das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) zusammen mit Detergenzien eluiert. Das gereinigte GluCl-Protein wird dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert.
SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Glutamat-gesteuertes Chlorid (GluCl)-Kanal-Protein von C. elegans, im wesentlichen frei von anderen Proteinen, welches sowohl die in SEQ-ID-Nr. 3 als auch die in SEQ-ID-Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt.
Expressionsvektor zur Expression eines GluCl-Kanal-Proteins von C. elegans in einer rekombinanten Wirtszelle, wobei der Expressionsvektor DNA umfasst, welche für die in SEQ-ID-Nr. 3 angegebene Aminosäuresequenz kodiert.
Expressionsvektor zur Expression eines GluCl-Kanal-Proteins von C. elegans in einer rekombinanten Wirtszelle, wobei der Expressionsvektor DNA umfasst, welche für die in SEQ-ID-Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz kodiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, welcher die in SEQ-ID-Nr. 1 angegebene Nukleotidsequenz umfaßt.
Expressionsvektor nach Anspruch 3, welcher die in SEQ-ID-Nr. 2 angegebene Nukleotidsequenz umfaßt.
Gereinigtes DNA-Molekül, kodierend für ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz wie in SEQ-ID-Nr. 3 angegeben umfaßt.
Gereinigtes DNA-Molekül, kodierend für ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz wie in SEQ-ID-Nr. 4 angegeben umfaßt.
Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 6, welches aus der in SEQ-ID-Nr. 1 angegebenen Nukleotidsequenz besteht.
Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 7, welches aus der in SEQ-ID-Nr. 2 angegebenen Nukleotidsequenz besteht.
Wirtszelle, welche ein rekombinantes GluCl-Kanal-Protein von C. elegans exprimiert, wobei die Wirtszelle einen Expressionsvektor nach Anspruch 2 oder Anspruch 4 und einen Expressionsvektor nach Anspruch 3 oder Anspruch 5 enthält.
Verfahren zur Expression eines GluCl-Kanal-Proteins von C. elegans in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend: a) Transfizieren eines Expressionsvektors nach Anspruch 2 oder Anspruch 4 und eines Expressionsvektors nach Anspruch 3 oder Anspruch 5 in eine geeignete Wirtszelle und b) Kultivieren der Wirtszelle von Schritt a) unter Bedingungen, welche die Expression des GluCl-Kanal-Proteins von C. elegans von dem Expressionsvektor erlauben.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche avermectin- und/oder glutamat-bindende Proteinaktivität modulieren, umfassend a) Bereitstellen eines GluCl-Proteins von C. elegans mittels rekombinanter Expressionsvektoren, wobei das Protein sowohl die in SEQ-ID-Nr. 3 als auch die in SEQ-ID-Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, und b) Kombinieren eines mutmaßlichen Modulators dieser Aktivität mit dem Protein und Messen einer Wirkung des mutmaßlichen Modulators auf das Protein.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche glutamat-gesteuerte Anionenkanalaktivität modulieren, umfassend a) Bereitstellen einer Zelle, die ein GluCl-Protein von C. elegans mittels rekombinanter Expressionsvektoren oder mittels synthetischer RNA exprimiert, wobei das Protein sowohl die in SEQ-ID-Nr. 3 als auch die in SEQ-ID-Nr. 4 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, und b) Kombinieren eines mutmaßlichen Modulators der Kanalaktivität mit der Zelle und Messen der Wirkung des mutmaßlichen Modulators auf den Kanal.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die gemessene Wirkung die Inhibierung oder Verstärkung der Bindung von Liganden eines glutamat-gesteuerten Anionenkanals ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die gemessene Wirkung die Stimulation oder Inhibierung eines durch glutamat-gesteuerte Anionenkanäle vermittelten Anionenflusses ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Anionenfluß ein Membran-Chloridfluß ist.