DE69603827T3

DE69603827T3 - Östrogen-Rezeptor

Info

Publication number: DE69603827T3
Application number: DE69603827T
Authority: DE
Inventors: George G.J. M.-Karolinska Institut Novum KUIPER; Eva - Karolinska Institute Novum ENMARK; Jan-Ake - Karolinska Institute Novum GUSTAFSSON
Original assignee: Karo Bio AB
Current assignee: Karo Healthcare AB
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-09
Publication date: 2009-11-05
Anticipated expiration: 2016-09-10
Also published as: DK0792292T3; EP0792292B1; AU6988096A; EP0935000A3; US5958710A; ATE183516T1; KR100263137B1; WO1997009348A2; DK0792292T4; DE69603827D1; DE792292T1; GR3031618T3; US20030113803A1; EP0792292B2; CA2201098A1; EP0935000A2; JP2002010788A; AU715528B2; JP2005204666A; ES2135249T5

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zellkern-Rezeptoren und deren Verwendungen.
Eine große Familie von Kern-Rezeptoren ist identifiziert worden, die Zellen die Fähigkeit verleihen, auf Moleküle, wie Retinsäure, Vitamin D, Steroidhormone und Schilddrüsen-Hormone zu reagieren. Umfangreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass Vertreter dieser Kernrezeptor-Superfamilie durch direkte Bindung an als ”Hormonreaktions-Elemente” (HRE) bezeichnete, diskrete cis-wirkende Elemente die Gentranskription aktivieren und/oder reprimieren. Es hat sich gezeigt, dass diese HRE's Wiederholungen von Consensus-DNA-Motiven umfassen, die aus Palindrom-Hexanucleotiden bestehen. Die Spezifität der HRE's wird durch die Orientierung der Hälften (d. h. einer Hälfte einer Palindrom-Sequenz) und die Abstände dazwischen bestimmt (Umenesono, K. et al., Cell, 65 (1991), 1255–1266).
Eine spezifische DNA-Bindung wird durch eine stark konservierte DNA-Bindungsdomäne vermittelt, die zwei Zink-Finger enthält und bei allen so entdeckten Kern-Rezeptoren konserviert ist. Für die Erkennung der Nucleotidsequenz-Hälften sind drei Aminosäuren an der C-terminalen Basis des ersten Zink-Fingers (bekannt als ”P-Box”) wichtig. Vertreter der Kernrezeptor-Superfamilie sind auf der Basis der Aminosäuresequenz innerhalb der P-Box in verschiedene Gruppen eingeteilt worden.
Alle Vertreter der Kernrezeptor-Superfamilie enthalten auch eine hypervariable N-terminale Domäne und eine Liganden-Bindungsdomäne, die einige ”Stücke” einer konservierten Sequenz enthält. Eines davon wird als ”Ti-Domäne” bezeichnet.
Moleküle, von denen man annimmt, dass sie Kern-Rezeptoren sind, weil sie mit charakterisierten Rezeptoren strukturell verwandt sind, für die jedoch kein Ligand gefunden worden ist, werden als ”Waisen-Rezeptoren” bezeichnet. Viele solcher Waisen-Rezeptoren sind identifiziert worden (vgl. beispielsweise Evans, R. M., Science, 240 (1988), 889–895, und O'Malley, B., Mol. Endocrinol., 4 (1990), 363–369).
Nun haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung unerwartet, anfangs bei der Ratte, einen neuartigen Waisen-Rezeptor identifiziert, der mit dem bekannten Östrogen-Rezeptor ERα verwandt ist und der als ”ERβ” (bei der Ratte speziell als ”rERβ”) bezeichnet worden ist. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der verwendete Begriff ”ERβ” Rezeptor rERβ. Die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz von rERβ sind jetzt bestimmt worden und sind in 1 gezeigt.
Ein Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Östrogen-Rezeptors (als ERβ bezeichnet) mit der Aminosäuresequenz von 1 und eines Östrogen-Rezeptors mit einer Aminosäuresequenz, die mit dieser Sequenz zu mehr als 95% identisch ist. Der isolierte Rezeptor lässt sich insbesondere bei der Suche nach Molekülen zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten oder krankhaften Veränderungen, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krankheiten oder krankhafte Veränderungen des zentralen Nervensystems oder Osteoporose, Prostatakrebs oder gutartiger Prostatahyperplasie, einsetzen.
Der erfindungsgemäße Rezeptor kann auch beim Testen von chemischen Substanzen aus der Umwelt auf Östrogen-Aktivität verwendet werden. Die Wirkung verschiedener in die Umwelt freigesetzter chemischer Substanzen auf die Fortpflanzung von Mensch und Tier hat zunehmende Besorgnis ausgelöst. Gefahren für die Fortpflanzungsfähigkeit von Vögeln, Fischen, Reptilien und einigen Säugern sind deutlich geworden und ähnliche Wirkungen beim Menschen sind zu vermuten. Jetzt tauchen stichhaltige Beweise auf, die zeigen, dass der Kontakt mit bestimmten chemischen Substanzen während kritischer Lebensphasen des Fötus die Entwicklung der Fortpflanzungsorgane und des Immun- und Nervensystems beeinträchtigen kann. Auf der Basis möglicher Parallelen zwischen tatsächlichen Wirkungen auf die Tierwelt, die beispielsweise bei in stark verschmutzten Gebieten lebenden Vögeln und Seehunden zu beobachten sind, und vermuteten Wirkungen beim Menschen in Kombination mit belegten Wirkungen auf die Fortpflanzung des Menschen, die durch einen pränatalen Kontakt mit einem Östrogen-Arzneimittel, nämlich Diethylstilbestrol (DES), verursacht werden, hat man die Vermutung geäußert, dass ”östrogene” Chemikalien die Fortpflanzungsfähigkeit sowohl von Tieren als auch des Menschen bedrohen. Unter den chemischen Substanzen, von denen bekannt ist oder die im Verdacht stehen, dass sie Östrogen-Wirkungen auf den menschlichen Körper nachahmen oder in anderer Weise das menschliche endokrine System stören, gibt es mehrere, die bereits als Umweltgefahren identifiziert worden sind. Unter den chemischen Substanzen, die als mögliche Ursachen für Störungen der Fortpflanzungsfunktion bei Tier und Mensch erwähnt worden sind, gibt es chlorierte organische Verbindungen, wie Dieldrin, Endosulfane, Chlordane, Endrine, Aldrin, DDT und einige PCBs, Kunststoffe wie Bisphenol A, Phthalate und Nonylphenol, und aromatische Kohlenwasserstoffe. Man hat die Hypothese aufgestellt, dass einige der vermuteten Wirkungen auf den Menschen auf den zunehmenden Kontakt mit Östrogenen aus der Umwelt zurückzuführen sind, d. h., eigentlich auf den Kontakt mit chemischen Verbindungen, auf die höhere Organismen während der fötalen Phase in einer Weise reagieren, die ähnlich der ist, die sie zeigen, wenn sie mit höheren Östrogen-Dosierungen in Kontakt kommen. Die Wirkungen zeigen sich beispielsweise in Störungen der Geschlechtsmerkmale und einem beeinträchtigten Fortpflanzungspotential. Als mögliche Wirkungen beim Menschen sind auch erhöhte Risiken von Brustkrebs und anderen mit Hormonen im Zusammenhang stehenden Erkrankungen diskutiert worden. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass Umwelt-Schadstoffe nicht nur die belegten ”Östrogen”-Wirkungen ausüben, sondern auch auf anderen Hormon-Stoffwechselwegen als den Östrogen-Stoffwechselweg wirken können. Es hat sich gezeigt, dass p,p'-DDE, das Hauptstoffwechselprodukt von DDT (auch beim Menschen), ein ziemlich wirksames anti-androgenes Mittel ist (Kelce, W. R. et al., Nature, 375 (1995), 581–585). Derzeit sind jedoch epidemiologische Untersuchungen dieser Fragen schwer zu interpretieren. Trotzdem wendet sich die allgemeine Meinung in zunehmendem Maße gegen diese potentiell Hormonstörenden chemischen Substanzen und die Forderungen der Bevölkerung und Umweltschützer an die Regierungsstellen und die Industrie, zu handeln, sind offensichtlich. Angesichts der Ähnlichkeiten zwischen dem erfindungsgemäßen Rezeptor ERβ und dem klassischen Östrogen-Rezeptor kann ERβ bei Tests chemischer Substanzen auf Östrogen-Effekte verwendet werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die einen Östrogen-Rezeptor nach dem ersten Aspekt der Erfindung codiert.
ERβ ist insofern einzigartig, als er zum Ratten-Östrogen-Rezeptor, insbesondere in seiner DNA-Bindungsdomäne, im höchsten Maße homolog ist. Es scheint, dass ERβ eine sehr begrenzte Gewebe-Verteilung hat. Bei weiblichen Ratten scheint er nur in den Eierstöcken vorzukommen und bei männlichen Ratten in der Prostata und den Testikeln. Da diese Gewebe klassische Ziele für die Östrogen-Wirkung darstellen, lässt sich der Schluss ziehen, dass ERβ gewisse Östrogen-Wirkungen vermitteln kann.
Die unterschiedliche Liganden-Spezifität von ERα und ERβ kann genutzt werden, um Arzneimittel zu entwickeln, die für beide Rezeptoren selektiv sind. Insbesondere kann die unterschiedliche Liganden-Spezifität zur Entwicklung von Medikamenten verwendet werden, die spezifisch auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei Frauen nach der Menopause oder auf Osteoporose abzielen.
Im Folgenden werden der erfindungsgemäße Kernrezeptor ERβ, ein Verfahren für seine Herstellung und Tests auf seine Funktionsfähigkeit ausschließlich anhand von Beispielen beschrieben, wobei auf die angefügten 1 bis 8, 10 bis 12 und 15 Bezug genommen wird:
1 zeigt die Aminosäuresequenz von ERβ und die Nucleotidsequenz des den Rezeptor codierenden Gens.
2A stellt einen phylogenetischen Stammbaum dar, der die Evolution von ERβ und anderen Rezeptoren zeigt.
2B zeigt die Homologie zwischen unterschiedlichen Domänen in ERβ und bestimmten anderen Rezeptoren.
In 2C sind die Aminosäuresequenzen der Liganden-Bindungsdomäne von rERβ, rERα, mERα und hERα einander zugeordnet.
In 2D sind die Aminosäuresequenzen der DNA-Bindungsdomäne von rERβ, rERα, mERα und hERα einander zugeordnet.
3A ist ein Film-Autoradiogramm einer Vorsteherdrüse, das eine starke Expression eines Clons des erfindungsgemäßen Rezeptors, nämlich des Clons 29, zeigt.
3B ist eine Dunkelfeld-Bildanalyse, die ein auffälliges Signal für Clon 29 im Epithel (e) von Prostata-Alveolen zeigt. Das/die Stroma(ta) zeigt/zeigen ein schwächeres Signal.
3C ist eine Bipolarisations-Bildanalyse eines mit Cresylviolett gegengefärbten Schnittes, die über dem Epithel (e) Silberkörner zeigt, während das/die Stroma(ta) weniger Körner enthält/enthalten.
In 3A bedeutet der Strich 0,7 mm, in 3B 200 μm und in 3C 30 µm.
4A zeigt ein Film-Autoradiogramm eines Eierstockes, das eine starke Expression von Clon 29 in Follikeln unterschiedlicher Entwicklungsstadien (einige sind durch Pfeile gezeigt) zeigt. Das interstitielle Gewebe (Pfeilspitzen) zeigt ein schwaches Signal.
4B zeigt eine Dunkelfeld-Bildanalyse, die eine hohe Expression von Clon 29 in Körnerzellen primärer (1), sekundärer (2), tertiärer (3) und reifer (4) Follikel zeigt. Im interstitiellen Gewebe (it) ist ein schwaches Signal vorhanden.
4C ist eine Bipolarisations-Bildanalyse eines Eierstocks, die in Körnerzellen (gc) ein starkes Signal zeigt, während in der Eizelle (oc) und der Cainterna (ti) ein deutliches Signal fehlt.
In 4A bedeutet der Strich 0,9 mm, in 4B 140 µm und in 4C 50 µm.
5A veranschaulicht die Ergebnisse einer Sättigungs-Ligandenbindungs-Analyse von cloniertem ERβ.
5B veranschaulicht die Spezifität einer Ligandenbindung durch clonierten ERβ.
5C veranschaulicht die E2-Bindung durch ERβ.
6 veranschaulicht die Aktivierung der Transkription durch clonierten ERβ.
Die 7 und 7A veranschaulichen die Stimulierung von cloniertem ERβ durch verschiedene Liganden.
8 veranschaulicht die Ergebnisse von RT-PCR-Experimenten zur Expression von Ratten-Östrogen-Rezeptoren.
10A ist eine Hill-Darstellung, in der die Bindung von ¹²⁵I-E2 durch hERα mit der durch rERβ verglichen wird.
10B ist eine Scatchard-Darstellung, in der die Bindung von ¹²⁵I-E2 durch hERα mit der durch rERβ verglichen wird.
11A veranschaulicht die relative Bindungsaffinität von hERα und rERβ zu verschiedenen Liganden.
11B ist ein Ausschnitt von 11A.
12 zeigt verschiedene Östrogen-Rezeptoren, die einander zugeordnet sind; und
15 veranschaulicht die Liganden-Bindungsaffinitäten erfindungsgemäßer ER's zu verschiedenen Phytoöstrogenen.
A. CLONIERUNG VON RATTEN-ERβ
1. PCR-Amplifikation und Clonierung komplementärer DNA
Ein Satz degenerierter Primer (DBD 1.2.3 und WAK/FAK) entsprechend den am stärksten konservierten Sequenzen der DNA-Bindungsdomäne (P-Box) und der Liganden-Bindungsdomäne (Ti-Abschnitt) von Vertretern der Kernrezeptor- Familie ist bereits entworfen worden (Enmark, E., Kainu, T., Pelto-Huikko, M. und Gustafsson, J.-A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204 (1994), 49–56). Einzelsträngige komplementäre DNA, die mittels Umkehrtranskription von Gesamt-RNA aus Ratten-Prostata erhalten worden war, wurde mit den Primern in PCR-Reaktionen eingesetzt, wie in Enmark, E., Kainu, T., Pelto-Huikko, M. und Gustafsson, J.-A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204 (1994), 49–56, beschrieben. Die Amplifikationsprodukte wurden auf einem 2%-igen Gel von bei niedriger Temperatur schmelzender Agarose aufgetrennt und DNA-Produkte von 400 bp bis 700 bp wurden aus dem Gel isoliert und an einen TA-Clonierungsvektor (Invitrogen) ligiert. In anderen Ausführungsformen verwendeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung in der DNA-Bindungsdomäne von Kern-Rezeptoren auch die Primersätze RP-1/RP-2 und DBD66-100/DBD210-238, genauso, wie von Hirose, T., Fijimoto, W., Yamaai, T., Kim, K. H., Matsuura, H. und Jetten, A. M., Mol. Endocrinol., 8 (1994), 1667–1677, bzw. Chang, C., Lopes Da Silva, S., Ideta, R., Lee, Y., Yeh, S. und Burbach, J. P. H., Proc. Natl. Acad. Sci., 91 (1994), 6040–6044, beschrieben. Der Clon Nr. 29 (mit dem Satz DBD-WAK/FAK erhalten) mit einer Länge von 462 bp zeigte eine hohe Homologie (65%) zu der Ratten-Östrogen-Rezeptor-cDNA (65%), die bereits aus der Ratten-Gebärmutter cloniert worden war (Koike, S., Sakai, M. und Muramatsu, M., Nucleic Acids Res., 15 (1987), 2499–2513). Die durch die DNA-Sequenzen von Clon 29 abgeleiteten Aminosäurereste ließen vermuten, dass dieses DNA-Fragment einen Teil der DNA-Bindungsdomäne, einen Hinge-Bereich und den Anfang der Liganden-Bindungsdomäne eines neuartigen Vertreters der Kernrezeptor-Familie codierte. Zwei PCR-Primer (1) wurden zur Erzeugung einer aus dem Hinge-Bereich des neuartigen Rezeptors bestehenden Sonde von 204 bp verwendet, die zum Screenen einer Rattenprostata-cDNA-Genbank (Clontech gt10) unter stringenten Bedingungen verwendet wurde, was zu vier stark positiven Clonen mit einer Größe von 0,9 kb, 1,8 kb, 2,5 kb bzw. 5 kb–6 kb führte. Der Clon von 2,5 kb wurde sequenziert und 1 zeigt die Nucleotidsequenz, die in einer Kern-Anlage (CyberGene AB) mittels cyclischer Sequenzierung unter Verwendung fluoreszierender Terminatoren (Applied Biosystems) an beiden Strängen mit einer Reihe interner Primer bestimmt wurde, und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Clon 29. Am Nucleotid 424 und am Nucleotid 448 befinden sich zwei ATG-Codons im Leseraster, denen am Nucleotid 319 ein Stoppcodon im Leseraster vorausgeht, was nahelegt, dass es sich bei beiden um mögliche Startcodons handelt. Das offene Leseraster codiert ein Protein von 485 Aminosäureresten (vom ersten Methionin-Rest aus gerechnet) mit einem berechneten Molekulargewicht von 54,2 kDa. Eine Analyse der Proteine mittels einer in vitro-Translationssynthese von Clon 29-cRNA in Kaninchen-Retikulocytenlysat zeigte eine Protein-Doppelbande, die auf SDS-PAGE-Gelen bei etwa 57 kDa wanderte (Daten nicht gezeigt), wobei das offene Leseraster bestätigt wurde. Die Protein-Doppelbande wird wahrscheinlich durch die Verwendung beider ATG-Codons zur Initiierung der Proteinsynthese verursacht. Die Aminosäuresequenz des Proteins von Clon 29 zeigt die charakteristische Zinkmodul-DNA-Bindungsdomäne, einen Hinge-Bereich und eine mutmaßliche Liganden-Bindungsdomäne, die charakteristische Merkmale von Vertretern der Kernrezeptor-Familie darstellen (Tsai, M.-J. und O'Malley, B. W., Ann. Rev. Biochem., 63 (1994), 451–486; Härd, T. und Gustafsson, J.-A., Acc. Chem. Res., 26 (1993), 644–650; Laudet, V., Hänni, C., Coli, J., Catzeflis, F. und Stehelin, D., EMBL J., 11 (1992), 1003–1012).
Ein Vergleich der Proteinsequenz mit verschiedenen Vertretern der Kernrezeptor-Familie (2) zeigte, dass das Protein von Clon 29 am stärksten mit dem Ratten-Östrogen-Rezeptor (ERα) verwandt ist, der aus dem Uterus cloniert worden ist (Koike, S., Sakai, M. und Muramatsu, M., Nucleic Acids Res., 15 (1987), 2499–2513), wobei die DNA-Bindungsdomäne zu 95% identisch ist (Aminosäurereste 103–167) (Griffiths, K., Davies, P., Eaton, C. I., Harper, M. E., Turkes, A. und Peeling, W. B., in: Endocrine Dependent Tumours (Herausgeber Voigt, K.-D. und Knabbe, C.) (1991), S. 83–125, Raven Press). Innerhalb der DNA-Bindungsdomäne von Kernrezeptoren ist eine Reihe funktioneller Merkmale identifiziert worden (Härd, T. und Gustafsson, J.-A., Acc. Chem. Res., 26 (1993), 644–650, und Zilliacus, J., Carlstedt-Duke, J., Gustafsson, J.-A. und Wright, A. P. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994), 4175–4179). Die sogenannte P-Box bestimmt die Erkennung der Nucleotidsequenz der Kernhälfte innerhalb des Reaktionselementes, während die D-Box die Dimerisierung zwischen Rezeptor-Monomeren vermittelt. Die P-Box- und D-Box-Sequenzen des Proteins von Clon 29, EGCKA bzw. PATNQ sind mit denen der entsprechenden Boxen in ERα (Härd, T. und Gustafsson, J.-A., Acc. Chem. Res., 26 (1993), 644–650, und Koike, S., Sakai, M. und Muramatsu, M., Nucleic Acids Res., 15 (1987), 2499–2513) identisch, wodurch sich vorhersagen lässt, dass das Protein von Clon 29 an ERE-Sequenzen bindet.
Die mutmaßliche Liganden-Bindungsdomäne (LBD) des Proteins von Clon 29 (Aminosäurereste 259–457) zeigt die stärkste Homologie zur LBD des Ratten-ERα (2), während die Homologie zu den menschlichen ERR1- und ERR2-Proteinen (Giguere, V., Yang, N., Segui, P. und Evans, R. M., Nature, 331 (1988), 91–94) erheblich geringer ist. Die Homologie der LBD zu den der menschlichen, Maus- und Xenopus-Östrogen-Rezeptoren beträgt auch etwa 55%, während die Homologie zu der LBD anderer Steroid-Rezeptoren nicht signifikant ist (2). Der Cystein-Rest 530 im menschlichen ERα ist als kovalente Verknüpfungsstelle eines Östrogen-Affinitätsmarkers identifiziert worden (Harlow, K. W., Smith, D. N., Katzenellenbogen, J. A., Greene, G. L. und Katzenellenbogen, B. S., J. Biol. Chem., 264 (1989), 17476–17485). Interessanterweise besitzen sowohl das Protein von Clon 29 (Cys-436) als auch die Maus-, Ratten- und Xenopus-ERαs einen Cystein-Rest an der entsprechenden Position. Auch zwei andere Aminosäurereste, die als nahe bei oder als Teil der Liganden-Bindungstasche der menschlichen ERα-LBD beschrieben worden sind (Asp 426 und Gly 521), sind in der LBD des Proteins von Clon 29 (Asp 333 und Gly 427) und in der LBD von ERαs verschiedener Arten (20, 21) konserviert. Die in ERα identifizierte Liganden-abhängige Transaktivierungsfunktion TAF-2 (Danielian, P. S., White, R., Lees, J. A. und Parker, M. G., EMBO J., 11 (1992), 1025–1033), von der man annimmt, dass sie am Kontakt mit anderen Transkriptionsfaktoren beteiligt ist und dadurch die Aktivierung der Transkription von Zielgenen beeinflusst, ist im Protein von Clon 29 fast vollständig konserviert (Aminosäurereste 441–457). Steroidhormon-Rezeptoren sind Phosphoproteine (Kuiper, G. und Brinkmann, A. O., Mol. Cell. Endocrinol., 100 (1994), 103–107) und mehrere Phosphorylierungsstellen, die in der N-terminalen Domäne und LBD von ERα identifiziert worden sind (Arnold, S. F., Obourn, J. D., Jaffe, H. und Notides, A. C., Mol. Endocrinol., 9 (1995), 24–33, und Le Goff, P., Montano, M. M., Schodin, D. J. und Katzenellenbogen, B. S., J. Biol. Chem., 269 (1994), 4458–4466), sind im Protein von Clon 29 konserviert (Ser 30 und Ser 42, Tyr 443). Das Protein von Clon 29 besteht aus 485 Aminosäureresten, während ERαs von Mensch, Maus und Ratte aus 590–600 Aminosäureresten bestehen. Der Hauptunterschied besteht in einer viel kürzeren N-terminalen Domäne im Protein von Clon 29, d. h. 103 Aminosäurereste im Vergleich zu 185–190 Aminosäureresten in den anderen Rezeptorproteinen. Auch die nicht-konservierte sogenannte F-Domäne am C-terminalen Ende von ERαs ist im Protein von Clon 29 15 Aminosäurereste kürzer. Die cDNA-Insertion eines positiven Clons von 2,6 kb wurde in die EcoRI-Stelle von pBluescript (Warenzeichen) (Stratagene) subcloniert. Die vollständige DNA-Sequenz von Clon 29 wurde mittels cyclischer Sequenzierung unter Verwendung fluoreszierender Terminatoren (Applied Biosystems) auf beiden Strängen mit einer Reihe interner Primer bestimmt (CyberGene AB).
In 2C bzw. 2D werden die Liganden- und DNA-Bindungsdomäne von ERβ mit denen von Ratten-, Maus- und menschlichen ERαs verglichen.
2. Sättigungs-Ligandenbindungs-Analyse und kompetitive Liganden-Untersuchungen:
Die cDNA von Clon 29 wurde in pBluescript stromabwärts vom T7-Promotor subcloniert, wobei p29-T7 erhalten wurde. Das Protein von Clon 29 wurde unter Verwendung des TnT-gekoppelten Retikulocytenlysat-Systems (Promega) in vitro synthetisiert. Translations-Reaktionsgemische wurden fünfmal mit TEDGMo-Puffer (40 mM Tris/HCI, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 10 mM Na₂MoO₄, 10 mM DTT) verdünnt und 0,1 ml-Aliquots wurden 16 h bei 8°C mit 0,3 nM–6,2 nM [2,4,6,7-3H]-17β-Estradiol (NEN-Dupont; spezifische Radioaktivität 85 Ci/mmol) in Gegenwart oder Abwesenheit eines 200-fachen Überschusses von unmarkiertem E2 inkubiert.
5A veranschaulicht die Ergebnisse einer Sättigungs-Ligandenanalyse des Proteins von Clon 29. Protein von Clon 29 enthaltendes Retikulocytenlysat wurde mit [³H]-E2 in 6 Konzentrationen von 0,3 nM bis 6,0 nM inkubiert. Parallelröhrchen enthielten zusätzlich die 200-fache Menge von nicht-radioaktivem E2. Gebundene und freie Liganden wurden mittels eines Tests unter Verwendung von Dextran-beschichteter Aktivkohle getrennt. Der K_d-Wert (0,6 nM) wurde anhand der Neigung der Linie in der gezeigten Scatchard-Darstellung (r = 0,93) berechnet und die Anzahl der Bindungsstellen wurde aus dem Schnittpunkt auf der Abszisse extrapoliert (Bmax = 1400 fmol/ml unverdünntes Translationsgemisch).
Für kompetitive Liganden-Untersuchungen wurde verdünntes Retikulocytenlysat mit 5 nM [2,4,6,7-³H]-17β-Estradiol 16 h bei 8°C in Gegenwart von nicht-radioaktivem E2, Estron, Estriol, Testosteron, Progesteron, Corticosteron, 5α-Androstan-3β,17β-diol, 5α-Androstan-3α, 17β-diol und Diethylstilbestrol (DCES) in Konzentrationen von 0,5 nM, 50 nM, 500 nM oder 5000 nM inkubiert. Gebundene und ungebundene Steroide wurden mittels eines Tests unter Verwendung von Dextran-beschichteter Aktivkohle (Ekman, P., Barrack, E. R., Greene, G. L, Jensen, E. V. und Walsh, P. C., J. Clin. Endocrinol. Metab., 57 (1983), 166–176) getrennt.
5B veranschaulicht die Spezifität der Ligandenbindung durch das Protein von Clon 29. Das Protein von Clon 29 enthaltendes Retikulocytenlysat wurde 16 h mit 5 nM [³H]-E2 und dem angegebenen x-fachen Überschuss kompetitiver Substanzen äquilibriert. Die Daten stellen [³H]-E2 dar, das in Gegenwart von unmarkiertem E2, Testosteron (T), Progesteron (prog), Corticosteron (cortico), Estron (E1), Diethylstilbestrol (DES), 5α-Androstan-3α,17β-diol (3α-AD), 5α-Androstan-3β,17β-diol (3β-AD) und Estriol (E3) gebunden wurde. Die Bindung von [³H]-E2 in Abwesenheit einer kompetitiven Substanz wurde mit 100% angesetzt.
3. In situ-Hybridisierung:
Die in situ-Hybridisierung wurde wie bereits beschrieben (Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J. und Hökfelt, T., Histochemistry, 98 (1992), 39–49) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden zwei gegen die Nucleotide 994–1041 bzw. 1981–2031 gerichtete Oligonucleotid-Sonden unter Verwendung terminaler Desoxynucleotidyltransferase (Amersham, GB) jeweils am 3'-Ende mit ³²P-dATP markiert. Für diese Untersuchung wurden erwachsene männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (im Alter von 2 bis 3 Monaten, n = 10) verwendet. Die Ratten wurden geköpft und die Gewebe wurden schnell entfernt und auf Trockeneis eingefroren. Die Gewebe wurden in einem Microm-HM500-Kryostat 14 µm dünn geschnitten und auf ”Probe-On”-Glasobjektträgern (Fisher Scientific, PA, USA) aufgetaut. Die Objektträger wurden bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt. Die Objektträger wurden in Kästchen mit erhöhtem Feuchtigkeitsgehalt 18 h bei 42°C mit 1 × 10⁶ CpM der Sonde in einer Hybridisierungslösung inkubiert, die 50% Formamid, 4 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 1 × Denhardt-Lösung (0,02% BSA, 0,02% FicoII, 0,02% PVP), 1% Sarkosyl, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7), 10% Dextransulfat, 500 µg/ml Lachssperma-DNA und 200 mM DTT enthielt. Die Objektträger wurden anschließend 60 min bei 55°C in 1 × SSC unter viermaligem Wechseln von SSC und schließlich in 1 × SSC gespült, wobei bei 55°C begonnen und langsam auf Raumtemperatur gekühlt wurde, in destilliertes Wasser überführt und in 50%-igem und 95%-igem Ethanol jeweils 30 sek kurz dehydratisiert, an der Luft getrocknet und mit einem Amersham-β-man-Autoradiographiefilm 15 bis 30 Tage bedeckt. In einer anderen Ausführungsform wurden die Objektträger in eine Kodak-NTB2-Kernspur-Emulsion (mit destilliertem Wasser 1:1 verdünnt) getaucht und 30 bis 60 Tage bei 4°C exponiert. Schließlich wurden die Schnitte mit Kresylviolett gefärbt.
Eine deutliche Expression von Clon 29 wurde im Fortpflanzungstrakt sowohl männlicher als auch weiblicher Ratten beobachtet, während in allen anderen Ratten-Geweben die Expression sehr gering war oder unter der Nachweisgrenze der in situ-Hybridisierung lag (nicht gezeigt). Bei den männlichen Fortpflanzungsorganen wurde eine hohe Expression in der Vorsteherdrüse beobachtet (3), während in den Testikeln, Nebenhoden und Vesicula seminalis eine sehr geringe Expression beobachtet wurde (nicht gezeigt). Bei den getauchten Schnitten war eine Expression in den Prostata-Epithelzellen (sezernierende Alveoli) deutlich sichtbar, während die Expression in glatten Muskelzellen und Fibroblasten im Stroms gering war (3). Bei den weiblichen Fortpflanzungsorganen war eine Expression im Eierstock zu sehen (4), während Uterus und Vagina negativ waren (nicht gezeigt). Bei den getauchten Schnitten war eine hohe Expression in der Granulosazellschicht von Primär-, Sekundär- und reifen Follikeln zu sehen (4), während Primordialfollikel, Oocyten und Gelbkörper vollkommen negativ erschienen. Eine geringe Expression war in den interstitiellen Zellen des Eierstocks zu beobachten. Beide verwendeten Antisense-Oligonucleotidsonden führten zu ähnlichen Ergebnissen. Durch Zugabe eines 100-fachen Überschusses der entsprechenden unmarkierten Oligonucleotidsonden während der Hybridisierungsreaktionen wurden alle Signale beseitigt.
4. Transaktivierungs-Analyse in CHO-Zellen:
Durch Insertion des Clon 29 enthaltenden 2,6 kb-Fragments in die EcoRI-Stelle des Expressionsvektors pCMV5 (Anderson, S., Davis, D. L., Dahlbäck, H., Jörnvall, H. und Russell, D. W., J. Biol. Chem., 264 (1989), 8222–8229) wurde der Expressionsvektor pCMV29 konstruiert. Das pERE-ALP-Reporter-Konstrukt enthält das Plazenta-Gen für eine sezernierte Form der alkalischen Phosphatase (Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. und Cullen, B. R., Gene, 66 (1988), 1–10) und das MMTV-LTR-Element, in dem die Glucocorticoidreaktions-Elemente durch das Vitellogeninpromotor-Östrogenreaktions-Element (ERE) ersetzt waren.
CHO-K1-Zellen wurden in Phenolrot-freiem Ham-F12-Medium mit 5% FCS (mit Dextran-beschichteter Aktivkohle behandelt) und 2 mM L-Glutamin in Platten mit 12 Vertiefungen in einer Dichte von etwa 1,7 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung angeimpft. Nach 24 h wurden die Zellen mit 250 ng pERE-ALP-Vektor und 50 ng pCMV29 unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco) nach den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Nach 5-ständiger Inkubation wurden die Zellen gewaschen und erneut mit 0,5 ml Phenolrotfreiem Coon-F-12-Medium versorgt, das 5% Serum-Ersatz (SRC 3000, Tissue Culture Services Ltd., Botolph Claydon, Buckingham, GB), 2 mM L-Glutamin und 50 µg/ml Gentamycin sowie die angegebenen Hormone enthielt. Nach 48 h wurde das Medium mit Hilfe eines Chemilumineszenz-Tests auf die Aktivität von alkalischer Phosphatase (ALP) untersucht. Ein 10 µl-Aliquot des Zellkultur-Mediums wurde mit 200 µl Testpuffer (10 mM Diethanolamin, pH 10,0, 1 mM MgCl₂ und 0,5 mM CSPD (Tropix Inc., Boston, USA)) gemischt und 20 min bei 37°C inkubiert, bevor eine Bestimmung in einer Mikroplatten-Luminometer-Vorrichtung (Luminoskan; Labsystems, Finnland) mit einer 1-sekundigen Integralbestimmung erfolgte. Die nur vom ERE-Reporter herrührende ALP-Aktivität wurde mit 1 angesetzt.
5. Merkmale der Ligandenbindung und Transaktivierungs-Funktion des Proteins von Clon 29:
Aufgrund der beschriebenen hohen Homologie zwischen den DBD- und LBD-Domänen des Proteins von Clon 29 und des Ratten-ERα wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Protein von Clon 29 einen neuartigen ER codieren könnte. Darüber hinaus sind die biologischen Wirkungen von Östrogenen auf die Ratten-Prostata und den Ratten-Eierstock wohlbekannt, die eine hohe Expression der RNA von Clon 29 zeigen (Griffiths, K., Davies, P., Eaton, C. I., Harper, M. E., Turkes, A. und Peeling, W. B., in: Endocrine Dependent Tumours (Herausgeber Voigt, K.-D. und Knabbe, C.), (1991), S. 83–125, Raven Press; Richards, J. S., Endocrine Rev., 15 (1994), 725–745; und Habenicht, U.-F., Tunn, U. W., Senge, Th., Schroder, R. H., Schweikert, H. U., Bartsch, G. und EI Etreby, M. F., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 44 (1993), 557–563). Zur Analyse der Steroidbindungseigenschaften des in vitro synthetisierten Proteins von Clon 29 wurde das Retikulocytenlysat 16 h bei 8°C mit steigenden Konzentrationen (0,3 nM–6,0 nM) von [³H]-E2 in Gegenwart oder Abwesenheit eines 200-fachen molaren Überschusses von unmarkiertem E2 inkubiert. Eine lineare Transformation von Sättigungsdaten enthüllte eine einzige Population von Bindungsstellen für E2 mit einem K_d-Wert (Dissoziationskonstante) von 0,6 nM (5A und C). Die Steroidbindungsspezifität wurde durch Inkubation von Retikulocytenlysat mit 5 nM [³H]-E2 in Gegenwart von unmarkierten kompetitiven Substanzen, die in Konzentrationen von 0,5 nM, 50 nM, 500 nM und 5000 nM vorlagen, bestimmt. Die bei den kompetitiven Tests erzeugten Kurven weisen auf einen Östrogen-Rezeptor hin, bei dem nur Östrogene effizient um Bindung an [³H]-E2 konkurrieren (5B). Eine 50%-ige Hemmung der spezifischen Bindung erfolgte bei einem 0,6-fachen Überschuss von unmarkiertem E2; Diethylstilbestrol, Estriol, Estron und 5α-Androstan-3β,17β-diol waren als kompetitive Substanzen 5mal, 15mal, 50mal bzw. 150mal weniger effektiv. Weder Testosteron, Progesteron, Corticosteron noch 5α-Androstan-3α,17β-diol waren effiziente kompetitive Substanzen, nicht einmal in den höchsten verwendeten Konzentrationen (1000-facher Überschuss). Die Dissoziationskonstante und die bestimmten Steroidbindungs-Spezifitäten stimmen gut mit den Daten überein, die bereits für ERs in Ratten- und menschlicher Prostata, Ratten-Granulosazellen, Ratten-Antralfollikeln und ganzem Ratten-Ovarialgewebe berichtet worden sind (Ekman, P., Barrack, E. R., Greene, G. L., Jensen, E. V. und Walsh, P. C., J. Clin. Endocrinol. Metab., 57 (1983), 166–176; van Beurden-Lamers, W. M. O., Brinkmann, A. O., Mulder, E. und van der Molen, H., Biochem. J., 140 (1974), 495–502; Kudolo, G. B., Elder, M. G. und Myatt, L, J. Endocrinol., 102 (1984), 83–91 und Kawashima, M. und Greenwald, G. S., Biology of Reprod., 48 (1993), 172–179).
Als das Protein von Clon 29 mit einer Sättigungsdosis von [³H]-E2 markiert und auf Saccharose-Dichtegradienten analysiert wurde, wurde ein einzelner Peak spezifisch gebundener Radioaktivität beobachtet. Der Sedimentations-Koeffizient dieses Komplexes betrug etwa 7S, wobei sich dieser in Gegenwart von 0,4 M NaCl nach 4S verschob (nicht gezeigt). Zur Untersuchung der Transkriptions-Regulationseigenschaften des Proteins von Clon 29 führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Cotransfektions-Experimente durch, bei denen CHO-Zellen mit einem das Protein von Clon 29 exprimierenden Expressionsvektor und/oder einem auf Östrogen reagierenden Reportergen-Konstrukt transfiziert wurden. Die Zellen wurden in Abwesenheit von E2 (Clon 29) oder in Gegenwart von 100 nM E2 (Clon 29 + E2) oder in Gegenwart von 100 nM E2 und 12 µM Tamoxifen (Clon 29 + E2/Tam) inkubiert. In Abwesenheit von exogen zugegebenem E2 zeigte das Protein von Clon 29 eine erhebliche Transkriptionsaktivität, die durch Zugabe von 100 nM E2 weiter erhöht werden konnte (6). Eine gleichzeitige Zugabe eines 10-fachen Überschusses des Antiöstrogens Tamoxifen unterdrückte partiell die E2-stimulierte Aktivität (6). Die konstitutive Transkriptionsaktivität des Proteins von Clon 29 konnte durch das Antiöstrogen ICI-1624384 unterdrückt werden (nicht gezeigt). Zuvor hatte sich gezeigt, dass Wildtyp-ERs von Maus und Mensch konstitutive Transkriptions-Aktivatoren sind und dass die Transkriptionsaktivität durch Zugabe von E2 weiter stimuliert werden kann (Txukerman, M., Xiao-Kun Zhang, Hermann, T., Wills, K. N., Graupner, G. und Phal, M., New Biologist, 2 (1990), 613–620; und Lees, J. A., Fawell, S. E. und Parker, M. G., Nucl. Acids Res., 17 (1989), 5477–5488). Um einen besseren Einblick zu bekommen, welche E2-Konzentrationen die Transkriptionsaktivität des Proteins von Clon 29 bewirken, wurden kurzzeitige Transfektions-Experimente in Gegenwart von steigenden E2-Konzentrationen durchgeführt. CHO-Zellen wurden kurzzeitig mit dem ERE- Reporter-Plasmid und dem das Protein von Clon 29 exprimierenden Expressionsplasmid transfiziert. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von E2 (0,1 nM–1000 nM), Estron (E1, 1000 nM) und 5α-Androstan-3β,17β-diol (3β-AD, 1000 nM) inkubiert oder es wurde kein Ligand zugegeben. Die Aktivität von alkalischer Phosphatase (ALP) wurde wie beschrieben bestimmt und die Aktivität in Abwesenheit eines Liganden (Kontrolle) wurde mit 1 angesetzt. Die Figur zeigt relative ALP-Aktivitäten (± Standardabweichung) von drei unabhängigen Experimenten. Das Protein von Clon 29 begann bei 0,1 nM E2 zu reagieren, und eine maximale Stimulation wurde bei 1 nM bis 10 nM E2 beobachtet (7). Der maximale Stimulationsfaktor betrug 2,6 ± 0,5 (Durchschnitt ± Standardabweichung, n = 9), verglichen mit einer Inkubation in Abwesenheit von E2. Außer E2 konnten auch Estron und 5α-Androstan-3β,17β-diol die Transkriptionsaktivität stimulieren, wenn auch in höheren Konzentrationen (7). Dexamethason, Testosteron, Progesteron, 5α-Androstan-3α,17β-diol, Schilddrüsenhormon und all-trans-Retinsäure konnten die Transkriptionsaktivität des Proteins von Clon 29 nicht stimulieren, nicht einmal in der höchsten getesteten Konzentration (1000 nM) (nicht gezeigt). Die Ergebnisse der Cotransfektions-Experimente stimmen gut mit den in 5 gezeigten Ligandenbindungs- und Spezifitäts-Daten des Proteins von Clon 29 überein. In Kontroll-Experimenten zeigte auch der menschliche Wildtyp-ERα in Abwesenheit von E2 Transkriptionsaktivität, die durch Zugabe von E2 erhöht werden konnte (nicht gezeigt).
6. Nachweis der Ratten-ER-Expression mittels RT-PCR
Die Gewebespezifität der Expression von Ratten-ERβ und -ERα wurde mittels einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung reverser Transkriptase (RT-PCR) bestimmt. Die Ergebnisse des Experiments sind in 8 gezeigt.
2. Vergleich der Liganden-Bindungsaffinität von hERα und rERβ
Die Ligandenaffinität der zwei Östrogen-Rezeptoren, d. h. menschlichem ERα (Eierstock) (hERα) und Ratten-ERβ (rERβ) wurde in Bindungs-Sättigungsexperimenten und in kompetitiven Bindungs-Experimenten getestet.
cDNAs der Rezeptor-Subtypen hERα und rERβ wurden in Kaninchen-Retikulocytenlysat in Gegenwart nicht-radioaktiver Aminosäuren nach den vom Hersteller (Promega) gelieferten Anweisungen in vitro translatiert.
Bei dem in allen Experimenten verwendeten radioaktiven Liganden handelte es sich um 16α-[¹²⁵I]-17β-Estradiol([¹²⁵I]-E2) (NEX-144, New England Nuclear). Das Verfahren für Bindungsexperimente wurde bereits in Salomonsson, M., Carlsson, B. und Haggblad, J., J. Steroid Biochem. Molec. Biol., Bd. 50 Nr. 5/6 (1994), S. 313–318, beschrieben. Kurz gesagt, wurden Östrogen-Rezeptoren mit [¹²⁵I]-E2 bis zum Gleichgewicht inkubiert (16 h–18 h bei +4°C). Die Inkubation wurde durch Trennung von proteingebundenem [¹²⁵I]-E2 von freiem [¹²⁵I]-E2 auf Sephadex-G25-Säulen gestoppt. Die Radioaktivität des Eluats wurde in einem gamma-Zähler bestimmt.
Bei den kompetitiven Experimenten wurden nicht-radioaktive Liganden in DMSO verdünnt, mit [¹²⁵I]-E2 (etwa 100 pM–200 pM) gemischt, in paralle Aliquots aufgeteilt und schließlich wurde hERα oder rERβ zugegeben. Die Endkonzentration von DMSO im Bindungspuffer betrug 2%.
Der bei den Experimenten verwendete Puffer wies die folgende Zusammensetzung auf: 20 mM Hepes (pH = 7,5), 150 mM KCI, 1 mM EDTA, 8,7% Glycerin, 6 mM Monothioglycerin, 10 mM Na₂MoO₄.
3. Gleichgewichts-Bindungs-Sättigungsexperimente (K_d-Bestimmungen)
Verschiedene Konzentrationen von [¹²⁵I]-E2 wurden mit ERs gemischt und wie vorstehend beschrieben, inkubiert. Freies [¹²⁵I]-E2 wurde durch Subtraktion von gebundenem [¹²⁵I]-E2 von zugegebenem [¹²⁵I]-E2 bestimmt. Die Bindungsdaten wurden mittels Hill-Darstellungen und Scatchard-Darstellungen analysiert (11). Die Gleichgewichts-Bindungsdaten sind in Tabelle 1 gezeigt. Die apparenten K_d-Werte für [¹²⁵I]-E2 unterschieden sich bei den beiden ERs etwa um den Faktor 4: K_d(hERα):K_d(rERβ) = 1:4. Tabelle 1. Gleichgewichts-Dissoziationskonstanten für [¹²⁵I]-E2 der beiden Subtypen

Rezeptor-Subtyp K_d (Hill-Darstellung) K_d (Scatchard-Darstellung)

hERα rERβ 0,06 nM 0,24 nM 0,09 nM 0,42 nM
4. Kompetitive Hemmungsexperimente (IK₅₀-Bestimmungen)
Die Experimente wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. IK₅₀-Werte wurden durch Anwendung einer vier Parameter umfassenden logistischen Analyse erhalten: b = ((b_max – b_min)/(1 + (I/IK₅₀)^S)) + b_min, wobei I die Konzentration eines zugegebenen Bindungs-Inhibitors darstellt, IK₅₀ die Inhibitor-Konzentration bei halbmaximaler Bindung bedeutet und S ein Neigungsfaktor ist. Die Konzentration von freiem [¹²⁵I]-E2 wurde bestimmt, indem am Ende der Inkubation den Vertiefungen ein Aliquot als Stichprobe entnommen wurde und danach die gebundene Radioaktivität von der Gesamt-Radioaktivität der Stichprobe subtrahiert wurde.
Da die Gleichgewichts-Bindungsexperimente (vorstehend) zeigten, dass die beiden ERs unterschiedliche K_d-Werte für [¹²⁵I]-E2 aufwiesen, wurden für die untersuchten Verbindungen K_i-Werte (anhand der Cheng-Prusoff-Gleichung: K_i = IK₅₀/(I + L/K_d), wobei L freies [¹²⁵I]-E2 bedeutet) berechnet. Zur Berechnung von RBA (Relative Bindungsaffinität) wurden zwei Verfahrensweisen angewendet. Die RBA-Werte wurden entweder unter Verwendung der IK₅₀-Werte oder der K_i-Werte gewonnen. Bei beiden Verfahrensweisen wurde der Wert für die Verbindung 16α-Brom-estradiol als Bezugswert (100%) ausgewählt. Beide Verfahrensweisen ergaben ähnliche Ergebnisse. Die Ergebnisse sind in 12 zusammengefasst. In dieser Figur bedeutet ”4-OH-Tam” 4-Hydroxytamoxifen, ”DES” Diethylstilbestrol, ”Hexestr” Hexestrol, ”ICI-164384” die ICI-plc-Verbindung Nr. 164384, ”17β-E2” 17β-Estradiol, ”16α-B-E2” 16α-Brom-estradiol, ”Ralox” Raloxifen und ”17α-E2” 17α-Estradiol.
Die Ergebnisse zeigen, dass ERα und ERβ signifikant unterschiedliche Liganden-Bindungsaffinitäten aufweisen – bei den beiden ER's unterschieden sich die apparenten K_d-Werte für [¹²⁵I]-E2 um einen Faktor von etwa 4 (K_d(hERα):K_d(rERβ) ≈ 1:4). Einige untersuchte Verbindungen zeigten bei der kompetitiven Hemmung der Bindung von [¹²⁵I]-E2 an die ERs signifikante Unterschiede. Es stellte sich heraus, dass bestimmte Verbindungen die Bindung von [¹²⁵I]-E2 an hERα im Vergleich zu der an rERβ stärker hemmten, während sich bei anderen herausstellte, dass sie stärkere Inhibitoren der Bindung von [¹²⁵I]-E2 an rERβ sind als der von [¹²⁵I]-E2 an hERα.

Claims

Isolierter Östrogenrezeptor (benannt ERβ) mit der Aminosäuresequenz von 1.
Isolierter Östrogenrezeptor (benannt ERβ) mit einer Aminosäuresequenz, die zu mehr als 95% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von 1.
Isolierte DNA-Sequenz, die einen Östrogenrezeptor nach einem der vorangehenden Ansprüche codiert.
isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 3, in der die DNA-Sequenz die Sequenz ist, die in 1 gezeigt ist.
Verwendung eines Östrogenrezeptors nach Anspruch 1 oder 2 oder einer DNA-Sequenz nach Anspruch 3 oder 4 in einem Test zur Bestimmung von Molekülen, die an einen Östrogenrezeptor nach Anspruch 1 oder 2 binden.
Verwendung eines Östrogenrezeptors nach Anspruch 1 oder 2 oder einer DNA-Sequenz nach Anspruch 3 oder 4 in einem Test zur Bestimmung von Molekülen für die Verwendung in der Behandlung von Prostata- oder Eierstockkrebs, gutartiger Prostatahyperplasie, Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Osteoporose oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Verfahren zur Konstruktion eines Wirkstoffes, umfassend das Vergleichen der Bindung einer Testverbindung an ER und an einen Östrogenrezeptor nach Anspruch 1 oder 2.
Verwendung eines Östrogenrezeptors nach Anspruch 1 oder 2 zum Testen der möglichen Östrogenwirkungen eines Stoffes.