DE69608959T2

DE69608959T2 - Chlamydia impfstoffen

Info

Publication number: DE69608959T2
Application number: DE69608959T
Authority: DE
Inventors: Jean-Francois Maisonneuve; Jean-Paul Prieels; Moncef Mohamed Slaoui; Vincent Verlant
Original assignee: SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1995-04-03
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 2000-11-16
Anticipated expiration: 2016-04-02
Also published as: PL322620A1; PT820304E; NZ306443A; DE69608959D1; MX9707638A; NO974561D0; CA2215520A1; AU5499996A; ATE193974T1; JPH11503142A; JP2007308508A; HK1008495A1; EP0820304B1; HUP9801572A3; ZA962616B; EP0820304A1; NO974561L; BR9604853A; CZ313497A3; CA2215520C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Impfstoff-Formulierung zur Vorbeugung gegen Chlamydia-Infektionen, insbesondere eine rekombinantes MOMP enthaltende Formulierung, die mit QS21 und 3D-MPL als Adjuvantien versetzt ist.
Das obligat intrazelluläre Bakterium Chlamydia trachomatis infiziert Schleimhaut-Epithelzellen der Konjunktiva und des Urogenitalsystems und verursacht ein breites Spektrum menschlicher Krankheiten, wie Trachom und Genitalinfektionen, die zu Langzeit-Folgeerscheinungen führen können. Trachom, das in mehreren Entwicklungsländern als Endemie auftritt, ist die weltweit wichtigste Ursache für vermeidbare Blindheit. Genitalinfektionen, von denen in den USA etwa 3 Millionen Fälle pro Jahr auftreten, bewirken, daß jährlich 200 000 Frauen nach einer Chlamydia-Salpingitis infertil werden (1). Dieses Pathogen stellt daher ein signifikantes Problem des öffentlichen Gesundheitswesens dar und Anstrengungen sind unternommen worden, um einen Impfstoff gegen menschliche Chlamydia-Infektionen zu entwickeln.
Impfstoff-Tests, die unter Verwendung ganzer Chlamydia-Organismen als Immunogen an Menschen und nicht-menschlichen Primaten durchgeführt wurden, führten zu einem Serovar-spezifischen Schutz, wobei jedoch einige der Impflinge nach Reinfektion schwerere Reaktionen entwickelten (2). Mehrere Untersuchungen haben gezeigt, daß die mit einer Chlamydia- Infektion verbundenen Erkrankungen immunologisch vermittelt werden (3). Außerdem zeigte sich, daß ein aufgereinigtes Chlamydia-Protein von 57 kDa (Hsp60) Erkrankungen hervorruft, die denen nach einer Reinfektion in bereits infizierten Tieren ähnelten (4, 5). Diese Beobachtung führte zu der Schlußfolgerung, daß Schutz gegen Chlamydia trachomatis wohl nur unter Verwendung eines aus Untereinheiten bestehenden Impfstoffs erreicht werden kann.
Die Art Chlamydia trachomatis wird in 15 Serovare stereotypisiert, die in 3 Serogruppen eingeteilt werden: den B-Komplex (Serovare B, Ba, D, E, L1 und L2), den intermediären Komplex (Serovare F, G, K, L3) und den C-Komplex (Serovare A, C, H, I und J) (6). Durch Geschlechtsverkehr übertragene Krankheiten (STD) werden durch die Serovare D bis K verursacht, die die 3 Serogruppen umfassen. Ein aus Untereinheiten bestehender Impfstoff gegen durch Chlamydia übertragene Geschlechtskrankeiten (STD) sollte daher gegen mehrere Serovare schützen, die mehr oder weniger antigenisch verwandt sind.
Bei der Entwicklung eines aus Untereinheiten bestehenden Impfstoffs war das Interesse größtenteils auf das Serotypisierungs-Antigen gerichtet, das aus dem 40 kDa großen Haupt-Außenmembran-Protein (MOMP) besteht. Dieses Protein, bei dem sich zeigte, daß es in vitro als Porin fungiert (7), kommt während des ganzen Lebenszyklus der Bakterien vor (8). Dieses Haupt- Oberflächen-Protein ist bei Menschen und Tieren hochimmunogen. Das MOMP- Protein zeigt 4 variable Domänen (VD), die von fünf konstanten Bereichen umgeben sind, die bei den Serovaren stark konserviert sind (9, 10). In vitro und in vivo neutralisierende B-Zell-Epitope sind in den VDs kartiert worden (11, 12, 13, 14, 15), während T-Zell-Epitope sowohl in variablen Domänen als auch in konstanten Domänen identifiziert worden sind (16, 17). Verschiedene Autoren haben rekombinantes MOMP in E. coli exprimiert (18, 19, 20), wobei jedoch Manning et al. gezeigt haben, daß ihr rekombinantes Protein nicht mit einem monoclonalen Antikörper reagieren konnte, der die Konformation eines MOMP-Epitops erkennt (18).
In verschiedenen Tiermodellen sind Immunisierungen mit rekombinanten oder aufgereinigten MOMP-Proteinen und anschließend homotypische oder heterotypische Chlamydia-Infektionen durchgeführt worden, wobei die Wirkungen auf die Infektionsparameter unterschiedlich waren (21, 22, 23). Ein elegantes experimentelles Modell für Salpingitis ist bei Mäusen entwickelt worden, bei denen eine intrauterine Beimpfung mit einem menschlichen Chlamydia trachomatis-Stamm zu einer langfristigen Infertilität führt (24, 25). Bei einem heterotypischen Infektions-Modell haben Tuffrey et al. gezeigt, daß eine parenterale und Schleimhaut-Immunisierung mit an Alhydrogel absorbiertem rMOMP die Schwere der Salpingitis verminderte bzw. die Dauer der Besiedlung des unteren Genitaltrakts verkürzte. Das Präparat verlieh jedoch keinen Schutz gegen die aus der Infektion resultierende Infertilität (23). Zukünftige Trends von Chlamydia-Impfstoffen sind in Ward, M. E., Journal of Infection, 25 (1992), Ergänzungsband 1, 11-26, diskutiert.
Sowohl die zellvermittelte als auch die humorale Immunität scheinen eine Rolle beim Schutz gegen die durch Chlamydia trachomatis verursachten Genital-Erkrankungen zu spielen. Die Gruppe von Rank hat jedoch die Vermutung geäußert, daß bei Mäusen die T-Zell-vermittelte Immunität der Hauptmechanismus des Immunsystems zur Kontrolle von Chlamydia- Geschlechtskrankheiten darstellt (26, 27, 28), wobei sich gezeigt hat, daß CD4- und CD8-positive T-Zellen in vivo zu der gegen Chlamydia gerichteten Immunität beitragen (29, 30).
3-De-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A ist aus GB 2 220 211B (Ribi) bekannt. Chemisch handelt es sich um ein Gemisch aus 3-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und es wird von Ribi Immunochem Montana hergestellt.
QS21 ist eine mittels HPLC aufgereinigte nicht-toxische Fraktion eines Saponins aus der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja saponaria molina und das Verfahren zu seiner Herstellung ist im US-Patent Nr. 5,057,540 (als QA21) offenbart. Sowohl QS21 als auch 3D-MPL umfassende Impfstoffe sind in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 94/00153 offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt erstmals eine Impfstoff-Zusammensetzung bereit, die Schutz gegen die aus Chlamydia-Infektionen resultierende Infertilität verleiht.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Impfstoff- Zusammensetzung bereit, die 3D-MPL, QS21 und MOMP von Chlamydia umfaßt. Insbesondere enthält der Impfstoff MOMP der B-Komplex-Serogruppe. Vorzugsweise enthält der Impfstoff mindestens MOMP vom Serovar L2, kann jedoch zusätzlich Antigene von anderen Serovaren, wie D und E, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird QS21 mit einem Sterin präsentiert, da solche Zusammensetzungen verringerte Reaktogenität zeigen und die Stabilität von QS21 gegenüber einer Basen-vermittelten Hydrolyse erhöhen.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist QS21 mit einer Cholesterin enthaltenden Liposomen-Struktur (nachstehend als DQ bezeichnet) verbunden. Solche Adjuvans-Zusammensetzungen sind in den gleichfalls anhängigen GB-Patentanmeldungen Nr. 9508326.7 und 9513107.4 (veröffentlicht als WO 96/33739) beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist. In dieser bevorzugten Formulierung kommen das Antigen und das MPL außerhalb der Liposomen- Struktur vor.
Die Impfstoff-Herstellung ist in "New Trends and Developments in Vaccines", herausgegeben von Voller et al., (1978), University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, allgemein beschrieben. Die Einkapselung innerhalb von Liposomen ist beispielsweise von Fullerton im US-Patent Nr. 4,235,877 beschrieben. Die Konjugation von Proteinen an Makromoleküle ist beispielsweise von Likhite im US-Patent 4,372,945 und von Armor et al. im US- Patent 4,474,757 offenbart.
Die Proteinmenge in jeder Impfstoff-Dosis wird als die Menge ausgewählt, die eine Schutz bietende Immunreaktion induziert, ohne daß signifikante nachteilige Nebenwirkungen typischer Impfstoffe auftreten. Eine solche Menge richtet sich danach, welches spezifische Immunogen eingesetzt wird und wie es präsentiert wird. Im allgemeinen ist zu erwarten, daß jede Dosis 1 ug -1000 ug Protein, vorzugsweise 2 ug-100 ug, am bevorzugtesten 4 ug-40 ug, enthält; Eine optimale Menge für einen speziellen Impfstoff kann mit Hilfe von Standard-Untersuchungen ermittelt werden, wozu die Feststellung entsprechender Immunreaktionen in Probanden gehört. Nach einer ersten Impfung können die Probanden eine oder mehrere Auffrischungs- Immunisierungen in geeigneten Abständen erhalten.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können sowohl für prophylaktische als auch therapeutische Zwecke verwendet werden.
Ein Aspekt der Erfindung ist dementsprechend die Bereitstellung eines Behandlungsverfahrens, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffs an einen Patienten umfaßt.
In einer Ausführungsform der Erfindung stammt das MOMP-Antigen vom Serovar 2 und wird in E. coli mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt. In solchen Fällen wird das Protein ohne seine Signalsequenz produziert.
In der vorliegenden Erfindung wurde bei immunisierten Gruppen das IgG1 : IgG2a-Verhältnis stark beeinflußt, je nachdem, ob das Antigen mit den Adjuvantien MPL + QS21 versetzt wurde oder nicht. Eine Immunisierung mit MPL + QS21 ging mit niedrigen IgG1 : IgG2a-Verhältnissen und einem partiellem Schutz einher, während eine Immunisierung ohne MPL + QS21 zu einem höheren IgG1 : IgG2a-Verhältnis führte und keinen Schutz bewirkte. Interessanterweise vermittelt Interferon-gamma, das von der Th1- Untergruppe von T-Helfer-Lymphocyten produziert wird, das Umschalten auf die Erzeugung von IgG2a-Antikörpern in B-Zellen, während die IgG1- Produktion durch Interleukin-4 vermittelt wird, das durch Th2-Zellen sezerniert wird (40). Da die IgG2a-Produktion durch Th1-Zellprodukte kontrolliert wird, wäre es wahrscheinlich, daß die geschützten Gruppen eine durch MPL + QS21 gesteuerte Th1-Zell-Aktivierung zeigen. Bei einem menschlichen Modell und einem Maus-Modell gibt es einen allgemeinen Zusammenhang zwischen den Th1-Cytokinen IL-2 und IFN-gamma und der Resistenz gegen eine Infektion mit intrazellulären Pathogenen, während die Th2-Cytokine IL-4 und IL-10 mit einer fortschreitenden Erkrankung verbunden sind. Das läßt sich anhand der Resistenz gegen oder Anfälligkeit für Leishmania major von Mäuse-Inzuchtstämmen veranschaulichen, die mit der Induktion einer spezifischen Th1- oder Th2-Reaktion korreliert (41). Zudem weist Interferon-gamma in vitro eine gegen Chlamydia gerichtete Aktivität auf und trägt in vivo zum Rückgang der Infektion bei (42, 43). Durch Immunstimulanzien gesteuerte Th1-Cytokine könnten daher für den in diesem Impfungs-Experiment beobachteten Schutz verantwortlich sein.
Zwei andere Beobachtungen unterstützen die Hypothese, daß in den mit rMOMP + MPL + QS21 geimpften Gruppen eine Schutz bietende zellvermittelte Immunität aufgebaut wurde: erstens wird die Möglichkeit des Vorliegens eines humoralen Schutzes dadurch ausgeschlossen, daß in Vaginalsekreten ein spezifisches sekretorisches IgA fehlt und die stark seröse Antikörper-Reaktion keine Neutralisierungswirkung aufweist. Zweitens legt der heterotypische Charakter des Schutzes, der unter Verwendung von zwei verschiedenen Serovaren erhalten wird, die sich auf der Ebene der MOMP-VDs-Sequenzen beträchtlich unterscheiden, nahe, daß die T-Zell-Epitope von prozessierten konservierten MOMP-Domänen das Mittel darstellen, das den Schutz gegen Infertilität bewirkt.
Im folgenden wird die Erfindung veranschaulicht.

1. MATERIALIEN UND VERFAHREN

1.1 Chlamydia-Stämme und Tiere

In der vorliegenden Untersuchung wurden der Chlamydia trachomatis- Serovar F-Stamm NI1, der von Tuffrey et al. isoliert und von Dr. J. Orfila freundlicherweise zur Verfügung gestellt worden war, und der Chlamydia trachomatis-Serovar L2-Stamm 434 (ATCC, Rockville, MD) verwendet. Die Chlamydien wurden auf Mc Coy-Zellen (ATCC, Rockville, MD) in einer Konzentration von etwa 10&sup6; Einschlußkörperchen-bildenden Einheiten/ml (IFE/ml) in mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) (Gibco BRL) angereichertes MEM überimpft. Nach 1-stündiger Zentrifugation (1500 · g) und 2-stündiger Inkubation bei 37ºC (5% CO&sub2;) wurde das Inokulum entfernt und den Zellen wurde frisches Medium zugeführt, das mit 0,5 ug/ml Cycloheximid (Sigma) angereichert war. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen mit Glasperlen aufgeschlossen, in 250 mM Saccharose, 10 mM Natriumphosphat, 5 mM L-Glutaminsäure, pH-Wert 7,2 (SPG) in einer geeigneten Konzentration von etwa 10&sup7; bis 10&sup8; IFE/ml geerntet und bei -70ºC aufbewahrt.
6-8 Wochen alte weibliche C3H/HeOuJ (H-2k)-Mäuse wurden von Iffa Credo (Frankreich) bezogen. Zur Zucht wurden 8 bis 10 Wochen alte Männchen des gleichen Stamms (B & K, GB) verwendet.

1.2 PCR-Amplifikation und Plasmid-Konstruktionen

Amplifikation. MOMP-Serovar L2-DNA wurde mittels Lyse von 10 ul Chlamydia-Inokulum in 240 ul Lyse-Puffer erhalten und eine PCR- Amplifikation wurde durchgeführt, wie bereits von Denamur et al. beschrieben (33). Anhand der veröffentlichten Sequenz (34) wurden die synthetischen Oligonucleotide 5'-GAGACTCCCATGGATCCACTGCCTGTGGGGAATCCTGC-3' und 5'- TTAGAAGCGGAATTGTGCATTTAC-3' (SB Biologicals, Belgien) ausgewählt. Das 5'- Nucleotid enthielt die den Amino-Terminus von reifem MOMP codierende Nucleotidsequenz (unterstrichen), der eine BamHI-Restriktionsendonucleasestelle (Fettdruck) vorausging. Die Amplifikation wurde unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase (Stratagen) und einer Koch-Light-NBS- Vorrichtung zur Durchführung thermischer Zyklen (New Brunswick) durchgeführt. Ein PCR-Produkt mit der richtigen Größe wurde unter Verwendung eines Geneclean II-Kits (Bio 101) aus einem 1,5%-igen Agarose- Gel aufgereinigt.

1.3 Clonierung

Die amplifizierte Serovar L2-MOMP-DNA wurde mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen, in den zuvor mit SmaI gespaltenen Vektor pGEM4Z (Promega) ligiert und unter Verwendung der Standard-CaCl&sub2;-Vorgehensweise in E. coli JM109 transformiert. Die erhaltenen Clone wurden einer Restriktionsanalyse unterworfen und ein richtiges DNA- Konstrukt wurde amplifiziert und unter Verwendung eines Nucleobond-PC-100- Kits (Macherey-Nagel) aufgereinigt. Aus pGEM4Z-MOMP wurde MOMP-DNA mittels Spaltung mit BamHI ausgeschnitten und in den mit BamHI gespaltenen Vektor pET15 (Novagen) stromabwärts vom T7lac-Promotor und der His.Tag- Sequenz insertiert. Nach Transformation in den E. coli-Stamm DH10B (Stratagen) wurden die richtigen Clone mittels Restriktionsanalyse ausgewählt. Die vollständige Nucleotidsequenz der clonierten DNA wurde mit Hilfe des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens (35) überprüft. Schließlich wurde ein pET15-MOMP-Plasmidpräparat zur Transformation des BL21(DE3)-Stamms (Novagen) verwendet, der die Expression des rekombinanten Produkts fördern kann, weil er eine durch IPTG induzierbare T7-Polymerase besitzt.

1.4 Erzeugung, Charakterisierung, Aufreinigung und Formulierung des Immunogens

1.4.1 Erzeugung und Charakterisierung. Mit pET15-MOMP transformierte BL21 (DE3)-Bakterien wurden in mit 200 ug/ml Ampicillin (Sigma) angereichertem LB-Medium (Gibco BRL) gezüchtet. Die Expression wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, wenn die bei 600 nm bestimmte optische Dichte der Kultur 0,6 bis 0,8 erreicht hatte. 3 h nach Induktion wurden die Zellen geerntet, 3mal mit PBS gewaschen und in Probenpuffer lysiert, der 2% SDS und 5% Mercaptoethanol enthielt. Die Proben wurden 3 min bei 95ºC erhitzt und Gesamtproteine wurden mittels 12% SDS-PAGE unter Verwendung von Molekulargewichtsmarkern (Gibco BRL) aufgetrennt, die auf dem gleichen Gel aufgetrennt wurden. Für das Immunblot-Verfahren wurden die mittels 12% SDS-PAGE aufgetrennten Proteine auf Nitrocellulose übertragen und unter Verwendung der von Dr. H. Caldwell freundlicherweise zur Verfügung gestellten mAbs L2 I-45 und L2 I-10 und eines gegen MOMP gerichteten Ziegen- Antiserums (Chemicon) nachgewiesen. Die zelluläre Position von rMOMP wurde, wie in Maniatis et al. beschrieben (36), mittels Zellfraktionierung bestimmt. Pellet und Überstände wurden in Probenpuffer resuspendiert oder darauf eingestellt und wie das Gesamt-Zellysat analysiert.
1.4.2 Aufreinigung. Ein 100 ml-Volumen einer 3 h durch IPTG induzierten Kultur wurde mit Lysozym und Desoxycholat lysiert, wie bereits von Marston et al. beschrieben (37). Das Zellysat wurde zentrifugiert (15 min bei 12 000 · g), das Pellet wurde in 2 ml SDS-PAGE-Probenpuffer, der 2% SDS, jedoch kein Mercaptoethanol enthielt, resuspendiert und 3 min gekocht. Das Lysat wurde zentrifugiert (15 min bei 12 000 · g), das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde auf Endkonzentrationen von 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,9, 0,5% SDS, 500 mM NaCl und 5 mM Imidazol eingestellt. Die Probe wurde dann auf eine Chromatographie-Säule aufgetragen, die 2 ml His.Bind-Harz (Novagen) enthielt, und nach dem Verfahren des Herstellers wurde eine Metallionen- Affinitätschromatographie durchgeführt. Die Identität und Reinheit des eluierten Produkts wurde mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und anschließender Färbung mit Coomassie Blau oder anschließendem Immunblotten bestimmt (vgl. vorstehend). Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des Lowry-Tests bestimmt. rMOMP enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung von Slide A-Lyser-Kassetten (Pierce) die Nacht über gegen PBS dialysiert.
Formulierung des Antigens. Drei Formulierungen wurden getestet:
1) MOMP + QS21 + 3D-MPL
2) MOMP + SB62-Öl-in-Wasser-Emulsion
3) MOMP, SB62, QS21 + 3D-MPL
Das erfolgte nach dem in WO 95/17210 und/oder WO 94/00153 beschriebenen Verfahren. Zur Injektion mit 5 ug MPL + 10 ug QS21 wurde kurz aufgereinigtes und dialysiertes rMOMP in PBS auf eine Konzentration von 25 ug/ml (200 ul) verdünnt oder zum Mischen mit einer als SB62 bezeichneten 100 ul Öl-in-Wasser-Emulsion mit oder ohne 5 ug MPL/10 ug QS21 auf eine Konzentration von 50 ug/ml (100 ul) verdünnt. Die jeweiligen Impfstoff- Formulierungen wurden wie folgt hergestellt:
1) MPL/QS21 wurde formuliert, indem zu dem MOMP-Antigen MPL (in Form von 100 nm-Partikeln) und anschließend Puffer und danach QS21 gegeben wurden.
2) MPL/QS21/SB62 wurde formuliert, indem zum Puffer das Antigen, anschließend SB62, dann MPL in Form von 100 nm-Partikeln und danach QS21 gegeben wurden. Bei dieser Formulierung geht man davon aus, daß sich das Antigen außen (d. h. außerhalb der Emulsionströpfchen) befindet und MPL und der größte Teil von QS21 ebenfalls außerhalb der Emulsionströpfchen vorliegen.
3) SB62 wurde formuliert, indem SBb2 zu dem Antigen in Puffer gegeben wurde. Das Antigen befindet sich außerhalb der Emulsionströpfchen.

1.5. Impfung und serologische Nachuntersuchung im Maus- Modell für Salpingitis und Fertilität

In den Wochen 0 und 2 wurden Gruppen von zehn C3H/HeOuJ-Weibchen mit 2 · 5 ug rMOMP in 200 ul der verschiedenen Formulierungen subkutan an der Schwanzwurzel immunisiert. Die Kontrollgruppe wurde mit der 5 ug MPL und 10 ug QS21 enthaltenden Emulsion scheinimmunisiert, wobei nach dem gleichen Impfplan gearbeitet wurde. In der 6. Woche erfolgte eine Beimpfung, wobei nach der bereits von Tuffrey et al. (24) beschriebenen Vorgehensweise gearbeitet wurde. Kurz zusammengefaßt, wurden den Mäusen 2,5 mg Progesteron (Depo-Provera, Upjohn) 7 Tage vor Infektion, die mittels bilateraler intrauteriner Beimpfung mit 5 · 10&sup5; IFE Chlamydia trachomatis NI1 in 100 ul SPG oder 100 ul eines Mc Coy-Zellextrakts erfolgte, subkutan verabreicht.
Ab der 10. Woche wurden die behandelten Mäuse zur Beurteilung der Fertilität über 3 Monate gemeinsam mit Männchen in Käfigen gehalten (1 Männchen für 2 Weibchen, wobei jedes Männchen innerhalb jeder Gruppe im Turnus einer Woche ausgewechselt wurde). Bei den über den Zuchtzeitraum berechneten Parametern handelte es sich um die mittlere Anzahl neugeborener Mäuse pro Gruppe (M) und die durchschnittliche Wurfgröße (N).
In der 6. Woche wurde Blut abgenommen und die Seren wurden im Hinblick auf rMOMP-spezifische Antikörper, die Erkennung von Einschlüssen des Chlamydia-serovar F-Stamms NI1 und die Neutralisierung einer heterologen (NI1) Infektion in vitro analysiert. In der 6. Woche wurden Vagina- Auswaschungen gesammelt, indem 50 ul PBS-mehrmals in die Vagina hinein- und herauspipettiert wurden, und auf rMOMP-spezifische sekretorische IgA- Antikörper analysiert.

1.6 Serologische Analyse

1.6.1 Bestimmung von gegen rMOMP gerichteten Antikörpern.

Unter Verwendung von rMOMP als Antigen wurden die Titer von rMOMP-spezifischen IgG- oder IgA-Antikörpern in einem enzymverbundenen Immunadsorptions-Test (ELISA) bestimmt. Die Platten (Maxisorp, Nunc) wurden mit einer 5 ug/ml-Lösung eines Antigens in 10 mM Carbonat/- Hydrogencarbonat-Puffer, pH-Wert 9,6, die Nacht über bei 4ºC beschichtet, mit 0,1% Tween 20 enthaltender PBS (Waschpuffer) gewaschen und mit 3% BSA (Sigma) enthaltender FBS 1 h bei 37ºC blockiert. Testseren wurden in 0,5% BSA enthaltendem Waschpuffer (Inkubationspuffer) 1 h bei 37% in einer Verdünnungsreihe verdünnt. Die Platten wurden gewaschen und mit einem an Meerettich-Peroxidase konjugierten Ziegen-Antiserum gegen Maus-IgG oder Maus-IgA (Sigma) 1 h bei 37ºC inkubiert. Nach Waschen wurde das Substrat Orthophenylendiamin (Sigma) 20 min bei Raumtemperatur zugegeben. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 2 M H&sub2;SO&sub4; beendet und auf einer Labsystems-Multiskan-Vorrichtung wurde die Extinktion bei 492 nm bestimmt. Die Titer der gegen rMOMP gerichteten IgG- oder IgA-Antikörper wurden als umgekehrter Wert der Serumproben-Verdünnung angegeben, die zu einem Extinktions-Mittelwert führte.
Bei jeder Serumprobe wurde die rMOMP-spezifische IgG-Reaktion in rMOMP-spezifische IgG2a-, IgG2b- und IgG1-Anteile in einem vorstehend beschriebenen direkten ELISA-Test zergliedert, der mit einigen Modifikationen durchgeführt wurde. Testseren wurden jeweils dreifach inkubiert, die Platten wurden gewaschen und in jede Reihe der dreifach getesteten Seren wurden in Inkubationspuffer verdünnte biotinylierte Ziegen-Antikörper gegen Maus- IgG2a, Maus-IgG2b oder Maus-IgG1 (Amersham) gegeben. Nach 1 h bei 37ºC wurden die Platten gewaschen und 1 h mit einem Streptavidin-Meerettich- Peroxidase-Komplex (Amersham) inkubiert. Der Nachweis und die Titer- Bestimmung wurden durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Die in Prozent angegebene Häufigkeit jedes der 3 IgG-Subtypen wurde als Verhältnis des Titers dieses IgG-Subtyps zu dem für die 3 Subtypen bestimmten Gesamt-Titer berechnet.

1.6.2 Heterotypischer Nachweis von Chlamydia-Einschlüssen.

Mc Coy-Zellen wurden auf sterilen Mikrotiterplatten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen (Nunc) gezüchtet und konfluente einzellige Schichten wurden mit etwa 5 · 10&sup4; IFE des Chlamydia trachomatis-Serovar F- Stamms NI1 infiziert. 24 h nach Infektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 10 min mit Methanol fixiert. Der Waschvorgang wurde wiederholt und 100 ul der 1 : 100 mit PBS verdünnten Serumproben wurden 1 h bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit an Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Ziegen-IgG gegen Maus-Antikörper (Sigma) 1 h bei 37ºC inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurde die Antikörper-Bindung durch Zugabe von Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB, Sigma) sichtbar gemacht. Das Vorliegen von NI1-Einschlüssen, die mit dem gegen rMOMP gerichteten IgG enthüllt worden waren, wurde unter Verwendung eines optischen Inversions- Mikroskops bestimmt.

1.6.3 Heterotypische Neutralisierungsaktivität in vitro.

Der Komplement-unabhängige in vitro-Neutralisierungstest wurde, wie von Su et al. (38) beschrieben, mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz zusammengefaßt, wurden 50 ul einer zweifachen Verdünnung von einzelnen Maus-Seren, bei denen das Komplement entfernt worden war, zu 105 IFE des in 50 ul SPG verdünnten Serovar F-Stamms NI1 gegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei 37ºC (5% CO&sub2;) inkubiert und dann wurde das Volumen von 100 ul auf Nierenzellen des Syrischen Hamsters (HaK, ATCC, Rockville, MD), die mit HBSS (Gibco BRL) gewaschen worden waren, überimpft und 2 h bei 37ºC (5% CO&sub2;) inkubiert. Danach wurden die Inokula entfernt, die Zellen wurden mit HBSS gewaschen und 10% FCS, 50 ug/ml Gentamycin und 0,5 ug/ml Cycloheximid enthaltendes MEM wurde zugegeben. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen fixiert und Einschlüsse wurden unter Verwendung von handelsüblichen, gegen MOMP gerichteten Ziegen-Antiseren (Chemicon) und eines an alkalische Phosphatase konjugierten Kaninchen- Antikörpers gegen Ziegen-Antikörper (Sigma), wie vorstehend beschrieben, immunchemisch nachgewiesen. 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT, Sigma) wurde als Substrat für die enzymatische Reaktion verwendet. IFE wurden quantitativ bestimmt, indem 5 Felder unter Verwendung eines Inversions-Mikroskops bei einer 200fachen Vergrößerung ausgezählt wurden. Die für die Probenseren erhaltene mittlere IFE-Anzahl pro Feld wurde als prozentuale Verringerung der mittleren IFE-Anzahl angegeben, die mit dem Negativ-Kontrollgemisch erhalten wurde, das Serum von unbehandelten Mäusen enthielt. Die Neutralisierungs-Titer (NT 50) wurden als umgekehrter Wert der Serumproben-Verdünnung berechnet, die zu einer 50%- igen Verringerung der Infektiosität führte.

1.7 Ergebnisse

1.7.1 Expression und Charakterisierung von rekombinantem Antigen

Ein mittels PCR amplifiziertes DNA-Fragment, das die reifes Serovar- L2-MOMP codierende Nucleotidsequenz enthielt, wurde im richtigen Leseraster und in richtiger Orientierung in den Expressionsvektor pET15 insertiert. Die Nucleotidsequenz des Chlamydia-Proteins und die Fusions-Verbindungsstelle mit dem das 5'-terminale His-Tag-Peptid codierenden Polynucleotidabschnitt waren dabei so, wie aufgrund des Entwurfs der Clonierungsstrategie prognostiziert. Nach Zell-Fraktionierung wurde das Expressionsprodukt in der unlöslichen Fraktion von E. coli lokalisiert, was nahelegt, daß es in Form unlöslicher Einschlußkörperchen exprimiert wurde. Das rekombinantes MOMP enthaltende Pellet wurde in 2%-igem SDS-Puffer solubilisiert und auf einer Metallionen-Affinitätschromatographie-Säule aufgetrennt, wobei immobilisierte Nickel-Ionen zur Chelatierung von Histidin-Resten verwendet wurden, die in dem mit rekombinantem MOMP fusionierten His-Tag-Peptid enthalten waren. Das aufgereinigte Protein, das mit Puffern ohne SDS gewaschen und eluiert worden war, zeigte das prognostizierte Molekulargewicht und zeigte mit gegen MOMP gerichteten monoclonalen und polyclonalen Antikörpern Immunreaktivität, wie mittels SDS-PAGE bzw. Western-Blot-Analyse gezeigt. Nach Dialyse lag die rMOMP-Konzentration zwischen 500 ug/ml und 1 mg/ml und die Reinheit des rekombinanten Produkts wurde auf 90% geschätzt.

1.7.2 Wirkung einer Immunisierung mit rMOMP, das mit Adjuvantien versetzt worden war, auf die serologische Reaktion bei Mäusen und die Fertilität nach heterotypischer Impfung

Die Ergebnisse des Experiments, das zur Bestimmung des prophylaktischen Potentials von mit unterschiedlichen Adjuvantien versetztem rekombinantem MOMP durchgeführt wurde, sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Gruppen 4 und 5 wurden mit rMOMP, das mit 5 ug MPL und 10 ug QS21 als Adjuvantien versetzt worden war, subcutan immunisiert. In Gruppe 4 wurde das mit Adjuvantien versetzte rekombinante Protein in einer SB62- Emulsion angesetzt, die Squalen und alpha-Tocopherol als Ölphase und Tween 80 als oberflächenaktives Mittel enthielt. Die Gruppe 6 wurde mit rMOMP in Kombination mit der gleichen SB62-Emulsion wie Gruppe 4, jedoch ohne Immunstimulanzien, subcutan immunisiert. Auch drei Kontrollgruppen wurden eingeplant: eine Gruppe unbehandelter Tiere (Gruppe 1), eine Gruppe scheinimmunisierter Tiere, wobei beide Immunstimulanzien in Kombination mit SB62-Emulsion verwendet wurden (Gruppe 2), und Gruppe 3, die wie Gruppe 4 immunisiert wurde, jedoch einer Schein-Infektion unterworfen wurde. Die Gruppen 2,4, 5 und 6 wurden mit dem heterotypischen Chlamydia trachomatis- Stamm NI1 infiziert.

1.7.3 Wirkung der Immunisierung auf die serologische Reaktion.

Zur Beurteilung der Immunogenität der unterschiedlichen Präparate wurden die IgG-Titer von Seren, die 4 Wochen nach der zweiten Impfstoff-Dosis abgenommen worden waren (Tag der Infektion), mittels des ELISA-Verfahrens bestimmt und für jede Gruppe wurden die arithmetischen mittleren Titer (AMT) berechnet. Eine Immunisierung durch zwei Injektionen von 5 ug rMOMP führte zum Auftreten eines hohen Titers von gegen rMOMP gerichtetem IgG. Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren die AMT-Werte für die Gruppen 4 und 6 praktisch gleich, während die Kombination von Emulsion und Immunstimulanzien jedoch zu einer zweifachen Erhöhung des mittleren Titers von rMOMP-spezifischem IgG führte. Tiere, die nur mit Adjuvantien scheinimmunisiert worden waren (Gruppe 2), wiesen keine signifikanten Titer von Antikörpern gegen das rekombinante Chlamydia-Antigen auf. Bei keiner Gruppe wurde ein rMOMP-spezifisches sekretorisches IgA in den unmittelbar vor Infektion gesammelten Vaginalauswaschungen nachgewiesen.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde ein signifikanter Unterschied im IgG- Subklassen-Profil zwischen den mit Immunstimulanzien behandelten Gruppen (4 und 5) und der Gruppe 6 beobachtet, die mit rMOMP enthaltender SB62- Emulsion immunisiert worden war. Es zeigte sich, daß die Verwendung von MPL + QS21 den relativen IgG2a-Titer signifikant erhöhte und den relativen IgG1- Titer senkte. Das nicht-emulgierte Präparat bewirkte eine maximale Ausprägung dieses Phänomens.
Um zu ermitteln, ob rMOMP-spezifische IgGs mit Chlamydien des heterotypischen Infektions-Stamms kreuzreagieren konnten, wurden Seren 1 : 100 verdünnt und in einem immunenzymatischen Test einzeln auf ihre Fähigkeit zur Erkennung von Chlamydia-Einschlüssen auf Methanol-fixierten infizierten Zellen getestet. Es zeigte sich, daß die Maus-Seren aller immunisierten Gruppen IgGs enthielten, die mit dem zur Infektion verwendeten Chlamydia trachomatis-Serovar F-Stamm NI1 reagierten. Unter Verwendung von Seren von scheinimmunsierten Mäusen als Negativ-Kontrolle wurden sie deshalb allesamt auf Komplement-unabhängige in vitro- Neutralisierungsaktivität gegen diesen Stamm getestet. Die Ergebnisse standen im Widerspruch zu den mittels ELISA-Test und immunenzymatischem Test erhaltenen Ergebnissen, da keines der Immunseren die Chlamydia-Infektiosität signifikant vermindern konnte.

1.7.4 Wirkung einer heterotypischen Immunisierung auf die Fertilität nach Infektion.

Acht Wochen nach der letzten Immunisierung (oder Scheinimmunisierung) mit rMOMP und 4 Wochen nach intrauteriner Infektion (oder Scheininfektion) wurden die Mäuse über 2 Monate mit Männchen zur Paarung zugelassen. Die Wirkung der Infektion mit dem heterologen Stamm Nil auf die Fertilität von CH3/HeuOuJ-Mäusen wurde anhand der folgenden Parameter bestimmt: der mittleren Anzahl Neugeborener pro Gruppe (N) und der durchschnittlichen Wurfgröße (M). Im Vergleich zu unbehandelten Mäusen wurde die Fertilität der mit Chlamydia beimpften Mäuse in Gruppe 2 (scheinimmunisiert) signifikant verändert. In diesem speziellen Fall bestätigte dieses Ergebnis die Gültigkeit des Tier-Modells. Immunisierte und scheininfizierte Tiere (Gruppe 3) zeigten gegenüber unbehandelten verringerte Fertilitäts-Parameter. Diese Gruppe, die zur Berücksichtigung nicht-pathologischer Veränderungen der Tier-Fertilität eingeplant worden war, wurde als Kontrolle verwendet, um das prophylaktische Potential der rMOMP-Formulierungen zu beurteilen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden zwischen den Gruppen, die auch mit Immunstimulanzien geimpft worden waren (Gruppen 4 und 5), und der Gruppe 6, die mit rMOMP enthaltender SB62- Emulsion immunisiert worden war, signifikante Unterschiede im Grad der Fertilität festgestellt. Die Gruppe S. bei der 7 von 10 Mäusen Junge warfen, zeigte die besten Ergebnisse und maximale Fertilitäts-Parameter, wobei der N- Wert 50% des Wertes der Kontrollgruppe 3 erreichte und der M-Wert mit dem für die gleiche Kontrollgruppe berechneten Wert vergleichbar war. Im Gegensatz dazu waren die Fertilitäts-Parameter der ohne Immunstimulanzien behandelten Gruppe 6 mit den Werten vergleichbar, die in der Infektions- Kontrollgruppe 2 erhalten wurden. Auch eine Immunisierung mit rMOMP in Kombination mit Immunstimulanzien und der SB62-Emulsion führte zum Schutz vor Infertilität, wobei jedoch die Verwendung der SB62-Emulsion das Ausmaß des Schutzes partiell zu verringern schien. Daher zeigte sich, daß die Verwendung von MPL und QS21 einen partiellen Schutz gegen eine Chlamydia- Infektion des oberen Genitaltrakts bot und daß die maximale Wirkung dieses Phänomens mit dem nicht-emulgierten Präparat erreicht wurde.

1.8 Schlußfolgerung

Die Ergebnisse der Erfinder der vorliegenden Erfindung zeigen, daß eine parenterale Immunisierung mit rMOMP, das mit MPL + QS21 als Adjuvantien versetzt worden war, eine durch eine heterologe Chlamydia-Infektion des Maus-Genitaltrakts verursachte Infertilität partiell verhindert, während im Gegensatz dazu eine Injektion von mit SB62 emulgiertem rMOMP ohne die beiden Immunstimulanzien keinen Schutz hervorruft. Andererseits induzierten alle Präparate eine starke und relativ homogene MOMP-spezifische Gesamt-IgG-Reaktion in den Seren immunisierter Tiere, wobei diese Antikörper mit Methanol-fixierten Chlamydia-Einschlüssen des heterotypischen Infektionsstamms kreuzhybridisieren konnten, die Chlamydia-Infektiosität in vitro jedoch nicht vermindern konnten. Unmittelbar vor Infektion waren im Vaginalsekret keine rMOMP-spezifischen IgA-Antikörper nachweisbar, was mit dem Verfahren der parenteralen Antigen-Verabreichung vereinbar war. Ein Vergleich der spezifischen Gesamt-IgG-Titer oder Neutralisierungs-Titer mit dem Ergebnis der pathologischen Untersuchung aller immunisierten Gruppen zeigte, daß es keinen direkten Zusammenhang gab.
Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigen, daß ein mit den Immunstimulanzien MPL und QS21 kombiniertes rekombinantes MOMP-Protein eine Immunreaktion induzieren kann, die Schutz vor einer von Chlamydia trachomatis verursachten Infertilität bietet.

2. ZWEITE REIHE VON EXPERIMENTEN MIT VERSCHIEDENEN MOMP- ADJUVANS-FORMULIERUNGEN

2.1 Getestete Materialien und Verfahren

Die Chlamydia- und Maus-Stämme waren mit denen identisch, die in dem in Beispiel 1 beschriebenen Experiment verwendet worden waren.

2.2 Herstellung und Formulierung von MOMP

Die Herstellung und Verwendung des DNA-Konstrukts pET15-MOMP zur Antigen-Herstellung sind in Beispiel 1 beschrieben. Die Vorgehensweise zur Antigen-Aufreinigung wurde modifiziert, um größere Mengen eines Endotoxin-freien Antigens herzustellen. Kurz zusammengefaßt, wurden 10 ml His.Bind-Harz (Novagen) mit 25 Volumina 2% SDS, 6 M Harnstoff in Wasser gewaschen, bevor ein Aufreinigungs-Schritt entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt wurde, während 250 ml eines mittels Zentrifugation pelletierten induzierten Lysats mit 4 M Harnstoff, 2 M NaCl und danach 2% Zwittergen (Calbiochem) gewaschen wurden, bevor in Tris-HCl, pH- Wert 7,9, 0,5% SDS, 500 mM NaCl und 5 mM Imidazol eine Solubilisierung erfolgte. Das Antigen wurde in Tris-HCl, pH-Wert 7,9, 100 mM Imidazol eluiert, ausgiebig gegen 5 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4 dialysiert und auf einer 0,22 um Sterilisationsfilter-Einheit (Millipore) filtriert. Zur Bestimmung des LPS- Gehalts wurde dann ein Limulus-Amöbocyten-Lysattest (Coatest, Chromogenix) verwendet.

2.3 Formulierung

Das Antigen wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, formuliert, wobei allerdings die MPL-Menge pro Dosis auf 10 ug eingestellt wurde. Eine Gruppe wurde auch unter Verwendung von modifiziertem QS21 (als DQ bezeichnet), das in den gleichfalls anhängigen GB-Anmeldungen 9508326.7 und 9513107.4 (veröffentlicht als WO 96/33739) beschrieben ist, getestet, wobei das modifizierte QS21 dem Impfstoff in einer Menge von 10 ug zugegeben wurde. Genauer gesagt, wurde der Impfstoff formuliert, indem das Antigen zu einem Puffer gegeben wurde. Danach wurde MPL in Form von 100 nm-Partikeln zugegeben. In einem gesonderten Röhrchen wurde QS21 mit kleinen unilamellaren Liposomen gemischt, die aus Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) und Cholesterin (DPOC : Cholesterin = 4 : 1 (Gew./Gew.)) bestanden, so daß das Verhältnis von QS21 zu Cholesterin 1 : 5 betrug (unter diesen Bedingungen wird das gesamte QS21 in die Liposomen-Membran eingebaut). Das QS21/SUV- Gemisch (als DQ bezeichnet) wird dann dem Antigen/MPL-Gemisch zugegeben.
In dieser Formulierung liegen das Antigen und MPL außerhalb der Liposomen vor, während sich QS21 in den Liposomen befindet.

2.4. Impfung im Maus-Modell für Salpingitis und Fertilität und immunologische und histologische Nachuntersuchung

Immunisierung, experimentelle Infektion und Probenentnahme wurden, wie vorstehend beschrieben, vorgenommen, wobei allerdings die Negativ- Kontrollgruppe mit einer 10 ug MPL und 10 ug QS21 enthaltenden Emulsion scheinimmunisiert wurde und eine zusätzliche Gruppe mit dem Antigen in Kombination mit MPL und DQ immunisiert wurde. Die Gruppen bestanden aus 15 Mäusen, wobei 10 davon über einen Zeitraum von 8 Wochen zur Paarung zugelassen wurden, während 5 Mäuse 2 Wochen nach Infektion zur histopathologischen und immuncytochemischen Analyse getötet wurden. Bei den zur Bestimmung der Fertilität einer Gruppe verwendeten Parametern handelte es sich um F (Anzahl von Mäusen, die einmal oder mehrmals warfen, geteilt durch die Gesamtzahl von Mäusen), M (Anzahl neugeborener Mäuse (tot oder lebend), geteilt durch die Anzahl von Würfen) und N (Anzahl neugeborener Mäuse (tot oder lebend), geteilt durch die Gesamtzahl von Mäusen).
Seren und Vaginalauswaschungen wurden mittels ELISA auf rMOMP- spezifische Antikörper analysiert, wobei die Seren auch auf die Erkennung von Einschlüssen des Chlamydia-Serovar F-Stamms NI1 und die Neutralisierung einer heterologen in vitro-Infektion (NI1) analysiert wurde. Alle Verfahren sind vorstehend beschrieben.
Die obere Hälfte des Genitaltrakts (Eierstock, Eileiter und oberer Teil des Gebärmutterhorns) wurde in eine OCT-Verbindung (Tissue-TEK, Miles) eingebettet und schockgefroren und gefrorene Schnitte (10 um) wurden auf Glasobjektträger (Superfrost, Menzel-Glaser) aufgezogen. Die Schnitte wurden an der Luft getrocknet, 5 min in Aceton fixiert und danach bei -70ºC aufbewahrt. Zur histopathologischen Analyse wurden mit Wasser rehydratisierte Schnitte mit Hämatoxylin (H) und Eosin (E) gefärbt. Zur immuncytochemischen Färbung wurden die Schnitte in PBS rehydratisiert, 60 min mit 2 ug eines biotinylierten Ratten-mAb gegen Maus-CD4 oder Maus-CD8 (Serotec) in 100 ul PBS inkubiert, zweimal mit PBS gewaschen und erneut 30 min mit einer 1/2000-Verdünnung von HRP-Streptavidin (Zymed) inkubiert. Nach Waschen wurde die Farbe mit einem Flüssig-DAB-Kit (Zymed) entwickelt, mit Hämatoxylin gegengefärbt und dauerhaft in Acrytol (Surgipath) eingebettet.

2.5 Interferon-gamma-Test

In den Wochen 0 und 2 wurden 200 ul einer Formulierung Mäusen in die Schwanzwurzel subkutan injiziert. Die Kontrollgruppe wurde mit der Emulsion in Kombination mit 10 ug MPL und 10 ug QS21 scheinimmunisiert. In der 4. Woche wurde den Tieren Blut zur serologischen Analyse abgenommen und dann wurden sie getötet. Bei allen Tieren wurde die Milz steril entfernt und vereinigt und eine Einzelzell-Suspension wurde zur erneuten Stimulierung mit 1 ug/ml rMOMP oder 4 ml Con A (Boehringer Mannheim) als Kontrolle hergestellt. Dazu wurden Kulturen auf Kulturplatten mit flachem Boden und 24 Vertiefungen angesetzt, wobei 106 der auf die Stimulierung reagierenden Zellen pro ml RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (Gibco BRL) verwendet wurden. 96 h nach erneuter Stimulierung gesammelte Überstände wurden unter Verwendung eines handelsüblichen ELISA-Kits (Cytoscreen, Biosource) auf IFN-gamma getestet.

2.6 Ergebnisse

2.6.1 Antigen

Nach Dialyse wurde bestimmt, daß die rMOMP-Konzentration rund 2 mg/ml betrug und die Verunreinigung mit Endotoxinen unter 0,05 EE/ug rMOMP lag.

2.6.2 Wirkung einer Immunisierung mit rMOMP, das mit Adjuvantien versetzt worden war, auf die humorale Immunreaktion von Mäusen, ihre Fertilität nach heterotypischer Infektion und auf das aus der Infektion resultierende Entzündungsinfiltrat.

Die Ergebnisse des Experiments, das zur Bestimmung des prophylaktischen Potentials von mit unterschiedlichen Adjuvantien versetztem rMOMP durchgeführt wurde, sind in Tabelle 2 gezeigt.

2.6.3 Wirkung einer Immunisierung auf die humorale Reaktion.

Die humorale Reaktion nach Impfung wurde in Seren und Vaginalauswaschungen bestimmt, die am Tag der Infektion gesammelt wurden. Alle Antigen-Formulierungen führten zu ähnlichen geometrischen mittleren Titern (GMT) von gegen rMOMP gerichtetem IgG, die bei etwa 30 000 lagen. Tiere, die nur mit Adjuvantien scheinimmunisiert worden waren, wiesen keine signifikanten Titer von Antikörpern gegen das rekombinante Chlamydia- Antigen auf. Bei keiner Gruppe wurde in den unmittelbar vor Infektion gesammelten Vaginalauswaschungen rMOMP-spezifisches sekretorisches IgA nachgewiesen. Eine Isotypisierung der rMOMP-spezifischen IgG-Reaktion zeigte, daß im Vergleich zu der Reaktion, die von einer nur MOMP enthaltenden Emulsion hervorgerufen wurde, das Vorliegen von MPL und QS21 oder DQ den relativen IgG2a-Titer erhöhte. Es zeigte sich, daß alle Immunseren IgG enthielten, das mit Methanol-fixierten Einschlüssen des zur Infektion verwendeten C. trachomatis-Serovar F-Stamms NI1 reagierte.

2.6.4 Wirkung einer heterotypischen Immunisierung auf die Fertilität nach Infektion.

Die Wirkung einer Infektion von Mäusen mit dem heterologen Stamm NI1 auf deren Fertilität wurde anhand der in den experimentellen Verfahren definierten Parameter F, N und M bestimmt. Für jede Gruppe sind die Werte der über den gesamten Paarungszeitraum berechneten Parameter in Tabelle 1 gezeigt. Im Gegensatz zu der scheininfizierten Gruppe führte eine Infektion der scheinimmunisierten Gruppe zu einer fast vollständigen Infertilität, was andeutete, daß die beobachtete Infertilität durch C. trachomatis induziert wird und nicht durch eine Manipulation der Tiere. Bei den Gruppen, die mit rMOMP und den beiden Immunstimulanzien MPL und DQ als Adjuvans immunisiert worden waren, führte die MPL und DQ enthaltende Antigen-Formulierung zu einem partiellen Schutz: in dieser Gruppe erreichten die Werte der Parameter F und N fast 80% der Werte, die in der scheininfizierten Gruppe (Positivkontrolle) registriert wurden. Im Gegensatz dazu führte eine Immunisierung mit rMOMP, das in der Emulsion formuliert worden war, vor der Infektion zu niedrigen Werten der Fertilitätsparameter F und N.

2.6.5 Histopathologische Veränderungen nach Infektion

Bei der histopathologischen Gegenprobe zu dem Fertilitäts- Experiment zeigte eine an Gewebe-Schnitten durchgeführte klassische HE- Anfärbung keine merklichen Unterschiede zwischen scheinimmunisierten und geimpften Gruppen hinsichtlich der Anzahl von Entzündungen der Eileiter und Eierstöcke. Wenn jedoch die Häufigkeit von T-Zell-Untergruppen mittels immuncytochemischer Anfärbung untersucht wurde, so wurden CD4- positive T-Zellen nur bei der mit MPL und DQ geimpften Gruppe nachgewiesen (4 von 4 Mäusen), während CD8-positive T-Zellen sowohl bei immunisierten als auch bei scheinimmunisierten Gruppen nachgewiesen wurden (Tabelle 3). In diesem Experiment wurden daher Infiltrate CD4-positiver T-Zellen nur bei der mit MPL und DQ geimpften Gruppe gefunden, die auch die einzige Gruppe war, die in der Fertilitäts-Gegenprobe des Experiments geschützt wurde.

2.6.6 Wirkung der Formulierung auf die IFN-gamma-Sekretion nach erneuter in vitro-Stimulierung

Die durch die Antigen-Formulierungen induzierte zelluläre Aktivierung (Tabelle 4) wurde in einem gesonderten Experiment analysiert. Einerseits zeigten Milzzellen, die von Tieren, die mit rMOMP in Kombination entweder mit MPL + QS21 oder MPL + DQ geimpft worden waren, isoliert und in vitro mit dem Antigen erneut stimuliert worden waren, in ihren Kulturüberständen IFN-gamma-Konzentrationen, die mit denen vergleichbar waren, die durch Stimulierung mit 4 ug/ml Concanavalin A während der gleichen Zeitspanne erhalten wurden. Andererseits erzeugten Zellen, die aus Tieren isoliert worden waren, die entweder scheingeimpft oder mit rMOMP ohne Immunstimulanzien geimpft worden waren, keine nachweisbaren Mengen von IFN-gamma, während sich die zusammen mit ConA gezüchteten Gegenproben allesamt als positiv für dieses Cytokin erwiesen. Eine an vereinigten Seren aller Gruppen durchgeführte serologische Analyse zeigte, daß die Sekretion von IFN-gamma mit einer Erhöhung des Antigen- spezifischen IgG2a-Anteils einherging.

SCHLUSSFOLGERUNG

Zusammengefaßt, legen die Daten des Infektions-Versuchs und des Tests zum IFN-gamma-Nachweis nahe, daß bei Mäusen die Kombination der beiden Adjuvantien MPL und QS21 oder DQ mit einem rekombinanten MOMP eilte Antigen-spezifische Th1-ähnliche Immunreaktion induziert, die sich anhand der Sekretion von IFN-gamma und erhöhter IgG2a-Titer bestimmen läßt und die zum Schutz gegen die aus einer Chlamydia-Infektion resultierende Infertilität führen kann.

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Claims

1. Impfstoffzusammensetzung, umfassend ein MOMP-Protein von Chlamydia in Verbindung mit QS21 und 3DMPL.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Protein von einem Chlamydia-L2-Serovar stammt.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, der zusätzlich ein Protein von einem Unterschiedlichen Serovar umfasst.

4. Impfstoff nach Anspruch 1, der zusätzlich ein Sterin umfasst.

5. Impfstoff nach Anspruch 4, wobei das Sterin Cholesterin ist.

6. Impfstoff nach Anspruch 5, wobei QS21 mit einem Cholesterin enthaltenden Liposom assoziiert ist.

7. Impfstoff nach Anspruch 6, wobei das Antigen außerhalb des Liposoms ist.

8. Impfstoff nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das Verhältnis von QS21 zu Cholesterin etwa 1 : 5 beträgt.

9. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, umfassend die Zugabe vom 3D-MPL zu dem MOMP-Antigen und die anschließende Zugabe von QS21.

10. Impfstoff wie hier beansprucht zur Verwendung als ein Medikament.

11. Verwendung eines MOMP-Proteins von Chlamydia in Verbindung mit QS21 und 3D-MPL für die Herstellung eines Impfstoffes zur Reduktion von Chlamydia-induzierter Infertilität.

Tabelle 1: Serologische und Fertilitäts-Analyse bei immunisierten und Kontroll-Mäusen, die über einen Zeitraum von 12 Wochen kontrolliert wurden

Tabelle 2:

sc: subkutaner Verabreichungsweg

GMT: geometrischer mittlerer Titer

ND: nicht durchgeführt

Tabelle 3

sc: subkutaner Verabreichungsweg

ND: nicht durchgeführt

Die Anzahl CD4- oder CD8-positiver T-Zellen wurde mit "keine Zelle" (-) bis maximale Infiltration (+++) des in Betracht gezogenen Zelltyps bewertet.

Tabelle 4

sc: subkutaner Verabreichungsweg

GMT: geometrischer mittlerer Titer

ND: nicht durchgeführt