DE69611442T2

DE69611442T2 - Enzymatische synthese von glykosidischen verbindungen

Info

Publication number: DE69611442T2
Application number: DE69611442T
Authority: DE
Inventors: Robert J. Bayer; Shawn Defrees; Murray Ratcliffe
Original assignee: Neose Technologies Inc
Current assignee: Neose Technologies Inc
Priority date: 1995-04-11
Filing date: 1996-04-10
Publication date: 2001-06-07
Anticipated expiration: 2016-04-11
Also published as: AU5387396A; CA2218246C; EP0820519B1; US5728554A; EP0820519A1; CA2218246A1; WO1996032491A1; DE69611442D1; JPH11503329A

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese von Oligosacchariden. Im Speziellen betrifft sie verbesserte enzymatische Synthesen solcher Verbindungen in einem einzigen Gefäß unter Verwendung leicht verfügbarer Ausgangsmaterialien.

STAND DER TECHNIK

Das bessere Verständnis der Rolle vQn Kohlenhydraten als Erkennungselemente an der Oberfläche von Zellen hat zu einem erhöhten Interesse an der Produktion von Kohlenhydratmolekülen mit definierter Struktur geführt. Beispielsweise sind Verbindungen, die die Sialyl-Lewis-Liganden Sialyl-LewisX und Silalyl-Lewisd umfassen, in Leukozyten- und Nicht-Leukozyten-Zelllinien vorhanden, die sich an Rezeptoren, wie z. B. die ELAM-1- und GMP 140-Rezeptoren binden. Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6224 (1991), und Phillips et al., Science 250, 1130 (1990), siehe auch USSN 08/063.181.
Wegen des Interesses an der Herstellung gewünschter Kohlenhydratstrukturen werden Glykosyltransferasen und ihre Rolle bei der Enzym-katalysierten Synthese von Kohlenhydraten zur Zeit ausgiebig erforscht. Diese Enzyme weisen hohe Spezifität auf und eignen sich zur Bildung von Kohlenhydrat-Strukturen mit definierter Sequenz. Folglich werden Glykosyltransferasen zunehmend als enzymatische Katalysatoren bei der Synthese einer Anzahl von Kohlenhydraten eingesetzt, die für therapeutische und andere Zwecke verwendet werden.
Beim Einsatz von Enzymen auf dem Gebiet synthetischer Kohlenhydrat-Chemie ist die Verwendung von Glykosyltransferasen für die enzymatische Synthese von Kohlenhydraten gegenüber chemischen Verfahren aufgrund der nahezu vollständigen Stereoselektivität und Bindungsspezifität, die diese Enzyme bieten, von Vorteil (Ito et al., Pure Appl. Chem. 65, 753 (1993), US-Patente Nr. 5.352.670 und 5.374.541).
Verbesserte Verfahren zur enzymatischen Synthese von Kohlenhydrat-Verbindungen würden einen Fortschritt bei der Herstellung einer Anzahl nützlicher Verbindungen herbeiführen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren zur Übertragung eines Monosaccharids von einem Donor-Substrat zu einem Akzeptor-Zucker bereit. Insbesondere umfassen die Verfahren:
(a) das Bereitstellen eines Reaktionsmediums, das zumindest eine Glykosyl-Transferase, ein Donor-Substrat, einen Akzeptor-Zucker und ein lösliches zweiwertiges Metallkation umfasst; und
(b) das Ergänzen der Konzentration des löslichen zweiwertigen Metallkations, um zu ersetzen, was durch Fällung verloren geht, wodurch eine Konzentration im Reaktionsmedium zwischen etwa 1 mM und etwa 75 mM für einen Zeitraum erzielt wird, der ausreicht, um die Übertragung des Monosaccharids im Wesentlichen abzuschließen. Das Ergänzen des zweiwertigen Metallkations kann entweder intermittierend oder kontinuierlich erfolgen.
Das bei den Verfahren verwendete zweiwertige Metallkation kann Mn&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus;, Co&spplus;&spplus;, Cu&spplus;&spplus;, Zn&spplus;&spplus; oder ein Kombination davon sein. Typischerweise ist das Kation Mn&spplus;&spplus;. Die Glykosyltransferase kann eine Sialyltransferase, eine Galactosyltransferase, eine Fucosyltransferase, eine Glucosyltransferase oder eine N-Acetylglucosaminyltransferase sein.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydrat-Verbindungen bereit, die in der Lage sind, die Bindung von ELAM-1 an seinen Liganden zu hemmen. Diese Verbindungen sind besonders nützlich für verschiedene therapeutische und diagnostische Anwendungen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Herstellung einer Verbindung der Formel: NeuAca(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcNAcβ(1→3)Galβ-OR.
Fig. 2 veranschaulicht einen Galactosyl-Transferase-Zyklus gemäß vorliegender Erfindung.
Fig. 3 veranschaulicht einen Fucosyl-Transferase-Zyklus.
Fig. 4 veranschaulicht einen N-Acetylglucosamin-Transferale-Zyklus.
Fig. 5 veranschaulicht einen Sialyl-Transferase-Zyklus gemäß vorliegender Erfindung.
Fig. 6 veranschaulicht einen Galactosyl-Transferase-Partialzyklus.
Fig. 7 veranschaulicht einen N-Acetylglucosamin-Transferale-Partialzyklus.
Fig. 8 veranschaulicht einen Sialyl-Transferase-Partialzyklus.
Fig. 9 zeigt die Reaktionsrate über der Metallion-Konzentration für einen Galactosyl- Transferase-Zyklus.
Fig. 10 veranschaulicht einen Sialyl-Transferase-Zyklus, bei dem die Sialsäure aus GlcNAc erzeugt wird.
Fig. 11 veranschaulicht die Metallion-Mengen, die während der Durchführung eines Galactosyl-Transferase-Zyklus unter kontinuierlicher MnCl&sub2;-Infusion erreicht werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Übertragung eines Monosaccharids von einem Donor-Substrat auf einen Akzeptor-Zucker bereit. Diese Übertragung erfolgt in einem Reaktionsmedium, das zumindest eine Glykosyl-Transferase, ein Donor-Substrat, einen Akzeptor-Zucker und ein lösliches zweiwertige Metallkation umfasst. die Verfahren basieren auf der Verwendung einer Glykosyl-Transferase zur Katalyse der Addition eines Saccharids an ein Substratsaccharid. Die Addition findet am nicht-reduzierenden Ende einer Oligosaccharid- oder Kohlenhydrat-Gruppe auf einem Biomolekül statt. Biomoleküle sind hierin so definiert, dass sie biologisch signifikante Moleküle, wie z. B. Proteine (z. B. Glykoproteine) und Lipide (z. B. Glykolipide, Phospholipide, Sphingolipide und Ganglioside) umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird die Konzentration an zweiwertigem Metallion während der Bildung der glykosyidischen Bindung ergänzt, um die Konzentration des löslichen zweiwertigen Metallkations im Reaktionsmedium zwischen 1 mM und 75 mM wiedereinzustellen.
In der vorliegenden Anmeldung werden folgende Abkürzungen verwendet:
Ara = Arabinosyl;
Fru = Fructosyl;
Fuc = Fucosyl;
Gal = Galactosyl;
GalNAc = N-Acetylgalacto;
Glc = Glucosyl;
GlcNAc = N-Acetylgiuco;
Man = Mannosyl; und
NeuAc = Sialyl (N-Acetylneuraminyl).
Es wird davon ausgegangen, dass Oligosaccharide ein reduzierendes Ende und ein nicht-reduzierendes Ende aufweisen, unabhängig davon, ob das Saccharid am reduzierenden Ende tatsächlich ein reduzierender Zucker ist. Gemäß der anerkannten Nomenklatur werden Oligosaccharide in der vorliegenden Anmeldung mit dem nichtreduzierenden Ende links und dem reduzierenden Ende rechts dargestellt.
Alle in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Oligosaccharide werden mit dem Namen oder der Abkürzung für das nicht-reduzierende Saccharid (z. B. Gal), gefolgt von der Konfiguration der glykosidischen Bindung (α oder β), der Ringbindung, der Ringposition des an der Bindung beteiligten reduzierenden Saccharids und dann dem Namen oder der Abkürzung des reduzierenden Saccharids (z. B. GlcNAc) beschrieben. Die Bindung zwischen zwei Zuckern kann beispielsweise als 2,3, 2→3, oder (2,3) ausgedrückt sein.

Ausführungsformen der Erfindung

Eine Anzahl von Glykosyl-Transferase-Zyklen (beispielsweise der in Fig. 2 dargestellte Galactosyltransferase-Zyklus, der in Fig. 3 dargestellte Fucosyltransferase-Zyklus, der in Fig. 4 dargestellte N-Acetylglucosamin-Transferase-Zyklus und der in Fig. 5 dargestellte Sialyltransferase-Zyklus) sind für die Herstellung von Oligosacchariden nützlich. Siehe US-Patent Nr. 5.374.541 und WO 9425615 A. Diese Enzymzyklen erzeugen ein oder mehrere Mol anorganisches Pyrophosphat pro gebildetem Mol Produkt und werden typischerweise in Gegenwart eines zweiwertigen Metallions durchgeführt. Das Metallion ist ein Cofaktor für zumindest eines der Enzyme in jedem der Zyklen. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben jedoch nun entdeckt, dass das zweiwertige Metallkation eine zweifache Rolle in den Glykosyl-Transferase-Zyklen spielt. Insbesondere haben sie entdeckt, dass das zweiwertige Metallion mit anorganischem Phosphat oder Pyrophosphat, das durch verschiedene Vorgänge in den Glykosyl-Transferase- Zyklen erzeugt wird, einen Komplex mit sehr niedriger Löslichkeit bildet. Als Ergebnis kann das Metallion das Pi oder PPi durch Fällung aus der Reaktion entfernen. Das führt wiederum dazu, dass verringerte Mengen an Metallionen in Lösung vorliegen, sowie zu einer entsprechenden Verringerung der Gesamt-Umsatzraten für jene Enzyme, welche die Metall on-Cofaktoren erfordern.
Eine mögliche Lösung für dieses Problem umfasst das Beginnen mit hohen Konzentrationen an Metallion-Cofaktoren. Allerdings hat sich der Einsatz hoher Konzentrationen an Metallion-Cofaktoren als schädlich sowohl für den Galactosvltransferase- als auch den Sialyltransferase-Zyklus erwiesen. Neben der Inaktivierung bestimmter Enzyme in den Zyklen ist berichtet worden, dass hohe Konzentrationen an Manganionen die Zersetzung von Nukleosidzuckern wie UDP-Glucose und UDP-Galactose katalysieren können (siehe Nunez et al., Biochemistry 15, 3843-3847 (1976)). Alternativ dazu haben andere Forscher anorganische Pyrophosphatase in das Reaktionsmedium aufgenommen und so versucht, die Reaktionszyklen durch Entfernung von Pyrophosphat zum Abschluss zu bringen. Dennoch werden zwischen dem durch anorganische Pyrophosphatase erzeugten Orthophosphat und dem Metallion-Cofaktor Komplexe mit eingeschränkter Löslichkeit gebildet, was eine Reduktion der Metallionkonzentrationen bewirkt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine alternative Lösung für das Problem der Metallion- Abreicherung in diesen Zyklen bereit, die darin besteht, die Metallion-Konzentrationen entweder kontinuierlich oder intermittierend während des gesamten zyklischen Verfahrens zu ergänzen. So findet die vorliegende Erfindung bei den hierin beschriebenen zyklischen Glykosyl-Transferase-Verfahren Anwendung, und jedem anderen Verfahren zur Bildung glykosidischer Bindungen, bei dem der Nukleosidabschnitt eines Donor-Substrats oder Donor-Zuckers entweder rezykliert wird oder als Teil eines Rezyklierverfahrens ähnlich den in den Fig. 2 bis 8 gezeigten dargestellt werden kann.
Ein Enzym im Galactosyl-Transferase-Zyklus, das einen absoluten Bedarf an zweiwertigen Metallkationen gezeigt hat, ist die Galactosyltransferase (siehe Khatra et al., Eur. J. Biochem. 44, 537-560 (1974)). Die Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Reaktionsrate beispielsweise von der Mny&spplus;&spplus;-Konzentration wurde untersucht, indem die Transferrate von ³H-Galactose von UDP-³H-Galactose auf N-Acetylglucosamin gemessen wurde, was zur Bildung von N-Acetyllactosamin führt (siehe Fig. 9). Wie in Fig. 9 zu erkennen fällt die Geschwindigkeit der Reaktion unterhalb von 2 mM rasch ab. Durch Halten der Metallion-Konzentration über 1 mM, vorzugsweise über 2 mM, kann der Zyklus mit maximaler Effizienz ablaufen. Allerdings hat sich eine zu hohe Konzentration von Mn&spplus;&spplus; als nachteilig erwiesen, teilweise aufgrund der bekannten Wirkung einer hohen Mn&spplus;&spplus;-Konzentration bei der Katalyse der Hydrolyse von Nukleotidzuckern. Bei Reaktionen, bei denen Pyrophosphat oder Phosphat erzeugt wird, wird ein Komplex mit geringer Löslichkeit gebildet, was zur Abreicherung des erforderlichen Metall-Cofaktors führt. Diese Abreicherung tritt bei Reaktionen, bei denen kein Phosphat- oder Pyrophosphat erzeugt wird, nicht auf.
Eine solche Reaktion ist in Fig. 6 als Galactosyltransferase-Partialzyklus dargestellt. In diesem Partialzyklus wird, wenn eine Galactosyltransferase, ein geeigneter Akzeptor und ausreichend UDP-Galactose (oder UDP-Glucose mit UDP-Gal-4-Epimerase) in Gegenwart von Mn&spplus;&spplus; inkubiert werden, der Akzeptor galactosyliert. Nichtsdestoweniger läuft diese Reaktion nicht vollständig ab. Statt dessen schreitet die Reaktion voran, bis sich das Hemm-Produkt UDP in ausreichenden Maße angesammelt hat, um die weitere Reaktion zu hemmen. Bei einer solchen Reaktion ändert sich die Metallionkonzentration nicht wesentlich im Zeitverlauf, da keine Spezies erzeugt wird, die seine Löslichkeit verringert.
Eine Lösung für das Problem unvollständiger Reaktion aufgrund der Hemmung durch UDP besteht darin, eine Phosphatase (z. B. Alkalische Phosphatase) zuzugeben, die das hemmende UDP in UMP + Pi und dann in Uridin + 2Pi umwandelt. In diesem Fall bleibt die Manganionen-Konzentration im Verlauf der Reaktion aufgrund ihrer Abreicherung durch das erzeugte Phosphat nicht mehr konstant. In diesem Fall ist nun entdeckt worden, dass das Ergänzen des Metallions eingesetzt werden kann, um die Reaktion vollständig ablaufen zu lassen.
Andere Enzyme im Galactosyltransferase-Zyklus mit einem bekannten absoluten Bedarf an zweiwertigen Metallkationen sind Pyruvat-Kinase (siehe Villafranca et al., THE EN- ZYMES XX, 63-94 (1992)) und UDP-Glucose-Pyrophosphorylase (siehe Turnquist et al., THE ENZYMES VIII(A), 51-71 (1973)). Bei hohen Konzentrationen sind zweiwertige Metallkationen Berichten zufolge für UDP-Glucose-Pyrophosphorylase hemmend.
Im Sialyltransferase-Zyklus (Fig. 5) ist ein Enzym mit einem absoluten Bedarf an zweiwertigen Metallkationen CMP-NeuAc-Synthetase (siehe Kean et al., METHODS IN EN- ZYMOLOGY 8, 208-21 S (1966)). Andere Enzyme in diesem Sialyltransferase-Zyklus mit einem absoluten Bedarf an zweiwertigen Metallionen sind Pyruvat-Kinase und Myokinase (siehe Villafranca et al., THE ENZYMES XX, 63-94 (1992)).
Wie oben für Galactosyltransferase beschrieben kann ein Partialzyklus oder eine stöchiometrische Reaktion, die eine Sialyltransferase, CMP-NeuAc-Synthetase, einen geeigneten Akzeptor, Sialsäure, CTP und ein geeignetes zweiwertiges Metallkation umfasst, durchgeführt werden (siehe Fig. 8). Im Gegensatz zum Galactosyltransferase-Zyklus bleibt die Konzentration an zweiwertigen Metallionen in einer solchen Reaktion aufgrund des anorganischen Pyrophosphats, das durch die CMP-NeuAc-Synthetase-Reaktion erzeugt wird, nicht konstant. Wenn ausreichend CTP und Sialsäure vorhanden sind, schreitet die Reaktion voran, bis entweder das zweiwertige Metallkation erschöpft ist, oder sich hemmendes CMP bis auf ein ausreichendes Niveau angesammelt hat. Wie beim Galactosyltransferase-Partialzyklus kann das hemmende Nukleotid durch Behandlung mit einer geeigneten Phosphatase entfernt werden, die Pi erzeugt. Dies dient dazu, das zweiwertige Metallkation weiter abzureichern.
Im GlcNAc-Zyklus (Fig. 4) ist ein Enzym mit einem absoluten Bedarf an zweiwertigen Metallkationen GlcNAc-Transferase. Ein weiteres Enzym im GlcNAc-Transferase-Zyklus mit einem absoluten Bedarf an zweiwertigen Metallen ist Pyruvat-Kinase.
Wie oben für Galactosyltransferase- und Sialyltransferase-Partialzyklen beschrieben kann ein Partialzyklus oder eine stöchiometrische Reaktion durchgeführt werden, der/die die GlcNAc-Transferase, einen geeigneten Akzeptor und entweder UDP-GlcNAc oder eine Kombination von GlcNAc-1-Phosphat mit UTP- und UDP-GlcNAc-Pyrophosphorylase umfasst (dargestellt durch die großen Pfeile in Fig. 7). Wie bei den anderen Zyklen und Partialzyklen wird auch ein geeignetes zweiwertiges Metallkation verwendet. Für den Fall, dass die Reaktion mit UDP-GlcNAc beginnt, schreitet die Reaktion voran, bis sich hemmendes UDP bis zu einem ausreichenden Niveau angesammelt hat.
Bei einer solchen Reaktion ändert sich die Metallion-Konzentration nicht wesentlich im Zeitverlauf, weil keine Spezies erzeugt wird, die seine Löslichkeit verringert. Was den Galactosyltransferase-Partialzyklus betrifft, kann das hemmende Nukleotid durch Behandlung mit einer geeigneten Phosphatase (z. B. Alkalischer Phosphatase) entfernt werden, die Pi erzeugt. Das dient dazu, das zweiwertige Metallkation zu erschöpfen.
Im Fall, dass der Partialreaktionszyklus mit UTP und GlcNAc-1-Phosphat begonnen wird, ist die Situation analog zum Partialzyklus, der für die Sialyltransferase erörtert wurde. Die Konzentration an zweiwertigen Metallionen in einer solchen Reaktion bleibt aufgrund des anorganischen Pyrophosphats, das durch die UDP-GlcNAc-Pyrophosphorylase-Reaktion erzeugt wird, konstant. Außerdem erschöpft das Entfernen des hemmenden UDP, das sich durch die Zugabe einer geeigneten Phosphatase ansammelt, das erforderliche zweiwertige Metall aufgrund des zusätzlichen erzeugten Phosphats weiter (siehe Fig. 7).
Wenn enzymatische Glykosylierungen für Herstellungsverfahren in größerem Maßstab durchgeführt werden, machen es wirtschaftliche und auf die Anlagen bezogene Überlegungen notwendig, dass die Reaktionen in einer möglichst konzentrierten Lösung durchgeführt werden, um die Rohmaterial-Anforderungen zu verringern, eine geeignete Gefäßgröße beizubehalten und die zu entfernende Menge an wässrigem Lösungsmittel zu verringern. Bei höheren Reaktandenkonzentrationen ist die erzeugte Phosphat- oder Pyrophosphat-Konzentration proportional größer. Das Vorhandensein von ausreichend zweiwertigem Metallkation zu Beginn, um ein gewünschtes Niveau beizubehalten, um die Reaktion vollständig ablaufen zu lassen, erweist sich tatsächlich als nachteilig für die Reaktion. Bei ausreichend hoher Reaktandenkonzentration und Geschwindigkeit erfordert auch das Auffüllen des zweiwertigen Metalls, das durch die Fällung alle 24 h verloren geht, Zugaben in einem so hohen Anteil, dass die vorübergehende hohe Konzentration nach einer solchen Zugabe für den Reaktionszyklus schädlich ist. In diesem Fall lässt sich mit kontinuierlicher Infusion von zweiwertigen Metallionen eine zufriedenstellende Konzentration in der Reaktion erreichen, und sie stellt ein bevorzugtes Verfahren dar.
Im Hinblick auf die bekannten Anforderungen für die Glykosyl-Transferasen sowie die in der vorliegenden Anmeldung dargelegten Entdeckungen stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren für die Übertragung eines Monosaccharids von einem Donor-Substrat auf einen Akzeptor-Zucker bereit. Bei diesem Verfahren wird ein Medium (typischerweise eine wässrige Lösung) bereitgestellt, die zumindest eine Glykosyl-Transferase, ein Donor-Substrat, einen Akzeptor-Zucker und ein lösliches zweiwertiges Metallkation enthält. Die Konzentration des zweiwertigen Metallkations im Reaktionsmedium wird so ergänzt, dass idealerweise eine Konzentration von zwischen etwa 1 mM und etwa 75 mM, vorzugsweise zwischen etwa 5 mM und etwa 50 mM, noch bevorzugter zwischen etwa 5 und etwa 30 mM, für einen ausreichend langen Zeitraum beibehalten wird, um die Glykosyl-Übertragung im Wesentlichen vollständig ablaufen zu lassen. Der Begriff "im Wesentlichen vollständig" bezeichnet in Zusammenhang mit dem Syntheseverfahren gemäß vorliegender Erfindung ein Verfahren, das laut DC oder ¹H-NMR zu zumindest etwa 90 O/o mehr bevorzugt etwa 95%, noch mehr bevorzugt etwa 98%, vollständig abgelaufen ist.
Durch kontinuierliches und intermittierendes Überwachen der Metallionen-Konzentration im Reaktionsmedium und Ergänzen des Mediums durch zusätzliche Mengen an zweiwertigen Metallionen können die Reaktionszyklen innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens zum vollständigen Ablaufen gebracht werden. Außerdem können, wenn mehr als eine Glykosyl-Transferase verwendet wird, aufeinanderfolgende Zyklen ohne Isolierung der Zwischenprodukte im selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Darüber hinaus können die Reaktionszyklen durch Entfernen des hemmenden Pyrophosphats bei einer wesentlich höheren Substrat- (Akzeptor-) Konzentration durchgeführt werden. Bevorzugte zweiwertige Metallionen zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung sind Mn&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Co&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus;, Zn&spplus;&spplus; sowie Kombinationen davon. Mehr bevorzugt ist das zweiwertige Metallion Mn&spplus;&spplus;.
Bei einer Gruppe von Ausführungsformen ist die Glykosyl-Transferase eine Sialyltransferase. Wenn eine Sialyltransferase verwendet wird, enthält das Reaktionsmedium vorzugsweise zusätzlich zu Sialyltransferase, Donor-Substrat, Akzeptor-Zucker und zweiwertigem Metall-Kation (i) eine katalytische Menge einer CMP-Sialsäure-Synthetase, (ii) eine Sialsäure und (iii) ein CMP-Sialsäure-Rezykliersystem, das zumindest 2 Mol Phosphat-Donor pro Mol Sialsäure umfasst, sowie katalytische Mengen eines Nukleosidtriphosphats, eine Kinase, die in der Lage ist, Phosphat vom Phosphat-Donor auf Nukleosiddiphosphate zu übertragen, und eine Nukleosidmonophosphat-Kinase, die in der Lage ist, das terminale Phosphat von einem Nukleosidtriphosphat auf CMP zu übertragen.
Eine α(2,3)Sialyltansferase, die oft als Sialyltransferase bezeichnet wird, ist das Haupt- Enzym, das gemäß vorliegender Erfindung zur Herstellung von NeuAcα(2,3)Galβ(1,4)- GlcNAcβ(1,3)GalβOR verwendet wird, worin R wie nachstehend definiert ist. Dieses Enzym überträgt Sialsäure auf eine Gal, wobei zwischen den beiden Sacchariden eine α-Bindung gebildet wird. Bindung (Verbindung) zwischen Sacchariden erfolgt zwischen der 2-Position von NeuAc und der 3-Position von Gal.
Ein Beispiel für α(2,3)Sialyltransferase, das als α(2, 3)Sialtransferase (EC 2.4.99.6) bezeichnet wird, überträgt Sialsäure auf ein nicht-reduzierendes terminales Gal eines Galβl→3Glc-Disaccharids oder Glykosids. Siehe Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256, 3159v (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257, 13845 (1982), und Wen et al., J. Biol. Chem. 267, 21011 (1992). Eine weitere beispielhafte a(2, 3)Sialyltransferase (EC.2.499.4) überträgt Sialsäure auf ein nicht-reduzierendes terminales Gal des Disaccharids oder Glykosids. Siehe Rearick et al., J. Biol. Chem. 254, 4444 (1979), und Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267, 21004 (1992).
Weitere Beispiele für Enzyme sind Galβ-1,4-GlcNAc-cc(2,6)Sialyltransferasen (siehe Kurosawa et al., Eur. J. Biochem. 219, 375-381 (1994), Kurosawa et al., J. Biol. Chem. 269, 1402 (1994)), GM3-Synthase (J. Biol. Chem. 268, 26273-78 (1993)) sowie α(2,8)Sialyltransferase (Livingston et al., J. Biol. Chem. 268, 11504 (1993)).
Ein zweites Haupt-Enzym, das bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist CMP-Sialsäure-Synthetase. Dieses Enzym wird im CMP-Sialsäure-Regenerationssystem eingesetzt, das in der Folge im Detail erörtert wird. CMP-Sialsäuresynthetase kann nach Verfahren, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sind, aus Zellen und Geweben isoliert und gereinigt werden, die das Synthetaseenzym enthalten. Siehe beispielsweise Gross et al., Eur. J. Biochem. 168, 595 (1987), Vijay et al., J. Biol. Chem. 250(1), 164 (1975), Zapata et al., J. Biol. Chem. 264(25), 14769 (1989), sowie Higa et al., J. Biol. Chem. 260(15), 8838 (1985). Das Gen für dieses Enzym ist auch sequenziert worden. Siehe Vann et al., J. Biol. Chem. 262, 17556 (1987). Von Über-Expression des Gens zur Verwendung bei einer Synthese von CMP-NeuAc im Gramm-Maßstab wurde ebenfalls berichtet. Siehe Shames et al., Glycobiology 1, 187 (1991). Dieses Enzym ist auch im Handel erhältlich.
Es ist auch eine Sialsäure erforderlich. Zu den in Frage kommenden Sialsäuren zählt nicht nur Sialsäure selbst (5-N-Acetylneuraminsäure; 5-N-Acetylamino-3,5-didesoxy-D- glycero-D-galacto-2-nonulosonsäure; NeuAc, manchmal auch als AcNeu oder NANA abgekürzt), sondern auch 9-substituierte Sialsäuren, wie etwa 9-O-C&sub1;-C&sub6;-Acyl-NeuAc, z. B. 9-O-Lactyl-NeuAc oder 9-O-Acetyl-NeuAc, 9-Desoxy-9-fluor-NeuAc und 9-Azido-9- desoxy-NeuAc. Die Synthese und Verwendung dieser Verbindungen in einem Sialylierungsverfahren wird in der am 1. Oktober 1992 veröffentlichten internationalen Anmeldung WO 92/16640 geoffenbart. Andere geeignete Sialsäuren sind N-Glykolylneuraminsäure, 5-Hydroxyneuraminsäure, 6-CbzNH, 5-CH&sub3;OC(O)NH-Neuraminsäure (Shames et al., Glykobiol. 1, 187 (1991)) und 5-N-Acylneuraminsäure.
Das Reaktionsgemisch enthält auch einen Akzeptor für die Sialyltransferase. Geeignete Akzeptoren sind beispielsweise Galactosyl-Akzeptoren, wie z. B. Galβ1→3Gal NAc, Lacto-N-tetrose, Galβ1→3GlcAc, Galβ1→3Ara, Galβ1→6GlcNAc, Galβ1→4Glc (Lactose), Galβ1→4Glcβ1-OCH&sub2;CH&sub3;, Galβ1→4Glcβ1-OCH&sub2;CH&sub2;CH&sub3;, Galβ1→4Glcβ1-OCH&sub2;- C&sub6;H&sub5;, Galβ1→4GlcNH-Acyl, Galβ1→4-GlcNAlloc, Galβ1→OCH&sub3;, Melibiose, Raffinose, Stachyose und Lacto-N-neotetrose. Geeignete Sialyl-Akzeptoren sind Sialyl-α2-OR oder Sialyl-α2→8Sialyl-OR, worin R Wasserstoff, ein Saccharid ein Oligosaccharid oder eine Aglykongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom ist, wie nachstehend beschrieben.
Beim CMP-Sialsäure-Rezykliersystem wird CMP-Sialsäure-Synthetase eingesetzt, wie zuvor angemerkt. Wie in Fig. 5 gezeigt reagiert CMP-Sialsäure (in Fig. 5 als CMP-NeuAc gezeigt) mit einem Sialyltransferase-Akzeptor in Gegenwart eine a(2, 3)Sialyltransferase, wodurch NeuAcα(2,3)Galβ(1,4)GlcNAcβ(1,3)GalβOR gebildet wird, worin R wie nachstehend definiert ist.
Das gemäß vorliegender Erfindung verwendete CMP-Sialsäure-Regenerationssystem umfasst Cytidinmonophosphat (CMP), ein Nukleosidtriphosphat (beispielsweise Adenosintriphosphat (ATP), einen Phosphat-Donor (beispielsweise Phosphoenolpyruvat oder Acetylphosphat), eine Kinase (beispielsweise Pyruvat-Kinase oder Acetyl-Kinase), die in der Lage ist, Phosphat vom Phosphat-Donor auf Nukleosiddisphosphate zu übertragen, sowie eine Nukleosid-Monophosphat-Kinase (beispielsweise Myokinase), die in der Lage ist, das terminale Phosphat von einem Nukleosidtriphosphat auf CMP zu übertragen. Die zuvor erörterte α(2,3)Sialyltransferase und CMP-Sialsäure-Synthetase können auch formal als Teil des CMP-Sialsäure-Regenerationssystems angesehen werden. Weil diese beiden Enzyme jedoch bereits erörtert worden sind, werden sie an dieser Stelle nicht noch weiter besprochen.
Nukleosidtriphosphate, die zur Verwendung gemäß dem CMP-Sialsäure-Regenerationssystem geeignet sind, sind Adenosintriphosphat (ATP), Cytidintriphosphat (CTP), Uridintriphosphat (UTP), Guanosintriphosphat (GTP), Inosintriphosphat (ITP) und Thymidintriphosphat (TTP). Ein bevorzugtes Nukleosidtriphosphat ist ATP.
Nukleosidmonophosphat-Kinasen sind Enzyme, welche die Phosphorylierung von Nukleosidmonophosphaten katalysieren. Nukleosidmonophosphat-Kinase (NMK) oder Myokinase (MK; EC 2.7.4.3), die dem CMP-Sialsäure-Regenerationssystem gemäß vorliegender Erfindung entsprechend verwendet werden, werden eingesetzt, um die Phosphorylierung von CMP zu katalysieren. NMKs sind im Handel erhältlich (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA).
Ein Phosphat-Donor und eine katalytische Menge einer Kinase, welche die Übertragung von Phosphat vom Phosphat-Donor auf ein aktivierendes Nukleotid katalysiert, sind ebenfalls Teil des CMP-Sialsäure-Regenerationssystems. Der Phosphat-Donor des Regenerationssystems ist eine phosphorylierte Verbindung, deren Phosphatgruppe dazu dienen kann, das Nukleosidphosphat zu phorphorylieren. Die einzige Einschränkung für die Auswahl des Phosphat-Donors besteht darin, dass weder die phosphorylierte noch die dephosphorylierte Form des Phosphat-Donors irgendwelche der Reaktionen, die an der Bildung des sialylierten Akzeptor-Saccharids beteiligt sind, wesentlich stören kann. Bevorzugte Phosphat-Donoren sind Phosphoenolpyruvat (PEP) und Acetylphosphat. Ein besonders bevorzugter Phophat-Donor ist PEP.
Die Wahl einer bestimmten Kinase zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung hängt vom eingesetzten Phosphat-Donor ab. Wenn Acetylphosphat als Phosphat-Donor verwendet wird, ist die Kinase Acetyl-Kinase. Wenn PEP als Phosphat-Donor verwendet wird, ist die Kinase Pyruvat-Kinase (PK; EC 2.7.1.40). Auch andere Kinasen können zusammen mit diesen und anderen Phosphat-Donoren verwendet werden, was Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist. Kinasen sind im Handel erhältlich (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA).
Aufgrund des in sich abgeschlossenen und zyklischen Charakters bestimmter dieser Glykosylierungsverfahren wird die Reaktion, nachdem alle Reaktanden und Enzyme vorhanden sind, fortgesetzt, bis das erste der stöchiometrischen Substrate (freie NeuAc oder PEP) oder Akzeptor aufgebraucht ist.
So wird im Sialylierungsbeispiel CMP in CDP umgewandelt, dessen Umwandlung durch Nukleosidmonophosphat-Kinase oder Myokinase in Gegenwart von zugesetztem ATP katalysiert wird. ATP wird durch Pyruvat-Kinase (PK) in Gegenwart von zugesetztem Phosphoenolpyruvat (PEP) katalytisch aus seinem Nebenprodukt ADP regeneriert. CDP wird weiters in CTP umgewandelt, wobei die Umwandlung durch PK in Gegenwart von PEP katalysiert wird. CTP reagiert mit Sialsäure, um anorganisches Pyrophosphat (PPi) und CMP-Sialsäure zu bilden, wobei letztere Reaktion durch CMP-Sialsäure-Synthetase katalysiert wird. Nach der Sialylierung der a(2, 3)Sialyltransferase-Azeptor-Verbindung tritt das freigesetzte CMP wieder in das Regenerationssystem ein, um erneut CDP, CTP und CMP-Sialsäure zu bilden. Durch Ergänzen der zweiwertigen Metallionkonzentration im Verlauf der Reaktionszyklen kann das gebildete PPi oder Pi mittels Fällung aus der Lösung entfernt werden. Darüber hinaus können die Metallion-Cofaktor-abhängigen Enzyme mit Maximaleffizienz arbeiten, indem die geeigneten Niveaus an zweiwertigen Metallkationen beibehalten werden.
Pyruvat ist ebenfalls ein Nebenprodukt und kann in einer anderen Reaktion genutzt werden, in der N-Acetylmannosamin (ManNAc) und Pyruvat in Gegenwart von NeuAc-Aldolase (EC 4.1.3.3) umgesetzt werden, um Sialsäure zu bilden. Alternativ dazu kann die Isomerisierung von GlcNAc zu ManNAc genutzt werden, und das kostengünstigere GlcNAc kann als Ausgangsmaterial für die Sialsäure-Erzeugung verwendet werden. So kann die Sialsäure durch ManNAc (oder GlcNAc) und eine katalytische Menge NeuAc- Aldolase ersetzt werden (siehe Fig. 10). Obwohl NeuAc-Aldolase auch die Umkehrreaktion (NeuAc zu ManNAc und Pyruvat) katalysiert, wird das erzeugte NeuAc über CMP- NeuAc katalysiert durch CMP-Sialsäure-Synthetase irreversibel in den Reaktionszyklus eingespeist. Außerdem kann das Ausgangsmaterial ManNAc auch unter Einsatz von nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren durch die chemische Umwandlung von GlcNAc hergestellt werden (siehe z. B. Simon et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 7159 (1988)). Die enzymatische Synthese von Sialsäure und seiner 9-substituierten Derivate sowie die Verwendung der resultierenden Sialsäure in einem anderen Sialylierungsschema ist in der am 1. Oktober 1992 veröffentlichen Internationalen Anmeldung WO 92/16640 geoffenbart.
Wie oben angeführt ist anorganisches Pyrophosphat (PPi) ein Nebenprodukt der Herstellung von CMP-NeuAc. Erzeugtes PPi kann wieder zugeführt werden, um andere Enzyme zu hemmen, so dass die Glykosylierung verringert wird. PPi kann jedoch durch zweiwertige Metallkationen (z. B. Mn&spplus;&spplus; oder Mg&spplus;&spplus;) komplexiert oder enzymatisch abgebaut werden. Beispielsweise kann PPi durch Hydrolyse unter Verwendung von anorganischer Pyrophosphatase (PPase; EC 3.6.1.1), einem im Handel erhältlichen PPi-katabolischen Enzym (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) entfernt werden. Dennoch erzeugt dieser enzymatische Abbau auch Phosphat (Pi), das mit zweiwertigen Metallkationen einen Niederschlag bilden kann. Als Ergebnis werden die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung durch Ergänzen des zweiwertigen Metallkations zum vollständigen Ablaufen gebracht. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Pyrophosphat-Fänger" auf Substanzen, die dazu dienen, anorganisches Pyrophosphat aus einem Reaktionsgemisch gemäß vorliegender Erfindung zu entfernen.
Wie nachstehend erklärt besteht das bevorzugte Verfahren zum Entfernen von PPi oder Pi aus dem Reaktionsgemisch darin, die Konzentration an zweiwertigem Metallkation im Medium beizubehalten. Insbesondere bilden die Kationen und das erzeugte anorganische Phosphat einen Komplex mit sehr geringer Löslichkeit. Durch Ergänzen der Kationen, die durch Fällung mit Pyrophosphat verloren gehen, kann die Reaktionsrate beibehalten werden, und die Reaktionen können zum vollständigen Ablaufen (d. h. 100% Umsatz) gebracht werden.
Das Ergänzen kann kontinuierlich (z. B. durch Automatisierung) oder intermittierend erfolgen. Die Formulierung "Erreichen einer löslichen zweiwertigen Metallkation-Konzentration" und andere verwandte Formulierungen beziehen sich auf Verfahren, bei denen die Konzentration des zweiwertigen Kations im Allgemeinen innerhalb des optimalen Bereichs liegt, so dass der Reaktionszyklus im Wesentlichen nicht gehemmt wird. Somit umfassen die Begriffe speziell auch Verfahren, bei denen die Konzentration an zweiwertigem Kation für gewisse Zeiträume außerhalb des optimalen Bereichs liegt. Wie nachstehend gezeigt, kann der Transferase-Reaktionszyklus zum vollständigen Ablaufen gebracht werden, wenn die Kationen-Konzentration auf diese Weise beibehalten wird.
Bei einer anderen Gruppe von Ausführungsformen ist die Glykosyl-Transferase eine Galactosyltransferase. Wenn eine Galactosyltransferase verwendet wird, enthält das Reaktionsmedium vorzugsweise zusätzlich zu Galactosyltransferase, Donor-Substrat, Akzeptor-Zucker und zweiwertigem Metallkation ein Donor-Substrat-Rezykliersystem, das zumindest 1 Mol Glucose-1-phosphat pro Mol Akzeptor-Zucker, einen Phosphat-Donor, eine Kinase, die in der Lage ist, Phosphat vom Phosphat-Donor auf Nukleosiddiphosphate zu übertragen, und eine Pyrophosphorylase, die in der Lage ist, aus UTP und Glucose-1-phosphat UDP-Glucose zu bilden, sowie katalytische Mengen an UDP und eine UDP-Galactose-4-epimerase. Beispiele für Galactosyltransferasen sind α(1,3)Galactosyltransferase (E. C. Nr. 2.4.1.151, siehe z. B. Dabkowski et al., Transplant Proc. 25, 2921 (1993), sowie Yamamoto et al., Nature 345, 229-233 (1990)), eine β(1,4)Galactosyltransferase (E. C. Nr. 2.4.1.90) und eine bakterielle β(1,4)Galactosyltransferase (siehe Gottschlich et al., J. Exp. Med. 180, 2181 (1994)).
Bei einer weiteren Gruppe von Ausführungsformen ist die Glykosyltransferase eine Kombination aus Sialyltransferase und Galactosyltransferasen. Bei dieser Gruppe von Ausführungsformen können die Enzyme und Substrate in einem Ausgangsreaktionsgemisch kombiniert werden, oder vorzugsweise können die Enzyme und Reagenzien für einen zweiten Glykosyltransferase-Zyklus dem Reaktionsmedium zugegeben werden, sobald der erste Glykosyltransferase-Zyklus nahezu abgeschlossen ist. Mittels Durchführung zweier Glykosyltransferase-Zyklen nacheinander in einem einzigen Gefäß werden die Gesamtausbeuten gegenüber Verfahren, bei denen eine Zwischenspezies isoliert wird, verbessert. Darüber hinaus werden Reinigung und Entsorgung von zusätzlichen Lösungsmitteln und Nebenprodukten eingeschränkt.
Bei einer anderen Gruppe von Ausführungsformen ist die Glykosyltransferase Fucosyltransferase. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind eine Reihe von Fucosyltransferasen bekannt. Kurz zusammengefasst zählen zu den Fucosyltransferasen alle jene Enzyme, die L-Fucose von GDP-Fucose auf eine Hydroxyposition eines Akzeptor-Zuckers übertragen. Vorzugsweise ist der Akzeptor-Zucker ein GlcNAc in einer βGal(1→4)βGlc- NAc-Gruppe in einem Oligosaccharidglykosid. Geeignete Fucosyltransferasen sind dabei die bekannte βGal(1-> 3)βGlcNAc α(1→3,4)-Fucosyltransferase (FTIII E. C. Nr. 2.4.1.65), die aus menschlicher Milch erhalten wird (siehe Palcic et al., Carbohydrate Res. 190, 1-11 (1989); Prieels et al., J. Biol. Chem. 256, 10456-10463 (1981); und Nunez et al., Can. J. Chem. 59, 2086-2095 (1981)) sowie die βGal(1→4)βGlcNAcα(1→3)- Fucosyltransferasen (FTIV, FTV, FTVI und FTVII, E. C. Nr. 2.4.1.65), die in Humanserum zu finden sind. Eine rekombinante Form von βGal(1→3, 4)βGlcNAc α(1→3,4)-Fucosyltransferase ist ebenfalls erhältlich (siehe Dumas et al., Bioorg. Med. Letters 1, 425-428 (1991); und Kukowska-Latallo et al., Genes and Development 4,1 288-1303 (1990)). Andere exemplarische Fucosyltransferasen umfassen α1,2-Fucosyltransfease (E. C. Nr. 2.4.1.69). Enzymatische Fucosylierung kann nach den von Mollicone et al., Eur. J. Biochem. 191, 169-176 (1990), oder in US-Patent Nr. 5.374.655 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wird klar sein, dass statt dessen andere Glykosyltransferasen in ähnlichen Transferasezyklen verwendet werden können, wie sie im Detail für Sialyltansferase beschrieben wurden. Insbesondere können die Glykosyltransferase beispielsweise auch Glucosyltransferasen sein, z. B. Alg8 (Stagljov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91, 5977 (1994)) oder Alg5 (Heesen et al., Eur. J. Biochem. 224, 71 (1994)). Geeignete N-Acetylgalactosaminyltransferasen umfassen α(1,3)N-Acetylgalactosaminyltransferase, β(1,4)N-Acetylgalactosaminyltransfeasen (Nagata et al., J. Biol. Chem. 267, 12082-12089 (1992); und Smith et al., J. Biol. Chem. 269, 15162 (1994)) sowie Polypeptid-N-Acetylgalactosaminyltransferase (Homa et al., J. Biol. Chem. 268, 12609 (1993)). Geeignete N-Acetylglucosaminyltransferasen sind GnTI (2.4.1.101; Hull et al., BBRC 176, 608 (1991)), GnTII, und GnTIII (Ihara et al., J. Biochem. 113, 692 (1993)), GnTV (Shoreiban et al., J. Biol. Chem. 268, 15381 (1993)), O-gebundene und andere N-Acetylglucosaminyltransferasen (Bierhuizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9326 (1992) und Gotschlich et al., J. Exp. Med. 180, 2181 (1994)), N-Acetylglucosamin-1-phosphat-Transferase (Rajput et al., Biochem. J. 285, 985 (1992)), sowie eine Hyaluronan-Synthase. Geeignete Mannosyltransferasen umfassen α(1,2)Mannosyltransferase, α(1,3)Mannosyltransferase, β(1,4)Mannosyltransferase, Dol-P-Man-Synthase, OCh1 und Pmt1.
Andere geeignete Glykosyltransferase-Zyklen werden von Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 114, 9283 (1992), Wong et al., J. Org. Chem. 57, 4343 (1992), DeLuca, et al., J. Am. Chem. Soc. 117, 5869-5870 (1995), und Ichikawa et al., "Carbohydrates and Carbohydrate Polymers", Yaltami (Hrsg.; ATL Press, 1993) beschrieben.
Bei den obigen Glykosyliransferase-Zyklen hängen die Konzentrationen oder Mengen der verschiedenen in den Verfahren verwendeten Reaktanden von zahlreichen Faktoren, einschließlich der Reaktionsbedingungen wie Temperatur und pH-Wert, sowie der Wahl und der Menge an zu glykosylierenden Akzeptor-Sacchariden ab. Weil das Glykosylierungsverfahren die Regeneration von aktivierenden Nukleotiden, aktivierten Donor- Zuckern und das Einfangen von erzeugtem PPi in Gegenwart katalytischer Mengen der Enzyme ermöglicht, ist das Verfahren durch die Konzentrationen oder Mengen der oben erörterten stöchiometrischen Substrate beschränkt. Die Obergrenze für die Konzentrationen von Reaktanden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, ist durch die Löslichkeit dieser Reaktanden bestimmt.
Vorzugsweise sind die Konzentrationen von aktivierenden Nukleotiden, Phosphat-Donor, Donor-Zucker und Enzymen so gewählt, dass Glykosylierung erfolgt, bis der Akzeptor aufgebraucht ist. Die nachstehend erörterten Überlegungen sind, obwohl sie im Kontext einer Sialyltransferase erfolgen, allgemein auch auf andere Glykosyltransferase- Zyklen anwendbar.
Jedes der Enzyme ist in katalytischen Mengen vorhanden. Die katalytische Menge eines bestimmten Enzyms variiert je nach der Konzentration des Substrats dieses Enzyms, sowie nach den Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Zeit und pH-Wert. Mittel zum Bestimmen der katalytischen Menge für ein bestimmtes Enzym unter vorgewählten Substrat-Konzentrationen und Reaktionsbedingungen sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt.
Enzym-Mengen oder Konzentrationen sind in Aktivitätseinheiten angegeben. Eine Aktivitätseinheit katalysiert die Bildung von 1 umol Produkt pro Minute bei einer bestimmten Temperatur (typischerweise 37ºC) und einem bestimmen pH-Wert (typischerweise 7,5). Somit sind 10 Einheiten eines Enzyms die katalytische Menge dieses Enzyms, die 10 umol Substrat pro Minute bei einer Temperatur von 37ºC und einem pH-Wert von 7,5 in 10 umol Produkt umwandelt.
Ein Reagens, das während des gesamten Verfahrens rezykliert wird, ist CMP/CDP/CTP. So kann die Reaktion mit einer einzigen Spezies oder einer Kombination aus CMP, CDP und CTP begonnen werden. Insofern, als CMP das kostngünstigere und am leichtesten erhältliche dieser Gruppe ist, wird CMP typischerweise verwendet, um die Reaktion zu beginnen, wobei die oben erörterten Mengen jene für die Gesamtmenge der verwendeten Spezies oder Kombination ist.
Die obigen Komponenten werden durch Vermischen in einem wässrigen Reaktionsmedium (Lösung) kombiniert. Das Medium besitzt einen pH-Wert von 6 bis 8,5. Dem Medium fehlen Geliermittel, die Enzymcofaktoren wie Mg&spplus;² oder Mn&spplus;² binden. Die Wahl des Mediums basiert auf der Fähigkeit des Medium, den pH-Wert auf einer gewünschten Höhe zu halten. So wird das Medium bei einigen Ausführungsformen auf einen pH- Wert von etwa 7,5 gepuffert, vorzugsweise mit HEPES. Wenn kein Puffer verwendet wird, sollte der pH des Mediums durch Zugabe einer Base auf etwa 6 bis 8,5 vorzugsweise etwa 7,2 bis 7,8, gehalten werden. Eine geeignete Base ist NaOH, vorzugsweise 6 M NaOH.
Das Reaktionsmedium kann falls notwendig auch solubilisierende Detergenzien (z. B. Triton oder SDS) und organische Lösungsmittel, wie z. B. Methanol oder Ethanol, enthalten. Außerdem können die Enzyme vorzugsweise frei in Lösung eingesetzt werden, können aber auch an Träger, wie z. B. ein Polymer, gebunden sein. Das Reaktionsgemisch ist so zu Beginn im Wesentlichen homogen, während der Reaktion kann sich jedoch ein Niederschlag bilden.
Die Temperatur, bei der das obige Verfahren durchgeführt werden kann, kann im Bereich von unmittelbar oberhalb des Gefrierpunkts bis zu jener Temperatur liegen, bei der das empfindlichste Enzym denaturiert. Die Temperatur liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0ºC bis etwa 45ºC, mehr bevorzugt bei etwa 20ºC bis etwa 30ºC.
Das so gebildete Reaktionsgemisch wird für einen ausreichend langen Zeitraum gehalten, damit der zu sialylierende Akzeptor ein gewünschtes Sialylα2→3β-Galactosid- (Sialosid-) Produkt bilden kann. Ein Teil dieses Produktes kann oft nach wenigen Stunden detektiert werden, wobei gewinnbare Mengen üblicherweise innerhalb von 24 h erhalten werden. Es wird bevorzugt, die Ausbeute des Verfahrens zu optimieren, und die Haltezeit beträgt üblicherweise etwa 36 bis etwa 240 h.
Die nach den obigen Verfahren erzeugten Produkte können ohne Reinigung verwendet werden. Es wird jedoch üblicherweise bevorzugt, das Produkt zu gewinnen. Es können allgemein bekannte Standardverfahren zur Gewinnung glykosylierter Saccharide, wie z. B. Dünn- oder Dickschicht-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Membranfiltration eingesetzt werden. Vorzugsweise werden Membranfiltration, wobei noch bevorzugter eine Umkehrosmosemembran eingesetzt wird, oder eine oder mehrere Säulenchromatographietechniken für die Gewinnung eingesetzt, wie in der Folge und in der hierin zitierten Literatur beschrieben. Beispielsweise kann Membranfiltration, worin die Membranen einen Molekulargewichts-Cutoff von etwa 3.000 bis etwa 10.000 aufweisen, eingesetzt werden, um Proteine zu entfernen. Nanofiltration oder Umkehrosmose kann dann eingesetzt werden, um Salze zu entfernen. Nanofiltermembranen sind eine Klasse von Umkehrosmosemembranen, die einwertige Salze durchlassen, mehrwertige Salze und ungeladene gelöste Stoffe, die je nach der verwendeten Membran größer als etwa 100 bis 700 Dalton sind, jedoch zurückhalten. So werden bei einer typischen Anwendung Saccharide, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, in der Membran zurückgehalten, und Salzverunreinigungen gehen durch sie hindurch. Unter Einsatz dieser Techniken können die Saccharide (z. B. Sialyllactose) im Wesentlichen mit 100%iger Reinheit, wie durch ¹H-NMR und DC ermittelt, hergestellt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel:
NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR
bereit. In dieser Formel ist R Wasserstoff, ein Saccharid, ein Oligosaccharid oder eine Aglykongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom. R' kann Alkyl oder Acyl mit 1-18 Kohlenstoffen (z. B. Acetyl oder Allyloxycarbonyl (Alloc)), 5,6,7,8-Tetrahydro-2-naphthamid, Benzamid, 2-Naphthamid, 4-Aminobenzamid oder 4-Nitrobenzamid, sein.
Der Begriff "Aglykongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom" bezeichnet eine Gruppe -A-Z, worin A eine Alkylengruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, Thiol, Hydroxy, Sauerstoff, Schwefel, Amino, Imino oder Alkoxy; und Z Wasserstoff, -OH, -SH, -NH&sub2;, -NHR¹, -N(R¹)&sub2;, -CO&sub2;H, -CO&sub2;R¹, -CONH&sub2;, -CONHR¹, -CON(R¹)&sub2;, -CONHNH&sub2; oder -OR¹ ist, worin R¹ jeweils unabhängig voneinander für Alkyl oder 1 bis 5 Kohlenstoffatome steht. Außerdem kann R
sein, worin n, m, o = 1-18 sind; (CH&sub2;)a-R² (worin n = 0-18 ist), wobei R² ein unterschiedlich substituierter aromatischer Ring ist, vorzugsweise eine Phenylgruppe, die mit einer oder mehreren Alkoxygruppen, vorzugsweise Methoxy oder O(CH&sub2;)mCH&sub3; (worin m = 0-18 ist), oder eine Kombination davon. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist R 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propyl.
Die Schritte dieses Verfahrens umfassen:
(a) das Galactosylieren einer Verbindung der Formel GlcNR'β(1→3)Galβ-OR mit einer Galactosyltransferase in Gegenwart einer UDP-Galactose unter Bedingungen, die ausreichen, um die Verbindung Galβ(1→4)GlcNR'β(1→3)Galβ-OR zu bilden;
b) das Sialylieren der unter (a) gebildeten Verbindung mit einer Sialyltransferase in Gegenwart eines CMP-Derivats einer Sialsäure unter Verwendung einer α(2,3)-Sialyltransferase unter Bedingungen, unter denen Sialsäure auf den nicht-reduzierenden Zucker übertragen wird, um die Verbindung: NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcNR'β(1→3)Galβ-OR zu bilden; und
(c) das Fucosylieren der unter (b) gebildeten Verbindung, um NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)- (Fucα1→3)GlcNR'β(1→3)Galβ-OR bereitzustellen. Außerdem wird für das vorliegende Verfahren zumindest einer von Galactosylierungs- und Sialylierungsschritt in einem Reaktionsmedium durchgeführt, das ein zweiwertiges Metallkation enthält, und das Medium wird intermittierend oder kontinuierlich mit dem zweiwertigen Metallkation ergänzt, um die Metallionkonzentration zwischen etwa 1 mM und etwa 75 mM zu halten.
Der Galactosylierungs- und der Sialylierungsschritt werden enzymatisch durchgeführt, vorzugsweise unter den allgemeinen Bedingungen, die oben für die Verfahren zum Ausbilden von glykosidischen Bindungen beschrieben werden. Demgemäß wird der Galactosylierungsschritt vorzugsweise als Teil eines Galactosyltransferase-Zyklus durchgeführt (siehe Fig. 2), und der Sialylierungsschritt wird vorzugsweise als Teil eines Sialyltransferase-Zyklus durchgeführt (siehe Fig. 5). Bevorzugte Bedingungen und Beschreibungen anderer Spezies und Enzyme in jedem dieser Zyklen wurden bereits beschrieben.
Der Fucosylierungsschritt kann entweder chemisch oder enzymatisch durchgeführt werden. Enzymatische Fucosylierung kann durchgeführt werden, indem das geeignete Oligosaccharid mit einer α(1→3)Fucosyltransferase und einem damit verträglichen GDP- Derivat von L-Fucose unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen die Fucose auf das Oligosaccharid übertragen wird. Der Begriff "α(1→3)Fucosyltransferase" bezeichnet jegliche Fucosyltransferase, die L-Fucose von GDP-Fucose auf eine Hydroxyposition eines GlcNAc in einer βGal(1→4)βGlcNAc-Gruppe in einem Oligosaccharidglykosid überträgt. Geeignete Fucosyltransferasen sind oben beschrieben worden und umfassen die bekannte βGal(1→3,4)βGlcNAc α(1→3,4)Fucosyltransferase und βGal- (1→4)βGlcNAc α(1→3)Fucosyltransferase.
Geeignete Bedingungen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfassen die Zugabe der α(1→3)Fucosyltransferase zu einem geeigneten Gemisch von Oligosaccharid und GDP-Fucose in einem geeigneten Puffer, wie z. B. 0,1 M Natriumcacodylat unter geeigneten pH- und Temperatur-Bedingungen, wie z. B. einem pH von 6,5 bis 7,5 und einer Temperatur von 0ºC bis 50ºC, vorzugsweise zwischen 25ºC und 45ºC, mehr bevorzugt zwischen 35ºC und 40ºC, für 12 h bis 4 Tage. Das resultierende fucosylierte Produkt kann unter Einsatz herkömmlicher Techniken, wie z. B. Membranfiltration, HPLC und Gel-, Umkehrphasen-, Ionenaustausch- oder Adsorptionschromatographie, isoliert und gereinigt werden.
Gemäß bevorzugter Ausführungsformen ist R Ethyl, der Fucosylierungsschritt wird auf chemischem Wege durchgeführt, und der Galactosylierungs- und der Sialylierungsschritt werden in einem einzigen Gefäß durchgeführt.
Gemäß anderer bevorzugter Ausführungsformen werden der Galactosylierungs-, der Sialylierungs- und der Fucosylierungsschritt enzymatisch durchgeführt, wobei die in den Fig. 2, 3 und 5 dargestellten Transferase-Zyklen mit zweiwertiger Metallion-Ergänzung durchgeführt werden. Mehr bevorzugt werden alle Enzymzyklen in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt. Noch mehr bevorzugt werden vier Enzymzyklen in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt, um ein Pentasaccharid der Formel:
NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR
herzustellen, worin R und R' wie oben beschrieben sind.
Gemäß wiederum einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Verbindungen bereit wie in der WO94/26760 beschrieben. Allgemein haben diese Verbindungen die Formel:
NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R")β-OR².
In dieser Formel ist R" Alkyl oder Acyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, 5,6,7,8-Tetrahydro-2-naphthamido; Benzamido; 2-Naphthamido; 4-Aminobenzamido; oder 4-Nitrobenzamido. R² kann gleich wie das oben beschriebene R sein oder kann Galβ-OR sein (R ist wie oben beschrieben).
In den obigen Beschreibungen werden die Begriffe allgemein in ihren Standardbedeutungen verwendet. Der Begriff "Alkyl", wie hierin verwendet, bezeichnet einen verzweigten oder linearen, gesättigten oder ungesättigten, einwertigen oder zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffen, einschließlich von Niederalkylen mit 1 bis 8 Kohlenstoffen, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Butyl, n-Hexyl und dergleichen, Cycloalkylen (3 bis 7 Kohlenstoffe), Cycloalkylmethylen (4 bis 8 Kohlenstoffe) und Arylalkylen.
Der Begriff "Aryl" bezeichnet einen Rest, der durch Entfernen eines Atoms von einem aromatischen Kohlenwasserstoff abgeleitet ist, z. B. Phenyl aus Benzol. Der aromatische Kohlenwasserstoff kann mehr als einen ungesättigten Kohlenwasserstoffring aufweisen, z. B. Naphthyl. Der Begriff "Alkoxy" bezeichnet Alkylreste, die über einen Sauerstoff an den Rest des Moleküls gebunden sind, z. B. Ethoxy, Methoxy oder n-Propoxy. Der Begriff "Alkylthio" bezeichnet Alkylreste, die über einen Schwefel an den Rest des Moleküls gebunden sind.
Der Begriff "Acyl" bezeichnet einen Rest, der durch Entfernung der Hydroxylgruppe von einer organischen Säure abgeleitet ist. Beispiele sind Acetyl, Propionyl, Oleoyl und Myristoyl.
Bevorzugte Ausführungsformen sind wie oben beschrieben.
Die oben beschriebenen Verbindungen können für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, z. B. als Antigene, Diagnosereagenzien oder als Therapiemittel. So stellt die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die zur Behandlung verschiedener Affektionen verwendet werden können. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen bestehen aus Oligosacchariden, die nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung eignen sich zur Verwendung für eine Vielzahl von Arzneimittel-Abgabesystemen. Geeignete Formulierungen zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mace Publishing Company, Philadephia, PA, USA, 17. Aufl. (1985), zu finden. Ein kurzer Überblick über Verfahren zur Arzneimittelabgabe ist Langer, Science 249, 1527-1533 (1990), zu entnehmen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind zur parenteralen, intranasalen, topischen, oralen oder lokalen Verabreichung, z. B. als Aerosol oder transdermal, zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bestimmt. Üblicherweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, z. B. intravenös, verabreicht. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung bereit, welche die Verbindung in einem annehmbaren Träger gelöst oder suspendiert umfassen, vorzugsweise in einem wässrigen Träger, z. B. Wasser, gepuffertem Wasser, Salzlösung, PBS und dergleichen. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, falls erforderlich, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie z. B. pH-Regler und Puffermittel, Tonizitätregler, Netzmittel, Detergenzien und dergleichen.
Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche Sterilisierungstechniken sterilisiert oder sterilfiltriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung als solche verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einem sterilen wässrigen Träger kombiniert wird. Der pH der Präparate liegt typischerweise zwischen 3 und 11 und beträgt mehr bevorzugt 5 bis 9, am meisten bevorzugt 7 bis 8.
Bei einigen Ausführungsformen können die Oligosaccharide gemäß vorliegender Erfindung in Liposome aufgenommen werden, die aus Standard-Vesikelbildungslipiden gebildet werden. Zur Herstellung von Liposomen sind verschiedene Verfahren bekannt, wie beispielsweise von Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), den US- Patenten Nr. 4.235.871, 4.501.728 und 4.837.028 beschrieben. Das Targeting von Liposomen unter Einsatz einer Vielzahl von Targeting-Mitteln (z. B. den Sialylgalactosiden gemäß vorliegender Erfindung) ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt (siehe z. B. die US-Patente Nr. 4.957.773 und 4.603.044).
Es können Standard-Verfahren zum Koppeln von Targeting-Zellen an Liposome eingesetzt werden. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen das Aufnehmen von Lipid- Komponenten, wie z. B. Phosphatidylethanolamin, die zum Binden von Targeting-Zellen aktiviert werden können, oder derivatisierten lipophilen Verbindungen, wie z. B. Lipidderivatisierten Oligosacchariden gemäß vorliegender Erfindung, in Liposome.
Targeting-Mechanismen erfordern im Allgemeinen, dass die Targeting-Mittel auf solche Weise an der Oberfläche des Liposoms positioniert sind, dass die Zielgruppen für Wechselwirkungen mit dem Ziel, beispielsweise einem Zelloberflächenrezeptor, verfügbar sind. Die Kohlenhydrate gemäß vorliegender Erfindung können vor der Bildung des Liposoms unter Einsatz von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind (z. B. Alkylierung oder Acylierung einer Hydroxylgruppe, die auf dem Kohlenhydrat vorhanden ist, mit einem langkettigen Alkylhalogenid bzw. mit einer Fettsäure) an ein Lipidmolekül gebunden werden, bevor das Liposom gebildet wird. Alternativ dazu kann das Lipsomon so gebildet werden, dass zunächst ein Verbinderabschnitt in die Membran aufgenommen wird, wenn die Membran gebildet wird. Der Verbinderabschnitt muss einen lipophilen Abschnitt aufweisen, der fest in der Membran eingebettet und verankert ist. Er muss auch einen reaktiven Abschnitt aufweisen, der auf chemischem Weg auf der wässrigen Oberfläche des Liposoms verfügbar ist. Der reaktive Abschnitt wird so gewählt, dass er chemisch geeignet ist, um eine stabile chemische Bindung mit dem Targeting-Mittel oder Kohlenhydrat zu bilden, das später zugegeben wird. In einigen Fällen ist es möglich, das Targeting-Mittel direkt an das Verbindermolekül zu binden, aber in den meisten Fällen ist es besser, ein drittes Molekül zu verwenden, das als chemische Brücke fungiert, wodurch das Verbindermolekül, das sich in der Membran befindet, mit dem Targeting-Mittel oder Kohlenhydrat verbunden wird, das dreidimensional von der Vesikeloberfläche weg absteht.
Die Zusammensetzungen, welche die Oligosaccharide enthalten, können zur prophylaktischen und/oder zur therapeutischen Behandlung verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen an einen Patienten, der bereits an einer Krankheit leidet, wie nachstehend beschrieben, in einer ausreichenden Menge verabreicht, um die Symptome der Erkrankung und ihrer Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise hintanzuhalten. Eine adäquate Menge, um dies zu erreichen, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen von der Schwere der Erkrankung sowie dem Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Patienten ab, liegen aber allgemein im Bereich von etwa 0,5 mg bis etwa 2.000 mg Oligosaccharid pro Tag für einen Patienten mit 70 kg, wobei häufiger Dosen von etwa 5 mg bis etwa 200 mg der Verbindungen pro Tag eingesetzt werden.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, welche die Oligosaccharide gemäß vorliegender Erfindung enthalten, an einen Patienten verabreicht, der für eine bestimmte Erkrankung anfällig oder auf andere Weise dem Risiko ausgesetzt ist. Eine solche Menge ist als "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Bei dieser Anwendung hängen die genauen Mengen wiederum vom Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten ab, liegen aber allgemein im Bereich von etwa 0,5 mg bis etwa 1.000 mg pro 70 kg Körpergewicht, häufiger von etwa 5 mg bis etwa 200 mg pro 70 kg Körpergewicht des Patienten.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosismengen und in einem Muster durchgeführt werden, die vom behandelnden Arzt gewählt werden. In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge der Oligosaccharide gemäß vorliegender Erfindung bereitstellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Die Oligosaccharide können auch als Diagnose-Reagenzien Anwendung finden. Beispielsweise können markierte Verbindungen verwendet werden, um Entzündungsbereiche oder Tumormetastasen in einem Patienten zu lokalisieren, bei dem eine Entzündung vermutet wird. Für diese Verwendung können die Verbindungen mit geeigneten Radioisotopen, beispielsweise ¹²&sup5;I, ¹&sup4;C oder Tritium, markiert sein.
Das Oligosaccharid gemäß vorliegender Erfindung kann als Immunogen zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper verwendet werden, die spezifisch mit den erfindungsgemäßen Verbindungen reaktiv sind. Die Vielzahl von Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung zur Herstellung und Manipulation verschiedener Immunglobulin-Moleküle zur Verfügung stehen, kann gemäß vorliegender Erfindung angewandt werden. Antikörper können durch eine Vielzahl von Mittel hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind.
Die Produktion von nicht-humanen monoklonalen Antikörpern, z. B. von Mäusen, Hasen, Pferden usw., ist allgemein bekannt und kann beispielsweise durch Immunisieren des Tieres mit einem Präparat erreicht werden, welches das Oligosaccharid gemäß vorliegender Erfindung enthält. Von den immunisierten Tieren erhaltene, Antikörper produzierende Zellen werden immortalisiert und gescreent, oder zunächst auf die Produktion des gewünschten Antikörpers gescreent und dann immortalisiert. Eine Erörterung der allgemeinen Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper ist Harlow und Lande, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, N. Y. (1988), zu entnehmen.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen die Erfindung weder einschränken noch definieren.

BEISPIELE

Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, angewandt auf die Herstellung von Ethyl(natrium-(5-acetamido-3,5-didesoxy-α-D- glycero-D-galacto-2-nonulopyranosylonat))-(2-3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1-4)-O-((α-L- fucopyranosyl)-(1-3))-O-(2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1-3)-O-β-D-galactopyranosid. Ein weiteres Beispiel ist die Herstellung von βGlcNAc(1,3)βGal(1,4)Glc aus βGal(1,4)Glc(Lactose) unter Einsatz des GlcNAc-Transferase-Zyklus. Dieses Trisaccharid kann dann über den Galactosyltransferase-Zyklus weiter in βGal(1,4)βGlcNAc(1,3)βGal- (1,4)Glc(lacto-N-neotetrose) umgewandelt werden. Die Nummerierung der Verbindungen entspricht der Nummerierung, die im Syntheseschema aus Fig. 1 verwendet wird.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Synthese eines Disaccharids, nämlich jene von GlcN(Alloc)(1→3)βGalOEt, das als Substrat im Galactosyltransferase-Zyklus aus Beispiel 3 verwendet wird. Die Nummerierung der in diesem Beispiel herstellten Verbindungen wird in Fig. 1 dargelegt, die ein Schema für die Herstellung eines bevorzugten Pentasaccharids zeigt.

Herstellung von Ethyl-β-D-galactopyranosid (I)

Eine Lösung von 2,3,4,6-Tetra-O-acetylgalactosylbromid (2,5 kg) in Dichlormethan (4 l) wurde mit einer Rate von 20-25 ml/min einem Reaktor zugeführt, der mit Silbercarbonat (3,13 kg, 11,4 Mol), Å-Molekularsieb (2,37 kg), Dichlormethan (16 l) und wasserfreiem Ethanol (4,0 l) gefüllt war. Das Rühren wurde fortgesetzt, um die Reagenzien heftig zu durchmischen. Zwei Stunden nach dem Ende der Zugabe der Bromidlösung zeigte DC auf Kieselgel, entwickelt mit Hexan : Ethylacetat (1 : 1), dass kein Bromid mehr vorhanden war. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch ein Celit-Bett (1 kg) filtriert, und das Filtrat wurde bei 30-35ºC im Vakuum eingedampft, was ein braunes Öl (1,95 kg) ergab. Dieses Öl wurde im Vakuum 17 h lang getrocknet.
¹H NMR (CDCL&sub3;) δ: 5.36 (1H, d, J3.4 = 3.7 Hz, H-4), 5.17 (1H, dd, J2.3 = 11.0 Hz, H-2), 4.99 (1H, dd, H-3), 4.46 (1H, d, J1.2 = 8.3 Hz, H-1), 2.15, 2.05, 2.04, 1.95 (12H, 45, OAC), 1.21(3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).
Das rohe Ethyltetraacetylgalctopyranosid (1,95 kg) wurde in wasserfreiem Methanol (11,7 l) gelöst, und eine 25%ige Lösung von Natriumethoxid in Methanol (90 ml) wurde zugetropft. Die Lösung wurde 1 h lang gerührt, dann zeigte DC auf Kieselgel, entwickelt mit Ethylacetat : Methanol (2 : 1), dass kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden war. Das Produkt besaß einen Rf = 0,6. Die Lösung wurde durch die Zugabe von Amberlite IR- 120 (H&spplus;)-Harz (0,6 kg) unter Rühren neutralisiert. Als der Lösungs-pH zwischen pH 6 und pH 7 lag, wurde das Harz abfiltriert, und das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft, was einen blassgelben Feststoff ergab. Der Feststoff wurde in siedendem Ethanol (11 l) gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf 25ºC abkühlen gelassen und dann auf 0ºC abgekühlt, was einen weißen Niederschlag ergab. Filtration dieses Feststoffs ergab Ethylβ-D-galactopyranosid (0,851 kg).
¹H NMR (D&sub2;O) δ: 4,38 (1H, d, J1.2 = 8.0 Hz, H-1), 3.89 (1H, bd, J3.4 = 3.7 Hz, H-4), 1.2 (3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).

Herstellung von Ethyl-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid (II)

Ethyl-β-D-galactopyranosid (I) (0,851 kg, 4,09 Mol) wurde in einen 20 I-Rotovapor-Kolben mit Toluolsulfonsäure (1,5 g, 7,9 mMol) gefüllt. Der Rotationsverdampferkolben wurde am Rotationsverdampfer befestigt, Benzaldehyddimethylacetal (1,23 l, 8,18 Mol) wurde eingesaugt, und das Gemisch wurde 4 h lang umgewälzt. Zwischen 30 und 40 min nach der Zugabe des Acetals wurde eine nhezu vollständige Lösung erhalten, rasch gefolgt vom Auftreten eines starken Niederschlags. Die Rotation wurde 4 h lang fortgesetzt, und dann wurde Triethylamin (1,5 ml) zugesetzt, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren. Vakuum wurde angelegt, und das Lösungsmittel wurde entfernt, was eine feste Masse ergab. Hexan (6 l) wurde in den Kolben gefüllt und das Gemisch für 0,5 h umgewälzt. Der resultierende Feststoff wurde abfiltriert und auf dem Filter mit Hexan : Ethylether (1 : 1, 2 l) gewaschen. Der so erhaltene weiße Feststoff wurde im Vakuum 17 h lang getrocknet, was reines Ethyl-4,6-O-benzyliden-β-D-gaiactopyranosid (1,0 kg, 3,38 Mol) in 83%iger Ausbeute ergab. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 7.53 (2H, m, aromatisch, 7.37 (3H, m, aromatisch, 5.57 (1H, s, CHPh), 4.29 (1H, d, J1.2 = 7.0 Hz, H- 1), 4.21 (1H, d, J3.4 = 3.27 Hz, H-4), 1.29 (3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).

Herstellung von Ethyl-2-O-benzoyl-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid (III)

Ethyl-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid (II) (0,924 kg, 3,12 Mol) wurde in einen 20 I-Reaktor gefüllt, der mit einem Luftantrieb, einem Tropftrichter mit Druckausgleich und Gaseinlass, einem Kühlbad und einem Gasauslass versehen war. Vor dem Verschließen des Kolbens wurden Dichlormethan (9,3 l) und Pyridin (2 l) zugegeben, was eine homogene Lösung ergab. Der Tropftrichter wurde mit Chloracetylchlorid (0,388 kg, 3,43 Mol, 273 ml) in Form einer 60%igen Lösung in Dichlormethan befüllt. Der Kolben wurde dicht verschlossen und ein schwacher Strom von trockenem Stickstoff eingeleitet. Das Bad wurde auf -65 ± 5ºC abgekühlt, und das Reaktionsgemisch wurde 30 min lang gerührt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Zutropfen der Acylchlorid-Lösung mit einer Rate von 3 bis 4 ml pro Minute aufgenommen. Nach der vollständigen Zugabe dieser Lösung wurde das Reaktionsgemisch für eine weitere Stunde auf -65 ± 5ºC gehalten. Dann wurde Benzoylchlorid (0,614 kg, 4,37 Mol, 0,507 l) dem Reaktionsgemisch mit einer Rate von 8 bis 12 ml pro Minute zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 17 h stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um ausgefallene Salze zu entfernen, und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, um einen Großteil des Dichlormethans zu entfernen. Eine kleine Probe wurde für NMR gezogen. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 5.75 (1H, dd, J2.3 = 10.6 Hz, H-2), 5.56 (1H, s, CHPh), 5.25 (1H, dd, J3,4 = 3.44 Hz, H-3), 4.69 (1H, d, J1.2 = 8.48 Hz, H-1), 4.48 (1H, bd, H-4), 1.15 (3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).
Wasser (180 ml) wurde dem Konzentrat zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde 2 h lang bei 40ºC gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch weiter eingeengt, was einen gelben Rückstand ergab, der in Dichlormethan (11 l) gelöst und in einen 50 I- Extraktor übergeführt wurde. Die organische Lösung wurde nacheinander mit eiskalter wässriger 0,5 N HCl (11 l), wässrigem gesättigtem Natriumhydrogencarbonat (11 l), kaltem Wasser (11 l) extrahiert, und die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat (1,0 kg) getrocknet, filtriert, und das Filtrat eingedampft, was einen gelben Feststoff ergab, der im Hochvakuum getrocknet wurde. Diese Reaktion wurde mittels DC auf Kieselgel überwacht und mit Hexan : Ethylacetat (1 : 1) entwickelt. Dieser Feststoff wurde in heißem Ethanol (9,5 l) gelöst, was nach Abkühlen und Filtration Ethyl-2-O-benzoyl-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid (0,737 kg, 1,85 Mol) in 59%iger Ausbeute ergab. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 5.59 (1H, s, CHPh), 5.36 (1H, dd, J2.3 = 10.07 Hz, H-2), 4.64 (18, d, J1.2 = 8.21 Hz, H-1), 1.15 (3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).
Um zu bestätigen, dass das Benzoat an C-2 vorhanden ist und dass C-3 eine freie Hydroxylgruppe trägt, wurde ein Tropfen Trichloracetylisocyanat der NMR-Probe zugesetzt, und das Spektrum wurde erneut aufgenommen. Dieses Spektrum enthielt ein Doppeldublett bei schwachem Feld mit δ = 5,27, was typisch für das H-3 von Galactose ist, die an C-3 verestert ist. Das aus dem Reaktionsgemisch erhaltene ursprüngliche Filtrat enthält zusätzliche Mengen an Produkt.

Herstellung von Ethyl-2-O-benzoyl-4,6-O-benzyliden-3-O-(3,4,6-tri-O-acetyl-2-desoxy-2- phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (IV)

Ethyl-2-O-benzoyl-4,6-O-benzyliden-β-D-galactopyranosid (III) (1,001 kg, 2,5 Mol) wurde in einen 20 I-Reaktor gefüllt, der mit einem Kühlbad, Tropftrichter mit Druckausgleich und Gaseinlass, Rührer und Gasauslass ausgestattet war. 4Å-Molekularsiebe (1,03 kg), Dichlormethan (6, 6 l), Collidin (0,367 I, 2,77 Mol) und nach 15-minütigem Rühren schließlich Silbertrifluormethansulfonat (0,689 kg, 2,641 Mol) wurden dem Kolben im Stickstoffstrom zugegeben. Der Tropftrichter wurde mit einer Lösung von 3,4,6-Tri-Oacetyl-2-desoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosylbromid (1,310 kg, 2,641 Mol), gelöst in Dichlormethan (2,40 l), befüllt. Das System wurde dicht verschlossen, schwache Stickstoffspülung wurde beibehalten und mit dem Rühren begonnen, zunächst für 1 h bei Raumtemperatur, dann wurde mit dem Abkühlen (-25ºC) des Reaktionsgefäßes begonnen, und das Gemisch wurde für eine weitere Stunde bei niedrigen Temperaturen gerührt. Die Bromidlösung wurde dann innerhalb von 1 bis 2 h zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde stehen gelassen, bis es Raumtemperatur erreicht hatte, nach 17 h wurde das Gemisch durch ein Celit-Bett filtriert, und das Filtrat wurde mit wässrigem Natriumthiosulfat (2 M, 3,0 l), Wasser (3 l), Salzsäure (1 M, 2 · 2 l), Natriumhydrogencarbonat (1 M, 3,0 l) und schließlich Wasser (3 l) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, was einen Feststoff ergab. Der Feststoff wurde in Isopropanol : Ethylacetat (1 : 1, 32 l) unter Rückfluss gelöst. Beim Abkühlen auf Raumtemperatur über Nacht wurde nach dem Filtrieren und Trocknen eine erste Fraktion von Ethyl-2-O-benzoyl-4,6-O-benzyliden-3-O-(3,4,6-tri-Oacetyl-2-desoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid erhalten. Einengen der Stammlösung (18 l eingedampft) und Stehenlassen der resultierenden Lösung bei Raumtemperatur über Nacht ergab eine zweite Fraktion von Material mit akzeptabler Reinheit. Nach DC-Analyse wurden die beiden Fraktionen vereinigt.
(1.479 kg, 1.816 mol, 72%). ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 7.75 (14H, m, aromatisch) 5.57 (1H, s, CHPh), 5.38 (1H, dd, J = 7.89 Hz, J = 10.5 Hz), 5.16 (1H, t, J = 9.99 Hz), 4.52 (1H, d, J1.2 = 7.89, H-1), 2.08, 2.01, 1.88 (3H, 3s, OAc), 0.95 (3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).

Herstellung von EThyl-3-O-(2-N-allyloxycarbonyl-2-amino-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl- β-D-galactopyranosid (V)

Zu Ethyl-2-O-benzoyl-4, 6-O-benzyiden-3-O-(3,4,6-tri-O-acetyl-2-desoxy-2-phthalimidoβ-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (IV) (1,017 kg, 1,25 Mol) wurden 80%ige Essigsäure (10 l) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde für 1,25 h auf 90ºC erhitzt, woraufhin ein DC auf Kieselgel, entwickelt mit Ethylacetat, das Produkt mit Rf = 0,5-0,6 und vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials anzeigte. Die Lösung wurde bis zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in Ethanol : Aceton = 1 : 1 (6 l) bei 70ºC gelöst. Entionisiertes Wasser (9,0 l) wurde der resultierenden Lösung zugegeben, um das Produkt zu fällen. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser : Aceton = 9 : 1 (6 l) gewaschen und 16 h lang luftgetrocknet, dann im Vakuum über Natriumyhydroxid- Plätzchen getrocknet. Eine zweite Fraktion wurde isoliert, indem der Stammlösung entionisiertes Wasser (4,5 l) zugegeben wurde. Dieses Material wurde wie oben beschrieben getrocknet. Die Ausbeute an Diol betrug 0,707 kg (81%). ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 5.67 (1H, dd, J3.4 = 9.07 Hz, J2'.3' = 11.23 Hz, H-3'), 5.57 (1H, d, J1'.2' = 9.21 Hz, H-1'), 5.32 (1H, dd, J2.3 = 10.08 Hz, H-2), 5.12 (1H, t, J4'.5' = 9.07 Hz, H-4'), 4.46 (1H, d, J1.2 = 8.64, H-1), 2.14, 2.03, 1.78 (9H, 3s, OAc), 0.98 (3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).
Ethyl-2-O-benzoyl-3-O-(3,4,6-tri-O-acetyl-2-desoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)- β-D-galactopyranosid (0,645 kg, 0,882 Mol) wurde in Ethanol (6,5 l) unter Rückflusserhitzen und Rühren gelöst. Nach dem Erhalt einer klaren Lösung wurde Hydrazinhydrat (0,4 l, 8,25 Mol) zugegeben, und das Gemisch wurde unter fortgesetztem Rühren rückflusserhitzt. Nach 16 h Rückfluss begann sich ein Niederschlag zu bilden, die Reaktion war abgeschlossen, wie mittels DC auf Kieselgel, entwickelt mit Ethylacetat : Essigsäure : Methanol : Wasser = 12 : 3 : 3 : 2, beurteilt. Das Produkt besaß einen Rf = 0,15. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt, dann wurde unter Rühren Aceton (5 l) zugegeben. Fortgesetztes Rühren ergab eine homogene Suspension, die filtriert wurde, was rohes Ethyl-3-O-(2-amino-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid als weißes, amorphes Pulver (0,4 kg) nach Trocknen im Hochvakuum in Gegenwart von Phosphorpentoxid ergab. Dieses Rohmaterial wurde einem Gemisch aus Methanol (5,5 l) und Wasser (0,3 l) zugegeben. Natriumhydrogencarbonat (0,90 kg, 10,7 Mol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 min gerührt. Dann wurde Allylchlorformiat (0,140 l, 1,32 Mol) unter kontinuierlichem Rühren bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 1 h zeigte ein DC auf Kieselgel, entwickelt mit Ethylacetat : Essigsäure : Methanol : Wasser = 12 : 3 : 3 : 2, das Produkt bei Rf = 0,6 und die Reaktion war abgeschlossen. Das Gemisch wurde filtriert und der Feststoff wurde mit Methanol (0,5 l) gewaschen. Das Filtrat wurde eingedampft, was einen Rückstand ergab. Der Rückstand wurde in Wasser (3,0 l) aufgenommen und mit Dichlormethan (4,0 l) extrahiert. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und mit Dichlormethan (1,0 l) gewaschen und eingeengt, was einen Feststoff ergab. Die feste Masse wurde für 2 h mit Aceton : Ethylacetat (1 : 2, 3 l) heftig gerührt. Die Suspension wurde filtriert, und der Feststoff wurde mit Ethylacetat gewaschen. Trocknen im Hochvakuum in Gegenwart von Phosphorpentoxid für 17 h ergab ein gebrochen weißes Pulver (0,444 kg).
¹H NMR (D&sub2;O) δ: 5.93 (1H, m, OCH&sub2;CH=CH&sub2;), 5.35-5.17 (2H, m, OCH&sub2;CH=CHO, 4.67 (1H, d, J1'.2' = 8.13 Hz, H-1'), 4.35 (1H, d, J1.2 = 8.10 Hz, H-1), 4.09 (1H, d, J3.4 = 3.OHz, H-4), 1.19 (3H, t, OCH&sub2;CH&sub3;).

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel liefert Vergleiche für Glykosyl-Transferase-Reaktionen mit und ohne Manganionenregulierung. Außerdem werden Vergleiche unter Metallionergänzung angegeben, die entweder kontinuierlich oder intermittierend erfolgt.

2.1 GlcNAc-Transferase-Zyklus mit und ohne Manganionenregulierung

Zu einer Lösung von 60 mM Lactose, 70 mM glcNAc-1-phosphat, 80 mM Phosphoenolpyruvat, 2 mM Uridin-5-diphosphat, 0,05% Natriumazid, 0,1% BSA, 0,1 M HEPES, pH 7,5, die 3,5 IE/ml Pyruvat-Kinase, 0,6 IE/ml UDP-glcNAc-Pyrophosphorylase und 0,13 IE/ml glcNAc-Transferase/Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein, gebunden an Glutathion-Sepharose 4B, enthielt, wurden entweder (A) 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM MnCl&sub2; oder (B) 10 mM MgCl&sub2;, 30 mM MnCl&sub2; zugegeben. Die Lösungen wurden unter Durchmischen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Manganionen wurde durch Ionenchromatographie überwacht und bei Probe B wie folgt ergänzt:
Nach 72 h wurden die Proben A und B mittels Dünnschicht-Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 65% Acetonitril, 10% Essigsäure und 25% Wasser als Elutionsmittel (sichtbar gemacht mit Orcinol) verglichen. Die nicht ergänzte Reaktion (A) wurde anhand von Dünnschicht-Chromatographie als zu 30 bis 40% vollständig geschätzt, während die Mangan-ergänzte Reaktion (B) als zu 100% vollständig geschätzt wurde.

2.2 Intermittierende gegenüber kontinuierlicher Metallionenergänzung

Es wurde ein Galactosyltransferase-Zyklus-Reaktionsgemisch hergestellt, das 80 mM Akzeptor, 80 mM GlcN(Alloc)(1-3)βGalOEt, 55 mM Phosphoenolpyruvat, 90 mM Glucose-1-phosphat, 1 mM UDP, 0,1% BSA, 0,05% NaN&sub3;, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 M HEPES, pH 7,5, 5.000 Einheiten/l Pyruvat-Kinase, 200 Einheiten/l UDP-Glucose-Pyrophosphorylase, 800 Einheiten/l UDP-gal-4-Epimerase und 1.050 Einheiten/l Galactosyltransferase enthält. Einer Teilmenge wurden 10 mM MnCl&sub2; ohne weitere Metallionzugaben zugesetzt. Eine weitere Teilmenge wurde periodisch wie folgt mit Mangan ergänzt:
Zu einer Lösung von 60 mM Lactose, 70 mM glcNAc-1-phosphat, 80 mM Phosphoenolpyruvat, 2 mM Uridin-5'-diphosphat, 0,05% Natriumazid, 0,1 0/0 BSA, 0,1 M HEPES, pH 7,5, die 3,5 IE/ml Pyruvat-Kinase, 0,6 IE/ml UDP-glcNAc-Pyrophosphorylase und 0,13 IE/ml glcNAc-Transferase/Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein, gebunden an Glutathion-Sepharose 4B, enthielt, wurden entweder (A) 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM MnCl&sub2; oder (B) 10 mM MgCl&sub2;, 30 mM MnCl&sub2; zugegeben. Die Lösungen wurden unter Durchmischen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Manganionen wurde durch Ionenchromatographie überwacht und bei Probe B wie folgt ergänzt:
Nach 72 h wurden die Proben A und B mittels Dünnschicht-Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 65% Acetonitril, 10% Essigsäure und 25% Wasser als Elutionsmittel (sichtbar gemacht mit Orcinol) verglichen. Die nicht ergänzte Reaktion (A) wurde anhand von Dünnschicht-Chromatographie als zu 30 bis 40% vollständig geschätzt, während die Mangan-ergänzte Reaktion (B) als zu 100% vollständig geschätzt wurde.

2.2 Intermittierende gegenüber kontinuierlicher Metallionenergänzung

Es wurde ein Galactosyltransferase-Zyklus-Reaktionsgemisch hergestellt, das 80 mM Akzeptor, 80 mM GlcN(Alloc)(1-3)βGalOEt, 55 mM Phosphoenolpyruvat, 90 mM Glucose-1-phosphat, 1 mM UDP, 0,1% BSA, 0,05% NaN&sub3;, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 M HEPES, pH 7,5, 5.000 Einheiten/l Pyruvat-Kinase, 200 Einheiten/l UDP-Glucose-Pyrophosphorylase, 800 Einheiten/l UDP-gal-4-Epimerase und 1.050 Einheiten/l Galactosyltransferase enthält. Einer Teilmenge wurden 10 mM MnCl&sub2; ohne weitere Metallionzugaben zugesetzt. Eine weitere Teilmenge wurde periodisch wie folgt mit Mangan ergänzt:
Einer weiteren Teilmenge wurden 10 mM MnCl&sub2; zugegeben und eine Infusion von 1 M MnCl&sub2; über eine Spritzenpumpe (anfänglich 54 mM/Tag) abgegeben, um eine Metallionenkonzentration zwischen etwa 4 und etwa 27 mM beizubehalten.
Alle Reaktionen wurden überwacht und nach Bedarf mit PEP ergänzt. Die Reaktion, der über eine Infusionspumpe MnCl&sub2; zugegeben wurde, war an Tag 4 laut DC abgeschlossen. Die Reaktion, der MnCl&sub2; periodisch zugegeben vurde, war an Tag 7 abgeschlossen. Die Reaktion mit 10 mM anfänglichem MnCl&sub2; ohne Ergänzung war selbst nach 13 Tagen noch nicht abgeschlossen.

2.3 Kontinuierliche gegenüber periodischer Ergänzung von Mn&spplus;&spplus; bei mäßigen Akzeptor-Konzentrationen

Es wurde ein Galactosyltransferase-Zyklus-Reaktionsgemisch angesetzt, das Folgendes enthielt: 40 mM GlcN(Alloc)(1-3)βGalOEt, 55 mM Phosphoenolpyruvat, 45 mM Glucose-1-phosphat, 1 mM UDP, 0,1% BSA, 0,05% NaN&sub3;, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 M HEPES, pH 7,5, 2.500 Einheiten/l Pyruvat-Kinase, 100 Einheiten/l UDP-Glucose-Pyrophosphorylase, 400 Einheiten/l UDP-Gal-4-Epimerase und 525 Einheiten/l Galactosyltransferase. Zyklen wurden mit unterschiedlichen Anfangskonzentrationen an MnCl&sub2; angesetzt, langsam gerührt, und 1 M MnCl&sub2; kontinuierlich über eine Spritzenpumpe zugeführt. Die Rate der Zugabe unter Verwendung der Spritzenpumpen wurde nicht kontinuierlich sondern inkrementell eingestellt. Zum Vergleich wurde ein Testzyklus einmal täglich auf 30, 25, 20 und 15 mM Mn wie oben beschrieben ergänzt. Die Ergebnisse eines Versuchs mit 10 mM MnCl&sub2;, durch Spritzenpumpe ungefähr beibehalten, werden in Fig. 11 gezeigt.
Die Zufuhrrate von MnCl&sub2; wurde von 36 mM/Tag auf 24 mM/Tag und dann auf 12 mM/Tag geändert, wie angegeben. Ähnliche Reaktionen wurden angesetzt, um eine konstante 5 mM- und eine konstante 15 mM-Manganionenkonzentration beizubehalten. Die Ergebnisse werden nachstehend zusammengefasst:

Art der Ergänzung Zeit bis Vollständigkeit

5 mM durch konstante Infusion 4 Tage
10 mM durch konstante Infusion 4 Tage
15 mM durch konstante Infusion 4 Tage
30, 25, 20 und 15 mM durch tägliche Zugabe 4 Tage
Wie diese Ergebnisse zeigen kann die Manganionen-Ergänzung bei Akzeptorkonzentrationen von etwa 40 mM auf mehreren Arten durchgeführt werden.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die enzymatische Synthese von βGal(1→4)GlcN(Alloc)- (1→3)βGalOEt unter Anwendung des Galactosyltransferase-Zyklus mit Regulierung der Manganion-Konzentration
In einem Polypropylengefäß wurden HEPES (695,3 g, 2,92 Mol) und 24 l H&sub2;O vereinigt, und der pH wurde mit 6 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Phosphoenolpyruvatmonokaliumsalz (245,5 g, 1,46 Mol), Glucose-1-phosphat (470,3 g, 1,31 Mol) und Rinderserumalbumin (29,2 g) wurden zugegeben, und der pH wurde mit 6 M NaOH erneut auf 7,5 eingestellt. Kaliumchlorid (152 g, 2,04 Mol), Natriumazid (14,6 g) Uridindiphosphat (15,2 g, 29,3 mMol) und GlcN(Alloc)(1→3)βGalOEt (520 g netto, 1,15 Mol) wurden zugegeben, gefolgt von der Zugabe von etwa 1 M Lösungen von MnCl&sub2;·4H&sub2;O (115,7 g, 0,58 Mol) und MgCl&sub2;·4H&sub2;O (59,3 g, 0,292 Mol). Pyruvat-Kinase (73.000 Einheiten), UDP- Glucosepyrophosphorylase (3.000 Einheiten), UDP-Gal-4-epimerase (180.000 Einheiten) und Galactosyl(β1→4)transferase (10.400 Einheiten) wurden zugegeben, und das Volumen des Reaktiongemisches wurde mit H&sub2;O auf etwa 29 l eingestellt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gehalten und täglich überwacht, wobei Dünnschichtchromatographie (DC) und Ionenchromatographie eingesetzt wurden. Die Quantifizierung der Mangan- und Magnesiumionen wurde durch Vergleich des Ionenchromatogramms des Reaktionsgemischs mit Chromatogrammen von Standards ermittelt, die 30 mM MnCl&sub2; und 30 mM MgCl&sub2; enthielten.
Die Manganionkonzentration wurde gemessen und wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt ergänzt. Tabelle
An Tag 9 war die Reaktion laut DC im Wesentlichen abgeschlossen (Vergleich des Produkts mit einer authentischen Probe, hergestellt durch Syntheseverfahren, wie in der USSN 08/063.181 beschrieben). Das Reaktionsprodukt wurde ohne Reinigung weiterverwendet, wie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben.
Wie die Ergebnisse in der Tabelle zeigen, führte die Erschöpfung von Mn&spplus;&spplus; dazu, dass nahezu täglich zusätzliche Mengen an MnCl&sub2;·4H&sub2;O zugegeben wurden, um die Metallionenkonzentration beizubehalten. Mangan ionen sind ein erforderlicher Cofaktor für zumindest ein Enzym im Galactosyltransferase-Zyklus. Allerdings bilden die Manganionen und das erzeugte anorganische Prophosphat (siehe Fig. 2) einen Komplex mit sehr geringer Löslichkeit. Im Niederschlag aus einem ähnlichen Galactosyltransferase-Zyklus wurden durch Protoneninduzierte Röntgenemissionsmessung ("proton induced X-ray emission"; PIXE) Konzentrationen von 31,5 Massenprozent Mangan und 18,7 Massenprozent Phosphor analysiert, was bestätigt, dass die gefällten Materialien primär Manganpyrophosphat sind. Wegen dieser begrenzten Löslichkeit kann der Transferasezyklus weiterhin ablaufen, aber mit verringerter Reaktionsgeschwindigkeit. Durch Ergänzen der Manganionen, die durch Fällung mit Pyrophosphat verloren gehen, kann die Reaktionsgeschwindigkeit beibehalten werden. So kann, wenn die Manganionkonzentration in einem optimalen Bereich gehalten wird, der Galactosyltransferase-Zyklus zum vollständigen Ablaufen gebracht werden.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die schädlichen Auswirkungen hoher Manganionen- Konzentrationen auf einen Galactosyltransferase-Zyklus.

4.1 Mn&spplus;&spplus;-Konzentration, die zu Beginn auf 90 mM festgelegt ist

Eine 10 ml-Aliquote des anfänglichen Reaktionsgemisches aus Beispiel 3 (des an Tag 0 hergestellten Gemisches), das 20 mM Mn&spplus;&spplus; enthielt, wurde entnommen, und die Manganionen-Konzentration wurde durch Zugabe von MnCl&sub2;·4H&sub2;O auf 90 mM eingestellt. Das resultierende Gemisch wurde täglich wie oben beschrieben überwacht, es erfolgten jedoch keine weiteren Zugaben von Manganionen. An Tag 9, als die Reaktion aus Beispiel 3 im Wesentlichen abgeschlossen war (als Ergebnis periodischer Zugabe von MnCl&sub2;·4H&sub2;O) war die Reaktion in der Aliquoten-Probe laut dC nur zu etwa 10 bis 20% abgeschlossen.

4.2 Verwendung von EDTA zur Demonstration der nicht-reversiblen Aspekte erhöhter Mn&spplus;&spplus;-Mengen

Eine weitere Untersuchung der schädlichen Auswirkungen von hohen Mn&spplus;&spplus;-Konzentrationen auf die Enzym-Zyklen wurde wie folgt durchgeführt: Es wurde eine Reaktion angesetzt, die 40 mM GlcN(Alloc)(1→3)βGalOEt, 55 mM Phosphoenolpyruvat, 45 mM Glucose-1-phosphat, 1 mM UDP, 0,1 0/0 BSA, 0,05% NaN&sub3;, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 M HE- PES, pH 7,5, 2.500 Einheiten/l Pyruvat-Kinase, 100 Einheiten/l UDP-Glucosepyrophosphorylase, 400 Einheiten/l UDP-gal-4-Epimerase und 525 Einheiten/l Galactosyltransferase enthielt. 1 M MnCl&sub2; wurde zugegeben, um eine Konzentration von 70 mM zu erreichen. Nach 2 Tagen war die Konzentration an Mn&spplus;&spplus; auf 42 mM gefallen, und der weitere Reaktionsfortschritt verlangsamte sich deutlich. Die Zugabe von EDTA bis auf 20 mM oder die Zugabe einer weiteren Teilmenge aller Zyklus-Enzyme oder 1 mM UDP oder 1 mM UDP + 20 mM EDTA führt nicht dazu, dass die Reaktion abgeschlossen wurde. Allerdings führte die Zugabe von 20 mM EDTA in Kombination mit einer weiteren Teilmenge aller Zyklus-Enzyme dazu, dass der Zyklus abgeschlossen wurde.
Das Fehlen von Auswirkungen aufgrund von EDTA allein weist darauf hin, dass die schädliche Wirkung hoher Mn&spplus;&spplus;-Konzentrationen nicht reversibel ist. Die Zugabe aller Enzyme in Gegenwart von ausreichend EDTA, um die Mn&spplus;&spplus;-Konzentration im Wesentlichen zu verringern, brachte die Reaktion zum Abschluss. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass eines oder mehrere der Enzyme in Gegenwart großer Mengen an Mn&spplus;&spplus; inaktiviert wird/werden.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die "Eintopf"-Synthese von αNANA(2→3)βGal(1→4)- GlcN(Alloc)(1→3)βGalOEt aus dem Produkt des Galactosyltransferase-Zyklus unter Anwendung des Sialyl-Transferase-Zyklus mit Manganionen-Regulierung.
Wasser (16 l) und HEPES (915,8 g, 3,84 Mol) wurden in einem Polypropylengefäß kombiniert, und der pH wurde mit 6 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Phosphoenolpyruvatmonokaliumsalz (511,8 g, 3,05 Mol), Rinderserumalbumin (38,5 g) und Natriumazid (19,25 g) wurden zugegeben, und der pH wurde mit 6 M NaOH erneut auf 7,5 eingestellt. Sialsäure (420 g, 1,36 Mol) wurde zugegeben, und der pH wurde mit 6 M NaOH erneut auf 7,5 eingestellt. Cytidin-5'-monophosphat (43,7 g, 0,135 Mol) und Adenosintriphosphat (8,1 g, 13,6 mMol) wurden zugegeben, und der pH wurde mit 6 M NaOH erneut auf 7,5 eingestellt. Pyruvat-Kinase (360.000 Einheiten), Myokinase (75.000 Einheiten), CMP-NeuAc-Synthetase (5.000 Einheiten) und α2,3-Sialyltransferase (2.400 Einheiten) wurden zugegeben und vermischt.
MnCl&sub2;·4H&sub2;O (402,1 g, 2,03 Mol) wurden als Lösung mit etwa 1 M zur Produktlösung aus Beispiel 3 zugegeben, gefolgt von der Zugabe des obigen Gemisches aus Sialyltransferase-Zyklus-Komponenten und zusätzlichen 20,4 l Wasser. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gehalten und täglich überwacht, wobei Dünnschichtchromatographie (DC) und Ionenchromatographie eingesetzt wurden. Die Quantifizierung der Manganionen wurde durch Vergleich der Ionenchromatogramme des Reaktionsgemischs mit Chromatogrammen von Standards ermittelt, die 30 mM MnCl&sub2; enthielten.
Die Manganionen-Konzentration wurde gemessen und ergänzt wie in nachstehender Tabelle gezeigt. Tabelle
Die Reaktion war an Tag 6 abgeschlossen, da kein Ausgangsmaterial mehr mittels DC detektierbar war.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel veranschaulicht die enzymatische Fucosylierung eines Oligosaccharids zur Erzeugung von Ethyl(ammonium-5-acetamido-3,5-didesoxy-α-D-glycero-D-galacto-2- nonulopyranosylonat)-(2,3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1,4)-O-(α-L-fucopyranosyl-(1,3)-O- (2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1,3)-O-β-D-galactopyranosid.
Ethyl(ammonium-5-acetamido-3,5-didesoxy-α-D-glycerogalacto-2-nonulopyranosylonat)- (2,3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1,4)-O-(2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1,3)- O-β-D-galactopyranosid (125 mg, 0,141 mMol) wurde in einer Lösung aus Wasser (6,2 ml), Natriumcacodylat (1 M, pH 6,5, 0,72 ml), MnCl&sub2; (1 M, 0,2 ml) und GDP-β-Fucosedinatriumsalz (Sigma, 130 mg, 0,212 mMol) gelöst. Die Alkalische Phosphatase (Rindereingeweide, 32 ul) und Fucosyl-Transferase V (Perlen, 100 mIE) wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch für 3 Tage gestürzt. Die Reaktion wurde dann chromatographiert (Biogel P-2, 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3;), was nach dem Lyophilisieren 70 mg des Ausgangsmaterials und 76 mg (52%) von XI) als weißen Feststoff ergab; Rf = 0,43 (Kieselgel, 30% 1 M N H&sub4;OAc/Isopropanol).

BEISPIEL 7

Dieses Beispiel veranschaulicht die chemische Synthese von NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)- (Fucα1→3)GlcNAcβ(1→3)Galβ-OEt, beginnend mit dem Tetrasaccharid aus Beispiel 5.

Herstellung von Ethyl(methyl-(5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-α-glycero-D-galacto-nonulopyranosylonat))-(2-3)-O-(2,4,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)- (1-4)-O-(3,6-di-O-acetyl-2-N-allyloxycarbonyl-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1-3)-O- 2,4,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosid (VIII)

Eine wässrige Lösung (40 l) von Ethyl(natrium-(5-acetamido-3,5-didesoxy-α-D-glycero-D- galacto-nonulopyranosylonat))-(2-3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1-4)-O-(2-N-allyloxycarbonyl-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1-3)-O-β-D-galactopyranosid (VII), hergestellt mittels aufeinanderfolgender Einwirkung von Galactosyl- und Sialyl-Transferasen in Gegenwart der geeigneten Cofaktoren auf das Disaccharid (V), (0,320 kg) wurde durch Papier filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Membran mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 3.000 oder 10.000 geschickt, um Protein aus dem gewünschten Produkt zu entfernen. Das Eluat wurde eingeengt und entsalzt, indem es gegen eine Umkehrosmosemembran in einer geeigneten Vorrichtung laufen gelassen wurde. Zurückgehaltenes Material, welches das Produkt enthielt, wurde in einem 50 I-Rotovapor zu einem dicken Sirup eingedampft. Gegebenenfalls kann das zurückgehaltene Material mit einem Chelatbildner- Harz behandelt werden, um zweiwertige Kationen zu entfernen. Nach der Filtration enthielt das Filtrat das gewünschte Produkt im Wesentlichen frei von Salzen und in einem hohen Reinheitsgrad. Der Sirup wurde zweimal mit Pyridin (2 · 2 l) gemeinsam eingedampft, dann für 20 h unter Vakuum gehalten. Der Rotovaporkolben wurde mit einer Lösung von N,N-Dimethylaminopyridin (20 g) in Pyridin (12 l) gefüllt. Das Rotavapor- Bad wurde mit Eiswassergemisch gefüllt, und die Rotation wurde fortgesetzt, während Essigsäureanhydrid (6 l) über einen Zeitraum von 1 h zugegeben wurde. Zwei Stunden nach der vollständigen Zugabe wurde weiteres Essigsäureanhydrid (2 l) zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde für 20 h langsam bei Raumtemperatur umgewälzt. Um vollständige Acetylierung zu gewährleisten, wurde weiteres Essigsäureanhydrid (1 l) zugegeben, und das Gemisch wurde für weitere 24 h umgewälzt. Die Reaktion wurde mittels DC (Ethylacetat : Hexan : Ethanol = 10 : 10 : 3) überprüft. Nach vollständiger Reaktion wurde ein Vakuum angelegt und 14 l Destillat gesammelt.
Dem resultierenden Rückstand wurde Methanol (15 l) über einen Zeitraum von 1 h zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 h umgewälzt. Dann zeigte ein DC auf Kieselgel (Ethylacetat : Hexan : Ethanol = 10 : 10 : 3 und Dichlormethan : Aceton = 3 : 2) vollständigen Umsatz des Lactons in einen langsamer lautenden Punkt, der die Methylestermonohydroxyverbindung war. Das Gemisch vurde dann eingeengt (18 l abgedampft), und das Gemisch wurde in Eiswasser gekühlt, während Essigsäureanhydrid (3 l) über einen Zeitraum von 30 min zugegeben wurde. Das Gemisch wurde für 20 h stehen gelassen. DC auf Kieselgel (Dichlormethan : Aceton = 3 : 2) zeigte vollständige Acetylierung, wobei das Produkt etwas höher lief. Methanol (1 l) wurde zugegeben, um überschüssiges Essigsäureanhydrid zu zerstören, und während dessen wurde eine schwach exotherme Reaktion festgestellt. Nach 1 h wurde das Gemisch zu einem Sirup eingeengt, der mit Hilfe von Ethylacetat-Wasser-Gemisch (13/13 l) in einen 50 I-Extraktor übertragen wurde. Das Gemisch wurde heftig gerührt. Nach der Phasentrennung wurde die untere wässrige Phase abgezogen, und die verbleibende organische Phase wurde durch Papier filtriert. Das Filtrat wurde mit 5%iger wässriger Salzsäure (15 l, die wässrige Phase sollte nach dem Waschen auf pH-Papier noch stark sauer sein) und wässrigem 1 M Natriumbicarbonat (15 l, die wässrige Phase sollte nach dem Waschen auf pH-Papier noch alkalisch sein) gewaschen. Die organische Phase wurde dann in einen 20 I-Behälter übertragen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde zu einem halbfesten Rückstand eingeengt. Dieser Rückstand wurde in Dichlormethan (3 l) gelöst und auf eine Kieselgelsäure (10 kg) geladen, die in Dichlormethan gepackt worden war. Elution zunächst mit Dichlormethan (25 l), dann mit Dichlormethan : Aceton = 3 : 1 (25 l) und schließlich mit Dichlormethan : Aceton = 1 : 1 (50 l) ergab Fraktionen, die Produkt enthielten. Grundlinien-Abtrennung wurde aus dem Disaccharid-Material erzielt, aber aus den Spuren von etwas schneller laufendem Material wurde kaum Abtrennung erzielt. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft und in Dichlormethan (1,5 l) erneut gelöst. Diese Lösung wurde langsam einem heftig gerührten Gemisch aus Ethylether (7,5 l) und Hexan (10 l) zugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde filtriert und mit Ether-Hexan = 2 : 1 gewaschen, über Nacht luftgetrocknet, dann im Hochvakuum für 48 h getrocknet. Mittels NMR wurde gezeigt, dass es sich bei dem Niederschlag (0,61 kg) um die Titelverbindung handelte. ¹H-NMR zeigte eine geringe enthaltene Menge an Restlösungsmittel (1-5 Gew.-%).
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 4.67 (d, 1H, H-1"), 4.49 (d, 1H, H-1'), 4.33 (d, 1H, H-1).

Herstellung von Ethyl(methyl-(5-acetamido-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-α-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyanosylonat))-(2,3)-O-(3,4,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)- (1,4)-O-(2-acetamido-2-desoxy-6-O-acetyl-β-D-glucopyranosvl)-(1,3)-O-(2,4,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosid) (IX)

Zu einer Lösung von blockiertem Tetrasaccharid (VIII) (0,532 kg, 0,37 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (8 l) wurde Polymethylhydrosiloxan (PMSH, 46 ml, 0,14 Mol) zugegeben. Dann wurde Pd(PPH&sub3;)&sub4; (14 g, 1,17 mMol) zugegeben, und das Gemisch wurde im Vakuum entgast. Das resultierende Reaktiongemisch wurde dann bei Raumtemperatur 17 h lang gerührt; dann zeigte DC (Ethylacetat : Hexan : Ethanol = 10 : 10 : 3) den Abschluss der Reaktion. Dem Reaktionsgemisch wurden Essigsäure (36 ml, 0,55 Mol) und Piperidin (60 ml, 0,65 Mol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, bis DC (Dichlormethan : Methanol = 95 : 5) den Abschluss der Reaktion zeigte. Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum ergab einen Rückstand, der in Dichlormethan (4 l) gelöst wurde. Diese Lösung wurde nacheinander mit Wasser (4 l), 20/niger wässriger Salzsäure (4 l), wässrigem Natriumhydrogencarbonat (4 l) und schließlich Wasser (4 l) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Filtrat eingedampft, was einen Sirup ergab. Dieser Sirup wurde in Methanol (2 l) gelöst, Aktivkohle (200 g) wurde zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde unter Rühren 2 h lang auf 55ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde eingeengt, was einen Rückstand ergab. Dieser Rückstand wurde in Dichlormethan (1 l) gelöst und einem Gemisch aus Hexan : Ether (1 : 1, 12 l) zugetropft, was 0,46 kg der Titelverbindung als weißen Feststoff ergab. ¹H NMR (CD&sub3;OD): δ 1.15 (t, 3H, J = 7.0 Hz, -OCH&sub2;CH&sub2;); 1.50 (t, 1H, J = 12.3 Hz, H-3a of NANA); 1.80, 1.91, 1.96, 2.01, 2.02, 2.04, 2.05, 2.07, 2.08, 2.09, 2.10, 2.16, 2.26 (13-Ac); 2.55 (dd, 1H, J = 4.6, 12.3 Hz, H-3e of NANA); 3.84 (S, 3H, COOCH&sub3;).

Herstellung von Ethyl(methyl-(5-acetamido)-3,5-didesoxy-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-α-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosylonat))-(2-3)-O-(2,4,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-(1-4)-O-((2,3,4-tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl)-(1-3))-O-(2-acetamido-6-O-acetyl-2- desoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1-3)-O-2,4,6-tri-O-acetyl-β-D-galactopyranosid (X)

Zu einer Lösung von Alkohol (IX) (0,118 kg, 0,090 Mol) in einem Gemisch aus Dichlormethan (250 ml) und Dimethylformamid (60 ml) wurde Tetraethylammoniumbromid (18,8 g, 0,090 Mol) zugegeben. Das Gemisch wurde dann mit Molekularsieben (4Å, 0,250 kg) unter Stickstoff bei Raumtemperatur 6 h lang gerührt. Dem obigen Gemisch wurden frisch zubereitetes Tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosylbromid (0,180 kg, 0,360 Mol) in Dichlormethan (100 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter Stickstoff bei Raumtemperatur 36 h lang gerührt, bis ein DC (Ethylacetat : Hexan : Ethanol = 10 : 10 : 3) den Abschluss der Reaktion zeigte. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit einem Gemisch aus Methanol (30 ml) und Diisopropylethylamin (30 ml) behandelt und bei Raumtemperatur für 30 min gerührt. Das Gemisch wurde mit 1 l Dichlormethan verdünnt und durch ein Celit-Bett filtriert. Das Filtrat wurde mit wässrigem gesättigtem Natriumbicarbonat (1,5 l) und Wasser (2 l) gewaschen, und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Sirup eingeengt. Dieser Sirup wurde auf Kieselgel (3,5 kg Kieselgel, 230-400 Mesh, Ethylacetat : Hexan : Ethano) = 5 : 5 : 1) chromatographiert, was die Titelverbindung (0,110 kg, 73%) als amorphen Feststoff ergab. ¹H NMR (CDCl&sub3;): δ 1.17 (t, 3H, J = 7.2 Hz, -OCH&sub2;CH&sub3;), 1.18 (d, 3H, 1 = 7.0 Hz, CH, v·Fnc), 1.60, 1.78, 1.84, 1.99, 2.01, 2.02, 2.04, 2.04, 2.06, 2.06, 2.07, 2.15, 2.19 (13-Ac), 2.55 (dd, 1H, J = 4.4, 12.2 Hz, H-3e MANA), 3.82 (s, 3H, COOCH&sub3;), 7.4-7.6, (15H, aromatisch).

Herstellung von Ethyl(natrium-(5-acetamido-3,5-didesoxy-α-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosylonat))-(2-3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1-4)-O-((α-L-fucopyranosyl)-(1-3))-O-(2- acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1-3)-O-β-D-galactopyranosid

Zu einer Lösung von Verbindung X (105 g, 61 mMol) in Essigsäure (900 ml) wurde Palladiumhydroxid auf Aktivkohle (20 g, 20% Pd) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit Wasserstoff gespült und dann unter Wasserstoffatmosphäre 8 h lang gerührt, bis DC (Dichlormethan : Methanol = 90 : 10) den Abschluss der Reaktion zeigte. Das Reaktionsgefäß wurde mehrmals mit Stickstoff gespült, und das Reaktionsgemisch wurde durch ein Celit-Bett filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Celit-Bett wurde mehrmals mit Ethylacetat gewaschen. Einengen des Filtrats ergab das debenzylierte Produkt als weißes Glas (etwa 97 g). Das weiße Glas wurde im Hochvakuum über Nacht getrocknet und in Ethylacetat (500 ml) gelöst. Das Triol-Produkt (79 g, 89%) wurde als weißer Feststoff gefällt, wobei 1 l eines Gemisches aus Ether und Hexan (8 : 2) zugegeben wurde. Ein Protonenspektrum des Produkts zeigte das völlige Fehlen aromatischer Protonen.
Zu einer Lösung des Triols (79 g, 50 mMol) in Methanol (1 l) wurde eine Lösung von Natriumethoxid (70 ml, 25% (w/v)) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 17 h lang gerührt. Wasser (100 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für weitere 24 h gerührt, bis DC auf Kieselgel (Isopropanol : NH&sub4;OH : H&sub2;O = 7 : 2 : 1) den Abschluss der Reaktion zeigte. Dem Reaktionsgemisch wurden 150 ml AG-50 H + Ionenaustauschharz zugegeben, das mit Methanol gründlich gewaschen worden war, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Das Ionenaustauschharz wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde bis zur Trockene eingeengt, um ein weißes Glas bereitzustellen. Das Material wurde in Methanol (300 ml) gelöst und durch eine 0,22 u-Nylonmembran filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethylether (300 ml) verdünnt, was das freie Pentasaccharid (48 g 84 %) als weißen Feststoff ergab. ¹H NMR (D&sub2;O): δ 1.10 (d, 3H, J = 6.5 Hz, CH&sub3;, v·Fuc); 1.16 (t, 3H, 1 = 7.0 Hz, -OCH&sub2;CH&sub3;), 1.74 (t, 1H, J = 12.2 Hz, H-3a v·NANA); 1.95, 1.96 (2-Ac); 2.72 (dd, 1 H, J = 4.4, 12.2 Hz, K-3e v·NANA); 4.32 (d, 1H, J = 8.0 Hz, β-anomer; 4,46 (d, 1H, J = 7,4 Hz, β-anomer); 4,65 8d, 1 H, J = 7,9 Hz, β-anomer), 5,06 (d, 1 H, J = 4,1 Hz, α- anomer von Fucose).

BEISPIEL 8

Alternativ dazu kann das Pentasaccharid ausgehend von Verbindung V aus Beispiel 1 enzymatisch hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass N-Allyloxycarbonyl durch N- Acetyl ersetzt wird. Das Ausgangsmaterial wird enzymatisch galactosyliert, sialyliert und fucosyliert, wobei die oben beschriebenen Verfahren eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zur Übertragung eines Monosaccharids von einem Donor-Substrat zu einem Akzeptor-Substrat, umfassend:

(a) das Bereitstellen eines Reaktionsmediums, das zumindest eine Glykosyl- Transferase, ein Donor-Substrat, ein Akzeptor-Substrat und ein lösliches zweiwertiges Metallkation umfasst; und

(b) das Ergänzen der Konzentration des löslichen zweiwertigen Metallkations, um im Reaktionsmedium eine Konzentration zwischen 1 mM und 75 mM für einen ausreichend langen Zeitraum zu erreichen, um die Synthese im Wesentlichen abzuschließen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reaktionsmedium weiters Phosphatase umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das lösliche zweiwertige Metallkation aus der aus Mn&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus;, Co&spplus;&spplus;, Zn&spplus;&spplus;, Cu&spplus;&spplus; und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ergänzen diskontinuierlich erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ergänzen kontinuierlich erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym Galactosyl-Transferase ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym Galactosyl-Transferase ist und das Reaktionsmedium weiters Sialyl-Transferase umfasst.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym Fucosyl-Transferase ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym N-Acetylglucosaminyl-Transferase ist.

10. Verfahren nach Anspruch, worin das Donor-Substrat CMP-NeuAc ist und in situ gebildet wird, das zweiwertige Metallkation Mn&spplus;&spplus; ist, das Akzeptorsubstrat Lactose ist, das Enzym Sialyl-Transferase ist und das Reaktionsmedium weiters CMP-NeuAc-Synthetase, Sialsäure und CTP umfasst.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Donor-Substrat UDP-Gal ist und in situ gebildet wird, das zweiwertige Metallkation Mn&spplus;&spplus; ist, das Akzeptor-Substrat GlcNAc- GalGlc ist, das Enzym Galactosyl-Transferase ist und das Reaktionsmedium weiters UDP-Gal-4-Epimerase, UDP-Glc und Phosphatase umfasst.

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Donor-Substrat UDP-GlcNAc ist, das zweiwertige Metallkation Mn&spplus;&spplus; ist, das Akzeptor-Substrat GalGlc ist, das Enzym n-Acetylglucosamin-Transferase ist und das Reaktionsmedium weiters Phosphatase umfasst.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Donor-Substrat ein Donorzucker ist und das Reaktionsmedium weiters umfasst:

(i) eine katalytische Menge einer Donorzucker-Synthetase;

(ii) einen Donorzucker-Vorläufer; und

(iii) ein Donorzucker-Rezykliersystem.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Glykosyl-Transferase Sialyl-Transferase ist und das Reaktionsmedium Folgendes umfasst:

(i) eine katalytische Menge einer CMP-Sialsäure-Synthetase;

(ii) eine Sialsäure;

(iii) ein CMP-Sialsäure-Rezykliersystem, das zumindest 2 Mol Phosphat-Donor pro Mol Sialsäure umfasst, sowie katalytische Mengen eines Nukleosidtriphosphats, Cytidinmonophosphat, eine Kinase, die in der Lage ist, Phosphat vom Phosphat-Donor auf ein Nukleosiddiphosphat zu übertragen, und eine Nukleosidmonophosphat-Kinase, die in der Lage ist, das terminale Phosphat von einem Nukleosidtriphosphat auf CMP zu übertragen; und worin der Akzeptor-Zucker ein Akzeptor für die Sialyl-Transferase mit einer Galactosyleinheit ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Sialyl-Transferase α-(2,3)-Sialyl-Transferase ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Sialyl-Transferase α-(2,3)-Sialyl-Transferase ist und das lösliche zweiwertige Metallkation Mn&spplus;&spplus; ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Sialsäure 5-N-Acetylneuraminsäure ist.

18. Verfahren nach Anspruch 14, worin der Akzeptor-Zucker aus der aus Galβ(1→4)- GlcNAc-OR und Galβ(1→4)GlcN(Alloc)-OR bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin R aus der aus Wasserstoff, Sacchariden, Oligosacchariden und Aglykongruppen mit zumindest einem Kohlenstoffatom bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die Sialsäure 5-N-Acetylneuraminsäure ist.

20. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Reaktionsmedium ein gepuffertes wässriges Medium mit einem pH-Wert von 6 bis 8 umfasst.

21. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Donor-Substrat eine β-Galactosyleinheit umfasst, die Galactosyl-Transferase in katalytischer Menge vorliegt und das Reaktionsmedium weiters ein Donor-Substrat-Rezykliersystem umfasst, das zumindest 1 Mol Glucose-1-phosphat pro Mol Akzeptor-Zucker umfasst, sowie katalytische Mengen an UDP, Pyruvat-Kinase, UDP-Glucose-Pyrophosphorylase und eine UDP-Galactose-4-Epimerase.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Akzeptor-Zucker aus der aus GlcN- (Alloc)(1→3)βGalOEt und GlcNAc(1→)βGalOEt bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

23. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Reaktionsmedium weiters Folgendes umfasst:

(i) ein Donor-Substrat-Rezykliersystem, das zumindest 1 Mol Glucose-1-phosphat pro Mol Akzeptor-Substrat umfasst; sowie katalytische Mengen UDP, Pyruvat-Kinase, UDP-Glucose-Pyrophosphorylase und eine UDP-Galactose-4-Epimerase;

(ii) eine katalytische Menge einer CMP-Sialsäure-Synthetase;

(iii) eine Sialsäure;

(iv) ein CMP-Sialsäure-Rezykliersystem, das zumindest 2 Mol Phosphat-Donor pro Mol Sialsäure sowie katalytische Mengen eines Nukleosidtriphosphats, Cytidinmonophosphat, eine Kinase, die in der Lage ist, Phosphat vom Phosphat-Donor auf ein Nukleosiddiphosphat zu übertragen, und eine Nukleosidmonophosphat-Kinase umfasst, die in der Lage ist, das terminale Phosphat von einem Nukleosidtriphosphat auf CMP zu übertragen.

24. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Fucosyl-Transferase α(1→3)-Fucosyl- Transferase ist und das Donor-Substrat GDP-Fucose ist.

25. Verfahren zur Herstellung von NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R')β- (1→3)Galβ-OR, worin:

R aus der aus Wasserstoff, einem Saccharid, einem Oligosaccharid und einer Aglykongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und

R' aus der aus Acetyl und Allyloxycarbonyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist; wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) das Galactosylieren einer Verbindung der Formel GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR mit einer Galactosyl-Transferase in Gegenwart einer UDP-Galactose unter Bedingungen, die ausreichen, um die Verbindung Galβ(1→4)GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR zu bilden;

(b) das Sialylieren der unter (a) gebildeten Verbindung mit einer Sialyl-Transferase in Gegenwart eines CMP-Derivats einer Sialsäure unter Verwendung einer α-(2,3)-Sialyl-Transferase unter Bedingungen, bei denen Sialsäure auf den nicht-reduzierenden Zucker übertragen wird, um die Verbindung NeuAca-(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R')β(1→3)- Galβ-OR zu bilden; und

(c) das Fucosylieren der unter (b) gebildeten Verbindung, um das NeuAcα(2→3)- Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR zu bilden; worin die Glactosylierungs- und Sialylierungsschritte in einem Reaktionsmedium durchgeführt werden, das ein lösliches zweiwertiges Metallkation umfasst, und das Medium mit dem löslichen zweiwertigen Metallkation ergänzt wird, um die Konzentration des zweiwertigen Metallkations zwischen 1 mM und 75 mM zu halten.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin R' Allyloxycarbonyl ist und der Fucosylierungsschritt auf chemischem Weg durchgeführt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 25, worin der Fucosylierungsschritt enzymatisch durchgeführt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Galactosylierung und die Sialylierung in einem einzigen Gefäß durchgeführt werden.

29. Verfahren nach Anspruch 25, worin vor Schritt (c) das Produkt aus Schritt (b) unter Einsatz von Membranfiltration mit einer Membran gereinigt wird, die einen Molekulargewichts-Cutoff von 100 bis 10.000 aufweist.

30. Verfahren nach Anspruch 29, worin der Molekulargewichts-Cutoff 200 bis 1.000 beträgt.

31. Verfahren nach Anspruch 25, worin der Galactosylierungsschritt die Verwendung eines UDP-Galactose-Rezykliersystems umfasst, das zumindest 1 Mol Glucose-1-phosphat pro Mol GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR und katalytische Mengen an UDP, Pyruvat-Kinase, UDP-Glucose-Pyrophosphorylase sowie eine UDP-Galactose-4-Epimerase umfasst.

32. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Sialylierungsschritt die Verwendung eines CMP-Sialsäure-Rezykliersystems umfasst, das zumindest 2 Mol Phosphat-Donor pro Mol Sialsäure umfasst, sowie katalytische Mengen eines Nukleosidtriphosphats, Cytidinmonophosphat, eine Kinase, die in der Lage ist, Phosphat vom Phosphat-Donor auf ein Nukleosiddiphosphat zu übertragen, und eine Nukleosidmonophosphat-Kinase, die in der Lage ist, das terminale Phosphat von einem Nukleosidtriphosphat auf CMP zu übertragen.

33. Verfahren nach Anspruch 25, worin R Ethyl ist; der Galactosylierungsschritt die Verwendung eines UDP-Galactose-Rezykliersystems umfasst, das zumindest 1 Mol Glucose-1-phosphat pro Mol GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR sowie katalytische Mengen an UDP, Pyruvat-Kinase, UDP-Glucose-Pyrophosphorylase und eine UDP-Galactose-4-Epimerase umfasst; der Sialylierungsschritt die Verwendung eines CMP-Sialsäure-Rezykliersystems umfasst, das zumindest 2 Mol Phosphat-Donor pro Mol Sialsäure umfasst, sowie katalytische Mengen eines Nukleosidtriphosphats, Cytidinmonophosphat, eine Kinase, die in der Lage ist, Phosphat vom Phosphat-Donor auf ein Nukleosiddisphosphat zu übertragen, und eine Nukleosidmonophosphat-Kinase, die in der Lage ist, das terminale Phosphat von einem Nukleosidtriphosphat auf CMP zu übertragen; wobei der Fucosylierungsschritt chemisch durchgeführt wird; und die Schritt (a) und (b) in einem einzigen Gefäß durchgeführt werden.

34. Verfahren zur Synthese von CMP-NeuAc, umfassend:

(a) das Bereitstellen eines Reaktionsmediums, das CMP-NeuAc-Synthetase, Sialsäure, CTP und ein lösliches zweiwertiges Metallkation umfasst; und

(b) das Ergänzen der Konzentration des löslichen zweiwertigen Metallkations, um eine Konzentration im Reaktionsmedium zwischen 1 mM und 75 mM für einen ausreichend langen Zeitraum zu erzielen, um die Synthese abzuschließen.

35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Sialsäure in situ gebildet wird und das Reaktionsmedium weiters GlcNAc, Brenztraubensäure und Sialsäure-Aldolase umfasst.