DE69614846T2

DE69614846T2 - Apparat und verfahren zur einschleunigung eines nucleotids in zellkerne

Info

Publication number: DE69614846T2
Application number: DE69614846T
Authority: DE
Inventors: P. Diet; J. Dzau; H. Gibbons; J. Mann; Heiko Von Der Leyen
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 2002-05-16
Anticipated expiration: 2016-05-04
Also published as: US5766901A; ATE204904T1; ES2163018T3; EP0826059B1; WO1996034967A1; DK0826059T3; CA2219091A1; DE69614846D1; EP0826059A1; EP0826059A4; JP3865318B2; JPH11505112A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Abgabe von Nucleotiden in Zellen von Geweben sowohl in vivo als auch ex vivo, und insbesondere den Einsatz von kontrollierten Drücken, um die Aufnahme von exogenen Nucleotiden in die Zelle und deren Lokalisierung innerhalb des Zellkerns zu bewirken.
Die effiziente Abgabe exogener Nucleotide, wie z. B. Desoxyribonucleinsäure (DNA), Ribonucleinsäure (RNA), usw., an die Zellen lebender Gewebe wird ein immer wichtigeres Problem in der modernen Medizin und der Forschung. Freie Nucleotide müssen sowohl in vivo als auch ex vivo in Zeilen abgegeben werden, und zwar zur Transfektion oder einer anderen genetischen oder pharmakologischen Manipulation. Arzneistoffe, die Nucleotide enthalten, müssen in Zellen lebender Gewebe eingebracht werden, um wirksam sein zu können. Tatsächlich muss das Nucleotid bei vielen Anwendungen nicht nur in die Zellen eingelassen, sondern auch in deren Kern lokalisiert werden.
Leider ist gegenwärtig kein Verfahren und auch keine Vorrichtung erhältlich, um die effiziente Abgabe exogener Nucleotide in Zellen von intaktem Gewebe zu erleichtern. Insbesondere gewährleistet kein gegenwärtig bekanntes Verfahren und auch keine bekannte Vorrichtung die effiziente Aufnahme und Kernlokalisation des Nucleotids. Ein einfacher Kontakt von Zellen mit DNA führt nur bei einer geringen Prozentzahl von Zellen, im Allgemeinen weniger als 5%, zu einer Aufnahme und Lokalisation.
Die gebräuchlichsten Verfahren zur Abgabe von Nucieotiden beruhen auf Formulierungen, wie z. B. kationischen Lipiden, die Komplexe mit DNA bilden, um das Eintreten von DNA in Zellen und die anschließende Kernlokalisation zu erleichtern. Es wurde bis heute von keiner Formulierung berichtet, die eine Transfektionseffizienz von mehr als 10% eines intakten Gewebes entweder in vivo oder ex vivo erreicht. Darüber hinaus ist der Kontakt von lebendem Gewebe mit den Formulierungen selbst unerwünscht, da viele Formulierungen als toxisch oder schädlich bekannt sind.
Ein anderes Abgabeverfahren beruht auf der DNA-Einkapselung. Beispielsweise ist in der US-PS 4,394,448 (Szoka, Jr. et al.) ein Verfahren zum Einbringen von DNA oder Fragmenten davon in lebende Zellen beschrieben. Die DNA oder das Fragment wird zunächst in einem wässrigen Gemisch hergestellt. Dieses wässrige Gemisch wird dann in ein Gemisch aus einer Lipidvesikelwand-bildenden Zusammensetzung und einem organischen Lösungsmittel eingebracht. Als Folge davon wird die DNA in dem Vesikel eingekapselt und sobald dies stattgefunden hat wird das Vesikel mit der Zielzelle in Kontakt gebracht. Das Einbringen findet beim Kontakt statt. Die Transfektionseffizienz dieses Verfahrens und entsprechender Variationen ist nach wie vor sehr niedrig.
Ein weiterer Ansatz zur DNA-Abgabe, der für die in vivo-Aufnahme verfügbar ist, beruht auf dem Einbringen der DNA in virale Vektoren, die man dann Zielzellen infizieren lässt. Obwohl die erreichten DNA-Abgaberaten höher sind als bei Lipidformulierungen, birgt die Verwendung viraler Vektoren viele Risiken. Die Vektoren sind potentiell toxisch und haben häufig schädliche immunologische Effekte, von denen einige immer noch unbekannt sind. Demgemäß wurde dieses Verfahren, obwohl es in der Forschung populär ist, für allgemeine klinische Anwendungen noch nicht als akzeptabel betrachtet, insbesondere für die Verwendung bei Menschen.
In Science, Band 244, Seiten 1342-1344 ist eine Technik und eine Vorrichtung zur Übertragung von Endothelzellen, d. h., zur Implantierung dieser Zellen auf einer Gefäßwand beschrieben. Dieses Verfahren beschreibt nicht, wie ein Nucleotid in lebende Zellen in Gewebe abgegeben werden kann. In der WO-A-94 24263 ist ein Abgabesystem beschrieben, bei dem eine nadellose Spritze verwendet wird, durch die ein genetisches Material in lebende Zellen injiziert wird. Das Ausmaß des Drucks, der eingesetzt wird, um die Probe abzugeben, hängt davon ab, ob die Probe intradermal, subkutan oder intramuskulär injiziert wird. In der EP-0 414 044 ist eine Vorrichtung zur Behandlung einer Zelle beschrieben, bei der ein Kolben in einen Zylinder getrieben wird, der mit einem Plattenkörper mit einem kleinen Injektionsloch kollidiert, das ein am vorderen Ende des Kolbens angebrachtes Zellbehandlungsmaterial, in die Probe, welche die Zelle enthält, injiziert. In der WO-92 204439 und in der WO-91 11526 ist eine Vorrichtung zur Injektion von DNA beschrieben, und zwar durch Beschießen der Zellen mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen bzw. mittels einer biologisch-biolistischen Insertionstechnik.
Schließlich werden bei einem Verfahren, das von Sanford et al. in den US-PSen 5,179,022 und 5,204,253 gelehrt wird, beschleunigte Mikroprojektile verwendet, um biologisches Material in lebende Zellen abzugeben. Bei dem ersten Patent werden die Mikroprojektile durch eine erste Vakuumkammer beschleunigt und durch eine aufnehmende Platte durch eine Öffnung in der Platte in eine zweite Vakuumkammer abgelenkt. In der zweiten Kammer treten die Mikroprojektile in das biologische Material ein, in dem sie dann aufgenommen werden. Gemäß dem zweiten Patent werden die Mikroprojektile durch einen "kalten" Gasschock beschleunigt - eine Gasschockwelle, die von einem Gas erzeugt wird, das sich bei Raumtemperatur befindet. Die beschleunigten Mikroprojektile durchdringen die Oberfläche der Zielzellen oder -gewebe und werden darin aufgenommen.
Das biolistische Verfahren hat mehrere Nachteile. Erstens ist es nicht für die Verwendung mit intaktem Gewebe entweder in vivo oder ex vivo geeignet, und zwar aufgrund hoher Aufprallenergien. Zweitens wandern die Mikroprojektile innerhalb des Gewebes nicht in einfacher Weise, da sie den größten Teil ihrer kinetischen Energie bei dem Aufprall verlieren. Bisher ist noch kein brauchbares Verfahren zur Erzeugung einer Teilchenbeschleunigung innerhalb von Geweben entwickelt worden.
Im Hinblick auf die vorstehenden Ausführungen ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur effizienten Abgabe von exogenen Nucleotiden in Zellen von Geweben sowohl in vivo als auch ex vivo. Insbesondere erlauben das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung eine hohe Abgabeeffizienz mit Kernlokalisation in mehr als 90% der exponierten Zellen. Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Abgabe reiner Nucleotide in Lösung zu ermöglichen, ohne dass exogene und potentiell toxische Substanzen notwendig sind. Insbesondere eliminiert die Erfindung den Bedarf an viralen Vektoren und Fremdpartikeln oder -substanzen, die bisher für die Komplexierung von Nucleotiden benötigt worden sind. Die Zellen werden auch nicht Fremdmaterial mit hoher Geschwindigkeit ausgesetzt, wie dies bei biolistischen Techniken der Fall ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, sicherzustellen, dass die Vorrichtung zur Abgabe der Nucleotide kostengünstig ist, einen einfachen Aufbau hat und einfach zu betreiben ist. Diese und andere Aufgaben und Vorteile werden nach dem Studieren der nachstehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen deutlicher.
Die Aufgaben der Erfindung wurden durch die Vorrichtung gemäß Anspruch 1 gelöst. Weitere Aufgaben dieser Erfindung wurden durch die Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 10 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Gegenstands sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass lebende Zellen in intaktem Gewebe, die in Gegenwart eines extrazeflulären Nucleotids unter Druck gesetzt worden sind, dieses Nucleotid aufnehmen und es in ihrem Zellkern lokalisieren. Das erfindungsgemäße Nucleotid-Abgabesystem setzt daher Zellen in einem Gewebe einer Hochdruck- Fluidumgebung aus, die Nucleotide enthält. Zur Abgabe der Lösung und zum Beaufschlagen des Gewebes mit Druck werden erfindungsgemäß verschiedene Systeme eingesetzt. In einigen Ausführungsformen sind das Abgabesystem und das System zur Beaufschlagung mit Druck das gleiche System. Dies wird durch die Verwendung einer spritzenartigen Einrichtung erreicht, um die Nucleotidlösung in ein Gewebe zu injizieren. In anderen Ausführungsformen ist das System zur Beaufschlagung mit Druck eine Gaskammer oder eine mechanische Klemmeinrichtung und das Abgabesystem ist ein Katheter mit darauf befestigten Ballons, um Gefäße abzuschließen und wasserdichte Segmente innerhalb eines Gefäßes zu erzeugen.
Dieses Nucleotidabgabesystem arbeitet mit jedem Gewebe, das vorübergehend abgeschlossen werden kann, einschließlich vollständige Organe oder Organismen. In vielen Ausführungsformen wird das Gewebe durch die Verwendung einer undurchlässigen und unelastischen Hülle, die das Gewebe umgibt, vor einem Barotrauma geschützt. In anderen Ausführungsformen wird das Gewebe kein Barotrauma erfahren können und es ist ausreichend, es vor dem Austreten von Flüssigkeiten zu schützen. Wenn das Gewebe ein Gefäß oder Organ mit einem Lumen ist, das bereits ein umschlossener Raum ist, müssen lediglich die Punkte des Fluideintritts und -austritts mit Ballons oder vorübergehenden Ligaturen (wie z. B. Befestigungsbändern) abgedichtet werden.
Fig. 1 zeigt die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform im Ausgangszustand.
Fig. 2 zeigt das Nucleotidabgabesystem von Fig. 1, wenn das Gewebe befestigt worden ist.
Fig. 3 zeigt das Nucleotidabgabesystem von Fig. 1 nach der Beaufschlagung mit Druck.
Fig. 4 zeigt eine alternative Ausführungsform, die an einem vollständigen Organ arbeitet.
Fig. 5 zeigt eine alternative Ausführungsform, die an einem Segment eines röhrenförmigen Gewebes arbeitet, das noch mit einem Gefäß verbunden ist.
Fig. 6 zeigt eine alternative Ausführungsform, bei der anstelle einer Spritze eine mechanische Einrichtung zur Beaufschlagung mit Druck verwendet wird.
Fig. 7 zeigt die Ausführungsform von Fig. 6 nach dem Beaufschlagen mit Druck.
Fig. 8 zeigt eine alternative Ausführungsform, bei der ein Katheter in Kombination mit zwei Ballons verwendet wird, um die Nucleotidlösung in das Lumen eines Gefäßes abzugeben.
Fig. 9 zeigt die Ausführungsform von Fig. 8, nachdem die Ballons aufgeblasen worden sind.
Fig. 10 zeigt eine alternative Ausführungsform von Fig. 8, bei der die Ballons innere Röhren aufweisen, um die Nucleotidlösung an die Wände eines Gefäßes abzugeben.
Fig. 11 zeigt die Ausführungsform von Fig. 10, wobei Pfeife den Fluss der Nucleotidlösung bei der Abgabe zeigen.
Fig. 12 zeigt eine alternative Ausführungsform, bei der zwei Katheter mit Ballons verwendet werden, um ein Organ mit Druck zu beaufschlagen.
Fig. 13 zeigt eine alternative Ausführungsform, die an einem isolierten Gewebe oder an Zellkulturen arbeitet.
Fig. 14 zeigt die Ausführungsform von Fig. 13, nachdem die Nucleotidlösung in die Kultur eingebracht worden ist.
Fig. 15 zeigt die Ausführungsform von Fig. 13, wenn die Kultur in eine mit Druck beaufschlagte Kammer eingebracht worden ist.
Fig. 16 zeigt die Transfektionseffizienz als Funktion des angelegten Drucks für eine menschliche V. saphens, die erfindungsgemäß transfiziert worden ist.
Fig. 17 veranschaulicht den erfindungsgemäßen Effekt einer Hülle auf die Transfektionseffizienz für eine FITC-ODN-transfizierte menschliche V. saphena.
Fig. 18 veranschaulicht die erfindungsgemäße Hemmung der IL-6?-Proteinproduktion nach der Transfektion von IL-6-Antisense-ODN in eine menschliche V. saphena.
Fig. 19-A veranschaulicht die erfindungsgemäße Hemmung der IL-6-mRNA-Produktion nach der Transfektion von IL-6-Antisense-ODN in die menschliche V. saphena einer ersten Person.
Fig. 19-B ist ein Graph, der dem von Fig. 19-A ähnlich ist, für eine zweite Person.
Fig. 19-C ist ein Graph, der dem von Fig. 19-A ähnlich ist, für eine dritte Person.
Fig. 20 zeigt die Transfektionseffizienz für eine erfindungsgemäße in vivo-Transfektion einer Hasen-Halsschlagader, die mit Fluoreszenzmikroskopie gemessen worden ist.
Fig. 21 zeigt die Luciferaseaktivität für Kontrollzellen, gesunde Zellen und arteriosklerotische Zellen nach der erfindungsgemäßen in vivo-Transfektion einer Hasen-Halsschlagader mit DNA, die für Leuchtkäfer-Luciferase kodiert.
Fig. 22 zeigt die Transfektionseffizienz für glatte Ratten-Muskelgefäßzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren in vitro transfiziert worden sind.
Fig. 23 zeigt die Luciferaseaktivitäten für Rattennieren, die erfindungsgemäß mit Plasmid- DNA perfundiert worden sind, die das Gen enthält, das für Leuchtkäfer-Luciferase kodiert Fig. 1 ist eine Seitenansicht des Ausgangszustands der bevorzugten Ausführungsform des Nucleotidlösungs-Abgabesystems. In dieser Ausführungsform umfasst das System eine spritzenartige Struktur mit einem Vorratsbehälter 10 zum Aufnehmen einer Nucleotidlösung 40 und einen Kolben 12. Eine Nucleotidlösung kann DNA, RNA oder entsprechende Moleküle enthalten. Gegenüber dem Kolben 12 öffnet sich der Vorratsbehälter 10 in ein Rohr 14. Um das Rohr 14 sind ausgehend von dem Vorratsbehälter 10 in dieser Reihenfolge ein Hahn 16, ein Druckmesser 18, eine zurückgezogene Hülle 20 und ein Wulst 22 angeordnet. Der Wulst 22 befindet sich angrenzend an das distale offene Ende 30 des Rohrs 14. Die Hülle 20 ist weder durchlässig noch elastisch, um das Gewebe vor einem Barotrauma zu bewahren. Der Hahn 16 ist zunächst geschlossen, wodurch verhindert wird, dass die Lösung 40 aus dem Vorratsbehälter 10 in das Rohr 14 fließt.
Fig. 2 veranschaulicht, wie eine röhrenförmige Gewebeprobe 24 befestigt wird. Das offene Ende 30 wird in das proximale Ende eines lebenden röhrenförmigen Gewebes 24 eingeführt. Der Wulst 22 passt in das proximale Ende des Gewebes 24 und ein Befestigungsband oder eine Ligatur 26A wird angebracht um ein Abgleiten des Gewebes 24 von dem offenen Ende 30 zu verhindern. Anschließend wird die Hülle 20 heruntergezogen, um das Gewebe 24 zu bedecken. Die Ligatur 26A wird um die Hülle 20 und das Gewebe 24 an dem Punkt herumgewickelt, an dem sie an dem Rohr 14 befestigt sind. In dieser Ausführungsform ist die Ligatur ein Befestigungsband 26A.
An diesem Punkt wird der Hahn 16 in die offene Position gedreht, wodurch Nucleotidlösung 40 in das Rohr 14 und die Hülle 20 fließen und alle anwesenden Gase und Flüssigkeiten durch das offene Ende 28 der Hülle 20 spülen kann. Nach diesem Spülen wird ein Befestigungsband 26B über dem distalen offenen Ende 28 der Hülle 20 angeordnet, um einen wasserdichten Verschluss zu bilden. Dabei wird das Befestigungsband 26B um die Hülle 20 und das Gewebe 24 gelegt. Natürlich ist es auch möglich, das Befestigungsband 26B nur um die Hülle 20 zu legen. Es muss jedoch sichergestellt sein, dass das Befestigungsband 26B fest angebracht wird.
Fig. 3 zeigt, wie eine Nucleotidlösung 40 in dem Gewebe 24 mit Druck beaufschlagt wird. Der Hahn 16 wird geöffnet und der Kolben 12 wird gedrückt, so dass die Nucleotidlösung 40 unter einem Injektionsdruck in die Hülle 20 injiziert wird. Man lässt den Druck innerhalb der Hülle 20 so lange ansteigen, bis ein vorbestimmter Inkubationsdruck - im Allgemeinen zwischen mindestens 300 mm Hg und 1500 mm Hg - erreicht worden ist. An diesem Zeitpunkt wird der Hahn 16 geschlossen (nicht gezeigt). Man lässt das Gewebe 24 dann für einen Zeitraum inkubieren, worauf das Befestigungsband 26B gelöst wird, um den Druck abzufassen (nicht gezeigt).
Fig. 4 veranschaulicht eine alternative Ausführungsform des Nucleotidabgabesystems, das an einem Organ arbeitet. In dieser Ausführungsform wird ein Organ 124 mit einer Schutzhülle 120 eingehüllt. Das Organ 124 weist eine Arterie 112 auf, die Blut in das Organ 124 fließen lässt, und eine Vene 114, die Blut abfließen lässt. Zunächst wird das Rohr 14 in das Lumen der Arterie 112 eingesetzt. Dann wird die Hülle 120 um die Arterie 112 und die Vene 114 gelegt. Das Befestigungsband 126A wird an der Arterie 112 um die Hülle 120 festgezogen und das Befestigungsband 12GB wird an der Vene 114 um die Hülle 120 festgezogen, um ein Austreten von Fluid aus dem Organ 124 zu verhindern. Das Befestigungsband 126A lässt es zu, dass das Rohr 14 in die Arterie 112 eindringt. Es umhüllt jedoch fest genug, um die Arterie 112 gegen eine Leckage abzudichten. An diesem Punkt wird Nucleotidlösung 40 injiziert und man lässt das Organ 124 inkubieren. Nach dem Inkubationszeitraum werden die Befestigungsbänder 126A und 126B entfernt und Blut kann wieder durch das Organ 124 fließen. Mit Ausnahme dieser Unterschiede ist diese Ausführungsform hinsichtlich der Struktur und des Betriebs mit der bevorzugten Ausführungsform identisch.
Fig. 5 veranschaulicht eine alternative Ausführungsform, die an einem Segment eines röhrenförmigen Gewebes arbeitet, wie z. B. einem Blutgefäß. In dieser Ausführungsform wird das Rohr 14 in das Lumen eines Gefäßes 224 eingesetzt, das nach wie vor mit dem Körper eines lebenden Tieres verbunden ist. Eine umhüllende Lage 220 umgibt das Gefäß 224 und eine Befestigungseinrichtung 228 befestigt die beiden Laschen der Lage 220 unter Bildung eines Schlauchs. In dieser Ausführungsform kann die Befestigungseinrichtung 228 eine Heißsiegelung sein. Zwei Befestigungsbänder 226A und 226B sind um die Lage 220 angebracht. Das Befestigungsband 226A ist an der Stelle, an der das Rohr 14 eintritt, um die Lage 220 angebracht und das Befestigungsband 226B ist um das andere Ende der Lage 220 angebracht. Die Befestigungsbänder 226A und 226B machen somit ein Segment 230 des Gefäßes 224 wasserdicht. An diesem Punkt wird Nucleotidlösung 40 injiziert und man läßt das Segment 230 inkubieren. Nach dem lnkubationszeitraum werden die Befestigungsbänder 226A und 226B entfernt und das Segment 230 wird wieder mit Blut perfundiert. Mit Ausnahme dieser Unterschiede ist diese Ausführungsform hinsichtlich der Struktur und des Betriebs mit der bevorzugten Ausführungsform identisch.
Fig. 6 ist eine alternative Ausführungsform von Fig. 5, die ein anderes Abgabesystem und ein anderes System zur Beaufschlagung mit Druck aufweist. In Fig. 6 wird die Nucleotidlösung 40 auf die gleiche Weise in das Lumen des Gefäßes 224 abgegeben.
Nachdem jedoch die Befestigungsbänder 226A und 226B um die Lage 220 angeordnet worden sind, wird eine steife röhrenförmige Umhüllung 250 um die Lage 220 angeordnet und eine Klemmeinrichtung 252 wird um die Umhüllung 250 angebracht, wie es in Fig. 7 gezeigt ist. Die Umhüllung 250 ist um ihren Umfang flexibel, so dass der Durchmesser des Schlauchs, den die Umhüllung 250 bildet, variabel ist. Die Umhüllung 250 ist jedoch in axialer Richtung steif, so dass sie selbst bei einer Änderung des Durchmessers im Wesentlichen röhrenförmig bleibt. Eine Spannschraube 254 zieht die Klemmeinrichtung 252 an und zieht die Umhüllung 250 fest, wodurch Druck innerhalb des Gefäßes 224 erzeugt wird. Dieser Druck wird für einen lnkubationszeitraum aufrechterhalten, nach dem die Schraube 254 gelöst und der Druck abgebaut wird. Mit Ausnahme dieser Unterschiede ist diese Ausführungsform hinsichtlich der Struktur und des Betriebs mit der Ausführungsform von Fig. 5 identisch.
Fig. 8 zeigt eine alternative Ausführungsform der Erfindung, bei der die Nucleotidlösung über einen Katheter in das Lumen eines Gefäßes abgegeben wird. Ein Katheter 314 wird in ein Gefäß 324 eingesetzt. Der Katheter 314 ist an seinem Ende 316 verschlossen. In einem gewissen Abstand von dem Ende 316 befindet sich eine Öffnung 330. Vor und nach der Öffnung 330 sind zwei Ballons 332A und 332B auf dem Katheter 314 befestigt. Zunächst sind die Ballons 332A und 332B nicht aufgeblasen.
Fig. 9 zeigt die Ausführungsform von Fig. 8 in Betrieb. Die Ballons 332A und 332B sind aufgeblasen und verschließen das Gefäß 324, in dem sie aufgeblasen sind. Dadurch wird ein leckagebeständiges Segment 334 innerhalb des Gefäßes 324 erzeugt. Anschließend wird eine Nucleotidlösung 340 durch den Katheter 314 abgegeben, die aus der Öffnung 330 austritt. Die Lösung 340 wird mit Druck beaufschlagt, so dass auch das Segment 334 mit Druck beaufschlagt wird. Nach einem lnkubationszeitraum wird die Luft aus den Ballons 332A und 3328 abgelassen und das Segment 334 wird wieder drucklos.
Fig. 10 zeigt eine alternative Ausführungsform von Fig. 8, bei der ein Ballon, der auf dem Katheter befestigt ist, Miniaturröhrchen zur Abgabe der Nucleotidlösung an die Wände eines Gefäßes aufweist. Fig. 10 zeigt diese Ausführungsform in dem Zustand, bei dem ein Ballon 432 bereits aufgeblasen worden ist, jedoch die Nucleotidlösung noch nicht abgegeben wurde. In dieser Ausführungsform gibt es keine Öffnung 330 auf dem Katheter 314. Der Ballon 432 weist Röhrchen 450 auf, die direkt mit Löchern 452 in dem Segment des Katheters 314 innerhalb des Ballons 432 verbunden sind.
Fig. 11 zeigt die Ausführungsform von Fig. 10 in Betrieb. Wenn eine mit Druck beaufschlagte Nucleotidlösung 440 durch den Katheter 314 abgegeben wird, tritt die Lösung 440 durch die Löcher 452 aus, fließt durch die Röhrchen 450 und erreicht die Wände des Gefäßes 324. Mit Ausnahme dieser Unterschiede ist diese Ausführungsform mit der Ausführungsform in Fig. 8 identisch.
Fig. 12 zeigt eine weitere alternative Ausführungsform von Fig. 8, bei der zwei Katheter mit Ballons ein Organ mit Druck beaufschlagen. Ein Katheter 550 mit einem Ballon 552 wird in eine Arterie 512 eingesetzt, die zu einem Organ 524 führt, und ein weiterer Katheter 560 mit einem Ballon 562 wird in eine Vene 514 eingesetzt, die von dem Organ 524 wegführt.
Zunächst sind die Ballons 552 und 562 nicht aufgeblasen (nicht gezeigt). Sobald ihre jeweiligen Katheter eingesetzt worden sind, werden sie aufgeblasen und verschließen so die Arterie 512 und die Vene 514. An diesem Punkt wird eine mit Druck beaufschlagte Nucleotidlösung 540 in das Organ 524 abgegeben. Mit Ausnahme dieser Unterschiede ist diese Ausführungsform hinsichtlich des Betriebs mit der Ausführungsform von Fig. 8 identisch.
Fig. 13 zeigt eine weitere alternative Ausführungsform der Erfindung, bei der eine Druckkammer verwendet wird. In Fig. 13 enthält eine Schale 610 eine Kultur 624 aus lebendem Gewebe. Fig. 14 zeigt, wie eine nicht mit Druck beaufschlagte Nucleotidlösung 640 in die Kultur 624 eingebracht wird. Danach wird die Schale 610 in eine Druckkammer 650 eingebracht, wie es in Fig. 15 gezeigt ist. Die Kammer 650 ist noch nicht mit Druck beaufschlagt. Anschließend wird die Kammer 650 verschlossen und abgedichtet und ein mit Druck beaufschlagtes Gas, wie z. B. CO&sub2;, wird durch einen Kanal 660 in die Kammer 650 eingeführt, wodurch die Lösung 640 und die Kultur 624 mit Druck beaufschlagt werden. Nach einem Inkubationszeitraum wird der Kanal 660 abgesperrt, um den Druck abzulassen. Diese Ausführungsform kann auch zum Einbringen eines Nucleotids in die Zellen eines gesamten Organismus verwendet werden. Um dies zu erreichen, wird ein Organismus in die Kammer 650 eingebracht und das durch den Kanal 660 eingeführte, mit Druck beaufschlagte Gas enthält das Nucleotid, das in die Zellen des Organismus aufgenommen werden soll.
Die Transfektionseffizienz der erfindungsgemäßen Verfahren wurde für verschiedene Drücke und Zelltypen bewertet. Die nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung und sind nicht beschränkend aufzufassen. Die in der nachstehenden Diskussion verwendeten Abkürzungen bedeuten: CTRL Kontrolle; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; FITC-ODN = FITC-markiertes Oligodesoxyribonucleotid; IL-6 = Interleukin-6; ODN = Oligodesoxyribonucleotid; PCR = Polymerasekettenreaktion; VSMC = glatte Muskelgefäßzelle. Die Zahl n bezeichnet die Anzahl der Kulturen, die für jeden Datenpunkt bewertet worden ist. Die angegebenen Drücke sind die auf die Proben angewandten Nettodrücke.

Beispiel 1

Eine menschliche V. saphena wurde mit einem erfindungsgemäßen Verfahren mit FITC- ODN transfiziert. Fig. 16 zeigt die Transfektionseffizienz als Funktion des angewandten Drucks für verschiedene ODN-Konzentrationen. Die Effizienz wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie als prozentualer Anteil der gesamten Intimazellen und Medialzellen gemessen, die eine Kernlokalisation von FITC-ODN aufwiesen. Die Drücke lagen im Bereich von 50 bis 760 mm Hg und die ODN-Konzentrationen in physiologischer Kochsalzlösung lagen im Bereich von 5 bis 100 uM. n hatte den Wert 6.

Beispiel 2

Die Wirkung einer Hülle auf die Transfektionseffizienz wurde mit einem Verfahren bewertet, das dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren entsprach, wobei die ODN-Konzentration 20 uM war und der Druck in einem Bereich von 50 bis 760 mm Hg lag. Fig. 17 zeigt die Ergebnisse des Experiments. n hatte den Wert 6.

Beispiel 3

Die Transfektionseffizienz eines erfindungsgemäßen Verfahrens wurde in vitro durch Messung der Hemmung der IL-6-Produktion durch Antisense-ODN in Ganzorgankulturen bestimmt. Venensegmente wurden nach der Transfektion 24 Stunden inkubiert. Fig. 18 zeigt die Abnahme von IL-6-Protein, die mittels ELISA in Wachstumsmedium für antisensetransfizierte Kulturen nachgewiesen worden ist. Das Niveau der Abnahme ist auf die Niveaus bezogen, die in Kontrollkulturen von nicht transfizierten und unspezifisch ODN-transfizierten Venen gefunden worden sind. n hatte den Wert 6.

Beispiel 4

Es wurde die quantitative reverse Transkriptions-PCR eingesetzt, um die Abnahme von IL-6- mRNA zu messen, die von der erfindungsgemäß durchgeführten antisense-ODN- Transfektion stammt. Es wurden drei Proben menschlicher V. saphena transfiziert und die mRNA-Mengen in antisense-transfizierten Venensegmenten wurde mit den Mengen in unbehandelten und revers-antisense-ODN-transfizierten Segmenten (Kontrolle) verglichen. Die Ergebnisse für die drei Proben sind in den Fig. 19-A, 19-B bzw. 19-C gezeigt. Abnahmen der mRNA-Mengen zeigen eine sequenzspezifische Wirksamkeit der antisense-ODN- Behandlung.

Beispiel 5

Hasen-Halsschlagaderzellen wurden mit einem erfindungsgemäßen Verfahren in vivo mit FITC-ODN transfiziert. Die Transfektionseffizienz wurde 4 Stunden, 4 Tage und 7 Tage nach der Transfektion gemessen. Der prozentuale Anteil FITC-positiver Kerne als Funktion der Zeit ist in Fig. 20 angegeben. n hatte einen Wert von 2 bis 3.

Beispiel 6

Die Expression des Gens für Leuchtkäfer-Luciferase wurde nach der in vivo-Transfektion einer Hasen-Halsschlagader mit einem Plasmid-DNA-Konstrukt gemessen, welches das Luciferasegen enthielt. Gesunde Arterien (normal) und arteriosklerotische Gefäße (CHOL/inj) wurden unter Druck transfiziert. Eine Kontrollarterie (Kontrolle) wurde ohne Druck mit dem Plasmid in Kontakt gebracht, welches das Luciferasegen trug. Die Arterien wurden am Tag 5 geerntet und Gewebehomogenisate wurden im Hinblick auf Luciferaseaktivität getestet. Die Testergebnisse sind in Fig. 21 gezeigt. n hatte einen Wert von 2 bis 4.

Beispiel 7

Glatte Rattenmuskelgefäßzellen (VSMC) wurden mit einem erfindungsgemäßen Verfahren in vitro mit FITC-ODN transfiziert. Die Zellen wurden entweder Atmosphärendruck (0 atm Nettodruck) oder 2 atm für 45 min ausgesetzt. Fig. 22 zeigt die Transfektionseffizienz für FITC-ODN-Konzentrationen von 1 uM bis 80 uM. n hatte den Wert 4.

Beispiel 8

Fig. 23 veranschaulicht den Effekt des Drucks auf die Transfektionseffizienz für Rattennierenzellen, die in vivo mit Plasmid-DNA perfundiert worden sind, weiche das Gen für Leuchtkäfer-Luciferase enthält. Ratten wurden nach der Nierenperfusion Atmosphärendruck (0 atm) oder 2 atm für 30 min ausgesetzt. Die Nieren wurden 3 Tage nach der Transfektion geerntet und Gewebehomogenisate wurden im Hinblick auf Luciferaseaktivität getestet. n hatte den Wert 7.
Aus der vorstehenden Beschreibung ist ersichtlich, dass unser Nucleotidabgabesystem exogene Nucleotide in Zellen in intaktem Gewebe in vivo oder ex vivo einbringt, und zwar ohne die Verwendung von fremden und potentiell toxischen Substanzen. Insbesondere ermöglicht dieses Verfahren die Absorption von reiner DNA in Lösung unter bestimmten Umständen mit einer Transfektionseffizienz von 90%, und zwar ohne die normale Funktion des Gewebes zu unterbrechen. Ferner werden bei jeder der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen Einrichtungen und Verfahren verwendet, die leicht verfügbar und einfach zu betreiben sind.
Obwohl die vorstehenden Erläuterungen viele spezielle Merkmale enthalten, sollten diese nicht beschränkend aufgefasst werden, sondern vielmehr als Veranschaulichung spezieller Ausführungsformen. Es sind viele andere Variationen möglich. Beispielsweise kann das Befestigungsband durch einen beliebigen Abdichtungsmechanismus ersetzt werden, wie z. B. eine Umstechungsligatur, eine Nahtbefestigung oder eine Klemme. Das Gewebe muss nicht röhrenförmig sein, sondern es ist nur erforderlich, dass es einfach mit einer Hülle umgeben werden kann. Die Hülle ist nicht immer notwendig, wie z. B. dann, wenn das Gewebe einen hohen Druck ohne Hülle aufrechterhalten kann. Die Hülle ist dabei hilfreich, das Gewebe bei hohem Druck einem Nucieotid auszusetzen, ohne das Gewebe zu überdehnen, und einen Druckverlust aufgrund der Leckage der Nucleotidlösung durch kleine Löcher oder Nebenzweige des Gewebes zu verhindern. Es können Hüllen verschiedener Größen, Formen und Materialien verwendet werden. Ferner kann eine Hülle elastisch sein, so dass sie eingeschnürt werden kann, um Druck auf das Gewebe auszuüben. Eine unelastische Hülle kann auch eingeschnürt werden, z. B. durch Verdrehen, um so den Druck darin zu erhöhen. Ferner muss die Hülle nicht mit dem Gewebe in Kontakt stehen. Es kann eine Fluidlösung zwischen der Hülle und dem Gewebe eingebracht werden.
Das System kann Nucleotide in die Zellen eines ganzen Organismus abgeben, mit der Maßgabe, dass der Organismus in eine mit Druck beaufschlagte Umgebung eingebracht werden kann.
Ferner kann das Nucleotid entweder in Lösung oder in einer Suspension vorgelegt werden. Der Kolben kann durch einen Servomechanismus automatisiert werden, um Nucleotidlösung mit einer sicheren, aber effizienten Geschwindigkeit abzugeben. Eine andere Möglichkeit zur Beaufschlagung von Gewebe mit Druck ist das Einbringen eines aufblasbaren Ballons in das Lumen eines Organs selbst. Der Druck kann 300 mm Hg und bis zu 1500 mm Hg betragen. Niedrigere oder höhere Drücke sind auch möglich, mit der Maßgabe, dass das Nucleotid in dem Zellkern lokalisiert ist und dass die notwendigen Maßnahmen ergriffen werden, um ein Barotrauma zu verhindern.
Im Allgemeinen kann eine beliebige Zusammensetzung, die ein Nucleotid enthält, mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Beispiele für solche Zusammensetzungen sind Lösungen, die DNA oder RNA, Oligonucleotide, Polynucleotide, Plasmide, Aptomere, modifizierte Formen von DNA oder RNA (z. B. Phosphorothioate oder Ribozyme) oder Proteine umfassen, die chemisch mit DNA assoziiert sind. Die abgegebene Nucleotidsequenz hängt natürlich von der Anwendung ab. Es gibt viele derartige Anwendungen, einschließlich beispielsweise die Behandlung von Transplantaten, um ein Transplantatversagen oder eine Erkrankung des Transplantats zu verhindern. Beispiele für solche Transplantate umfassen Blutgefäßtransplantate, die bei Bypassoperationen verwendet werden. Wirksame Nucleotidsequenzen für verschiedene Anwendungen sind bekannt.
Da jedes Molekül, das an den Kern abgegeben wird, durch das Cytoplasma hindurchtreten muss, ist es klar, dass im Allgemeinen ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Abgabe von Nucleotiden an das Cytoplasma von Zellen verwendet werden kann.
Demgemäß sollte der Schutzbereich der Erfindung nicht anhand der veranschaulichten Ausführungsformen bestimmt werden, sondern anhand der beigefügten Patentansprüche und deren Äquivalenten.

Claims

1. Eine Vorrichtung zur Einführung eines Nucleotids in lebende Zellen in einem Gewebe, wobei die Vorrichtung umfasst:

a) ein Behältnis, welches das Nucleotid beinhaltet;

b) ein Einführungssystem zum Einbringen des Nucleotids unter Druck in die extrazelluläre Umgebung der lebenden Zellen des Gewebes, wodurch die Aufnahme des Nucleotids in die lebenden Zellen bewirkt wird; und

c) eine Hülle zur Umschließung des Gewebes, wobei die Hülle in ausreichendem Maß undurchlässig ist, um das Gewebe unter einem lnkubationsüberdruck zu halten, um dadurch die Aufnahme des. Nucleotids zu erleichtern und das Gewebe vor einem Barotrauma zu schützen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei zwischen der Hülle und dem Gewebe ein Fluid vorliegt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, weiter umfassend d) eine Abdichtungseinrichtung, die auf der Hülle angeordnet ist, um ein Auslaufen aus dem Bereich zwischen der Hülle und dem Gewebe zu verhindern.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, weiter umfassend: e) eine Spüleinrichtung zur Entfernung von Fluiden und Gasen aus dem Raum, der von dem Gewebe eingenommen wird, bevor das Nucleotid eingebracht wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Spüleinrichtung eine undurchlässige Hülle und eine Pumpeinrichtung zum Durchleiten eines Spülgases durch die undurchlässige Hülfe umfasst.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei das Gewebe zu einem lebenden Tier gehört.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Nucleotid in einer Suspension vorliegt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Nucleotid in einer Lösung vorliegt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Nucleotid aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA und entsprechenden Molekülen ausgewählt ist.

10. Verwendung eines Behältnisses und eines Kathetersystems zur Herstellung einer Vorrichtung zur Einführung eines Nucleotids in lebende Zellen in einem Gewebe in vivo, wobei

a) das Behältnis angepasst ist, um das Nucleotid zu beinhalten; und

b) das Kathetersystem angepasst ist, um das Nucleotid in die extrazelluläre Umgebung der lebenden Zellen des Gewebes einzubringen und um Druck auf die Zellen und die Umgebung auszuüben, um dadurch die Aufnahme des Nucleotids in die lebenden Zellen zu bewirken, und wobei das Kathetersystem einen aufblasbaren Ballon umfasst, um den Bereich, der das Gewebe umfasst, abzudichten.

11. Verwendung einer Vorrichtung zur Einführung eines Nucleotids in lebende Zellen in vitro, wobei die Vorrichtung umfasst:

a) eine Druckkammer;

b) einen innerhalb der Druckkammer angeordneten Behälter zur Aufnahme der lebenden Zellen und des Nucleotids; und

c) eine Einrichtung zur Beaufschlagung mit Druck, insbesondere eine Einrichtung zur Beaufschlagung mit Druck zur Einführung eines mit Druck beaufschlagten Gases in die Druckkammer, um einen lnkubationsüberdruck in der Druckkammer aufzubauen, um dadurch die Aufnahme des Nucleotids in die lebenden Zellen zu bewirken.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Nucleotid in einer Suspension vorliegt.

13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Nucleotid in einer Lösung vorliegt.

14. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Nucleotid aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA und entsprechenden Molekülen ausgewählt ist.

15. Verwendung einer Druckmesseinrichtung zur Herstellung einer Vorrichtung zur Einführung eines Nucleotids in lebende Zellen in einem Gewebe in vivo, wobei:

a) die Vorrichtung angepasst ist, um das Nucleotid in die extrazelluläre Umgebung der lebenden Zellen einzuführen; und

b) die Vorrichtung ferner angepasst ist, um einen lnkubationsüberdruck um das Gewebe aufzubauen, um dadurch die Aufnahme des Nucleotids in die lebenden Zellen zu bewirken.

16. Verwendung einer Druckmesseinrichtung zur Herstellung einer Vorrichtung zur Einführung eines Nucleotids in lebende Zellen in einem Gewebe in vivo, wobei:

a) die Vorrichtung angepasst ist, um das Nucleotid in die extrazelluläre Umgebung der lebenden Zellen einzuführen;

b) die Vorrichtung ferner angepasst ist, um eine Umschließung zu definieren, welche die lebenden Zellen und die extrazelluläre Umgebung umfasst; und

c) die Vorrichtung ferner angepasst ist, um einen Inkubationsüberdruck in der Umschließung aufzubauen, um dadurch die Aufnahme des Nucleotids in die lebenden Zellen zu bewirken.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der gesamte Organismus in die Umschließung eingebracht wird.