DE69618460T2

DE69618460T2 - Verfahren zum nachweis von nukleinsäuresequenzen unter verwendung von kompetitiven amplifikation

Info

Publication number: DE69618460T2
Application number: DE69618460T
Authority: DE
Inventors: Larry Birkenmeyer; K. Mushahwar
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2002-09-26
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: ES2171679T3; EP0832281B1; WO1996040996A1; ATE211771T1; DE69618460D1; US5667974A; JPH11506613A; CA2223823A1; US5955598A; EP0832281A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis einer Nukleinsäuresequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann, und insbesondere ein Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Nukleinsäuresequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann.

Hintergrund der Erfindung

Verfahren zur Amplifikation einer Targetnukleinsäuresequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann, sind derzeit im Fachgebiet wohl bekannt. Solche Verfahren umfassen die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Ligasekettenreaktion (LCR). Diese Verfahren haben im Bereich der medizinischen Diagnostik breite Anwendung gefunden als auch in den Bereichen der Genetik, Molekularbiologie und Biochemie.
Bei der PCR wird ein Paar von Primern im Überschuß verwendet, um an den äußeren Enden komplementärer Stränge der Targetnukleinsäure zu hybridisieren. Die Primer werden jeweils durch eine Polymerase verlängert, wobei die Targetnukleinsäure als Matrize verwendet wird. Die Verlängerungsprodukte werden nach der Ablösung von dem ursprünglichen Targetstrang ihrerseits Targetsequenzen. Neue Primer werden dann hybridisiert und durch eine Polymerase verlängert, und der Zyklus wird wiederholt um die Anzahl von Targetsequenzmolekülen geometrisch zu erhöhen. Die PCR ist in den U. S. Patenten Nr. 4.683.195 und 4.683.202 offengelegt.
Die LCR ist ein alternativer Mechanismus zur Targetamplifikation. Bei der LCR werden zwei Sense (erste und zweite) Sonden und zwei Antisense (dritte und vierte) Sonden im Überschuß gegenüber dem Target verwendet. Die erste Sonde hybridisiert an ein erstes Segment des Targetstranges, und die zweite Sonde hybridisiert an ein zweites Segment des Targetstranges, wobei die ersten und zweiten Segmente aneinander angrenzend positioniert sind, so daß die primären Sonden in ein fusioniertes Produkt ligiert werden können. Weiterhin kann eine dritte (sekundäre) Sonde an einen Anteil der ersten Sonde hybridisieren, und eine vierte (sekundäre) Sonde kann an einen Anteil der zweiten Sonde in einer ähnlichen ligierbaren Art hybridisieren. Falls das Target ursprünglich doppelsträngig ist, werden die sekundären Sonden ebenfalls an das Targetkomplement zu Beginn hybridisieren. Sobald der fusionierte Strang von Sense- und Antisensesonden von dem Targetstrang getrennt wird, wird er mit den dritten und vierten Sonden hybridisieren, welche ligiert werden können, um ein komplementäres, sekundär fusioniertes Produkt zu bilden. Die fusionierten Produkte sind funktional gleichwertig entweder zu dem Target oder zu seinem Komplement. Durch wiederholte Zyklen von Hybridisation und Ligation wird eine Amplifikation der Targetsequenz erzielt. Diese Technik ist beschrieben in EP-A-320 308. WO-A-93 20227 beschreibt eine Multiplexligasekettenreaktion. Andere Aspekte der LCR Technik wie zum Beispiel die Lücken-LCR (GLCR) sind beschrieben in EP-A-439 182 von K. C. Backman et al..
Unglücklicherweise ist es ein Nachteil von Nukleinsäureamplifikationsreaktionen, daß diese im wesentlichen qualitativ sind. Die Art der Amplifikationsreaktionen erschwert deren Anwendung zur quantitativen Bestimmung der Anwesenheit einer Targetsequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann. Demzufolge können traditionelle Amplifikationsreaktionen im allgemeinen nicht verwendet werden um die Quantität einer Targetsequenz in einer Testprobe zu bestimmen, wogegen traditionelle Amplifikationsreaktionen nützlich sind zum Nachweis einer minimalen Quantität einer Targetsequenz in einer Testprobe.
Einige traditionelle Amplifikationsreaktionen wurden verändert, um quantitative Amplifikationsreaktionsanalysen zu ermöglichen. Eine solche quantitative Amplifikationsreaktion wird "kompetitive Amplifikation" genannt. Dieses Verfahren wird üblicherweise auf die PCR angewendet. Gemäß diesem Verfahren kompetitieren eine Standardnukleinsäuresequenz mit einer Targetsequenz während der Amplifikationsreaktion. Im allgemeinen werden die Standardsequenz und eine Probe, von der angenommen wird, eine Targetsequenz zu enthalten, in einer Verdünnungsserie kombiniert, in der die Menge der Standardsequenz in allen Teilen dieser Serie konstant ist. Alternativ werden die Standardsequenz und die Probensequenz in einer Verdünnungsserie kombiniert, in der die Menge der Standardsequenz innerhalb der Bestandteile der Verdünnungsserie variiert wird. In jedem Fall ist die Konzentration der Standardsequenz in den Bestandteilen der Verdünnungsserie bekannt. Die PCR wird dann an allen Bestandteilen der Verdünnungsserie durchgeführt und führt zu der Herstellung einer Mischung von zwei Nukleinsäurearten. Eine Art ist abgeleitet aus der Standardsequenz und die zweite Art ist abgeleitet aus der Probensequenz. Die Konzentration von jeder Art in einer bestimmten Verdünnung ist abhängig von der Anzahl von Kopien der Standard- und der Probensequenzen in der Verdünnung vor der Amplifikation. Während der Amplifikationsreaktion werden nachweisbare Gruppen üblicherweise in beide Arten von Sequenzen eingeführt. Nach der Amplifikation werden die beiden Arten getrennt und die Menge der Nachweisgruppe, die in jede Art eingebaut wurde, wird nachgewiesen. Dieses Nachweisverfahren wird für jeden Bestandteil der Verdünnungsserie durchgeführt. Eine Kompetitivkurve kann dann erzeugt werden und die Menge von Probensequenz kann dann erzeugt werden und die Menge von Probensequenz kann extrapoliert werden, basierend auf den bekannten Mengen von Standardsequenz.
Verfahren zur kompetitiven Amplifikation wurden in U. S. Patent Nr. 5.219.727 beschrieben, Jalava et al., BioTechniques 15: 134-39 (1993) und in WO-A-93 02215. Obwohl diese kompetitiven Amplifikationstechniken ihren Nutzen bewiesen haben, erfordern sie wesentliche Mengen von Probenvorbereitungszeit, wie auch das Eingreifen von Technikern, und eine begleitendes Risiko der Probenkontamination. Zusätzlich erfordert die Durchführung einer Amplifikation an Bestandteilen einer Verdünnungsserie mehr Reagenzien, als das Durchführen einer Amplifikation an einer Einzelprobe. Alle diese Faktoren addieren sich zu den Kosten der Durchführung von kompetitiven Amplifikationsreaktionen.
Darüber hinaus umfassen alle Verfahren gemäß dem Stand der Technik PCR-Amplifikationen bei denen der mittlere Teil der Standardsequenz vollständig ohne Bezug zu der nachzuweisenden Targetsequenz ist, und durch Target spezifische Primer begrenzt wird, zur Anwendung als Unterscheidungsmerkmal des Standards von der Targetsequenz. Somit werden die beiden Sequenzen leicht unterschieden. Ein solches Verfahren ist nicht vereinbar mit der LCR-Amplifikation, da der mittlere Teil sowohl des Targets wie der Standardsequenz wesentlich ist für den Erfolg der Amplifikationsreaktion. Es existierte vor der Erfindung der Anmelder kein Verfahren zur Unterscheidung einer Standardsequenz von einer Targetsequenz unter Verwendung der LCR-Amplifikation gemäß dem Stand der Technik.
Somit besteht ein Bedürfnis für ein Verfahren zur quantitativen Durchführung einer Amplifikationsreaktion, worin der mittlere Teil der Standardsequenz im wesentlichen gleich ist zu der Targetsequenz, welche nicht die Amplifikation einer Serie von Konzentrationsstandards neben jedem zu quantifizierenden Assay erforderte, und welches in einer klinischen Laboreinrichtung verwendet werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis der Menge einer Targetnukleinsäuresequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann, zur Verfügung, das folgende Schritte umfaßt:
(a) In Kontakt bringen der Testprobe mit einem Mittel zur Durchführung einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion und:
(i) zwei Target-Primersets, wobei ein erstes Primerset eine erste Targetsequenz repräsentiert und ein zweites Primerset eine zweite Targetsequenz innerhalb des Genoms der Targetnukleinsäure repräsentiert, und worin jedes Primerset vier Oligonukleotidprimer umfaßt, von denen zwei Sense Primer und die anderen zwei Antisense Primer sind,
(ii) einer internen Standard (IS) -Sequenz, worin die IS- Sequenz im wesentlichen von einer Kombination der ersten Targetsequenz und der zweiten Targetsequenz abgeleitet ist,
(iii) einem IS-Primerset, wobei das IS-Primerset vier Oligonukleotidprimer umfaßt, von denen zwei von der ersten Targetsequenz und die anderen zwei von der zweiten Targetsequenz abgeleitet sind, und
(iv) einem Satz von dNTPs, unter hybridisierenden Bedingungen, so daß für jedes Paar von Target-Oligonukleotid- Primersequenzen oder IS-Oligonukleotid-Primersequenzen, das an jeden Strang der Targetsequenzen oder der IS-Sequenz oder seinen komplementären Strang hybridisiert, eine Ligasereaktion stattfindet, wobei die Nukleotidlücke zwischen den Oligonukleotid-Primersequenzen durch die dNTP's in Anwesenheit der Targetnukleinsäuresequenz gefüllt wird, wobei jede der Ligasereaktionen den gleichen Satz an dNTWs erfordert, oder einen Unter-Satz davon, um die Lücke zu füllen; und
(b) Bestimmen des Verhältnisses von Target- Amplifikationsprodukten zu IS-Amplifikationsprodukten, die in der Testprobe anwesend sind.
Das oben beschriebene Verfahren der Erfindung kann ebenfalls verwendet werden um zwischen zwei unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen zu unterscheiden, welche in einer Testprobe vorhanden sein können, insbesondere wenn eine der beiden Nukleinsäuresequenzen eine Mutation oder Allele der anderen Nukleinsäuresequenz enthält.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das hierin beschriebene Verfahren ist anwendbar auf Nukleinsäureamplifikationsreaktionen (hiernach "Amplifikationsreaktion"), welche Primersets (ebenfalls bezeichnet als "Sondenset") verwenden, um eine Targetnukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Kurz ausgedrückt verwendet das Verfahren zwei Targetprimersets, wobei jedes Primerset eine unterschiedliche Targetsequenz innerhalb des Genoms der Targetnukleinsäuresequenz darstellt, d. h. um eine erste Targetsequenz und eine zweite Targetsequenz zu ergeben, bei einer Amplifikationsreaktion zur quantitativen Bestimmung der Konzentration einer Targetsequenz, welche in einer Testprobe vorhanden sein kann. Zusätzlich verwendet das Verfahren eine interne Standard (IS) Sequenz, welche eine Sequenz umfaßt, welche im wesentlichen abgeleitet ist aus einer Kombination der ersten Targetsequenz und der zweiten Targetsequenz und seinem entsprechenden IS Primerset. In diesem Verfahren kompetitieren die beiden Targetsequenzen und die IS Sequenz um die gleichen Oligonukleotidprimer, welche die Target- und IS Primersets umfassen. Das Verfahren umfaßt im allgemeinen das in Kontakt bringen einer Testprobe, von der angenommen wird, eine Targetsequenz mit zwei Targetprimersets zu enthalten, eine IS Sequenz und ihr entsprechendes IS Primerset und dNTPs unter Hybridisierungsbedinungen um eine Reaktionsmischung zu bilden. Diese Reaktionsmischung wird Zyklen unterworfen, um den Oligonukleotidprimersequenzen zu gestatten mit den entsprechenden Targetsequenzen oder der IS Sequenz und seinem komplementären Strang über eine Ligasereaktion zu hybridisieren, und somit zu amplifizieren. Das Vorhandensein von jeglichen amplifizierten Targetsequenzen oder IS Sequenzen kann dann nachgewiesen werden.
Eine Targetprimerserie umfaßt zwei Primersets, wobei jedes Set von Primern eine unterschiedliche Targetsequenz innerhalb des Genoms der Targetnukleinsäuresequenz darstellt. Ein erstes Primerset stellt eine erste Targetsequenz und ein zweites Primerset stellt eine zweite Targetsequenz dar. Bei der Beschreibung der Erfindung wird die erste Targetsequenz als "Target X" bezeichnet und die zweite Targetsequenz wird als "Target Y" bezeichnet. Jedes Targetprimerset umfaßt vier Oligonukleotidprimer, von denen zwei Sense Primer sind und die anderen beiden Antisense Primer sind.
Die IS Sequenz ist im wesentlichen aus einer Kombination der ersten Targetsequenz und der zweiten Targetsequenz der Targetnukleinsäure abgeleitet. Wie in dem Verfahren der Erfindung verwendet, kann die IS Sequenz einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Das entsprechende IS Primerset umfaßt ebenfalls vier Oligonukleotidprimer, von denen zwei abgeleitet sind aus der ersten Targetsequenz und die anderen beiden aus der zweiten Targetsequenz.
In einer alternativen Ausführungsform kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden um quantitativ nur eine der beiden Targetsequenzen X und Y nachzuweisen, in dem die Oligonukleotidprimer verwendet werden, welche spezifisch für die besondere nachzuweisende Targetsequenz sind, eine IS Sequenz und ihr entsprechendes IS Primerset. Bei der Amplifikationsreaktion kompetitieren die Targetsequenzen X oder Y und die IS Sequenz, um die gleichen beiden geteilten Oligonukleotidprimer, welche die Primersets der Targetsequenzen X oder Y und den internen Standard umfassen. Die anderen beiden Oligonukleotidprimer des IS Primersets können jede Sequenz sein, die wirksam bei der LCR teilnehmen, während sie gleichzeitig nicht mit der Amplifikation der nachzuweisenden Targetsequenz interferieren.
Eine Testprobe ist üblicherweise jeder Bestandteil des Körpers eines Individuums, welcher eine Targetnukleinsäure von Interesse enthalten kann. Testproben können unter Verwendung von Verfahrensweisen hergestellt werden, welche im Fachgebiet wohlbekannt sind, wie z. B. der Entnahme einer Probe von einem Patienten, und, falls notwendig, das Zerreißen jeglicher darin enthaltenden Zellen zur Freisetzung von Nukleinsäuren.
Eine Targetnukleinsäuresequenz ist üblicherweise eine Nukleinsäuresequenz (z. B. RNA oder DNA), welche mindestens zwei Targetsequenzen enthält, an die Mitglieder der Targetprimerserie hybridisieren. Im Falle von RNA Targetsequenzen, ist es offensichtlich, das eine cDNA Kopie der RNA Targetsequenz vor der Amplifikationsreaktion synthetisiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegen beide Targetsequenzen und somit ihre entsprechenden Primersets üblicherweise innerhalb des Genoms der Targetnukleinsäuresequenz. Diese Eigenschaft der Erfindung liefert den Vorteil, daß das Risiko reduziert wird, das die Targetnukleinsäuresequenz in der Amplifikationsreaktion aufgrund der Tatsache das entweder die erste oder zweite Targetsequenzen in der Testprobe gelöscht oder anderweitig verändert wird nicht nachgewiesen wird. Weiterhin stellen üblicherweise beide Primersets Targetsequenzen dar, welche hochgradig in dem Genom der nachzuweisenden Targetnukleinsäure erhalten sind. Diese Eigenschaft der Erfindung liefert den Vorteil, daß das Risiko reduziert wird, daß die Targetnukleinsäuresequenz bei der Amplifikationsreaktion aufgrund des Vorhandenseins einer Variante der Sequenz in der Testprobe nicht nachgewiesen wird. Falls beispielsweise die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz aus einem bakteriellen oder viralen Genom stammt, sollten die Primersets Targetsequenzen von jenen Genprodukten darstellen, welche jeweils hochgradig innerhalb der bakteriellen Stämme oder viralen Isolate erhalten sind.
Beispielsweise kann die Targetsequenz das Genom von einem Virus, wie z. B. Hepatitis B umfassen und die Targetsequenzen können Regionen umfassen, welche üblicherweise in dem viralen Genom vorhanden sind, wie z. B. das Oberflächenantigen, das Coreantigengen und das Precoreantigengen. Alternativ können beide Targetsequenzen innerhalb einer beliebigen Region der beiden oben erwähnten Regionen vorhanden sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegen die beiden Targetsequenzen X und Y innerhalb unterschiedlicher Genome. Diese Ausführungsform ist besonders nützlich für den Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von verwandten Organismen. Beispielsweise kann in einer Amplifikationsreaktion zum Nachweis von HIV die erste Targetsequenz von einer Region des HIV-1 Genoms abgeleitet sein, und die zweite Targetsequenz kann aus der gleichen Region abgeleitet sein, oder alternativ, von einer unterschiedlichen Region des HIV-2 Genoms.
Die Targetnukleinsäuresequenz kann einsträngig, doppelsträngig, kontinuierlich oder fragmentiert sein, solang Anteile davon ausreichend kontinuierlich sind, damit die einzelnen Targetprimersets hybridisieren können und somit eine beliebige spezifische Targetsequenz amplifizieren. Während die Sequenzen des gesamten Genoms der Targetnukleinsäuresequenz nicht bekannt sein können, ist es im allgemeinen der Fall, daß zumindest die Targetsequenz, welche die Targetprimersets umfaßt, bekannt ist.
Obwohl es keine minimale Längenerfordernisse für die nachzuweisende Targetnukleinsäuresequenz bei einer Amplifikationsreaktion gibt, ist üblicherweise jeder Oligonukleotidprimer eines Primersets aus etwa 18 bis etwa 25 Basenpaare zusammengesetzt, was bedeutet, daß die ligierten Primerpaare etwa 50 Nukleotide aufweisen.
Targetprimerserien zusammen mit einer IS Sequenz und ihren entsprechenden Primern können in einer Amplifikationsreaktion verwendet werden, um quantitativ die Menge einer Targetsequenz in einer Testprobe zu bestimmen. Amplifikationsreaktionen wie z. B. die LCR und die GLCR sind im Fachgebiet bekannt. Diese Reaktionen verwenden üblicherweise Primer um wiederholt Kopien einer Targetnukleinsäuresequenz zu erzeugen, welche üblicherweise eine kleine Region einer viel größeren Nukleinsäuresequenz ist. Primer sind selbst Nukleinsäuresequenzen, welche komplementär zur Regionen einer Targetsequenz sind und welche unter geeigneten Bedingungen an die komplementären Regionen der Targetsequenz hybridisieren oder binden. Kopien der Targetsequenz werden üblicherweise durch das Verfahren der Primerligation erzeugt, welches Enzyme mit einer Ligaseaktivität verwendet, um angrenzende Primerpaare zu ligieren. Während enzymatische Verfahren der Ligation überwiegen, sind auch andere Verfahren wie z. B. die chemische Ligation gleichermaßen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Nukleotide, welche zu den Primern oder Sonden als Monomere oder vorgeformte Oligomere zugesetzt werden, sind ebenfalls komplementär zu der Targetsequenz. Sobald die Primer ausreichend ligiert sind, werden sie von der Targetsequenz getrennt, üblicherweise durch das Erhitzen der Reaktionsmischung zu einer "Schmelztemperatur", welche jene ist, an der die komplementären Nukleinsäurestränge dissoziieren. Auf diesem Wege wird eine Sequenz gebildet, die komplementär ist zu der Targetsequenz.
Ein neuer Amplifikationszyklus kann dann stattfinden, um die Anzahl von Targetsequenzen weiter zu amplifizieren, indem jegliche doppelsträngige Sequenzen getrennt werden, indem Primern gestattet wird an ihre jeweiligen Targets zu hybridisieren, indem die hybridisierten Primer ligiert werden, und indem erneut getrennt wird. Die komplementären Sequenzen, welche durch die Amplifikationszyklen gebildet werden, können als Matrizen für Primer oder Sondenverlängerungen dienen, um die Anzahl von Targetsequenzen weiter zu amplifizieren. Somit werden multiple Kopien der Targetsequenz und seiner komplementären Sequenz erzeugt.
Im allgemeinen werden bei der LCR vier Primer verwendet, von denen zwei komplementär zu einem Anteil des Targetstranges und die anderen beiden komplementär zu seinem Komplement sind. Andere Reagenzien, die in Amplifikationsreaktionen verwendet werden, kollektiv bezeichnet als Mittel zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion, sind wohl bekannt und umfassen: Enzymcofaktoren wie z. B. Magnesium, Salze, Nikotinamidadenindinukleotid (NAD), und Deoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) wie beispielsweise Adenintriphosphat, Guanintriphosphat, Cytosintriphosphat und Thymintriphosphat.
Bei dem Verfahren der Erfindung wird eine Reaktionsmischung vorzugsweise zwischen etwa 15 und etwa 60 umlaufen, stärker bevorzugt zwischen etwa 20 und etwa 45 Zyklen. Es sollte ebenfalls verstanden werden, das die Konzentrationen von beispielsweise den Nukleotidtriphosphaten, Enzymen und in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Cofaktoren höher sein können, als jene die üblicherweise in einer typischen Amplifikationsreaktion verwendet werden.
Nachdem eine Targetprimerserie, IS Sequenz und ihr entsprechendes Primerset in einer Amplifikationsreaktion verwendet werden, können amplifizierte Targetsequenzprodukte (ebenfalls bezeichnet als "Targetamplifikationsprodukte") und amplifizierte IS Sequenzprodukte (ebenfalls bezeichnet als "IS Amplifikationsprodukte") nachgewiesen werden. In einer Ausführungsform wird der Nachweis von amplifizierten Targetsequenzprodukten getrennt von dem Nachweis von amplifzierten IS Sequenzprodukten in zwei Reaktionen. Alternativ können in einer anderen Ausführungsform der Erfindung der Nachweis der Targetamplifikationsprodukte und IS Amplifikationsprodukte in einer Nachweisreaktion durchgeführt werden, worin die Targetamplifikationsprodukte und IS Amplifikationsprodukte in einer solchen Art markiert sind, daß die beiden Amplifikationsprodukte unterscheidbar sind. Zum Beispiel könnten die Targetamplifikationsprodukte an einen fluoreszierenden Marker angeheftet sein, dessen Fluoreszenz bei einer Wellenlänge liegt, wogegen die IS Amplifikationsprodukte an einen fluoreszierenden Marker angeheftet sind, dessen Fluoreszenz bei einer zweiten Wellenlänge liegt. Beide Wellenlängen könnten in einer Reaktionsmischung abgelesen werden.
Bei der Ausführungsform der Erfindung, worin zwei getrennte Reaktionen stattfinden, können nach der Amplifikationsreaktion, die amplifizierten Targetsequenzprodukte und amplifizierten IS Sequenzprodukte durch den Einsatz einzigartiger Fangreagenzien nachgewiesen werden, welche auf einer festen Phase immobilisiert sind, so daß jedes Fangreagenz ein einzigartiges amplifziertes Produkt immobilisiert, z. B. Targetsequenz X, Targetsequenz Y oder die IS Sequenz. Alternativ immobilisiert bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, ein erstes Fangreagenz die Targetamplifikationsprodukte und ein zweites Fangreagenz immobilisiert die 15 Amplifikationsprodukte. Fangreagenzien umfassen üblicherweise "Mitglieder eines spezifischen Bindungspaares", welche direkt oder indirekt ein spezifische Bindungspaar mit den amplifizierten Produkten bilden können. Wie hierin verwendet, bezeichnet spezifisches Bindungsglied ein Glied eines Bindungspaares, z. B. zwei unterschiedliche Moleküle worin eines der Moleküle über, beispielsweise, chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das andere Molekül bindet. Außer den Antigen und Antikörper spezifischen Bindungspaaren, umfassen andere spezifische Bindungspaare, sind jedoch nicht beschränkt auf diese, Avidin und Biotin, Haptene wie Adamantan und Carbazol, welche beschrieben sind in der PCT Anmeldungs-Nrn. PCT/US93/05534 und PCT/US93/06832, und Hapten spezifische Antikörper, komplementäre Nukleotidsequenzen, Enzymcofaktoren oder Substrate und Enzyme und dergleichen. Entsprechend einer Ausführungsform ist das Fangreagenz, welches zum Nachweis der Targetamplifikationsprodukte verwendet wird, unterschiedlich von dem Fangreagenz, welches zum Nachweis der IS Amplifikationsprodukte verwendet wird.
Feste Phase bezeichnet jegliches Material, welches unlöslich ist, oder welches durch eine folgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann durch ihre intrinsischen Fähigkeit ein Bindungsglied anzuziehen und zu immobilisieren ausgewählt werden. Alternativ kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor enthalten, welcher die Fähigkeit hat, ein Bindungsglied anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz umfassen, welche gegensätzlich hinsichtlich eines Bindungsgliedes geladen ist, oder hinsichtlich einer geladenen Substanz, welche an ein Bindungsglied konjugiert ist. Als eine weitere Alternative kann das Rezeptormolekül jedes spezifische Bindungsglied sein, welches immobilisiert ist (angeheftet ist) an der festen Phase und welches die Fähigkeit hat ein weiteres Bindungsglied über eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül erlaubt vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays die indirekte Bindung eines Bindungsgliedes an eine feste Phase Material. Die feste Phase kann somit beispielsweise Latex, Plastik, abgeleitetes Plastik, magnetisches oder nicht magnetisches Metall, Glas oder eine Silikonoberfläche oder die Oberflächen von Teströhren, Microtiterkammern, Blätter, Kugeln, Mikropartikeln, Chips und andere Konfigurationen sein, die im Fachgebiet bekannt sind. Es ist ebenfalls innerhalb des Bereiches der Erfindung, daß die feste Phase jegliches geeignetes poröses Material mit ausreichender Porösität umfaßt, um, falls notwendig, den Zugang durch ein Konjugat zu gestatten. Mikroporöse Strukturen werden im allgemeinen bevorzugt, aber Materialien mit Genstruktur in hydriertem Zustand können ebenfalls verwendet werden. Die poröse Struktur von Nitrozellulose hat ausgezeichnete Absorptions- und Adsorptionsqualitäten für eine breite Vielzahl von Reagenzien, einschließlich Bindungsgliedern. Nylon besitzt ebenfalls ähnliche Charakteristika und ist ebenfalls geeignet. Solche Materialien können in geeigneten Formen verwendet werden, wie z. B. Filme, Blätter oder Platten oder sie können aufgebracht oder angeklebt oder laminiert werden auf geeignete inaktive Träger wie z. B. Papier, Glas, Plastikfilme oder Stoffe.
Es gibt eine Vielzahl von Arten in denen die Amplifikationsprodukte auf eine feste Phase immobilisiert werden können. Beispielsweise kann die feste Phase mit Polynukleotiden beschichtet werden, welche Bindungspaare bilden mit den Amplifikationsprodukten. Alternativ können die Amplifiaktionsprodukte mit indirekten Markern markiert sein, welche spezifische Bindungspaare mit einem Bindungsglied bilden, welches an die feste Phase angeheftet ist. Es ist offensichtlich, daß das spezifische Bindungsglied, welches an die feste Phase angeheftet ist, Bindungspaare mit allen Amplifikationsprodukten bilden kann, welche in einer Amplifikationsreaktion erzeugt werden können, oder multiple spezifische Bindungspaare, welche an die feste Phase angeheftet sind, können spezifisch sein für einzelne Amplifikationsprodukte, beispielsweise Targetsequenz X, Amplifikationsprodukte oder Targetsequenz Y Amplifikationsprodukte. Jene die im Fachgebiet bewandert sind, erkennen ebenfalls, daß es verschiedene Verfahren gibt und diese verwendet werden können um einen Marker in ein Amplifikationsprodukt einbringen zu können.
Nach dem die Targetamplifikationsprodukte, falls vorhanden, und IS Amplifikationsprodukte auf der festen Phase immobilisiert wurden, kann deren Vorhandensein unter Verwendung eines "Markers" darauf nachgewiesen werden. Der Ausdruck Marker bezeichnet ein Molekül oder einen Molekülteil, welcher eine Eigenschaft oder Charakteristik aufweist, welche nachgewiesen werden kann. Ein Marker kann direkt nachweisbar sein, wie beispielsweise Radioisotope, Fluorophore, Chemiluminophore, Enzyme, kolloidale Partikel, fluoreszierende Mikropartikel und dergleichen, oder ein Marker kann indirekt nachweisbar sein wie z. B. mittels spezifischer Bindungsglieder. Es ist offensichtlich, daß direkte Marker zusätzliche Bestandteile erfordern können, wie z. B. Substrate, triggernde Reagenzien, Licht und dergleichen um den Nachweis des Markers zu ermöglichen. Falls indirekte Marker zum Nachweis verwendet werden, werden sie üblicherweise in Verbindung mit einem "Konjugat" verwendet. Ein Konjugat ist üblicherweise ein spezifisches Bindungsglied, welches an einem direkt nachweisbaren Marker angeheftet oder gekoppelt wurde. Die Kopplungschemie zur Synthetisierung eines Konjugats sind im Fachgebiet wohl bekannt und können beispielsweise jegliches chemische Mittel und/oder physikalische Mittel umfassen, welches nicht spezifische Bindungseigenschaften des spezifischen Bindungsgliedes auf den nachweisbaren Anteil des Markers zerstört.
Somit kann in dem Fall der amplifizierten Produkte, welche auf eine feste Phase immobilisiert wurden, die einen direkt nachweisbaren Marker tragen, das immobilisierte amplifizierte Produkt direkt nachgewiesen werden. In den Fällen in dem die amplifizierten Produkte einen indirekten Marker tragen, kann ein Konjugat verwendet werden, welches ein Bindungsglied umfaßt, das spezifisch ist für den indirekten Marker, um das Vorhandensein des amplifizierten Produktes auf der festen Phase nachzuweisen.
Die verschiedenen Amplifikationsprodukte können durch das Markieren der verschiedenen Amplifikationsprodukte mit unterscheidbaren Markern unterschieden werden. Beispielsweise kann jedes Amplifikationsprodukt direkt oder indirekt mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert sein, welche Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen aussenden. Alternativ kann jedes Amplifikationsprodukt mit einem unterschiedlichen Enzym markiert werden, welches jeweils ein Signal bei Vorhandensein eines unterschiedlichen fluorogenen Substrates aussendet. Als eine weitere Alternative können die Amplifikationsprodukte basierend auf dem Zeitpunkt unterschieden werden, an dem die Marker ein Signal erzeugen. Spezifisch kann das Signal von einem Fluorophor und Enzym durch das Ablesen eines konstanten Signals von dem einen Fluorophor und das Ablesen eines Geschwindigkeitssignals von dem Enzym unterschieden werden, wodurch das konstante Signal, falls vorhanden, ein Ausgangsliniensignal erstellt, von dem das Geschwindigkeitssignal aus startet. Ein solches Nachweisverfahren wurde in WO-A-96 19731 beschrieben.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Testprobe, welche eine Targetnukleinsäuresequenz enthalten kann, die die Targetsequenzen X und Y umfaßt, in Kontakt gebracht mit zwei Primersets, wobei das erste Primerset spezifisch ist für das Target X und die Oligonukleotidprimer 1, 2, 3 und 4 umfaßt, und das zweite Set spezifisch ist für Target Y und die Oligonukleotidprimer 5, 6, 7 und 8 umfaßt. Die Testprobe wird zum gleichen Zeitpunkt ebenfalls mit einer internen Standardsequenz IS und seinen entsprechenden Oligonukleotidprimern 1, 2, 5 und 6 in Kontakt gebracht. Die Haptene A, B und C werden mit den Oligonukleotidprimersets in einer solchen Art assoziiert, daß die amplifizierten Targetsequenzprodukte X und Y durch Einfangen auf Mikropartikeln nachgewiesen werden, an welche Anti- Haptenantikörperfangreagenzien angeheftet sind. Die Amplifikationsprodukte X und Y werden durch Anti-B-Antikörper gefangen und ein Signal wird erzeugt mit einer Mischung von Anti-A-Antikörper und Anti-C-Antikörper, die mit einem Marker konjugiert sind, beispielsweise dem Enzym alkaline Phosphatase. Ähnlich werden die IS Amplifikationsprodukte durch Anti-A- Antikörper eingefangen und ein Signal wird erzeugt mit Anti-C- Antikörper, die mit einem Marker konjugiert sind, wie z. B. alkaliner Phosphatase. Ein Signalverhältnis von (X + Y)/S wird um die Menge von Targetnukleinsäuresequenz zu quantifizieren bestimmt, welche in der Probe vorhanden ist.
Gemäß den zugrunde liegenden Prinzipien des Verfahrens der Erfindung wird bei Fehlen von X und Y Targetsequenzen oder in Anwesenheit von geringen Mengen das Ausmaß der IS Targetamplifikation konstant bleiben. Da die Ausgangskonzentration der X und Y Targetsequenzen ansteigt, werden die vier Oligonukleotidprimer, welche bei der IS Amplifikation teilnehmen, um die gleichen Sequenzen kompetitieren, wie jene für die X und Y Targetamplifikation, da die gleichen vier Nukleotidprimer bei der X und Y Targetamplifikation teilnehmen. Somit wird das endgültige Niveau der 15 Amplifikation progressiv abnehmen, je mehr die Ausgangskonzentrationen von X und Y Targetsequenzen progressiv ansteigen.
Während des Verlaufs der Amplifikation können Hybridstrukturen zwischen den Targetamplifikationsprodukten und den IS Amplifikationsprodukten gebildet werden. Solche Hybride können bei der Ligation nicht teilnehmen, selbst wenn Oligonukleotide mit 3'-Hydroxylenden innerhalb solcher Betriebe weiter durch die DNA Polymerase verlängert werden können. Somit sollte, falls die Mengen von Amplifikationsprodukten zunehmen, es eine Erhöhung bei der Bildung solcher Hybride geben. Die wird seinerseits die Menge von IS Amplifikationsprodukten reduzieren, im Vergleich zu jeder Menge, welche erzeugt wurde, wären die ersten und zweiten Targetsequenzen nicht vorhanden. Das Verfahren der Erfindung ist so entwickelt, daß die Menge von IS Sequenz, welche in der Amplifikationsreaktion verwendet wird, so ist, daß die Hybridbildung nicht die Menge von X und Y Amplifikationsprodukten signifikant vermindert, welche im Verlauf der Reaktion gebildet werden.
Das Ausmaß der Hybridbildung in der Reaktionsmischung ist so, daß wahrscheinlich große Meßwerte von Strukturen gebildet werden, welche mehrere Oligonukleotide und Amplifikationsprodukte enthalten. Bei Vorhandensein von X und Y Targetsequenzen, können solche Hybride die Sensitivität des Target X und Target Y Nachweises erhöhen, da für jedes Hybrid, welches durch einen Anti-A-Antikörper gefangen ist, es zwei Sätze von Haptenen (z. B. B und C) gibt, welche durch ein markiertes Konjugat nachweisbar sind. Auf der anderen Seite sollten Hybridstrukturen keine falschen positiven Ergebnisse bewirken, da sie sich beim Fehlen der Targetsequenzen nicht bilden können.
Die 5' zu 3' Exonukleaseaktivität der DNA Polymerase kann die Hybridstrukturen, die oben beschrieben sind, abtrennen, in dem der ligierte Amplifikationsproduktstrang abgetrennt wird, an den der Oligonukleotidprimer, der verlängert wird, nicht hybridisiert. Damit der Strang durch die DNA Polymerase abgetrennt wird, muß der Strang stromaufwärts der Abtrennstelle (z. B., 5') einzelsträngig sein. Gegebenenfalls kann, damit die Polymerase die DNA abtrennt, die Sequenz des zu trennenden Stranges am 5' Ende nicht modifiziert sein. Somit wäre durch das haptenieren der 5' Enden der Oligonukleotidprimer 4 und 5, jedoch durch nicht haptenieren der 5' Enden der Oligonukleotidprimer 1 und 8, beide Stränge der amplifizierten IS Sequenz empfänglich gegenüber einer Abtrennung, wogegen sowohl das X als auch das Y amplifizierte Sequenzprodukt von einer Zertrennung geschützt wird.
Das daraus folgende Ergebnis wäre, daß die IS Amplifikationsprodukte abgetrennt würden, wodurch das Signal, das durch IS Amplifikationsprodukte erzeugt wird, vermindert wird, wogegen die X und Y Amplifikationsprodukte nicht abgetrennt wurden, wodurch das Signal, das durch die Targetamplifikationsprodukte erzeugt wird, erhalten wird, und was deren Teilnahme an folgenden Amplifikationszyklen gestattet. Die Abtrennung würde während der Durchführung der Zyklen und später durch das Einschließen einer abschließenden Inkubation bei oder kurz unterhalb der Tm der Nukleotidprimer 2 und 7 auftreten. Dies würde zum Vorhandensein von IS Amplifikationsprodukten in einer abtrennbaren Konformation führen (z. B. eine verzweigte Hybridstruktur in der der 5'-Arm der Gabel einzelsträngig ist). Es ist offensichtlich, daß eine solche Abtrennung nicht auftritt, falls die verwendete Polymerase keine 5' zu 3' Exonukleaseaktivität besitzt.
Gemäß der Theorie der Erfindung würde, während das Signal der Targetsequenzen X und Y während der Erzeugung der Amplifikationsprodukte über den Verlauf der Amplifikationsreaktion ansteigt und dann ein konstantes Niveau erreicht, das IS Signal bei einem konstanten Niveau beginnen und dann aufgrund der Oligonukleotidprimerkompetition abnehmen, der möglichen Formation von nicht ligierbaren Hydriden, und der möglichen Exonukleaseabtrennung der IS Amplifikationsprodukten wie oben beschrieben.
Die Menge von X und Y in einer Testprobe kann durch das Bestimmen des Signalverhältnisses von (X + Y)/IS für die Probe auf einer Standardkurve nachgewiesen werden, erzeugt durch das Darstellen von (X + Y)/IS gegen bekannte Ausgangskonzentrationen der Targetsequenzen X und Y in der Amplifikationsreaktion. Durch das Bestimmen des Verhältnisses von dem Signal erzeugt durch die Targetamplifikationsprodukte (X + Y) zu dem Signal erzeugt durch die IS Amplifikationsprodukte, kann man die ursprünglichen Mengen von X und Y Target in der Probe ableiten.
Die folgenden Beispiele werden geliefert, um die vorliegende Erfindung weiter darzustellen, und sind nicht als Einschränkung für die Reichweite der Erfindung gedacht, welche durch die anhängigen Ansprüche definiert sind.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

QUANTITATIVE LCR AMPLIFIKATIONEN VON HBV

Zwei Targetsequenzen wurden coamplifiziert mit einer IS Targetsequenz unter Verwendung einer GLCR Amplifikation. Eine Targetsequenz, Targetsequenz X (Sequenzidentifikations-Nr. 1), wurde tatsächlich in Duplexform verwendet, obwohl sie aus Gründen der Einfachheit als Einzelstrang dargestellt ist. Sequenzidentifikations-Nr. 1 entspricht den Map-Positionen 180 bis 225 des Hepatitis B Virus (HBV), wie beschrieben von Ono et al., Nucleic Acids Research 11: 1747-57 (1983). Die andere Targetsequenz, Targetsequenz Y (Sequenzidentifikations-Nr. 2), welche ebenfalls als Einzelstrang dargestellt ist, wurde ebenfalls in Duplexform verwendet. Sequenzidentifikations-Nr. 2 entspricht den Map-Positionen 658 bis 703 des HBV. Das Insert wurde aus dem HBV Subtyp ay geklont. Beide Sequenzen sind unterhalb in Tabelle 1 in einer 5' zu 3' Richtung dargestellt. TABELLE 1
Ein linearisiertes doppelsträngiges rekombinantes DNA Plasmid Y82-1 wurde erzeugt, welches die X und Y Targetsequenzen aus dem Vektor pUC19 enthielt. Das HBV Insert wurde aus einem BamHI Fragment des HVB Genoms abgeleitet, ca. 1400 Basenpaare lang, welches das komplette Oberflächenantigengen (S-Gen), einen Anteil des pre-S Gens und einen kleinen Teil des X Gens enthielt.
Target spezifische Sonden wurden um die obigen Targetsequenzen durch LCR zu amplifizieren und nachzuweisen entwickelt. Das erste Primerset war für Sequenzidentifikations- Nr. 1 und seinen komplementären Strang spezifisch. Beide Sonden aus diesem Set (Sequenzidentifikations-Nr. 3 und Sequenzidentifikations-Nr. 4) wurden mit Biotin hapteniert, welches als "Bio" bezeichnet ist. Die beiden restlichen Sonden aus diesem Satz (Sequenzidentifikations-Nr. 5 und Sequenzidentifikations-Nr. 6) wurden mit Fluorescein hapteniert, welches als "Fl" bezeichnet ist. Die 5' Enden der Sequenzidentifikations-Nr. 4 und Sequenzidentifikations-Nr. 5 waren funktionell mit einer Phosphatgruppe ausgestattet, welche als "p" bezeichnet ist, um die Ligation der Sequenzidentifikations-Nr. 3 an Sequenzidentifikations-Nr. 5 und die Ligation von Sequenzidentifikations-Nr. 4 an Sequenzidentifikations-Nr. 6 zu gestatten. Die Sequenzidentifikations-Nr. 4 und die Sequenzidentifikations-Nr. 6 hybridisierten mit den Sequenzidentifikations-Nr. 1 und die Sequenzidentifikations-Nr. 3 und die Sequenzidentifikations-Nr. 5 hybridisierten mit dem komplementären Strang zu Sequenzidentifikations-Nr. 1. Der Sondensatz, welcher verwendet wurde, um die Targetsequenz X zu amplifizieren und nachzuweisen, ist in Tabelle 2 gezeigt, worin die einzelnen Sonden in einer 5' zu 3' Ausrichtung aufgelistet sind.

TABELLE 2

Sequenzidentifikations-Nr. 5'-Sequenz-3'

3 BioTAGGACCCCTGCTCGTGTTACA
4 pAACACGAGCAGGGGTCCTABio
5 pCGGGGTITCTTGTTGACAAGFI
6 FICTTGTCAACAAGAAAAACCCCGCC
Ein zweites Primerset war für die Sequenzidentifikations- Nr. 2 und seinen komplementären Strang spezifisch. Zwei Sonden aus diesem Set (Sequenzidentifikations-Nr. 7 und Sequenzidentifikations-Nr. 8) wurden mit Adamantan hapteniert, welches als "Ad" bezeichnet ist. Die verbliebenen beiden Sonden aus diesem Satz (Sequenzidentifikations-Nr. 9 und Sequenzidentifikations-Nr. 10) wurden mit Fluorescein (Fl) hapteniert. Die 5' Enden der Sequenzidentifikations-Nr. 8 und Sequenzidentifikations-Nr. 9 waren funktionell mit einer Phosphatgruppe (p) ausgestattet, um die Ligation von Sequenzidentifikations-Nr. 7 an Sequenzidentifikations-Nr. 9 und die Ligation von Sequenzidentifikations-Nr. 8 an Sequenzidentifikations-Nr. 10 zu gestatten. Die Sequenzidentifikations-Nr. 8 und Sequenzidentifikations-Nr. 10 hybridisierten mit der Sequenzidentifikations-Nr. 2 und die Sequenzidentifikations-Nr. 7 und die Sequenzidentifikations-Nr. 9 hybridisierten mit dem komplementären Strang zur Sequenzidentifikations-Nr. 2. Der Sondensatz, welcher verwendet wird um die Targetsequenzen Y zu amplifizieren und nachzuweisen, ist in Tabelle 3 gezeigt, worin die einzelnen Sonden in einer 5' zu 3' Auflistung aufgelistet sind.

TABELLE 3

Sequenzidentifikations-Nr. 5'-Sequenz-3'

7 AdCCGTITCTCCTGGCTCAGTTTAC
8 pAAACTGAGCCAGGAGAAACGGAd
9 pAGTGCCATlTGTTCAGTGGTTCR
10 FIGAACCACTGAACAAATGGCACTA
Eine interne Standardsequenz wurde synthetisiert, welche eine Chimera aus der 5'-Hälfte der X Sequenz und dem komplementären Strang der 5'-Hälfte der Y Sequenz umfaßte. Das IS Target, welches verwendet wurde, war einzelsträngig. Die Sequenz ist unterhalb in Tabelle 4 in einer 5' zu 3' Ausrichtung gezeigt. TABELLE 4
Das für die Sequenzidentifikations-Nr. 11 und seinen komplementären Strang spezifische Primerset bestand aus dem vier Oligonukleotidprimern Sequenzidentifikations-Nr. 3, Sequenzidentifikations-Nr. 4, Sequenzidentifikations-Nr. 7 und Sequenzidentifikations-Nr. 8.
Das Plasmid Y82-1, welches die X und Y Targetsequenzen wie oben beschrieben enthielt, wurde in acht unterschiedlichen Konzentrationen in der Reaktion getestet, wie in Tabelle 5 unterhalb gezeigt, um die Targetsequenzen gemäß der GLCR, im wesentlichen wie beschrieben in EP-A-439.182, zu coamplifizieren. Konzentrierter 5X LCR Puffer, welcher in der Reaktion verwendet wurde, umfaßte 259 mM EPPS Puffer, pH-Wert 7,8, 50 mM MgCl&sub2;, 50 mM NH&sub4;Cl, 400 mM K&spplus; und 50 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA). Die LCR "Masterlösung" umfaßte die folgenden Bestandteile:

Bestandteil endgültige Konzentration

34 ul dGTP (50uM) 1uM
34 ul dGTP (50uM) 1uM
17 ul beta-NAD (10mM) 100uM
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 3 2.5 · 10¹&sup0;/ul
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 4 2.5 · 10¹&sup0;/ul
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 5 2.5 · 10/ul
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 6 2.5 · 10¹&sup0;/ul
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 7 2.5 · 10¹&sup0;/ul
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 8 2.5 · 10¹&sup0;/ul
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 9 2.5 · 10¹&sup0;/ul
4.25 ul Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 10 2.5 · 10¹&sup0;/ul
6.8 ul Targetsequenz DNA (100 Kopien/ul) 20 Kopien(LCR
3404 5X LCR Puffer
945.2 ul H&sub2;O

Die Enzymlösung umfaßte die folgenden Bestandteile:

Bestandteil Einheiten/LCR

175 ul Abbott Ligase (1360 Unites/ul) 6800
14 ul Amplitaq® Polymerase (5 Units/ul) 2
21 ul 1X LCR Puffer
Die Abbott Ligase ist von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, kommerziell verfügbar. Die Amplitaq® Polymerase ist von Cetus Corporation, Emeryville, CA, kommerziell erhältlich. 2,5 ul Y82- 1 wurde zu 41,5 ul LCR Masterlösung hinzugefügt. Die Mischung wurde gemischt und dann unter Verwendung einer Mikrofuge für mehrere Sekunden zentrifugiert um die Mischung abzusetzen. Ein Tropfen Mineralöl wurde zu jeder Mischung hinzugefügt und die Mischung wurde auf 100ºC für drei Minuten erhitzt und erneut zentrifugiert. Der Mischung wurde gestattet auf 75ºC abzukühlen, dann wurden sechs ul Enzymlösung hinzugefügt, um eine endgültiges Volumen von 50ul zu erzielen. Jede 50 ul Reaktion wurde in dreifacher Ausführungsform durchgeführt. Die zyklische Thermierung wurde in einem COY Tempcycler durchgeführt, kommerziell erhältlich von Coy Laboratory products, Inc., Ann Arbor, MI, für 40 Zyklen von 85ºC bis 30 Sekunden und 54ºC für 60 Sekunden. Nach dem Thermocycling wurden alle drei Replikate kombiniert. Der kombinierte LCR Pool wurde in Hälften aufgetrennt und in zwei getrennten IMx Assays analysiert. Jeder IMx Assay wurde doppelt durchgeführt. Der erste IMx Assay (Imx- 1) wurde entwickelt, um HBV X und Y Targetsequenzen nachzuweisen. Genauer gesagt, wurden 35 ul von jedem kombinierten LCR Pool in 35 ul IMx Linienverdünner hinzugefügt, kommerziell verfügbar von Abbott Laboratories. Mikropartikel, an welche Anti-Fluorescein Antikörper angeheftet waren, fingen die Oligonukleotide ein, welche mit Konjugat nachgewiesen wurden, welches ein 50/50 Verhältnis von Anti-Biotin Antikörper und Anti-Adamantan Antikörper enthielt, konjugiert in alkaliner Phosphatase (AP). Der zweite IMx Assay (Imx-2) wurde entwickelt, um die IS Targetsequenzen nachzuweisen. Fünfundreißig ul von jedem kombinierten LCR Pool wird 35 ul IMx Linienverdünner hinzugefügt. Mikropartikel, an welche Anti-Biotin Antikörper angeheftet waren, fingen die Oligonukleotide, welche mit Konjugat nachgewiesen wurden, das Anti-Adamantanantikörper konjugiert an AP enthielt. Die IMx Ergebnisse für jeden LCR Pool sind unten aufgelistet. TABELLE 5
Eine log : log Darstellung von Y82-1 Molekülen gegen das Verhältnis von IMx-1/IMx-2 zeigte, daß die Quantifizierung der Targetnukleinsäuresequenz über fünf Größenordnungen linear war.

BEISPIEL 2

NACHWEIS VON WILD-TYP UND MUTIERTEN FORMEN VON HBV PRECORE GEN UND OBERFLÄCHENANTIGEGEN

Das Verfahren kann verwendet werden, um zwischen dem Wild- Typ (Wt) und mutierten (Mut) Sequenzen für das HBV Oberflächenantigen (HbsAg) Codon 145 Mutation zu unterscheiden. Codon 145 des HbsAg Gens codiert die Aminosäureglycin. Jedoch ändert eine Punktmutation innerhalb dieses Codons die Aminosäure zu Arginin, was zu einem Phenotyp führt, welcher durch den Impfstoff nicht erfaßt wird. Die Wt Sequenz (Sequenzidentifikations-Nr. 12), wird in einer Duplexform verwendet, obwohl sie aus Gründen der Einfachheit als Einzelstrang dargestellt ist. Die Punktmutationen für die mutierte Sequenz (Sequenzidentifikations-Nr. 13) ist in Fettdruck dargestellt. Die Target spezifischen Sonden werden um die Wt und Mut Targetsequenzen durch LCR zu amplifizieren und nachzuweisen, wie in Tabelle 6 unterhalb gezeigt, verwendet. Das Primerset, welches für Sequenzidentifikations-Nr. 12 und seinen komplementären Strang spezifisch ist, umfaßt die Sequenzidentifikations-Nr. 14, Sequenzidentifikations-Nr. 15, Sequenzidentifikations-Nr. 16 und Sequenzidentifikations-Nr. 17. Die 5' Enden von Sequenzidentifikations-Nr. 15 und Sequenzidentifikations-Nr. 16 sind funktionell mit einer Phosphatgruppe (p) ausgestattet, um die Ligation von Sequenzidentifikations-Nr. 14 an Sequenzidentifikations-Nr. 16 und die Ligation von Sequenzidentifikations-Nr. 15 und Sequenzidentifikations-Nr. 17 zu gestatten. Sequenzidentifikations-Nr. 18 wird anstelle von Sequenzidentifikations-Nr. 14 für die mutierte Sequenzidentifikations-Nr. 13 ersetzt.
Ähnlich kann das Verfahren verwendet werden, um eine Punktmutation innerhalb des Codon 28 des HVB Precore Antigen (HBeAg) Gens nachzuweisen. Das Codon 28 kodiert die Aminosäuretryptophan. Jedoch ändert eine Punktmutation innerhalb dieses Codons die Aminosäure in ein Stopcodon, was zu einem HbeAg-Phenotyp führt. Eine oft assoziierte zweite Mutation tritt drei Basen weiter stromabwärts auf. Die Wt Sequenz (Sequenzidentifikations-Nr. 19) wird in Duplexform verwendet, obwohl sie aus Gründen der Einfachheit als Einzelstrom dargestellt ist. Die Punktmutationen der mutierten Sequenz (Sequenzidentifikations-Nr. 20) sind in Fettdruck dargestellt. Die Target spezifischen Sonden werden entwickelt, um die Wt und Mut Sequenzen durch LCR zu amplifizieren und nachzuweisen, wie in Tabelle 6 unterhalb gezeigt. Der Primersatz, welcher für die Sequenzidentifikations-Nr. 19 und seinen komplementären Strang spezifisch ist, umfaßt die Sequenzidentifikations-Nr. 21, Sequenzidentifikations-Nr. 22, Sequenzidentifikations-Nr. 23 und Sequenzidentifikations-Nr. 24. Die 5' Enden von den Sequenzidentifikations-Nr. 22 und Sequenzidentifikations-Nr. 23 waren funktionell mit einer Phosphatgruppe (p)ausgestattet, um die Ligation von Sequenzidentifikations-Nr. 21 an Sequenzidentifikations-Nr. 23 und die Ligation von Sequenzidentifikations-Nr. 22 an Sequenzidentifikations-Nr. 24 zu gestatten. Der Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations- Nr. 25 wird anstelle von Primer Sequenzidentifikations-Nr. 21 für die Einzelpunktmutation ersetzt.
Die IS Sequenz ist als Sequenzidentifikations-Nr. 26 in der Tabelle 6 unterhalb gezeigt. Das Primerset, welches für die Sequenzidentifikations-Nr. 26 und seinem komplementären Strang spezifisch ist, umfaßt die vier Oligonukleotidprimersets Sequenzidentifikations-Nr. 16, Sequenzidentifikations-Nr. 17, Sequenzidentifikations-Nr. 23 und Sequenzidentifikations-Nr. 24. Um einen kompetitiven LCR für das HBsAg Gen durchzuführen, werden die Oligonukleotide, die oben aufgelistet sind, für die Targetsequenzen, die man nachweisen will, entweder die Wt oder die Mut Sequenz, zusammen mit den Oligonukleotiden Sequenzidentifikations-Nr. 23 und Sequenzidentifikations-Nr. 24 verwendet. Um einen kompetitiven LCR für das HBeAg Gen durchzuführen, werden die oben aufgelisteten Nukleotide aus der Targetsequenz, die man nachweisen will, entweder der Wt oder der Mut Sequenz, zusammen mit den Oligonukleotiden Sequenzidentifikations-Nr. 16 und Sequenzidentifikations-Nr. 17 verwendet.
Alternativ können beide HBsAg und HBeAg kompetitiven LCR Assays durchgeführt werden, vorzugsweise beide Wt Assays oder beide Mut Assays zusammen, da sie die gleichen Nukleotiderfordernisse teilen. In diesem Fall wird IS stets amplifiziert, da die Oligonukleotidprimer Sequenzidentifikations-Nr. 16, Sequenzidentifikations-Nr. 17, Sequenzidentifikations-Nr. 23 und Sequenzidentifikations-Nr. 24 stets vorhanden sein werden. Zusätzliche dNTPs werden für Lückenfüllung an dem IS nicht benötigt, da nur dGTP erforderlich ist, welches sowieso in den anderen LCR Assays vorhanden sein würde. TABELLE 6
Unter Verwendung des IMx Formates, wie in Beispiel 1 beschrieben, würden die Wt und Mut HBsAg Amplifikationsprodukte auf Anti-Fluoresceinmikropartikeln gefangen und mit einem Anti- Biotinkonjugat nachgewiesen werden. Die Wt und Mut HBeAg Amplifikationsprodukte würden auf Anti-Fluoresceinpartikeln gefangen und mit Anti-Adamantankonjugat nachgewiesen werden. Um HBsAg Amplifikationsprodukten und HBeAg Amplifikationsprodukten in einer Reaktion zu testen, würde eine Mischung aus Anti- Adamantan und Anti-Biotinkonjugat verwendet werden. In einem zweiten IMx Test würden die co-amplifizierten IS Produkte, die in allen Reaktionen vorhanden sind, auf Anti-Biotin Mirkopartikeln gefangen und würden mit Anit-Adamantankonjugat nachgewiesen werden. Auf diese Weise würden die IS Produkte spezifisch nachgewiesen und könnten mit dem IMx Signal der getesteten Targetsequenzen wie in Beispiel 1 beschrieben verglichen werden.
LCR Test Sequenzidentifikations-Nr. Hapten dNTPs, die erforderlich sind
Während die Erfindung im Detail und unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es dem Facharbeiter offensichtlich, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen an solchen Ausführungen durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Gebiet der Erfindung abzuweichen, welcher durch die anhängigen Ansprüche definiert ist.

SEQUENZLISTE

(1) Allgemeine Information

(i) Anmelder: Birkenmeyer, Larry Mushahwar, Isa K.
(ii) Titel der Erfindung: VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON NUKLEINSÄURESEQUENZEN UNTER VERWENDUNG VON KOMPETITIVEN AMPLIFIKATIONEN
(iii) Anzahl von Sequenzen: 26
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Abbott Laboratories D377/AP6D
(B) Straße: 100 Abbott Park Road
(C) Stadt: Abbott Park
(D) Staat: Illinois
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 60064-3500
(v) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Floppy disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Programm: Patentln Release #1.0, VErsion #1.30
(vi) Daten der vorliegenden Anmeldung:
(A) Anmeldenummer:
(B) Anmeldetag:
(C) Klassifizierung:
(viii) Angaben zum Anwalt:
(A) Name: Porembski, Priscilla E.
(B) Registrierungsnummer: 33,207
(C) Aktenzeichen/Aktennummer: 5770.US. 01
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: 708-937-6365
(B) Telefax: 708-938-2623

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 1:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: genomische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 1:
TAGGACCCCT GCTCGTGTTA CAGGCGGGGT TTTTCTTGTT GACAAG

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: genomische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 2:
CCGTTTCTCC TGGCTCAGTT TACTAGTGCC ATTTGTTCAG TGGTTC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 3:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Biotin
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 3:
TAGGACCCCT GCTCGTGTTA CA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 4:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphatat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Biotin
(B) Position: 19
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 4:
AACACGAGCA GGGGTCCTA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 5:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphatat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Fluorescein
(B) Position: 22
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 5:
CGGGCTTTTT CTTGTTGACA AG

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 6:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Fluorescein
(B) Position: 1
Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 6:
CTTGTCAACA AGAAAAACCC CGCC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 7:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Adamantan
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 7:
CCGTTTCTCC TGGCTCAGTT TAC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 8:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphatat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Adamantan
(B) Position: 21
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 8:
AAACTGAGCC AGGAGAAACG G

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 9:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphatat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Fluorescein
(B) Position: 22
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 9:
AGTGCCATTT GTTCAGTGGT TC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 10:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Fluorescein
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 10:
GAACCACTGA ACAAATGGCA CTA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 11:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 11:
TAGGACCCCT GCTCGTGTTA CAGTAAACTG AGCCAGGAGA AACGG

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 12:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 12:
CTGTACCAAA CCTTCGGACG GAAATTGCAC CTGTATTCCC ATCCC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 13:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: doppel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 13:
CTGTACCAAA CCTTCGGACA GAAATTGCACC TGTATTCCC ATCCC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 14:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Fluorescein
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 14:
CTGTACCAAA CCTTCGGAC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 15:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Fluorescein
(B) Position: 18
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 15:
TCCGAAGGTT TGGTACAG

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 16:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Biotin
(B) Position: 24
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 16:
AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 17:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Biotin
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 17:
GGGATGGGAA TACAGGTGCA ATTTC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 18:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Fluorescein
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 18:
CTGTACCAAA CCTTCGGACA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 19:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 44 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: doppelt
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 19:
TGTGCCTTGG GTGGCTTTGG GGCATGGACA TTGACCCTTA TAk

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 20:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 44 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 20:
TGTGCCTTGG GTGGCTTTAG GACATGGACA TTGACCCTTA TAAA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 21:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Fluorescein
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 21:
TOTGCCTTGG GTGGCTTTG

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 22:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Fluorescein
(B) Position: 18
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 22:
AAAGCCACCC AGGCACA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 23:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Phosphat
(B) Position: 1
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 3' Adamantan
(B) Position: 22
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 23:
CATGGACATT GACCCTTATA AA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 24:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Adamantan
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 24:
TTTATAAGGG TCAATGTCCA TGCCC

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 25:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: 5' Fluorescein
(B) Position: 1
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 25:
TGTGCCTTGG GTGGCTTTA

(2) Information für Sequenzidentitätsnummer 26:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 50 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stränigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: synthetische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentitätsnummer 26:
GGGATGGGAA TACAGGTGCA ATTTCGGGCA TGGACATTGA CCCTTATAAA

Claims

1. Ein Verfahren zum Nachweis der Menge einer Targetnukleinsäuresequenz, die in einer Testprobe vorhanden sein kann, das folgende Schritte umfaßt:

(a) In Kontakt bringen der Testprobe mit einem Mittel zur Durchführung einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion und:

(i) zwei Target-Primersets, wobei ein erstes Primerset eine erste Targetsequenz repräsentiert und ein zweites Primerset eine zweite Targetsequenz repräsentiert innerhalb des Genoms der Targetnukleinsäure, und wobei jedes Primerset vier Oligonukleotidprimer umfaßt, von denen zwei Sense Primer und die anderen zwei Antisense Primer sind,

(ii) einer internen Standard (IS) -Sequenz, wobei die IS- Sequenz im wesentlichen von einer Kombination der ersten Targetsequenz und der zweiten Targetsequenz abgeleitet ist,

(iii) einem IS-Primerset, wobei das IS-Primerset vier Oligonukleotidprimer umfaßt, von denen zwei von der ersten Targetsequenz und die anderen zwei von der zweiten Targetsequenz abgeleitet sind, und

(iv) einem Satz von dNTPs,

unter hybridisierenden Bedingungen, so daß für jedes Paar von Target-Oligonukleotid-Primersequenzen oder IS-Oligonukleotid- Primersequenzen, das an jeden Strang der Targetsequenzen oder der IS-Sequenz oder seinen komplementären Strang hybridisiert, eine Ligasereaktion stattfindet, wobei die Nukleotidlücke zwischen den Oligonukleotid-Primersequenzen durch die dNTP's in Anwesenheit der Targetnukleinsäuresequenz gefüllt wird, wobei jede der Ligasereaktionen den gleichen Satz an dNTP's erfordert, oder einen Unter-Satz davon, um die Lücke zu füllen; und

(b) Bestimmen des Verhältnisses von Target- Amplifikationsprodukten zu IS-Amplifikationsprodukten, die in der Testprobe anwesend sind.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Amplifikationsreaktion zwischen ungefähr 15 und ungefähr 60 thermische Zyklen umfaßt.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei mindestens 1 Glied jedes Primersets einen Marker umfaßt.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Marker indirekt detektierbar ist.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der bestimmende Schritt folgende Schritte umfaßt:

(a) Immobilisieren des Target-Amplifikationsproduktes und des IS-Amplifikationsproduktes an eine feste Phase unter Verwendung von Einfangreagenzien, so daß ein erstes Einfangreagenz die Target-Amplifikationsprodukte immobilisiert und ein zweites Einfangreagenz die IS-Amplifikationsprodukte immobilisiert; und

(b) Detektieren eines Signals, das durch die Anwesenheit der Target-Amplifikationsprodukte oder der IS- Amplifikationsprodukte hervorgerufen wird.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Einfangreagenzien ein Glied eines spezifischen Bindungspaares umfassen, wobei das Bindungsglied spezifisch an ein spezifisches Bindungspaarglied bindet, das an das Amplifikationsprodukt angeheftet ist.

7. Ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen zwei verschiedenen Nukleinsäuresequenzen, die in einer Testprobe anwesend sein können, das fogende Schritte umfaßt:

(iv) einem Satz von dNTPs,

unter hybridisierenden Bedingungen, so daß für jedes Paar von Target-Oligonukleotid-Primersequenzen oder IS-Oligonukleotid- Primersequenzen, das an jeden Strang der Targetsequenzen oder der IS-Sequenz oder seinen komplementären Strang hybridisiert, eine Ligasereaktion stattfindet, wobei die Nukleotidlücke zwischen den Oligonukleotid-Primersequenzen durch die dNTP"s in Anwesenheit der Targetnukleinsäuresequenz gefüllt wird, wobei jede der Ligasereaktionen den gleichen Satz an dNTP's erfordert, oder einen Unter-Satz davon, um die Lücke zu füllen; und

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei eine der beiden Nukleinsäuresequenzen eine Mutation oder Allele der anderen Nukleinsäuresequenz umfaßt.