DE69622596T2

DE69622596T2 - Nicht-radioaktives rezeptorassay zur quantitativen und qualitativen analyse von spurenmengen eines rezeptorbindierendenanalytes

Info

Publication number: DE69622596T2
Application number: DE69622596T
Authority: DE
Inventors: Arie De Zeeuw; Kornelis Ensing; Johanna Janssen
Original assignee: Merska BV
Current assignee: Merska Bv Groningen Nl
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2016-10-26
Also published as: EP0934527A1; EP0934527B1; DE69622596D1; DK0934527T3; CA2269796A1; WO1998019166A1; AU7342496A; US6465259B1

Description

1 Einführung

Rezeptorbindungsassays sind üblicherweise zur Untersuchung von Rezeptor-Liganden- Wechselwirkungen in z. B. der Neurochemie, Neubiologie, Psychopharmakologie und verwandten Gebieten eingesetzt worden. Rezeptorassays werden auch als ein analytisches Verfahren verwendet, um Wirkstoffgehalte in biologischen Matrizes zu messen. Das Prinzip dieser Verfahren beruht auf der Konkurrenz eines markierten Liganden und des Analyten um die Bindung an einen bestimmten Rezeptor. Bis heute sind Rezeptorassays meistens mit radioaktiven Liganden durchgeführt worden. Aufgrund der niedrigen Dichte von Rezeptorbindungsstellen in den meisten Geweben, z. B. 10 bis 100 pMol gebundener Ligand pro Gramm Gewebe, muß der verwendete Ligand eine hohe Affinität und Selektivität für die Bindungsstellen besitzen sowie eine hohe spezifische Radioaktivität, um niedrige Gehalte an Ligand bestimmen zu können. Radioaktive Liganden sind kommerziell verfügbar, die aufgrund ihrer hohen spezifischen Aktivität bei sehr niedrigen Gehalten selektiv gemessen werden können. Im übrigen hat diese Art von Markierung, da die meisten Radioisotope im. Molekül eingebaut sind, keinen Einfluß auf die Bindungsaffinität des Liganden gegenüber dem Rezeptor. Da die Verwendung von Radioaktivität mehrere gut dokumentierte Nachteile aufweist, wie etwa begrenzte Lagerdauer, problematische Handhabung und bei der Entsorgung derselben erforderliche Sorgfalt, sind nicht-radioaktive Liganden, wie etwa fluoreszenzmarkierte Liganden, für verschiedene Rezeptortypen synthetisiert worden. Bis heute sind die Ergebnisse jedoch nicht so gewesen, daß verläßliche quantitative Daten für Spurenmengen von Analyten in einer einfachen und befriedigenden Weise erhalten werden können, daß sie eine Alternative zu denjenigen Arten von Analyse bieten können, die mit radioaktiven Rezeptorassays (RRAs) durchgeführt werden.
Beispiele für einen nicht-radioaktiven Rezeptorassay sind für eine große Anzahl von Rezeptoren allgemein in WO93/03382 (Tyler McCabe) dargestellt. Sie beschreiben, wie zahlreiche Versuche durchgeführt wurden, um Rezeptoren unter Verwendung fluoreszierender Liganden zu charakterisieren. Die erwähnten Rezeptoren sind α-adrenerge, β-adrenerge, Opioid-, Adenosin-, Glucagon-, Steroid- und Dopamin-Rezeptoren. Sie geben an, daß es Probleme mit der Quantifizierung und Visualisierung durch die direkte Fluoreszenzmessung aufgrund von Autofluoreszenz und Mangel an Spezifität gab. Sie stellen eine Gruppe von fluoreszierenden Liganden bereit, die zur intrazellulären und extrazellulären Bestimmung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen geeignet sind und um die Spezifität und Affinität von nicht-charakterisierten Verbindungen zu bestimmen. Sie analysieren intrazelluläre gegenüber extrazellulären Ereignissen durch Auswahl einer fluoreszierenden Sonde, die unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit vom pH der Umgebung emittiert. Sie führen ihre Tests auf 100% Gewebe durch. Die erwähnten Rezeptoren waren Opioid, Kaliumkanal, Glibenclamid und Glycin. Die tatsächlich dargestellten Assays sind ein mit Fluoreszein markierter Ligand für den Opioid-Rezeptor, mit Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol- 4-yl(= NBD) markierte Liganden für die Kaliumkanal- und Glibenclamid- und Glycin- Rezeptoren. Sie geben an, daß der Fluoreszenzwert durch Subtraktion des Autofluoreszenzwertes korrigiert ist. Dies bedeutet, daß der Assay, den sie einsetzen, niemals ausreichend empfindlich sein kann, um verläßliche Quantifizierung oder Nachweis von Spurenmengen von Analyten zu erhalten.
Einer der wichtigen Rezeptoren für Pharmakologen und Ärzte ist der Benzodiazepin- Rezeptor. Benzodiazepine sind extrem breit verwendete Wirkstoffe und sind primär für die Behandlung von Angstzuständen und Schlaflosigkeit verwendet worden. Es ist akzeptiert, daß die pharmakologischen Wirkungen durch spezifische Rezeptoren im zentralen Nervensystem vermittelt werden. Es ist festgestellt worden, daß dieser Rezeptor zur Bestimmung geringer Konzentrationen von an Benzodiazepin-Rezeptor bindenden Analyten extrem schwierig zu greifen ist. In-vitro-Rezeptor-Radioliganden-Wechselwirkungen sind verwendet worden, um die Mechanismen der pharmakologischen Wirkungen zu untersuchen und auch um neue Benzodiazepin-Wirkstoffe zu untersuchen.
Ein alternatives Verfahren ist die Verwendung von nicht-radioaktiven Immunoligandenassays gewesen. Diese lösen die mit der Verwendung von Radioaktivität zusammenhängenden Probleme. Ihre Nachteile sind jedoch zahlreich. In Immunoassays ist das bindende Molekül ein Antikörper, der gegen den zu bestimmenden Liganden erzeugt worden ist. Um Antikörper zu erzeugen, muß der Ligand zunächst an einen großen Träger gebunden werden, z. B. BSA. Die Position der Bindung des BSA an den Liganden beschränkt die Selektivität des Antikörpers. Der Antikörper ist nicht selektiv für die Bindungsposition. Die Empfindlichkeit von Immunoassays ist nicht mit der pharmakologischen Wirksamkeit des Liganden korreliert. Die Affinität zwischen Ligand und Antikörper beruht ausschließlich auf der chemischen Struktur, nicht auf der chemischen Struktur, die die pharmakologische Wirksamkeit bestimmt. Ein Ligand kann eine hohe Affinität für den Antikörper aufweisen, wenn solch ein Ligand pharmakologisch kaum wirksam ist und umgekehrt. Zum Beispiel hat die Merck-Markierung für den Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay für Benzodiazepine (Vitalab Eclair) kaum irgendeine Affinität für den Benzodiazepin-Rezeptor (Ki = 200 nM). Im Hinblick auf Metaboliten kann nichts im Hinblick auf ihre pharmakologische Aktivität ausgesagt werden. Zusätzlich sind, wenn mehrere Liganden bestimmt werden müssen, mehrere Antikörper für jeden separaten Liganden erforderlich. In den Rezeptor-Liganden-Assays kann ein einzelner Ligand ausreichen, um auf mehrere Analyten zu testen. Die Immunoligandtechnologie ist z. B. in EP-A-0 264 797 (Abbott) dargestellt.
Spezifisch für den Benzodiazepin-Rezeptor sind zum Beispiel fluoreszenzmarkierte Liganden als nicht-radioaktiv markierter Ligand für die Charakterisierung des Benzodiazepin-Rezeptors [g - i] verwendet worden. Solche Charakterisierungsexperimente unterliegen jedoch nicht dem Grad an Empfindlichkeit, der für Analytennachweis und -quantifizierung an Spurenmengengrenzen erforderlich ist. Der Inhalt der zitierten Artikel wird im weiteren dargestellt werden, um einen vollständigeren Überblick über die Technologie und die spezifischen Probleme zu schaffen.
Zusätzlich zu den obigen beschäftigen sich jüngere Veröffentlichungen über den Benzodiazepin-Rezeptor mit der Verwendung von fluoreszenzmarkierten Liganden als markiertem Liganden für einen Benzodiazepin-Rezeptor-Assay [b(1991), j(1993), c[1995)], im Gegensatz zu einfacher Charakterisierung.
In den Fluoreszenz-Benzodiazepin-Rezeptor-Assays, die von Takeuchi et al. [b, c] entwickelt worden sind, wurden die freien Markierungsfraktionen nach Sammlung dieser Fraktionen durch Zentrifugation quantifiziert. Da - membrangebundene Rezeptoren Hintergrundfluoreszenz zeigen [c], wurde erwartet, daß das Problem der Autofluoreszenzinterferenz in diesen Assays reduziert war. Dies war jedoch nicht der Fall. Zusätzliche Maßnahmen waren erforderlich und die Empfindlichkeit dieser Assays ließen eine Menge zu wünschen übrig.
Takeuchi und Rechnitz beschrieben bereits 1991 in [b] das Quantifizieren der freien Fraktion des Liganden. Sie verwendeten ein HPLC-System in Verbindung mit AMCA-Ro7-1986 (AMCA-Didesethylflurazepam) als Liganden in ihren Fluoreszenzrezeptorassays. Die Verwendung von HPLC war als eine Vorbehandlung erforderlich, um mögliche Interferenz in der Matrix zu iminieren. Der Überstand nach der Gebunden/Frei-Trennung durch Zentrifugation wurde direkt auf die HPLC-Säule ohne weitere Aufreinigung, wie etwa Filtration, gespritzt. Um genügend Unterschied im Fluoreszenzsignal zwischen der maximalen Bindung und der nicht-spezifischen Bindung zu erhalten, mußten sie auch eine hohe Menge an Rezeptormaterial verwenden, 50 mg/ml. Solch ein Test ist für kommerzielle Verwendung im Großmaßstab aufgrund der prohibitiven Kosten der Verwendung solch höher Mengen an Rezeptormaterial nicht praktisch. Zusätzlich ist die Verwendung solcher hohen Mengen an tierischem Gewebe auch von einem ethischen Standpunkt unerwünscht.
Takuchi et al. [j und c] beschäftigten sich später mit dem Problem der Autofluoreszenz in einer alternativen und bevorzugten Weise, wie offenbart in ihren Artikeln von 1993 und 1995. Genauer konstatierten sie in dem letzteren Artikel: "Weil die kommerziell verfügbaren Benzodiazepin-Rezeptor-Präparate nur teilweise gereinigt sind, zeigen ihre Überstände - starke Hintergrundfluoreszenz und können mit der Messung von mit Fluorophor markierten Liganden interferieren". Um dieses Problem zu lösen, offenbarten sie in dem zitierten Artikel die Entwicklung eines zeitaufgelösten fluorometrischen Assays für Benzodiazepine. Sie konstatieren spezifisch: "Radioliganden-Rezeptorassays werden häufig in Laboratorien durchgeführt, da keine brauchbaren nicht-isotopischen Assays unter Verwendung von Wirkstoffrezeptoren berichtet worden sind". Sie liefern auch die Überlegungen für die Entwicklung von nicht-isotopischen Rezeptorassays: "Die Markierung könnte die Ligandenaffinität gegenüber dem Rezeptor nicht signifikant verringern und gleichzeitig muß ein hochempfindliches Meßverfahren für den markierten Liganden verfügbar sein, damit eine mit radioisotopischen Verfahren vergleichbare Empfindlichkeit erreicht werden kann." Ihr neues Verfahren beinhaltete die Selektion einer spezifischen Markierung mit speziellen Fluoreszenzfähigkeiten. Sie wählten die Verwendung eines Europium-Chelats als Markierung, da ihr Überstand starke Hintergrundfluoreszenz zeigte, die mit der Messung dei" mit Fluorophor markierten Liganden interferierte. Das Europium-Chelat liefert eine unterschiedliche Art von Fluoreszenz als die Autofluoreszenz des Membranmaterials. Das Europium-Chelat liefert eine langandauernde Fluoreszenz nach Anregung mit gepulstem Licht. Dies ermöglicht die Durchführung von zeitaufgelöster Fluorometrie ohne Interferenz von kurzzeitiger Fluoreszenz üblicher Fluorophore wie derjenigen, die in der Rezeptormatrix vorliegen. Sie trennten anschließend die gebundenen und freien Fraktionen von ihrer Markierung, Eu-1021-S. durch Zentrifugation und quantifizierten die freien Fraktionen durch die Messung der zeitaufgelösten Fluoreszenz im Überstand. Die vorliegende Erfindung liefert eine geeignete Alternative und ermöglicht überdies die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen, die auch bei Wellenlängen im Bereich der Hintergrundfluoreszenz bestimmt werden können. Die vorliegende Erfindung erfordert keine zeitaufgelöste Fluoreszenz. Die vorliegende Erfindung erreicht höhere Empfindlichkeit. Um genügend Unterschied im Fluoreszenzsignal zwischen der maximalen Bindung und der nichtspezifischen Bindung zu erhalten, mußten Takeuchi et al. auch eine hohe Menge an Rezeptormaterial verwenden, 50 mg/ml. Solch ein Test ist für kommerzielle Verwendung im Großmaßstab aufgrund der prohibitiven Kosten der Verwendung solch hoher Mengen von Rezeptormaterial nicht praktisch. Zusätzlich ist die Verwendung solch hoher Mengen an tierischem Gewebe auch von einem ethischen Standpunkt unerwünscht.
Wie gesagt beschäftigten sich obige Artikel [g-i] mit der Charakterisierung von Benzodiazepin-Rezeptoren statt mit der Quantifizierung.
Havunjian et al. [g] und McCabe et al. [h] beschreiben jedoch, wie sie die gebundenen Fraktionen ihrer markierten Liganden quantifizierten. Wie oben jedoch offenbart, mußten, da membrangebundene Rezeptoren Hintergrundfluoreszenz zeigen [c] und ihre Messungen in der Gegenwart der Rezeptormaterialien durchgeführt wurden, zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden, um dieses Problem zu überwinden. Genauer verwendete Havunjian fluoreszenzmarkiertes Benzodiazepin BD 623 (NBD-NH-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890, auch bekannt als NBD-Desethylflumazenil) als einen Benzodiazepin-Liganden in Assays zur Überwachung von Fluoreszenz/Dequenching. Die gebundene Fraktion wurde bestimmt. Nach Bestimmung der Autofluoreszenz des Membranpräparates (Autofluoreszenz) (Bereich A, Fig. 2A des zitierten Artikels) wurde BD 623 zugegeben und die Fluoreszenz über die Zeit überwacht. Die Fluoreszenz wurde allmählich bis zu einem Plateau gequencht (Bereich C), wo die Zugabe von überschüssigem Flurazepam ein Dequenching der Fluoreszenz bewirkte, das bis zum Gleichgewicht überwacht wurde (Bereich D). Die Verwendung von BD 623 als einem Prototyp für die Entwicklung weiterer Fluoreszenzliganden, um Liganden-Rezeptor- Wechselwirkungen zu untersuchen, wurde postuliert. In der Praxis wurde festgestellt, daß die Assays ungenügend empfindlich waren, um einen Assay bereitzustellen, mit dem niedrige Mengen an Analyt nachgewiesen werden können. Sie erforderten hohe Mengen an Ligand, im vorgelegten Beispiel ergibt sich eine Menge an Ligand von ungefähr 10·Kd. Sie erforderten auch hohe Mengen an Rezeptormaterial. Havunjian offenbart: "Die Verwendung von Rezeptordichten mit 20- bis 80-mal höherer Fluoreszenz, verglichen mit Radiorezeptorassays, ...". In diesem Verfahren ist es bemerkenswert, daß sie die Menge des Quenching von NBD- NH-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890 nachweisen können, insbesondere in Anbetracht der niedrigen Quantenausbeute des Fluorophors NBD, die 0,02 in Tris-Citrat-Puffer (pH 7,4; 50 mM) ist [g]. Sie präsentierten keine brauchbare Alternative zu Radiorezeptorligandenassays.
Der Artikel von Tyler McCabe [h] (mit einem späteren Datum als die zuvor zitierte PCT- Anmeldung dieses Autors) beschäftigt sich mit den Problemen im Zusammenhang mit Radioassays und postuliert die Anwendung von Fluoreszenz als einer Alternative. Zwei Benzodiazepin-Liganden, markiert mit Fluorophoren, werden Fluorescein-NH-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15- 3890 (BD 621) und (BD 607), das direkte Kopplungsprodukt von Ro-7-1986 mit Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester in DMF präsentiert. BD 621 ist ein Fluorescein-Desethylflumazenil-Derivat und BD 607 ist ein Fluorescein Didesethylflurazepam-Derivat. McCabe et al. maßen die gebundenen Fraktionen ihres fluoreszenzmarkierten Benzodiazepins. Nach Trennung der gebundenen und nichtgebundenen Fraktionen durch Zentrifugation suspendierten sie den Pellet erneut in Puffer und maßen die Fluoreszenzintensität der Suspension. Der fluoreszenzmarkierte Ligand war während der Messung noch an den Rezeptor gebunden. Kein Hinweis auf eine Nachweisgrenze ist angegeben. Hohe Mengen an Ligand und hohe Mengen an Rezeptor für einen empfindlichen Assay würden unter Befolgung der Lehre dieses Dokuments ins Auge gefaßt werden. Es ist bemerkenswert, daß ihr fluoreszenzmarkiertes Benzodiazepin tatsächlich sogar in der Gegenwart des Rezeptormaterials nachgewiesen werden konnte. Das Fluorophor-Fluorescein hat jedoch relativ hohe Anregungs- und Emissionswellenlängen (λex, = 499 nm und λem = 521 nm) im Vergleich zu anderen Fluorophoren, wie etwa einem Cumarin-Derivat. Die Autofluoreszenz des Rezeptormaterials ist niedriger bei höheren Wellenlängen, was die Sache erklären könnte. Nichtsdestoweniger wäre die Interferenz immer noch enorm. Sie haben sogar selbst festgestellt, daß die Fluorescenzintensität von Fluoreszein-NH-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3 890 stärker war, wenn gemessen in Gewebesuspension, als wenn gemessen in Puffer allein, und daß diese erhöhte Intensität nicht auf der Hintergrundfluoreszenz der Gewebesuspension beruhte. Die Kd-Werte der angegebenen Fluorophore sind 63 und 74, was es unmöglich macht, daß sie ausreichende Empfindlichkeit für eine Anwendung beim Nachweisen und Quantifizieren von Spurenanalyten besitzen. In der Praxis wären die Assays ungenügend empfindlich, um einen Assay bereitzustellen, der in der Lage wäre, niedrige Mengen an Analyt nachzuweisen, und erforderten hohe Mengen an Rezeptormaterial.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen hochempfindlichen Rezeptor- Liganden-Assay bereitzustellen, der es nicht erforderlich macht, mit Radioaktivität umzugehen, aber einen Test mit wenigstens der Empfindlichkeit und Spezifität eines radioaktiven Rezeptorassays bereitstellt. Solch ein Assay muß einfach auszuführen und wirtschaftlich brauchbar sein, wobei eine Routine-Laboranwendung möglich ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen hochempfindlichen Rezeptor-Liganden-Assay bereit der es nicht erforderlich macht, mit Radioaktivität umzugehen, aber einen Test mit wenigstens der Empfindlichkeit und Spezifität eines radioaktiven Rezeptorassays bereitstellt. Solch ein Assay ist einfach auszuführen und wirtschaftlich brauchbar, wobei Routine-Laboranwendung möglich ist. Es wird auch eine Gruppe von Liganden bereitgestellt, die spezifisch auf Benzodiazepin-Rezeptoren gerichtet sind, geeignet zur Verwendung in einem Assay gemäß der Erfindung.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum quantitativen und/oder qualitativen Testen eines Analyten in einer Probe zur Verfügung, wobei besagter Analyt eine rezeptorbindende Verbindung ist, wobei besagtes Verfahren - niedrige Nachweisgrenzen äquivalent zu denjenigen eines Radiorezeptorassays für besagten Rezeptor besitzt, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt
a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Material, das einen Rezeptor für besagten Analyten umfaßt, damit Rezeptor-Analyt-Bindung auftritt, und
b) weiteres In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem nachweisbaren Liganden für den Rezeptor, damit Rezeptor-Liganden-Bindung auftritt, gefolgt von
c) Trennen der resultierenden rezeptorgebundenen und freien Fraktionen,
d) Unterwerfen der rezeptorgebundenen Fraktion unter dissoziierenden Bedingungen, die den Liganden vom Rezentor freisetzen und
e) Testen auf den dissoziierten Liganden in einer für den Nachweis des nachweisbaren Liganden per se bekannten Weise, wobei besagter Rezeptor in einer Konzentration zwischen 0,5 bis 5 nM vorliegt, wobei besagter nachweisbarer Ligand wenigstens 90 % rein ist, wobei besagter nachweisbarer Ligand nicht-radioaktiv nachweisbar ist, besagter nachweisbarer Ligand in einer Menge zugegeben wird, die der Menge entspricht, die erforderlich ist für die Besetzung durch den Liganden von 10 bis 75% des Rezeptormaterials, das im Assay vorhanden ist, in Abwesenheit von Analyt bei einer Rezeptorkonzentration unterhalb des Kd des Liganden und Rezeptors unter Bedingungen, die ansonsten denjenigen des Assays entsprechen, wobei besagte dissoziierende Bindungen und besagter nachweisbarer Ligand derart sind, daß wenigstens 90% gebundener Ligand in solcher Form freigesetzt werden, daß weniger als 10% dei resultierenden nachweisbaren Produkts sich erneut mit dem Rezeptor assoziiert, wobei besagte dissoziierende Bedingungen und besagter nachweisbarer Ligand so ausgewählt sind, daß das resultierende dissoziierte Produkt quantitativ und/oder qualitativ nachweisbar ist. Der Ligand und die dissoziierenden Bedingungen können so ausgewählt werden, daß der Ligand nicht abgebaut wird und somit das nachweisbare Produkt bildet, oder so, daß Abbau des Liganden vollständig auftritt und gleichförmig ein nachweisbares Produkt liefert.
Vorzugsweise wird die Affinität des dissoziierten Liganden vom Rezeptor für den Rezeptor Null sein oder so nah an Null wie möglich. Das nachweisbare Produkt kann der Ligand nach Dissoziation als solcher oder gebunden an die nachweisbare Markierung sein. Das nachweisbare Produkt kann auch das Abbauprodukt sein, das Markierung umfaßt, die nicht länger an den Liganden oder an eine abgebaute Form des Liganden gebunden ist. Die Schritte a) und b) können gleichzeitig durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt a) vor Schritt b) ausgeführt, um das Einstellen eines kontrollierten Nicht- Gleichgewichtes zu ermöglichen, was größere Empfindlichkeit liefert.
Insbesondere ist das Verfahren gemäß der Erfindung daraufgerichtet, Assays durchzuführen, m denen der Analyt bei einem Gehalt unter 1 uM nachgewiesen werden soll. Der Assay kann auch sogar mit Erfolg bei Analytgehalten unter 100 nM, am bevorzugtesten unterhalb 50 nM durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Verfahren gemäß der Erfindung durchgeführt, um so niedrige Analytgehalte wie möglich festzustellen. Im Hinblick auf die Entwicklungpotenter Wirkstoffe und Analyse ihrer Aktivitätsniveaus sind Analytkonzentrationen, die so niedrig wie 1 picomolar, aber auch so niedrig wie 100 femtomolar sind, von Interesse.
In einem Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt eine geeignete Ausführungsform die Zugabe von Ligand in einer Menge, die äquivalent ist zu einer Menge innerhalb des Bereiches 0,1-2,0 ·Kd nM des Rezeptors und Liganden. Vorzugsweise wird der Ligand in einer Menge zwischen 0,5-1,5·Kd nM zugegeben. Recht geeigneterweise wird eine Menge von ungefähr 1 Kd nM angewendet. Für eine größere Anzahl von Liganden sind Kd-Werte bereits aus Handbüchern verfügbar. Ein Fachmann kann auch in einer per se bekannten Weise feststellen, welches der Kd-Wert für einen bestimmten Liganden und Rezeptor ist. Im allgemeinen ist ein nachweisbarer Ligand mit einem Kd-Wert für den nachweisbaren Liganden und Rezeptor unterhalb 10 nM ein hervorragender Kandidat zur Verwendung im Assay gemäß der Erfindung. Solch ein Kd stellt die erforderliche Empfindlichkeit für den Nachweis und die Quantifizierung von Spurenanalyten sicher.
Im Verfahren gemäß der Erfindung kann Schritt c) auf eine Reihe von Weisen durchgeführt werden, die für einen Fachmann deutlich sein werden. Es wird von der Natur des Rezeptormaterials abhängen, ob zusätzliche Vorbehandlungsschritte vor der Trennung erforderlich sind. Der einfachste Weg zur Durchführung von Schritt c) umfaßt das Trennen der gebundenen Fraktion auf der Basis des Größenunterschiedes zur freien Fraktion. Im Falle von membrangebundenem Rezeptormaterial kann die Trennung z. B. einfach über Filtration erfolgen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die freie Fraktion in Schritt c) von der gebundenen Fraktion durch Filtration getrennt. Alternativ könnte Zentrifugation angewendet werden. In einer Ausführungsform, durch die die gebundene Fraktion durch den Filter zurückgehalten wird und die freie Fraktion durch den Filter hindurchgeht; muß die Menge an Rezeptormaterial derart sein, daß die Menge an Rezeptor geringer ist als die Menge an Rezeptormaterial, welche den Filter verstopfen wird. Beispielhaft ist die Menge an Rezeptor niedriger als 1 bis 4 mg/ml lyophilisiertes Rezeptormaterial, wenn das Assayvolumen 0,25 ml entspricht, d. h. 4 bis 16 mg/ml Rezeptormaterial/ml Assayvolumen, wenn man einen Filtertyp verwendet, wie er in MultiScreen-FB-Filtrationsplatten von Millipore oder einem äquivalenten Typ vorliegt. Whatman®-GFB-Filtermaterial ist geeignet. Alternativ ist die Menge an Rezeptormaterial, wenn der Trennschritt einen Filter verwendet, niedriger als die Menge an Rezeptor, welche den Filter verstopfen wird, wenn die Menge an Rezeptor niedriger ist als 1 bis 4 mg/ml lyophilisiertes Rezeptormaterial pro 0,2 cm² Filterfläche, wenn man einen Filtertyp verwendet, wie er in MultiScreen-FB-Filtrationsplatten von Millipore oder einem äquivalenten Typ, wie oben erwähnt, vorliegt. Eine Kombination der zwei Anforderungen ist ebenfalls möglich.
Eine spezifischere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, wie allgemein definiert, welches die Schritte umfaßt
a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Material, das einen Rezeptor für den Analyten umfaßt, damit Rezeptor-Analyt-Bindung auftritt, und
b) weiteres In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Liganden für den Rezeptor, damit Rezeptor-Liganden-Bindung auftritt, in einem Behälter, der einen Filter umfaßt, wobei besagter Filter derart ist, daß sichergestellt ist, daß das Rezeptormaterial nicht durch den Filter hindurchgehen kann, wohingegen die kleineren Teilchen, insbesondere der nicht-gebundene Ligand und Analyt dies können,
c) Trennen der resultierenden rezeptorgebundenen und freien Fraktionen durch Filtrieren der resultierenden Mischung und Spülen des Filters,
d) Unterwerfen der rezeptorgebundenen Fraktion, wie in und auf dem Filter vorhanden, unter dissoziierende Bedingungen, die den Liganden vom Rezeptor freisetzen, und Leiten der resultierenden Lösung durch den Filter in ein anderes Gefäß, damit Nachweis des dissoziierten nachweisbaren Produktes in einer für den Nachweis eines solchen nachweisbaren Produktes per se bekannten Weise auftritt.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann unter Verwendung von membrangebundenem Rezeptormaterial durchgeführt werden, wie für den Benzodiazepin-Rezeptor angegeben. Alternativ kann jedoch lösliches oder löslich gemachtes Rezeptormaterial angewendet werden. Eine gewisse Modifikation des Verfahrens, wenn die unterschiedlichen Rezeptortypen verwendet werden, ist aufgrund der unterschiedlichen Natur der Rezeptormaterialien erforderlich, aber die grundlegende Methodik ist dieselbe, wie einem Fachmann deutlich sein wird, dem die Unterschiede zwischen löslichem Rezeptormaterial, löslich gemachtem Rezeptormaterial und gebundenem Rezeptormaterial bewußt sind. In einem Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem das Rezeptormaterial lösliches oder löslich gemachtes Rezeptormaterial ist und besagtes Material einer Behandlung unterworfen worden ist, die Trennung über Filtration in Schritt c) ermöglicht, wie oben für das Verfahren gemäß der Erfindung allgemein offenbart, ist eine Behandlung zusätzlich erforderlich, die sicherstellt, daß die rezeptorgebundene Fraktion bei Filtration in einer per se bekannten Weise nicht durch den Filter hindurchgehen kann. Ein Beispiel für eine solche Behandlung umfaßt die Ausfällung mit Protaminen vor dem eigentlichen Filtrationsschritt. Alternative Maßnahmen, um den Trennschritt zu erzielen, werden einem Fachmann für die Trennung von freier/gebundener Fraktion deutlich sein.
Es ist allgemein bekannt, daß Liganden-Rezeptor-Bindung sehr empfindlich gegenüber Größe und Ort der nachweisbaren Markierung auf dem Liganden sein kann. Bindung der Markierung an den Liganden kann die Bindungsaffinität für den Rezeptor negativ beeinflussen. Der günstigste Ort für eine solche Bindung und auch Orte, die für solch eine Bindung unmöglich sind, sind für zahlreiche Liganden untersucht worden. Natürlich können für die Anwendung im vorliegenden Verfahren nur die Liganden mit einer Markierung an solch einer günstigen Stelle berücksichtigt werden. Zusätzlich zur allgemeinen Stelle der Markierung hängt der Grad, in dem die Affinität beeinflußt wird, auch von der Natur des Fluorophors ab. Ein kleines Fluorophor könnte die Bindung nicht in dem Maße negativ beeinflussen, wie dies ein großes Fluorophor könnte. Im Falle eines nachweisbaren Liganden, welcher ein Ligand ist, der mit einer zusätzlichen nachweisbaren Markierung versehen ist, ist es manchmal im Hinblick auf die Aufrechterhaltung des richtigen Grades an Spezifität und Empfindlichkeit bevorzugt, den Liganden mit einer nachweisbaren Markierung zu versehen, die über einen Spacer gebunden ist. Im allgemeinen umfaßt der Spacer, wenn man einem Spacer verwendet, der Markierung und Ligand verknüpft, eine Kohlenstoffkette mit zwischen 2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatomen. Die allgemeinen Anforderungen an die nachweisbaren Liganden sind in der allgemeinen Definition des Verfahrens gemäß der Erfindung zusammengefaßt. Geeignete Beispiele werden bereitgestellt. Die geigneten Liganden können von einem Fachmann unter Verwendung von ohne weiteres verfügbaren Details bestimmt werden, die Affinitäten und Rezeptorbindungsstrukturen betreffen. Wir veranschaulichen dies für die fluoreszenzmarkierten Liganden des Benzodiazepin-Rezeptors. Eine Reihe von geeigneten Liganden existiert bereits und natürlich ist es möglich, zahlreiche Liganden auf der Basis der in der vorliegenden Anmeldung vorgelegten Information herzustellen, die in geeigneter Weise in der vorliegenden Erfindung angewendet werden können. Bevorzugte markierte Liganden werden diejenigen sein, die ohne weiteres synthetisiert werden können. Wir liefern ein Beispiel für eine Fluoreszenzverbindung, die ohne weiteres hergestellt werden kann. Wir beziehen uns auch auf Artikel [h], der die Herstellung von markierten Liganden darstellt. Solche Verfahren können ohne weiteres so angepaßt werden, daß sie zu den spezifischen Details des herzustellenden markierten Liganden passen, und veranschaulichen das Prinzip der involvierten einfachen Chemie. Mit unserem Verfahren wurde ein Spacer mit dem Fluorophor verknüpft und anschließend mit dem Liganden. Der verwendete Spacer umfaßte eine terminale Carboxygruppe. McCabe verwendete eine terminale Aminogruppe für ihren Spacer, wobei dieser Spacer mit dem Liganden im Anschluß an eine leichte Adaptation des Liganden zu einem hydrolysierten Derivat verknüpft wurde. Das Fluorophor wurde anschließend mit dem Liganden-Spacer- Konstrukt verknüpft. Das Verfahren von McCabe erfordert das Einführen und Abspalten einer Schutzgruppe für die reaktive Gruppe des zur Bindung des Fluorophors verwendeten Spacers. Eine solche Synthese erfordert mehr Schritte und ist daher kein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von markiertem Liganden.
Im Hinblick auf die dissoziierenden Bedingungen, die im Assay verwendet werden können diese das Spülen unter anderen Bedingungen als physiologischen Bedingungen umfassen und unter Bedingungen, die sicherstellen, daß das nachweisbare Produkt, d. h. der Ligand oder die nachweisbare Markierung des Liganden stabil und funktionell bleibt. Dies impliziert die Verwendung von Bedingungen, die zusätzlich zu der Tatsache, daß sie nicht-physiologisch sind, nicht zu aggressiv sind. Der Ausdruck "andere als physiologische Bedingungen" impliziert vorzugsweise das Ausschließen der Verwendung von Bedingungen mit einem pH zwischen 6 bis 8. Der Ausdruck physiologische Bedingungen ist ein in der Technik anerkannter Ausdruck und gibt die Bedingungen an, die im Körper in vivo vorherrschen. Die Dissoziationsbedingungen gemäß dem Assay können einen schwachen Puffer, d. h. einen pH zwischen 3,5 und 4,5, vorzugsweise zwischen 3,75 und 4,25, umfassen. Ein Acetatpuffer ist 1 ein geeignetes Beispiel für einen Puffer zum Dissoziieren unter nicht zu aggressiven- Umständen.
Um die Hintergrundfluoreszenz auf ein Minimum zu verringern, sollten die oben erwähnten dissoziierenden Bedingungen und oben erwähntes besagtes Rezeptormaterial derart sein, daß keine anderen Verbindungen in einer Menge freigesetzt werden, die mit dem Nachweis des freigesetzten nachweisbaren Produktes interferieren kann. Im Falle der an Benzodiazepin- Rezeptor bindenden Liganden liefert zum Beispiel ein Flumazenil-Derivat eine hervorragende Ausführungsform dieser Art. Es zeigt nahezu keine Affinität nach Dissoziation, wie aus dem an anderer Stelle vorgelegten Beispiel deutlich wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Fraktion, die aus dem Dissoziationsschritt resultiert, welche das dissoziierte freie nachweisbare Produkt umfaßt, unter Verwendung eines HPLC-Chromatographen untersucht, der mit einem Detektor des Typs verbunden ist, der zum Nachweis des nachweisbaren Produktes erforderlich ist. Dies verringert das Risiko interferierender Fluoreszenz aufgrund kontaminierender autofluoreszierender Rezeptorteilchen oder anderer fluoreszierender Verunreinigungen. Alternativ wird die Fraktion, die aus dem Dissoziationsschritt resultiert, welche das dissoziierte freie nachweisbare Produkt umfaßt, unter Verwendung von GLC untersucht, verbunden mit einem Detektor des Typs, der zum Nachweis des nachweisbaren Produktes erforderlich ist. Andere Trennverfahren zwischen dem Dissoziationsschritt und dem Nachweisschritt können ebenfalls verwendet werden und werden einem Fachmann deutlich sein.
In einem Verfahren gemäß der Erfindung wird das Rezeptormaterial vorzugsweise wenigstens dreimal vor In-Kontakt-Bringen der Probe mit Analyt gewaschen, um das Risiko interferierender Verunreinigung zu verringern. Anschließend kann das nachweisbare Produkt über eine Reihe von nicht-isotopischen Nachweisverfahren in Abhängigkeit vom Typ des verwendeten Liganden und/oder der verwendeten Markierung bestimmt werden. Geeignete Beispiele für Nachweisverfahren sind FID = (Flammionisationsnachweis), ECD = (Elektroneneinfangnachweis), NPD = (Stickstoffphosphornachweis) und Massenspektrometrie. Andere Verfahren können auch elektrochemischen Nachweis, Fluoreszenz, Chemolumineszenz und Lumineszenz umfassen. All diese Technologien sind gut bekannt und Details betreffend ihre Anwendung sind gut publiziert und einem Fachmann zugänglich, ohne unangemessene Mühe zu erfordern. Zahlreiche Handbücher und allgemeine Textbücher beschreiben solche Verfahren und Apparate zur Durchführung solcher Verfahren sind kommerziell verfügbar.
Insbesondere das Gebiet, in dem das nachweisbare Produkt ein Ligand als solcher ist, der mit Fluoreszenztechnologie nachweisbar ist, oder ein Ligand ist, der mit einer Markierung versehen ist, die mit Fluoreszenztechnologie nachgewiesen werden kann, ist eine geeignete Ausführungsform. Nicht-zeitaufgelöste Fluorometrie wird nun eine brauchbare Option für den Nachweis, da das Problem aufgrund von Autofluoreszenz von Rezeptormaterial überwunden ist. Eine große Anzahl von Fluoreszenzmarkierungen ist verfügbar. Insbesondere haben wir festgestellt, daß eine Reihe von Fluoreszenzmarkierungen in die oben definierte Gruppe fällt. Solche markierten Liganden- und/oder die nachweisbaren Produkte nach dem Dissoziationsschritt müssen die erforderliche minimale Affinität besitzen, wie an anderer Stelle für das Verfahren definiert. Der markierte Ligand muß stabil sein. Der markierte Ligand oder das erhaltene nachweisbare Produkt müssen, nach Unterwerfen unter die Dissoziationsbedingungen des Assays, verringerte Affinität für das Rezeptormaterial aufweisen, wie an anderer Stelle für das Verfahren definiert. Vorzugsweise wird der markierte Ligand oder das erhaltene nachweisbare Produkt keine Affinität nach der Dissoziation aufweisen. Eine bevorzugte Gruppe von markiertem Ligand oder erhaltenem nachweisbaren Produkt hat verringerte Affinität und vorzugsweise keine Affinität nach Hydrolyse. Die erforderliche Affinitätsverringerung ist auch an anderer Stelle in dieser Beschreibung beschrieben. Die fluoreszierenden Gruppen AMCA, NBD und ein Cumarin-Derivat haben hervorragende Eigenschaften geliefert. Das Cumarin-Derivat ist aufgrund des höheren Fluoreszenzsignals, das es in wäßriger Lösung liefert, gegenüber dem NBD bevorzugter. Genauer zeigten die resultierenden fluoreszenzmarkierten Liganden die erforderlichen Affinitätswerte, wenn die Fluorophore an die Liganden Didesethylflurazepam bzw. Desethylflumazenil gebunden waren. Didesethylflurazepam und Desethylflumazenil sind geeignete Benzodiazepin-Liganden mit hoher Spezifität und Affinität. Drei geeignete Verbindungen dieser Art für Benzodiazepin-Rezeptor-Assays gemäß der Erfindung haben einen Ki von 8,6 nM, 5,7 nM bzw. 6,5 nM und umfassen einen Spacer. Die Strukturformeln sind in Fig. 1 angegeben. Eine besonders geeignete Verbindung für Benzodiazepin- Rezeptorbindung ist der fluoreszierende Ligand FLB (Mmc-O-CO-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890), dargestellt in der Fig. 1B. Dieser Verbindung wird aufgrund ihrer extremen Geeignetheit. In einem Assay gemäß der Erfindung auch als ein Teil der Erfindung angesehen. NBD ist eine relativ kleine apolare Gruppe und Verknüpfung über einen Spacer verhindert sterische Hinderung. Gruppen mit ähnlicher Größe sollten ebenfalls brauchbar sein. Die Entwicklung geeigneter Liganden unter Verwendung bekannter Daten und Computermodellierung um die drei Verbindungen herum, die wir als geeignet angegeben haben, sollte weiter alternative Ausführungsformen liefern. Im Hinblick auf die Anforderungen an die Benzodiazepin- Rezeptorbindung beziehen wir uns auf die Artikel [a] und [e]. Solche Artikel können Einsichten in alternative Benzodiazepin-Rezeptor-Liganden mit hoher Affinität liefern. Die von Flumazenil abgeleiteten Verbindungen besitzen z. B. extrem niedrige Affinität für den Benzodiazepin-Rezeptor nach Hydrolyse und bilden aus diesem Grund eine bevorzugte Gruppe von Liganden für Benzodiazepin-Rezeptoren.
Eine besonders geeignete Verbindung-für-Östrogen-Rezeptorbindung ist der nachweisbare Ligand Cumestrol. Cumestrol ist ein Beispiel für einen Liganden, der keine Markierung benötigt, weil er per se Fluoreszenzeigenschaften besitzt.
Die Auswahl einer Markierung wird z. B. vom dem zu untersuchenden Rezeptormaterial sowie den Probenbedingungen abhängen. Es ist bekannt, daß Fluoreszenzeigenschaften mit den Bedingungen variieren. Ein Markierungstyp wird in einem wäßrigen Medium geeignet sein, wohingegen ein anderer in einem nicht wäßrigen Medium geeignet sein wird. Insbesondere aus dem Gebiet der Wirkstoffe und des Testens von Proben wird es bevorzugt sein, nachweisbare Liganden anzuwenden, die ein optimales Signal in einem wäßrigen System, wie etwa einer wäßrigen Lösung, liefern. Körperflüssigkeiten werden im allgemeinen die zu testende Probe in solchen Fällen bilden, so daß der nachweisbare Ligand entsprechend ausgewählt werden kann. In einer geeigneten Ausführungsform gemäß der Erfindung liefert das nachweisbare Produkt ein nachweisbares Signal im Testmedium, das ausreichend ist für verläßliche Quantifizierung, d. h. eine Abweichung von weniger als 10% vom tatsächlichen Wert zeigt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Verwendung eines Liganden, der ein solches nachweisbares Signal in einem wäßrigen Medium in einem solchen verläßlichen Grad liefert. Geeigneterweise kann ein Fluoreszenzsignal in wäßrigem Medium mit wenigstens der Stärke von 0,2* das Signal von 1 M Chinin-Standard in 1 M H&sub2;SO&sub4; angewendet werden, um dies zu erreichen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung kann mit Rezeptormaterial durchgeführt werden, das membrangebundenes Rezeptormaterial ist. In einer alternativen Ausführungsform können auch Membranrezeptoren verwendet werden, die im Stand der Technik als lösliche oder löslich gemachte Rezeptoren bekannt sind. Beispiele für Membranrezeptoren sind Adenosin-, adrenerge, Dopamin-, Histamin-, Muskarin- (oder Acetylcholin-), Nikotin-, Opiat-, Serötin-, Benzodiazepin-, GABA-, Glycin-, Calciumkanal-, Natriumkanal-, chemotaktische Peptid-, EGF(Epidermis-Wachstumsfaktor)-, Glucocorticoid-, Cannabonoid-, Cholecystokinin Cytokinin-, Leukotrien- und Neurokinin-Rezeptoren. Diese Membranrezeptoren können aus der einbettenden Membran durch z. B. Detergentien extrahiert werden, die löslich gemachte Rezeptoren liefern. Beispiele für solche löslichen Rezeptoren sind Steroidhormon- Rezeptoren, Androgen-, Progesteron- und Östrogen-Rezeptoren. Östrogen-Rezeptor- Benzodiazepin- und Cytokin-Rezeptor-Assays unter Verwendung des Assays, wie gemäß der Erfindung definiert, sind von besonderem Interesse.
Das im Assay gemäß der Erfindung verwendete Rezeptormaterial kann aus rezeptorhaltigem Gewebe gewonnen werden. Das Rezeptormaterial kann natives Rezeptormaterial sein, das in vivo von einem Tier oder Mikroorganismus erhalten worden ist. Das Material kann aus Präparaten erhalten werden, die aus tierischen Körpern als solchen gewonnen worden sind Hirnmaterial kann z. B. die gewünschten Rezeptoren umfassen. Das Rezeptormaterial kann auch aus Gewebekultur oder Zellkultur erhalten werden. Im Prinzip gibt es im Moment zahlreiche kommerzielle Quellen für Rezeptormaterial, die verwendet werden können. Es ist bevorzugt, ein so reines Material wie möglich zu verwenden. Der erforderliche Reinheitsgrad wird jedoch in Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung variieren. Ein weiterer Parameter, der einen Einfluß auf die ausgewählte Quelle von Rezeptormaterial ausüben wird wird der Preis des Rezeptormaterials sein. Rezeptormaterial, das in der im allgemeinen für Körperproben, die Rezeptormaterial umfassen, erforderlichen Weise vorbehandelt worden ist, was zu einem P2-Pellet führt, ist ausreichend rein für die Durchführung des Assays gemäß der Erfindung. Wie angegeben, kann natürlich auch stärker gereinigtes Rezeptormaterial verwendet werden. Wenn der Assay in irgendeiner der oben beschriebenen Ausführungsformen durchgeführt wird, kann eine Menge an Rezeptormaterial verwendet werden, die zu derjenigen äquivalent ist, die im P2-Pellet vorliegt, die aus rezeptorhaltigem Gewebe gewonnen ist, wobei besagter P2-Pellet eine Konzentration aufweist, die 0,5-5 pmol/mg Protein entspricht.

Beispiel Fluoreszenzrezeptorassay für Benzodiazepine

In dieser Ausführungsform unseres Fluoreszenzrezeptorassays wurden die gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen von FLB durch Filtration getrennt. Da FLB in der Gegenwart von Rezeptormaterial nicht gemessen werden konnte, aufgrund seiner Autofluoreszenz, dissoziierten wir FLB vor der Quantifizierung des gebundenen FLB. Dies wurde erreicht durch Inkubieren des an die Rezeptoren gebundenen FLBs mit einem schwachen Acetatpuffer (pH 4) nach der ersten Filtration. Die zweiten Filtrate enthielten dann das gebundene FLB. Zur Quantifizierung der gebundenen Fraktionen von FLB verwendeten wir ein RP-HPLC- System mit einem Fluoreszenzdetektor. Dies wurde gemacht, weil die Filtrate noch einige Verunreinigungen des Rezeptormaterials enthielten und Fluoreszenzdetektoren für chromatographische Zwecke empfindlicher erschienen als herkömmliche statische Fluoreszenzdetektoren.
Wir folgern, daß Mmc-O-CO-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890 (FLB) eine hervorragende Wahl für fluoreszenzmarkiertes Benzodiazepin zur Verwendung als markierter Ligand im Fluoreszenzrezeptorassay für Benzodiazepin ist. In diesem Beispiel beschreiben wir die Verwendung von FLB als fluoreszenzmarkierten Liganden für den Benzodiazepin- Rezeptorassay. Die Bindung von FLB an Benzodiazepin-Rezeptor wurde durch Durchführung von Sättigungsexperimenten festgestellt. Außerdem wurden Kalibrierungskurven für drei Benzodiazepine, Diazepam, Lorazepam und Flumazenil, mit FLB als Markierung bestimmt. Die Kalibrierungskurve von Lorazepam wurde auch mit einer Kalibrierungskurve verglichen, die mit dem radioaktiv markierten Liganden [³H]Flunitrazepam erhalten wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß FLB den radioaktiv markierten Liganden [³H]Flunitrazepam erfolgreich ersetzen kann.

2 Materialien und Verfahren

2.1 Chemikalien

[N-Methyl-³H]Flunitrazepam (82,0 Ci/mmol) wurde von DuPont NEN (Wilmington, DE, U. S. A.) erhalten. Lorazepam waL ein Geschenk von Wyeth Laboratoria B. V. (Hoofddorp, Niederlande). Flumazenil und Diazepam waren ein Geschenk von Roche Nederland B. V. (Mijdrecht, Niederlande). Die Synthese und Reinigung des fluoreszenzmarkierten Benzodiazepin-FLB, Struktur siehe Fig. 1, ist an ariderer Stelle in der Beschreibung beschrieben. Methanol und Acetonitril waren HPLC-Qualität und wurden erhalten von Lab- Scan (Dublin, Irland). Alle anderen Chemikalien waren analytische Qualität und wurden bezogen von Merck (Darmstadt, Deutschland).
Die MultiScreen-FB-Filtrationsplatten wurden freundlicherweise gestiftet von Millipore (Etten-Leur, Niederlande). Rialuma, verwendet als Szintillationscocktail, wurde erhalten von Lumac (Olen, Belgien).
Entmineralisiertes Wasser wurde vor Verwendung in den Puffern weiter gereinigt durch ein Elgastat-Maxima-Instrument (Elga, High Wycombe, UK).
Die Synthese von FLB wurde wie folgt durchgeführt:
265 mg 4-Hydroxybuttersäure (Natriumsalz) und 1,95 g Kaliumcarbonat wurden in 200 ml Acetonitril suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 37,5 mg 18-Krone-6 und 375 mg 4- Brommethyl-7-methoxycumarin zugegeben und das Ganze wurde bei 65ºC für 1 Stunde inkubiert. Nach der Derivatisierung wurde das gebildete Sediment durch Filtration entfernt und das Acetonitril wurde unter Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Chloroform gelöst. Das Chloroform wurde sechsmal mit 20 ml gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und nach Verdampfen unter Vakuum wurde 1(4-Hydroxybutyryl)- oxymethyl-7-methoxycumarin gesammelt. Für die Markierung von Desethylflumazenil wurden 87,7 mg Desethylflumazenil (RolS-3890) in 5 ml trockenem Dichlormethan gelöst und 200 gl trockenes Triethylamin wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf Eis gekühlt und 40 mg Methansulfonylchlorid wurden zugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde die Mischung wieder auf Eis gekühlt. 100 mg 1-(4- Hydroxybutyryl)-oxymethyl-7-methoxycumarin wurden zugegeben und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur während der Nacht fortgesetzt. Nach der Derivatisierung wurde: das Dichlormethan verdampft und der Rückstand wurde in 10 ml trockenem Benzol erneut suspendiert. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und die Benzolfraktion wurde unter Vakuum eingedampft. Dieser Rückstand wurde in 50 ml Dichlormethan gelöst. Das Dichlormethan wurde dreimal mit 20 ml Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und aus Hexan umkristallisiert. Das Mmc-O-CO-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890 wurde mit RP-HPLC weiter gereinigt.

2.2 HPLC-System

Das Chromatographiesystem bestand aus einer SP 8800 HPLC-Pumpe (Spectra Physics, San Jose, CA, U. S. A.), einem Autosampler, Modell 460, ausgestattet mit einer 120 ul-Schleife (Kontron Instruments, Basel, Schweiz), einem F-1080 Fluoreszenzdetektor, ausgestattet mit einer 40 ul-Küvette und einem 30 nm-Schlitz (Merck-Hitachi, Darmstadt, Deutschland) und einem Regulator mit 2 bar Rückdruck (Merck, Darmstadt, Deutschland). Peak-Höhen wurden aufgezeichnet mit einem BD-8-Rekorder (Kipp & Zonen, Kronberg).
Die Trennung wurde unter Verwendung einer Säule mit 125·4 mm i.d., gepackt mit 5 um LiChrospher® 100 RP-18 (Merck, Darmstadt, Deutschland), durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus 40% entmineralisiertem Wasser, 40% Methanol und 20% Acetonitril. Die Durchflußrate betrug 1,0 ml/min. Mmc-CO-(CH&sub2;)&sub3;-RO15-3890 wurde bei λex 318 nm und λem 400 nm nachgewiesen.

2.3 Präparation von membrangebundenen Rezeptoren

Kalbshirne, erhalten aus dem Schlachthaus und aufbewahrt bei -80ºC nach Verwerfen des Kleinhirns, wurden in 6 Volumenteilen (w/v) eiskalter 0,32 M Saccharose in einem Potter- Elvehjem-Homogenisator (RW 20 DZW. Janke & Kunkel KG, Staufen i. Breisgau, Deutschland), ausgestattet mit einem Teflon-Stößel, homogenisiert und für 10 Minuten bei 1000 · g in einer Beckman-L8-55-Ultrazentrifuge (Beckman Instruments, Mijdrecht, Niederlande) zentrifugiert. Der Überstand wurde für 60 min bei 100.000 · g zentrifugiert. Der resultierende Pellet (P2) wurde in Natriumphosphatpuffer (pH 7,4; 50 mM) erneut suspendiert und für 30 min bei 100.000 · g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde viermal wiederholt. Alle Vorgänge wurden bei 4ºC durchgeführt. Der gewaschene P&sub2;-Pellet wurde in 5 Volumenteilen (w/v) Phosphatpuffer erneut suspendiert, mit flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert (Hetosicc CD 52-1, Heto, Birker d, Dänemark). Der lyophilisierte P&sub2;-Pellet wurde bei -20ºC aufbewahrt. Für die Rezeptorbindungsassays wurde der lyophilisierte P&sub2;- Pellet in Tris-HCl-Puffer (pH 7,4; 50 mM) mit einem Glas-Teflon-Potter-Homogenisator (3,5 mg/ml) erneut suspendiert.
Die Proteinmenge wurde gemäß dem in früheren Experimenten [d] beschriebenen Verfahren mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.

2.4 Radioligandenbindungsassay

Die Filter einer MultiScreen-FB-Filtrationsplatte wurden durch Pipettieren von 200 ul eiskalten Tris-HCL-Puffer (pH 7,4; 50 mM) in jede Vertiefung vorbefeuchtet. Nach Warten für wenigstens 5 s wurde Vakuum über die MultiScreen-Vakuumleitung (Millipore, Etten- Leur, Niederlande) angelegt. Für den Bindungsassay wurden 25 ul Tris-HCl-Puffer, enthaltend Lorazepam (30 pM-100 nM Endkonzentration) und 25 um [³H]Flunitrazepam- Lösung (2,2 nM Endkonzentration) in Tris-HCl-Puffer doppelt in die Vertiefungen der Filtrationsplatte pipettiert. Zu dieser Mischung wurden 200 ul Rezeptorsuspension zugegeben und die Platte wurde für 1 min gerüttelt. Nach der Inkubation für 45 min bei 4ºC wurde Vakuum angelegt (400 mbar) und die Filter wurden einmal mit 200 ul eiskaltem Puffer gespült. Um das gebundene [³H]Flunitrazepam zu dissoziieren, wurden 200 ul Acetatpuffer (pH 4; 100 mM) in jede Vertiefung pipettiert und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Dissoziationslösungen wurden durch Filtration in einer Mikrotiterplatte gesammelt. Einhundert ul Filtrate wurden in 6 ml Polyethylen-Zählampullen überführt und in 3,5 ml Rialuma dispergiert. Nach Schütteln der Ampullen wurde die Reaktivität für 5 min. In einem Szintillationszähler Tri-Carb 4000 Packard (Canberra Packard, Groningen, Niederlände) gezählt. Die Bindungsexperimente wurden doppelt durchgeführt.

2.5 Fluoreszenzbindungsassay

Für die Sättigungsexperimente wurde 25 ul FLB-Lösung (0,5 bis 50 nM Endkonzentration) in Tris-HCl-Puffer (pH 7,4; 50 mM) doppelt in die Vertiefungen der Filtrationsplatte nach Vorbefeuchten der Filter pipettiert. Für die Bestimmung der Gesamtbindung wurden 25 ul- Tris-HCl-Puffer zugegeben und für die Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung 25 ul Tris-HCl-Puffer, die 100 uM Flumazenil enthielten. Zu dieser Mischung wurden 200 ul der Rezeptorsuspension (225 ug Protein pro Assay) zugegeben und die Platte wurde für 1 min gerüttelt. Nach Inkubation für 45 min bei 4ºC wurde Vakuum angelegt (400 mbar) und die Filter wurden einmal mit 200 ul eiskaltem Puffer gespült. Um das gebundene FLB zu dissoziieren, wurden 200 ul Acetatpuffer (pH 4; 100 mM) in jede Vertiefung pipettiert und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Dissoziationslösungen wurden durch Filtration in einer Mikrotiterplatte gesammelt und 300 ul-Glasmikroampullen (Phase Sep, Waddinxveen, Niederlande) überführt. Einhundert ul der Filtrate wurden mit dem oben beschriebenen HPLC-Verfahren analysiert.
Um die Mengran FLB in den Filtraten zu quantifizieren, wurde eine Kalibrationskurve erstellt durch Verdünnen von fünf verschiedenen Lösungen von FLB in Tris-HCl-Puffer mit dem 100-fachen mit Acetatpuffer, um die Konzentrationen 0,3; 0,5; 1,5; 3,0 und 5,0 mM zu erhalten. Die Kalibrationsproben wurden doppelt analysiert. Für die Kalibrationskurven war das Verfahren identisch zu den Sättigungsexperimenten. Hier wurden 25 ul FLB-Lösung (7,3 nM Endkonzentration) in Tris-HCl-Puffer mit 25 ul einer Lösung von Diazepam (1 nM-1 uM Endkonzentration), von Lorazepam (0,3 nM-300 nM Endkonzentration) oder von Flumazenil (30 pM-30 nM Endkonzentration) vermischt.

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Prinzip des Fluoreszenzrezeptorassays

Das Prinzip des Fluoreszenzrezeptorassays in dieser Ausführungsform ist in Fig. 2 dargestellt. Nach Trennung der gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen von FLB durch Filtration wurde das gebundene FLB vom Benzodiazepin-Rezeptor dissoziiert. Dies wurde durchgeführt, um das FLB in einer Lösung zu erhalten, frei von Rezeptoren und Filtermaterialien, so daß die Menge an FLB leicht durch Messen des Fluoreszenzsignals bestimmt werden konnte. Anstelle der Messung der gebundenen Fraktion von FLB war es auch möglich, die freie Fraktion von FLB zu bestimmen. In diesem Falle mußten die Filtrate während des ersten Filtrationsschrittes gesammelt werden. Da nur 26% des zugegebenen FLBs bei einer Assaykonzentration von 7,3 nM an die Rezeptoren gebunden waren (Gesamtbindung), wurden für eine genauere Messung die gebundenen Fraktionen quantifiziert.

3.2 Das HPLC-System

Die Menge an gebundenem FLB wurde mit HPLC quantifiziert. Das HPLC-System Würde verwendet, da die Fluorenszenzdetektoren für chromatographische Zwecke empfindlicher sind als statische Fluoreszenzspektrometer für Küvetten. Überdies enthalten die Dissoziationslösungen, nach der Dissoziation, auch einige Verunreinigungen, die von dem Rezeptormaterial freigesetzt werden. Aus diesem Grund wurde der P&sub2;-Pellet, während der Präparation des membrangebundenen Rezeptormaterials, 5-mal anstelle von 2-mal gewaschen, gemäß unserem Standardverfahren [d]. Unter Verwendung eines HPLC-Systems zur Quantifizierung von FLB kann das FLB von diesen Verunreinigungen getrennt werden.
Die Zusammensetzung der mobilen Phase des Chromatographiesystems wurde aus den Optimierungsexperimenten zur Reinigung von FLB erhalten. Mit diesem System hat FLB einen Kapazitätsfaktor von 4,5 und wird vollständig von den Verunreinigungen getrennt.
In vorherigen Experimenten wurde die Dissoziation des gebundenen FLB von den Benzodiazepin-Rezeptoren von uns untersucht. Die höchste Rückgewinnung (90,8% FLB) wurde durch Dissoziation mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,4; 50 mM), der 10 uM Flumazenil enthielt, erhalten. Um die Menge an dissoziiertem FLB zu quantifizieren, wurden 100 ul der Dissoziationslösung direkt in das HPLC-System eingespritzt. Tris-HCl-Puffer gab jedoch einen enormen Lösungsmittelpeak, so daß es eine unzureichende Auflösung zwischen dem Lösungsmittelpeak und FLB gab.
Acetatpuffer (pH 4, 100 mM) hat auch die Fähigkeit, das gebundene FLB von den Rezeptoren zu dissoziieren, mit einer Wiedergewinnung von 87,2%. Weil Acetatpuffer keinen solchen Lösungsmittelpeak wie Tris-HCl-Puffer verursachte, konnte FLB quantifiziert werden. Fig. 2 zeigt Chromatogramme von 10 nM-Lösungen von FLB in Tris-HCl-Puffer bzw Acetatpuffer.

3.3 Bindungseigenschaften von FLB an den Benzodiazepin-Rezeptor

Die Sättigungs- und Inhibitionskurven für sowohl das radioaktiv markierte Benzodiazepin- [³H]-Flunitrazepam als auch das fluoreszenzmarkierte Benzodiazepin FLB, wurden mit dem Programm EBDA-Ligand V4 (Biosoft, Cambridge, UK) unter Verwendung eines Ein- Bindungsstellen-Modells angepaßt. Fig. 4 zeigt eine repräsentative Sättigungskurve von FLB. Die spezifische Bindung wurde berechnet durch Subtrahieren der nicht-spezifischen Bindung von der Gesamtbindung. Die Bindungsaffinität von FLB für den Benzodiazepin- Rezeptor wurde zu 8,60 ± 2,89 nM-berechnet. Dieser Wert ist vergleichbar mit der Affinitätskonstante, die mit Radioligandenbindungsassays geschätzt worden war. Inhibitionsassays mit [³H]-Flunitrazepam ergaben einen Ki-Wert von 6,5 nM für FLB. Der Bmax-Wert wurde berechnet zu 3,42 ± 0,01 nM, was 3,84 ± 0,09 pM/mg Protein entspricht in einer vorherigen Studie ermittelten wir einen Bmax von 1,0 pM/mg Protein [d]. Bisher gibt es noch keine Erklärung für diesen Unterschied der Bmax-Werte. Dieser Anstieg der Bindungsstellen kann nicht Extra-Bindungsstellen für das Fluorophor oder der Möglichkeit zugeordnet werden, daß Flumazenil mehr Bindungsstellen hat als Flunitrazepam, da FLB vollständig durch sowohl Diazepam, Lorazepam als auch Flumazenil verdrängt werden kann (siehe Fig. 4). Havunjian et al. [g] haben ebenfalls einen höheren Bmax für das fluoreszenzmarkierte Benzodiazepin BD 623 (NBD-NH-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890, das ebenfalls ein Flumazenil-Derivat ist) als für [³H]-Flumazenil gefunden, 7,2 gegenüber 2,3 nM (ihre höheren Bmax-Werte können jedoch mit der Tatsache erklärt werden, das sie Rezeptormaterial von Ratten verwendeten, im Gegensatz zu unserer Verwendung von Kalbs-Rezeptormaterial). Als eine mögliche Erklärung brachten sie den Unterschied in der Trennung von gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen von markiertem Liganden zwischen ihren zwei Verfahren vor. Bei Verwendung von [³H]-Flumazenil verwendeten sie Filtration, aber mit BD 623 trennten sie die gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen nicht. Nach Bindung von BD 623 an den Rezeptor ist die Fluoreszenzintensität verringert und aus dem Niveau des Fluoreszenz-Quenching kann die Menge an gebundenem BD 623 geschätzt werden. Sie sind jedoch unsicher, ob die Diskrepanz mit dem Unterschied in der Trennung erklärt werden kann.
Die nicht-spezifische Bindung von FLB betrug 25% der Gesamtbindung bei einer freien anfänglichen Konzentration von 15 nM und war vergleichbar mit anderen Fluoreszenzrezeptorassays für Benzodiazepine. Takeuchi et al. [c] fanden z. B. in ihrem zeitaufgelösten fluorometrischen Assay mit Eu-1012-S als markiertem Benzodiazepin eine nicht-spezifische Bindung von 27% und eine nicht-spezifische Bindung von 20% in ihrem Fluoreszenzrezeptorassay mit Ro7-1986-AMCA als markiertem Liganden [b].

3.4 Fluoreszenzrezeptorassay für Benzodiazepine

FLB wurde als Fluoreszenzmarkierung durch Bestimmung von Kalibrationskurven von drei Benzodiazepinen mit unterschiedlichen Affinitäten für den Benzodiazepin-Rezeptor getestet, nämlich Flumazenil, Lorazepam und Diazepam. Diese Experimente wurden mit einer FLB- Assay-Konzentration von 7,3 nM durchgeführt. Diese Konzentration entspricht dem Kd von FLB. Repräsentative Kalibrationskurven sind in Fig. 4 gezeigt.
Mit FLB als markiertem Liganden zeigen die drei Benzodiazepine dieselbe Größenordnung in der Affinität, als wenn sie mit einem radioaktiv markierten Liganden bestimmt sind. Die IC&sub5;&sub0;- Werte, berechnet aus den Kalibrationskurven, sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

IC&sub5;&sub0;-Werte verschiedener Benzodiazepine

IC&sub5;&sub0; n(M)
Flumazenil 4,9 ± 1,5
Lorazepam 7,2 ± 0,5
Diazepam 41 ± 7
Um den Fluoreszenzrezeptorassay mit dem Radiorezeptorassay zu vergleichen, wurden die Kalibrationskurven von Lorazepam mit sowohl der Fluoreszenzmarkierung FLB als auch der radioaktiven Markierung [³H]Flunitrazepam bestimmt. Wie man in Fig. 6 sehen kann, sind beide Kurven identisch. Der IC&sub5;&sub0; von Lorazepam, bestimmt mit [³H]Flunitrazepam als markiertem Liganden, betrug 6,61 ± 0,69 nM und unterschied sich nicht signifikant von dem IC&sub5;&sub0;, der im Fluoreszenzrezeptorassay bestimmt wurde, wenn verglichen mit dem Student-t- Test (p = 0,451). Dies beweist, daß Rezeptorassays erfolgreich mit Fluoreszenzmarkierungen durchgeführt werden können. Zum Vergleich der IC&sub5;&sub0;-Werte von Lorazepam, bestimmt mit zwei unterschiedlichen Liganden, anstelle der Ki-Werte, muß das Verhältnis zwischen der Konzentration an freiem markierten Liganden (L*) und dem Kd des markierten Liganden gleich sein, da die Beziehung zwischen dem IC&sub5;&sub0; und dem Ki ausgedrückt wird durch die Cheng-Prusoff-Gleichung [k]:
IC&sub5;&sub0; = Ki·(1 + [L*]/Kd)
In unseren Experimenten ist dieses Verhältnis für beide Liganden gleich, so daß der Radiorezeptorassay mit dem Fluoreszenzrezeptorassay durch Vergleich der IC&sub5;&sub0;-Werte verglichen werden konnte.
Durch Verwendung eines HPLC-Systems zur Quantifizierung von FLB vermieden wir die. Interferenz von Verunreinigungen der Rezeptorpräparation. Überdies war, da in unserem Assay die gebundenen Fraktionen statt der nicht-gebundenen Fraktionen bestimmt werden, die Genauigkeit des Assays merkbar verbessert. Zusätzlich wurde eine Rezeptorkonzentration von 2,8 mg/ml verwendet, was einen zusätzlichen Vorteil gegenüber den Verfahren nach dem Stand der Technik lieferte. Ensing [1] hatte z. B. berechnet, daß durch Erhöhen der Rezeptorkonzentration die Nachweisgrenze gesenkt werden kann. Nun ist ein Assay bereitgestellt worden, der niedrige Konzentrationen von Rezeptormaterial bietet, während er empfindlichen Nachweis erzielt.
Als Schlußfolgerung kann der Benzodiazepin-Rezeptorassay erfolgreich mit dem fluoreszenzmarkierten Benzodiazepin-FLB ausgeführt werden. Die Zeit, um einen Fluoreszenzrezeptorassay durchzuführen und die gebundenen Fraktionen zu quantifizieren, ist vergleichbar mit der für einen Radiorezeptorassay notwendigen Zeit. Aber die Verwendung eines Fluoreszenzmarkierung anstelle einer radioaktiven Markierung hat mehrere Vorteile, wie etwa die niedrigeren Kosten, weniger gefährlich für die Gesundheit, etc. Überdies können Fluoreszenzrezeptorassays auch in Laboratorien ausgeführt werden, die nicht für die Arbeit mit Radioaktivität ausgerüstet sind.

Literaturstellen

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[i] J. L. Velazquez, C. L. Thompson, E. M. Barnes und K. J. Angelides. Distribution and lateral mobility of GABA/benzodiazepine receptors on nerve cells, J. Neurosci., 9 (1989) 2163-2169.
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[k] Y.-C. Chen und W. H. Prusoff, Relationship between the inhibition-constant (Ki) andthe concentration of inhibition constant (Ki) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (I&sub5;&sub0;) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol.42 (1973) 3099-3108.
[1] K Ensing. The radioreceptor assay, a tool for the bioanalysis or drugs, in Bioanalysis of anticholinergics with muscarinic receptors in relation with chronic obstructive hing diseases, Ph. D. thesis, University of Groningen, 1984, S. 25-40.

Figurenbeschreibung

Fig. 1
Struktur von 3 Verbindungen, die für einen Fluoreszenzassay gemäß der Erfindung geeignet sind. Die Verbindungen sind
a) AMCA-Ro7-1986
Ki = 8,6 nM [b]
b) Mmc-O-CO-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890
Ki = 6,5 nM
c) NBD-NH(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3 890
K, = 5,7 nM [g]
Fig. 2
Prinzip des Fluoreszenzrezeptorassays für Benzodiazepine.
Fig. 3
Chromatogramme von 10 nM FLB, (A) in Tris-HCl-Puffer (pH 7,4; 50 nM), enthaltend 10 uM Flumazenil, und (B) in Acetatpuffer (pH 4; 100 mM).
Fig. 4
Sättigungskurve von FLB für den Benzodiazepin-Rezeptor stellt die Gesamtbindung dar die spezifische Bindung und die nicht-spezifische Bindung.
Fig. 5
Kalibrationskurven für verschiedene Benzodiazepine: Diazepam ( ), Lorazepam ( ) und Flumazenil ( ).
Fig. 6
Vergleich von Kalibrationskurven von Lorazepam mit unterschiedlichen Typen von markierten Liganden: stellt einen Assay dar, durchgeführt mit [³H]Flunitrazepam (2,2 nM Endkonzentration) und stellt einen Assay dar, durchgeführt mit FLB (7,3 nM Endkonzentration).
Fig. 7
Herstellungsverfahren für FLB

Claims

1. Verfahren zum quantitativen und/oder qualitativen Testen eines Analyten in einer Probe, wobei besagter Analyt eine rezeptorbindende Verbindung ist, wobei besagtes Verfahren niedrige Nachweisgrenzen äquivalent zu denjenigen von Radiorezeptorassays besitzt, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfaßt

a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Material, das einen Rezeptor für besagten Analyten umfaßt, damit Rezeptor-Analyt-Bindung auftritt, und

b) weiteres In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem nachweisbaren Liganden für den Rezeptor, damit Rezeptor-Liganden-Bindung auftritt, gefolgt von

c) Trennen der resultierenden rezeptorgebundenen und freien Fraktionen,

d) Unterwerfen der rezeptorgebundenen Fraktion unter dissoziierende Bedingungen, die den Liganden vom Rezeptor freisetzen, und

e) Testen auf den dissoziierten Liganden in einer für den Nachweis des nachweisbaren Liganden per se bekannten Weise, wobei besagter Rezeptor in einer Konzentration zwischen 0,5-5 nM vorliegt, wobei besagter nachweisbarer Ligand wenigstens 90% rein ist, wobei besagter nachweisbarer Ligand nichtradioaktiv nachweisbar ist, wobei besagter nachweisbarer Ligand in einer Menge zugegeben wird, die der Menge entspricht, die erforderlich ist für die Besetzung durch den Liganden von 10 bis 75% des Rezeptormaterials, das im Assay vorhanden ist, in Abwesenheit von Analyt bei einer Rezeptorkonzentration unterhalb des Kd des Liganden und Rezeptors unter Bedingungen, die ansonsten denjenigen des Assays entsprechen, wobei besagte dissoziierende Bedingungen und besagter nachweisbarer Ligand derart sind, daß wenigstens 90% gebundener Ligand freigesetzt werden, in solch einer Form, daß weniger als 10% des resultierenden nachweisbaren Produktes sich erneut mit dem Rezeptor assoziiert, wobei besagte dissoziierende Bedingungen und besagter nachweisbarer Ligand so gewählt sind, daß der resultierende dissoziierte Ligand quantitativ und/oder qualitativ nachweisbar ist, wobei fakultativ Schritt a) und b) gleichzeitig durchgeführt werden oder Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt wird und fakultativ in Schritt c) die gebundene Fraktion auf der Basis des Größenunterschiedes von der freien Fraktion getrennt wird und fakultativ die freie Fraktion in Schritt c) von der gebundenen Fraktion durch Filtration getrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand und die Dissoziationsbedingungen so gewählt werden, daß der Ligand unter den dissoziierenden Bedingungen nicht abgebaut wird, wodurch das nachweisbare Produkt geliefert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand und die Dissoziationsbedingungen so gewählt werden, daß der Ligand vollständig und gleichförmig abgebaut wird, wodurch das nachweisbare Produkt geliefert wird.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein höherer Grad an Reinheit des Liganden gewählt wird, um das Vorhandensein von Verunreinigungen mit hoher Affinität für den Rezeptor zu kompensieren.

5 Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zugesetzte Menge an Ligand äquivalent ist zu einer Menge im Bereich 0,1 bis 2,0 Kd nM des Rezeptors und Liganden, vorzugsweise in einer Menge zwischen 0,5 bis 1, 5 · Kd nM, wobei z. B. der Kd für den Liganden und Rezeptor unter 10 nM liegt.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

b) weiteres In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Liganden für den Rezeptor, damit Rezeptor-Liganden-Bindung auftritt, in einem Behälter durchgeführt wird, der einen Filter umfaßt, wobei besagter Filter von der Art ist, daß sichergestellt ist, daß das Rezeptormaterial nicht durch den Filter hindurchgehen kann, wohingegen die kleineren Teilchen, insbesondere der nicht-gebundene Ligand und Analyt, dies können,

c) das Trennen der resultierenden rezeptorgebundenen freien Fraktion durch Filtrieren der resultierenden Mischung und Spülen des Filters durchgeführt wird,

d) die rezeptorgebundene Fraktion, wie in und auf dem Filter vorhanden, dissoziierenden Bedingungen unterworfen wird, die den Liganden vom Rezeptor freisetzen, und die resultierende Lösung durch den Filter in ein weiteres Gefäß geleitet wird, damit Nachweis des dissoziierten Produktes in einer per se für den Nachweis des nachweisbaren Produktes bekannten Weise eintritt.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mit der nachweisbaren Markierung versehen ist, die über einen Spacer gebunden ist, wobei z. B. der Spacer eine Kohlenstoffkette mit zwischen 2 bis 10, vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatomen umfaßt.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand ein Flumazenil-Derivat ist.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß besagte dissoziierenden Bedingungen und besagtes Rezeptormaterial derart sind, daß keine anderen Verbindungen in einer Menge freigesetzt werden, die mit dem Nachweis des freigesetzten Liganden interferieren kann, wobei die dissoziierenden Bedingungen z. B. das Spülen unter anderen als physiologischen Bedingungen und unter Bedingungen umfassen, die sicherstellen, daß der nachweisbare Ligand oder die nachweisbare Markierung des Liganden stabil und funktionell bleibt, d. h. Bedingungen, die zusätzlich nicht zu aggressiv sind, und wobei z. B. die physiologischen Bedingungen einen pH zwischen 6 bis 8 ausschließen und fakultativ einen schwachen Puffer umfassen, d. h. mit einem pH zwischen 3,5 und 4,5, vorzugsweise zwischen 3,75 und 4,25, z. B. einen Acetatpuffer.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Produkt ein nachweisbares Signal in wäßrigem Medium liefert, das ausreichend für verläßliche Quantifizierung ist, d. h. eine Abweichung von weniger als 10% vom tatsächlichen Wert zeigt.

11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt bei einem Gehalt unter 1 mikromolar, vorzugsweise unter 0,5 mikromolar, bevorzugter unter 100 nM, am bevorzugtesten unter 50 nM nachgewiesen werden soll und fakultativ der Analyt bei einem so niedrigen Gehalt wie möglich nachgewiesen werden soll, so niedrig wie 1 picomolar, vorzugsweise so niedrig wie 100 femtomolar.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt in einem wäßrigen System bestimmt werden soll, d. h. in einer Körperflüssigkeitsprobe.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzlicher Trennschritt zwischen dem Dissoziationsschritt und dem Nachweisschritt durchgeführt wird, wobei z. B. i) die Fraktion, die aus dem.

Dissoziationsschritt resultiert, welche freien Liganden umfaßt, unter Verwendung eines HPLC-Chromatograph getestet wird, der mit einem Detektor das für den Nachweis des nachweisbaren Liganden erforderlichen Typs verbunden ist, oder ii) die Fraktion, die aus dem Dissoziationsschritt resultiert, welche freien Liganden umfaßt, unter Verwendung von GLC getestet wird, verbunden mit einem Detektor des für den Nachweis des nachweisbaren Liganden erforderlichen Typs.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der nachweisbare Ligand über FID (Flammionisationsdetektion), ECU (Elektroneneinfangdetektion), NPD (Stickstoff-Phosphor-Detektion) oder Massenspektrometrie (13ii) bestimmt werden kann oder daß der nachweisbare Ligand über Fluoreszenz, Chemolumineszenz, Lumineszenz, Massenspektrometrie oder elektrochemische Detektoren (13i) nachweisbar ist und daß geeigneterweise das nachweisbare Produkt mit Fluoreszenztechnologie, vorzugsweise direkter Fluoreszenzmessung, am bevorzugtesten nicht-zeitaufgelöster Fluorometrie nachweisbar ist.

15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen ist, vorzugsweise einer NBD- oder MMC-Markierung oder einem Äquivalent davon im Hinblick auf funktionelle Eigenschaften des Fluoreszenztyps, Stabilität, Wirkung auf Ligandenaffinität, wobei z. B. der Ligand der Fluoreszenzligand FLB ist und wobei z. B. der Ligand ein Fluoreszenzsignal in wäßrigem Medium mit wenigstens der Stärke von 0,2* das Signal 1 M Chinin-Standard in 1 M H&sub2;SO&sub4; liefert.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormaterial membrangebundenes Rezeptormaterial ist.

17. Verfahren nach einem der vorangehenden Anspruche, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormaterial ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe von Membranrezeptoren: Adenosin-, adrenerge, Dopamin- , Histamin-, Muskarin- (oder Acetylcholin-), Nikotin-, Opiat-, Serotin-, Benzodiazepin-, GABA-, Glycin-, Calciumkanal-, Natriumkanal-, chemotaktische Peptid-, EGF(Epidermis- Wachstumsfaktor)-, Glucocorticoid-, Cannabinoid-, Cholecystokinin-, Cytokin-, Leukotrien- und Neurokinin-Rezeptoren.

18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormaterial aus P2-Pellet gewonnen wird.

19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Rezeptormaterial, wenn der Trennschritt einen Filter verwendet, niedriger ist als die Menge an Rezeptor, die den Filter verstopfen wird, z. B. die Menge an Rezeptor niedriger ist als 1-4 mg/ml lyophilisiertes Rezeptormaterial, wenn das Assayvolumen 0,25 ml entspricht, d. h. 4-16 mg/ml Rezeptormaterial/ml Assayvolumen, wenn ein Filtertyp verwendet wird, wie er in MultiScreen-FB- Filtrationsplatten von Millipore oder von einem äquivalenten Typ vorliegt, wobei z. B. die - Menge an Rezeptormaterial, wenn der Trennschritt einen Filter verwendet, niedriger ist als die Menge an Rezeptor, die den Filter verstopfen wird, z. B. die Menge an Rezeptor niedriger ist als 1-4 mg/ml lyophilisiertes Rezeptormaterial pro 0,2 cm² Filterfläche, wenn ein Filtertyp verwendet wird, wie er in MultiScreen-FB- Filtrationsplatten von Millipore oder von einem äquivalenten Typ vorliegt, und wobei z. B die Menge an Rezeptormaterial, wenn der Trennschritt einen Filter verwendet, niedriger ist als die Menge an Rezeptor, die den Filter verstopfen wird, z. B. die Menge an Rezeptor niedriger ist als 1-4 mg/ml lyophilisiertes Rezeptormaterial pro 0,2 cm² Filterfläche, wenn ein Filtertyp verwendet wird, wie er in MultiScreen-FB- Filtrationsplatten von Millipore oder von einem äquivalenten Typ vorliegt.

20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Rezeptormaterial äquivalent ist zu derjenigen, die im P2-Pellet vorliegt, gewonnen aus rezeptorhaltigem Gewebe, wobei besagter P2-Pellet eine Konzentration besitzt, die 0,5-5 pmol/mg Protein entspricht.

21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormaterial ein Benzodiazepin-empfindlicher Rezeptor ist.

22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Rezeptormateriallösliches oder löslich gemachtes Rezeptormaterial ist, wobei z. B. der Rezeptor ein Östrogen-Rezeptor ist und wobei z. B. der nachweisbare Ligand Cumestrol ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das lösliche Rezeptormaterial ausgewählt ist aus Rezeptoren für die Steroidhormone Androgen, Östrogen und Progesteron oder ausgewählt ist aus der Gruppe von Membranrezeptoren, die in Anspruch 17 angegeben sind, nach Löslichmachung des Rezeptors.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß das lösliche oder löslich gemachte Rezeptormaterial einer Behandlung unterworfen worden ist, die Trennung über Filtration in Schritt c) ermöglicht, z. B. Behandlung, die sicherstellt, daß die rezeptorgebundene Fraktion bei Filtration nicht durch den Filter hindurchgehen kann, in einer per se bekannten Weise, wie etwa Ausfällung mit Protaminen.

25. Verbindung FLB (Mmc-O-CO-(CH&sub2;)&sub3;-Ro15-3890) mit der folgenden Formel.

26 Verwendung der Verbindung nach Anspruch 25 in einem Verfahren, das die Bindung an einen Benzodiazepin-Rezeptor erfordert, in einer zu anderen Rezeptor-Liganden- Bindung erfordernden Verfahren analogen Weise.

27. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 25 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24.